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WO1998015625A1 - Nematodenproteine, dafür kodierende dna-sequenzen, dagegen spezifische antikörper und ihre verwendung zum auffinden nematizider wirkstoffe - Google Patents

Nematodenproteine, dafür kodierende dna-sequenzen, dagegen spezifische antikörper und ihre verwendung zum auffinden nematizider wirkstoffe Download PDF

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Publication number
WO1998015625A1
WO1998015625A1 PCT/EP1997/005314 EP9705314W WO9815625A1 WO 1998015625 A1 WO1998015625 A1 WO 1998015625A1 EP 9705314 W EP9705314 W EP 9705314W WO 9815625 A1 WO9815625 A1 WO 9815625A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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protein
proteins
cyclic
amino acids
sequence
Prior art date
Application number
PCT/EP1997/005314
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Achim Harder
Jürgen Scherkenbeck
Peter Jeschke
Frank Wunderlich
Hans-Peter Schmitt-Wrede
Beate Saeger
Original Assignee
Bayer Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19704024A external-priority patent/DE19704024A1/de
Application filed by Bayer Aktiengesellschaft filed Critical Bayer Aktiengesellschaft
Priority to AU46249/97A priority Critical patent/AU4624997A/en
Publication of WO1998015625A1 publication Critical patent/WO1998015625A1/de

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43536—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms
    • C07K14/4354—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms from nematodes

Definitions

  • NEMATODE PROTEINS CODING DNA SEQUENCES, AGAINST SPECIFIC ANTIBODIES AND THEIR USE TO DETECT NEMATTZIDER ACTIVE SUBSTANCES
  • the present invention relates to proteins, as well as parts of these proteins, which react with substances acting against parasitic nematodes from the group of cyclic or open-chain depsipepdees, which consist of amino acids and hydroxycarboxylic acids, furthermore DNA sequences for these proteins or for Coding parts of these proteins and the use of these proteins or their parts for the identification of substances with action against parasitizing
  • nematicidal substances have long been used as broad-spectrum anthelmintics in animal breeding (e.g. benzimidazole, levamisole, morantel or avermectinoids). Based on the substance classes mentioned, numerous studies have led to the elucidation of the mechanism of action and the identification of the respective binding protein / receptor (benzimidazole ß -Tubuhn, Levamisol / Morantel mcotinergic acetylcho nceptor, avermectinoids glutamate-mediated chloride channel) Due to increasing resistance to these broad-spectrum anthelmintics, it is desirable to develop new anthelmintically effective substances
  • a cychic depsipeptide PF 1022A and its activity against endoparasites is known (Y Kodama et al, Sei Reports of Meiji Seika Kaisha 3J_, 1992, pp. 1-8, EP-OS 382 173 and EP-OS 503 538). Further cychsche Depsipepüde (Cycloocta - depsipeptides WO 93/19053, EP-OS 634 408, WO 94/19334, WO 95/07272 EP-OS 626 375, EP-OS 626 376, EP-OS 664 297, cyclohexadepsipeptides
  • benzimidazole levamisole, morantel or avermectinoids
  • a binding protein or receptor in nematodes of cyclic or open-label depsipeptides as ligands consisting of amino acids and hydroxycarboxylic acids as building blocks, in particular of the cyclic depsipepüd PF 1022A nothing became known
  • the present invention relates to proteins, as well as parts of these proteins, which react with substances acting against parasitic nematodes from the group of cyclic or open-chain depsipede, which consist of amino acids and hydroxycarboxylic acids.
  • the present invention further relates to DNA
  • the present invention further relates to the use of these proteins or their parts for the identification of substances with action against parasitic nematodes from the group of cyclic or open depsipeptides, which consist of amino acids and hydroxycarboxylic acids
  • the present invention further relates to methods for identifying the proteins and their parts, and the production of the proteins or their parts using recombinant technology
  • Identification and characterization of the cDNA sequences which code for the proteins according to the invention is carried out by constructing a statistically representative cDNA library using polyadenerated RNA fraques, isolated from parasitic nematodes and subsequently immunoscreening the cDNA library mentioned
  • cDNA sequences according to the invention are identified and characterized with the aid of antibodies against a conjugate consisting of a cyclic or open-chain depsipepüd hapten and a suitable Car ⁇ er protein
  • conjugates of PF 1022A or its derivatives are preferred.
  • the proteins according to the invention are produced by expressing the cDNA according to the invention in suitable expression systems, for example in bacteria, in particular in E coh, as a prokaryotic expression system or in a eukaryotic expression system, in particular the baculovirus system
  • Active ingredients that are found with the help of the proteins according to the invention are of great interest for medicine and veterinary medicine
  • Antibodies are to be developed to deal with relatively small and simple molecules that, after application to a test animal alone, are unable to trigger an appropriate immune response there, first of all preparatory measures must be taken before the actual immunization (E Harlow, D Lane in , “Anubodies, a Laboratory Manual,” Cold Springer Harbor
  • Such compounds are called, because of their size (molecules with a molecular weight of less than 10,000 daltons are normally weak immunogens, molecules with a molecular weight of less than 2,000 daltons alone can hardly trigger an immune response) and simple
  • immunogens complete anugenes
  • These hapten molecules can be attached to mostly soluble, high molecular weight compounds (Carrier molecules) are conjugated, making them in their properties become comparable to complete antigens, ie they now have the ability to trigger an immune response
  • Some of the antibodies formed in the course of the immunization reaction are then able to react with specific epitopes on the hapten molecule, regardless of whether the hapten molecule is present alone or is still coupled to the carrier molecule.
  • hapten-carrier conjugates in addition to the hapten-specific antibodies, those are also induced and formed which are against the carrier or the link between carrier and hapten, or only against the complex of hapten- (link) carrier.
  • Antibodies are usually directed against that part of the molecule which is furthest away from the carrier
  • the open-label or cyclic depsipeptides used for the immunization preferably the cyclodepsipeptide PF 1022A or its
  • the open-chain and cyclic depsipeptides acting as haptens are preferably rodents, such as mice, rats, before the immunization of experimental animals.
  • Suitable carrier molecules in the context of this invention are primarily to be understood as macromolecular compounds which have freely accessible reactive groups for the coupling reaction with the hapten and which in the
  • Particularly preferred carriers are macromolecular compounds which contain freely accessible reactive amino groups. Lysine-rich proteins with a molecular weight between 10,000 and 1,500,000, such as “bovine serum albumin” (BSA molecular weight 66 200), “human serum albumin” (HSA, molecular weight 58,000) or “keyhole”, are very particularly preferred as car ⁇ er molecules Limpet Protein “(KLH, molecular weight 1,000,000) These are commercially available
  • Car ⁇ er molecules such as "Porcine Thyreoglobu n", B2 Microglobuhn, Haemocyamn, immunoglobulins, toxins (cholera, tetanus, Dipthe ⁇ a toxin, etc.), polysaccharides, lipopolysacchants, natural or synthetic polyadenyl and polyu ⁇ dyl acids, polyalanyl and polylysine polyps, or cell membrane components, such as, for example, molded or glutaraldehyde-treated erythrocyte cell membranes
  • Equally suitable for use as a Car ⁇ er molecule is, for example, the purified IgG fraküon against mouse IgG (H + L) from rabbits according to that described in H Kawamura and J A Berzofsky (J Immunol 58 (1986), p 136)
  • the hapten can be conjugated to the carrier molecule either directly or, preferably, via a bridge ched, which is optionally first attached to the hapten molecule
  • the coupling of the open and cyclic depsipeptides as haptens, in particular the PF 1022A or its derivatives, to the carrier molecule must take place in such a way that the relevant structural elements of the depsipepdee remain freely accessible and are therefore able to trigger a specific immune response, i.e. the Induction of specific antibodies
  • the cyclic depsipeptides with 24 ring atoms include compounds of the general formula (I)
  • R represents optionally substituted benzyl, may be mentioned being Subsütuenten hydrogen, C, _ 4 -Alkvl, in particular methyl, hydroxy, halogen, especially fluorine, C, _ -Al oxy, especially methoxy or tert-butyloxy, nitro, amino, dialkyl amino , in particular dimethylamino or diethylamino, N-morphohnyl, N-pyrrohdinyl or N-pipe ⁇ dinyl,
  • R 2 for hydrogen, C, - 4 alkyl, especially methyl, hydroxy, halogen, especially fluorine, C 1.4 alkoxy, especially methoxy or tert-butyloxy, nitro, amino, dialkylamino, especially dimethylamino or diethylamino, N-morphohnyl, N. -Pyrrohdinyl or N-pipe ⁇ dinyl,
  • R represents benzyl
  • R represents hydrogen, hydroxy, C -alkoxy, in particular methoxy, halogen, in particular fluorine, alkenyloxy, in particular allyloxy,
  • R- stands for hydrogen, hydroxy, C, 6- alkoxy, especially methoxy, nitro, amino, dialkylamino, especially dimethylamino, N-morphohnyl
  • the compounds of the general formula (I) can be present in their optically active, stereoisomeric forms or as racemic mixtures.
  • the optically active, stereoisomeric forms of the compounds of the general formula (I) are preferably used Assemble L-configured amino acids and D-configured hydroxycarboxylic acids as ring building blocks
  • the compound PF 1022A of the following formula (Ia) known from EP-OS 382 173 and EP-OS 503 538 of the following formula (la) is an example of a cychic depsipeptide:
  • R stands for benzyl and R 2 for hydrogen
  • R, and R. each represent nitro, amino or hydroxy
  • R- stands for hydroxy
  • R- stands for nitro, amino or methoxycarbonylamino Cyclic depsipeptides with 24 ring atoms of the general formula (Ib) are particularly preferably used, which are bonded via a free primary amino group of the benzyl fragment, optionally by means of a suitable bridge member with a primary amino function on the Car ⁇ er protein for covalent hapten-Car ⁇ er binding
  • bridging bonds which comprise between 3 and 10 bridging carbon atoms and which have, for example, amino, foryl, carboxyl or SH groups as reactive groups
  • dialdehydes such as glutardialdehyde
  • the actual coupling reaction is then preferably carried out with the aid of the diazo coupling.
  • the aminobenzyl devat of cyclodepsipepud PF 1022A first solubilized in a suitable solvent.
  • suitable solvents are, in particular, water and dilute acids
  • the Car ⁇ er protein such as BSA or KLH is added. After an incubation time of 0. 1 to 12 hours, preferably 2 to 4 hours, is neutralized, dialyzed and then lyophilized. The residue can then, if appropriate, after the interposition of further purification steps and subsequent determination of the degree of substitution (cf. P Tijssen in "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", Burdon, RH & Knippenberg ,
  • alternative methods for coupling the hapten to the Car ⁇ er molecule can also be used, such as, for example, the formation of the Schiff base, the active ester method or the mixed anhydride method.
  • the carboxyl function of the bridgehead is used using acetic anhydride or the carbodnmide derivative l-ethyl-3- (3'-dimethylamino-propyl) carbodum-linked to the Car ⁇ er molecule
  • the conjugation of the hapten to the Car ⁇ er molecule can alternatively be carried out by an oxidaon with free SH groups of the Car ⁇ er
  • the donor animals preferably rabbits (code no. SA 1 100-1 102, SA 1003-1005, Eurogentec, Seraing, Belgium) are immunized by one or more applications of the high molecular weight Car ⁇ er protein, for example KLH or BSA, coupled Depsipepüd-Haptene
  • injection which can take place intravenously, intraperitoneally or subcutaneously
  • the KLH-PF 1022A-De ⁇ vat and BSA-PF 1022A-De ⁇ vat conjugates (complexes) are used for the immunization of several donors, in particular three rabbits, per Car ⁇ er-hapten complex.
