WO1998017813A1

WO1998017813A1 - Procede de transformation de riz de type indica

Info

Publication number: WO1998017813A1
Application number: PCT/JP1997/003806
Authority: WO
Inventors: Yukoh Hiei
Original assignee: Japan Tobacco Inc.
Priority date: 1996-10-22
Filing date: 1997-10-22
Publication date: 1998-04-30
Also published as: JPH10117776A; EP0897013A4; KR19990072163A; AU736027B2; CA2240454A1; US6329571B1; CA2240454C; AU4721997A; EP0897013A1

Description

明細書インディカイネの形質転換方法

技術分野本発明は、ァグロパクテリゥ厶法によるイネの形質転換方法に関する。

背景技術

イネの形質転換方法には、プロ卜プラストを介したエレクトロポレーシヨン法や PEG 法が開発され、培養が容易なジャポニカイネで、用いられてきた。しかしながら、この方法は、プロトプラストからの再分化系が確立されている品種のみに、適用可能であり、培養が困難なインディ力イネへの適用例は少ない。

パーティクルガン法はプロトプラス卜培養系を必要としないため、広範な品種に適用できる新たな形質転換方法として、多くの研究機関で、用いられるようになってきている。一般的に、インディ力イネ品種は、培養が困難とされているが、なかでも、インディ力イネの大部分を占め、 Groupl と呼ばれる品種群（Glaszma nn J. C. (1987) Isozymes and classification of Asian rice varieties. The or Appl. Genet. 74:21-30 ) は培養が困難とされている。し力、しな力《ら、 Ghris touらが報告したパーティクルガン法（Christou P. , Ford, T. L. and Kofron, M. (1992) The development of a variety - independent gene-transfer method for rice. TIB TECH 10: 239-246)による Group I 品種の形質転換効率は、未熟胚あたり 2-3 %と低く、他の研究グループによる近年の報告においても、ィンデイカイネでは、効率の高い形質転換系は得られていない（Li L , Rongda, Q. , Kochko, A. , Fauquet, C. and Beachy, R. N. (1993) An improved rice tra nsformat ion system using the biol istic method. Plant Cel l Report 12: 250 - 255) o

他方、ァグロパクテリゥム法は、双子葉植物において、簡便かつ安定的な形質転換方法として、広く用いられてきた。これに対し、これまで、イネ科などの単子葉植物には、ァグロパクテリゥム法は適用できないと考えられてきた（Potryk us I. , (1990) Gene transter to cereals: an assessment Bio/technology 8:5 35-542) 。近年になって、単子葉植物であるイネにおいて、形質転換が可能であることが明らかにされ (W094/00977; W095/06722; Hiei Y. , Ohta, S. , Komari, Τ. and Kumashi ro, T. (1994) Efficient transformation of rice (Oryza Sat i a L. ) mediated by transformation by Agrobacter ium and sequence analysi s of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal 6:271 - 282 ) 、有用な形質転換方法として、今後の研究の進展が期待されている。

一方、 Raneeらは、インディ力イネの完熟種子から再分化能を有するカルスを誘導するのに有効な N B培地を開示している（lann M. Ranee, I . . et a I . , Par tial desiccation of mature embryo— der ived calli, a simple treatment that dramatical ly enhcnaces the regeneration ability of i nd i ca rice, Plant C el I Reports (1994) 13:647-651)。しかしながら、 N B培地の形質転換細胞の選抜に対する効果については、調査していない。パーティクルガン法では、 Li らが、 NBに類似する培地（NAA, BA および L- glutamine を含まない）を用いて、ジャポニカイネにおける、効率の高い形質転換を報告している（Li L et al., (1993) An improved rice transtormat ion system using the biohstic method. Plant Cell Report 12: 250-255 ) 。しかしながら、インディ力イネについては、効率よく形質転換体を得ることができなかったことを、報告している。また、 Li らは、この培地のァグロパクテリゥム法への適用については、調査していない。

上述したように、プロ卜プラストを介する方法では、プロトプラストからの再分化系が確立されていない品種には、適用ができないという問題点がある。パーティクルガン法においても、これまでに報告されている方法では、インディカイネのような培養困難な品種での形質転換効率は低い。

そこで、インディ力イネの形質転換方法として、ァグロパクテリゥム法を適用することが考えられる。上記のように、ァグロバク亍リウム法でジャポニカイネを形質転換する方法は公知である。本願発明者らは、ジャポニカイネに適用される方法をインディ力イネにも適用できないか検討した。ァグロパクテリゥムによるイネの形質転換方法には、 W094/00977および H i e i et a l . (1994) で報告されているように、脱分化組織を用いる方法が、まず考えられる。そこで、 Group I に分類される数種類のインディ力イネを用いて、カルスへのァグロパクテリゥムによる遺伝子導入を試みた。その結果、わずかながら、形質転換体が得られることがわかった。しかしながら、再現性を有する形質転換系を確立するには至らなかった。カルスを用いて形質転換を行う場合、細胞分裂活性が高く、再分化能を持つカルスを材料として用いる必要がある。しかしながら、培養が困難なイネ品種では、遺伝子導入に適した細胞分裂活性の高いカルスを誘導することは、容易ではない。このため、カルスを供試組織とした場合には、適用できる品種の幅が限られて、培養が困難な品種では、容易に形質転換体を得ることはできないものと考えられた。

