WO1998030230A1

WO1998030230A1 - Compositions proteinees et procede de production

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Publication number: WO1998030230A1
Application number: PCT/JP1998/000042
Authority: WO
Inventors: Koji Furushima; Katsuhiro Uriyu; Tuyoshi Takahashi; Motonori Hashimoto; Shoju Kameyama
Original assignee: Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd.
Priority date: 1997-01-09
Filing date: 1998-01-08
Publication date: 1998-07-16

Description

明細書

蛋白質含有組成物及びその製造方法

技術分野

本発明は、感染性ウィルス及び所望の蛋白質の変性体を実質的に含まない所望の蛋白質を含有する組成物に関する。さらに、ウィルス夾雑の可能性のある蛋白質含有組成物から、感染性ウイルス及び所望の蛋白質の変性体を実質的に含まない所望の蛋白質を含有する組成物を製造する方法に関する。背景技術

蛋白質を含有する製剤、特にヒト血漿を原料とする血漿分画製剤には、ヒトに感染し得る病原因子が混入しているおそれがあり、特にウィルス感染に対する問題は重要である。これまで輸血後にヒト免疫不全ウィルス（H I V ) 、 A型肝炎ウィルス（H A V ) 、 B型肝炎ウィルス（H B V ) 、 C型肝炎ウィルス（H C V ) などのウィルスの感染事故が発生している。このような事故は過去のものではなく、数々の技術の導入によって事故の発生率は指数的な数値をもって劇的に少なくなっているものの、現在もその発生を完全に否定することはできない。これらウィルス伝播を防ぐために、夾雑の可能性のあるウィルスを不活化又は除去する方法が知られている。例えば、蛋白質含有組成物を液状で加熱する方法 (特開昭 5 5— 1 4 5 6 1 5号公報、特開昭 5 6— 1 3 9 4 2 2号公報、特開昭 5 6 - 1 0 6 5 9 4号公報など）、乾燥状態で加熱する方法（特表昭 5 8 - 5 0 0 5 4 8号公報、特開昭 5 8 - 2 1 3 7 2 1号公報など）、トリアルキルホスフエー卜および界面活性剤と接触させる方法（特開昭 6 0 - 5 1 1 1 6号公報など ) 、紫外線照射による方法（特開平 7— 1 9 6 5 3 1号公報など）、ウィルス除去膜による方法（特願平 7— 2 5 7 7 7 1号明細書など）が知られている。

しかし、加熱処理では熱に強いウィルスが残存し、界面活性剤処理では非ェンベロープウィルスが残存し、紫外線照射の単独処理では蛋白質が失活する可能性があるなど、ウィルスを不活化又は除去する方法において単一の処理、公知組合せ処理では蛋白質の活性を殆ど失うことなく、完全に夾雑ウィルスを不活化又は除去することは困難であった。例えば、パルボウイルスのように、熱に強く、界面活性剤で不活化されず、小さいために 3 5 n mの膜処理では除去できないウイルスを不活化もしくは除去するのは困難であった。

このように蛋白質含有組成物から夾雑ウィルスを不活化又は除去するための多くの技術が知られているが、今日でさえ未知のウィルスの出現や、各種処理に対して耐性をもつゥィルスが存在する可能性があり、ウィルスがより完全に不活化もしくは除去された蛋白質含有製剤の提供が望まれている。

本発明は、これらの課題を解決するためになされたものであり、医薬品として安全な蛋白製剤を提供するために、蛋白質の活性を殆ど失うことなく効率良く夾雑ウィルスが不活化又は除去された、所望の蛋白質を含有する組成物及びその製造方法を提供しょうとするものである。発明の開示

本発明者らは上記課題を解決するために種々研究を重ねて来たところ、ウィルス夾雑の可能性のある蛋白質含有組成物に対して、加熱処理、紫外線照射処理、界面活性剤による処理及びウィルス除去膜処理のうち少なくとも三種の処理を行うことによって、感染性ウィルス及び所望の蛋白質の変性体を実質的に含まない所望の蛋白質を含有する組成物が得られることを見いだし、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は下記の通りのものである。

( 1 ) ウィルス夾雑の可能性のある蛋白質含有組成物に、加熱処理、紫外線照射処理、界面活性剤による処理及びウィルス除去膜処理のうち少なくとも三種の処理を行うことを特徴とする、感染性ウィルスおよび所望の蛋白質の変性体を実質的に含まない所望の蛋白質を含有する組成物の製造方法。

( 2 ) 少なくともウィルス除去膜処理を行うことを特徴とする（1 ) 記載の製造方法。 (3) 加熱処理が、液体状態の蛋白質含有組成物を 3 0〜6 5°Cにて 1 0分間〜 2 0時間処理するものである、（1) 記載の製造方法。

(4) 加熱処理が、乾燥状態の蛋白質含有組成物を 6 0〜 1 0 0°Cにて 2 0時間〜 1 0 0時間処理するものである、（1) 記載の製造方法。

(5) 紫外線照射処理が、波長 1 8 0〜3 5 0 nmにある紫外線にて、照射エネルギ一量 1〜5 0 OmJ 0 u 1 e/cm² を液体状態の蛋白質含有組成物に対して照射する処理である、（ 1) 記載の製造方法。

(6) 界面活性剤による処理が、ポリソルベート系界面活性剤による処理である、（ 1 ) 記載の製造方法。

(7) トリアルキルホスフェートを併用することを特徴とする（6) 記載の製造方法。

(8) ウィルス除去膜処理が、多孔性中空糸膜を用いた濾過処理である、（1) または（2) 記載の製造方法。

(9) 所望の蛋白質がフイブリノゲンであり、界面活性剤による処理、紫外線照射処理及び乾燥状態での加熱処理を行うことを特徴とする（1) 記載の製造方法

( 1 0) 所望の蛋白質がへパリン · コファクタ一 IIである（1 ) 記載の製造方法 o

(1 1) 加熱処理、紫外線照射処理、界面活性剤による処理及びウィルス除去膜処理のうち少なくとも三種の処理がなされ、感染性ウィルス及び所望の蛋白質の変性体を実質的に含まず、総蛋白質のうち有効な所望の蛋白質が 9 0 %以上含まれていることを特徴とする所望の蛋白質を含有する組成物。

