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WO1998018487A1 - Agent prophylactique/therapeutique - Google Patents

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WO1998018487A1
WO1998018487A1 PCT/JP1997/003978 JP9703978W WO9818487A1 WO 1998018487 A1 WO1998018487 A1 WO 1998018487A1 JP 9703978 W JP9703978 W JP 9703978W WO 9818487 A1 WO9818487 A1 WO 9818487A1
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WO
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fas
disease
cells
antibody
therapeutic agent
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Application number
PCT/JP1997/003978
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shigekazu Nagata
Takehiro Yatomi
Takashi Suda
Original Assignee
Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
Osaka Bioscience Institute
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to a prophylactic / therapeutic agent or a cell apoptosis inhibitor and an organ preservative for diseases comprising a Fs antagonist as an active ingredient.
  • Fas is a monoclonal antibody obtained by immunizing a mouse with human fibroblasts, such as a Fas antibody (Yonehara S.), J. Exp. Med., Vol. 747-1756, 1989), and is a cell surface antigen that transmits apoptotic signals to cells.
  • the Fas gene has been cloned by Itoh N. et al.
  • Fas is a protein on the cell membrane of about 45 kD, and from its amino acid sequence, it belongs to the TNF receptor family. (Cell, Vol. 66, pp. 233-243, 1991).
  • the mouse Fas gene is also cloned (Watanabe-Fukunaga R. et al., J. Immunol., 148, 1274-1279, 1992), and FasA is expressed in mouse thymus, liver, It was confirmed to be expressed in lung, heart and ovary.
  • Human Fas ligand is a polypeptide reported by Nagata et al. As a biomolecule that induces apoptosis in cells expressing Fas ( ⁇ omohir 0 Takahashi et al., Internati al al. Immunology, Vol. 6, pp. 1567-1574, 1994). Human Fas ligand is a type II membrane protein belonging to the TNF family and having a molecular weight of about 40 kD, and is thought to form a trimer in vivo, similar to TNF (Masato Tanaka et al. EMBO J ournal, Vol. 14, Vol. 1, pp. 119-195, pp. 1995).
  • human Fas ligand is rat Fas ligand (Takashi Suda et al., Ce11, 75, 1169-1-1178, 1993) and mouse Fas ligand.
  • Ligand Tomohiro Takashih et al., Cell, 76, 969-9776, 1994
  • rat Fas ligand and mouse Fas ligand can also recognize human Fas and induce apoptosis.
  • Fas intracellular signal transduction of apoptosis via Fas
  • Fas which interacts with the intracellular region of Fas, particularly a region called death domain (Deathdoma in) to generate a signal.
  • thiol protease associated with interleukin-1 converting enzyme contributes to the signaling of apoptosis via Fas. It is suggested that there is a possibility.
  • Fas-mediated apoptosis is associated with various diseases and physiological phenomena.
  • abnormalities of Fas-mediated apoptosis may be involved in the reduction of T lymphocytes in AIDS patients, hepatocellular death in viral fulminant hepatitis, and certain autoimmune diseases. And You.
  • Fa s / Fas ligand system may also play a role other than apoptosis, such as acting on neutrophils and acting on pro-inflammatory activity (Nagagaki N Et al., Clinical Immunity Vol. 28, pp. 667-675, 1996).
  • SIRS systemic inflammatory response
  • FasZFasL system Fas / Fas ligand system
  • Ischemic reperfusion injury is found in almost all tissues and organs and is involved in various diseases. It is also a problem during organ preservation and transplantation. In particular, of ischemia / reperfusion injury accompanying liver, heart or kidney infarction, surgery or transplantation, tissue damage in each organ (for example, cell necrosis) and dysfunction in each organ (for example, arrhythmia in the heart, etc.) ) Is serious In some cases, this can lead to death of the individual, which is a major social problem. In various organ disorders or ischemia-reperfusion injury, IL-18 is known to be produced and secreted from an early stage to a late stage. It is also known that apoptosis occurs during organ preservation and reperfusion during organ transplantation.
  • Endotoxins in bacterial infections induce endogenous cytosine production in living organisms, for example, endotoxinemia, endotoxin shock in sepsis, etc., and various organs such as liver. (D Inarello CA et al., J. America and Medicine, Vol. 269, pp. 1829, 19993), sometimes causing serious illness. During this process, apoptosis is observed experimentally. Although it has been reported that the Fas / FasL system may be involved in some way, it is not clear how the FazZFasL system is involved in these disorders.
  • NO may be involved in atherosclerotic plaque remodeling because it suppresses apoptosis by NO and NO induces the expression of Fas (Fukuo K. et al., Hypertension, 27, 823-8 26, 1 996).
  • Fas Fas
  • apoptosis of cardiomyocytes occurs, and expression of Fas increases at that time (Lab. Invest., 73, 77 1-787, 1995) and
  • a rat myocardial infarction model the majority of myocardial cell death is apoptosis, and it has been reported that the expression of Fas increases more than 100-fold at that time (Lab. Invest., 74, 86-107, 1996).
  • Fas was implicated in these heart diseases. Therefore, there is no data on whether Fas promotes or suppresses cardiomyocyte apoptosis in heart disease, and there is no data in the above reports. It was still unclear whether Fas was directly involved. Therefore, to date, there is no known therapeutic agent or method for treating heart disease by suppressing Fas-mediated apoptosis.
  • Apoptosis is also implicated in renal disease, and it has been reported that Fs mRNA expression is increased in an experimental renal ischemia-reperfusion injury model (Hakuno N. et al., Endocrinology 1). 37, 1938-1948, 1996). It is not clear how the FazZFasL system is involved in renal disease.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • GVH reaction graft-versus-host reaction
  • donor or graft-derived lymphocytes cause a transplant immune response to host tissue antigens. It is a disease caused by GVHD occurs after bone marrow transplantation such as incompatible bone marrow transplantation or bone marrow transplantation for congenital immunodeficiency disease, GVHD occurs after organ transplantation, and GVHD occurs after blood transfusion such as massive blood transfusion for immunocompromised hosts.
  • GVHD is associated with organ or tissue damage based on the GVH response, clinically including wasting such as diarrhea, weight loss and slimming, skin eruption, splenomegaly, and impaired liver function.Histologically, bone marrow and lymphoid tissues It is characterized by symptoms including disintegration and intestinal villous atrophy.
  • GVHD GVHD-induced apoptosis
  • Fas-mediated apoptosis apoptosis
  • apoptosis particularly Fas-mediated apoptosis
  • epithelial cell death of the intestine, skin and tongue has been reported to be mainly apoptosis (An iti C. Gi 11 iam et al., J. Invest. to l., Vol. 107, 377-383, pp. 996).
  • spleen lymphocytes from control mice with normal Fas ligand were used as donors and spleen lymphocytes from g1d mice that were mutant mice of Fas ligand. It has been reported that the survival time does not change when skin is used as a donor, but skin and liver damage hardly occurs (Matthew B. Barkerb, et al., J. Exp. Med., 183). Vol. 2645-2659, 1996), although it is suggested that Fas-mediated apoptosis may be involved in GVHD, but Fas-mediated apoptosis is involved in GVHD lethality. No conclusion has been reached as to whether or not.
  • splenic lymphocytes derived from 1d mice have a mechanism other than Fas ligand as an alternative mechanism for Fas ligand deficiency. It is speculated that changes in the expression levels of various factors (for example, parolin, TNF, etc.) may affect the GVHD response, and the results obtained may not necessarily be limited to the effects of Fas ligand deficiency. is there. Therefore, it was unclear how Fas-mediated apoptosis is involved in GVHD, or the possibility of a specific inhibitor of Fas-mediated apoptosis as a GVHD therapeutic.
  • Non-specific immunity such as cyclosporin A
  • cyclosporin A as a preventive or therapeutic agent for GVHD
  • non-specific immunosuppression causes side effects such as infections.
  • therapeutic agent or method for GVHD by inhibiting Fas-mediated apoptosis.
  • therapeutic agent or treatment for GVHD by selective immunosuppression.
  • the drugs on the market are mainly for thrombolysis or circulation improvement, and there are no drugs available that directly prevent or treat the injury.
  • endotoxemia and sepsis for example, steroid-protease inhibitors are used for shock, but there are no drugs that directly prevent or treat organ damage at present.
  • Drugs used for diseases based on organ damage are mainly symptomatic treatments, and drugs that prevent or cure curative diseases based on tissue or organ damage are available. Absent. In addition, no widely effective preventive or therapeutic drug has been obtained for various tissues or organs.
  • An object of the present invention is to provide a medicament as a prophylactic / therapeutic agent and an organ preservative agent for a disease by a new mechanism of action, comprising a Fas gonist, and a therapeutic method. More specifically, the present invention provides a preventive / therapeutic agent for a disease associated with Fas, an organ preservative, and a method for treating, which comprise a Fas antagonist active ingredient. Disclosure of the invention
  • the present inventors have intensively studied the function of the Fas / Fas ligand system and the role of apoptosis mediated by the Fas / Fas ligand system in various diseases. Improve pathology in various disease models by inhibiting the action of ligand system, especially Fas / Fas ligand system-mediated apoptosis, such as death of cardiomyocytes during ischemia-reperfusion, allogeneic bone marrow transplantation
  • the present inventors have found that the onset of GVHD and damage to organs caused by endotoxin are suppressed by an antagonist that inhibits apoptosis via Fas, and thus completed the present invention.
  • the present invention relates to a disease containing a Fas antagonist as an active ingredient, more specifically a disease involving the Fas / Fas ligand system, and particularly a medicament for treating a disease involving apoptosis via Fas.
  • a medicament for prevention and prevention or treatment that is, a prophylactic and therapeutic agent.
  • the target diseases include (1) heart disease, preferably ischemic heart disease, particularly myocardial infarction, heart failure or cardiac ischemia reperfusion injury, (2) renal disease, preferably renal failure, renal ischemia, ischemia Blood reperfusion injury or acute renal insufficiency, (3) GVHD, (4) ischemia or ischemia reperfusion injury or a disease based thereon, particularly a disease based on ischemia reperfusion injury in the heart, kidney or liver, and Ischemia-reperfusion injury associated with surgery or transplantation, or ischemia-reperfusion injury after thrombolytic therapy or vascular reconstruction surgery or a disease based thereon (5) Organ damage due to bacterial endotoxin (endotoxin), endotoxemia Disease, sepsis, or associated organs or tissues, particularly liver damage or liver failure.
  • endotoxin endotoxemia Disease
  • sepsis or associated organs or tissues
  • a Fa antagonist is contained as an active ingredient. It is a characteristic organ preservative.
  • the present invention also provides an apoptosis inhibitor containing a Fas antagonist as an active ingredient.
  • the Fas antagonist is preferably at least one of an anti-Fas ligand antibody, an anti-Fas antibody and a Fas derivative, and in particular, the anti-Fas ligand antibody is a humanized anti-Fas ligand. Preferably, it is an antibody.
  • the present invention provides a novel use of a Fs antagonist.
  • a Fas antagonist is a substance having an inhibitory or inhibitory action. Specifically, a FasZFas ligand-based biological action, in particular, it inhibits or inhibits Fas-mediated cell apoptosis. It is a substance that inhibits.
  • FIG. 1 is a view showing the cDNA sequence and translated amino acid sequence of the light chain variable region of the mouse F919-9-18 antibody.
  • the CDRs are underlined, and the first amino acid in the mature chain is double underlined.
  • FIG. 2 is a view showing a cDNA sequence and a translated amino acid sequence of a heavy chain variable region of a mouse F919-9-18 antibody.
  • the CDRs are underlined, and the first amino acid in the mature chain is double underlined.
  • FIG. 3 is a view showing a cDNA sequence and a translated amino acid sequence of a light chain variable region of a humanized F919 antibody.
  • the CDRs are underlined, and the first amino acid of the mature chain is double underlined.
  • FIG. 4 is a view showing a cDNA sequence and a translated amino acid sequence of a heavy chain variable region of a humanized F919 antibody.
  • the CDRs are underlined and the first amino acid in the mature chain is Underlined heavy.
  • FIG. 5 shows the partial nucleotide sequence in a vector (pMl304) containing the nucleotide sequence of shFa s (nd 29), one of the Fas derivatives, and the cDNA encoding Fc.
  • FIG. 4 shows the amino acid sequence deduced therefrom (up to amino acid 64 (DNA 275)).
  • FIG. 6 shows the partial nucleotide sequence in a vector (pMl304) containing the nucleotide sequence of cDNA encoding shFas (nd 29) -Fc, one of the Fas derivatives, and deduced from it. It is a figure which shows an amino acid sequence (65-144 amino acids (276-515 DNA)). * Indicates possible N-glycosylation sites.
  • Fig. 7 shows the partial nucleotide sequence in a vector (pMl304) containing the nucleotide sequence of cDNA encoding shFas (nd 29) — Fc, one of the Fas derivatives, and It is a figure which shows the deduced amino acid sequence (amino acids 145-224 (DNA of 516-755)). * Indicates possible N-glycosylation sites.
  • Fig. 8 shows the partial nucleotide sequence in a vector (pMl304) containing the nucleotide sequence of shF as (nd 29) —Fc encoding one of the F as derivatives, and the estimated value.
  • 1 is a diagram showing the amino acid sequence (amino acids 225 to 304 (DNAs 756 to 995)).
  • Fig. 9 shows the partial nucleotide sequence in a vector (pMl304) containing the nucleotide sequence of cDNA encoding shFas (nd 29) —Fc, which is one of the Fas derivatives, and deduced from it.
  • pMl304 the nucleotide sequence of cDNA encoding shFas (nd 29) —Fc, which is one of the Fas derivatives, and deduced from it.
  • Fig. 10 shows the partial nucleotide sequence in a vector (pMl 3 17) containing the nucleotide sequence of the cDNA encoding shF as (nd 29) -hinge, which is one of the Fas derivatives, and its deduced sequence.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence (up to amino acid 64 (DNA 275)).
  • Fig. 11 shows the partial nucleotide sequence in a vector (pMl 3 17) containing the nucleotide sequence of cDNA encoding shF as (nd 29) -hinge, one of the Fas derivatives, and the deduced nucleotide sequence.
  • FIG. 6 shows the amino acid sequence of the amino acid sequence (amino acid at position 65 and thereafter (DNA at positions 276 to 515)). The asterisk indicates a possible N-Dali conversion site.
  • Fig. 12 shows the partial nucleotide sequence in a vector (pMl3 17) containing the nucleotide sequence of cDNA encoding shFas (nd29) -hine, one of the Fas derivatives, and its estimated value.
  • FIG. 7 is a diagram showing the amino acid sequence to be determined (DNA No. 516 and after).
  • FIG. 13 is a graph showing the inhibitory effect of a Fs derivative (hFas-Fc) on myocardial infarction in an experimental rat cardiac ischemia-reperfusion injury model.
  • FIG. 14 is a graph showing the effect of a Fas derivative (hFas-Fc) on an increase in plasma Cpk level 3 hours after reperfusion in an experimental rat cardiac ischemia-reperfusion injury model.
  • hFas-Fc Fas derivative
  • FIG. 15 is a graph showing the effect of extending the survival days of human Fas-Fc in a mouse GVHD model.
  • the open square (mouth) indicates the survival rate of the hFas-Fcl OmgZkg administration group
  • the closed square (country) indicates the survival rate of the control group.
  • FIG. 16 is a graph showing the lethality-suppressing effect of an anti-human Fas ligand antibody in a mouse liver injury model.
  • the open square (mouth) is the F 9 19—9-11-10.4 mg / kg dose group
  • the open triangle ( ⁇ ) is the F 9 19—9-11-1 81.2 mg Zkg dose group
  • the closed square ( ⁇ ) Indicates the survival rate of the control group.
  • FIG. 17 is a graph showing the effect of an anti-mouse Fs ligand antibody (# 58-11) on suppressing myocardial infarction in an experimental rat heart ischemia-reperfusion injury model.
  • Fig. 18 shows the effect of anti-mouse Fas ligand antibody (# 58-111) on plasma CPK elevation after 3 hours of reperfusion in an experimental rat heart ischemia-reperfusion injury model. is there.
  • FIG. 19 is a graph showing the effect of the anti-mouse Fs ligand antibody (# 58-11) to improve the survival rate in a mouse GVHD model.
  • An open circle ( ⁇ ) indicates the survival rate of the GVHD-negative group
  • a closed circle ( ⁇ ) indicates the survival rate of the # 58—111 Omg / kg administration group
  • a closed square (Peng) indicates the survival rate of the control antibody 10 mg / kg administration group.
  • FIG. 20 is a graph showing the effect of an anti-mouse Fs ligand antibody (# 58-11) on suppressing a rise in plasma urea nitrogen in a mouse renal ischemia perfusion model.
  • FIG. 21 is a graph showing the effect of an anti-mouse Fs ligand antibody (# 58-11) on suppressing plasma creatinine elevation in a mouse renal ischemia perfusion model.
  • the diseases targeted by the prophylactic and therapeutic agents of the present invention include various diseases. These diseases are caused by the biological effects of the FasZFas ligand system, and Potyosis is involved. Specifically, in those diseases, the biological action of the Fas / Fas ligand system, in particular, apoptosis mediated by Fas is involved or contributes to the onset, maintenance or exacerbation of the disease or an accompanying symptom or condition. ing. Specific examples include heart disease, renal disease, GVHD, ischemia-reperfusion injury, and diseases caused by endotoxin.
  • the heart disease is preferably ischemic heart disease, particularly myocardial infarction, Includes myocarditis due to the cause, cardiomyopathy, especially dilated cardiomyopathy, heart failure, and ischemia-reperfusion injury and heart disease based thereon.
  • Myocardial infarction includes acute and old.
  • Heart failure includes heart failure, especially in ischemic heart disease, which often occurs as a complication of acute or old myocardial infarction.
  • GVHD includes GVHD that occurs after bone marrow transplantation such as incompatible bone marrow transplantation and bone marrow transplantation for congenital immunodeficiency disease, GVHD that occurs after organ transplantation, and blood transfusion such as mass transfusion to immunocompromised hosts. Includes GVHD that occurs.
  • GVHD is associated with organ or tissue damage based on the GVH response, including diarrhea, wasting such as weight loss and slimming, rash, liver dysfunction.Histologically, bone marrow and lymphoid tissue breakdown and intestinal It is characterized by symptoms including villous atrophy.
  • the renal diseases include renal ischemia, renal ischemia-reperfusion injury, diseases based thereon, renal failure and its causative diseases, and preferably include acute renal failure.
  • Acute renal failure includes prerenal acute renal failure, postrenal acute renal failure, and renal acute renal failure.
  • causes of renal acute renal failure include acute renal circulatory or renal ischemic acute tubular necrosis, acute tubular necrosis due to nephrotoxicity, acute glomerulonephritis, acute interstitial nephritis, acute cortical necrosis o
  • Diseases based on ischemia or ischemia-reperfusion injury include heart, kidney, liver Diseases based on ischemia-reperfusion injury in the organ, brain, lung, spleen or spleen, preferably heart, kidney or liver, and ischemia-reperfusion injury associated with surgery or transplantation, and thrombolytic therapy or vascular reconstruction Includes diseases based on postoperative ischemia-reperfusion injury.
  • ischemia-reperfusion injury refers to the return of blood flow after a total lack of local blood flow (ischemia) due to various causes such as infarction, surgery, transplantation, thrombolytic therapy or vascular reconstruction. (Reperfusion) tissue damage or organ or tissue dysfunction
  • disease based on ischemia-reperfusion injury is found in the liver, heart, kidney, brain, lung, spleen, kidney, etc., and includes, for example, liver failure, reperfusion arrhythmia, renal failure, etc. It also includes the symptoms and conditions associated with the disease.
  • Endotoxin Diseases caused by bacterial endotoxin include endotoxin-induced organ damage, endotoxinemia or sepsis, or organ P-harm in those disorders and diseases based on them.
  • organ damage For example, liver damage, acute Examples include liver failure, kidney failure, and kidney failure.
  • diseases and the like based on organ disorders are also included as diseases targeted by the preventive and therapeutic agents of the present invention.
  • the term "disease based on organ damage” refers not only to various organ failures such as liver failure and renal failure, but also to jaundice and blood GPT, GOT, LDH, etc. associated with these diseases.
  • Other possible target diseases of the prophylactic / therapeutic agents of the present invention include viral hepatitis or alcoholic or pharmaceutical non-viral hepatitis.
  • the Fas agonite inhibits apoptosis of cells of organs or tissues, for example, cardiomyocytes.
  • organ preservative for example, an organ preservative such as heart, kidney, or liver, which contains a Fs antagonist as an active ingredient.
  • the Fas antagonist used in the present invention is to be referred to as a Fas / Fas ligand-based antagonist, and it blocks the generation or transmission of a signal by Fas at any stage.
  • the function or biological effect of the Fas ZFas ligand system in particular, as long as it suppresses or inhibits the apoptosis via Fas, particularly the apoptosis via Fas by the Fas ligand, is particularly limited.
  • Fas ligand or Fas Without inhibiting the action or function of Fas ligand or Fas, interacting with the Fas ligand extracellular region or Fas extracellular region, inhibiting the interaction of Fas ligand with Fas, Influences the interaction between the intracellular domain of Fas and the intracellular factor that interacts with it, or a cytoplasmic factor involved in the signaling of apoptosis through Fas (eg, ICE-like protease) And those having various mechanisms of action, such as those that suppress the activity of lipase. It also includes both proteinaceous polymeric substances and low molecular weight compounds.