カルス以外の組織としては、未熟胚を材料にする方法（W095/06722、 EP-A - 0 6 72 752) も適用可能であると考えられる。ところが、ジャポニカイネに対しては有効な W095/06722又は EP- A- 0 672 752に記載された方法をインディ力イネにそのまま適用すると、やはり、形質転換効率が低く、実用的な形質転換系を確立することはできなかった。

発明の開示

従って、本発明の目的は、インディ力イネを高効率で形質転換することができる方法を提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、 W095/06722、 EP-A- 0672752に記載された、イネの未熟胚細胞をァグロパクテリゥム属細菌により形質転換する方法において、形質転換細胞の選抜工程において用いる培地として、上記 Ranee らの N B培地を基本とした培地を用いることにより、インディ力イネにおいても高い形質転換効率を達成することができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、インディ力イネ未熟胚細胞をァグロバク亍リウム法によリ形質転換し、形質転換された細胞を選抜する、イネの形質転換方法において、形質転換された細胞を選抜する培地として、 KN0₃ ²000 〜⁴000 mg/ l 、 gS0₄ 60 〜200 mg/l_s KH₂P0₄200〜600 mg/L CaCI₂ 100 〜450 mg/U (NH₄)₂-S0₄200〜60 0 mg/U H3BO31 ~7 mg/U MnS0₄2 〜20 mg/l 、 EDTA又はその塩 20〜50mg/し Fe 3〜8 mg/しミオイノシ！ ^一ル 50〜200 mg/し 2， 4-ジクロロフエノキシ酢酸 0. 5 〜10 mg/l 、サイトカイニン類 0.01〜5 mg/l及び糖類 5000〜 80000 mg/l並びにゲル化剤を含み、 p Hが 4.5 ~6.5 である培地を用いることを特徴とする、ィンデイカイネの形質転換方法を提供する。

本発明により、従来方法では形質転換効率が低く、再現性のある形質転換を行うことができなかったインディ力イネについて、高効率で形質転換を行うことができるようになった。

図面の簡単な説明

図 1は、本発明の方法に好ましく用いることができるスーパーバイナリーべクター PT0K162 及び pT0K233 の構造を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明の形質転換方法に供される細胞は、インディ力イネの未熟胚細胞である。インディ力イネとしては、特に限定されないが、従来技術において形質転換が特に困難な Group I (Glaszmann 、上掲）に分類されるものに適用した場合に特に威力を発揮する。 Group I のインディ力イネに属する品種としては、 I R 8、 I R24、 I R26、 I R 36、 I R54、 I R64、 I R 72、新青矮 1、南京 1 1、水原 258等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。本発明において、未熟胚とは、受粉後の登熟過程にある未熟種子の胚を言う。また、本発明の方法に供される未熟胚のステージ（熟期）は特に限定されるものではなく、受粉後いかなる時期に採取されたものであってもよい。もっとも、受精後 2曰以降のものが好ましい。また、未熟胚はインブレッド、インブレッド間の F 1、インブレッドと自然受粉品種間の F 1、市販 F 1品種の未熟胚であることが好ましい。さらに、胚の中でも胚盤細胞が好ましい。また、未熟胚は、ァグ口パクテリゥム属細菌と接触させる前に脱分化処理を施す必要はない。ここで、脱分化処理とは、植物組織の分化した細胞を脱分化培地において培養し、無秩序に増殖するカルス等の未分化状態の細胞塊を得るための処理である。

形質転換に用いられるァグロパクテリゥ厶属細菌は、丁 i プラスミド又は R i プラスミドを持つ、従来より双子葉植物の形質転換に用いられているものを用いること力できる。これらのものの多くは Agrobacterium tumefaciens由来の T i プラスミドのヴィルレンス領域（vir 領域）由来の DN A領域を含むベクターを有しており、植物に付与しょうとする形質を担う遺伝子はこのベクター中に挿入されるか、またはこのベクターとは別のプラスミド中に存在し、相同組換え等により T i プラスミド中に in で挿入されるものである。また、小鞠らは、 robacterium tumefaciens A 28 1 という強病原性の、形質転換効率が極めて高い株（Hood, E. E. et a I . , 1984; Biotech. 2 :702 - 709、 Hood, E. E. et a I . , 1986; J. Bacter iol. 168: 1283 - 1290 、 Komar i , T. et al. , 1986; J. Bacterio I. 166:88 - 94、 Jin, S. et al. , 1987; J. Bacter iol. 169:4417 - 4425 、 Komar i, T. , 1989; Plant Science 60:223- 229、 ATCC 37349) に含まれる T i プラスミド ρΉΒο542のヴィルレンス領域（vir 領域）由来の DN A領域を含むベクターを開発した（特開平 4一 222527号）。本発明では、 Agrobacteriu m tumefaciens A 281中に含まれる T i プラスミド pTiBo542のヴィルレンス領域、ァグロバク亍リウ厶属細菌の T i プラスミドまたは R i プラスミドの T一 DN Aの左ボーダー及び右ボーダー配列、並びにこれら左ボーダーと右ボーダーとの間に位置する所望の遺伝子を有するベクターを「スーパーバイナリーベクタ —」と呼ぶ。本発明では、このようなスーパーバイナリベクターを好ましく用いることができる。