( 1 ) ウィルスの核酸を実質的に含まないことを特徴とする（1 1 ) 記載の組成物。

( 1 3) 三種の処理が、界面活性剤による処理、紫外線照射処理及び乾燥状態での加熱処理であり、所望の蛋白質がフイブリノゲンである（1 1) または（1 2 ) 記載の組成物。 ( 1 4 ) 所望の蛋白質がへパリン · コファクター I Iである（ 1 1 ) または（ 1 2 ) 記載の組成物。

本発明の製造方法が適用される蛋白質は特に限定されるものではなく、血漿由来の蛋白質、尿由来の蛋白質、他の組織由来の蛋白質、遺伝子組み換えや組織培養によって得られた蛋白質などが挙げられる。蛋白質の具体例としては、例えば血液凝固因子（フィプリノゲン、プロトロンビン、トロンビン、第 V I I因子、第 VI I I因子、第 IX因子、第 X因子、第 XI I I因子など）、へパリン . コファクタ一 I I

、アルブミン、ヘモグロビン、インターフヱロン、フイブロネクチン、プラスミノ一ゲン、プラスミノ一ゲン活性化因子、アンチトロンビン I I I 、 C , インヒビター、 α , プロテア一ゼインヒビタ一、免疫グロブリン、ハプトグロビン、コロ二一形成刺激因子などが挙げられる。特にフイブリノゲン、へパリン · コファクター 11には本発明の製造方法が好適である。

フイブリノゲンは、分子量約 3 4万の血漿中に存在する蛋白質で、生体内ではトロンビンの作用を受けてフイブリンに変換され、さらにトロンビンによって活性化された第 XI 11因子と C a ⁺⁺の存在下で強固なフイブリン塊を形成し、血液を凝固させる。フイブリノゲンを含有する組成物は、低フイブリノゲン血症の治療剤ゃフィプリン糊の構成成分として有用である。フイブリノゲン含有組成物は、本発明の製造方法が好適に適用され、具体的には、界面活性剤による処理、紫外線照射処理及び乾燥状態での加熱処理の組み合わせが特に好適である。

へパリン ' コファクター Πは、分子量 72， 000の一本鎖の糖蛋白質であり、正常血漿中に約 1 O mg/dL存在する。へパリン · コファクタ一 I Iは主として肝臓で産生され血液凝固に関与するプロテア一ゼのうちトロンビンのみを阻害する。へパリン · コファクター I I含有組成物は、本発明の製造方法が好適に適用される。本発明の製造方法に適用されるウィルス夾雑の可能性のある蛋白質含有組成物は、液状であっても、乾燥状であってもよい。液状の蛋白質含有組成物は、特に制限されず、例えば血漿又は組織抽出液を各種分画法により処理して得た画分からなる溶液、遺伝子組換え宿主又は組織の培養により得られた蛋白質含有溶液、市販の液状の蛋白質製剤又は市販の凍結乾燥された蛋白質製剤を溶液としたものなどが挙げられる。また、乾燥状の蛋白質含有組成物についても、特に制限されず、液状の蛋白質含有組成物を安定化剤の存在下に凍結乾燥したものなどが挙げ本発明の製造方法が適用される蛋白質含有組成物の精製度は特に限定されるものではなく、本発明のウィルスの不活化処理または除去処理は蛋白質の分離、精製のいずれの段階にも適用可能である。

本発明の製造方法では、夾雑が危惧されるウィルスのほとんど全てが不活化又は除去される。ウィルスの具体例としては、ワクチニァウィルス、ムンブスウイルス、単純疱疹ウィルス、エコーウィルス、パルボウイルス、 H I V、 H A V、 H B V、 H C Vなどが挙げられる。特に、夾雑が危惧されるウィルスとしては、 H I V、 H B V、 H C V. パルボウイルスなどが挙げられる。

加熱処理は、液状組成物を加熱する液状加熱処理、凍結乾燥組成物を加熱する乾燥加熱処理のいずれでもよく、熱に対して感受性のあるウィルス、例えば H I Vに有効である。加熱処理は、通常 3 0〜 1 0 0 °Cにおいて、通常 1 0分間〜 1 2 0時間、好ましくは 1 0分間〜 1 0 0時間実施される。好ましい加熱温度と加熱時間との組み合わせとして、液状加熱処理では 3 0〜6 5 °Cにて 1 0分間〜 2 0時間、乾燥加熱処理では 6 0〜 1 0 0 °Cにて 2 0時間〜 1 0 0時間が挙げられ乾燥加熱処理は、不活性ガス雰囲気下又は減圧密栓下で行うことにより、加熱時の安定性をより高めることができる。不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウムガスなどが挙げられる。また、乾燥状態とは実質的に無水の状態であり

、可及的に水分の少ない状態であることが好ましい。水分の含量は、通常 3 %以下、好ましくは 1 %以下であり、通常は 0 . 0 5〜3 %程度である。

加熱処理に際しては、安定化剤を添加するのが好ましく、乾燥加熱処理の場合には、二糖類、糖アルコール、アミノ酸及びノ又は有機酸塩などが蛋白質 1 に対して 1 0 0 m g〜3 g、好ましくは 1〜2 gの割合で添加される。なお、安定化剤の添加は、凍結乾燥による影響を緩和するために、凍結乾燥前に添加するのが好ましい。液状加熱処理の場合には、糖（単糖類、二糖類、糖アルコールなど