  • examples of the Fas antagonist used in the present invention include a Fas derivative, an anti-Fas ligand antibody, a Fas derivative having an activity of the FasZFasL system, particularly an activity of suppressing apoptosis via Fas.
  • Anti-Fas antibody, anti-sense oligonucleotide to the gene of Fas or Fas ligand or mRNA interacts with the intracellular region of Fas Substances, or ICE inhibitors.
  • the Fas antagonist used in the present invention is preferably a Fas derivative, an anti-Fas antibody, or an anti-Fas ligand antibody, which has an action to suppress apoptosis via Fas.
  • the Fas and the Fas ligand are preferably human-derived, and the anti-Fas antibody and the anti-Fas ligand antibody are preferably an anti-human Fas antibody and an anti-human Fas ligand antibody, respectively. It is preferably a humanized anti-Fas ligand antibody.
  • the humanized anti-Fas ligand antibody preferably has a constant region and a framework region derived from a human, and a complementarity determining region derived from a non-human.
  • the Fas antagonist used in the present invention may be one that suppresses apoptosis of Fas-expressing cells by a suitable atsay method described in International Patent Application Publication No.WO95Z13293, etc. preferable.
  • the antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and the molecular species of the antibody used in the present invention is not particularly limited. It may be a normal form of an antibody molecule, or a fragment of an antibody as long as it binds to an antigen and inhibits apoptosis via the Fas antigen, for example, Fab, F (ab ') 2, Fv, Alternatively, a single chain FV (sc Fv) in which the Fvs of the H chain and the L chain are linked by an appropriate linker so as to be single-stranded can also be used. Further, immunoglobulins classified into any class, subclass and isotype may be used.
  • Fas ligand or Fas bind to the Fas ligand or Fas, thereby producing the biological effects of the Fas / Fas ligand system, particularly the apoptosis through Fas.
  • Fas ligand binds to the Fas ligand or Fas, thereby producing the biological effects of the Fas / Fas ligand system, particularly the apoptosis through Fas.
  • Fas / Fas ligand system particularly the apoptosis through Fas.
  • the anti-Fas ligand antibody or anti-Fas antibody used in the present invention may be of any origin, type (monoclonal or polyclonal) and production method, but is preferably a mammalian monoclonal antibody.
  • the animal species of the cells producing the monoclonal antibody used in the present invention is preferably a mammal, and may be derived from humans or mammals other than humans.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal other than a human a rabbit antibody or a rodent-derived monoclonal antibody is preferable.
  • the rodent is not particularly limited, but mouse, rat, hamster and the like are preferably exemplified. This is because monoclonal antibodies can be easily prepared using these animals.
  • the monoclonal antibody may be an antigen by ordinary immunological means such as radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA, ELISA), and immunofluorescence (Immunofluorescence Analysis). It is preferable that the activity of inhibiting the apoptosis of cells expressing Fas be measured by an appropriate Atsetsu method described in International Patent Application Publication No. WO 95/13293, etc. .
  • the 9-18 antibody is a preferred example.
  • the variable region sequence of the antibody is shown in FIG. 1 (cDNA is described in SEQ ID NO: 1) and FIG. 2 (cDNA is described in SEQ ID NO: 2).
  • the anti-Fas ligand antibody and the anti-Fas antibody used in the present invention include, for example, International Patent Application Publication No. WO 95/13293, International Patent Application No.PC TZ JP96 / 01820, International Patent Application Publication No.WO It can be manufactured using the method described in 95/10540.
  • a monoclonal antibody When a monoclonal antibody is used in the present invention, it may be prepared using a known technique.For example, Fas or Fas ligand or a partial peptide thereof is used as a sensitizing antigen, and is used as a normal sensitizing antigen. It can be prepared by immunizing according to the immunization method, fusing the obtained immune cells with known parent cells by a normal cell fusion method, and screening for monoclonal antibody-producing cells by a normal screening method. .
  • the sensitizing antigen is a human Fas ligand or a fragment thereof. Tak aha shi T., et al., Internati on al Immuno 1 o gy, Volume 6, 1567-1574, Using the gene sequence of human Fas ligand disclosed in 1994, inserting the gene sequence into a known expression vector system and transforming an appropriate host cell, or in the host cell or It is preferable to purify the desired Fas ligand protein from the culture supernatant and use this purified Fas ligand protein as a sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion, and is preferably selected from mice, rats, hamsters, and the like. ⁇ Egrets can be used.
  • Suitable methods can be used to immunize animals with the sensitizing antigen. After immunization in this manner and confirming that the level of the desired antibody in serum has been increased, the Immune cells are taken out therefrom and subjected to cell fusion. Preferred immune cells include spleen cells in particular.
  • the other parent cell fused with the immune cell is not particularly limited, but may be any of various known myeoma cell lines such as mammals, particularly mice, for example, P 3 -X63-Ag 8 -U 1 ( P 3 — U 1) and the like are preferably used.
  • Cell fusion between the immune cells and Myeoma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Milstein et al. (Milstein et al., Methods Enzymol. 73: 3-46, 1 98 1) etc.
  • a method of culturing the hybridoma according to a conventional method and obtaining the same from the culture supernatant a method is used in which the hybridoma is transplanted into a mammal compatible with the hybridoma, proliferated, and obtained from the ascites fluid.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • the monoclonal antibody used in the present invention obtained by the above method may be purified to a high purity by using a known purification method such as a salting-out method, a gel filtration method, and an affinity chromatography method.
  • a known purification method such as a salting-out method, a gel filtration method, and an affinity chromatography method.
  • the monoclonal antibody used in the present invention is not limited to a method using a hybridoma, but may also be prepared using a method using antibody-producing cells immortalized by EBV or the like, or using a method for preparing the cells by genetic engineering. it can.
  • the anti-Fas ligand antibody and the Fas antibody used in the present invention are more preferably chimeric antibodies or humanized antibodies artificially modified for the purpose of, for example, reducing the heterogeneity of humans.
  • mice monoclonal antibodies have drawbacks in the treatment of humans and in repeated treatment regimens.
  • the first drawback is that mouse monoclonal antibodies have a relatively short circulating half-life and, when used in humans, lack the functional properties of other important immunoglobulins.
  • a second disadvantage is that non-human monoclonal antibodies contain a substantial length of amino acids that are immunogenic when injected into a human patient. That is, many studies have shown that after infusion of a foreign antibody, the immune response to the antibody elicited by the patient can be very strong, essentially eliminating the therapeutic utility of the antibody after the first treatment. It has been shown that In the future, when monoclonal antibodies with antigenicity against various mice or other humans are developed, the initial or initial several treatments with any of the different non-human antibodies will be followed by Even treatments for unrelated therapies can be ineffective due to cross-reactivity, or themselves can be dangerous substances.
  • a chimeric antibody that can be used in the present invention comprises a non-human mammal, for example, the variable region of a mouse monoclonal antibody and the constant region of a human antibody.
  • Such a chimeric antibody can be produced using a known method for producing a chimeric antibody, in particular, using a gene recombination technique.
  • a reshaped human antibody is used in the present invention.
  • CDR complementarity determining region
  • the constant region and the framework region be derived from human
  • the complementarity determining region be derived from non-human.
  • Preferred examples of reshaped human antibodies (humanized antibodies) useful in the present invention are disclosed in International Patent Application Publication No. WO 97/02290 (Application No. PCT / JP96 / 01820).
  • Mouse antibody having the CDRs of the F919-9-118 antibody One example of the variable region is shown in FIG. 3 (cDNA is described in SEQ ID NO: 3) and FIG. 4 (cDNA is described in S
  • one or more amino acids in the framework (FR) region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the humanized antibody forms an appropriate antigen-binding site.
  • the Fas derivative used in the present invention is not particularly limited as long as it has at least a binding ability to a Fas ligand or suppresses apoptosis by the Fas ligand. Substitution, deletion, addition, etc. in the amino acid sequence of known Fas Or any mutation, such as Z or insertion, that inhibits the biological action of the Fas / Fas ligand system, in particular, the Fas-mediated apoptosis, while maintaining the binding activity to the Fas ligand. included. Further, the Fas derivatives include Fas variants, truncated forms, chimeric proteins, fusion proteins and chemically modified ones.
  • the Fas from which it is derived may be of any animal species, as long as it has the above properties, but it is preferable to use a human-derived one in consideration of antigenicity.
  • a known Fas extracellular region a Fas antigen lacking a transmembrane region, and a chimeric protein of a Fas extracellular region and another protein, such as a human Fas extracellular region and a human HFas-Fc, which is a chimeric protein of Fc fragment of immunoglobulin, and the like.
  • the Fas derivative may be of any production method, and can be produced by a known Fas sequence and a known gene recombination technique.
  • the method for producing human Fas-Fc is described in Examples of International Patent Application Publication No. WO 95/13293.
  • Fas derivatives having a deletion at the N-terminus of Fas are also preferable, and as of March 14, 1996, Research Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology, 1-chome, Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan Deposit (Accession Nos. P-155 14 and P-155 55), and transferred from the original deposit to the international deposit on March 6, 1997 (Accession No. FERMBP-5854 and Accession No. FE) RMB P-5855) Plasmids contained in E.
  • the Fas derivative encoded by the amino acid sequence of the known human Fas is a derivative containing the Fas extracellular region lacking the amino acid sequence from the 1st to the 29th at the N-terminus (Fig. 5 to Fig. 5).
  • 9 and array number No. 5 describes the partial nucleotide sequence in the vector (pM1304) containing the nucleotide sequence of cDNA encoding shFas (nd 29) Fc, No.
  • Fas derivatives shFas a vector containing the nucleotide sequence of the cDNA encoding the hinge (partial nucleotide sequence in pMl 3 17) is described.
  • it has high activity and is a suitable example as an active ingredient of the prophylactic / therapeutic agent of the present invention.
  • these Fas derivatives used in the present invention have a binding activity to a Fas ligand or a suppressive activity on Fas-mediated apoptosis by an appropriate Atsei method.
  • the sequence of the antisense oligonucleotide to Fas or Fas ligand gene or mRNA used in the present invention is not limited as long as it suppresses the expression of Fas or Fas ligand.
  • International Patent Application Publication No. WO 95/13 293 discloses an antisense oligonucleotide of a Fas ligand disclosed in the specification (the present specification is cited in this specification and incorporated herein by reference).
  • the prophylactic / therapeutic agent of the present invention is characterized by containing the above-mentioned Fas antagonist, and comprises at least one pharmaceutical carrier or medium, for example, sterilized water, physiological saline, vegetable oil, mineral oil, higher alcohol, higher alcohol Fatty acids, harmless organic solvents, etc., and as required, excipients, colorants, emulsifiers, suspending agents, surfactants, solubilizers, anti-adsorption agents, stabilizers, preservatives, humectants, Pharmaceutical compositions such as injections and oral preparations can be in the form of a kit in appropriate combination with an antioxidant, a buffer, a tonicity agent, a soothing agent and the like.
  • a pharmaceutical carrier or medium for example, sterilized water, physiological saline, vegetable oil, mineral oil, higher alcohol, higher alcohol Fatty acids, harmless organic solvents, etc., and as required, excipients, colorants, emulsifiers, suspending agents, surfactants, solubilizer
  • the prophylactic / therapeutic agent of the present invention is preferably administered parenterally, for example, systemically by intravenous injection, intracoronary injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, etc. Can be administered locally or locally, as well as rapidly or continuously.
  • the dose of the prophylactic / therapeutic agent of the present invention for humans varies depending on the disease state, age and administration method of the patient, but an appropriate amount can be appropriately selected. For example, in the case of systemic administration, an appropriate divided volume can be selected in the range of about 0.1 to 10 O mgZkg.
  • the use of the prophylactic / therapeutic agent of the present invention is not limited to these administration methods and dosages. Further, a plurality of Fas antagonists may be used in combination or in combination with other drugs.
  • the agent for preventing or treating heart disease of the present invention can be formulated according to a conventional method.
  • injectable preparations are obtained by dissolving a purified Fas antagonist in a solvent, for example, a saline solution, a buffer, etc., and adding an anti-adsorption agent as necessary, or It may be freeze-dried for reconstitution before use, and common excipients for freeze-drying can be used.
  • the Fas antagonist used for the prophylactic or therapeutic agent of the disease of the present invention may be used in a heart disease model, particularly in a cardiac ischemia-reperfusion model as described in Examples, or in a GVHD model, particularly in a GVHD model as described in Examples. It suppresses damage to organs and tissues of the host, and has the effect of prolonging the survival days and increasing the survival rate.
  • a renal disease model shows a serum creatinine increase inhibitory effect
  • GOT, GPT, etc. which are indicators of liver injury, and a survival rate increasing effect.
  • the agent for preventing or treating a disease according to the present invention suppresses cell damage and cell death of various organs or tissues, particularly apoptosis, by administering to a patient having the disease as described above.
  • Preventive or therapeutic effect, and alleviate the accompanying symptoms and improve the condition, and suppress the progression and worsening of symptoms Has an effect.
  • the Fas antagonist used in the present invention has a preventive / therapeutic effect on heart disease, GVHD, renal disease, disease based on ischemia-reperfusion injury and a disease based on organ damage, and also an effect as an organ preservative and cell apoptosis. Has an inhibitory action.
  • the Fas antagonist and the drug containing the same used in the present invention are useful as preventive and therapeutic agents for diseases involving Fas, particularly diseases involving Fas-mediated apoptosis.
  • diseases involving Fas particularly diseases involving Fas-mediated apoptosis.
  • prevent and treat heart disease especially ischemic heart disease such as myocardial infarction, myocarditis due to various causes, cardiomyopathy, especially dilated cardiomyopathy, heart failure, and ischemia reperfusion injury and heart disease based on it. be able to.
  • GVHD includes GVHD that occurs after bone marrow transplantation such as incompatible bone marrow transplantation and bone marrow transplantation for congenital immunodeficiency disease, GVHD that occurs after organ transplantation, and GVHD that occurs after blood transfusion such as massive blood transfusion to a host with reduced immunity. Is included.
  • GV HD is associated with organ or tissue damage based on the GVH reaction, including diarrhea, wasting such as weight loss and slimming, skin rash, liver dysfunction.Histologically, bone marrow and lymphatic tissue breakdown and It is characterized by symptoms including intestinal villous atrophy, and these GVHD-related symptoms or diseases It can also be used to prevent or treat conditions.
  • Ischemia-reperfusion injury and diseases based on it in the liver, heart, kidney, lung, spleen, small intestine, large intestine, stomach, kidney, brain, muscle, skin, etc. for example, liver failure, reperfusion arrhythmia, It can be used to directly prevent and treat damage and dysfunction of various organs such as renal failure and necrotizing enteritis.
  • administration or administration before or after surgery prevents or treats the above-mentioned organ or tissue disorder, and the above-mentioned organ or tissue after transplantation It is expected to have the effect of improving the engraftment rate and maintaining the function.
  • it is expected to have an inhibitory effect on the formation and expansion of tissue damage or necrotic infarct, and an improvement effect on the above-mentioned dysfunction of organs or tissues.
  • it can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases based on ischemia-reperfusion injury after thrombolytic therapy or vascular reconstruction.
  • it can be used for the purpose of directly preventing and treating diseases and dysfunctions of various organ disorders such as liver and kidney failures such as liver failure and renal failure.
  • it can be used as an organ preservative at the time of transplantation by, for example, adding it to a preservation solution for transplanting the above-mentioned tissue or organ, or adding it to a perfusate of the organ.
  • Fas antagonist used in the present invention suppresses not only acute phase but also chronic disorder in organ damage due to endotoxin, particularly liver damage or endotoxemia or sepsis. Therefore, the Fas antagonist used in the present invention is expected to prevent, treat, or ameliorate diseases based on these and the accompanying pathological conditions, and is considered to have very favorable properties as pharmaceuticals.
  • the Fas antagonist used in the present invention is used in the liver at the time of surgical operation such as transplantation or ischemia-reperfusion injury at the time of reduction or blockage of hepatic blood flow (blood supply) due to shock and circulatory failure. It is expected to prevent, treat or ameliorate liver failure, tissue damage and liver function decline.
  • thrombolytic therapy for myocardial infarction, percutaneous intracoronary thrombolytic therapy (PTCR), and reperfusion after percutaneous coronary lumen dilatation (PTCA) result in intracellular calcium ions. It is expected to prevent, treat, or ameliorate irreversible cell death or fatal arrhythmias caused by overload.
  • renal ischemia In the kidney, renal ischemia, renal ischemia-reperfusion injury due to postoperative or renal transplantation, diseases based on them, renal failure, its causative disease, and glomerular endogenous cells (endothelial cells, epithelial cells, mesangial cells, etc.) It is expected to prevent, treat or ameliorate disorders such as mesangial matrix, extracellular matrix of basement membrane or tubular epithelial cells.
  • each plasmid DNA was dissolved in 500 1 of a solution of 10 mM Tris-HC1 (pH 7.4) / 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter abbreviated as TE buffer 1). . To each of them was added 125 ml of D-MEM (Taishui Pharmaceutical) containing 0.2 mg / m 1 DEAE-dextran and 50 mM Tris-HC1 (pH 7.4), and DNA-DEAE A dextran mixture was prepared.
  • COS-1 / pMl 304 culture supernatant 11 was precipitated with ammonium sulfate (70% saturation), suspended in phosphate buffered saline (PBS), and dialyzed against PBS.
  • the obtained suspension (57 ml) was applied to a column of an Affinity Protein A Preparative Cartridge (manufactured by Biorad; 7.3 ml) according to the instruction manual, and eluted with shFas ( nd 29) — F c was recovered.
  • Ultrafiltration was performed using Filtron Omega Cell (manufactured by Fuji Filter Co., Ltd .; molecular weight cut off: 30 kD), followed by concentration.
  • the concentrate was dialyzed against 0.9% NaCl to obtain purified shFas (nd 29) -Fc.
  • HFas-Fc was purified in the same manner.
  • the protein mass of each sample was measured by the Lowry method using serum albumin as a standard substance.
  • the purified shFas (nd29) — Fc was electrophoresed on a polyacrylamide gel using a 5-20% gradient gel containing 0.1% SDS, and 2D—silver staining reagent II Stained with "Daiichi” (Daiichi Pure Chemicals) to detect bands.
  • Purified shFa s (nd 29) -Fc is detected as almost one band with a molecular weight of approximately 85 kD corresponding to a dimer under non-reduction and approximately 43 kD corresponding to a monomer under reduction. Was done.
  • the fraction of the eluted main peak was lyophilized, dissolved in 70% formic acid to prepare a sample, and using a Model 477 A Protein Sequencing System-1 20 APTH Analyzer (manufactured by PerkinElmer), The N-terminal amino acid sequence was determined. That is, PTH amino acid was detected by ultraviolet absorption at 270 nm, and the amino acid was identified based on the retention time of a standard PTH amino acid (manufactured by Pakinkin Elmer) separated in the same manner in advance.
  • the anti-Fas monoclonal antibody (4B4-1B3) was mixed with Formyl-Cell mouth fine (manufactured by Seikagaku Corporation) to prepare an antibody affinity column according to a conventional method.
  • the culture supernatant 101 of COS-1 / pMl 3 17 was ultrafiltrated and concentrated to 1.51 using a Filtron Mini Set (fraction molecular weight: 10 kD; manufactured by Fuji Filter). Then, 1 M Tris-HCl (pH 9.0) was added to the concentrate to adjust the pH to 8.0, and 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 1 M NaCl was added. ) was applied to an affinity column immobilized with anti-Fas antigen monoclonal antibody which had been equilibrated in advance. The column is loaded with 50 mM Tris containing 1 M NaCl.
  • shFas (nd 29) -hinge was eluted with 0.1 M glycine-HC1 (pH 2.5) containing 1 M NaC1.
  • Fractions containing one shFas (nd 29) hinge were pooled, subjected to ultrafiltration using Filtron omega cell (fraction molecular weight: 10 kD, manufactured by Fuji Filter), and concentrated. The concentrated solution was dialyzed against 0.9% NaCl to obtain one shFas (nd 29) of purified.
  • the resulting purified shF as (nd 29) — hinge was subjected to electrophoresis on a polyacrylamide gel using a 5-20% gradient gel containing 0.1% SDS, and 2D-silver staining reagent The band was detected by staining with “Daiichi” (manufactured by Daiichi Kagaku).
  • the purified shFas (nd29) -hinge is reduced to about 23 kD and 27 kD under reduction as two bands with molecular weights of about 43 kD and about 27 kD. As two bands.
  • the N-terminal amino acid sequence was determined using the purified shFas (nd29) -hinge obtained above in the same manner as described above. As a result, it was confirmed that the human Fs antigen had an N-terminal amino acid sequence in which 29 residues of the N-terminal amino acid were deleted.
  • s hFas (nd 29) One Fc and hFas-Fc were measured using the activity of 1A12 cells and FLm14 cells to suppress the cytotoxic activity on WC8 cells and W4 cells as an index.
  • 1A12 cells are cells transformed with mouse WR19L cells to express human Fas ligand
  • FLml4 cells are mouse FDC cells expressing mouse Fas ligand.
  • WC8 cells are cells obtained by transforming human Fas antigen
  • W4 cells are cells obtained by transforming mouse WR19L cells so as to express mouse Fas antigen. These WR19L cells express little mouse Fas antigen and are susceptible to the cytotoxic effect of TNF.
  • the cytotoxic activity was measured according to the method of Rouvier E. (J. Exp. Med., 177: 195-200, pp.1993). Year) .