  • the first Boost immunization takes place 14 days after the first immunization.
  • the serum according to the invention is obtained after 10 days from the third boost immunization
  • the success of the immunization can be determined by determining the concentration of specific antibodies using an enzyme-linked immunoassay (ELISA "Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay” known to the person skilled in the art) or by Western blot analysis. Polyclonal analytes are used in the Western blot analysis producing good signals can be used for an "immune screening" of cDNA libraries
  • the Car ⁇ er-hapten complexes in particular the KLH-PF 1022A-De ⁇ vat complex and the Car ⁇ er protein KLH or the BSA-PF 1022A-De ⁇ vat complex and the Car ⁇ er protein BSA are in an SDS-PAGE (SDS-polyacrylic - amide gel) (see Laemmli et al, Nature 227, 1970, pp 680-685) and the proteins obtained are then blotted onto nitrocellulose.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylic - amide gel
  • the Car ⁇ er-hapten complexes or the C am er-P roteins are also blended using a "mini fold S "apparatus (Schleicher & Schuell, Dassel) blotted directly onto nitrocellulose filters
  • suitable serum dilutions preferably in a ratio of 1 1,000, very particularly preferably in a ratio of 1,500, leads to a significantly stronger detection reaction with the inventive Car ⁇ er - Hapten complexes as with the carrier proteins KLH or BSA (use of alkaline NBT / BCIP solution, see production examples)
  • Immuno screening used for the isolation and characterization of cDNA sequences which code for proteins which occur in different types of nematodes and for the binding of cyclic or open-chain depsipeptides as ligands, consisting of amino acids and hydroxycarboxylic acids as building blocks, in particular of the cyclic depsipeptide PF 1022A
  • the use of the antibodies according to the invention in all known immunoassays such as, for example, immunoradiometric tests after marking the tracer body with chloramine T or Bolton-Hunter reagent, as well as other competent and non-competent binding assays, such as fluorescence, enzyme, is of course necessary - (ELISA), chemiluminescent or other immunoassays, including all forms of radioimmunoassay (RIA) possible (Harlow, E Lane, d (1988) Antibodies A Laboratory Manual, CSH, 2nd Edn, New York, 319 to 359, 353 to 612 ) It is irrelevant whether the layer body is on
  • Polystyrene tubes, polystyrene balls, paramagnetic particles or activated S au lenmate ⁇ all of all kinds is bound covalently or non-covalently
  • polyadenylated RNA fracuons which are derived from parasitic nematodes according to the Guamdinium isothiocyanate / Casiumchlo ⁇ d cushion method described by Chirgwin et al (cf. Biochemistry 18, 1979, p 5294 to 5299) can be isolated, used for cDNA synthesis
  • polyadenylated RNA fracuons from parasitic nematodes of the order of the Strongylida, in particular Haemonchus spp or T ⁇ chostrongylus spp are preferably used for the cDNA synthesis to construct a statistically representative cDNA library
  • the synthesis is carried out according to the known methods of the "Great Length cDNA Synthesis Kit” from Clontech (Heidelberg)
  • the first strand synthesis is carried out using suitable polymers, in particular a 01 ⁇ go (dT) 25 (dN) primer.
  • EcoRI adapters are ligated to the double-stranded cDNA and cDNA molecules> 500 bp are fractionated via chromaspin columns (Clontech)
  • the constructs are packaged in vitro (Gigapack Gold II, Stratagene)
  • the anaers obtained above against the Car ⁇ er-hapten complexes but in particular the KLH-PF 1022A De ⁇ vat complex, are now used in "immune screening"
  • the inductor isopropyl- ⁇ -thiogalacto-pyrano- is preferably used for this
  • the filters with the Car ⁇ er-hapten complexes in particular the KLH -PF
  • the incubation time with the Car ⁇ er-hapten complexes is 1 to 12 hours.
  • the incubation takes place at temperatures between +5 and + 45 ° C, but preferably at room temperature.
  • the filters are then left for 4 hours Incubated at room temperature with the antiserum
  • the antiserum is present in a dilution of 1 200 to 1 2 000, preferably 1 500 to 1 1000
  • the phages obtained in this way are subjected to a "rescreening".
  • the isolated pure phage clones can then be converted into plasmid clones by means of in vivo excision, and the plasmid DNA can be used for further DNA analyzes
  • Both strands of the cDNA according to the invention are analyzed several times via automatic laser fluorescence sequencing and the sequence data are further investigated using software from Genetics Computer Group Ine (Madison, WI, USA)
  • the ID No. in the sequence listing Sequences according to the invention shown in FIGS. 1 and 3 each contain an “open reading frame” for a protein which recognizes the active substance PF 1022A and other active substances with similar immunulogical binding properties.
  • the first cloned cDNA, designated pHC-2, has 972 bases of the sequence shown in the sequence listing ID No 1
  • the non-coding 5 'section of the pHC-2 cDNA according to the invention consists of only 10 bases.
  • the first nucleotide sequence ATG at sequence position 1 1 represents the start codon.
  • this initiation site for translation is of the Kozak type (see M Kozak, J. Cell Biol 108, 1989, p. 229)
  • an N-terminal signal peptide with the cleavage site between 18 and 19 can be detected (cf. von Heinje, Nucleic Acids Research 14, 1986, pp. 4,683 to 4,690).
  • the first protein according to the invention which recognizes PF 1022A, is characterized in that it has a sequence of 207 amino acids with a resulting molecular weight of 23,991 g / mol (see sequence listing ID No. 2).
  • the first protein according to the invention is an integral membrane protein. In addition to the signal peptide sequence, it has a potential transmembrane region (position 174- 190) A glycosylation site can be located on the asparagine (Asn) at position 167. Glycosylations of the protein according to the invention preferably take place at this position 167
  • the first protein according to the invention which recognizes the Depsipepüd PF 1022A, shows similarities to different proteins from different organisms (Swiss-Prot database with 43 470 protein sequences). 'Best Fit 1 analyzes reveal an identity of 28% or a similarity of 53% to the 25 kDa Glycoprotein GP25L from Canis famiha ⁇ s (EMBL Accession No. P27869) GP25L is part of a heterotetrameric Ca ⁇ + -binding protein complex of the endoplasmic retina (ER). This complex is apparently important for the retention of ER-resident proteins (Wada et al, J Biol Chem 266, 1991, p
  • the Xenopus laevis cDNA clone X1262 (EMBL Accession No. X90517) also encodes a GP25L-like protein (Joost et al, Biochem J 3 12, 1995, pages 205 to 213), which has an identity of 56% or similarity of 73% to the invention Has target protein
  • a human EST (“expressed sequence tag” cDNA fragment, EMBL Accession No. T32283) likewise encodes a GP25L-like ammosaic fragment which has an identity of 71% or similarity of 83% to the invention
  • the protein also shows 24% identity or 52% similarity to the 23 kDa Saccharomyces cerevisiae precursor protein P24B (EMBL Accession No. P32803). This protein is probably involved in the transport of some secretory proteins from the ER to the Golgi complex
  • Northern blot analysis for the mRNA corresponding to the second cDNA clone pHC-1 determined a size of approximately 3.5 kb.
  • the clone pHC-1 isolated by immunoscreening has a size of 2 kb.
  • the still missing 5 'area of the mRNA was isolated using the 5'-RACE methodology [MA Frohmann (1990) PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (MA Innis, DH Gelfand, JJ Sninsky & TJ White eds) S 28-38, Academic Press,
  • the 5 'untranslated section of the mRNA (see sequence listing ID No 3) comprises 98 bases. It may be that some bases of the 5' end of the mRNA are still missing.
  • the 3 'non-translaced section (without poly (A) -ta ⁇ l ) consists of 462 bases.
  • the probable start codon of the Kozak type is located at sequence position 99, although there are two further ATG codons upstream. However, these are excluded as an translation site for the following reasons.
  • Position 99 is the second target protein according to the invention which recognizes PF 1022A, characterized in that it has a sequence of 986 amino acids with a molecular weight of 109 740 g / mol (s sequence listing ID No 4) In addition, the protein according to the invention shows a pI of 6 13
  • the second protein according to the invention is also an integral membrane protein.
  • an amino terminal signal pepüd cleavage point between the amino terminal signal pepüd
  • Potential N-glycosylation sites are located on the asparagine (Asn) in position 26, in position 499 and in position 862 locatable
  • three potential attached determinants in the region of the amino acid sections 1 0 to 156, 428 to 434 and 799 to 804 can be derived from the amino acid sequence sequence protocol ID No 4 of the second target protein according to the invention. These determinants of the amino acid sequence of the second protein according to the invention are preferred for production monoclonal antibody against the protein of importance
  • Thr residues Particularly striking in the amino terminal area is a section of 20 threonine (Thr) residues, which is interrupted by a Senn (Ser) residue (amino acid position 128 to 147), the carboxy-terminal part of the protein according to the invention contains a remarkably large number of proline (Pro) residues (Positions 915 to 926 extremely rich in proline
  • the target protein according to the invention does not have a noticeably high proline content.
  • Prohnrich sections can be targets for protein-protein interactions or act as a spacer between functional domains (see, for example, Yu et al, Cell Vol 78, 1994, pages 933-945 , Linial, Neuro- report Vol 5, 1994, S 2009-2015)
  • the cDNA section. the coding for the second protein according to the invention showed, when screening the EMBL database between bases 1790 to 2460, the sequence shown in the sequence listing ID No 4, a 60% homology to a genome section of the free-living nematode C elegans (accession no. Z54306, Wilson et al, Nature Vol 368, 1994, pp 32-38)
  • the similar C elegans genome section is an exon of a gene whose deduced gene product is said to be similar to G protein-coupled receptors. No further information about this gene or gene product exists, since the published sequence is the product of the C elegans genome product (see Wilson et al, Nature Vol 368, 1994, S 32-38)
  • the 'Best Fit' analysis shows a 49% identity or 65% similarity of this deduced protein to the H contortus gene product.
  • the elegans protein also has a threonine (Thr) in the amino terminal region - From 15 residues, which is also interrupted by a Senn (Ser) residue
  • the best fit analysis of the second protein according to the invention in comparison to various G protein-coupled receptors shows the following result: There is an identity of 22% or similarity of 44% to the precursor protein of the pig calcitonin receptor (SwissProt Accession No. P251 17), there is a gastrin / cholecvstokinin type B receptor of the rat ( ⁇ .ccess ⁇ on no. P30553) Identity of 20% or a similarity of 45% and there is an 18% identity or 46% similarity to the neuromedin K receptor of the rat (Accession No. P16177)
  • the two proteins according to the invention can be regarded as new prototypes of specific proteins of parasitic nematodes, in particular in nematodes from the order of the Strongylida, such as Haemonchus spp
  • proteins according to the invention can be obtained by expression in a prokaryotic or eukaryotic expression system in a manner known per se
  • Suitable prokaryotic expression systems are all known host vector systems such as bacteria of the species Streptomyces, srjp_ Bacillus subggis, Salmonella typhimu ⁇ um or Serraüa marcescens. especially E coli. in which the expression of a recombinant DNA under the control of an inducible promoter is possible Natural, hybrid or bacteriophage promoters come into consideration as promoters for expression in E. coli.