) 、中性塩、アミノ酸、有機酸塩及び Z又はアルブミンなどを安定化剤として添加することができ、蛋白質含有水溶液 1 0 O.m 1当たり、糖 1 0〜2 0 0 g、中性塩 0 . 1〜 1 0 g、アミノ酸 1〜3 0 g、有機酸塩 1〜3 0 g、アルブミン 0 . 1〜 1 0 g程度を添加するのが好ましい。

界面活性剤による処理は、液状の蛋白質含有組成物に界面活性剤を添加することにより行われ、エンベロープウィルス、例えばムンプスウィルス、単純疱疹ゥィルス、 H I V、 H B Vs H C Vなどに対して有効である。

界面活性剤による処理は、 0〜7 0 °C、好ましくは 2 0〜6 0 °Cの温度で、好適には 3 0分以上、より好適には 1〜3 0時間、さらに好適には 3〜 1 0時間行われる。

界面活性剤による処理において、使用できる界面活性剤としては、脂肪酸のポリオキシエチレン誘導体、ソルビトール無水物の部分エステル、例えばポリソルベート 8 0 (商品名： Tween 8 0など）、ポリソルべ一ト 2 0 (商品名： Tween 2 0など）などのポリソルべ一ト系界面活性剤、非イオン性油浴水洗剤、例えばォキシェチル化アルキルフヱノール（商品名：トリトン X I 0 0など）が挙げられる。さらに、デォキンコール酸ナトリウム、スルホベタインとして周知の合成双性イオン洗剤である Zwi t tergents、例えば N—ドデシルー N， N—ジメチルー 2 —アンモニォ一 1 —エタンスルホネート、及びその同族体、または非イオン性洗剤、例えばォクチルー 3， D—ダルコビラノシドなどが挙げられる。特にポリソべ一ト系界面活性剤が好ましい。界面活性剤の使用量は特に制限はないが、例えば約 0 . 1〜 1 0 wZ v %、好ましくは約 0 . 1〜3 w " v %の範囲で使用することができる。

また、界面活性剤と併用してトリアルキルホスフェートを用いてもよい。使用されるトリアルキルホスフヱ一トとしては特に限定されないが、好適にはトリ一 ( n—ブチル）ホスフヱ一ト、トリ一（tert—ブチル）ホスフェート、トリー（ n—へキシル）ホスフヱート、トリ一（2—ェチルへキシル）ホスフヱ一ト、トリー（n—デシル）ホスフェートなどが挙げられる。特に好ましいのはトリー（ n—プチル）ホスフヱ一ト（以下「TNBP」という。）である。なお、二種以上の異なるトリアルキルホスフエ一トの混合物も使用することができる。トリアルキルホスフヱ一トは、 0. 0 0 1〜 1 0 wZv^、好ましくは約 0. 0 1〜3 ノ¥%の範囲で使用される。

また界面活性剤による処理は、蛋白質の活性低下を防ぐために、プロテアーゼ阻害剤の存在下で行うのが好ましい。プロテアーゼ阻害剤としては、実質的にプ口テアーゼの活性を阻害する物質であれば特に限定されない。例えば、 _ε—アミノカプロン酸（EACA) 、リジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸、ァプロチニン、トラネキサム酸などの蛋白質などが例示される。

紫外線照射処理は、液状の蛋白質含有組成物に対して均一に紫外線を照射して行い、耐熱性の非エンベロープウィルス、例えばパルボウイルス、 HAVなどに対しても有効である。

紫外線照射処理の際の温度は 1〜 3 5 °C、好ましくは 1 0〜 3 0 °C、波長は 1 8 0〜3 5 0 nm、好ましくは 2 0 0〜 3 2 0 n m、照射エネルギー量は、液層の厚みを薄くして、例えば 3 mm以下、好ましくは 0. 5 mm以下にして、 1〜 5 0 OmJ o u 1 eZcm² 、好ましくは 5 0〜2 0 OmJ o u 1 e/cm² とする。照射エネルギー量とは、紫外線の強度（ WZcm² ) と照射時間（s e c) との積で示したものである。照射に用いられる容器は、循環式のものが実用的であり、液層の厚みを 3 mm以下、好ましくは 0. 5 mm以下に調整する。ウィルス除去膜処理に用いられる膜は、メンブレン膜であっても、多孔性中空糸膜であつてもよく、ウイルス除去膜処理はこれらの膜を用いて濾過処理を行うものであり、加熱処理、界面活性剤による処理又は紫外線照射処理などで不活化され、分解されたウィルスの残骸（ウィルスの核酸など）の除去にも有効であり、本処理は上記他の三種の処理よりも後に行うのが好ましい。

例えば、多孔性中空糸膜を用いる場合において、多孔性中空糸は管状の糸であつて、その周壁に中空糸内部の中空部から外部に貫通する孔を多数有し、この周壁が濾過に用いられる膜となる。使用される多孔性中空糸の周壁の孔の平均孔径は 1〜 1 0 0 nmである。好ましい平均孔径は、濾過される蛋白質の種類及び濃度により異なり、例えばハプトグロビン、免疫グロプリンであれば 3 5 ±2 nm 、トロンビン、アンチトロンビン III 、血液凝固第 IX因子であれば 1 5 ±2 nm

C、あ o

多孔性中空糸を形成する素材は特に制限されないが、再生セルロースが好ましく用いられる。再生セルロースからなる多孔性中空糸は、好ましくは、セル口一ス銅アンモニア溶液からミクロ相分離法〔Am. Ch em. S o c. ， 9， 1 9 7 - 2 2 8 ( 1 9 8 5 ) 3 により調製される。多孔性中空糸は、好ましくはモジユールの態様で使用される。例えば、多孔性中空糸を多数平行に束ねて力一トリッジに充填し、接着剤を用いて一体化した態様が挙げられる。市販のものとしては BMM (Bemberg Microporus Membrane 、旭化成社製）が挙げられる。 BMM は銅アンモニア法による再生セルロースを原料とした多孔性中空糸である。 BM Mモジュールとして、膜となる周壁が 1 0 0層以上の多重層構造であるブラノバ 1 5、ブラノバ 3 5、ブラノバ 7 5 (いずれも商品名、旭化成社製）を使用することができる。