  • 1 0 0 ⁇ 1 in 1 0% inactivated FB S-containing RPM I 1 640, 1 X 1 0 6 cells with 20 C [5 1 C r] Sodium chromic acid i (NE N Co.) WC8 or W4 cells were incubated at 37 ° C for 2 hours. After washing with 10% inactivated FBS-containing RPM11640, these cells were used as target cells.
  • A12 cells were used as effector cells, and WC8 cells were used as target cells. And, when FLml 4 cells are used as effector cells and W4 cells are used as target cells, the specific cytotoxic activity of sh Fas (nd 29) Fc and hFas-Fc As a result, shF as (nd 29) —F c had a cytotoxic inhibitory activity 3 to 10 times higher than hF as—F c.
  • shFas (nd29) -hinge had a cytotoxic inhibitory activity 3 to 10 times higher than that of hFas-Fc.
  • Nembutal (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was administered intraperitoneally to 320-450 g male Wistar rat (manufactured by Nippon Charisliver Co., Ltd.) and anesthetized. 3 After fixing the rat in a supine position on a warming stand (manufactured by IKED ASCI ENT IFIC CO. LTD) kept at 55 ° C, cut off the trachea and mount a respirator (SN-480-7 manufactured by Shinano Seisakusho). Connected.
  • the chest is opened at the 4th intercostal space of the left chest to expose the heart, and a suture needle with a thread (weak needle for ophthalmology, manufactured by Natsume Seisakusho) 2 to 3 mm upstream from the base of the left coronary artery. It was ligated with a single bow. Twenty minutes later, the ligation was released by releasing the single bow and reperfusion was performed for 3 hours. Next, in order to determine the ischemic area, ligation was performed again, and 1% Evans-Ble-containing saline was administered from the left femoral vein.
  • a suture needle with a thread weak needle for ophthalmology, manufactured by Natsume Seisakusho
  • the heart was excised, frozen in liquid nitrogen, divided into 5 sections using a razor blade (Fuza-Ichi Kazu Razor Co., Ltd.), and 1% TTC (2, 3, 5, chloride, trifenyltetrazoli) was used. (Manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 37 ° C for 20 minutes. Each section was stored in a 10% neutral buffered formalin solution until further analysis. One hour after reperfusion and 1 hour after reperfusion for the measurement of plasma creatine kinase (CPK). Three hours later, blood was collected from the jugular vein.
  • TTC 2, 3, 5, chloride, trifenyltetrazoli
  • the human Fas-Fc (hFas-Fc) used was prepared according to the method described in Example 1 of International Patent Application Publication No. WO95Z13293.
  • the solution was diluted with saline containing 0.1% human serum albumin (manufactured by Chemo-Serum Therapy Laboratory) and administered at a dose of lmgZl OmlZkg via the right femoral vein immediately after the start of reperfusion.
  • the control group received saline containing 0.1% human serum albumin.
  • the hFas-Fc 1 mgZkg administration group was 5 cases, and the control group was 8 cases.
  • the ratio of non-ischemic area (Evans blue positive, TTC positive area), ischemic area (Evans blue negative, TTC positive area), necrotic area (Evans blue one negative, TTC negative area) in each section is determined by the following method. Calculated. For both sides (upper surface, lower surface) of the heart section, images from a stereo microscope (SHZ10, manufactured by Olympus Optical Co., Ltd.) were analyzed using image analysis software (ImageCommand 509, Olympus). Optical Co., Ltd.) and fractionated the non-ischemic area, ischemic area and necrotic area on the monitor, and printed the fractionated screen on a printer.
  • SHZ10 stereo microscope
  • image analysis software ImageCommand 509, Olympus
  • the area of each region in the projected image was measured using a digital branimeter 1 (manufactured by Uchida Yoko Co., Ltd.).
  • the plasma CPK value was measured using CPK Test II and Auto Analyzer-1 (COB ASFARA, manufactured by Roche).
  • mice Seven week-old female ICR mice (manufactured by Nippon S.L.I.C.) were intraperitoneally administered with hFas-Fc2.5 mg / kg for three consecutive days.
  • the control group received saline.
  • Body weight was measured every day from the day before administration to the day after administration, and the effect of hFas-Fc administration on body weight was examined.
  • necropsy was performed on the day following the end of the administration, macroscopic observation of major organs and measurement of the number of splenocytes were performed, and the effect of hFas-FC administration was examined.
  • a host mouse As a host mouse, a male, 6-week-old, BDF1 mouse (manufactured by Nippon Charls River Co., Ltd.) was used. Cyclophosphamide (Shiono Giyaku Co., Ltd., Endoxan) was administered at 450 mg / kg intraperitoneally to the host mice to induce bone marrow suppression.
  • a donor mouse As a donor mouse, a male, 7-week-old, C57B LZ6 mouse (manufactured by Nippon Charl River Co., Ltd.) was used. The spleen of the donor mouse was loosened using tweezers in Hanks' solution (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), followed by centrifugation, and the obtained cells were subjected to 0.017 M tris—0.747% ammonium chloride. The suspension was suspended in the solution to lyse only the red blood cells.
  • mice The remaining cells were washed with Hanks' solution and used as donor mouse-derived spleen lymphocytes, which were transplanted into the host mice one day after administration of the aforementioned cyclophosphamide by 3 ⁇ 10 7 mice / mouse tail vein.
  • hFas-Fcl, 3, 1 OmgZkg was administered once every two days via the tail vein, and the effect on the survival days was examined.
  • the control group received saline containing 0.1% human serum albumin (manufactured by Chemical and Serum Therapeutics Research Institute), which is a dilution of hFas-FC, and each group was did.
  • human serum albumin manufactured by Chemical and Serum Therapeutics Research Institute
  • FIG. 15 Weight loss was also mild.
  • Example 5 Production of shFas (nd29) -Fc-producing CHO cells (CHO (pM1304) 72-105-55)
  • Plasmid pMl 304 ⁇ g was dissolved in 5.51 of a 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) Zl mM ethylenediaminetetraacetic acid solution.
  • a F-12 Nutrient Mixture (Ham) medium (manufactured by GIBCO BRL; hereinafter, abbreviated as HamF12 medium) was added to these to give a solution A, thereby obtaining a solution A.
  • a HamF12 medium was added to Lipfect AMINE reagent (GIB CO BRL) 96 91 to a concentration of 800 ⁇ to give a solution ⁇ .
  • the medium was replaced with a MEMa (1) medium containing 10% inactivated dialysis fetal serum and the scale was increased when the cells became confluent.
  • MEMa MEMa
  • the number of cells is increased to 2.5 X 10 5 cells.
  • Z 50,000 / 110% MEM containing inactivated dialysis fetal serum The cells were inoculated in an ⁇ (—) medium / 2-well plate (manufactured by NUNC), and the supernatant was collected 2 or 3 days later.
  • the amount of shFas (nd29) -Fc in the supernatant was measured by EIA, and a strain with high expression level (CHO (pMl304) 72) was selected.
  • the CHO (pM 13 0 4) 7 2—10 5—55 prepared in Example 5 was used as a growth medium in a cell factory (Nunc) having a culture area of 600 cm 2 as a growth medium.
  • MTX-containing IBL Media I manufactured by Immune Biology Laboratories, Inc.
  • the cells were implanted to a density of 2.3 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , in the presence of 5% C ⁇ 2 /95% air.
  • the cells were cultured at ° C for 6 days. After confirmation of confluence, the medium was replaced with a medium (production medium) from which IBL Media I was removed from insulin and transfulin.
  • the supernatant was recovered after culture for 4 days at 3 7 ° C. After the supernatant has been collected, the production medium is added again to the cells, and After culturing for 4 days, the supernatant was recovered again.
  • shFas (nd29) -Fc was injected into male, 6-week-old, BDF1 mice (manufactured by Nippon Charisulliver-1). was administered via the tail vein at a dose of 10 or 30 mg / kg once every two days for 12 days for a total of seven times, and the effect was examined.
  • the experiments consisted of three groups: a control group, a group of sFas (nd29) -Fc1Omg / kg, and a group of sshFas (nd29) -Fc3Omg / kg. did.
  • the control group was given 3 Omg / kg of human serum albumin and shFas (nd 29) -Fcl Omg / kg in order to keep the same amount of protein in each administration group at 3 Omg / kg.
  • shF as (nd 29) ⁇ Fc 30 mg / kg group shF as ( nd 29) — F c 3 Omg / kg was administered.
  • Body weight was measured once every two days from the day of administration. On the 14th day after the start of administration, blood was collected from the fundus vein and the blood cell count was measured.
  • Example 8 Effect of a Fs antagonist in an endotoxin-induced liver injury model
  • C57BL / 6 CrS1c mice male, 9 weeks old, manufactured by Japan SLC Co., Ltd.
  • 5 animals per group and 3 groups were used as test animals.
  • a solution of Propion bacteria acnes (P. acness) heat-killed bacteria manufactured by Lipi Immunochemical Corporation
  • physiological saline to a concentration of 1.5 mg / m1 was added to the mouse via the tail vein. 2 ml was administered.
  • the shFas (nd 29) — Fc prepared in Example 1 was diluted with a diluent (saline containing 0.1% human serum albumin), and 0.3 mgZ8mlZkg, 1 mg / 8 m It was administered via the tail vein at a dose of 1 / kg.
  • the control group received a diluent.
  • 0.2 ml of a lipopolysaccharide (manufactured by Sigma) solution prepared with a physiological saline solution was intraperitoneally administered. Eight and twenty-four hours after administration of lipopolysaccharide, 751 blood was collected from the fundus.
  • the collected blood was mixed with 8.3 n 1 of a 3.8% aqueous sodium citrate solution, and then centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes. After centrifugation, the obtained plasma was frozen in liquid nitrogen and stored at minus 30 degrees until use.
  • GOT and GPT are measured using GOT-FA Test Co. (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), GPT-FA Test Co. (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and Auto Analyzer I (Roche). PT / JP97 / 03978, Cobasfara).
  • Example 9 Effect of anti-human Fs ligand antibody on liver injury model mouse (1) Preparation of liver injury model mouse
  • mice Male, 5-week-old, BAL B / c mice (Nippon SLC Co., Ltd.) were used. The mouse was administered 2 ml of physiological saline containing 5.O mg / ml of P. acnes heat-killed bacteria (RIBII MMUNOCHEM RESEARCH, INC.) Via the tail vein. Ten days later, human Fas ligand extracellular region was diluted to 50 ug / ml with physiological saline containing 0.1% human serum albumin, and 0.2 ml was administered via the tail vein to produce a liver injury model mouse.
  • P. acnes heat-killed bacteria RIBII MMUNOCHEM RESEARCH, INC.
  • the extracellular region of human Fas ligand was expressed by incorporating DNA encoding the extracellular region of human Fas ligand into PPIC9, a plasmid for Pichia pastoris yeast (manufactured by Invitrogen).
  • Pichia yeast GS115 strain manufactured by Invitrogen
  • hFas-FC-binding protein A was obtained from the culture supernatant of the resulting transformant.
  • Example 10 Preparation, production and purification of anti-mouse Fs ligand antibody
  • Soluble mouse F a s ligand WX 2 J. Immunology, 157 vol.
  • Mouse extracellular domain of mouse Fas ligand and part of intracellular, transmembrane and extracellular domains of mouse CD40 ligand (N-terminal) A plasmid encoding a chimeric protein fused to the amino acid sequence of the human fusion factor (EF) promoter downstream of the promoter. (Mizushi ma-Nagata, Nuc 1 eic Acids Research, Vol. 18, p. 5322, p. 1990). The above plasmid was transfected into WR19L cells, and recombinant cells W40 LFL expressing mouse Fas ligand on the cell membrane were obtained and used as antigens for administration. Armenian hamsters were used as immunized animals.
  • EF human fusion factor
  • Hybridoma # 58—11 was cultured in serum-free medium, Hybridoma-SFM (GIB COBRL), and the culture supernatant was purified using a protein A column (PROS EP—A, Bioprocessing). Purified antibody FLIM58 (# 58-11) was obtained. The protein concentration was calculated from the absorbance at 280 nm.
  • Example 1 Neutralizing activity of anti-mouse Fas ligand antibody # 58-11 against mouse and rat Fas ligand
  • the neutralizing activity of the anti-mouse Fas ligand antibody # 58-11 was determined by Atsushi using the release of 51 Cr as an index in the same manner as in the method described in the example of International Patent Application Publication No. WO 95/13293. Examined.
  • mice Male, 7-week-old, ICR mice (Nippon-charl-liver) and male, 11-week-old, Wi-star-rat (Nippon-chart-river) splenocytes were prepared in the same manner as in Example 4. .
  • the resulting spleen cells were prepared in 2 X 1 0 six Zm 1 concentration, 4 0 U / m 1 recombinant human IL one 2 (Bo ehringe rMannh eim Co.) and 1 0% inactivated FBS ( The cells were cultured in a RPMI 1640 medium (GI BCO BRL) containing JRHB iosciences) at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide.
  • a RPMI 1640 medium GI BCO BRL
  • the preparation of the target cells was carried out in the same manner as described in International Patent Application Publication No. WO 95/13293. That is, using the mouse Fa s expressing cells W 4 cells to the target Bok, 1 0 6 W 4 cells 20 ⁇ C i 51 C r - chromic acid The cells were cultured for 2 hours at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide gas using an RPMI 1640 medium containing sodium (NEN) and labeled with 51 Cr.
  • Fas derivative shFas (nd29) -1Fc described in International Patent Application No. PCTZTZ97 / 01502 was added and used as a positive control for Atsusei.
  • the obtained results were analyzed by International Patent Application Publication No. WO 9 5/1 3 2 9 3 Atsusi the same method the free indicators 51 C r, which is described.
  • shFas (nd29) -Fc used as a positive control showed a cytotoxic activity by activated mice and rat splenocytes in a dose-dependent manner between 0.3 / zgZml and 3 g / ml. It was proved that the activated and rat spleen cells which were suppressed and used showed cytotoxicity in a FasL-dependent manner.
  • anti-mouse Fas ligand antibody # 58—11, as well as shFas (nd29) -Fc showed a cytotoxic activity of activated mouse and rat spleen cells of 0.03 ⁇ . gZml ⁇ 0.3 ⁇ g / It was suppressed in a dose-dependent manner during m1. That is, anti-mouse Fas ligand antibody # 58-11 inhibited mouse and rat Fas ligand.
  • Example 1 Toxicity test of anti-mouse Fs ligand antibody # 58-11
  • mice Male, 8-week-old, DB A / 1J mice and C 3 HZH e mice (Nippon Charl Sliver) were used.
  • Anti-mouse Fs ligand antibody # 58-11 was administered via the tail vein at a dose of 100 mg / 3 Om1 / kg.
  • physiological saline (Otsuka Pharmaceutical) was administered at a dose of 3 Oml / kg via the tail vein.
  • N 3 in each group for both strains.
  • the observation period was set to 7 days, and body weight measurement, hematology (red blood cells, white blood cells, platelets), blood biochemical tests (GOT, GPT, urea nitrogen), and visual necropsy were performed.
  • Anti-mouse Fas ligand antibody # 58 11 Weight gain, hematological test values (red blood cells, white blood cells, platelets) and blood biochemical test values (GOT, GPT, urea nitrogen) after administration in the 1 administration group are control groups No difference was observed compared to. In addition, gross necropsy findings showed no abnormality in the anti-mouse Fs ligand antibody # 58-11 administration group.
  • Example 1 Effect of anti-mouse Fs ligand antibody on cardiac ischemia-reperfusion injury (1)
  • a rat heart ischemia-reperfusion model was prepared in the same manner as in Example 2.
  • Anti-mouse Fas ligand antibody # 58-1-1 1 was diluted with 0.1% human serum albumin-containing saline, and the right right thigh was injected at a dose of lmg / 5ml / kg immediately after the start of reperfusion. Stillness Administered by pulse.
  • the control group received a purified IgG antibody derived from normal hamster serum (Cappe 1) at a dose of lmg / 5ml / kg.
  • the non-ischemic area, ischemic area, necrotic area, and plasma creatine kinase (CPK) measurement in each section were measured in the same manner as in Example 2.
  • the ratio (%) of the necrotic area to the ischemic area in the anti-mouse Fs ligand antibody # 58-11 administration group was lower than that in the control group (FIG. 17).
  • the plasma CPK value of the anti-mouse Fas ligand antibody # 58-11 administration group was lower than that of the control group (FIG. 18).
  • Example 1 Effect on survival rate of anti-mouse Fs ligand antibody in mouse GVHD model
  • a host mouse As a host mouse, a male, 6-week-old, DBA / 2 mouse (Nippon Charls River Co., Ltd.) was used. Intraperitoneal injection of 350 mg / kg cyclophosphamide (Shionogi Pharmaceutical Co., Ltd., Endoxan) was induced in the host mice to induce bone marrow suppression.
  • cyclophosphamide Shionogi Pharmaceutical Co., Ltd., Endoxan
  • mice Male, 7-8 week-old, B10.D2 mice (Japan SLC-1 Co., Ltd.) were used as donor mice.
  • the spleen of the donor mouse was loosened using Hantz's solution (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) using tweezers, centrifuged, and the obtained cells were dissolved in a 0.017 M tris-0.74% ammonium chloride solution. And only the red blood cells were lysed. The remaining cells were washed with Hanks' solution, and the resulting spleen lymphocytes from the donor mouse were used. Kurohosufami de administration 1 day after 3 X 1 0 7 or the host mice / were from mouse tail vein porting.
  • the survival rate on day 8 after the transfer of spleen cells was 63% in the GVHD-negative group, 63% in the anti-mouse Fs ligand antibody # 58-11 administration group, and 38% in the control antibody administration group. From a comparison with the survival rate of the control antibody-administered group, the survival rate-improving effect on GVHD was observed in the anti-mouse Fs ligand antibody # 58-11 administration group (FIG. 19).
  • Example 1 Effect of anti-mouse Fs ligand antibody on renal ischemia-reperfusion model (1) Preparation of renal ischemia-reperfusion model
  • a male, 6-week-old, ICR mouse (Japan SLC-1) was fixed in a supine position on an operating table under Bentovalpital anesthesia, and the abdomen was incised. After the right kidney was removed from the laparotomy, the left renal artery and vein was cut off using a clip (VAS CULAR CLIP AS-1, Kyowa Watch Industry) to establish an ischemic state. After 30 minutes, the clip was removed and the blood was reperfused. Twenty-four hours after blood reperfusion, blood was collected from the abdominal vena cava to measure plasma creatinine and urea nitrogen.
  • VAS CULAR CLIP AS-1 Kyowa Watch Industry
  • Creatinine was measured using Determina CRE 55 s (Kyowa Medix), and urea nitrogen was measured using urea nitrogen B The measurement was performed with an autoanalyzer (COBASF ARA, Roche) using stoichiometer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • Anti-mouse Fas ligand antibody # 58—11 is diluted with saline containing 0.1% BSA (SI GMA), and left renal arteriovenous at a dose of 0.3mgZl 0mlZkg or 3mgZ1 Oml / kg Intravenous administration was performed immediately before ischemia and immediately after reperfusion.
  • the control group received a physiological saline solution containing 0.1% BSA.
  • the right kidney was removed, and then 0.1% BSA-containing saline was administered without being put into an ischemic state. There were 8 cases in each group.
  • the plasma creatinine and urea nitrogen levels of the anti-mouse Fas ligand antibody # 58-113 mg / kg group were lower than those of the control group, demonstrating the effect of suppressing renal ischemia-reperfusion injury ( Figure 20 and 2 1).
  • the above results indicate that the agent for preventing or treating diseases or the agent for preserving an organ of the present invention has an excellent effect on diseases. Further, the agent for preventing or treating a disease of the present invention does not show remarkable toxicity, and at least no toxicity due to inhibiting the biological action of the Fas / Fas ligand system is not observed.
  • the agent for preventing or treating a disease containing a Fa antagonist of the present invention as an active ingredient blocks the generation or transmission of a signal by Fas, and mediates the biological action of the Fas / Fas ligand system, particularly through Fas. As long as cell death, especially apoptosis, is suppressed, it is effective in treating diseases involving this.