  • P R ⁇ phage, hsp, omp or synthetic promoters such as beispielswei se in DE-OS 3,430,683 or in EP-A 0 1 73 149 proposed are advantageous for example is the tac promoter-operator sequence, which is now commercially available (eg expression vector pKK223-3, Pharmacia, "Molecular Biologicals, Chemicals and Equipment for Molecular Biology", 1984, p. 63)
  • Baculovvi russy stem should be mentioned in particular as a suitable eukaryotic expression system
  • a suitable eukaryotic expression system in particular the baculovirus system, in which post-translational modifications are carried out, is preferably used for the expression of the proteins according to the invention
  • homologous or cross-reacting proteins of other parasitic nematodes can be detected, for example, by Western blot analyzes
  • the protein according to the invention can be used in suitable test kits for screening for the non-toxic effect of these compounds
  • the active substances which are found with the aid of the proteins according to the invention are suitable for combating pathogenic endoparasites which occur in humans and in animal husbandry and animal breeding in useful, breeding, zoo, laboratory, experimental and hobby animals in the case of favorable warm-blood toxicity They are effective against all or individual stages of development of the pests as well as against resistant and normally sensitive species.
  • pathogenic endoparasites disease, deaths and reduced performance (e.g. in the production of meat, milk, wool, skin, eggs, etc.) are to be reduced , so that the use of the active ingredients enables more economical and simple animal husbandry. Pay for the pathogenic endoparasites
  • Nematodes are especially mentioned
  • Strongylida for example Strongylus spp, T ⁇ odontophorus spp,
  • Oesophagodontus spp T ⁇ chonema spp, Gyalocephalus spp, Cyhndropharynx spp, Pote ⁇ ostomum spp, Cyclococercus spp, Cyhcostephanus spp, Oesophagostomum spp, Chabertia spp, Stephanurus spp, Ancylostoma sppum sppum, Uncinaostoma spp, Syncostomppm Metastrongylus spp, Dictyocaulus spp, Muelle ⁇ us spp, Protostrongylus spp,
  • Neostrongylus spp Cystocaulus spp, Pneumostrongylus spp, Spicocaulus spp, Elaphostrongylus spp, Parelaphostrongylus spp, Crenosoma spp, Paracrenosoma spp, Angiostrongylus spp, Aelurostrongylus spp, Tilaroides spp, Tilaroides spp, Filaroides spp, Filaroides spp, Nematodirus spp, Hyostrongylus spp, Obehscoides spp,
  • Asca ⁇ dia From the order of the Asca ⁇ dia, for example Asca ⁇ s spp, Toxasca ⁇ s spp, Toxocara spp, Parasca ⁇ s spp, Anisakis spp, Asca ⁇ dia spp
  • the livestock and breeding animals include mammals such as cattle, horses, sheep, pigs, goats, camels, water buffalos, donkeys, rabbits, fallow deer, reindeer, fur animals such as mink, chinchilla, washable, birds such as chicken, geese,
  • Laboratory and animal research animals include mouse rats, guinea pigs, golden hamsters, dogs and cats
  • the pets include dogs and cats
  • the application can be prophylactic as well as therapeutic
  • the active ingredients are used directly or in the form of suitable preparations enterally, parenterally, dermally or nasally
  • antibodies in particular monoclonal antibodies, can also be produced which have a nematic effect and can be used as nematic active substances
  • ID-No 2 the three additional determinants of the most protein according to the invention
  • the sections 69 to 75, 157 to 162 and 1 59 to 164 are used for the generation of monoclonal antibodies
  • the three attached determinants of the protein according to the invention (ID-No 4), sections 150 to 156, 428 to 434 and 799 to 804 can be used in particular for the generation of monoclonal antibodies
  • the KLH-PF 1022A-De ⁇ vat and BSA-PF 1022A-De ⁇ vat conjugates were used to immunize rabbits (3 animals per Car ⁇ er-hapten complex).
  • the first boost immunizations took place 14 days after the immunization in Im A total of 10 further boost immunizations were carried out every 4 weeks. From the third boost immunization, approximately 20 ml of blood was taken after 10 days for serum extraction. 24 days after the last immunization, the animals were completely bled
  • the specificity of the aniserum against the PF 1022A-De ⁇ vat was checked by Western blot analysis.
  • the KLH-PF 1022A-De ⁇ vat complex and the Car ⁇ er protein KLH were analyzed using a "slot blot" apparatus (Minifold S, Schleicher &
  • RNA of the gastrointesinal nematode Haemonchus contortus was extracted according to the Guanidinium Isothiocyanate / Casiumchlo ⁇ d cushion method described by Chirgwin et al (Biochemistry 18, 1979, pp. 5 294 to 5 299).
  • the polyadenylated RNA fracüon was then used purified via Ol ⁇ go (dT) chromatograph (Aviv & Leder, Proc
  • RNA fracüon 5 ⁇ g of the polyadenylated RNA fracüon were used for the cDNA synthesis.
  • the synthesis followed the instructions of the "Great Lenght cDNA Synthesis Kit” from Clontech (Heidelberg).
  • the first strand synthesis was carried out with an Ol ⁇ go (dT ), 5 (dN) polymer carried out.
  • EcoRI adapters were ligated to the double-stranded cDNA and cDNA molecules> 500 bp were fractionated via chromaspin columns (Clontech). After ligation of the cDNA into the EcoRI site of the vector ⁇ ZAPII (Stratagene Heidelberg), the Constructs packaged in vitro (Gigapack Gold II, Stratagene)
  • the antiserum against the KLH-PF 1022A-De ⁇ vat complex was used for the immune screening.
  • 1 100 diluted antiserum was incubated for four hours at room temperature with filter-bound E coli lysate
  • the clone was analyzed by automated laser fluorescence sequencing (A L F DNA sequencer, Pharmacia Freiburg, or Licor
  • the filter was hybridized overnight at 65 ° C in 6 x SSC, 5 x Denhardt's reagent with radioactively labeled plasmid DNA ("random p ⁇ ming" with 50 ⁇ Ci [ ⁇ - j2 P] dCTP).
  • the membranes were then in 0 with high rigidity , 2 x SSC, 0.5% SDS washed at 65 ° C (Sambrock et al, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring
  • the first cloned cDNA called pHC-2 comprises 972 bases and codes for a protein with 207 amino acids (see sequence listing ID No 2)
  • the second mRNA which is characterized by several cDNA fragments (pHC-1), is composed of 3 539 bases and codes for a protein with 986 amino acids (see sequence listing ID No 4).
  • Seq ID No 1 the nucleotide sequence of the cDNA (pHC-2) according to the invention from the gastrointesinal nematode Haemonchus contortus.
  • the cDNA shown comprises 972 bases which code for 207 amino acids of the protein according to Seq ID No 2.
  • the coding for protein ID No 2 is the start Position 1 1
  • Seq ID No 2 is the amino acid sequence of the first protein from the gastrointesinal nematode derived from the nucleotide sequence Seq ID No 1
  • Haemonchus contortus In this sequence lie on the positions
  • Seq ID No 3 the nucleotide sequence of the cDNA (pHC-1) according to the invention from the gastrointesinal nematode Haemonchus contortus.
  • the mRNA characterized by several cDNAs consists of 3,539 bases which code for 986 amino acids of the protein according to Seq ID No 4.
  • Start for the coding of protein ID No 4 is position 99
  • Seq ID No 4 the amino acid sequence of the second protein derived from the nucleotide sequence Seq ID No 3 of the gastrointestinal nematode Haemonchus comfortu s. In this sequence are on the positions
  • Figure 1 shows the nucleotide sequence from Seq ID 1 and assigned the amino acids of the protein from Seq ID 2
  • Figure 2 shows the nucleotide sequence from Seq ID 3 and assigned the amino acids of the protein from Seq ID 4
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTI-SENSE NO
  • TTTTCTCTTT TTTAATGCGA GTCACCTGAA TTTTGGCTAA ATCTAGATGT GATGTTGCTG 840
  • MOLECULE TYPE cDNA
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTI-SENSE NO
  • GATCCATGCC CAGGAGTGAA GAAATACCTT GAAGTCACAT ATCTGTGTGT TGCTGATGTG 480
  • TTTCCTCATC CAGGTGTTGC CATCCATTAT CCCTCATTCG ATCTGGATTC CTCCTACCAA 2820
  • GCATGTGTCC CTGTAAATGT TTCCTCGAGA GAGATTTTTG CCGAGGTTGT GCGCTTCAGT 3120

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, sowie Teilstücke dieser Proteine, die mit gegen parasitierenden Nematoden wirkenden Soffen aus der Gruppe der cyclischen oder offenkettigen Depsipeptide, die aus Aminosäuren und Hydroxycarbonsäuren bestehen, reagieren, ferner DNA-Sequenzen, die für diese Proteine bzw. für Teilstücke dieser Proteine kodieren, sowie die Verwendung dieser Proteine oder ihrer Teilstücke zur Identifizierung von Stoffen mit Wirkung gegen parasitierende Nematoden.