このモジュールは上記多孔性中空糸と、高圧蒸気滅菌可能なポリ力一ボネ一ト製のプラスチック容器、及びこれらを一体化するポリゥレタン系接着剤により構成されている。このモジュールは、高圧蒸気滅菌されており、モジュール内には注射用蒸留水が充填されている。ブラノバを構成する各種材料の安全性は、日本薬局方の定める方法により確認されている（BMM商品説明書より）。

濾過する際の蛋白質含有溶液の温度は、 1〜5 0 °Cであり、好ましくは 2〜 4 0°Cである。濾過圧力は 0. 1〜 1 k g f Zcm² であり、好ましくは、 0. 1 〜0. 9 k g f /cm² である。蛋白質含有溶液の蛋白質濃度を 0. 0 1〜3 0 wZv%、好ましくは 0. 0 5〜2 8 w/v%とすることにより、効率よく濾過することができる。濾過処理の方法としては、溶液にひずみ速度を与えながら濾過するクロスフ口一濾過法（循環式）、溶液にひずみ速度を与えずに濾過するデッドエンド濾過法 (非循環式）がある。また、上記条件の濾過処理前に、蛋白質含有水溶液を、予備的に上記条件以外の中空糸濾過、または平膜状の濾過膜などを用いて予備濾過処理を行うことが好ましい。

加熱処理、紫外線照射処理、界面活性剤による処理及びウィルス除去膜処理の各処理は、蛋白質の精製度にかかわらず、いずれの製造工程においても、任意の順序にて行うことができる。

本発明の製造方法により、特にパルボウイルスのように熱に耐性で、界面活性剤で不活性化されず、 3 5 n mの膜処理で除去されないようなウィルスでも不活化または除去することができる。

本発明の製造方法において上記各処理の組合せとしては、液状加熱処理一紫外線照射処理一ゥィルス除去膜処理、界面活性剤による処理一紫外線照射処理一乾燥加熱処理、界面活性剤による処理一ウィルス除去膜処理一乾燥加熱処理、界面活性剤による処理一紫外線照射処理ーゥィルス除去膜処理が最適なものとして推奨される。なお、これらの組合せは処理の順序を限定的に示すものではない。本発明方法により、ウィルスの不活化又は除去処理を行った後、又は行う前に各所望の蛋白質に応じて精製処理を行ってもよい。精製はィォン交換クロマトグラフィ一、ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、塩濃度分画技術、 P E G (ポリエチレングリコール）分画、アルコール分画などの方法を適宜選択し、利用することにより行われる。

本発明の製造方法により得られる組成物は、感染性ウィルスおよび所望の蛋白質の変性体を実質的に含まず、総蛋白質のうち有効な所望の蛋白質が 9 0 %以上含まれている組成物である。より好ましくは、総蛋白質のうち有効な所望の蛋白質が 9 5 %以上含まれている組成物である。また、本発明の組成物は、好ましくは、ウィルスの核酸を実質的に含まない組成物である。

有効な所望の蛋白質とは、変性しておらず、処理前と同等の生物学的活性を保持している蛋白質である。有効な所望の蛋白質が 9 0 %以上とは、総蛋白質当たりの有効な所望の蛋白質の重量％が9 0 %以上であることをいう。有効蛋白質重量％は、高速液体クロマトグラフィー（HPL C) 分析やセルロースアセテート電気泳動法などにより測定することができる。

有効な所望の蛋白質は、 TSK— G 3 0 0 0 SWXLカラムを装着し、波長 2 8 0 nmの吸光度による H PL C分析で、処理前と同じところにピークを有する。また、セルロースアセテート膜電気泳動法又は S D Sポリアクリルアミドゲル電気泳動法分析では、処理前と同位置にバンドが観察される。

所望の蛋白質の変性体とは、各種処理により変性し活性を失った蛋白質である。各種処理により、例えば、蛋白質の分子量が変化して、ダイマー、ポリマーや分解物が生じる。これら変性体が投与されると、新たな抗原性物質による抗体産生等、望ましくない作用が生じるので変性体を実質的に含有していない組成物を得ることは、医薬品製剤の製造においては重要なことである。

本発明の実質的に変性体を含まない組成物は、安定化剤の添加によるウィルス不活化処理、変性体が生じない条件でのウィルス不活化または除去処理、および、ゥィルス不活化または除去処理前後の各種精製処理を組み合わせることにより得ることができる。

所望の蛋白質の変性体は、 HPLCにより、所望の蛋白質のピーク展開位置の高分子側又は低分子側に単一又は複数のピークとして観察される。また、電気泳動では、所望の蛋白質の泳動位置より陽極側あるいは陰極側に単一もしくは複数のバンドとして観察される。

本発明の組成物では、 HPL Cでは所望の位置にのみピークが認められ、電気泳動では、所望の位置にのみバンドが観察されることより、実質的に変性した蛋白質は含有されていない。

ウィルスの核酸を実質的に含有しないとは、 PCR (ポリメラーゼチヱ一ンリアクション）を用いた方法などで核酸の検出を試みても、核酸が検出限界以下であることをいう。 P CRは、 Transfusion Vol.32, p.824-828(1992) に記載される方法などが用いられる。 P C R法は非常に感度の良、核酸の検出方法であり、もし組成物中にウィルス核酸が夾雑していればその核酸の検出が可能である。本発明の所望の蛋白質を含有する組成物は、そのまま製剤として使用してもよいし、慣用の方法により液状製剤または乾燥製剤としてもよい。その際には、通常医薬品に用いられる薬理的に許容される添加剤、例えば、防腐殺菌剤、キレート剤、粘稠剤、等張化剤など、又は製薬上必要な成分を適宜配合してもよい。実施例 ·実験例