このようなスーパーバイナリ一ベクターの例として pT0K162 (特開平 4一 22 2527号、米国特許第 5, 591， 616号、 EP - A- 0 604 662) を挙げることができる。その構造を図 1に示す。このプラスミドは、大腸菌および /^ra&acier/' tumef ac/'e"s中で増殖可能である pT0K154と呼ばれるプラスミド（T i プラスミドから誘導された公知の PGA472プラスミドと pVGK101 と呼ばれる公知の広宿主域プラスミドから後述の方法により構築された、 T領域を含むプラスミド）に ρΉΒο 542のヴィルレンス領域由来の既にクローン化されていた上記 1 5. 2キロべ一スの Kpnl断片（virB, virG, VirG各遺伝子を含む）を組み込んだものである。この PT0K154には、 T領域の 2つの境界配列とその間にインディ力イネに導入しようとする遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子が配列されており、この例は、インディ力イネに導入しょうとする遺伝子が pTiBo542のヴィルレンス領域由来のクローン化された DN A断片を含有するプラスミド上に配置されている例である。また、 pT0K162と pGL2- IG (W095/06722)から誘導された、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子（hpt)およびヒマのイントロン付き GUS遺伝子を、 pT0K162の T-DN A領域中に相同組換えにより組み込んだ pT0K233 (Hiei et al. , 上掲）も好ましいスーパーバイナリーベクターの 1例である。 pT0K233 の構造を同じく図 1に示す。

インディ力イネに組み込もうとする所望の遺伝子は、上記プラスミドの T一 D N A領域中の制限酵素部位に常法により組み込むことができ、プラスミドが有する薬剤耐性等の適当な選択マーカーに基づいて選択することができる。もっとも、図 1に示す pT0K162 のように、大型で多数の制限部位を持つものは、通常のサブクローンニングの手法では所望の DN Aを T領域内に導入することが必ずしも容易でないことがある。このような場合には Agrobacter ;um tumefaciens細胞内の in vivo系での相同組換え（Herrera- Estrel la， L. et al. , 1983; EMBO J. 2:987—995、 Horsch, R, H. et al. , 1984; Science 223:496 - 498 ) を利用することにより、目的の DNAを pT0K162 に導入することが可能になる。すなわち、例えば、先ず、 pT0K162 を Agrobacterium tumefaciensに導入しておいて、この菌をさらに所望 DNAを導入した pBR322と呼ばれるプラスミド（類似のブラスミドを含む）を導入する。 PT0K162 の DNAには pBR322と相同な部分があるので、 pBR322誘導体は相同配列を介した組換えにより PT0K162 に組み込まれることになる。 pBR322は pT0K162 と異なり Agrobacterium tumefaciens 中では複製できないので、このような組み込まれた状態（pT0K162:_:PBR322 誘導体という ) でなければ Agrobacterium tumefaciens中で生存することができない。そして、 pT0K162 と pBR322誘導体の各々に特異的な特性（薬剤耐性等）について選抜すれば、 pT0K162: :pBR322 誘導体を有する Agrobacterium tumefaciens を得ることができる。さらに、 pT0K162 を有すも Agrobacterium tumefaciensに各種のプラスミドを導入して研究したところ、 PBR322誘導体の選抜マーカ一としては、トランスポゾン T n 7 (De Greve, H, H. et aに， 1981; Plasmid 6:235— 248 ) 由来のスぺクチノマイシン耐性遺伝子（S P) が優れていることが判明した。従って、すでに所望の遺伝子が PBR322にクローン化されている場合には、 S P遺伝子をそのプラスミドに揷入すれば、 Agrobacterium tumefaciens内の相同組換えにより、 PT0K162 の T領域に所望の遺伝子を導入することができる。またその他の場合には、 pBR322由来の DNAと S P遺伝子から構成されるプラスミドを用意しておいて、これに所望の遺伝子を挿入する方法も考えられる。この際、 T領域の境界配列を活用すれば、最終的に、 pT0K162 上において、カナマイシン耐性遺伝子と所望の遺伝子を別々の T領域中に配置することも可能である。カナマイシン耐性をマーカーとして植物を形質転換した場合、両 T領域とも導入される場合も相当の比率で生じるわけであるので、目的遺伝子の導入は十分達成できる。また、両 T領域が別々の染色体に組み込まれる場合もあり得るので、後に目的の遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子から分離することも可能となる。

寄主となるァグロパクテリゥム属細菌としては、特に限定されないが、 Agroba cterium tumefaciensをヌナましく用し、<&こと力《できる。

プラスミドを Agrobacterium tumefaciens等のァグロパクテリゥム属細菌に導入する操作は従来法により行うことができ、例えば、細菌の三系交雑手法（Di tta, G. et al. , 1980; Pro. Natl. Acad. Sci. USA 77 :7347 - 7351 ) により行うことができる。

このようにして調製されるァグロパクテリゥム属細菌には、 pT0K162 由来のヴィルレンス能力の高い DN Aが含まれるので、高い効率でインディ力イネの形質転換を行うことが可能である。

尚、本発明においては、インディ力イネに導入しょうとする遺伝子は、従来の技術と同様に T領域の境界配列の間に配置されるものであるが、ァグロパクテリゥ厶属細菌中で、 T i プラスミド上に配置されてもよく、または他のプラスミド上に配置されてもよい。