Description

NEMATODENPROTEINE, DAFÜR KODIERENDE DNA-SEQUENZEN, DAGEGEN SPEZIFISCHE ANTIKÖRPER UND IHRE VERWENDUNG ZUM AUFFINDEN NEMATTZIDER WIRKSTOFFE
Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, sowie Teilstucke dieser Proteine, die mit gegen parasitierende Nematoden wirkenden Stoffen aus der Gruppe der cycli- schen oder offenkettigen Depsipepüde, die aus Aminosäuren und Hydroxycarbon- sauren bestehen, reagieren, ferner DNA-Sequenzen die für diese Proteine bzw für Teilstucke dieser Proteine kodieren sowie die Verwendung dieser Proteine oder ihrer Teilstucke zur Identifizierung von Stoffen mit Wirkung gegen parasitierende
Nematoden
Eine Reihe nematizider Substanzen werden bereits seit langem als Breitspektrum- Anthelmintika in der Tierzucht verwendet (z B Benzimidazole, Levamisol, Morantel oder Avermectinoide) Ausgehend von den genannten Substanzklassen führten zahlreiche Studien zur Aufklarung des Wirkmechanismus und zur Identifizierung des jeweiligen Bindungsproteins/Rezeptors (Benzimidazole ß-Tubuhn, Levamisol/Morantel mkotinerger Acetylcho nrezeptor, Avermectinoide Glutamat- vermittelter Chlorid-Kanal) Durch zunehmende Resistenz gegen diese Breit- spektrum-Anthelmintika ist es wünschenswert neue anthelmintisch wirksame Stoffe zu entwickeln
Ein cychsches Depsipeptid PF 1022A und seine Wirkung gegen Endoparasiten ist bekannt (Y Kodama et al , Sei Reports of Meiji Seika Kaisha 3J_, 1992, S 1 -8, EP-OS 382 173 und EP-OS 503 538) Weitere cychsche Depsipepüde (Cycloocta- depsipeptide WO 93/19053, EP-OS 634 408, WO 94/19334, WO 95/07272 EP-OS 626 375, EP-OS 626 376, EP-OS 664 297, Cyclohexadepsipeptide
WO 93/25543, WO 95/27498, EP-OS 658 551) und offenkettige Depsipepüde (EP-OS 657 171 , EP-OS 657 172, EP-OS 657 173) und ihre endoparasitizide Wirkung sind bekannt
Eine Reihe von Studien bezuglich der Aufklarung des Wirkungsmechanismus von PF 1022A in verschiedenen parasitären Nematoden, beispielsweise Angio- strongylus cantonensis, Haemonchus contortus, Ascaπs suum wurden durchgeführt (vgl dazu M Terada et al , Jpn J Parasitol 42, 1993, S 220-226, F E Dutton et al , J Anübioücs 48, 1995, S 820-823, E Baldwin et al , J Exp Biol 23, 1947, S 277-91) Außer den bereits genannten Breitspektrum-Anthelminüka (z B Benzimidazole, Levamisol, Morantel oder Avermectinoide) ist über ein Bindungsprotein bzw Rezeptor in Nematoden von cyclischen oder offenketügen Depsipeptiden als Liganden, bestehend aus Aminosäuren und Hydroxycarbonsauren als Bausteine, insbesondere des cyclischen Depsipepüds PF 1022A, bisher nichts bekannt geworden
Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, sowie Teilstucke dieser Proteine, die mit gegen parasitierende Nematoden wirkenden Stoffen aus der Gruppe der cyclischen oder offenketügen Depsipepüde, die aus Aminosäuren und Hydroxycarbon- sauren bestehen, reagieren Die vorliegende Erfindung betrifft ferner DNA-
Sequenzen die für diese Proteine bzw für Teilstucke dieser Proteine kodieren
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung dieser Proteine oder ihrer Teilstucke zur Identifizierung von Stoffen mit Wirkung gegen parasitierende Nematoden aus der Gruppe der cyclischen oder offenketügen Depsipeptide, die aus Aminosäuren und Hydroxycarbonsauren bestehen
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Identifizierung der Proteine und ihrer Teilstucke, sowie die Herstellung der Proteine oder ihrer Teilstucke über rekombinante Technologie
Identifizierung und Charakterisierung der cDNA-Sequenzen, die für die erfin- dungsgemaßen Proteine kodieren, erfolgt durch Konstruktion einer statistisch repräsentativen cDNA-Bibhothek unter Verwendung polyadenyherter RNA- Fraküonen, isoliert aus parasitären Nematoden und einem sich anschließenden Immunscreening der genannten cDNA-Bibhothek
Identifizierung und Charakterisierung der erfindungsgemaßen cDNA-Sequenzen erfolgen mit Hilfe von Antikörpern gegen ein Konjugat, bestehend aus einem cyclischen oder offenketügen Depsipepüd-Hapten und einem geeigneten Carπer- Protein
Es sind bis jetzt nur monoklonale Antikörper gegen verschiedene Cyclodepsi- pepüd-Synthetasen, beispielsweise die Enniaün-Synthetase (A Bilhch et al , Biol Chem Hoppe-Seyler 36^8 (5), 1987, S 521-529, A Lawen et al , J Biol Chem
265, ( 19) 1990, S 1 1355- 1 1360) oder die Cvclospoπn-Svnthetase (A Lawen et al , J Biol Chem 266, (24), 1991 , S 15567-15570), aber nicht spezifische Antikörper gegen Konjugate bestehend aus Depsipepüd-Hapten und einem geeigneten Carπer-Protein, bekannt geworden
Bevorzugt zur Identifizierung und Charakterisierung der erfindungsgemaßen cDNA-Sequenzen werden Konjugate von PF 1022A oder seiner Derivate als
Depsipepüd-Hapten an Carπer-Proteine eingesetzt
Die erfindungsgemaßen Proteine werden durch Expression der erfindungsgemaßen cDNA in geeigneten Expressionssystemen, beispielsweise in Bakterien, insbesondere in E coh, als prokaryoüsches Expressionssystem oder in einem euka- ryoüschen Expressionssystem, insbesondere dem Baculovirussystem hergestellt
Wirkstoffe die mit Hilfe der erfindungsgemaßen Proteine aufgefunden werden, sind für die Medizin und Tiermedizin von hohem Interesse
Weitere Aspekte der Erfindung und ihre bevorzugten Ausfuhrungsformen sind im folgenden naher erläutert bzw in den Patentansprüchen definiert
Da es sich bei den offenketügen und cyclischen Depsipepüden, für die spezifische
Antikörper entwickelt werden sollen, um relativ kleine und einfache Moleküle handelt, die nach der Applikation in ein Versuchstier alleine nicht in der Lage sind, dort eine entsprechende Immunantwort auszulosen, müssen vor der eigentlichen Immunisierung zunächst vorbereitende Maßnahmen getroffen werden (E Harlow, D Lane in, "Anübodies, a Laboratory Manual", Cold Springer Harbor
Lab , Cold Spring Harbor, USA, 1988)
Man bezeichnet solche Verbindungen, die aufgrund ihrer Große (Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 10 000 Dalton sind normalerweise schwache Immunogene, Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 2 000 Dalton können alleine kaum eine Immunantwort auslosen) und einfachen
Strukturierung nicht zur Induktion einer Immunreaktion in der Lage sind, als Haptene oder inkomplette Anügene und stellt sie somit den kompletten Anügenen (= Immunogene) gegenüber, die sowohl als Anügen wirken als auch eine Immunantwort zu induzieren vermögen Solche Haptenmolekule können an meist lösliche, hochmolekulare Verbindungen (Tragermolekule) konjugiert werden, wodurch sie in ihren Eigenschaften kompletten Antigenen vergleichbar werden, d h sie besitzen jetzt die Fähigkeit zur Auslosung einer Immunantwort
Einige der im Verlauf der Immunisierungsreaktion gebildeten Antikörper sind dann in der Lage, mit spezifischen Epitopen auf dem Haptenmolekul zu reagieren, unabhängig davon, ob das Haptenmolekul allein oder aber nach wie vor gekoppelt an das Carriermolekύl vorliegt.
Bei der Immunisierung mit Hapten-Carrier-Konjugaten werden neben den Hapten- spezifischen Antikörpern auch solche induziert und gebildet, die gegen den Carrier oder das Bindeglied zwischen Carrier und Hapten, oder die nur gegen den Kom- plex aus Hapten-(Bindeglied)-Carrier gerichtet sind Die spezifischen Anti-Hapten-
Antikorper sind im Regelfall gegen denjenigen Teil des Moleküls gerichtet, der vom Carrier am weitesten entfernt ist
Unter der im folgenden häufig verwendeten Bezeichnung Hapten werden im Rahmen der Erfindung die für die Immunisierung verwendeten offenketügen oder cyclischen Depsipeptide, bevorzugt das Cyclodepsipeptid PF 1022A oder seine
Derivate verstanden
Im Rahmen dieser Erfindung werden daher die als Haptene wirkenden offen- kettigen und cyclischen Depsipeptide, insbesondere PF 1022A oder seine Derivate, vor der Immunisierung von Versuchstieren, bevorzugt Nagetieren, wie z B. Mause, Ratten. Kaninchen, Meerschweinchen, an einen hochmolekularen Trager "Carrier" gekoppelt, der geeignet ist, besagten Depsipeptiden eine komplette Wirksamkeit zu verleihen
Unter geeigneten Carrier-Molekulen im Rahmen dieser Erfindung sind in erster Linie makromolekulare Verbindungen zu verstehen, die frei zugangliche reaktive Gruppen für die Kupplungsreaktion mit dem Hapten aufweisen und die in der
Lage sind, durch Kupplung an das Hapten, diesem eine immunogene Potenz zu verleihen oder aber deren bereits vorhandene Immunogenizität zu verstarken
Besonders bevorzugte Carrier sind makromolekulare Verbindungen, die frei zugangliche reaktive Aminogruppen enthalten. Ganz besonders bevorzugt als Carπermolekule sind lysinreiche Proteine mit einem Molekulargewicht zwischen 10 000 und 1 500 000, wie sie z B "Bovine Serum Albumin" (BSA Molekulargewicht 66 200), "Humanes Serum Albumin" (HSA, Molekulargewicht 58 000) oder "Keyhole Limpet Protein" (KLH, Molekular- gewicht 1 000 000) Diese sind kommerziell erhältlich
Selbstverständlich können auch andere makromolekulare Verbindungen als Carπer- Molekule verwendet werden, wie z B "Porcine Thyreoglobu n", B2 Microglobu- hn, Haemocyamn, Immunglobuline, Toxine (Cholera-, Tetanus-, Diptheπa-Toxin u a ), Polysacchaπde, Lipopolysacchaπde, natürliche oder synthetische Polyadenyl- und Polyuπdylsauren, Polyalanyl- und Polylysin-Polypepüde oder Zellmembrankomponenten, wie beispielsweise Formahn- oder Glutaraldehyd-behandelte Erythrozytenzellmembranen
Ebenso geeignet für die Verwendung als Carπer-Molekul ist beispielsweise die gereinigte IgG-Fraküon gegen Maus IgG (H+L) aus Kaninchen gemäß dem bei H Kawamura und J A Berzofsky (J Immunol 58 (1986), S 136) beschriebenen
Verfahren
Die Kopplung von Haptenen an Carπern erfolgt nach an sich etablierten Techniken (P Tijssen in "Pracüce and Theory of Enzyme Immunoassays", Burdon, R H & Knippenberg, P H , Hrsg , Elsevier, Oxford, UK 1985)
Die Konjugation des Haptens an das Tragermolekul kann entweder direkt oder aber vorzugsweise über ein Bruckenghed erfolgen, welches gegebenenfalls zunächst an das Haptenmolekul angelagert wird
Die Kupplung der offenketügen und cyclischen Depsipeptide als Haptene, insbesondere des PF 1022A oder seiner Derivate, an das Tragermolekul muß dabei in der Weise erfolgen, daß die relevanten Strukturelemente der Depsipepüde frei zuganglich bleiben und somit in der Lage sind eine spezifische Immunantwort auszulosen, d h die Bildung spezifischer Antikörper zu induzieren
Als bevorzugte Haptene dienen Depsipepüd-Liganden aus offenketügen oder cyclischen Depsipepüden mit 6 bis 30 Ringatomen, bestehend aus Aminosäuren und Hvdroxycarbonsauren als Bausteine Als ganz besonders bevorzugte Haptene dienen Depsipepüd-Liganden aus cvcli- schen Depsipeptiden mit 24 Ringatomen, bestehend aus Aminosäuren und Hydroxycarbonsauren als Bausteine
Zu den cyclischen Depsipeptiden mit 24 Ringatomen zahlen Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
Figure imgf000008_0001
in welcher
R, für gegebenenfalls substituiertes Benzyl, wobei als Subsütuenten genannt seien Wasserstoff, C,_4-Alkvl, insbesondere Methyl, Hydroxy Halogen, insbesondere Fluor, C,_ -Al oxy, insbesondere Methoxy oder tert -Butyloxy, Nitro, Amino, Dialkyl amino, i nsbesondere Dimethyl amino oder Diethylamino, N-Morphohnyl, N-Pyrrohdinyl oder N-Pipeπdinyl, steht,
R2 für Wasserstoff, C,_4-Alkyl, insbesondere Methyl, Hydroxy, Halogen, insbesondere Fluor, C1.4-Alkoxy, insbesondere Methoxy oder tert -Butyloxy, Nitro, Amino, Dialkylamino, insbesondere Dimethylamino oder Diethylamino, N-Morphohnyl, N-Pyrrohdinyl oder N-Pipeπdinyl, steht,
wobei
a) für den Fall, daß R, für Benzyl steht, R für Wasserstoff, Hydroxy, C -Alkoxy, insbesondere Methoxy, Halogen, insbesondere Fluor, Alkenyloxy, insbesondere Allyloxy, steht,
b) für dem Fall, daß R, für Methyl steht,
R-, für Wasserstoff, Hydroxy, C,,6-Alkoxy, insbesondere Methoxy, Nitro, Amino, Dialkylamino, insbesondere Dimethylamino, N-Morphohnyl steht
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können in ihren optisch aktiven, stereoisomeren Formen oder als racemische Gemische voi liegen Vorzugsweise werden die optisch aktiven, stereoisomeren Formen der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) verwendet Besonders bevorzugt werden die cyclischen Depsipepüde verwendet, die sich aus L-konfiguπerten Aminosäuren und D-konfigu- πerten Hydroxycarbonsauren als Ringbausteine zusammensetzen
Beispielhaft sei als cychsches Depsipeptid die aus EP-OS 382 173 und EP-OS 503 538 bekannte Verbindung PF 1022A der folgenden Formel (la), in der
R, für Benzyl und R2 für Wasserstoff steht, genannt
Figure imgf000009_0001
Außerdem seien als cyclische Depsipeptide die aus der PCT-Anmeldung WO 93/19053 und EP 0 634 408 AI bekannten Verbindungen genannt, die geeignete funktioneile Gruppen enthalten, die eine direkte kovalente Kopplung an ein Carπer-Protein oder aber eine Kopplung über ein Bruckenmolekul an ein
Carrier-Protein gestatten
Insbesondere seien aus der PCT-Anmeldung WO 93/19053 und EP 0 634 408 A I die Verbindungen der folgenden Formel (Ib), in der R, für (R3) substituiertes Benzyl steht, genannt:
Figure imgf000010_0001
in welcher
R-, und R. jeweils für Nitro, Amino oder Hydroxy stehen
Weiterhin seien als Depsipeptide die aus der PCT-Anmeldung WO 94/19334 bekannten Verbindungen genannt
Insbesondere seien aus der PCT-Anmeldung WO 94/19334 die Verbindungen der folgenden Formel (Ic), in der R, für Benzyl steht, genannt
Figure imgf000011_0001
in welcher
R-, für Hydroxy steht
Schließlich seien als Depsipeptide die aus der PCT-Anmeldung WO 95/07272 bekannten Verbindungen genannt.