以下、本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれらによつて何ら限定されるものではない。実施例 1 (血液凝固第 VI II因子含有組成物）

正常ヒト血漿を凍結融解して得られたクリオプレシピテ一トをへパリン水溶液で溶解し、水酸化アルミニウムゲルを 2 vZv%添加し、遠心分離により脱プロトロンビン溶液を得た。次いで、 TNB Pを 0. 3

及び丁 6 e n 80 を 1 wZv%になるように添加し、 3 0 °Cにて 6時間の界面活性剤処理を行った o

グリシンを 2Mになるように添加し、遠心してフィプリノゲンを沈澱させて除去し、得られた上清に塩化ナトリウムを 1. 75 Mになるように添加し第 VIII因子を沈澱として回収した。回収した沈澱を 1 M塩化ナトリウム含有 20 mMトリス塩酸緩衝液に溶解し、液層の厚みを 0. 5 mmにして、波長 2 0 0〜 320 n m、照射エネルギー量 50 m J o u 1 e/cm² の紫外線照射処理を行った。この溶液をゲル濾過クロマトグラフィ一によつて第 VIII因子を精製すると共に、残存している TNB P及び Twe e n 8 0を除去した。こうして得られた第 VI II因子を再度グリシン分画、塩化ナトリウム分画を行って沈澱させ、溶解透析後

、所定の濃度になるように調整し、バイアルに小分けし、凍結乾燥した。凍結乾燥された第 VIII因子含有組成物を、 6 0°Cにて 72時間の乾燥加熱処理に付して、血液凝固第 VII I因子含有組成物を得た。

得られた血液凝固第 VI 11因子含有組成物の比活性は 30単位 Zm g蛋白質以上であり、また血液凝固第 VI II因子の変性体を実質的に含んでいなかった。実施例 2 (血液凝固第 IX因子含有組成物）

正常ヒト血漿に陰イオン交換樹脂（DEAE—セフアデックス）を投入し、第 IX因子をゲルに吸着させた後、 0. 1 5 M塩化ナトリウムを含む緩衝液でよく洗浄し、 0. 5 M塩化ナトリウムを含む緩衝液で第 IX因子を溶出させた。次いで、 TNB Pを 0. 3 ^^ノ ^及び丁 e e n 80を 1 wZv%になるように添加し、 30°Cにて 6時間の界面活性剤処理を行った。処理された第 IX因子溶液に、再度陰イオン交換樹脂（DEAE—セフアデックス）を投入し、第 IX因子を吸着させ、洗浄することにより TNBP及び Twe e n 80を洗液に除去した。

次いで、第 IX因子溶液の液層の厚みを 0. 5 mmにして、波長 20 0〜320 nm、照射エネルギー量 1 50 m J o u 1 e/cm² の紫外線照射処理を行った ο

0. 5 M塩化ナトリウムを含む緩衝液で第 IX因子溶液の蛋白濃度を 0. 1〜1 . 0 w/v%に調整し、 BMM膜（1 5 ± 2 nm) を用いて、温度 2〜 10 °C、濾過圧力 0. 5 k g f Zcm² にてデッドエンド濾過法によりウィルス除去膜処理を行った。

膜処理された第 IX因子溶液を所定のィォン強度及び力価に調整し、小分けし、凍結乾燥し、さらに 60°Cにて 72時間の乾燥加熱処理を行うことにより、血液凝固第 IX因子含有組成物を得た。

得られた血液凝固第 IX因子含有組成物の H P L C分析による有効な血液凝固第 IX因子複合体の重量％は 95%であり、血液凝固第 IX因子複合体の変性体を実質的に含んでいなかった。実施例 3 (血液凝固第 IX因子含有組成物）界面活性剤処理の後の陰イオン交換樹脂（DEAE—セフアデックス）処理の代わりに、第 IX因子に対するモノクロ一ナル抗体を結合させた樹脂に第 IX因子を結合させた以外は実施例 2と同様の方法により血液凝固第 IX因子含有組成物を得た。

得られた血液凝固第 IX因子含有組成物の HP L C分析による有効な血液凝固第 IX因子の重量％は 9 5%であり、血液凝固第 IX因子の変性体を実質的に含んでいなかった。実施例 4 (トロンビン含有組成物）

正常ヒト血漿由来のコーンの F r. II + III 画分又は F r. Ill 画分を 0. 1 5M塩化ナトリウム溶液で溶解した血液凝固第 II因子（プロトロンビン）溶解液に、トロンボプラスチン（胎盤抽出液）を添加して、プロトロンビンをトロンビンに変換した。次いで、 TNB Pを 0. 3 wZv%及び Twe e n 80を 1 v%添加し、 30°Cにて 6時間の界面活性剤処理を行った。

そして、陽イオン交換樹脂（SP—セフアデックス）でトロンビンを吸着し、 0. 1 5 M塩化ナトリウム溶液でよく洗浄した後、 0. 5M塩化ナトリウムを含む緩衝液でトロンビンを溶出した。

0. 5 M塩化ナトリウムを含む緩衝液で卜ロンビンの濃度を 0. 5wZv%に調整し、 B MM膜（1 5 ± 2 n m) を用いて、温度 2〜 1 0。C、濾過圧力 0. 5 k g f /cm² にてデッドエンド濾過法によりウィルス除去膜処理を行った。こうして得られたトロンビン溶液を所定のイオン強度、力価に調整し、小分けし、凍結乾燥した後、 60°Cにて 72時間の乾燥加熱処理を行うことにより、トロンビン含有組成物を得た。

得られたトロンビン含有組成物の HPLC分析による有効なトロンビンの重量 %は 95%であり、トロンビンの変性体を実質的に含んでいなかった。実施例 5 (フイブリノゲン含有組成物）正常ヒト血漿由来のコーンの F r. I画分を生理食塩水で溶解し、 TNBPを 0. 3 wZv%及び Twe e n 80を 1 wZv%になるように添加し、 30 にて 6時間の界面活性剤処理を行った。そして、グリシン一塩化ナトリウム分画又はエタノール分画にて、 TNB P及び Tw e. e n 8 0を上清に除去し、フイブリノゲンを沈澱させて回収した。