ァグロバク亍リウム属細菌でインディ力イネの未熟胚を形質転換する方法は、未熟胚をァグロバク亍リウム属細菌と単に接触させることにより行うことができる。例えば、 1 0 ⁶〜1 0 ^{1 1}細胞 Zm I程度の細胞濃度のァグロパクテリゥム属細菌懸濁液を調製し、この懸濁液中に未熟胚を 3〜1 0分間程度浸漬後、固体培地上で数日間共存培養することにより行うことができる。形質転換に供する未熟胚は、 2 , 4— D存在下での培養等の脱分化処理を行う必要はない。

形質転換した未熟胚は、その後、脱分化状態で形質転換細胞の選抜、増殖を行うことが好ましい。選抜は、前記所望の遺伝子の発現及びマーカー（薬剤耐性等 ) に基づいて行うことができる。脱分化状態の細胞は、正常個体再生能力を有するカルスであることが好ましい。

本発明の方法では、形質転換細胞の選抜を、上記の組成及び p Hを有する培地上で行う。上記組成におけるサイ卜カイニン類の好ましい例として 6 —ベンジルァミノプリンを挙げることができる。また、上記組成における糖の好ましい例としてマルトース、ショ糖及びグルコース並びにこれらの混合物を挙げることができる。ゲル化剤としては、寒天、ァガロース、ゲランガム等を挙げることができる。これらは培地をゲル化させるためのものであり、その配合量はゲル化を行うのに適当な量であれば特に限定されず、通常 2〜1 0 _g Z I程度である。前記組成に加え、少なくとも K I 0. 5〜2 mg/ k ZnS0₄ 0. 7 〜5 mg/ U Na₂ o0₄ 0. 1 ~ 0. 3 mg/ U CuS0₄ 0· 01〜0, 02 mg/ l 、 GoC I ₂ 0. 01〜0. 02 mg/ l 、ニコチン酸 0, 25 〜10 mg/ l 、ピリドキシン 0. 25〜5呵 / I及びチアミン 0. 05〜20 mg/ l をさらに含む培地も好ましく用いることができる。この組成に加え、少なくともカザミノ酸 100 〜3000 mg/ l 、プロリン 100 〜3000 mg/ l 、グルタミン 100 〜3000 mg/ I 及び α—ナフタレン酢酸 0. 01 ~5 mg/ l をさらに含む培地も好ましく用いることができる。さらに、上記の各組成に加え、 1000〜60000 mg/ lの糖アルコールをさらに含むものも好ましく用いることができる。ここで、糖アルコールの好ましい例としてマ二トール及びソルビトールを挙げることができる。なお、薬剤耐性により選抜を行う場合には上記の組成に加えて当該薬剤を含むことは言うまでもない。なお、選抜は 2〜5回程度行うことが好ましい。この場合、一次選抜の期間は 2〜3週間程度が好ましく、 2次選抜の期間は 2週間程度が好ましい。選抜を複数回行う場合、いずれの選抜も上記培地上で行うが、成分の含量が上記範囲内で異なる培地を異なる選抜工程で用いてもよい。

形質転換細胞からの植物体の再生は公知の方法（Ranee et a l . , 1994 (上掲） ) により行うことができる。この場合、再分化培地にも選抜薬剤を加えることが好ましい。これにより所望の形質を獲得した植物体、好ましくは、所望の形質を獲得し、正常稔性を有する形質転換植物体を再生することができる。なお、これらの具体的操作の一例が下記実施例に詳述されている。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、下記実施例は例示のためのみに記載するものであり、如何なる意味においても限定的に解釈してはならない。

実施例 1、比較例 1 ~ 3

(1 ) ァグロバクテリウムの菌系およびプラスミド

宿主バクテリアには LBA4404 (ATCC 37349)を用い、ベクターとして上記 pT0K2 33 (図 1参照）を用いた。

(2) 供試品種および組織

供試品種として、 I R8, I R24, I R26, I R36, I R54, I R64, I R72,新青矮 1 ,南京 1 1 , 水原 258 を用いた。開花後 10- 14 日目の未熟種子の穎を除去し、 70%ェタノールで数秒、ツイーン 20を含む 1 %次亜塩素酸ナトリウム水溶液で 15分間滅菌処理を行った。滅菌水で数回洗浄後、実体顕微鏡下で、長さ 1 . 5-2 mmの未熟胚を摘出した。

(3) 接種および共存培養

50 mg/ l ハイグロマイシンおよび 50 mg/ l カナマイシンを含む AB培地（Ch i l ton -D. et aに (1974) Agrobacter i urn tumef ac i ens DNA and PS8 bacter iopha ge DNA not detected in crown gal I tumors. Proc. Natl. Acad. Scに USA, 71 :3672-3676) 上で 3- 7 日間培養したァグロパクテリゥムのコロニーを白金耳でかきとり、 AAM 培地（Hiei et al. 1994、上掲）中に懸濁し、接種液とした。菌密度は 2〜3 X 1 0⁸/mlに調整した。