Insbesondere seien aus der PCT-Anmeldung WO 95/07272 die Verbindungen der folgenden Formel (Id), in der R für Methyl steht, genannt'
Figure imgf000011_0002
in welcher
R-, für Nitro, Amino oder Methoxycarbonylamino steht Besonders bevorzugt werden cyclische Depsipeptide mit 24 Ringatomen der allgemeinen Formel (Ib) eingesetzt, die über eine freie primäre Aminogruppe des Benzyl fragments, gegebenenfalls mittels eines geeigneten Biuckengliedes mit einer primären Aminofunktion auf dem Carπer-Protein zur kovalenten Hapten- Carπer-Bindung gebunden sind
Als Bruckengheder für eine Konjugation des Haptens, insbesondere des Cyclodepsipepüds PF 1022A und seiner Derivate der allgemeinen Formel (Ib), an das Carπer-Molekul kommen in erster Linie Verbindungen in Betracht, die mindestens zwei oder aber mehrere reaktive Gruppen enthalten, welche in der Lage sind, mit den frei zugänglichen reaktiven Gruppen des Carπer-Molekuls in Wechselwirkung zu treten
Besonders bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung ist die Verwendung von Bruckenghedem die zwischen 3 und 10 Brucken-C-Atome umfassen und die als reaktive Gruppen z B Amino-, For yl-, Carboxyl- oder SH-Gruppen besitzen
Diese reaktiven Gruppen können mit Hilfe bekannter Verfahren mit den reaktiven
Gruppen des Hapten- und Carπer-Molekuls zur Reaktion gebracht werden unter Ausbildung eines Hapten-Carπer-Konjugates
So ist es beispielsweise möglich ein Bruckenghed über eine reaktive Aminogruppe, insbesondere der Derivate des Cyclodepsipepüds PF 1022A, mit Hilfe von Dialdehyden, wie z B Glutardialdehyd, an eine der freien Aminogruppen des
Carπer-Molekuls zu binden
In einer spezifischen Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung geht man von den in der PCT-Anmeldung WO 93/19053 und EP 0 634 408 AI genannten Derivaten des Cyclodepsipepüds PF 1022A der allgemeinen Formel (Ib), vorzugsweise vom Nitrobenzyl-Deπvat aus und setzt diese Verbindungen mit Hilfe bekannter
Methoden, wie z B durch Hydrierung, in einem weiteren Reaktionsschritt sehr einfach in das bekannte Aminobenzyl-Deπvat des Cvclodepsipepüds PF 1022A um
Die eigentliche Kopplungsreaküon erfolgt dann vorzugsweise mit Hilfe der Diazo- kupplung Dabei wird das Aminobenzyl-Deπvat des Cyclodepsipepüd PF 1022A zunächst in einem geeigneten Losungsmittel solubilisiert Als geeignete Losungsmittel kommen insbesondere Wasser und verdünnte Sauren in Betracht
Im Anschluß an die Umwandlung der Aminofunktion in das entsprechende Dia- zoniumsalz nach literaturbekannten Methoden (vgl Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Band X/3) wird das Carπer-Protein wie z B BSA oder KLH zugegeben Nach einer Inkubationszeit von 0, 1 bis 12 Stunden, vorzugsweise 2 bis 4 Stunden wird neutralisiert, dialysiert und anschließend lyophilisiert Der Ruckstand kann dann gegebenenfalls nach Zwischenschaltung weiterer Reinigungsschritte und nachfolgender Bestimmung des Substitutionsgrades (vgl P Tijssen in "Pracüce and Theory of Enzyme Immunoassays", Burdon, R H & Knippenberg,
P H , Hrsg , Elsevier, Oxford, UK 1985) für die eigentliche Immunisierungsreaktion verwendet werden
Neben der als bevorzugt genannten Diazokupplung, können auch alternative Verfahren für die Kupplung des Haptens an das Carπer-Molekul verwendet werden, wie z B die Schiffbasenbildung, die Aktivestermethode oder die gemischte Anhydridmethode Bei der zuletzt genannten Methode wird die Carboxylfunküon des Bruckenghedes unter Verwendung von Essigsaureanhydπd oder des Carbodnmid- Denvates l-Ethyl-3-(3'-dιmethylamιnopropyl)carbodumιd an das Carπer-Molekul geknüpft
Besitzt das Bruckenghed beispielsweise eine reaktive SH-Gruppe, so kann alternativ die Konjugation des Haptens an das Carπer-Molekul durch eine Oxi- daüon mit freien SH-Gruppen des Carπers durchgeführt werden
Die Immunisierung der Donortiere, bevorzugt Kaninchen (Code-Nr SA 1 100 - 1 102, SA 1003 - 1005, Fa Eurogentec, Seraing, Belgien), erfolgt durch eine ein- bis mehrmalige Applikation der an das hochmolekulare Carπer-Protein, beispielsweise KLH oder BSA, gekoppelten Depsipepüd-Haptene
Die bevorzugte Apphkationsform ist die Injektion, die sowohl intravenös intraperitoneal oder subcutan erfolgen kann
Besonders bevorzugt ist jedoch eine intravenöse Injektion In einer spezifischen Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung werden die KLH-PF 1022A-Deπvat- und BSA-PF 1022A-Deπvat-Kon|ugate (Komplexe) zur Immunisierung von mehreren Donorüeren, insbesondere von drei Kaninchen, pro Carπer-Hapten-Komplex eingesetzt Die erste Boost-Immunisierung erfolgt dabei 14 Tage nach der Erstimmunisierung Weitere Boost-Immunisierungen, insbesondere 10 Boost-Immunisierungen, folgen dann im Abstand von jeweils 4 Wochen Ab der dritten Boost-Immunisierung wird jeweils nach 10 Tagen das erfin- dungsgemaße Serum gewonnen
Der Erfolg der Immunisierung laßt sich durch Bestimmung der Konzentration von spezifischen Antikörpern mit einem, dem Fachmann an sich bekannten Enzymgekoppelten Immunoassay (ELISA "Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay") oder durch Western blot-Analvse kontrollieren Polyklonale Anüseren, die bei der Western blot-Analyse gute Signale produzieren, sind für ein "Immunscreemng" von cDNA-Bibhotheken verwendbar
Besonders bevorzugt zur Bestimmung der Spezifitat des Anüserums gegen
Depsipepüde, insbesondere gegen PF 1022A-Deπvat ist die Western blot-Analyse
Dabei werden die Carπer-Hapten-Komplexe, insbesondere der KLH-PF 1022A- Deπvat-Komplex und das Carπer-Protein KLH oder der BSA-PF 1022A-Deπvat- Komplex und das Carπer-Protein BSA in einem SDS-PAGE (SDS-Polyacryl- amidgel) aufgetrennt (vgl Laemmli et al , Nature 227, 1970, S 680-685) und die erhaltenen Proteine anschließend auf Nitrozellulose geblottet Alternativ werden die Carπer-Hapten-Komplexe bzw die C am er-P roteine auch mittels einer "Mini- fold S" Apparatur (Schleicher & Schuell, Dassel) direkt auf Nitrozellulose-Filter geblottet Die Inkubation der Filter mit geeigneten Serumverdunnungen, bevorzugt im Verhältnis 1 1 000, ganz besonders bevorzugt im Verhältnis 1 500, fuhrt zu einer deutlich stärkeren Nachweisreaktion mit den erfindungsgemaßen Carπer- Hapten-Komplexen als mit den Carrier-Proteinen KLH oder BSA (Verwendung von alkalischer NBT/BCIP-Losung, vgl Herstellungsbeispiele)
Die auf diese Weise erhaltenen spezifischen, polyklonalen Antikörper werden dann in immunologischen Verfahren, wie beispielsweise dem erfindungsgemaßen
"Immunscreening", zur Isolierung und Charakterisierung von cDNA-Sequenzen eingesetzt, die für Proteine kodieren, die in verschiedenartigen Nematodenspezies vorkommen und für die Bindung von cyclischen oder offenketügen Depsipeptiden als Liganden, bestehend aus Aminosäuren und Hydroxycarbonsauren als Bausteine, insbesondere des cyclischen Depsipeptids PF 1022A, verantwortlich sind
Darüber hinaus ist selbstverständlich der Einsatz der erfindungsgemaßen Antikörper in allen bekannten Immunoassays, wie z B immunoradiometπschen Tests nach Markierung des Traceranü korpers mit Chloramin T oder Bolton-Hunter-Rea- genz, sowie anderen kompeteüven und nicht-kompeteüven Bindungsassays, wie Fluoreszenz-, Enzym- (ELISA), Chemilumineszenz- oder anderen Immunoassays, einschließlich allen Formen des Radioimmunoassays (RIA) denkbar (Harlow, E Lane, d (1988) Antibodies A Laboratory Manual, CSH, 2nd Edn , New York, 319 bis 359, 353 bis 612) Dabei ist es unerheblich, ob der Schichtanükorper an
Polystyrolrohrchen, Polystyrolkugelchen, paramagnetische Partikel oder aktivierte S au lenmateπ allen aller Art kovalent oder nicht-kovalent gebunden ist
Im Rahmen der Erfindung werden zur Konstruktion einer statistisch, leprasen- taüven cDNA-Bibhothek polyadenylierte RNA-Fraküonen, die aus parasitären Nematoden nach der vo Chirgwin et al beschriebenen Guamdinium-Isothiocya- nat/Casiumchloπd-Kissen Methode (vgl Biochemistry 18, 1979, S 5294 bis 5299) isolierbar sind, für die cDNA-Synthese verwendet
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt zur Konstruktion einer statistisch repräsentativen cDNA-Bibhothek polyadenylierte RNA-Fraküonen aus parasitären Nematoden der Ordnung der Strongylida, insbesondere Haemonchus spp oder Tπchostrongylus spp , für die cDNA-Synthese verwendet
Die Synthese erfolgt entsprechend den bekannten Methoden des "Great Length cDNA Synthesis Kit" von Clontech (Heidelberg)
Die Erststrangsynthese wird mit geeigneten Pπmern, insbesondere einem 01ιgo(dT)25(dN) Primer, durchgeführt EcoRI Adaptoren werden an die doppelstrangige cDNA ligiert und cDNA-Molekule > 500 bp über Chromaspin- Saulen (Clontech) fraktioniert