  • the preventive / therapeutic agent for a disease containing the Fas antagonist of the present invention as an active ingredient suppresses the biological action of the FasZFas ligand system, in particular, the death of cells mediated by Fas, particularly, apoptosis.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • TTTTCTTCCA TTTCAGGTGT CGTGAGGAAT TCACCATGCT GGGCATCTGG ACCCTCCTAC 60 CTCTGGTTCT GACTAGTGTC GCTACTCAGA ACTTGGAAGG CCTGCATCAT GATGGCCAAT 120 TCTGCCATAA GCCCTGTCCT CCAGGTGAAA GGAAAGCTAG GGACTGCACA GTCAATGGGG 180 LS

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Description

明細書 予防 ·治療剤 技術分野
本発明は F a sアンタゴニストを有効成分とする疾患の予防 ·治療剤又は細胞 アポト一シス抑制剤および臓器保存剤に関する。 背景技術
F a sは、 ヒト線維芽細胞でマウスを免疫して得られたモノクロ一ナル抗体で ある F a s抗体 （ヨネハラ S. (Yonehara S. ) 等、 J. Exp. Med.、 1 6 9 卷、 1 747— 1 756頁、 1 989年） によって認識され、 アポト一シスのシ グナルを細胞に伝達する細胞表面抗原である。 最近、 ィ トウ N. (Itoh N.) 等に よって、 F a s遺伝子がクローニングされ、 F a sが約 45 kDの細胞膜上の蛋 白質であり、 そのアミノ酸配列から TNFレセプタ一フアミ リーに属する事が判明 した （Cell、 66卷、 233-243頁、 1991年） 。 また、 マウス Fa s遺伝子もクロー ニングされ （ワタナベ フクナガ（Watanabe- Fukunaga R.)等、 J. Immunol. , 148 卷、 1274-1279頁、 1992年） 、 Fa sm Aが、 マウスの胸腺、 肝、 肺、 心臓、 卵 巣で発現していることが確認された。
ヒ ト F a s リガンドは、 F a sを発現する細胞に対してアポ トーシスを 誘導する生体内分子として、 長田等により報告されたポリベプチ ドである (Ί o m o h i r 0 Tak ah a s h i等、 I n t e r n a t i on a l I mmu n o l o g y、 6巻、 1 5 6 7— 1 5 7 4頁、 1 9 9 4年） 。 ヒ ト F a s リガンドは、 TNFフアミ リーに属する分子量約 4 0 k Dの I I型 膜蛋白質で、 TNFと同様に、 生体内で 3量体を形成すると考えられている (Ma s a t o T a n a k a等、 EMBO J o u r n a l , 1 4卷、 1 1 2 9— 1 1 3 5頁、 1 9 9 5年） 。 また、 ヒ ト F a s リガンドはラッ ト F a sリガンド （T a k a s h i S u d a等、 C e 1 1、 7 5巻、 1 1 6 9— 1 1 7 8頁、 1 9 9 3年） やマウス F a s リガン ド （T o mo h i r o Tak ah a s h i等、 C e l l、 76巻、 969— 97 6頁、 1 994年） と 細胞外領域において高いホモロジ一を有しており、 ヒ ト F a s リガンドはヒ ト F a sのみでなくマウス Fa sをも認識し、 アポト一シスを誘導することがで きる。 逆に、 ラッ ト Fa sリガンド及びマウス Fa sリガンドも、 ヒト F a sを 認識してアポトーシスを誘導することができる。
また、 F a sを介するアポトーシスの細胞内シグナル伝達の機序に関し ても研究が進んでおり、 F a sの細胞内領域、 特にデスドメイン （D e a t h d oma i n) と呼ばれる領域と相互作用して、 シグナルを伝達または抑制する 因子の同定及びクローニングが報告されている他、 インタ一ロイキン— 1変換酵 素 （I CE) 関連チオールプロテア一ゼが F a sを介するアポト一シスのシグナ ル伝達に寄与している可能性が示唆されている。
近年、 アポトーシス、 特に F a sを介するアポト一シスと種々の疾患及び生理 的現象との関連が示唆されている。 例えば、 エイズ患者における Tリンパ球の減 少、 ウィルス性劇症肝炎における肝細胞死及びある種の自己免疫疾患等にお いて、 F a sを介するアポト一シスの異常が関与する可能性が示唆されてい る。
また、 Fa s/Fa sリガンド系はアポト一シス以外の機能、 例えば、 好中球 に作用して起炎症性に働く作用等も担っている可能性が示唆されている （力ャガ キ N. 等、 臨床免疫 28巻、 66 7— 675頁、 1 9 9 6年） 。
ところで、 種々の刺激、 例えばエンドトキシン、 又は侵襲により、 好中球を初 めとする免疫担当細胞が活性化され、 サイ トカインなど液性因子が血液中、 組織 中に放出された結果、 全身性の炎症反応を起こしている状態は全身性炎症反 応征候お手 (Sy s t emi c i n f l a mm a t o r y r e s p on s e s ynd r ome ：以下、 S I RSと略す） と呼ばれる。 S I RSにおいては、 種々の臓器障害を伴う場合が多く、 臓器障害が重篤な場合には多臓器機能不全症 候群 （MODS) に移行する場合もある （若林ら、 臨床検査、 3 8巻、 349— 352頁、 1 994年） 。 臓器が障害を受ける過程には、 種々の要因が関与する とされる力 侵襲に際して局所で産生された I L一 1などによりマクロファージ などの細胞から産生される I L一 8の作用による好中球の浸潤、 集積が重要な役 割を果たすといわれており、 最近注目を集めている。 また、 上述したように Fa s/F a sリガンド系 （以下、 F a sZF a s L系と称す） も好中球の活性 化に関与する可能性が報告されている。
虚血再灌流障害は、 ほとんどすべての組織あるいは臓器において認めら れ、 種々の疾患に関与している。 また、 臓器保存時やその移植の際にも問題とな る。 とりわけ、 肝臓、 心臓または腎臓における梗塞、 外科手術または移植などに 伴う虚血再灌流障害のうち、 各臓器における組織障害 （例えば細胞壊死など） 、 および、 各臓器における機能障害 （例えば心臓における不整脈など） は、 重篤な 場合には個体を死に至らしめるものであり、 社会的に大きな問題となっている。 種々の臓器障害または虚血再灌流障害においては、 I L一 8は、 早期から晩期に わたって産生 ·分泌されることが知られている。 また、 臓器移植時等における臓 器保存時及び再灌流時ではアポ卜一シスが起こっていることが知られている。 さ らに、 いくつかの実験モデルにおいてアポトーシスが観察されること及び F a s 又は F a s Lの発現が変動することが報告されている。 また、 肝虚血再灌流 24 時間後に好中球が著しく増加し、 好中球の中和抗体が虚血再灌流障害を改善する こと （ジェシケ， ェイチ. 等 （ J a e s c h k e , H. e t a 1. ) ， FASEB J o u r n a l, 4巻、 3 355— 33 5 9頁、 1 99 0年） 、 お よび、 肺虚血再灌流 3時間後に I L一 8、 好中球およびマクロファージが著しく 増加し、 I L一 8の中和抗体が、 虚血再灌流障害を改善することが報告されてい る （セキド， ェヌ. 等 （S e k i d o, N. e t a 1. ) ， Na t u r e、 3 65巻、 654— 657頁、 1 993年） 。 以上のような事実から、 好中球およ び I L一 8は、 臓器障害および虚血再灌流障害の早期から晩期にわたって、 重要 な役割を果たしていることが示唆される。 一方、 F a s/F a s L力く、 これらの P章害において、 どのように関与しているかについては明らかでない。
細菌感染における内毒素 （エンドトキシン） は、 生体内において種々のサイ ト 力ィン産生を誘導し、 例えばェンドトキシン血症、 敗血症等においてェンドトキ シンショ ックを惹起する他、 多様な臓器、 例えば肝臓等に障害をもたらし (D i n a r e l l o C. A. 等、 J. Ame r i c an Me d i c a l As s o c i a t i on 269巻、 1 829頁、 1 993年） 、 時に重篤な病 態を引き起こす。 この過程においても、 実験的にアポト一シスが観察されること 及び F a s/F a s L系が何らかの形で関与する可能性が報告されているも のの、 F a sZF a s L系がこれらの障害においてどのように関与しているかに ついては明らかでない。
従来、 種々の心疾患における心筋細胞死は主に壊死 （ネクロ一シス） によると 考えられていたが、 アポト一シス、 特に F a sを介するアポトーシスが心疾患と 何らかの関連を有する可能性が、 臨床的に、 及び実験的に報告されている。 例え ば、 新生ラッ ト心筋細胞をインビトロで虚血にすると、 その際に F a sの発現量 が増加すること （Tan ak a M. 等、 C i r c. Re s. ， 7 5， 426— 4 3 3, 1 9 9 4 ) 、 並びに I L一 1がラッ ト血管平滑筋細胞の一酸化窒素 (NO) 合成を誘導すると共にアポト一シスを誘導すること、 NO合成の阻害剤 力く I L一 1によるアポト一シスを抑制すること、 及び NOは F a sの発現を誘導 することから NOは動脈硬化のプラークのリモデリングに関与している可能 性 （Fuku o K. 等、 Hyp e r t e n s i on, 27， 823 - 8 26, 1 996 ) 等が報告されている。 また、 ィヌの心不全モデルにおいて、 心筋細胞 のアポトーシスがおこること、 その際 F a sの発現増加がおこること （L a b. I nv e s t. , 73， 77 1 - 787, 1 9 95 ) 及びラッ ト心筋梗塞モデル において、 心筋細胞死の大部分がアポ トーシスであり、 その際 F a sの発 現が 1 00倍以上に増加することが報告されている （L ab. I nv e s t. , 74， 86 - 1 07, 1 996 ) 。 さらに、 福田等は、 心筋疾患患者の心筋細胞 における F a sの発現を検討し、 肥大性心筋症では F a sの発現は認めなかった が、 心筋炎及び拡張型心筋症では少なく とも一部の心筋細胞で F a sの発現 を認めた （特発性心筋症調査班、 平成 6年度研究報告、 1 5 2— 1 5 5、 1995 ) 。 しかしながら、 これらの心疾患において F a sがどのように関与し ているかは明らかではなかった。 従って、 以上の報告では、 Fa sが心疾患にお いて心筋細胞のアポトーシスを促進しているか、 あるいは抑制的に作用するのか については何らデータもなく、 心疾患患者の心筋細胞障害又は心筋細胞死に対し て F a sが直接関与しているか否かは依然として不明であった。 したがって、 現 在までのところ、 F a sを介するアポト一シスを抑制することによる心疾患の治 療剤及び治療方法は知られていない。
腎疾患においても、 アポ トーシスの関与が示唆され、 実験的腎虚血再灌 流障害モデルで F a s mRN Aの発現が増加することが報告されている (Hakuno N. 等、 Endo c r i no l ogy 1 37巻、 1 938— 1948頁、 1996年） 。 し力、し、 腎疾患において、 F a sZF a s L系がど のように関係しているかについては明らかではない。
移植片対宿主病 （以下、 G VHD， g r a f t ve r s u s ho s t d e s e a s e) は、 供与者又は移植片由来のリンパ球が宿主の組織抗原に対し て移植免疫反応を起こす移植片対宿主反応 （GVH反応） に起因する疾患で ある。 不適合性骨髄移植や先天性免疫不全症への骨髄移植等の骨髄移植後に起る GVHD、 臓器移植後に起る GVHD、 免疫低下した宿主に対する大量輸血等の 輸血後に起る GVHD等がある。 GVHDは、 GVH反応に基づく臓器又は組織 の障害を伴い、 臨床的には下痢、 体重減少及び痩身等の消耗症、 皮疹、 脾腫及び 肝機能障害を含み、 組織学的には、 骨髄やリンパ組織の崩壊及び腸絨毛の萎縮を 含む症状を特徴とする。
種々の GVHDにおける宿主組織構成細胞死は主に壊死 （ネクロ一シス） によ ると考えられていたが、 アポトーシス、 特に F a sを介するアポトーシスが GVHDと何らかの関連を有する可能性が、 実験的に報告されている。 例えば、 マウス GVHDモデルにおいて腸、 皮膚及び舌の上皮細胞死は主にアポト一シス であることが報告されている （An i t i C. G i 1 1 i a m等、 J. I nv e s t. De rma t o l. 、 1 07巻、 377— 383頁、 1 99 6 年） 。 F a sを介したアポト一シスの関与については F a s リガンドが正常 なコントロールマウスの脾リ ンパ球をドナ一とした時と、 F a s リガンドの 変異マウスである g 1 dマウス由来の脾リンパ球をドナーとした場合で生存 時間は変わらないが皮膚、 肝障害はほとんど起らないことが報告されてお り （Ma t t h ew B. B a r k e rB等、 J. Exp. Me d. 、 1 8 3巻、 2645— 2659頁、 1 9 9 6年） 、 Fa sを介したアポトーシスが GVHD に関与する可能性は示唆されているものの、 Fa sを介したアポト一シスが GV HDの致死に関与するのか否かについては結論がでていない。 また、 上記報告に おいては用いられている材料が g 1 dマウス由来の脾リンパ球であることから、 1 dマウス由来脾リンパ球において F a s リガンド欠損の代替機構として F a sリガンド以外の他の因子 （例えば、 パ一フオリン、 TNFなど） の発現量 の変化などが G V H D反応に影響を与えることが推察され、 得られた結果が必ず しも F a sリガンド欠損の効果だけではない可能性がある。 したがって、 F a s を介したアポト一シスが G V H Dにどのように関与しているのか、 あるいは F a sを介したアポトーシスの特異的抑制物質の GVHD治療薬としての可能性 は不明であつた。
GVHDの予防、 治療薬として、 従来サイクロスポリン Aなどの非特異的免疫 抑制剤が用いられていたが、 非特異的免疫抑制を起こすため感染症などの副作用 が問題となっている。 現在までのところ、 F a sを介するアポト一シスを抑制す ることによる G V H Dの治療剤及び治療方法は知られていない。 また、 選択的免 疫抑制による G V H Dの治療剤及び治療方法は知られていない。
また、 虚血再灌流障害に基づく疾患に関しては、 上市されている薬物は、 血栓 溶解または循環改善を主体とするものであり、 障害を直接予防または治療するよ うな薬物は得られていない。 エンドトキシン血症及び敗血症に関しても、 例 えば、 ショックに対してはステロイ ドゃ蛋白分解酵素阻害剤等が用いられるが、 臓器障害を直接予防又は治療するような薬物は現在のところない。 臓器障害に基 づく疾患に対して用いられている薬物は、 対症療法が中心となっており、 組織ま たは臓器の障害に基づく疾患を予防または根治的に治療するような薬物は得られ ていない。 また、 種々の組織または臓器に対して広く有効な予防，治療薬も得ら れていない。
このような現状から、 広く種々の組織または臓器において障害に基づく疾患を 予防または治療する効果があり、 生体内で効果が認められ、 ヒトに対する毒性の 低い医薬品が望まれているが、 これらを満足するものは得られていないのが現状 であ^。
本発明の目的は、 F a sアン夕ゴニストを含有する、 新しい作用機序による疾 患予防 ·治療剤及び臓器保存剤としての医薬、 及び治療方法を提供することであ る。 より詳しくは、 本発明は F a sアンタゴニスト 有効成分とする、 F a sの 関与する疾患の予防 ·治療剤、 臓器保存剤及び治療方法を提供する。 発明の開示
本発明者らは、 F a s /F a sリガンド系の機能及び F a s /F a sリガンド 系を介するアポト一シスの各種疾患における役割を鋭意研究してきたが、 F a s アンタゴニス卜によって、 F a sZF a s リガンド系の作用、 特に F a s/ F a sリガンド系を介するアポトーシスを抑制することにより種々の疾患モデル において病態を改善すること、 例えば、 虚血再灌流時の心筋細胞の死、 同種骨髄 移植に伴う GVHDの発症及びェンドトキシンに惹起される臓器の障害が、 F a sを介するアポトーシスを阻害するアンタゴニストにより抑制されることを 見出し、 本発明を完成した。
すなわち、 本発明は F a sアンタゴニストを有効成分とする疾患、 詳しくは F a s/F a sリガンド系の関与する疾患であり、 特に F a sを介するアポト一シ スの関与する疾患の処置のための医薬、 特に予防及びノ又は治療のための医薬、 すなわち予防 ·治療剤を提供する。 ここで、 対象となる疾患には、 （ 1 ) 心 疾患、 好ましくは虚血性心疾患、 特に心筋梗塞、 心不全又は心虚血再灌流障害、 (2) 腎疾患、 好ましくは腎不全、 腎虚血、 虚血性再灌流障害、 または急性腎不 全、 （3) GVHD、 （4) 虚血もしくは虚血再灌流障害又はそれに基づく 疾患、 特に、 心臓、 腎臓又は肝臓における虚血再灌流障害に基づく疾患、 また、 外科手術または移植に伴う虚血再灌流障害、 あるいは血栓溶解療法もしくは血管 再建術後の虚血再灌流障害またはそれらに基づく疾患 （5) 細菌内毒素 （エンド トキシン） による臓器の障害、 エンドトキシン血症、 敗血症、 またはそれらに伴 う臓器もしくは組織、 特に肝臓の障害又は肝不全、 等が含まれる。
本発明の別の態様は、 F a sアンタゴニストを有効成分として含有することを 特徴とする臓器保存剤である。 また、 本発明は Fa sアンタゴニストを有効成分 とするアポトーシス抑制剤を提供する。 ここで該 F a sアンタゴニス トは、 抗 F a sリガンド抗体、 抗 F a s抗体又は F a s誘導体の少なくともいずれか一 つであることが好ましく、 特に該抗 F a sリガンド抗体がヒト化抗 F a sリガン ド抗体であることが好ましい。
すなわち、 本発明は、 F a sアンタゴニストの新規な用途を提供する。
なお、 本発明において F a sアンタゴニストとは、 抑制または阻害作用を有す る物質であり、 詳しくは、 F a sZF a sリガンド系の生物作用、 特に、 F a s を介する細胞のァポト一シスを抑制または阻害する物質である。 図面の簡単な説明
第 1図は、 マウス F 9 1 9-9 - 1 8抗体の軽鎖可変領域の c DN A配列及び 翻訳アミノ酸配列を示す図である。 CDRに下線を引き、 成熟鎖の 1番目のアミ ノ酸には二重下線を引いた。
第 2図は、 マウス F 9 1 9 - 9 - 1 8抗体の重鎖可変領域の c D N A配列及び 翻訳アミノ酸配列を示す図である。 CDRに下線を引き、 成熟鎖の 1番目のアミ ノ酸には二重下線を引いた。
第 3図は、 ヒト化 F 9 1 9抗体の軽鎖可変領域の c DN A配列及び翻訳ァミノ 酸配列を示す図である。 CDRに下線を引き、 成熟鎖の 1番目のアミノ酸には二 重下線を引いた。
第 4図は、 ヒト化 F 9 1 9抗体の重鎖可変領域の c DN A配列及び翻訳ァミノ 酸配列を示す図である。 CDRに下線を引き、 成熟鎖の 1番目のアミノ酸には二 重下線を引いた。
第 5図は、 F a s誘導体の一つである s hFa s (n d 29) 一 F cをコ一ド する c DN Aの塩基配列を含むベクタ一 （pMl 3 04 ) 中の部分塩基配列およ びそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である （64番のアミノ酸 （275 番の DNA) まで） 。
第 6図は、 F a s誘導体の一つである s hFa s (n d 29) 一 F cをコード する c DNAの塩基配列を含むベクター （pMl 304 ) 中の部分塩基配列およ びそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である （6 5〜1 44番のアミノ酸 (276〜5 1 5番の DNA) ) 。 *印は可能な N—グリコシレーションサイ ト を示す。
第 7図は、 F a s誘導体の一つである s hFa s (n d 29) — F cをコ一ド する c DNAの塩基配列を含むベクタ一 （pMl 304 ) 中の部分塩基配列およ びそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である （1 45〜224番のァミノ 酸 （5 1 6〜755番の DNA) ) 。 *印は可能な N—グリコシレ一ションサイ トを示す。
第 8図は、 F a s誘導体の一つである s hF a s (n d 29) — F cをコード する c DNAの塩基配列を含むベクタ一 （pMl 304 ) 中の部分塩基配列およ びそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である （225〜3 04番のァミノ 酸 （756〜995番の DNA) ) 。
第 9図は、 F a s誘導体の一つである s hF a s (n d 29) —F cをコ一ド する c DNAの塩基配列を含むベクター （pMl 304 ) 中の部分塩基配列およ びそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である （30 5番のアミノ酸 （9 9 6番の DNA) 以降） 。
第 1 0図は、 Fa s誘導体の一つである s h F a s (n d 29) —h i n g e をコードする c DNAの塩基配列を含むベクタ一 （pMl 3 1 7) 中の部分塩基 配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である （64番のアミノ酸 (275番の DNA) まで） 。
第 1 1図は、 F a s誘導体の一つである s hF a s (n d 29) -h i n g e をコードする c DNAの塩基配列を含むベクタ一 （pMl 3 1 7) 中の部分塩基 配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である （6 5番のアミノ酸 以降 （276〜5 1 5番の DNA) ) 。 *印は可能な N—ダリコシレ一ションサ ィ トを示す。