摘出した未熟胚に、 1ml のバクテリア懸濁液を加え、約 30秒間ポルテックスをかけた。 5-10分間静置した後、バクテリア懸濁液が付着した未熟胚を、共存培養用の NB- AS 培地上に、胚盤を上向きにして置床し、 25°C暗黒化で 4-5 日間共存培養を行った。なお、ここで用いた NB— AS培地の組成は、 Ranee et a I (1994) (上掲）に記載の NB培地から L—グルタミンを除き、ァセトシリンゴン 100 μ Μ、ショ糖 20g/し D -グルコース 10 g/l 、シ一プラーク（Sea Plaque)ァガロース 12.5 g/l を加えたものである。すなわち、その組成は、 KN0₃ 2830 m g/l 、 MgS0₄-7H₂0 185 mg/l 、 KH₂P0₄400 mg/l 、 CaCI₂-2H₂0 166 mg/l 、 (NH₄) ₂ ■S0₄463 mg/l 、 Kl 0.7 mg/l 、 H₃B0₃3.0 mg/l, MnS0₄-H₂0 10 mg/l 、 ZnS0₄-7H ₂0 2.0 mg/l , Na₂Mo0₄-2H₂0 0.25 mg/U CuS0₄'5H₂0 0.025 mg/l 、 CoCI₂-6H₂0 0. 025 mg/l 、 Na₂-EDTA 37.3 mg/U Fe₂S0₄-7H₂0 27.8 mg/l 、ミオイノシ | ^一ル 1 00 mg/U ニコチン酸 1.0 mg/U 塩酸ピリドキシン 1.0 mg/l 、塩酸チアミン 1 0 mg/U カザミノ酸 300 mg/l 、 L—プロリン 300 mg/l 、 2, 4 -ジクロロフエノキシ酢酸 2 mg/l 、 α—ナフタレン酢酸 1 mg/l 、 6 -ベンジルァミノプリン 1 m g/U ァセトシリンゴン 100 μ Μ、ショ糖 20g/し D -グルコース 10 g/l 、ジープラーク（Sea Plaque)ァガロース 12.5 g/l, pH5.2であった。

(4) 形質転換細胞の選抜

共存培養後、伸長した苗条をメスで除去し、 3 mg/lハイグロマイシンを含む N BM培地上に移植し、 30°C暗黒下で 3 - 4 日間培養した。次に未熟胚を 20 - 50 mg/l ハイグロマイシンを含む NBM (実施例 1 ) 、 2 N 6M (比較例 1 ) 、 CCM ( 比較例 2) 、 MSM (比較例 3) の各 1次選抜培地に移植し、 30°C明条件下で 2 -3 週間培養した。未熟胚の胚盤上に形成されたハイグロマイシン耐性カルスを、 20 mg/l ハイグロマイシンを含む NB2 培地もしくは 30 mg/l ハイグロマイシンを含む CGM 培地に移植し、 2 週間 30°C明条件下で 2 次選抜を行った。同 NB2 培地もしくはハイグロマイシン濃度を 50 mg/l とした CCM 培地を用いて、さらに、 10-14 日間隔で 1-3 回（3-5 次選抜）にわたつて、コンパク卜で球状のェンブリオジェニックなカルスの選抜および増殖を行った。なお、ここで用いた NBM、 2 N 6M、 CCM、 MSM、 N B 2培地の組成を以下に示す。なお、これらの選抜培地には、下記組成にさらに 250 mg/lのセフォタキシムを添加した。

N Bi 咅地

KN0₃ 2830 mg/l 、 gS0₄-7H₂0 185 mg/l 、 KH₂P0₄400 mg/l 、 CaCI₂-2H₂0 166 m g/l 、 (NH₄)₂-S0₄463 mg/l 、 Kl 0.75 mg/し H₃B0₃3, 0 mg/l、 MnS0₄-H₂0 10 mg/ I 、 ZnS0₄'7H₂0 2,0 mg/l 、 Na₂Mo0₄-2H₂0 0.25 mg/U CuS0₄'5H₂0 0.025 mg/l 、 CoCI₂-6H₂0 0.025 mg/l 、 Na₂-EDTA 37.3 mg/し Fe₂S0₄'7H₂0 27.8 mg/l 、ミオイノシトール 100 mg/U ニコチン酸 1.0 mg/l、塩酸ピリドキシン 1.0 mg/l 、塩酸チアミン 10 mg/l、カザミノ酸 300 mg/l 、 L一プロリン 300 mg/l 、 L一グルタミン 300 mg/l 、 2,4-ジクロロフエノキシ酢酸 2 mg/l 、《—ナフタレン酢酸 1 mg/l 、 6-ベンジルァミノプリン 1 mg/l、 D—マル! ス 30 g/l 、ゲランガム（商品名 Gel rite, Sigma社製） 2.5 g/l 、 pH5.8

2 N 6M培地

N 6無機塩類、 N 6ビタミン（Chu C.-C. (1978) The N6 medium and its appl i cations to anther culture of cereal crops. In proc. Symp. Plant Tissue C ulture. Peking: Science Press, pp. 43—50) に、カザミノ酸 1 g/l 2， 4ージクロロフエノキシ酢酸 2 mg/l 、 D—マルトース 30 g/l 、ゲランガム（商品名 G elrite, Sigma社製） 2.5 g/l を加えたものである。すなわち、 KN0₃ 2830 mg/l 、 MgS0₄-7H₂0 185 mg/l 、 KH₂P0₄400 mg/l 、 CaCI₂-2H₂0 166 mg/U (NH₄)₂-S0₄ 463 mg/l 、 Kl 0.8 mg/l 、 H₃B0₃1.6 mg/し MnS0₄-4H₂0 3.3 mg/l 、 ZnS0₄-7H₂0 1.5 mg/l 、 Na₂Mo0₄-2H₂0 0.25 mg/U CuS0₄'5H₂0 0.025 mg/l 、 Na₂-EDTA 37.3 mg/し Fe₂S0₄-7H,0 27.8 mg/l 、ニコチン酸 0.5 mg/l、塩酸ピリドキシン 0.5 mg/l 、塩酸チアミン 1.0 mg/l 、カザミノ酸 1 g/l、グリシン 2 mg/L 2, 4-ジクロ口フエノキシ酢酸 2 mg/l 、 D—マルトース 30 g/l 、ゲランガム（商品名 Gel rite, Sigma社製) 2.5 g/l 、 pH5.8