Nach Ligation der cDNA in die EcoRI-Schnittstelle des Vektors λZAJPII (Stra- tagene, Heidelberg) werden die Konstrukte in vitro verpackt (Gigapack Gold II, Stratagene) In einer spezifischen Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung werden die weiter oben erhaltenen Anüseren gegen die Carπer-Hapten-Komplexe, insbesondere aber der KLH-PF 1022A-Deπvat-Komplex, nun im "Immunscreening" eingesetzt
Dazu werden nach Entfernung der Anü-E coli Antikörper aus den genannten
Anüseren durch Inkubation mit Filter-gebundenem E coli Lysat, ca 5 000 "plaque forming units" (pfu) der Bibliothek pro Assay auf LB-Agar plattiert und so lange bei +37°C inkubiert bis Plaques sichtbar werden Anschließend erfolgt eine Expressionsinduktion der Fusionsproteine mittel s Induktor gesättigtem Nitrozellulosefilter
Vorzugweise verwendet man hierfür den Induktor Isopropyl-ß-thiogalakto-pyrano-
Figure imgf000016_0001
Nach einer weiteren Inkubationszeit von 1 bis 24 Stunden, bevorzugt von 4 bis 12 Stunden bei Temperaturen zwischen +40°C und +45°C, bevorzugt bei +42°C, werden die Filter mit den Carπer-Hapten-Komplexen, insbesondere dem KLH-PF
1022A-Komplex, inkubiert
Die Inkubationszeit mit den Carπer-Hapten-Komplexen, insbesondere dem KLH- PF 1022A-Komplex, betragt 1 bis 12 Stunden Die Inkubation erfolgt bei Temperaturen zwischen +5 und +45°C, bevorzugt jedoch bei Raumtemperatur Danach werden die Filter für 4 Stunden bei Raumtemperatur mit dem Antiserum inkubiert Das Antiserum liegt in einer Verdünnung von 1 200 bis 1 2 000, bevorzugt von 1 500 bis 1 1 000, vor
Im Anschluß an die Deteküon der gebundenen Antikörper, beispielsweise mit an alkalischer Phosphatase gekoppelten Anü-Kaninchen-Anükorpern und NBT/BCIP- Substratlosung, erfolgt die Abtrennung positiver Agarbereiche sowie eine Eluie- rung der Phagen
Die auf diese Weise erhaltenen Phagen werden einem "rescreening" unterworfen Die isolierten reinen Phagenklone können dann mittels in vivo Exzision zu Plasmidklonen konvertiert, und die Plasmid-DNA kann für weitere DNA-Analysen eingesetzt werden Beide Strange der erfindungsgemaßen cDNA werden mehrmals über automatische Laser-Fluoreszenz-Sequenzierung analysiert und die Sequenzdaten mit einer Software der Genetics Computer Group Ine (Madison, WI, USA) weiter untersucht
Auf diese Weise wurden erfindungsgemäß zwei klonierte cDNA's mit der
Bezeichnung pHC-1 bzw. pHC-2 erhalten.
Die in den Sequenzprotokollen ID No. 1 und 3 gezeigten erfindungsgemaßen Sequenzen enthalten jeweils einen "offenen Leserahmen" für ein Protein, das den Wirkstoff PF 1022A und andere Wirkstoffe mit ahnlichen immunulogischen Bindungseigenschaften erkennt.
Der erste klonierte cDNA mit der Bezeichnung pHC-2 weist 972 Basen der im Sequenzprotokoll ID No 1 gezeigten Sequenz auf
Der nicht-kodierende 5'-Abschnitt der erfindungsgemaßen pHC-2 cDNA besteht nur aus 10 Basen. Die durch Northern blot-Analyse bestimmte Große der kom- plementaren RNA (1,05 kb) stimmt sehr gut mit der Lange der cDNA überein
Für die pHC-2 cDNA Sequenz mit 972 Basen (vgl Sequenzprotokoll ID No 1 ) stellt die erste Nucleotidsequenz ATG an der Sequenzposition 1 1 das Startkodon dar. So ist beispielsweise diese Initiationsstelle der Translation vom Kozak-Typ (vgl. M Kozak, J. Cell Biol 108, 1989, S. 229) Darüber hinaus ist ein N- terminales Signalpeptid mit der Spaltstelle zwischen 18 und 19 detektierbar (vgl von Heinje, Nucleic Acids Research 14, 1986, S 4 683 bis 4 690).
Aus der Nucleotidsequenz der erfindungsgemaßen pHC-2 cDNA mit 972 Basen der im Sequenzprotokoll ID No. 1 gezeigten Sequenz des gastrointesünalen Nematoden Haemonchus contortus läßt sich die entsprechende Aminosauresequenz für das Protein ableiten. Das erfindungsgemaße erste Protein, das PF 1022A erkennt, ist dadurch gekennzeichnet, daß es eine Sequenz von 207 Aminosäuren mit einem daraus resultierenden Molekulargewicht von 23 991 g/mol aufweist (s Sequenzprotokoll ID No. 2).
Das erste erfindungsgemaße Protein ist ein integrales Membranprotein Es besitzt neben der Signalpeptidsequenz eine potentielle Transmembranregion (Position 174- 190) Eine Glycosylierungsstelle ist am Asparagin (Asn) der Position 167 lokali- sierbar Bevorzugt finden Glycosylierungen des erfindungsgemaßen Proteins an dieser Position 167 statt
Darüber hinaus lassen sich aus dem Aminosauresequenz Sequenzprotokoll ID No 2 des erfindungsgemaßen Targetproteins drei potentielle anügene Determinanten, im
Bereich der Abschnitte 69 bis 75, 157 bis 162 und 159 bis 164, ableiten
Diese Determinanten der Aminosauresequenz des erfindungsgemaßen Proteins sind bevorzugt zur Erzeugung monoklonaler Antikörper gegen das Protein von Bedeutung
Das erste erfindungsgemaße Protein, welches das Depsipepüd PF 1022A erkennt, zeigt Ähnlichkeiten zu verschiedenen Proteinen aus unterschiedlichen Organismen (Swiss-Prot Datenbank mit 43 470 Proteinsequenzen) 'Best Fit1 Analysen ergeben eine Identität von 28 % bzw eine Ähnlichkeit von 53 % zum 25 kDa Glyco- protein GP25L von Canis famihaπs (EMBL Accession Nr P27869) GP25L ist ein Teil eines heterotetrameren Ca~+-bιndenden Proteinkomplexes des Endoplasma- üschen Reükulums (ER) Dieser Komplex ist offenbar für die Retention von ER- residenten Proteinen von Bedeutung (Wada et al , J Biol Chem 266, 1991 , S
Figure imgf000018_0001
Der Xenopus laevis cDNA Klon X1262 (EMBL Accession Nr X90517) kodiert ebenfalls ein GP25L-ahnlιches Protein (Joost et al , Biochem J 3 12, 1995, S 205 bis 213), das eine Identität von 56 % bzw Ähnlichkeit von 73 % zum erfindungsgemaßen Targetprotein aufweist
Ein humanes EST ("expressed sequence tag" cDNA-Fragment, EMBL Accession Nr T32283) kodiert gleichfalls ein GP25L-ahnhches Ammosaurefragment, das eine Identität von 71 % bzw Ähnlichkeit von 83 % zum erfindungsgemaßen
Protein aufweist
Das Protein zeigt außerdem eine Identität von 24 % bzw eine Ähnlichkeit von 52 % zu dem 23 kDa Saccharomyces cerevisiae-Vorlauferprotein P24B (EMBL Accession Nr P32803) Dieses Protein ist wahrscheinlich am Transport von einigen sekretorischen Proteinen vom ER zum Golgi-Komplex beteiligt
(Schimmoller et al EMBO J 14, 1995 S 1 329 bis 1 339) Gemeinsamkeiten des GP25L-Vorlauferproteιns bzw GP25L-ahnlιchen Proteinen zum erfindungsgemaßen Protein sind die Signalsequenz für den Transport in das ER, die Transmembrandomane, eine N-Glykosylierungsstelle sowie eine ähnliche Molmasse
Durch Northern blot Analyse für die zum zweiten cDNA Klon pHC- 1 korrespondierende mRNA wurde eine Große von ca 3,5 kb ermittelt Der über das Immunscreening isolierte Klon pHC- 1 weist eine Große von 2 kb auf Der noch fehlende 5'-Bereιch der mRNA wurde mittels der 5'-RACE Methodik isoliert [M A Frohmann (1990) PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (M A Innis, D H Gelfand, J J Sninsky & T J White eds ) S 28-38, Academic Press,
San Diego, USA] Die so aus mehreren cDNA-Fragmenten charakterisierte mRNA setzt sich aus 3 539 Basen der im Sequenzprotokoll ID No 3 gezeigten Sequenz zusammen
Der 5 '-nicht translaüerte Abschnitt der mRNA (vgl Sequenzprotokoll ID No 3) umfaßt 98 Basen Es kann sein, daß noch einige Basen des 5'-Endes der mRNA fehlen Der 3'-nιcht translaüerte Abschnitt (ohne poly(A)-taιl) besteht aus 462 Basen Das wahrscheinliche Startkodon vom Kozak-Typ liegt an Sequenzposition 99, obwohl strangaufwarts noch zwei weitere ATG-Kodons liegen Diese scheiden aber als Imüaüonsstelle der Translation aus folgenden Gründen aus Das ATG an Sequenzposition 22 ist nicht vom Kozak-Typ und die von dieser Position deduzierte Aminosauresequenz bricht bereits mit einem TAA-Stop an Position 55 ab Das ATG an Sequenzposition 75 ist ebenfalls nicht vom Kozak-Typ und die von dieser Position deduzierte Aminosauresequenz bricht mit einem TAA-Stop bereits an Position 90 ab Ausgehend vom Startkodon ab Position 99 ist das zweite erfindungsgemaße Targetprotein, das PF 1022A erkennt, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Sequenz aus 986 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 109 740 g/mol aufweist (s Sequenzprotokoll ID No 4) Zudem zeigt das erfindungsgemaße Protein einen pl von 6 13
Das zweite erfindungsgemaße Protein ist ebenfalls ein integrales Membranprotein Es besitzt neben einem aminoterminalen Signalpepüd (Spaltstelle zwischen den
Aminosäuren 18 und 19) fünf Transmembrandomanen (Aminosaureabschnitte 531 bis 562, 595 bis 615, 673 bis 700, 725 bis 744 und 750 bis 774) Potentielle N- Glykosylierungsstellen sind jeweils am Asparagin (Asn) in Position 26, in Position 499 sowie in Position 862 lokahsierbar Darüber hinaus lassen sich aus der Aminosauresequenz Sequenzprotokoll ID No 4 des zweiten erfindungsgemaßen Targetproteins drei potentielle anügene Determinanten im Bereich der Aminosaureabschnitte 1 0 bis 156, 428 bis 434 und 799 bis 804 ableiten Diese Determinanten der Aminosauresequenz des zweiten erfin- dungsgemaßen Proteins sind bevorzugt zur Erzeugung monoklonaler Antikörper gegen das Protein von Bedeutung