第 1 2図は、 F a s誘導体の一つである s hFa s (n d 2 9) -h i n e をコードする c DNAの塩基配列を含むベクタ一 （pMl 3 1 7) 中の部分塩基 配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である （5 1 6番の DNA 以降） 。
第 1 3図は、 F a s誘導体 （h F a s— F c ) の実験的ラッ ト心虚血再灌流障 害モデルにおける心筋梗塞巣抑制効果を示す図である。
第 1 4図は、 F a s誘導体 （h F a s— F c ) の実験的ラッ ト心虚血再灌流障 害モデルにおける再灌流 3時間後の血漿中 C P K値上昇抑制効果を示す図で ある。
第 1 5図は、 マウス GVHDモデルにおけるヒト F a s— F cの生存日数延長 効果を示す図である。 白四角 （口） は hFa s— F c l OmgZk g投与群、 黒四角 （國） はコントロール群の生存率をそれぞれ示す。 第 1 6図は、 マウス肝障害モデルにおける抗ヒト F a sリガンド抗体の致死抑 制効果を示す図である。 白四角 （口） は F 9 1 9— 9一 1 8 0. 4mg/k g 投与群、 白三角 （△) は F 9 1 9— 9一 1 8 1. 2mgZk g投与群、 黒四角 (■) はコントロール群の生存率をそれぞれ示す。
第 1 7図は、 抗マウス F a sリガンド抗体 （# 5 8— 1 1 ) の実験的ラッ ト心 虚血再灌流障害モデルにおける心筋梗塞巣抑制効果を示す図である。
第 1 8図は、 抗マウス F a s リガンド抗体 （# 5 8— 1 1) の実験的ラッ ト心 虚血再灌流障害モデルにおける再灌流 3時間後の血漿中 C P K値上昇抑制効果を 示す図である。
第 1 9図は、 マウス GVHDモデルにおける抗マウス F a s リガンド抗体 （# 5 8 - 1 1) の生存率改善効果を示す図である。 白丸 （〇） は GVHD陰性群、 黒丸 （·） は # 5 8— 1 1 1 Omg/k g投与群、 黒四角 （鵬） はコントロール 抗体 1 0 mg/k g投与群の生存率をそれぞれ示す。
第 2 0図は、 抗マウス F a sリガンド抗体 （# 5 8— 1 1) のマウス腎虚血灌 流モデルにおける血漿中尿素窒素上昇抑制効果を示す図である。
第 2 1図は、 抗マウス F a sリガンド抗体 （# 5 8— 1 1 ) のマウス腎虚血灌 流モデルにおける血漿中クレアチニン上昇抑制効果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下にさらに詳細に本発明を説明する。
本発明の予防 ·治療剤の対象となる疾患には、 種々の疾患が含まれる。 これら の疾患は、 F a sZF a s リガンド系の生物作用、 特に、 F a sを介するァ ポト一シスが関与するものである。 詳しくは、 それらの疾患において、 F a s/ F a sリガンド系の生物作用、 特に、 F a sを介するアポト一シスが、 該疾患又 は付随する症状もしくは病態の発症、 維持又は増悪に関与又は寄与している。 具体的には、 心疾患、 腎疾患、 GVHD、 虚血再灌流障害、 エンドトキシンに 起因する疾患等が挙げられ、 （ 1 ) 心疾患としては、 好ましくは虚血性心疾患、 特に心筋梗塞、 種々の原因による心筋炎、 心筋症、 特に拡張型心筋症、 心不全、 並びに虚血再灌流障害及びそれに基づく心疾患等が含まれる。 心筋梗塞には、 急 性及び陳旧性が含まれる。 心不全には、 特に虚血性心疾患における心不全が含ま れ、 それは、 急性又は陳旧性の心筋梗塞の合併症として起こることが多い。 ( 2 ) G VHDとしては、 不適合性骨髄移植や先天性免疫不全症への骨髄移植等 の骨髄移植後に起る GVHD、 臓器移植後に起る GVHD、 免疫低下した宿主に 対する大量輸血等の輸血後に起る GVHD等が含まれる。 GVHDは、 GVH反 応に基づく臓器又は組織の障害を伴い、 下痢、 体重減少及び痩身等の消耗症、 皮 疹、 肝機能障害を含み、 組織学的には、 骨髄やリンパ組織の崩壊及び腸絨毛の萎 縮を含む症状を特徴とする。
(3) 腎疾患には、 腎虚血、 腎虚血再灌流障害、 それらに基づく疾患、 腎不全及 びその原因疾患が含まれ、 好ましくは急性腎不全等が挙げられる。 急性腎不全に は腎前性急性腎不全、 腎後性急性腎不全及び腎性急性腎不全が含まれる。 腎性急 性腎不全の原因疾患には腎循環障害若しくは腎虚血性の急性尿細管壊死、 腎毒性 による急性尿細管壊死、 急性糸球体腎炎、 急性間質性腎炎、 急性皮質壊死が含ま れ o
(4) 虚血又は虚血再灌流障害に基づく疾患には、 特に、 心臓、 腎臓、 肝 臓、 脳、 肺、 脾臓又は脖臓、 好ましくは心臓、 腎臓又は肝臓における虚血再灌流 障害に基づく疾患、 また、 外科手術または移植に伴う虚血再灌流障害、 および血 栓溶解療法または血管再建術後の虚血再灌流障害に基づく疾患が含まれる。
「虚血再灌流障害」 の語は、 梗塞や外科手術、 移植、 血栓溶解療法あるいは血 管再建術など種々の原因により局所の血流が全くなくなった （虚血） 後に再び血 流が戻った （再灌流） 際に起きる組織損傷や臓器または組織の機能障害であり、
「虚血再灌流障害に基づく疾患」 の語は、 肝臓、 心臓、 腎臓、 脳、 肺、 脾臓、 脬 臓などにおいて認められ、 例えば、 肝不全、 再灌流不整脈、 腎不全などを含み、 これらの疾患に付随する症状及び病態も含んでいる。
( 5 ) 細菌内毒素 （エンドトキシン） に起因する疾患としては、 エンドトキシン による臓器の障害、 ェンドトキシン血症もしくは敗血症又はそれらにおける臓器 P章害およびそれらに基づく疾患が挙げられ、 例えば、 肝障害、 急性肝不全、 腎障 害および腎不全等が挙げられる。
( 6 ) さらに、 その他、 臓器障害に基づく疾患等が本発明の予防 ·治療剤の対象 疾患として含まれる。 本明細書において、 「臓器障害に基づく疾患」 の語は、 例 えば肝不全、 腎不全などの各種臓器不全のみならず、 これらの疾患に付随する黄 疸、 血中 G P T · G O T · L D H等の上昇、 疲労 ·倦怠感、 食欲不振、 意識 障害、 興奮、 昏睡、 腹水、 糸球体濾過量の低下、 浮腫、 蛋白尿、 乏尿、 高力リゥ ム血症、 代謝性アシドーシス、 血中クレアチニン '尿素窒素量等の上昇などの症 状も含んでいる。 また、 S I R Sに伴う MO D Sも含んでいる。
本発明の予防 ·治療剤のその他の可能な対象疾患としては、 ウィルス性肝炎又 はアルコール性もしくは薬剤性の非ゥィルス性肝炎もその用途に含まれる。 これらの疾患においては、 該 F a sアン夕ゴニス卜が臓器又は組織の細胞、 例 えば心筋細胞のアポトーシスを抑制する。
本発明の別の態様は、 F a sアンタゴニストを有効成分として含有することを 特徴とする臓器、 例えば、 心臓、 腎臓、 肝臓等の臓器保存剤である。
なお、 治療対象としては、 ヒ トが重要であるが、 ヒ ト以外の動物も含みう る。
本発明で使用される F a sアンタゴニストは、 F a s /F a s リガンド系ァン タゴニス卜と言うべきものであり、 F a sによるシグナルの発生又は伝達をいず れかの段階で何らかの形で遮断し、 F a s ZF a sリガンド系の機能又は生物作 用、 特に、 F a sを介するアポト一シス、 特に F a s リガンドによる F a sを介 するアポト一シスを抑制又は阻害するものであれば、 特に限定されず、 F a s リ ガンドもしくは F a sの作用もしくは機能を阻害するもの、 F a sリガンド細胞 外領域もしくは F a s細胞外領域と相互作用するもの、 F a s リガンドと F a s の相互作用を阻害するもの、 F a s細胞内領域とそれと相互作用する細胞内因子 との間の相互作用に影響するもの、 または F a sを介するアポトーシスのシグナ ノレ伝達に関与する細胞質内因子 （例えば I C E様プロテア一ゼ） の活性を抑制す るもの等の様々な作用機序を有するものが含まれる。 また、 タンパク質性の高分 子物質および低分子の化合物のいずれもが含まれる。 具体的には、 本発明で使用 される F a sアンタゴニストとしては、 F a s ZF a s L系の作用、 特に F a s を介するアポトーシスを抑制する活性を有する、 F a s誘導体、 抗 F a s リガン ド抗体、 抗 F a s抗体、 F a sもしくは F a s リガンドの遺伝子もしくは mR N Aに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、 F a sの細胞内領域と相互作用す る物質、 または I CE阻害剤等が挙げられる。 ここで、 本発明で用いる F a sァ ンタゴ二ストとしては、 F a sを介するアポト一シスを抑制する作用を有する、 F a s誘導体、 抗 F a s抗体、 又は抗 F a sリガンド抗体が好ましい。 さらに、 F a s及び F a sリガンドはヒト由来のものが好ましく、 抗 F a s抗体及び抗 F a sリガンド抗体はそれぞれ抗ヒト F a s抗体及び抗ヒト F a sリガンド抗体が 好ましく、 抗 F a sリガンド抗体は、 ヒ ト化抗 F a sリガンド抗体であるのが好 ましい。 ヒト化抗 F a sリガンド抗体とは、 定常領域と、 フレームワーク領域が ヒト由来で、 相補性決定領域が非ヒト由来であるのが好ましい。 また、 本発明で 用いる F a sアンタゴニストは、 国際特許出願公開番号 WO 9 5 Z 1 3 2 9 3な どに記載されている適当なアツセィ法において F a s発現細胞のアポト一シスを 抑制するものが好ましい。
なお、 本明細書において引用する文献はこれらをもって本明細書の一部と 成す。
なお、 本発明で用いられる抗体はポリクローナル抗体であってもモノクロ一ナ ル抗体であってもよく、 また、 本発明に使用される抗体の分子種は特に限定され ない。 通常の形態の抗体分子であってもよいし、 さらには抗原に結合し、 F a s抗原を介するアポト一シスを阻害するかぎり抗体の断片、 たとえば、 F ab、 F (ab' ) 2、 Fv、 又は H鎖と L鎖の F vを一本鎖となるよう適当 なリンカ一で連結させたシングルチヱイン F V (s c Fv) も使用することがで きる。 また、 いずれのクラス、 サブクラス及びイソタイプに分類される免疫グロ ブリンであってもよい。 これら抗体は F a sリガンド又は F a sと結合すること により、 F a s/F a sリガンド系の生物作用、 特に、 F a sを介するアポト一 シスを阻害する機能を有するものであれば特に限定されない。
本発明で使用される抗 F a sリガンド抗体又は抗 F a s抗体はその由来、 種類 (モノクロ一ナル、 ポリクロ一ナル） 及び製法を問わないが、 哺乳動物由来のモ ノクロ一ナル抗体が好ましい。 また、 本発明に用いるモノクローナル抗体の産生 細胞の動物種は哺乳類が好ましく、 ヒ ト由来またはヒ ト以外の哺乳動物由来 であってよい。 ヒト以外の哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、 ゥサギ あるいはげつ歯類由来のモノクローナル抗体が好ましい。 げっ歯類としては、 特 に制限されないが、 マウス、 ラッ ト及びハムスターなどが好ましく例示される。 これらの動物を用いるとモノクローナル抗体作製が簡便だからである。 また、 該 モノクロ一ナル抗体としては、 放射免疫測定法 （R I A) 、 酵素免疫測定法 (E I A, E L I S A) 、 蛍光抗体法 ( I mmu no f l u o r e s c e n c e An a l y s i s) 等の通常の免疫学的手段により抗原を認識し、 また、 国際特 許出願公開番号 WO 95 / 1 3 29 3などに記載されている適当なアツセィ法に より F a sを発現する細胞のアポト一シスに対する抑制活性が測定されるものが 好ましい。
これらのうちでも特に、 平成 7年 6月 2 2日付で日本国茨城県つくば巿東 一丁目一番三号の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し （受託番号 P— 1 5 002 ) 、 さらに平成 8年 5月 9日付で原寄託から国際寄託に移管した (受託番号 F ERM B P— 5535 ) ハイプリ ドーマ F 9 1 9— 9— 1 8によ り産生されるマウス F 9 1 9 - 9 - 1 8抗体が好ましい例である。 該抗体の可変 領域配列を図 1 (配列番号 1に c D N Aを記載） 及び図 2 (配列番号 2に c D N Aを記載） に示した。 本発明で用いる抗 F a sリガンド抗体及び抗 F a s抗体は、 例えば、 国際特許 出願公開番号 WO 95 / 1 3 293、 国際特許出願番号 P C TZ J P 9 6 / 0 1 820、 国際特許出願公開番号 WO 95 / 1 0540などに記載されている方法 を用いて作製すること力出来る。
本発明においてモノクローナル抗体を用いる場合は、 公知技術を使用して作製 してもよく、 例えば、 F a sもしくは F a sリガンド又はそれらの部分べプチド 等を感作抗原として使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得ら れる免疫細胞を通常の細胞融合法によつて公知の親細胞と融合させ、 通常のスク リーニング法により、 モノクロ一ナルな抗体産生細胞をスクリーニングすること によって作製できる。
より具体的には、 感作抗原が、 ヒ ト F a s リガンド又はその断片の場合、 Tak aha s h i T. 等、 I n t e r n a t i on a l I mm u n o 1 o gy、 6卷、 1 567— 1 574頁、 1 994年に開示されたヒト F a sリガン ドの遺伝子配列を用い、 該遺伝子配列を公知の発現べクタ一系に挿入して適当な 宿主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中または、 培養上清中から目的 の F a sリガンドタンパク質を精製し、 この精製 F a sリガンドタンパク質を感 作抗原として用いるのが好ましい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細 胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター、 ゥサギ等が使用できる。
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法を用いることが出来る。 このよう に免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、 哺乳動物か ら免疫細胞が取り出され、 細胞融合に付される力 好ましい免疫細胞としては、 特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、 特に限定されないが、 哺乳 動物、 特にマウス等の公知の種々のミエ口一マ細胞株、 例えば、 P 3—X63— Ag 8 -U 1 (P 3— U 1 ) 等が好適に使用される。 前記免疫細胞とミエ口一マ 細胞との細胞融合は基本的には公知の方法、 たとえば、 ミルスティンらの方 法 （Mi l s t e i nら、 Me t ho d s En z ymo l. 73 : 3— 4 6， 1 98 1) 等に準じて行うことができる。
次いで、 公知の方法により、 目的とする本発明で用いる抗体を産生するハイブ リ ドーマのスクリ一ニング及び単一ク口一ン化が行われる。
このようにして作製される、 本発明で用いるモノクローナル抗体を産生するハ イブリ ドーマからモノクローナル抗体を取得するには、 当該ハイプリ ドーマを通 常の方法にしたがい培養し、 その培養上清から得る方法、 あるいはハイプリ ド一 マをこれと適合性がある哺乳動物に移植して増殖させ、 その腹水から得る方法な どが採用される。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後 者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
さらに、 前記の方法により得られる本発明に用いるモノクローナル抗体は、 塩 析法、 ゲル漉過法、 ァフィ二ティークロマトグラフィー法等の公知の精製手段を 利用して高純度に精製してもよい。
本発明に使用されるモノクローナル抗体は、 ハイプリ ド一マを用いる方法に限 られず、 EBV等によって不死化した抗体産生細胞を用いる方法、 遺伝子工学的 に作製する方法を用 、て作製することもできる。 また、 本発明で用いる抗 F a s リガンド抗体及び F a s抗体は、 ヒトに対する 異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変したキメラ抗体または ヒト化抗体がより好ましい。
これは、 非ヒトモノクローナル抗体、 例えばマウス抗体の使用は、 ヒ卜の治療 において、 繰り返しの治療療養法において欠点を有するからである。 第一の欠点 は、 マウスモノクローナル抗体は、 比較的短い循環半減期を有し、 そして、 ヒト に用いられた場合は、 他の重要な免疫グロプリンの機能的特性を欠く ことで める。
第二の欠点は、 非ヒトモノクローナル抗体は、 ヒト患者中に注入されたときに 免疫原性となるアミノ酸の実質的長さを含むことである。 すなわち、 多くの研究 により、 外来の抗体の注入後、 患者によって引き起こされた抗体に対する免疫応 答が、 非常に強くなり得て、 最初の処置後の抗体の治療的有用性を本質的に排除 してしまうことが示されている。 さらに今後種々のマウス若しくは他のヒ 卜に対 する抗原性を有するモノクロ一ナル抗体が開発されたときには、 いずれかの 異なった非ヒト抗体を用いた最初若しくは初期数回の処置の後、 それに続く関連 のない療法のための処置でさえ、 交叉反応性のために効果がなかったり、 若しく はそれ自身が危険な物質となることがあり得る。
本発明で用いる事ができるキメラ抗体は、 ヒト以外の哺乳動物、 例えば、 マウ スのモノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域とからなる。 このよう なキメラ抗体は、 既知のキメラ抗体の製造方法、 特に遺伝子組換技法を用いて製 造することができる。
さらに好ましくは、 再構成 ( r e s h a p e d ) したヒト型抗体を本発明に用 いることができる。 これはヒト以外の哺乳動物、 たとえばマウス抗体の相補性決 定領域 （CDR) をヒ ト抗体の相補性決定領域へ置換したものである。 すな わち、 定常領域と、 フレームワーク領域がヒト由来で、 相補性決定領域が非ヒト 由来であるのが好ましい。 本発明に有用な再構成ヒト型抗体 （ヒト化抗体） の好 適な例としては、 国際特許出願公開番号 WO 97 /02290 (出願番号 PC T /J P 9 6 / 0 1 820 ) に開示されているマウス抗体 F 9 1 9— 9一 1 8抗体 の CD Rを有するものが挙げられる。 その可変領域の 1例を図 3 (配列番号 3に cDNAを記載） 及び図 4 (配列番号 4に cDN Aを記載） に示した。
なお、 必要に応じ、 ヒト化抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成 するように抗体の可変領域のフレームワーク （FR) 領域の 1以上のアミノ酸を 置換してもよい。
本発明に用いるヒ ト化抗体を製造するには、 リーチマンら、 ネ一チヤ一、 3 3 2 : 3 2 3 ( 1 9 8 8 ) 及びヨーロッパ特許公開第 0 2 3 9 4 0 0号公 報、 クィーンら、 P r o c. Na t l . A c a d. S c i . USA, 8 6 : 1 0029 ( 1 989 ) 、 国際特許出願公開公報 WO 90 / 07 8 6 1及び WO 92/1 1 0 1 8、 Co等、 P r o c. Na t l. Ac a d. S c i. USA, 88， 2869 (1 99 1) 、 （ 0及び011 e en、 Na t u r e、 3 5 1巻、 5 0 1頁、 1 9 9 1年、 ならびに、 コ一ら、 J. I mmu n o l . 1 4 8 : 1 1 49 ( 1 992 ) 等に開示されている方法を用いることができる。
本発明で使用される F a s誘導体は、 少なくとも F a sリガンドとの結合能を 有するか、 もしくは F a sリガンドによるアポト一シスを抑制するものであ れば、 特に限定されない。 公知の Fa sのアミノ酸配列中に置換、 欠失、 付加ま たは Zおよび挿入といった任意の変異を有し、 F a sリガンドとの結合活性を維 持したまま、 F a s/F a sリガンド系の生物作用、 特に、 F a sを介するアポ トーシスを阻害するものが含まれる。 さらに該 F a s誘導体には、 F a s変 異体、 切断型 (t r un c a t e d f o rm) F a s、 キメラタンパク質、 融 合タンパク質および化学的に修飾されたものも含まれる。 なお、 その由来となる Fa sは上記の性質を有する限り、 その動物種を問わないが、 抗原性を考慮すれ ばヒト由来のものを使用するのが好ましい。
具体的には、 公知の F a sの細胞外領域、 膜貫通領域を欠失した F a s抗原、 及び Fa s細胞外領域と他の蛋白質とのキメラ蛋白質、 例えばヒ ト F a s細胞外 領域とヒト免疫グロブリンの F c断片のキメラ蛋白質である hF a s— F c等が 挙げられる。 Fa s誘導体は、 何れの製法のものでも良く、 公知の F a sの配列 及び公知の遺伝子組み換え技術等により、 製造することができる。 例えば、 ヒ ト F a s -F cの製法は、 国際特許出願公開番号 WO 95 / 1 3 293の実施例中 などに記載されている。 また、 F a sの N末端に欠失を有する F a s誘導体も好 ましく、 平成 8年 3月 1 4日付で日本国茨城県つくば市東一丁目一番三号の工業 技術院生命工学工業技術研究所に寄託し （受託番号 P - 1 5 5 1 4及び P - 1 55 1 5) 、 さらに平成 9年 3月 6日付で原寄託から国際寄託に移管 （受託番 号 FERMBP— 5854及び受託番号 F E RMB P— 5855 ) されている大 腸菌が含むプラスミ ド （pMl 304及び pMl 3 1 7) (台湾寄託番号はそれ ぞれ C CRC 9 4 0 1 7 1および C CRC 9 4 0 1 7 0 ) にコ一ドされてい る F a s誘導体は、 公知のヒト F a sの N末端の 1番目から 29番目までのァミ ノ酸配列を欠失した Fa s細胞外領域を含有する誘導体 （図 5〜9および配列番 号 5に s hFa s (n d 29) 一 F cをコ一ドする c D N Aの塩基配列を含むベ クタ一 （pM 1 304 ) 中の部分塩基配列を記載し、 図 1 0〜 1 2および配列番 号 6に F a s誘導体の一つである s hFa s (n d 29) — h i n g eをコード する cDN Aの塩基配列を含むベクタ一 （pMl 3 1 7) 中の部分塩基配列を記 載） であるが、 その活性が高く、 本発明の予防 ·治療剤の有効成分として好適な 例である。 これらの本発明に用いる F a s誘導体は、 適当なアツセィ法により F a sリガンドに対する結合活性又は F a sを介するアポト一シスの抑制活性を有 することがわかる。