次いで、回収されたフイブリノゲン溶液の液層の厚みを 0. 5mmにして、波長 20 0〜320 nm、照射エネルギー量 1 0 OmJ o u 1 e/cm² の紫外線照射処理を行った。

再度グリシン—塩化ナトリウム分画又はエタノール分画を行い、フイブリノゲンを沈澱させて回収した。こうして得られたフィプリノゲンの沈澱を所定の濃度に溶解し、小分けし、凍結乾燥した後、 6 0°Cにて 72時間の乾燥加熱処理を行うことにより、フイブリノゲン含有組成物を得た。

得られたフィプリノゲン含有組成物の有効なフィプリノゲンの重量％は 90 % であり、フイブリノゲンの変性体を実質的に含んでいなかった。実施例 6 (ヒト尿性トリプシンインヒビタ一（HUT I) 含有組成物）

原料として、 J. Lab. C l i n. Me d. , 7 9， 49 1, ( 1 972 ) に記載された方法に準じて得られたヒト新鮮尿を用い、 HUT I溶液を調製した。 HUT I溶液の濃度は約 3 wZv%とした。次いで、この HUT I溶液の pH を 5. 5に調整し、 60°Cにて 1 0時間の液状加熱処理を行った。

液状加熱処理された HUT I溶液に対して、 BMM膜（1 5 ±2 nm) を用いて、温度 1 0〜1 5°C、濾過圧力 0. 8 k g f Zcm² にてデッドエンド濾過法によりウィルス除去膜処理を行った。

次に、 H U T I溶液の液層の厚みを 0. 5 mmにして、波長 200〜 3 20 n m、照射エネルギー量 1 O OmJ ou l eZcm² の紫外線照射処理を行った。力価調整及び除菌濾過を行い、 HUT I溶液を分注して、 HUT I含有組成物を得た。得られた HUT I含有組成物の HP L C分析による有効な HUT Iの重量％は 95%であり、 HUT Iの変性体を実質的に含んでいなかった。実施例 7 (ヒト尿性トリプシンインヒビター（HUT I) 含有組成物）

実施例 6の製造方法における B MM膜処理を紫外線照射処理の後で行った以外は実施例 6と同様の方法により、 HUT I含有組成物を得た。

得られた H U T I含有組成物の HPLC分析による有効な HUT Iの重量％は

95 %であり、 HUT Iの変性体を実質的に含んでいなかった。実施例 8 (アルブミン含有組成物）

正常ヒト血漿からコーンの冷エタノール分画法により得られた第 V画分を精製して純度 96 %以上のアルブミン画分を得た。これをアルブミン濃度 5 w/v% 溶液に調製し、 60°Cにて 1 0時間の液状加熱処理を行った。

液状加熱処理された溶液に対して、 BMM膜（35±2 nm) を用いて、温度 2〜1 0°C、濾過圧力 0. 5 k g f /cm² にてデッドエンド濾過法によりウイルス除去膜処理を行った。

濾過処理終了後、濾液の液層の厚みを 0. 5 mmにして、波長 200〜 3 20 nm、照射エネルギー量 50 mJ o u 1 e/cm² の紫外線照射処理を行った。この液を濃縮して、アルブミン含有組成物を得た。

得られたアルブミン含有組成物の HP L C分析による有効なアルブミンの重量 %は 95%であり、アルブミンの変性体を実質的に含んでいなかった。実施例 9 (アンチトロンビン ΙΠ 含有組成物）

正常ヒト血漿からコーンの冷エタノール分画法で得られた F r. IV— 1画分 1 0 k gを生理食塩水 1 00 Lに懸濁し、この液を pH6. 5に調整し、 PEG40 00を 1 2. 5 wZv%になるように加え、生じた沈澱を遠心分離して除き、さらに PEG4000を 25 w/v%になるように加え、生じた沈澱を遠心分離して回収し

この沈澱を冷生理食塩水約 20 Lに溶解し、予め生理食塩水で調製されたへパリンセファロ一スのカラムへ注入し、アンチトロンビン III をカラムに吸着させた。このカラムを 0. 4 Mの塩化ナトリウム溶液で洗浄した後、 2. 0Mの塩化ナトリウム溶液をカラムに流して溶出部分を回収した。

次いで、ショ糖（溶液 1 mL当たり 1 g) 及びクェン酸ナトリウム（溶液 1 m L当たり 0. 3 g) を加え、 pH7. 8に調整した後、 6 0°Cにて 1 0時間の液状加熱処理を行い、続いて 0. 9 w/v%塩化ナトリウム溶液に対し一夜透析を行いつつ濃縮して、アンチトロンビン ΙΠ の lw/v%水溶液を得、必要に応じて濾過又は遠心分離を行って澄明な液とした。

このアンチトロンビン III の 1 w/v%水溶液にマンニト一ノレ 2 wZv%とクェン酸ナトリウム 0. 5 2 wZv%を加え、塩化ナトリウムが 0. 5w/v%になるように少量の冷蒸留水で希釈し、 1 Nの水酸化ナトリウムで p H 7. 6に調整した。 BMM膜（1 5 ±2 nm) を用いて、温度 2〜 1 0 °C、濾過圧力 0. 5 k g f /cm² にてデッドエンド濾過法によりウィルス除去膜処理を行った。濾過処理終了後、濾液の液層の厚みを 0. 5 mmにして、波長 2 0 0〜320 nm、照射エネルギー量 50 m J 0 u 1 e/c m² の紫外線照射処理を行った。滅菌した 0. 2 /mのメンブレンフィルタ一で除菌濾過し、 500単位づっ分注し、凍結乾燥を行って、アンチトロンビン III 含有組成物を得た。