CCM培地

CCtg地 (Potrykus I et a I (1979) Callus formation from cel l culture prot op lasts of corn (lea mays L). Theor. Appl. Genet. 54 :209 - 214; Hartke S. et a I (1989) Somatic embryogenes i s and plant regeneration from various indica r ice (Oryza Sati a L. ) genotypes. J. Genet & Breed. 43: 205-214) に D—マル! ^一ス 30 g/し 2, 4 -ジクロロフエノキシ酢酸 2 mg/l 、ゲランガム (商品名 Gel rite, Sigma社製） 2.5 g/l を加えたものである。すなわち、 KN0₃ 1212 mg/U NH₄N0₃640 mg/l 、 CaCI₂-2H₂0 588 mg/l 、 gS0₄-7H₂0 247 mg/l 、 KH₂P0₄136 mg/l 、 FeS0₄-7H₂0 27.8 mg/U Na₂EDTA 37.3 mg/l 、 H₃B0₃3.1 mg/L MnS0₄-4H₂0 11.15 mg/l 、 ZnS0₄-7H₂0 5.76 mg/U Kl 0.83 mg/U Na₂Mo0₄-2H₂0 0.24 mg/U CuS0₄-5H₂0 0.025 mg/l 、 CoS0₄-7H₂0 0.028 mg/l 、ニコチン酸 6 m g/k 塩酸チアミン 8.5 mg/L 塩酸ピリドキシン 1 mg/しグリシン 2 mg/U ミオイノシトール 90 mg/l 、ココナッツ水 100 ml/1 (Gibco社製）、マ二！ ^一ル 36. 43 g/し D—マル !《—ス 30 g/l、 2, 4 -ジクロロフエノキシ酢酸 2 mg/l 、ゲランガム（商品名 Gel rite, Sigma社製） 2.5 g/l 、 pH5.8

MSM培地

MS無機塩類、 MSビタミン（Murashige, T. and Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Phy siol. Plant. 15: 473-497) に、カザミノ酸 1 g/l、 D—マル！ ^一ス 30 g/l、 2， 4 -ジクロロフエノキシ酢酸 2 mg/l 、ゲランガム（商品名 Gelrite, Sigma社製） 2.5 g/l を加えたものである。すなわち、 NH₄N0₃1650 mg/l, KN0₃ 1900 mg /I 、 MgS0₄-7H₂0 370 mg/l 、 KH₂P0₄170 mg/l 、 CaCI₂'2H₂0 440 mg/l 、 Kl 0,8 3 mg/ H3BO36.2 mg/U MnS0₄-4H₂0 22.3 mg/U ZnS0₄-7H₂0 8.6 mg/l 、 Na₂Mo0 4-2H₂0 0.25 mg/l, CuS0₄-5H₂0 0.025 mg/l 、 CoCI₂-6H₂0 0.025 mg/l 、 Na₂-EDT A 37.3 mg/l, Fe₂S0₄-7H₂0 27.8 mg/l 、ミオイノシ！ ^一ル 100 mg/しニコチン酸 0.5 mg/U 塩酸ピリドキシン 0.5 mg/l 、塩酸チアミン 0.1 mg/l 、グリシン 2.0 mg/U カザミノ酸 1 g /し 2， 4-ジクロロフエノキシ酢酸 2 mg/l 、 D— マルトース 30 g/l 、ゲランガム（商品名 Gel rite, Sigma社製） 2.5 g/l 、 pH5. 8

N B 2培地

KN0₃ 2830 mg/l 、 gS0₄-7H₂0 185 mg/l 、 KH₂P0₄400 mg/l 、 CaCI₂-2H₂0 166 m g/l 、 (NH₄)₂-S0₄463 mg/l 、 Kl 0.7 mg/l 、 H₃B0₃3.0 mg/U MnS0₄-H₂0 10 mg/ I 、 ZnS0₄-7H₂0 2.0 mg/l 、 Na₂Mo0₄-2H₂0 0.25 mg/U CuS0₄-5H₂0 0.025 mg/l 、 CoCI₂-6H₂0 0.025 mg/l 、 Na₂-EDTA 37.3 mg/U Fe₂S0₄-7H₂0 27.8 mg/l 、ミオイノシ！ -ール 100 mg/U ニコチン酸 1.0 mg/l、塩酸ピリドキシン 1· 0 mg/l 、塩酸チアミン 10 mg/しカザミノ酸 300 mg/l 、し一プロリン 300 mg/l 、し一グルタミン 300 mg/l 、 2,4-ジクロロフエノキシ酢酸 2 mg/l 、 α—ナフタレン酢酸 1 mg/l 、 6-ベンジルァミノプリン 0.2 mg/l、 D—マルトース 30 g/l 、 D—マ二トール 30 g/l 、ゲランガム（商品名 Gel rite, Sigma社製） 2.5 g/l 、 pH5.8