本発明で使用される F a s又は F a sリガンドの遺伝子または mRN Aに対す るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 F a s又は F a sリガンドの発現を抑制 するものであれば、 その配列は限定されず、 例えば国際特許出願公開番号 WO 9 5 / 1 3 2 9 3に開示されている F a s リガンドのァンチセンスォリ ゴヌクレオチド等が挙げられる （本明細書はこの文献を引用して明細書の内容と する） 。
本発明の予防 '治療剤は、 上述の F a sアンタゴニストを含有することを特徴 とし、 少なく とも一種の医薬用担体、 または媒体、 例えば、 滅菌水や生理食 塩水、 植物油、 鉱油、 高級アルコール、 高級脂肪酸、 無害性有機溶媒等、 さらに は必要に応じて賦形剤、 着色剤、 乳化剤、 懸濁剤、 界面活性剤、 溶解補助剤、 吸 着防止剤、 安定化剤、 保存剤、 保湿剤、 酸化防止剤、 緩衝剤、 等張化剤、 無痛化 剤等と適宜組み合わせて注射剤や経口剤などの医薬組成物ゃキッ 卜の形態をとる ことができる。 本発明の予防 ·治療剤は、 好ましくは非経口的に、 たとえば、 静 脈内注射、 冠動脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射等により全身ある いは局部的に、 ならびに急速もしくは持続的に投与することができる。 本発明の 予防 ·治療剤のヒ トに対する投与量は患者の病態、 年齢あるいは投与方法により 異なるが、 適宜適当な量を選択することが可能である。 例えば、 全身投与の 場合、 約 0 . 1— 1 0 O mgZkgの範囲で適当な分割容量を選択することがで きる。 しかしながら、 本発明の予防 ·治療剤の使用はこれらの投与方法および投 与量に制限されるものではない。 さらに、 複数の F a sアンタゴニストを組み合 わせて使用したり、 他の薬剤と併用してもよい。
本発明の心疾患予防 ·治療剤は常法にしたがって製剤化することができる。 た とえば、 注射用製剤は、 精製された F a sアンタゴニストを溶剤、 たとえば、 生 理食塩水、 緩衝液などに溶解し、 それに、 必要に応じて吸着防止剤などを加えた ものであり、 または、 使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであって もよく、 凍結乾燥のための一般的な賦形剤を使用することができる。
本発明の疾患の予防 ·治療剤に用いる F a sアンタゴニス トは、 心疾患 モデル、 特に実施例のような心虚血再灌流モデルにおいて、 または G V H Dモデ ル、 特に実施例に記載するような G V H Dモデルにおいて、 宿主の臓器及び組織 の障害を抑制し、 生存日数延長及び生存率上昇効果を示す。 また、 腎疾患モデル において、 血清クレアチニンの上昇抑制作用を示し、 さらに、 エンドトキシン誘 発肝障害モデルにおいて、 肝障害の指標である G O T、 G P T等の上昇抑制作用 及び生存率上昇効果を示す。 よって、 本発明の疾患の予防 ·治療剤は、 前述した ような疾患の患者等に投与することにより、 各種臓器又は組織の細胞の障害及び 細胞死、 特にアポ卜一シスを抑制し、 該疾患の予防又は治療効果、 およびそれに 付随する症状の緩和及び病態の改善効果、 ならびに症状の進行や悪化を抑制する 効果を有する。
また、 インビト口での細胞障害抑制活性、 心臓および腎臓の虚血再灌流モデル における組織障害を抑制したことから、 各種臓器の保存効果を有する。
また、 抗 F a sリガンド抗体を用いた実施例ではげつ歯類 （マウスおよびラッ ト） で実験を行っているため、 主に抗マウス Fa sリガンド抗体を使用し予防' 治療剤の効果を示しているが、 ヒ卜に用いる場合は抗ヒト F a sリガンド抗体お よびヒト化抗 F a sリガンド抗体により実施例と同様の効果が期待できる。 本発明に用いる F a sアンタゴニストは、 心疾患、 GVHD、 腎疾患、 虚血再 灌流障害に基づく疾患及び臓器障害に基づく疾患に対する予防 ·治療作用、 並び に臓器保存剤としての作用及び細胞アポト一シス抑制作用を有する。 従って、 本 発明に用いる F a sアンタゴニスト及びそれを含有する薬剤は、 F a sの関与す る疾患、 特に F a sを介するアポトーシスの関与する疾患の予防治療剤として有 用である。 例えば、 心疾患、 特に心筋梗塞等の虚血性心疾患、 種々の原因による 心筋炎、 心筋症、 特に拡張型心筋症、 心不全、 並びに虚血再灌流障害及びそれに 基づく心疾患等を予防 ·治療することができる。
また、 前記した種々の GVHD、 および GVHDに伴う症状又は病態の予防又 は治療のために使用できる。 GVHDには、 不適合性骨髄移植や先天性免疫不全 症への骨髄移植等の骨髄移植後に起る GVHD、 臓器移植後に起る GVHD、 免 疫低下した宿主に対する大量輸血等の輸血後に起る G V H D等が含まれる。 G V HDは、 GVH反応に基づく臓器又は組織の障害を伴い、 下痢、 体重減少及び痩 身等の消耗症、 皮疹、 肝機能障害を含み、 組織学的には、 骨髄やリンパ組織の崩 壊及び腸絨毛の萎縮を含む症状を特徴とし、 これらの GVHDに伴う症状又は病 態の予防又は治療のためにも使用できる。
肝臓、 心臓、 腎臓、 肺、 脾臓、 小腸、 大腸、 胃、 脬臓、 脳、 筋肉、 皮膚などに おいて認められる虚血再灌流障害及びそれに基づく疾患、 例えば、 肝不全、 再灌 流不整脈、 腎不全、 壊死性腸炎などで各臓器の損傷や機能障害を直接予防 ·治療 する目的で用いることができる。 また、 外科手術や移植に伴う虚血再灌流の 際に、 術前 '術後に投与することにより、 上記の臓器または組織の障害を予防ま たは治療し、 移植後の上記の臓器または組織の生着率を改善する効果および機能 を維持する効果が期待される。 さらに組織損傷または壊死性梗塞巣の形成 ·拡大 等に対する阻止効果、 上記の臓器または組織の機能障害の改善効果が期待さ れる。 また、 血栓溶解療法あるいは血管再建術後の虚血再灌流障害に基づく疾患 の予防 ·治療剤として用いることができる。 また、 種々の臓器障害に基づく 疾患、 例えば、 肝不全、 腎不全など、 肝臓、 腎臓などの損傷や機能障害を直接予 防 ·治療する目的で使用することができ、 また、 これらの疾患に付随する黄疸、 血中 G P T · G O T · L D H等の上昇、 疲労 '倦怠感、 食欲不振、 意識障害、 興 奮、 昏睡、 腹水、 糸球体濾過量の低下、 浮腫、 蛋白尿、 乏尿、 高カリウム血症、 代謝性アシドーシス、 血中クレアチニン '尿素窒素量等の上昇などを予防、 治療 または改善する目的で使用することができる。 また、 上記の組織または臓器を移 植する際の保存液中に添加する、 臓器の灌流液中に添加する等の方法により、 移 植時における臓器保存剤として用いることができる。 さらに、 F a sの関与する 種々の疾患、 例えば、 上述した虚血再灌流障害に基づく疾患の予防 ·治療剤とし て用いることができる。 さらには、 S I R Sに伴う MO D Sの予防 ·治療剤とし ても用いることができる。 本発明に用いる F a sアンタゴニストは、 エンドトキシンによる臓器障害、 特 に肝臓障害又はェンドトキシン血症もしくは敗血症において、 急性期のみな らず、 慢性的な障害をも抑制する。 従って、 本発明に用いる F a sアンタゴニス トは、 これらに基づく疾患および付随する病態について予防、 治療または改善す ることが期待され、 医薬品としては非常に好ましい特性を有すると考えられ る。
本発明に用いる F a sアンタゴニストは、 肝臓においては、 移植などの外科的 手術時、 あるいはショックおよび循環不全などによる肝血流量 （血液供給） の減 少あるいは遮断の際の虚血再灌流障害において、 肝不全や組織障害ならびに肝機 能低下に対する予防、 治療または改善作用が期待される。 また、 心臓にお いては、 心筋梗塞に対する血栓溶解療法、 経皮的冠動脈内血栓溶解療法 （P T C R) や経皮的冠動脈内腔拡張術 （P T C A) 後の再灌流の結果、 細胞内カルシゥ ムイオンの過負荷等に起因する不可逆的な細胞死や致死的な不整脈に対する 予防、 治療または改善作用が期待される。 また、 腎臓においては、 術後または腎 移植等に起因する腎虚血、 腎虚血再灌流障害、 それらに基づく疾患、 腎不全、 そ の原因疾患及び糸球体固有細胞 （内皮細胞、 上皮細胞、 メサンギゥム細胞） 、 メ サンギゥム基質、 基底膜の細胞外基質または尿細管上皮細胞などの障害に対する 予防、 治療または改善作用が期待される。 実施例
以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらに限定され るものではない。
実施例 1. s h F a s (n d 2 9) — F c及び s h F a s (n d 2 9 ) - h i ng eの調製
(1) 形質転換体の作製および培養
pM 1 304 S pM1 3 1 7、 および国際特許出願公開 WO 9 5Z1 3 2 93の 実施例 1に記載の p BF— F c 1 (ヒト F a s抗原の細胞外領域とヒ ト I gG 1 の F c領域とのキメラ蛋白質 （hF a s— F cと表記することがある） の発現プ ラスミ ド） を使用して、 以下の方法で形質転換体 COS— 1/pMl 3 04、 C OS- 1/pMl 3 1 7, COS- 1/p BF-F c 1を作製した。 すなわち、 それぞれのプラスミ ド DNA 1 0 0〃 gを 5 0 0 1の 1 0 mMT r i s— HC 1 (pH 7. 4) /1 mMエチレンジァミン四酢酸 （以下、 TEバッファ一 と略す） 溶液に溶解した。 これらに、 それぞれ 0. 2mg/m 1 DEAE—デキ ストランおよび 5 0 mM T r i s— HC 1 (p H 7. 4) を含有する D— MEM (曰水製薬） 1 25mlを添加し、 D N A— D E A Eデキストラン混合液 を作製した。 1 700 cm2 ローラ一ボトル （コ一ニング社製） でセミコンフル ェン卜まで単層培養した COS— 1細胞に DNA— DEAEデキストラン混合液 を添加し、 37°Cにて培養し、 形質転換体 COS— 1/pMl 3 04、 COS— l ZpM1 3 1 7、 COS- l /p B F-F c 1を得た。 4時間後、 D N A 一 DEAEデキストラン混合液を除去し、 1 0 %ゥシ胎児血清 （ライフテツ クオリエンタル社製） を含有する D— MEM培地に交換し、 さらに 24時間培養 した。 その後、 培地を p h e n o 1 r e d f r e e D-MEM (FBS, BSA無添加） に交換し、 さらに 72時間培養した後、 培養上清を回収した。 (2) s hFa s (n d 29) — F cの精製
①ァフィニティ一クロマトグラフィー
COS- 1/pMl 304培養上清 1 1を、 硫安沈殿 （ 70 %飽和） した後、 リン酸緩衝生理食塩液 （PBS) に懸濁し、 PBSに対して透析した。 得られた 懸濁液 5 7 m 1を、 使用説明書に従い、 ァフイブレツププロティン Aプレパ ラテイヴカートリッジ （バイオラッ ド社製； 7. 3m l) カラムにアプライし、 溶出し s hF a s (n d 29) — F cを回収した。 フィルトロンオメガセル （フ ジフィルタ一社製；分画分子量 30 kD) を用いて限外濾過を行い、 濃縮した。 この濃縮液を 0. 9%NaC 1に対して透析し、 精製 s hFa s (n d 29) - F cを得た。 また、 同様にして、 hF a s— F cを精製した。 各標品のタンパク 質量はゥシ血清アルブミンを標準物質として L o w r y法で測定した。
得られた精製 s h F a s (n d 2 9 ) — F cを、 0. 1 %S D Sを含む 5— 20 %グラジェントゲルを用いたポリアクリルァミ ドゲル上で電気泳動を行 い、 2D—銀染色試薬 · II 「第一」 （第一化学薬品社製） で染色し、 バンドを検 出した。 精製された s hFa s (n d 29) 一 F cは非還元下で 2量体に相当す る分子量約 85 kD、 還元下で単量体に相当する約 43 kDのほぼ 1本のバンド として検出された。
得られた精製 s hF a s (n d 29) — F cを、 予め 0. 0 5%トリフルォロ 酢酸にて平衡化した V YD AC C 4カラム （4. 6 mm0 x 25 cm、 サイプ レス社製） に供し、 次いでカラムを 0. 05 %トリフルォロ酢酸で洗浄した。 洗 78 浄後、 0. 05%トリフルォロ酢酸 /0〜1 00%ァセトニトリルを使用し、 直 線濃度勾配法により流速 1 m 1 Z分にて溶出を行った。
溶出されたメインピークの画分を凍結乾燥し、 7 0%蟻酸に溶解してサンプル とし、 モデル 477 Aプロテインシークェンシングシステム一 1 20 APTHァ ナライザ一 （パーキンエルマ一社製） を使用し、 その N末端アミノ酸配列を決定 した。 即ち、 PTHアミノ酸の検出を 27 0 nmの紫外部吸収にて行い、 予め同 一の方法で分離した標準 PTHアミノ酸 （パ一キンエルマ一社製） の保持時間を 基準にしてアミノ酸を同定した。 この結果、 ヒ ト F a s抗原の N末端アミ ノ酸 29残基を欠失した N末端アミノ酸配列 （Th rG l nAs nL e uG l u G l yL e uH i sH i sAs p) を有していることが確認された。
(3) s hFa s (n d 29) -h i n g eの精製
ヒト F a s抗原で免疫したマウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞を用いて公 知の方法 （K o h l e rと M i l s t e i n, N a t u r e, 2 5 6卷、 4 9 5頁、 1 9 7 5年） で作製した、 抗 F a sモノクロ一ナル抗体 （4 B 4 一 B 3) を、 ホルミルーセル口ファイン （生化学工業社製） と混合し、 常法に従 い、 抗体ァフィ二ティ一カラムを作製した。
COS— 1/pMl 3 1 7培養上清 1 0 1を、 フィルトロンミニセッ ト （分画 分子量 1 0 k D； フジフィルター社製） で限外濾過濃縮し、 1. 5 1とした。 そ の後に、 濃縮液に 1M T r i s—HC l (pH 9. 0) を添加して pH8. 0 に調製し、 1 M Na C 1を含む 5 0 mM Tr i s—HC l (pH 8. 0) に て予め平衡化した抗 F a s抗原モノクロ一ナル抗体固定化ァフィ二ティ一力 ラムにアプライした。 カラムを 1 M N a C lを含む5 0 mM T r i s— HC 1 (pH 8. 0 ) 320 mlで洗浄後、 1 M Na C 1を含む 0. 1 M g l y c i n e— HC 1 (pH 2. 5) で s hFa s (n d 29) -h i n g e を溶出した。 s hFa s (n d 29) 一 h i n g eを含む画分をプールし、 フィ ルトロンオメガセル （分画分子量 1 0 k D； フジフィルター社製） を用いて限外 濾過を行い、 濃縮した。 この濃縮液を 0. 9 %N a C 1に対して透析し、 精 製 s hF a s (n d 29) 一 h i ng eを得た。
得られた精製 s hF a s (n d 29) — h i n g eを、 0. 1 % S D Sを含む 5 -20 %グラジェントゲルを用いたポリアクリルァミ ドゲル上で電気泳動を行 い、 2D—銀染色試薬 · II 「第一」 （第一化学薬品社製） で染色し、 バンドを検 出した。 精製された s h F a s (n d 2 9 ) -h i n g eは非還元下で分子 量約 4 3 k D及び約 2 7 k Dの 2本のバンドとして、 還元下で約 2 3 k D及 び 27 kDの 2本のバンドとして検出された。
上記で得た精製 s hF a s (n d 29) 一 h i n g eを用い、 前記と同様に、 その N末端ァミノ酸配列を決定した。 その結果、 ヒト F a s抗原の N末端ァミノ 酸 29残基を欠失した N末端アミノ酸配列を有していることが確認された。
(4) s hFa s (n d 29) — F c、 s hFa s (n d 29) 一 h i n g e及 び hF a s— F cのアポトーンス抑制活性の比較
s hFa s (n d 29) 一 F c及び h F a s— F cが 1 A 1 2細胞及び F Lm 1 4細胞の WC 8細胞及び W 4細胞に対する細胞障害活性を抑制する活性を指標 として測定した。 1 A 1 2細胞はヒ ト F a s リガンドを発現するようにマウ ス WR 1 9 L細胞を形質転換させた細胞であり、 また、 FLml 4細胞はマウス Fa sリガンドを発現するようにマウス FDC— P 1細胞を形質転換させた細胞 である。 WC 8細胞はヒト F a s抗原を、 W4細胞はマウス F a s抗原を発現さ せるようにマウス WR 1 9 L細胞を形質転換させた細胞である。 この WR 1 9 L 細胞は、 マウス F a s抗原を殆ど発現せず、 TNFの細胞障害作用に感受性の細 胞である。 細胞障害活性の測定は、 ルービエ E. (Ro u V i e r E. ) 等 の方法に準じて行った （J. Exp. Me d. ， 1 77巻、 1 9 5— 2 0 0頁、 1 993年） 。 先ず、 1 A 1 2細胞或は FLml 4細胞を 1 0%非働化？83含 有 R PM I 1 6 4 0で洗浄し、 エフェクタ一細胞とした。 一方、 1 0 0〃 1 の 1 0 %非働化 FB S含有 RPM I 1 640中で、 20 C iの [5 1 C r] ク ロム酸ナトリウム （NE N社製） と共に 1 X 1 06 個の WC 8細胞または W4細胞を 37°Cで 2時間インキュベートした。 1 0 %非働化 FB S含有 RPM 1 1 6 4 0で洗浄した後、 これらの細胞をタ一ゲッ ト細胞として使用した。 1 X 1 04 個の 1 A 1 2細胞或は 1 X 1 05 個の FLm 1 4細胞とタ一ゲッ ト細 胞 1 X 1 04 個とを、 様々な濃度の s hF a s (n d 29) — F c及び hF a s — F cと丸底のマイクロタイタ一プレー卜の各ゥエル中で混合した。 このとき全 液量が計 1 00 1になるようにした。 800 r pmで 2分間、 プレー卜の遠心 操作を行った後、 37 °Cで 4時間インキュベートした。 更に、 1， 2 00 r pm で 5分間プレートの遠心操作を行い、 各ゥエルより上清 5 0 // 1を分取してァカ ゥンターを用いて放射活性を測定し、 特異的細胞溶解率を算出した。 51C rの自 然放出は、 培地のみでタ一ゲッ ト細胞をインキュベートすることにより決定し、 一方、 最大放出量は、 ターゲッ ト細胞に 0. 1 %となるように T r i t 0 nX— 1 00を加えることにより決定した。
1 A 1 2細胞をェフ クタ一細胞とし、 WC 8細胞をタ一ゲッ ト細胞としたと き、 および、 FLml 4細胞をエフヱクタ一細胞とし、 W4細胞をタ一ゲッ ト細 胞としたときの s h F a s (n d 29) 一 F c及び h F a s— F cの特異的細胞 障害抑制活性を比較したところ、 s hF a s (nd 29) —F cは、 hF a s— F cと比較して 3〜 1 0倍高い細胞障害抑制活性^有していた。
同様に、 s hF a s (n d 2 9) 一 h i n g eは hF a s— F cと比較し て 3〜1 0倍高い細胞障害抑制活性を有していた。
実施例 2. Fa sアンタゴニス卜の心疾患モデルにおける効果
(1) 心虚血再灌流モデルの作製
320〜450 gの雄性 Wistarラッ ト （日本チヤ一ルスリバ一 （株） 製） にネ ンブタール （大日本製薬 （株） 製） 6 0 mgZk gを腹腔内投与し、 麻酔し た。 3 5 °Cに保温した保温台 （ I KED A S C I ENT I F I C CO. LTD製） 上に仰臥位にラッ トを固定後、 気管を切開し人工呼吸器 （シナノ製作 所製 SN— 480— 7 ) を接続した。 次に左側胸部第 4肋間で開胸し心臓を露 出し、 左冠状動脈の起支部より 2〜3 mm上流を糸付き縫合針 （眼科用弱湾針、 (株） 夏目製作所製） を用いて片蝶結びにて結紮した。 20分後に片蝶結びを解 く ことで結紮を解除し、 再灌流を 3 時間行った。 次に虚血領域を決定するた めに、 再び結紮を行い、 左大腿静脈から 1 %エバンスブル一含有生理食塩水を投 与した。 その後、 心臓を摘出し、 液体窒素で凍結後、 剃刀刃 （フ ザ一安全剃刀 (株） 製） を用いて 5つの切片に分け、 1 %TTC (塩化 2、 3、 5、 トリフエ ニルテトラゾリゥム、 和光純薬工業 （株） 製） 含有生理食塩水中で 37°C、 2 0 分染色した。 各切片は以後の解析まで、 1 0%中性緩衝ホルマリン液中に保存し た。 また、 血漿中クレアチンキナーゼ （CPK) 測定用に、 再灌流 1時間後およ び 3時間後に頸静脈から採血を行った。
(2) ヒ ト F a s— F cの投与
ヒ ト F a s— F c (h F a s -F c) は、 国際特許出願公開番号 WO 9 5 Z1 3293の実施例 1に記載の方法に従って調製したものを使用した。 0. 1 %ヒト血清アルブミン （ （財） 化学及血清療法研究所製） 含有生理食塩水にて希 釈し、 l mgZl OmlZkgの用量で、 再灌流開始直後に右大腿静脈から投与 した。 なお、 コントロール群には 0. 1 %ヒ 卜血清アルブミン含有生理食塩水を 投与した。 hF a s—F c 1 mgZk g投与群を 5例、 コントロール群を 8例と した。
(3) 各切片中の非虚血領域、 虚血領域、 壊死領域の測定