Besonders auffallig ist im aminoterminalen Bereich ein Abschnitt aus 20 Threonin (Thr)-Resten, der von einem Senn (Ser)-Rest unterbrochen ist (Aminosaureposition 128 bis 147), der carboxvterminale Teil des erfindungsgemaßen Proteins enthalt auffallig viele Prolin (Pro)-Reste (Position 915 bis 926 extrem Prolinreicher
Abschnitt) Das erfindungsgemaße Targetprotein weist allerdings keinen auffallig hohen Prolingehalt auf Prohnreiche Abschnitte können Targets' für Protein- Protein Wechselwirkungen sein oder als ' Spacer' zwischen funktionalen Domänen fungieren (siehe z B Yu et al , Cell Vol 78, 1994, S 933-945, Linial, Neuro- report Vol 5, 1994, S 2009-2015)
Der cDNA-Abschnitt. der für das zweite erfindungsgemaße Protein kodiert, zeigte beim Screening der EMBL-Datenbank zwischen den Basen 1790 bis 2460, der im Sequenzprotokoll ID No 4 gezeigten Sequenz, eine 60%ιge Homologie zu einem Genomabschnitt des freilebenden Nematoden C elegans (Accession-Nr Z54306, Wilson et al , Nature Vol 368, 1994, S 32-38)
Der ahnliche C elegans Genomabschnitt ist ein Exon eines Gens, dessen deduziertes Genprodukt ähnlich zu G-Protein gekoppelten Rezeptoren sein soll Weitere Informationen über dieses Gen bzw Genprodukt existieren nicht, da die veröffentlichte Sequenz Produkt des C elegans Genomproiektes ist (vgl Wilson et al , Nature Vol 368, 1994, S 32-38) Die 'Best Fit' Analyse zeigt eine 49 %ιge Identität bzw 65 %ιge Ähnlichkeit dieses deduzierten Proteins zu dem H contortus Genprodukt Auch das C elegans Protein besitzt in der aminoterminalen Region einen Threonin (Thr)- Ab schnitt aus 15 Resten, der ebenfalls von einem Senn (Ser)-Rest unterbrochen wird
Die Best Fit' Analyse des zweiten erfindungsgemaßen Proteins im Vergleich zu verschiedenen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zeigt folgendes Ergebnis Zum Vorlauferprotein des Calcitonin Rezeptors des Schweins (SwissProt-Accession-Nr P251 17) besteht eine Identität von 22 % bzw Ähnlichkeit von 44 %, zum Gastrin/ Cholecvstokinin Typ B Rezeptor der Ratte ( Λ.ccessιon-Nr P30553) besteht eine Identität von 20 % bzw eine Ähnlichkeit von 45 % und zum Neuromedin K Rezeptor der Ratte (Accession-Nr P16177) besteht 18 % Identität bzw 46 % Ähnlichkeit
Weitere Proteine, die Threonin (Thr)-reιche Abschnitte aufweisen (aus der SwissProt-Datenbank), z B Integument Mucin aus Xenopus laevis (Accession-Nr
P10667, Q05049), Fascichn II aus Drosophila me/anogastei (P34083), intestinale alkalische Phosphatase aus der Maus (P24822) oder das Speichelprotein SGS-3 aus Drosophila melanogastei (P13729) zeigen - abgesehen vom gemeinsamen Threonin (Thr)-Abschnιtt - keine weiteren signifikanten Ähnlichkeiten zum erfin- dungsgemaßen Protein
Die beiden erfindungsgemaßen Proteine (vgl Sequenzprotokolle ID No 2 und 4) können als neue Prototypen von spezifischen Proteinen parasitärer Nematoden, insbesondere in Nematoden aus der Ordnung der Strongylida, wie beispielsweise Haemonchus spp , angesehen werden
Mit Hilfe der erfindungsgemaßen cDNA-Sequenzen (vgl Sequenzprotokolle ID
No 1 und 3) ist es beispielsweise möglich, Zellinien herzustellen, die die jeweiligen erfindungsgemaßen Proteine permanent expπmieren Hierzu werden mit an sich bekannten gentechnologischen Methoden die für diese Proteine kodierenden cDNA-Sequenzen (eweils in einen gegeigneten Vektor eingebaut, mit dem eine geeignete Zellinie, die das jeweilige Protein bisher nicht expπmierte, transformiert wird Dadurch können Zellinien erhalten werden, die das jeweilig erste oder zweite erfindungsgemaße Protein (vgl Sequenzprotokolle ID No 2 und 4) konstant expπ- mieren
So können die erfindungsgemaßen Proteine durch Expression in einem prokaryo- tischen oder eukaryoüschen Expressionssystem in an sich bekannter Weise gewonnen werden
Geeignete prokaryoüsche Expressionssysteme sind dabei alle bekannten Wirts- Vektor-Systeme wie Bakterien der Arten Streptomyces, srjp_ Bacillus subülis, Salmonella typhimuπum oder Serraüa marcescens. insbesondere E coli. in denen die Expression einer unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors stehenden rekombinanten DNA möglich ist Als Promotoren für eine Expression in E coli kommen naturliche, Hybrid- oder Bakteπophagenpromotoren in Betracht Bevorzugt verwendet man hierbei Promotoren oder Operatoren aus der Gruppe lac-, lacuv5-, trp-, tac-, trc-, rac-, phoA-, j oder PR des Phagen λ, hsp, omp oder synthetische Promotoren, wie sie beispielswei se in der DE-OS 3 430 683 bzw i n der EP-A 0 1 73 149 vorgeschlagen sind Vorteilhaft ist z B die tac-Promotor-Operator-Sequenz, die inzwischen handelsüblich ist (z B Expressionsvektor pKK223-3, Pharmacia, "Molecular Biologicals, Chemicals and Equipment for Molecular Biology", 1984, S 63)
Als geeignetes eukaryoüsches Expressionssystem ist insbesondere das Baculo- vi russy stem zu nennen
Vorzugsweise verwendet man zur Expression der erfindungsgemaßen Proteine ein geeignetes eukaryotisches Expressionssystem, insbesondere das Baculovirussystem, bei dem post-translationale Modifikationen durchgeführt werden
Bei der Expression der erfindungsgemaßen Proteine kann es sich als zweckmäßig erweisen, einzelne Kodons zu verandern Dabei ist der gezielte Austausch von Basen in der kodierenden Region auch sinnvoll, wenn die genutzten Kodons in den Proteinen abweichend sind von der Kodonnutzung im heterologen Expressionssystem, um eine optimale Synthese des Proteins zu gewährleisten Zudem sind oft Deletionen von nicht-translatierten 5'- bzw 3 '-Abschnitten sinnvoll, beispielsweise wenn mehrere destabilisierende Sequenzmotive ATTTA im 3'-Bereich der cDNA vorliegen Dann sollten diese bei der bevorzugten Expression in Eukaryonten deletiert werden
Veränderungen dieser Art sind Deletionen, Additionen oder Austausch von Basen und ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung
Mit den erfindungsgemaßen spezifischen Antikörpern gegen die Proteine können beispielsweise durch Western blot-Analysen homologe bzw kreuzreagierende Proteine anderer, parasitärer Nematoden, detektiert werden
Mit Hilfe der erfindungsgemaßen Proteine und ihrer Homologen können neue spezifische Wirkstoffe gegen Nematoden gefunden werden Insbesondere kann das erfindungsgemaße Protein aufgrund der potentiellen Rezeptoreigenschaften zur Bindung von offenketügen oder cyclischen Depsipeptiden als Liganden, bestehend aus Aminosäuren und Hydroxycarbonsauren als Bausteine, in geeigneten Testkits zum Screening auf nemaüzide Wirkung dieser Verbindungen verwendet werden
Die Wirkstoffe, die mit Hilfe der erfindungsgemaßen Proteine gefunden werden, eignen sich bei gunstiger Warmblutertoxizitat zur Bekämpfung von pathogenen Endoparasiten, die bei Menschen und in der Tierhaltung und Tierzucht bei Nutz-, Zucht-, Zoo-, Labor-, Versuchs- und Hobbytieren vorkommen Sie sind dabei gegen alle oder einzelne Entwicklungsstadien der Schädlinge sowie gegen resistente und normal sensible Arten wirksam Durch die Bekämpfung der pathogenen Endoparasiten sollen Krankheit, Todesfalle und Leistungsminderungen (z B bei der Produktion von Fleisch, Milch, Wolle, Hauten, Eiern usw ) vermindert werden, so daß durch den Einsatz der Wirkstoffe eine wirtschaftlichere und ein- fächere Tierhaltung möglich ist Zu den pathogenen Endoparasiten zahlen
Nematoden Ganz besonders genannt seien
Aus der Ordnung der Enophda z B Tπchuπs spp , Capillaπa spp , Tπ- chomosoides spp , Tπchinella spp
Aus der Ordnung der Rhabdiüa z B Micronema spp , Strongyloides spp
Aus der Ordnung der Strongylida z B Strongylus spp , Tπodontophorus spp ,
Oesophagodontus spp , Tπchonema spp , Gyalocephalus spp , Cyhndropharynx spp , Poteπostomum spp , Cyclococercus spp , Cyhcostephanus spp , Oesopha- gostomum spp , Chabertia spp , Stephanurus spp , Ancylostoma spp , Uncinaπa spp , Bunostomum spp , Globocephalus spp , Syngamus spp , Cyathostoma spp , Metastrongylus spp , Dictyocaulus spp , Muelleπus spp , Protostrongylus spp ,
Neostrongylus spp , Cystocaulus spp , Pneumostrongylus spp , Spicocaulus spp , Elaphostrongylus spp , Parelaphostrongylus spp , Crenosoma spp , Paracrenosoma spp , Angiostrongylus spp , Aelurostrongylus spp , Filaroides spp , Parafilaroides spp , Tπchostrongylus spp , Haemonchus spp , Ostertagia spp , Marshallagia spp , Coopeπa spp , Nematodirus spp , Hyostrongylus spp , Obehscoides spp ,