得られたアンチトロンビン III 含有組成物の HP L C分析による有効なアンチトロンビン III の重量％は 95 %であり、アンチトロンビン III の変性体を実質的に含んでいなかった。実施例 1 0 (アンチトロンビン III 含有組成物）

実施例 9の製造方法における B MM膜処理を紫外線照射処理の後で行った以外は実施例 9と同様の方法により、アンチトロンビン III 含有組成物を得た。得られたアンチトロンビン III 含有組成物の HP L C分析による有効なァンチトロンビン ΙΠ の重量％は 9 5 %であり、アンチトロンビン III の変性体を実質的に含んでいなかった。実施例 1 1 (ハブトグロビン含有組成物）

正常ヒト血漿からコーンの低温エタノール法で得られた F r. IV画分 3 0 k g を生理食塩液 1 2 0 Lに懸濁し、この液を pH 8. 0に調整し、 PEG4000を 1 2. 5 w/v%になるように加え、生じた沈澱を除き、さらに pH 6. 5に調整した後、 PEG4000を 2 5 w/v%になるように加え、生じた沈澱を遠心分離して回収した。この沈澱 1 k gに注射用水 4 Lを加えて抽出溶解した後、硫酸アンモニゥムを 2 4 wZv%になるように添加し、 pH 4. 6に調整して生じた沈澱を除き、さらに pH 7. 0の条件下で硫酸アンモニゥムを 3 0 w/v%になるように加えて生じた沈澱を採取した。

得られた沈澱を注射用水に溶解し、透析後、 2 0 w/v%になるようにグリシンを添加して溶解した。次いで、 6 0°Cにて 1 0時間の液状加熱処理を行った。加熱処理した液は、 0. 0 5Mのリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7. 0) にて透折した後、陰イオン交換樹脂（DEAE—セフアデックス A— 5 0) をあらかじめ同一液で平衡化したものにハプトグロビンを吸着させ、平衡化液と同一液にて洗浄後、 0. 1 3 Mの N a C 1を含む 0. 0 5 Mリン酸ナトリウム緩衝液（ p H 7. 0) にてハプトグロビンを溶離した。溶離液を限外濾過膜で処理した後、生理食塩液で透析し、メンブレンフィルタ一で清澄濾過してハプトグロビン溶液を得た。

このハプトグロビン溶液（5 wZv%) に対して、 BMM膜（3 5 ± 2 nm) を用いて、温度 3 0〜4 0°C、濾過圧力 0. 5 k g f Zcm² にてデッドエンド濾過法によりウイルス除去膜処理を行った。

濾過処理終了後、濾液の液層の厚みを 0. 5 mmにして、波長 2 0 0〜 3 2 0 nm、照射エネルギー量 1 0 OmJ o u 1 e/cm² の紫外線照射処理を行い、ハプトグロビン含有組成物を得た。得られたハプトグロビン含有組成物をセルロースァセテ一ト電気泳動分析した結果、有効なハプトグロビンの重量％は 95%であり、ハプトグロビンの変性体を実質的に含んでいなかった。実施例 1 2 (ハブトグロビン含有組成物）

実施例 1 1の製造方法における BMM膜処理を紫外線照射処理の後で行い、 B MM膜（35 ± 2 nm) を用いた以外は実施例 1 1と同様の方法により、ハプトグロビン含有組成物を得た。

得られたハプトグロビン含有組成物をセルロースァセテ一ト電気泳動分析した結果、有効なハプトグロビンの重量％は 9 5%であり、ハプトグロビンの変性体を実質的に含んでいなかった。実施例 1 3 (へパリンコファクタ一 II (HCII) 含有組成物）

正常ヒト血漿からコーンの冷エタノール分画で得られた F r. II + III 上清画分を一 6°C〜一 4 °Cでへパリンァフィ二ティ一樹脂カラムに通した後、 0. 4M の塩化ナトリウムを含む 0. 0 1 Mのクェン酸ナトリウム溶液（pH 6. 8) を用いて HC IIを溶出させた。この溶出画分を限外濾過により脱塩及び濃縮した H CII溶液に、 TNBPを 0. 3 w/v%及び Tw e e n 80を 1 w/v%になるように添加し、 3 0°Cにて 6時間の界面活性剤処理を行った。

そして、塩濃度を調整した HCII溶液を陰イオン交換樹脂（DEAE—セファデックス）カラムに通し、 HCIIを吸着させ、 0. 1 0Mの塩化ナトリウムを含む 0. 0 1 Mのクェン酸ナトリウム溶液（pH 7. 2) で溶出させた。さらに、脱塩及び濃縮し、 HCII溶液を陽イオン交換樹脂（SP—トヨパール）に通し、 0. 1 5 Mの塩化ナトリウムを含む 0. 0 1 Mのクェン酸ナトリウム溶液（ p H 7. 2) で溶出させた。この溶出液を限外濾過により濃縮した後、ゲル濾過し、精製 HC II溶液を得た。

この精製 HCII溶液を 1 w7v%に調整し、 BMM膜（1 5±2 nm) を用いて、温度 3 0〜4 0°C、濾過圧力 0. 5 k g f /cm² にてデッドエンド濾過法によりウィルス除去膜処理を行った。

濾過処理終了後、濾液の液層の厚みを 0. 5 mmにして、波長 2 0 0〜3 2 0 nm、照射エネルギー量 1 5 0 m J 0 u 1 e/c m の紫外線照射処理を行って、 HC II含有組成物を得た。

得られた HC II含有組成物の HP LC分析による有効な HC IIの重量％は 9 7 %であり、 H C Πの変性体を実質的に含んでいなかつた。実施例 1 4 (へパリンコファクタ一 II (HCII) 含有組成物）