次に、選抜されたカルスを 40 mg/l ハイグロマイシンを含む NBM 再分化前培養培地に移植、約 10日間 30°C明条件下で培養した。

(5) 形質転換体の再分化および GUS 発現の調査

再分化前培養により得られた、 hygromyc i n耐性のェンブリオジェニックな力ルスを、濾紙をひいたシャーレ中で乾燥処理を行った後（Ranee et al. 1994 ( 上掲））、 RN培地（Ranee et al. 1994 (上掲））の糖源を 30 g/l D—マルトースとした R刚再分化培地（30 mg/l ハイグロマイシンを含む）上に置床した。 2-3 週間後、再分化植物を 30 mg/l ハイグロマイシンを含む MSI (1/2 濃度 MS 主要無機塩、 MS微量無機塩、 MSビタミン、 1 g/l カザミノ酸、 0.2 mg/lインドール酪酸、 15 g/l ショ糖、 3 g/l Gel rite、 pH5.8 ) 発根培地に移植し、 25°C明条件下で約 3 週間培養した。得られたハイグロマイシン耐性の再分化植物の葉片を、 X - Glue処理することにより、 GUS 発現を調査した（Hiei et al. 1994、上掲）。再分化個体をさらに 500 倍の Hyponex 水溶液中に移植し、 25°C明条件下で 10日間育苗した後、温室内のポッ卜へ移植した。

(6) 形質転換体のサザン分析および後代における導入遺伝子の発現

GUS 発現を示した再分化個体の葉より抽出した DNA を、制限酵素 Hindi I I または Kpnlで処理し、 hpt または GUS遺伝子をプローブとしたサザン分析を行つた。サザン分析については、 Sambrookら（1990) が記載している方法によって if了つ (Sambrook, J. et aに， Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press) 。形質転換体の自殖次世代の種子を、ホルモンフリーの MS培地に播種し、発芽後、葉片の X - Glue処理により、 GUS 発現を調査した。さらに、同実生を 50 mg/l ハイグロマイシンを含むホルモンフリーの MS培地に移植し、ハイグロマイシンに対する抵抗性を調査した。

結果を表 1及び表 2に示す。

1次選抜における基本培地の比較（品種： IR24、菌系： LBA4404/pT0K233)

* ：独立の GUS 陽性植物の系統数（クローンは含まれていない）。

2, 3 次選抜培地には NB2 培地（20 mg/l ハイグロマイシン）を用いた再分化前培養培地には NBM 培地（40mg/l ハイグロマイシン）を用いた再分化培地には RNM 培地（30 mg/l ハイグロマイシン）を用いた。

表 2 1次選抜における基本培地の比較（品種： IR36、菌系： LBA4404/pT0K233)

2次選抜培地には GGM培地（30 mg/l ハイグロマイシン）を用いた ₍

3-5 次選抜培地には GCM培地（50 m _g/l ハイグロマイシン）を用い:

再分化前培養培地には NB培地（40mg/l ハイグロマイシン）を用し、

再分化培地には R關培地（30 m g/l ハイグロマイシン）を用いた。

表 3 LBA4404/pT0K233 によるインディ力イネの形質転換結果

** : 2次選抜以降の培地には CCM 培地を用いた。

以下、上記実験の結果についてさらに説明する。

(1 ) 形質転換細胞の選抜

1次選抜培地において、 2-3 週間培養した後、 NBM 培地では CGM， MSMおよび 2 N6M培地に比べ、非常に高頻度でハイグロマイシン耐性カルスが得られた（表 1、表 2 ) 。 1次選抜過程の未熟胚について、 X- G l ue処理による GUS 遺伝子の発現を調査したところ、 NBM 培地で培養した未熟胚の胚盤上に形成された複数の細胞塊が、各々、一様な GUS 発現を示していることを確認した。 CCM および MSM 培地では、胚盤全体が肥大しており、 GUS 発現領域の特異的な増殖は、ほとんど見られなかった。すなわち、 NBM培地では、遺伝子導入領域が選択的な増殖を示すため、 1 未熟胚あたり、複数の独立なハイグロマイシン耐性の細胞塊を、得ることができた。これに対し、 CCM および MSM 培地では、遺伝子導入領域の選択的な増殖は見られず、胚盤の表層細胞全体がカルス化する傾向があった。このため、 CCM および MSM培地で 1 次選抜を行った場合、ハイグロマイシン耐性の細胞塊を見きわめ、選抜することは、困難であった。 CC および MSM培地のハイグロマイシンの濃度を、 20, 30 mg/l と低くした場合には、ハイグロマイシンを添加しない場合と同様に、胚盤全体が増殖を示した。また、 2N6M培地では、 NBM 培地に比べ、未熟胚から選抜されるカルスの数が少なく、生長が遅い傾向が見られた。 Christouらは、パーティクルガン法において、 MSおよび CC培地を形質転換細胞の選抜に用いているが (Ghristou P. et al. , (19 91) Production of transgenic rice (Oryza Sat i va L. ) plants from agronomic ally important indica and japonica varieties via electric discharge part i cle acceleration of exogenous DNA into immature zygotic embryos. Bio/tech no logy 9: 957-962; Christou P. , Ford, T. L. and Kofron, M. (1992) The dev e I opment of a var iety_ independent gene-transfer method for r ice. TIB TECH 10: 239-246) 、本比較例における場合と同様に、得られた形質転換体の数は少なかった。