各切片の非虚血領域 （エバンスブルー陽性、 TTC陽性領域） 、 虚血領域 （ェ バンスブルー陰性、 TTC陽性領域） 、 壊死領域 （エバンスブル一陰性、 TTC 陰性領域） の割合は以下の方法で算出した。 心切片の両面 （上面、 下面） につい て、 実体顕微鏡 （SHZ 1 0、 ォリ ンパス光学工業 （株） 製） からの画像を 画像解析ソフ ト （ I ma g e C omma n d 5 0 9 8、 オリンパス光学工業 (株） 製） に入力し、 モニター上で非虚血領域、 虚血領域、 壊死領域を分画し、 分画した画面をプリンタ一に打ち出した。 打ち出した画像中の各領域の面積をデ ジタルブラ二メータ一 （ （株） 内田洋行製） を用いて測定した。 次に以下の式に より、 各領域の湿重量を計算した。 切片の上面、 下面の各領域の面積比を 各々 A、 Bとすると各領域の湿重量 = 0. 5 X (A + B) X切片湿重量であ
-t)o
(4) 心標本に占める非虚血領域、 虚血領域、 壊死領域の比率 （％) の算出 各切片における非虚血領域の湿重量の和を全非虚血領域の湿重量とした。 また、 全非虚血領域の湿重量と各切片の湿重量の和 （心標本全湿重量） の比 率 （％) を心標本に占める非虚血領域の比率 （％) とした。 同様に、 虚血領域、 壊死領域について全湿重量および、 心標本に占める比率 （％) を算出した。 (5) 血漿中クレアチンキナーゼ （CPK) 測定
血漿中 CPK値は、 CPKテストヮコ一および、 オートアナライザ一 （COB ASFARA、 ロッシュ社製） を用いて測定した。
(6) 結果
h F a s— F c投与群の虚血領域に対する壊死領域の比率 （％) はコントロー ル群よりも低かった （図 1 3) 。 また、 hF a s— F c投与群の血漿中クレアチ ンキナ一ゼ （CPK) 活性値はコントロール群よりも低かった （図 1 4) 。 実施例 3. hF a s -F cの毒性試験
( 1 ) 方法
7週齢の雌性 I C Rマウス （日本エスエルシ一 （株） 製） に h F a s— F c 2. 5mg/k gを連日 3日間腹腔内に投与した。 対照群には生理食塩水を 投与した。 投与開始前日から、 投与終了の翌日まで、 連日体重を測定し、 hF a s— F c投与の体重に及ぼす影響を調べた。 また、 投与終了の翌日に剖検を実施 し、 主要臓器の肉眼的観察及び脾細胞数の測定を行い、 hF a s— F c投与の影 響を調べた。
( 2 ) 結果
連日 3日間の hF a s— F c 2. 5mg/k gの腹腔内投与は、 体重および脾 細胞数に影響を及ばさなかった。 また、 剖検においても hF a s— F c投与によ る影響は観察されなかった。
実施例 4. F a sアンタゴニス卜のマウス GVHDモデルにおける効果
(1) 宿主マウスの骨髄抑制
宿主マウスと して、 雄性、 6週齢、 BDF 1マウス （日本チヤ一ルスリ バ一 （株） 製） を用いた。 宿主マウスの腹腔内にシクロホスファミ ド （塩野義製 薬 （株） 、 エンドキサン） を 450 mg/k gを投与し骨髄抑制を誘導した。
(2) 供与マウス由来脾臓リンパ球の調製および宿主マウスへの移植
供与マウスとして雄性、 7週齢、 C 5 7 B LZ6マウス （日本チヤ一ル スリバー （株） 製） を用いた。 供与マウスの脾臓をハンクス液 （日水製薬 （株） 製） 中でピンセッ トを用いてほぐした後、 遠心し、 得られた細胞を 0. 0 1 7M トリス— 0. 7 4 7 %塩化ァンモニゥム溶液中に懸濁し赤血球のみを溶血さ せた。 残った細胞をハンクス液で洗浄したものを供与マウス由来脾臓リンパ球と し、 前述のシクロホスファミ ド投与 1日後の宿主マウスに 3 X 1 07 個 /マウス 尾静脈から移植した。
(3) hFa s-F cの効果検討
供与マウス由来脾臓リ ンパ球移植の翌日から、 h F a s— F c l、 3、 1 OmgZk gを 2日に 1 回、 尾静脈から投与し、 生存日数に対する効果を調べ た。 なお、 コントロール群には hF a s— F cの希釈液である 0. 1 %ヒト血清 アルブミ ン （ （財） 化学及血清療法研究所製） 含有生理食塩水を投与し、 各群] = 5とした。 その結果、 コントロール群に比較して、 hF a s— F c l O mg/k g投与群に生存日数延長効果が認められた （図 1 5) 。 また、 体重減少 も軽度であった。 実施例 5. s h F a s (n d 2 9 ) — F c生産 C HO細胞 （CHO (pM 1 3 0 4 ) 7 2 - 1 0 5 - 5 5) の作製
(1) s hF a s (n d 2 9) 一 F c形質転換体の作製
プラスミ ド pMl 3 0 4 1 6〃gを 5. 5 1の 1 0 mMT r i s— H C 1 (pH 7. 4) Zl mMエチレンジァミン四酢酸溶液に溶解した。 これらに F— 1 2 Nu t r i e n t M i x t u r e (Ham) 培地 （G I B C 0 B R L社 製；以下、 HamF 1 2培地と略す） を 8 0 0 1になるよう加え、 溶液 Aとし た。 L i p 0 f e c t AM I NE試薬 （G I B CO BRL社製） 9 6 〃 1 に HamF 1 2培地を 8 0 0 \になるよう加え、 溶液 Βとした。 溶液 Αと溶液 Bを混合し、 室温で 3 0分間インキュベート後、 H amF 1 2培地を 6. 4m l 添加し、 DNA— L i p o f e c t AM I N E混合液を作製した。 前日 に、 1. 2 1 0 6 個の(： 110 D X B 1 1細胞を 1 0 c ΙΉ Φシャーレ (コ一ニング社製） に植え込んだものを H a mF 1 2培地で洗浄後、 DN A-L i p o f e c t AM I NE混合液 8 m 1を添加した。 5 % C 02 / 9 5 % a i r存在下、 3 7でで 7. 5時間イ ンキュベー ト後、 D N A— L i p o f e c t AM I NE混合液を除去し、 1 0 %非働化ゥシ胎児血清 (JRH B I OSC I ENCES社製） 含有 HamF 1 2培地に交換し、 さら に 2 4時間培養した。 再度、 1 0%非働化ゥシ胎児血清含有 HamF 1 2培地に 交換し、 2 4時間培養後 1 03 、 1 04 、 1 05 個 Z 1 0 m 1 1 0 %非働化ゥ シ胎児血清含有 HamF 1 2培地 Zl 0 c ΓΠΦシャーレになるよう蒔き直した。 その 2日後、 1 0 %非働化透析ゥシ胎児血清 （G I B C 0 BR L社製） 含有 Μ i n i mum E s s e n s i a l Me d i um A l p h a Me d i um w i t h o u t r i b o n u c l e o t i d e s a n d d e o xy r i b o n u c l e o t i d e s (G I BCO BRL社製；以下、 ΜΕΜα (—） と略す） 培地に交換し、 DHFR遺伝子が導入された細胞の選択を開始した。 そ の後、 3または 4日毎に 1 0 %非働化透析ゥシ胎児血清含有 ΜΕΜα (—） 培地 で培地交換すると約 2週間目ごろより、 DHFR陽性細胞のコロニーが形成され た。 これら力、ら、 延原らの方法 （実験医学、 Vo l . 5 No. 1 1 1 9 8 7 年、 1 1 0 8— 1 1 1 2頁） に従い、 s h F a s (n d 2 9 ) 一 F c発現ノ DHFR陽性細胞をクロ一ニングした。 すなわち、 約 100 個の単コロニーを ペニシリンカップを用いてクローニングし、 4 8穴プレート （NUNC社製） へ 継代した。 その後、 3または 4日毎に 1 0%非働化透析ゥシ胎児血清含有 MEM a (一） 培地で培地交換し、 コンフルェントになるとスケールアップした。 6穴 プレート （NUNC社製） でコンフルェントになる程度まで、 細胞が増殖し たら、 細胞数を 2. 5 X 1 05 個 Z 5 0 0 / 1 1 0 %非働化透析ゥシ胎児血清 含有 MEM α (—） 培地 /2 4穴プレート （NUNC社製） にそろえて植 え込み、 2または 3日後に上清を回収した。 上清中の s hF a s (n d 2 9) - F c量を E I Aで測定し、 発現量の高い株 （CHO (pMl 3 0 4 ) 7 2 ) を選 択した。
(2) 遺伝子増幅による s h F a s (n d 2 9 ) 一 F c高発現株 （CHO (pM 1 3 0 4 ) 7 2 - 1 0 5 - 5 5 ) の作製
延原らの方法 （実験医学、 Vo l. 5 No. 1 1 1 9 8 7年、 1 1 0 8— 1 1 1 2頁） に従いメソトレキセ一ト （MTX) による遺伝子増幅を行い、 s h F a s (n d 2 9) 一 F c高発現株を作製した。 すなわち、 CHO (pM 1 3 0 4) 7 2細胞を 1 03 、 1 04 、 1 05 個 Z 1 0 m 1 1 0 %非働化透析ゥシ胎 児血清含有 MEM （一） 培地 Z1 0 crn シャーレになるよう植え込み、 翌日 5 nM MTX (L e d e r 1 e社製） を含む 1 0 %非働化透析ゥシ胎児血清含 有 MEM （一） 培地に交換し、 遺伝子増幅を開始した。 その後、 3または 4日 毎に 5 nM MTXを含む 1 0%非働化透析ゥシ胎児血清含有 ΜΕΜα (―) 培 地で培地交換すると、 約 2週間目ごろより 5 η Μ ΜΤ X耐性細胞のコロニーが 形成された。 以降、 CHO (ρΜ 1 3 0 4 ) 7 2細胞取得と同様の方法で、 5 nM MTX耐性株 s hFa s (n d 29 ) — F c高発現細胞 （C H 0 ( p M 1 3 0 4 ) 7 2 - 1 0 5 ) を得た。 その後、 同様の操作を繰り返すことで、 5 0 nM MTX耐性株s hF a s ( n d 2 9 ) — F c高発現細胞 （ C H 0 (pM 1 304 ) 72 - 1 0 5 - 55 ) を得た。
実施例 6. CHO細胞を用いた s hF a s (n d 29 ) — F cの生産およびそ の精製
(1) s hFa s (n d 29) —F c生産 CHO細胞の培養
実施例 5で作製した CHO (pM 1 3 0 4) 7 2— 1 0 5— 5 5を培養面 積 6 0 0 0 c m2 のセルファク ト リー （Nu n c社製） に増殖培地として 5 0 nM MTX含有 I BL M e d i a I ( (株） 免疫生物研究所製） を 用い、 2. 3 X 1 04 個/ cm2 となるよう植え込み、 5 %C〇2 / 9 5 % a i r存在下、 37 °Cで 6日間培養した。 コンフルェントになったのを確認後、 培地を I BL Me d i a Iからインシュリンとトランスフヱリンを除いた培地 (生産培地） に交換した。 5%C 02 / 95 a i r存在下、 3 7°Cで 4日間培 養した後に上清を回収した。 上清回収後の細胞に、 再び生産培地を加え、 さらに 4日間培養し上清を再び回収した。
(2) CHO細胞培養上清からの s h F a s (n d 29) 一 F cの精製 実施例 1一 （2) と同様の方法で上述の培養上清から、 プロテイン Aクロマト グラフィ一を用いて s hF a s (n d 29) — F cを精製した。
実施例 7. s hF a s (n d 29 ) — F cの毒性試験
s h F a s (n d 2 9 ) 一 F cの毒性を調べるために、 雄性、 6週齢、 BDF 1マウス （日本チヤ一ルスリバ一 （株） 製） に s hF a s (n d 2 9) — F cを 1 0、 30 mg/k gの用量で 2 日に 1 回、 1 2日間、 計 7回尾静脈から 投与し、 その影響を調べた。 実験はコントロール群、 s hF a s (n d 2 9) 一 F c 1 Omg/k g投与群、 s hF a s (n d 29) -F c 3 Omg/k g投与 群の 3群とし、 各群 n = 3とした。 なお、 各投与群の投与蛋白質量を同じ 3 Omg/k gとするために、 コントロール群には 3 Omg/k gのヒ ト血清ァ ルブミンを、 s hFa s (n d 29) 一 F c l Omg/k g投与群には s hF a s (n d 29) — F c l Omg/kgとヒト血清アルブミン 2 Omg/k gを、 s hF a s (n d 2 9 ) ~F c 3 0 mg/k g投与群には s h F a s (n d 29) — F c 3 Omg/k gを投与した。 投与開始日から、 2日に 1回、 体重測 定を行った。 投与開始 1 4日目に眼底静脈より採血を行い血球数を測定後、 血漿 を調製し、 GOT、 GPT、 クレアチニンを測定した。 また、 採血終了後、 剖検 を行い、 目視による主要臓器 （肺、 心臓、 肝臓、 腎臓、 脾臓、 腸） の変化を調べ た。 血球数の測定は S y sme x社の自動血球測定装置 K一 2 0 0 0を用い て行った。 GOT、 GPT、 およびクレアチニンはオートアナライザ一C〇BA SFARA (ロッシュ社製） を用いて測定した。 その結果、 1 0、 30mg/k gの s hFa s (n d 29) — F cを 2 日に 1 回、 1 2日間、 計 7回マウスに投与しても体重増加、 血球数、 肝臓 （GOT、 G PT) 、 腎臓 （クレアチニン） 、 その他主要臓器 （肉眼的所見） への有意な影響 は認められなかった。
実施例 8. F a sアンタゴニストのエンドトキシン誘発肝障害モデルにおける 効果
(1) s hF a s (n d 29) 一 F cのマウス肝障害抑制作用
C 57 B L/6 C r S 1 cマウス （雄、 9週齢、 日本エスエルシ一株式会社 製） を用い、 1群 5匹、 3群を被験動物として用いた。 同マウスに 1. 5mg/ m 1の濃度になるように生理食塩水に溶解したプロピオンバクテリウムァクネス (P. a c n e s s ) 加熱死菌 （リ ピイムノケミカルコーポレーション社 製） 液を尾静脈から 0. 2 m l投与した。 8日後に、 実施例 1で調製した s hFa s (n d 29) — F cを希釈液 （ 0. 1 %ヒ ト血清アルブミン含有生理 食塩水） で希釈し、 0. 3mgZ8mlZkg、 1 m g/ 8 m 1 /k gの用量で 尾静脈から投与した。 対照群には希釈液を投与した。 5分後に の濃 度になるように生理食塩水で調製したリポポリサッカライ ド （シグマ社製） 液を 0. 2ml腹腔内に投与した。 リポポリサッカライ ド投与 8、 24時間後に眼底 から 7 5 1を採血した。 採血した血液は 3. 8 %クェン酸ナトリゥム水溶 液 8. 3 n 1と混合後、 3000回転、 1 0分間遠心した。 遠心後、 得られた血 漿を液体窒素で凍結後、 使用時までマイナス 30度で保存した。 GOT、 GPT の測定は GOT— FAテストヮコー （和光純薬工業株式会社製） 、 GPT— FA テストヮコー （和光純薬工業株式会社製） とオートアナライザ一 （ロッシュ P T/JP97/03978 社製、 コバスファラ） を用いて測定した。 その結果、 s hFa s (n d 2 9) 一 F c 1 mg/8 m 1 /k g投与群において G O Tおよび G P Tの値は対照群の それよりも低値であり、 肝障害抑制効果が認められた。
(2) s hF a s (n d 29) -h i n g eのマウス肝障害抑制作用
C 57 BL/6 C r S i cマウス （雄、 9週齢、 日本エスエルシ一株式会社 製） を用い、 1群 5匹、 3群を被験動物として、 上記と同様に行った。 その 結果、 s hF a s (n d 29) —h i n g e投与群の GOTおよび GPTの値は 対照群のそれよりも低値であり、 肝障害抑制効果が認められた。
実施例 9. 抗ヒト F a sリガンド抗体の肝障害モデルマウスにおける効果 (1) 肝障害モデルマウスの作製
雄性、 5週齢、 BAL B/cマウス （日本エスエルシー （株） 製） を用 いた。 同マウスに 5. O mg/m lの P. a c n e s加熱死菌 （ R I B I I MMUNOCHEM RESEARCH, I N C. ) 含有生理食塩水を尾静脈 から 2 m 1投与し、 1 0日後にヒト F a sリガンド細胞外領域を 0. 1 %ヒ ト血清アルブミン含有生理食塩水で 50 u g/m 1に希釈し、 尾静脈から 0. 2 m 1投与することで肝障害モデルマウスを作製した。 なお、 ヒト F a sリガンド 細胞外領域は、 ピキア （P i c h i a p a s t o r i s) 酵母用プラスミ ド PP I C 9 ( I n V i t r o g e n社製） に、 ヒ ト F a sリガンド細胞外領域 をコードする DN Aを組み込んだ発現プラスミ ドで、 ピキア酵母 GS 1 1 5 株 （I nv i t r o g e n社製） を形質転換し、 得られた形質転換体の培養上清 から、 80%飽和硫安塩析、 hF a s— F c結合プロテイン A—セル口ファイン ァフィ二ティ一カラム、 及び Mono S (フアルマシア社製） カラム等による精 製操作により得た （タナカ M. 等、 Na t u r e Me d i c i n e. 2巻、 3 1 7— 3 2 2頁、 1 9 9 6年） 。 また、 国際特許出願公開番号 WO 9 5/1 3
2 9 3の実施例 1 8に記載の方法に従って調製したものも同様に使用できる。 ( 2 ) 抗ヒ ト F a sリガンド抗体の致死抑制効果
前述の受託番号 F ERM B P— 5 5 3 5のハイブリ ド一マ F 9 1 9— 9 - 1 8により産生されるマウス抗ヒ 卜 F a s リガンドモノクローナル抗体 F 9 1 9— 9一 1 8を使用した。 抗ヒ ト F a s リガンドモノクローナル抗体 F 9 1 9— 9一 1 8投与群には、 ヒ ト F a s リガンド細胞外領域投与の 5分前に F 9 1 9— 9— 1 8を 0. 4mgZk gあるいは 1. 2mgZk g尾静脈から投 与した。 コントロール群には、 抗ヒ ト F a s リガンド抗体の希釈液である 0. 1 %ヒ ト血清アルブミ ン含有生理食塩水を投与した。 各群 n= 5とした。 その 結果、 コント口一ル群は F a s リガンド細胞外領域投与 8時間後までに全例死亡 したが、 抗ヒト F a sリガンド抗体 0. 4mg/k g投与群の 2 4時間後の生存 率は 2 0 %、 抗ヒト F a s リガンド抗体 1. 2mg/k g投与群の 2 4時間後の 生存率 1 0 0%であった （図 1 6) 。
実施例 1 0. 抗マウス F a sリガンド抗体の作製および生産、 精製
( 1 ) 抗マウス F a sリガンド抗体の作製
可溶型マウス F a sリガンド WX 2 (J. I mmun o l o gy、 1 5 7卷、
3 9 1 8— 3 9 2 4頁、 1 9 9 6年） 由来のマウス F a sリガンド細胞外領域と マウス CD 4 0 リガンドの細胞内領域、 膜貫通領域および細胞外領域の一部 （N 末端から 7 8アミノ酸） を融合したキメラ蛋白質をコードする遺伝子をヒ トエロ ンゲ一シヨンファクター （EF) プロモータの下流に有するプラスミ ドを作製し た （ミズシマーナガタ （Mi z u s h i ma-Na g a t a) 、 N u c 1 e i c Ac i d s Re s e a r c h, 1 8卷、 5322頁、 1 9 9 0年） 。 上記プ ラスミ ドを WR 1 9 L細胞にトランスフヱク トし、 細胞膜上にマウス F a sリガ ンドを発現している組換え細胞 W 40 LFLを得て、 投与抗原として用いた。 免 疫動物としてアルメニアハムスターを用いた。 フロイント完全アジュバントと混 合した 1 X 1 07 個の W4 0 L F Lをアルメニアハムスターの皮下に投与 し、 1 ヶ月後に P B Sに懸濁した 2 X 1 07 個の W4 0 L F Lを皮下に投与 した。 さらに 1ヶ月後、 PBSに懸濁した 5 X 1 06 個の W40 LFLをフッ ト パッ ドに投与した。 3日後、 リンパ節細胞を取り出し、 マウスミエ口一マ細胞 P 3 -X 63 -Ag 8 -U 1 (P 3— U 1 ) と細胞融合した。 HAT培地 （ヒポキ サンチン一アミノプテリン一チミジン） による選択の後、 生育したハイプリ ドー マの中から、 その培養上清中にマウス F a sリガンドによる細胞障害性を中和す る活性を有するハイプリ ドーマ FL I M4 (# 4— 2) 、 FL I M23 (# 23 — 2) 、 FL IM58 (# 58— 1 1) を得た。
(2) FL I M5 8 (# 58— 1 1 ) の生産および精製
ハイブリ ドーマ # 5 8— 1 1を無血清培地 H y b r i d oma - S FM (G I B COBRL社） にて培養し、 その培養上清をプロテイン一 Aカラム (PROS E P— A、 B i o p r o c e s s i n g社） で精製し、 精製抗体 FL IM58 (# 58— 1 1) を得た。 蛋白濃度は 280 nmの吸光度より算出 した。 実施例 1 1. マウスおよびラッ ト F a sリガンドに対する抗マウス F a sリガ ンド抗体 # 58— 1 1の中和活性
抗マウス F a sリガンド抗体 # 58— 1 1の中和活性は国際特許出願公開番号 WO 95 /1 3293の実施例に記載されている方法と同様に、 51 C rの遊離を 指標としたアツセィにより調べた。
(1) エフェクター細胞の調製
雄性、 7週令、 I CRマウス （日本チヤ一ルスリバ一） および、 雄性、 1 1週 令、 Wi s t a rラッ ト （日本チヤ一ルスリバ一） の脾細胞を実施例 4の方法と 同様に調製した。 得られた脾細胞を 2 X 1 06 個 Zm 1の濃度に調製し、 4 0 U /m 1組換え型ヒト I L一 2 (Bo e h r i n g e rMannh e i m社） およ び 1 0 %非働化 F B S (J RHB i o s c i e n c e s社） 含有 R PM I 1 640培地 （G I BCOBRL社） にて、 5%炭酸ガス存在下 37 °Cでー晚培 養した。 1 0 O nMコンカナマイシン A (和光純薬工業） を添加し、 1時間培養 後、 1 0 n g/m 1 PMA (S I GMA社） および 500 n g/m 1ィオノマイ シン （CALB I OCHE M社） を添加し、 さらに 2時間培養した。 細胞を回収 し、 1 0 %非働化 F B S含有 R PM 1 1 640培地にて洗浄後、 2. 5 x 1 07 個 Zm 1 となるよう 1 0 %非働化 F B S含有 R PM I 1 6 4 0培地に懸濁し
(2) タ一ゲッ ト細胞の調製
ターゲッ ト細胞の調製は国際特許出願公開番号 W〇 95 / 1 3 293に記載さ れているのと同様の方法でおこなった。 すなわち、 ターゲッ 卜にはマウス Fa s 発現細胞 W 4細胞を用い、 1 06 個の W 4細胞を 20〃 C iの51 C r - クロム酸 ナトリウム （NEN社） を含む RPM 1 1 6 4 0培地を用いて 3 7 °Cで 5 %炭酸 ガス存在下で 2時間培養し、 51 C r標識した。