実施例 1 3の製造方法における B MM膜処理を紫外線照射処理の後で行つた以外は実施例 1 3と同様の方法により、 HCII含有組成物を得た。

得られた H C II含有組成物の H P L C分析による有効な H C IIの重量％は 9 7

%であり、 H C IIの変性体を実質的に含んでいなかった。実験例 1 (ウィルス不活化又は除去効果の確認）

実施例 1〜実施例 1 4と同様にウィルス不活化処理前の試料を調製した。これらの各々の試料に、モニタ一ウィルスとしてワクチニァウィルス、ムンプスウイルス、単純疱疹ウィルス、エコーウィルス、パルボウイルス及び H I Vを各々 1 0⁵ 感染価以上となるように添加し、各実施例記載のウィルス不活化又は除去処理を行って、各処理後の試料についてウィルス感染価を測定した。

ウィルス感染価の測定は、ワクチニァウィルス、ムンブスウィルス及び単純疱疹ウィルスについてはプラーク形成法（PFU測定法）にて、エコーウィルス、パルボウイルス及び H I Vについては C P E形成法（TC I Dso測定法）にて行つた。

各ウイルスについて、各ウイルス不活化又は除去処理の前後におけるウィルス感染価の減少率を求め、各実施例における全工程にわたるウィルス感染価を算出し、各最終組成物におけるウィルス感染価を求めて、ウィルス不活化又は除去効果の確認を行った。その結果、各ウィルス感染価はいずれも検出限界以下であり、ウィルス不活化又は除去効果が確認された。実験例 2 (ウィルス核酸の検出）

各実施例で得られた所望の蛋白質を含有する組成物中に C型肝炎ウィルス（H C V ) の核酸が含まれていないことを確認した。核酸の検出は、ポリメラ一ゼチヱーンリアクション（P C R ) 測定方法によって行った。 P C R測定方法は、 Tr ansfus i on Vol. 32, p. 824-828(1992) に記載される方法に従った。

この結果、各組成物において、 H C Vの核酸はいずれも検出限界以下であった。よって、各実施例で最終的に得られた組成物は H C Vの核酸を実質的に含まない組成物である。産業上の利用可能性

本発明の製造方法によれば、蛋白質の活性を損失することなく、効率的にウイルスが不活化又は除去され、感染性ウィルス及び所望蛋白質の変性体を実質的に含まない所望の蛋白質を含有する組成物を得ることができる。たとえば、熱に耐性で、界面活性剤処理にも強く、小さいウィルスのため通常の膜処理では除去できないようなウィルスも、本発明の製造方法により効率良く不活化又は除去される。よって、安全性の高い蛋白質含有製剤の工業的製造方法として極めて好ましい方法である。特に、未知のウィルス夾雑が危惧されるような蛋白質含有組成物から、所望の蛋白質を含有する製剤を製造するのに有用である。

また、本発明の所望の蛋白質を含有する組成物は、感染性ウィルス及び所望蛋白質の変性体を実質的に含まず、総蛋白質のうち有効な所望の蛋白質が 9 0 %以上含まれていることを特徴とするものであるから、本発明の組成物より医薬品として安全性および品質の高い蛋白質含有製剤を提供できる。本発明は日本で出願された平成 9年特許願第 2， 1 5 5号を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲

1. ウィルス夾雑の可能性のある蛋白質含有組成物に、加熱処理、紫外線照射処理、界面活性剤による処理及びウィルス除去膜処理のうち少なくとも三種の処理を行うことを特徴とする、感染性ウィルスおよび所望の蛋白質の変性体を実質的に含まない所望の蛋白質を含有する組成物の製造方法。

2. 少なくともウィルス除去膜処理を行うことを特徴とする請求の範囲第 1項記載の製造方法。

3. 加熱処理が、液体状態の蛋白質含有組成物を 3 0〜6 5°Cにて 1 0分間〜 2 0時間処理するものである、請求の範囲第 1項記載の製造方法。

4. 加熱処理が、乾燥状態の蛋白質含有組成物を 6 0 ~ 1 0 0°Cにて 2 0時間〜 1 0 0時間処理するものである、請求の範囲第 1項記載の製造方法。

5. 紫外線照射処理が、波長 1 8 0〜3 5 0 nmにある紫外線にて、照射エネルギ一量 1〜5 0 OmJ o u 1 eZcm² を液体状態の蛋白質含有組成物に対して照射する処理である、請求の範囲第 1項記載の製造方法。

6. 界面活性剤による処理が、ポリソルベート系界面活性剤による処理である、請求の範囲第 1項記載の製造方法。

7. トリアルキルホスフェートを併用することを特徴とする請求の範囲第 6項記載の製造方法。

8. ウィルス除去膜処理が、多孔性中空糸膜を用いた濾過処理である、請求の範囲第 1項または第 2項記載の製造方法。

9. 所望の蛋白質がフイブリノゲンであり、界面活性剤による処理、紫外線照射処理及び乾燥加熱処理を行うことを特徴とする請求の範囲第 1項記載の製造方法

1 0. 所望の蛋白質がへパリン · コファクター IIである請求の範囲第 1項記載の製造方法。

1 1. 加熱処理、紫外線照射処理、界面活性剤による処理及びウィルス除去膜処理のうち少なくとも三種の処理がなされ、感染性ウィルス及び所望の蛋白質の変性体を実質的に含まず、総蛋白質のうち有効な所望の蛋白質が 9 0 %以上含まれていることを特徴とする所望の蛋白質を含有する組成物。

1 2. ウィルスの核酸を実質的に含まないことを特徴とする請求の範囲第 1 1項記載の組成物。

1 3. 三種の処理が、界面活性剤による処理、紫外線照射処理及び乾燥加熱処理であり、所望の蛋白質がフイブリノゲンである請求の範囲第 1 1項または第 1 2 項記載の組成物。

1 4. 所望の蛋白質がへパリン ' コファクタ一 IIである請求の範囲第 1 1項または第 1 2項記載の組成物。