NBM 培地から NAA および BAを除去した 2,4-D 単独の培地では、再分化能を有するェンプリオジェニックな耐性カルスを得ることは、困難であった。このことから、 BAなどのサイトカイニン類は、再分化能を有する、ェンプリオジェニックなカルスを誘導するために、必要であると考えられた。 Li ら（1993) (上掲）は、 NB培地の NAA, BA および L- glutamine を含まない培地で、形質転換細胞の選抜を行ったが、インディ力イネでは、わずかな再生個体が得られたのみであることを報告しており、本比較例における結果と一致している。

1次選抜の培養期間は、 2-3 週間が好適であり、それ以上培養を続けると、未熟胚の胚盤上に形成されたカルスが必要以上に増殖し、未熟胚あたり複数の独立な選抜カルスを得ることが困難となるほか、カルスの形態が不良となる傾向があつた。

(2) 2次選抜以降の培養

供試した 10品種のうち 8 品種については、 NB2 培地上でカルスがェンブリオジエニックな状態で増殖した。 IR36, IR72の 2 品種については、比較の結果、 NB 2 培地より CCM 培地（30-50 mg/lハイグロマイシン、 250 mg/lセフオタキシム i y

) の方で、形態の良好なカルスが維持できた。

NBM 培地で 1次選抜を行った試験区では、他の培地に比べ、 2, 3次選抜においても非常に多くのカルスが耐性を維持していた（表 1、 2 ) 。 2次選抜以降の培養はほぼ 2 週間毎に行ったが、 3 週間以上培養を継続すると、カルスが褐変し、形態が不良になる傾向があった。選抜は、 3 次選抜もしくは 4, 5次選抜まで行つた後、再分化前培養を行った。

(3) 再分化培養

10品種すべてで効率よく再分化個体が得られ、再分化が困難な品種等は、特に認められなかった。また、発根培地には I BA (0. 2 mg / I ) を添加した MS I 培地が、ホルモンフリーの培地より、発根を明らかに促進し、好適であった。また、発根培地へのハイグロマイシンの添加（30m_g/ l ) は、植物体の段階でのハイグロマイシン耐性個体の選抜に有効であつた。

(4) 形質転換効率

再分化した個体の大部分は、葉において一様な GUS 発現を示した（表 3 ) 。 NB M培地で 1 次選抜を行う培養系を用いた場合、供試した 10品種すベてから、未熟胚あたり 30%以上の非常に高い効率で、ハイグロマイシン耐性かつ GUS 発現を示す形質転換体が得られた（表 1、 2、 3 ) 。

(5) サザン分析および後代への遺伝

GUS発現を示した再生個体は、サザン分析の結果、調査した全個体で導入遺伝子が確認されたとともに、 T-DNA は、各個体ごとに、イネゲノムのランダムな部位に導入されていることを確認した。また、後代の GUS 発現およびハイグロマイシン耐性の調査の結果、メンデルの法則に適合する遺伝的分離が観察された。

Claims

請求の範囲

1. インディ力イネ未熟胚細胞をァグロパクテリゥム法により形質転換し、形質転換された細胞を選抜する、イネの形質転換方法において、形質転換された細胞を選抜する培地として、 N0₃ 2000 〜4000 mg/l 、 MgS0₄60〜200 mg /し KH₂P0₄ 200〜600 mg/U CaCI₂100 〜450 mg/U (NH₄) ₂'S0₄200〜600 mg/し H₃B0₃1 〜7 mg/U MnS0₄2 ~20 mg/l 、 EDTA又はその塩 20〜50mg/l、 Fe 3〜8 mg/U ミオイノシ! ^一ル 50〜200 mg/U 2, 4 -ジクロロフエノキシ酢酸 0.5 〜10 mg/l 、サイトカイニン類 0.01〜5 mg/l及び糖類 5000〜80000 mg/l並びにゲル化剤を含み、 p Hが 4.5 〜6.5 である培地を用いることを特徴とする、インディ力イネの形質転換方法。

2. 前記サイトカイニン類が 6-ベンジルァミノプリンである請求項 1記載の方法。

3. 前記糖類がマルトース、ショ糖及びグルコースから成る群より選ばれる少なくとも 1種である請求項 1又は 2記載の方法。

4. 前記培地は、少なくとも、 Kl 0.5〜2 mg/U ZnS0₄0.7 〜5 mg/l, Na₂Mo0₄ 0.1 〜0.3 mg/し GuS0₄0· 01〜0.02 mg/l 、 CoCI₂0.01〜0· 02 mg/l 、ニコチン酸 0·25〜10 mg/l 、ピリドキシン 0.25〜5 mg/l及びチアミン 0.05〜20 mg/l をさらに含む請求項 1ないし 3のいずれか 1項に記載の方法。

5. 前記培地は、少なくとも、カザミノ酸 100 〜 3000 mg/l 、プロリン 100 〜 3000 mg/l 、グルタミン 100 〜3000 mg/l 及び α—ナフタレン酢酸 0.01〜5 mg/l をさらに含む請求項 4記載の方法。

6. 前記培地は、 1000〜60000 mg/lの糖アルコールをさらに含む請求項 1ないし 5のいずれか 1項記載の方法。

7. 前記糖アルコールはマ二トール又はソルビ I ^一ルである請求項 6記載の方法。

8. 前記インディ力イネは Group I に属する、請求項 1ないし 7のいずれか 1 項記載の方法。