(3) 抗マウス F a sリガンド抗体 # 5 8— 1 1のマウスおよびラッ ト F a s リ ガンドに対する中和活性
上述の活性化マウスあるいはラッ ト脾細胞 1 X I 06 個に種々の濃度の抗 マウス F a s リガンド抗体 # 5 8— 1 1を添加し、 5 %炭酸ガス存在下で 3 7°C、 3 0分間培養した。 次に上述の5' C rで標識した W 4細胞を 1 x 1 04 個を添加し、 8 0 0 r p m、 2分間の遠心後、 5 %炭酸ガス存在下 3 7 °Cで 4時 間培養した。 1 2 0 0 r pmで 5分間遠心して得られた上清中の51 C r量を測定 し、 抗マウス F a s リガンド抗体 # 5 8— 1 1の効果を調べた。 また、 上述の活 性化マウスおよびラッ ト脾細胞による細胞障害活性が F a s Lによる細胞障害活 性であることを確かめるために、 抗マウス F a sリガンド抗体 # 5 8— 1 1と同 様の方法にて国際特許出願番号 PC TZJ P 9 7 / 0 1 5 0 2に記載されている F a s誘導体 s h F a s (n d 2 9 ) 一 F cを添加し、 アツセィの陽性コン トロールとして用いた。 得られた結果は国際特許出願公開番号 WO 9 5/1 3 2 9 3に記載されている51 C rの遊離を指標としたアツセィと同様の方法にて解析 した。 その結果、 陽性コントロールとして用いた s h F a s (n d 2 9) 一 F c は活性化マウスおよびラッ ト脾細胞による細胞障害活性を 0. 3/zgZml〜3 g/mlの間で用量依存的に抑制し、 用いた活性化マウスおよびラッ ト脾細胞 は F a s L依存的に細胞障害性を示すことが証明された。 また、 抗マウス F a s リガンド抗体 # 5 8— 1 1も s hF a s (n d 2 9) -F cと同様に、 マウスお よびラッ トの活性化脾細胞の細胞障害活性を 0. 0 3〃gZml〜0. 3〃g/ m 1の間で用量依存的に抑制した。 すなわち、 抗マウス F a s リガンド抗体 # 58— 1 1はマウスおよびラッ ト F a sリガンドを阻害した。
実施例 1 2. 抗マウス F a sリガンド抗体 # 58— 1 1の毒性試験
(1) 方法
雄性、 8週齢、 DB A/1 Jマウスおよび C 3 HZH eマウス （日本チヤール スリバー） を用いた。 抗マウス F a sリガンド抗体 # 5 8— 1 1を 1 0 0 mg/ 3 Om 1/k gの用量で尾静脈から投与した。 またコントロール群には生理食塩 水 （大塚製薬） を 3 Oml /k gの用量で尾静脈から投与した。 2種の系統とも に各群 n= 3とした。 観察期間を 7日間とし、 体重測定、 血液学的検査 （赤 血球、 白血球、 血小板） 、 血液生化学的検査 （GOT、 GPT、 尿素窒素） 、 肉 眼による剖検を行った。
(2) 結果
抗マウス F a sリガンド抗体 # 58— 1 1投与群の投与後の体重増加、 血液学 的検査値 （赤血球、 白血球、 血小板） 、 血液生化学的検査値 （GOT、 GPT、 尿素窒素） はコントロール群と比べて差を認めなかった。 また、 肉眼による剖検 所見においても抗マウス F a sリガンド抗体 # 58— 1 1投与群に異常は認めら れなかった。
実施例 1 3. 抗マウス F a sリガンド抗体の心虚血再灌流障害に対する効果 ( 1 ) 方法
実施例 2と同様の方法でラッ ト心虚血再灌流モデルを作製した。 抗マウス F a sリガンド抗体 # 5 8— 1 1を 0. 1 %ヒ ト血清アルブミ ン含有生理食塩水 にて希釈し、 lmg/5m l/k gの用量で、 再灌流開始直後にラッ 卜右大腿静 脈から投与した。 なお、 コントロール群には正常ハムスター血清由来精製 I gG 抗体 （C a p p e 1社） を l mg/5 m l /k gの用量で投与した。 # 5 8 一 1 1投与群 3例、 コントロール群 3例とした。 実施例 2と同様の方法で各切片 中の非虚血領域、 虚血領域、 壊死領域の測定、 および血漿中クレアチンキナーゼ (CPK) 測定を測定した。
(2) 結果
抗マウス F a sリガンド抗体 # 5 8— 1 1投与群の虚血領域に対する壊死領域 の比率 （％) はコントロール群よりも低かった （図 1 7) 。 また、 抗マウス Fa sリガンド抗体 # 58— 1 1投与群の血漿中 C P K値はコントロール群よりも低 かった （図 1 8) 。
実施例 1 4. マウス G V H Dモデルにおける抗マウス F a sリガンド抗体の生 存率に対する効果
(1) 宿主マウスの骨髄抑制
宿主マウスとして、 雄性、 6週齢、 DBA/2マウス （日本チヤ一ルスリバ一 (株） ） を用いた。 宿主マウスの腹腔内に 350 mg/k gのシクロホスファミ ド （塩野義製薬 （株） 、 エンドキサン） を投与し骨髄抑制を誘導した。
(2) 供与マウス由来脾臓リンパ球の調製および宿主マウスへの移植
供与マウスとして雄性、 7〜8週齢、 B 1 0. D 2マウス （日本エスエルシ一 (株） ） を用いた。 供与マウスの脾臓をハンクス液 （日水製薬 （株） ） 中でピン セッ トを用いてほぐした後、 遠心し、 得られた細胞を 0. 0 1 7Mト リスー 0. 747 %塩化アンモニゥム溶液中に懸濁し赤血球のみを溶血させた。 残った 細胞をハンクス液で洗浄したものを供与マウス由来脾臓リンパ球とし、 前述のシ クロホスファミ ド投与 1日後の宿主マウスに 3 X 1 07 個/マウス尾静脈から移 植した。
(3) 抗マウス F a sリガンド抗体 # 5 8— 1 1の効果検討
供与マウス由来脾臓リンパ球移植の 30分前に、 1 OmgZl Om lZkgの 抗マウス F a sリガンド抗体 # 58— 1 1あるいは正常ハムスター血清由来精製 I gG (C a p p e 1社） を尾静脈から投与し、 生存率を調べた。 なお、 上記抗 体の代わりに抗体希釈液である生理食塩水 （大塚製薬） 1 Om l /kgを、 供与 マウス由来脾臓リンパ球の代わりに細胞懸濁液であるハンクス液を投与したマウ スを GVHD陰性群とした （各群とも n=8) 。 その結果、 脾細胞移殖 8日後に おける生存率は、 GVHD陰性群 63%、 抗マウス F a sリガンド抗体 # 58一 1 1投与群 63%、 コントロール抗体投与群 38 %であつた。 コントロール抗体 投与群の生存率との比較から、 抗マウス F a sリガンド抗体 # 5 8— 1 1投与群 に GVHDにおける生存率改善効果が認められた （図 1 9) 。
実施例 1 5. 抗マウス F a sリガンド抗体の腎虚血再灌流モデルにおける効果 (1) 腎虚血再灌流モデルの作製
雄性、 6週令、 I CR系マウス （日本エスエルシ一 （株） ） をベン トバル ピタール麻酔下で手術台上に仰臥位に固定し、 腹部を切開した。 開腹部より右側 腎臓を摘出した後、 左側腎動静脈をクリ ップ （VAS CULAR C L I P AS— 1、 協和時計工業） を用いて遮断し、 虚血状態とした。 3 0分後クリッ プをはずし血液を再灌流した。 血液再灌流の 2 4時間後、 腹部大静脈より採 血し、 血漿中クレアチニン、 および尿素窒素を測定した。 クレアチニンの測定は デタミナ CRE 55 s (協和メディ ックス） を、 尿素窒素の測定は尿素窒素 Bテ ストヮコ一 （和光純薬工業 （株） ） を用いてオートアナライザー （COBASF ARA、 ロッシュ） により測定した。
( 2 ) 抗マウス F a sリガンド抗体 # 5 8— 1 1の投与
抗マウス F a sリガンド抗体 # 58— 1 1を 0. 1 %B S A (S I GMA) 含 有生理食塩水にて希釈し、 0. 3mgZl 0m lZk gあるいは 3mgZ 1 Oml/k gの用量で左側腎動静脈虚血直前および再灌流直後に静脈内投与し た。 なお、 コントロール群は 0. 1 %BS A含有生理食塩水を投与した。 偽手術 群は右腎摘出した後、 虚血状態とせずに 0. 1 %BS A含有生理食塩水を投与し た。 各群 8例ずっとした。
( 3 ) 結果
抗マウス F a sリガンド抗体 # 5 8— 1 1 3 mg/k g投与群の血漿クレアチ ニン値、 尿素窒素値はコントロール群より低値であり、 腎虚血再灌流障害の抑制 効果が認められた （図 20および 2 1) 。 以上の結果は、 本願発明の疾患予防 . 治療剤または臓器保存剤が疾患に優れた効果を有することを示すものである。 ま た、 本発明の疾患予防 ·治療剤は、 著しい毒性を示さず、 少なく とも F a s /F a sリガンド系の生物作用を抑制することによる毒性は認められない。 従って、 本発明の F a sアンタゴニストを有効成分とする疾患予防 ·治療剤は、 F a sによるシグナルの発生又は伝達を遮断し、 F a s /F a sリガンド系の生 物作用、 特に F a sを介した細胞の死、 特にアポ一シスが抑制される限り、 これ が関与する疾患の治療に有効である。 産業上の利用可能性
本発明の F a sアンタゴニストを有効成分とする疾患の予防 ·治療剤は F a s Z F a s リガンド系の生物作用、 特に、 F a sを介する細胞の死、 特に、 ァ ポト一シスを抑制し、 疾患の予防又は治療効果を有する。 又、 著しい毒性を示さ ず、 少なくとも F a s /F a sリガンド系の生物作用を抑制することによる毒性 は認められない。 したがって、 本発明の F a sアンタゴニストは、 細胞の死、 特 に、 アポト一シスが関与する疾患の予防 ·治療剤として期待される。
配列表 配列番号： 1
配列の長さ ： 38 1
配列の型：核酸
配列の種類： cDNA t o mRNA
配列：
ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG TACCAGATGT 60 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA CAGAGTCACC 120 ATCAGTTGCA GGGCCAGTCA GGACATTAGC AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA 180 GATGGAACTG TTAAACTCCT GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA 240 AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGGACAAAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAA 300 GGAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTAGTACGC TTCCGTGGAC GTTCGGTGGA 360 GGCACCAAGC TGGAAATCAA A 381 配列番号： 2
配列の長さ ： 408
配列の型：核酸
配列の種類： cDNA t o mRNA
配列：
ATGGATTGGG TGTGGACCTT GCTATTCCTG ATAGCAGCTG CCCAAAGTGC CCAAGCACAG 60 ATCCAGTTGG TGCAGTCTGG ACCTGAGCTG AAGAAGCCTG GAGAGACAGT CAAGATCTCC 120 TGCAAGGCTT CTGGGTATAC CTTCACAGAA TATCCAATGC ACTGGGTGAA GCAGGCTCCA 180
GGAAAGGGTT TCAAGTGGAT GGGCATGATA TACACCGACA CTGGAGAGCC ATCATATGCT 240
GAAGAGTTCA AGGGGCGGTT TGCCTTCTCT TTGGAGACCT CTGCCAGCAC TGCCTATTTG 300
CAGATCAACT TCCTCAAAAA TGAGGACACG GCTACATATT TCTGTGTAAG ATTTTACTGG 360 GATTACTTTG ACTACTGGGG CCAAGGCACC ACTCTCACAG TCTCCTCA 408 配列番号： 3
配列の長さ ： 3 8 1
配列の型：核酸
配列の種類： c D N A t o mR N A
配列：
ATGGAGACCG ATACCCTCCT GCTATGGGTC CTCCTGCTAT GGGTCCCAGG ATCAACCGGA 60
GATATTCAGA TGACCCAGAG TCCGTCGACC CTCTCTGCTA GCGTCGGGGA TAGGGTCACC 120
ATAACTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTTCG AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAGCCA 180 GGCAAAGCTC CCAAGCTTCT AATTTATTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG GGTACCTTCA 240
CGCTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACCAAT TATACCCTCA CAATCTCGAG TCTGCAGCCA 300
GATGATTTCG CCACTTATTT TTGCCAACAG GGTAGTACGC TTCCGTGGAC GTTCGGTCAG 360
GGGACCAAGG TGGAGGTCAA A 381 配列番号： 4
配列の長さ ： 4 0 8
配列の型：核酸 OZ V901VV00VV 31V01VV001 VaVVOXOXVV V30V301I33 0V01013V3V VOI01V10I3
09S V丄 3丄 3W丄 3丄 丄丄丄丄丄丄:) WV 33VVVI0IV0 V00 0VV33V 1VV0V033V0 0030V00I0V
008 VVIVVVOOIO VV0V113D01 VOVOOVVOIV OIOIOIIVOV X01VOVVOVO OlVVVaOUO 02 0^2 UillVOOOO VVV0V9V3V0 V10V00VV00 OVVOVVOOOI 3330103013 VOVOOVVOIV 081 0000XVV3 0 VOVOOIOVOO OVXOOVVVOO VVV010DV33 X30I0I3330 VV1V330101 OZl XVVOOOOIVO 1V3XV09I30 00VV0D113V VDV013VI3D 31010VX3V0 13X100X313
09 OVIOOIOOOV 00131V3000 X001V33V31 IVVOOVOIOO X0100V31I1 V33IL3丄丄丄丄
： ST
V N H UI o % v a 3 ：
Figure imgf000057_0001
mm s ：
01
SO VOIOOIOX OV3V0100IO 33V100VV31 000013V 3V 01113VX1V0
098 0013V1111V 0VV101013V 11V1310X30 OOVOVDOVOJ. OIOOVOIOXO 130V3130V9
008 oivxviaooi ovavvoovxo XOOVOVDDII lOVOlXVOVl XIOOOVOOOV VOXIOVOVVO on looxvivoiv aoovovooxo vovoaovovi VIVDIVOOOO IVOOlOVVOl IIOOOVOVOO
081 V30X300V3V 0V3100310V 301VV331V1 VV0V3V3110 3V1V100013 llOOVVVOOl 9 OZl 03I0100VV3 lOVOXOOVVO DI300VV0VV 0100V0130V 001310V001 09110V3010
09 0V3V30VV30 3010VVV303 OVOOIOOVIV 01301IVX30 1103V00101 00011V001V
：圆
V N HUI o v a 3 ： mu
SL6£0/L6d£/lDd L8f8T/86 OAV CACTCACCAG CAACACCAAG TGCAAAGAGG AAGGATCCAG ATCTAACGAG CCCAAATCTT 480
GTGACAAAAC TCACACATGC CCACCGTGCC CAGCACCTGA ACTCCTGGGG GGACCGTCAG 540
TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA 600
CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC TGGTACGTGG 660 ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC AACAGCACGT 720
ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC AAGGAGTACA 780
AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA 840
AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAT GAGCTGACCA 900
AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGG 960 AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC GTGCTGGACT 1020
CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG 1080
GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA 1140
GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAATGATAGG GTACCTTCTG AG 1182 配列番号： 6
配列の長さ ： 5 3 1
配列の型：核酸
配列の種類： c D NA t o mR N A
配列：
TTTTCTTCCA TTTCAGGTGT CGTGAGGAAT TCACCATGCT GGGCATCTGG ACCCTCCTAC 60 CTCTGGTTCT GACTAGTGTC GCTACTCAGA ACTTGGAAGG CCTGCATCAT GATGGCCAAT 120 TCTGCCATAA GCCCTGTCCT CCAGGTGAAA GGAAAGCTAG GGACTGCACA GTCAATGGGG 180 L S
189 0 V013I133V1 00V013VIV3 309X030V33 30XV3V3V01 3VVVV3V010
08 1X01VVV333 OVOOVVIDIV OVOOIVDOVV OOVOVVVOOl OVVOOVOVVO OVOOVOIOVO S
OZf V301VV00VV 3IV3IVV001 VOVVOIOXVV V00V001130 3V01013V3V V010XV1013
098 VX313VV10I 丄丄丄 1LL3VVV 33VVV101V0 V3010VV30V IVVOVOOOVO 0333V0013V
008 vvivvvooio vvoviJLOooi vovoovvoiv oioionvov xoivovvovo oivvvaouo on ixmvoooo VVVOVOVOVO VIOVOOVVOO OVVOVVOOOl OOOOIOODIO VOVOOVVOIV
SL6£0/L6d£/L3d LSP8VS6 OAV

Claims

請求の範囲
1 . F a sアンタゴニストを有効成分とする疾患の予防 ·治療剤。
2 . 前記疾患が F a sの関与する疾患であることを特徴とする請求の範囲第 1 項に記載の予防 ·治療剤。
3 . 前記疾患が F a sを介するアポトーシスの関与する疾患であることを特徴 とする請求の範囲第 1項または第 2項に記載の予防 ·治療剤。
4 . 前記疾患が心疾患であることを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 3項のい ずれかに記載の予防 ·治療剤。
5 . 前記心疾患が心筋梗塞、 心不全、 または心虚血再灌流障害もしくはそれに 基づく疾患であることを特徴とする請求の範囲第 4項に記載の心疾患予防 ·治療 剤。
6 . 前記疾患が腎疾患であることを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 3項のい ずれかに記載の予防 ·治療剤。
7 . 前記腎疾患が腎不全、 腎虚血、 または腎虚血再灌流障害もしくはそれに基 づく疾患であることを特徴とする請求の範囲第 6項に記載の腎疾患予防 ·治 療剤。
8 . 前記腎疾患が急性腎不全であることを特徴とする請求の範囲第 6項に記載 の腎疾患予防 ·治療剤。
9 . 前記疾患が移植片対宿主病 （G V H D) であることを特徴とする請求の範 囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の予防 ·治療剤。
1 0 . 前記疾患が虚血再灌流障害又はそれに基づく疾患であることを特徴とす る請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の予防 ·治療剤。
1 1 . 前記疾患が、 心臓、 腎臓、 または肝臓の虚血再灌流障害もしくはそれに 基づく疾患であることを特徴とする請求の範囲第 1 0項に記載の予防 ·治療 剤。
1 2 . 前記疾患が、 外科手術または移植に伴う虚血再灌流障害、 あるいは血栓 溶解療法もしくは血管再建術後の虚血再灌流障害またはそれに基づく疾患である ことを特徴とする請求の範囲第 1 0項に記載の予防 ·治療剤。
1 3 . 前記疾患がエンドトキシンによる臓器の障害、 エンドトキシン血症、 敗 血症、 またはそれらに基づく疾患であることを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の予防 ·治療剤。
1 4 . 前記臓器が、 肝臓であることを特徴とする請求の範囲第 1 3項に記載の 予防 ·治療剤。
1 5 . F a sアンタゴニストを有効成分として含有することを特徴とする臓器 保存剤。
1 6 . 前記 F a sアン夕ゴニス卜が F a s誘導体、 抗 F a s リガンド抗体、 ま たは抗 F a s抗体であることを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 1 5項のいずれ かに記載の予防 ·治療剤又は臓器保存剤。
1 7 . 前記抗 F a s リガンド抗体がヒ ト化抗 F a sリガンド抗体であることを 特徴とする請求の範囲第 1 6項に記載の疾患予防 ·治療剤又は臓器保存剤。
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