Amidostomum spp , Ollulanus spp Aus der Ordnung der Oxyuπda z B Oxyuris spp , Enterobius spp , Passalurus spp , Syphacia spp , Aspiculuπs spp , Heterakis spp
Aus der Ordnung der Ascaπdia z B Ascaπs spp , Toxascaπs spp , Toxocara spp , Parascaπs spp , Anisakis spp , Ascaπdia spp
Aus der Ordnung der Spiruπda z B Gnathostoma spp , Physaloptera spp ,
Thelazia spp , Gongylonema spp , Habronema spp , Parabronema spp , Draschia spp , Dracunculus spp
Aus der Ordnung der Filaruda z B Stephanofilaπa spp , Parafilaπa spp , Setaria spp , Loa spp , Dirofilaπa spp , Litomosoides spp , Brugia spp , Wuchereria spp , Onchocerca spp
Aus der Ordnung der Gigantorhynchida z B Filicollis spp , Moniliformis spp , Macracanthorhynchus spp , Prosthenorchis spp
Zu den Nutz- und Zuchttieren gehören Saugetiere wie z B Rinder Pferde, Schafe, Schweine, Ziegen, Kamele, Wasserbüffel, Esel, Kaninchen, Damwild, Rentiere, Pelztiere wie z B Nerze, Chinchilla, Waschbar, Vogel wie z B Huhner, Gänse,
Puten, Enten, Suß- und Salzwasserfische wie z B Forellen, Karpfen und Aale
Zu Labor- und Vei suchstieren gehören Mause Ratten, Meerschweinchen Goldhamster, Hunde und Katzen
Zu den Hobbytieren gehören Hunde und Katzen
Die Anwendung kann sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch erfolgen
Die Anwendung der Wirkstoffe erfolgt direkt oder in Form von geeigneten Zubereitungen enteral, parenteral, dermal oder nasal
Weiterhin können mit Hilfe der erfindungsgemaßen Proteine auch Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, hergestellt werden, die nemaüzide Wirkung besitzen und als nemaüzide Wirkstoffe eingesetzt werden können Insbesondere können die drei anügenen Determinanten des eisten erfindungsgemaßen Proteins (ID-No 2), die Abschnitte 69 bis 75, 157 bis 162 und 1 59 bis 164 für die Erzeugung monoklonaler Antikörper dienen
Weiterhin können insbesondere die drei anügenen Determinanten des erfindungsgemaßen Proteins (ID-No 4), die Abschnitte 150 bis 156, 428 bis 434 und 799 bis 804 für die Erzeugung monoklonaler Antikörper dienen
Beispiel 1
Herstellung der KLH-PF 1022A- und BSA-PF 1022A-Denvat-K.oniu.rate
200 mg Cyclo-(MeLeu-D-4-NH2-PhLac-MeLeu-D-Lac-MeLeu-D-4-NH2-PhLac- MeLeu-D-Lac-) werden in 4,39 ml eiskalter 0,1 N Salzsaure gelost und bei 0°C mit 3,27 ml einer 0,05 M Natriumnitritlosung versetzt Ebenfalls bei 0°C wird eine Losung aus 200 mg BSA oder KLH mit 91,5 mg NaCl in 10 ml 0,5 M Natronlauge zugetropft Man rührt noch zwei Stunden bei 0°C nach und neutralisiert mit konzentrierter Salzsaure Anschließend wird dialysiert und lyophilisiert Danach wird der Ruckstand in Wasser aufgenommen, mit Methylenchloπd gewaschen Nach Abtrennung der wassngen Phase wird erneut lyophilisiert Die zumeist pulverigen KLH-PF 1022A-Deπvat- und BSA-PF 1022A-Deπvat-Konjugate lassen sich ohne weitere Reinigung für die nachfolgenden Immunisierungsversuche verwenden
Beispiel 2
Herstellung von Antiserum »egen PF 1022A
Die KLH-PF 1022A-Deπvat- und BSA-PF 1022A-Deπvat-Konjugate (Komplexe) wurden zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt (3 Tiere pro Carπer-Hapten- Komplex) Die ersten Boost-Immunisierungen erfolgte 14 Tage nach der Ersüm- munisierung Im Abstand von jeweils 4 Wochen wurden insgesamt 10 weitere Boost-Immunisierungen durchgeführt Ab der dritten Boost-Immunisierung wurde jeweils nach 10 Tagen ca 20 ml Blut für die Serumgewinnung entnommen 24 Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Tiere komplett ausgeblutet
Die Spezifitat des Anüserums gegen das PF 1022A-Deπvat wurde durch Western blot-Analyse überprüft Der KLH-PF 1022A-Deπvat-Komplex sowie das Carπer- Protein KLH wurden über eine "slot blot" Apparatur (Minifold S, Schleicher &
Schuell, Dassel) in gleichen Mengen (20 μg pro "slot") an Nitrozellulosefilter gebunden Die Filter wurden mit einer 1 500 Verdünnung des Anüserums für vier Stunden bei Raumtemperatur inkubiert Der Nachweis der gebundenen Antikörper erfolgte mit alkalischer Phosphatase-konjugierten Anti-Kaninchen-Antikorpern (Sigma, Deisenhofen) und einer alkalischen Nιtroblautetrazolιum/5-Bromo-l- chloro-3-ιndolylphosphat-Substratlosung (NBT/BCIP) Der KLH-PF 1022A-Kom- plex reagierte deutlich starker mit dem Antiserum als KLH
Beispiel 3
Identifizierung und Charakterisierung der cDNA
a) Konstruktion der cDNA-Bibhothek
Die Extraktion der totalen RNA des gastrointesünalen Nematoden Haemonchus contortus erfolgte nach der von Chirgwin et al beschriebenen Guani- dinium-Isothiocyanat/Casiumchloπd-Kissen Methode (Biochemistry 18, 1979, S 5 294 bis 5 299) Die polyadenylierte RNA-Fraküon wurde an- schließend über Olιgo(dT)-Chromatographιe gereinigt (Aviv & Leder, Proc
Natl Acad Sei , USA, 69, 1972, S 1 408 bis 1 412)
Zur Konstruktion einer statistisch repräsentativen cDNA-Bibhothek wurden 5 μg der polyadenylierten RNA-Fraküon für die cDNA-Synthese eingesetzt Die Synthese folgte den Vorschriften des "Great Lenght cDNA Syn- thesis Kit" von Clontech (Heidelberg) Die Erststrangsynthese wurde mit einem Olιgo(dT),5 (dN) Pπmer durchgeführt EcoRI Adaptoren wurden an die doppelstrangige cDNA li giert und cDNA-Molekule > 500 bp über Chromaspin-Saulen (Clontech) fraktioniert Nach Ligaüon der cDNA in die EcoRI-Schnittstelle des Vektors λZAPII (Stratagene Heidelberg) wurden die Konstrukte in vitro verpackt (Gigapack Gold II, Stratagene)
b) Immunscreening der cDNA-Bibhothek
Das Antiserum gegen den KLH-PF 1022A-Deπvat-Komplex wurde für das Immunscreening verwendet Um die Anü-E coli Antikörper aus dem Antiserum zu entfernen, wurde 1 100 verdünntes Antiserum für vier Stunden bei Raumtemperatur mit Filter-gebundenem E coli Lysat inkubiert Ca
5 000 "plaque forming units" (pfu) der Bibliothek wurden pro Assay auf LB-Agar plattiert und so lange bei 37°C inkubiert, bis Plaques sichtbar wurden Es wurde dann ein mit Isopropyl-ß-thiogalakto-pyranosid gesättigter Nitrocellulosefilter auf die Platte gelegt, um die Expression der Fusions- proteine zu induzieren Nach einer Inkubationszeit von vier bis 12 Stunden bei 42°C wurde der Filter wiedei entfernt und mit dem KLH-PF 1022A- Konjugat (20 mg/ml) für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur mku- biert Danach wurden die Filter mit Antiserum (1 500 bis 1 1 000 Verdun- nung) für vier Stunden bei Raumtemperatur inkubiert Gebundene Antikörper wurden mit alkalischer Phosphatase konjugierten Anü-Kaninchen-Anü- korpern und NBT/BCIP-Substratlosung deteküert
Positive Agarbereiche wurden ausgestochen (20 bis 30 verschiedene Plaques) und die eluierten Phagen wurden einem "rescreening" unterwor- fen Die letztlich isolierten reinen Phagenklone wurden mittels in vitro
Excision zu Plasmidklonen konvertiert und die Plasmid-DNA für weitere Analysen eingesetzt
c) DNA-Analyse
Die Analyse des Klons erfolgte über automatisierte Laser-Fluoreszenz- Sequenzierung (A L F -DNA Sequencer, Pharmacia Freiburg, bzw Licor
4000, MWG, Ebersberg) unter Verwendung des "Auto Read Sequencing" System (Pharmacia) bzw des "Thermo-Sequenase Fluorescence" Sequen- zierungskit (Amersham, Braunschweig) Beide Strange der erfindungsgemaßen cDNA wurden mehrmals sequenziert Sequenzdaten wurden mit der GCG Software (Geneücs Computer Group Ine , Madison, WI, USA) analysiert Es erfolgte die Benutzung der Protein- bzw DNA-Bibliotheken der EMBL (Heidelberg)
d) Glyoxal-denatuπerte poly-A -RNA ( 10 μg/Spur) wurde in Agarosegelen aufgetrennt und auf eine Hybond-N-Membran (Amersham, Braunschweig) transferiert (Chomczynski, Anal Biochem 201, 1992, S 134 bis 139) Die
Hybridisierung des Filters erfolgte über Nacht bei 65°C in 6 x SSC, 5 x Denhardt's Reagenz mit radioaktiv markierter Plasmid-DNA ("random pπming" mit 50 μCi [α-j2P]dCTP) Die Membranen wurden anschließend unter hoher Stπngenz in 0,2 x SSC, 0,5 % SDS bei 65°C gewaschen (Sambrock et al , Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989) Mit Hilfe der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Techniken konnten zwei mRNA-Spezies aus Nematoden kloniert und vollständig sequenziert werden (vgl Sequenzprotokolle ID No 1 und 3, Anhang)
Die erste klonierte cDNA mit der Bezeichnung pHC-2 umfaßt 972 Basen und kodiert für ein Protein mit 207 Aminosäuren (vgl Sequenzprotokoll ID No 2)
Die aus mehreren cDNA-Fragmenten (pHC-1) charakterisierte zweite mRNA setzt sich aus 3 539 Basen zusammen und kodiert für ein Protein mit 986 Aminosäuren (vgl Sequenzprotokoll ID No 4)
Im folgenden Sequenzprotokoll zeigt
Seq ID No 1 die Nucleotidsequenz der erfindungsgemaßen cDNA (pHC-2) aus dem gastrointesünalen Nematoden Haemonchus contortus Die dargestellte cDNA umfaßt 972 Basen, die für 207 Aminosäuren des Proteins gemäß Seq ID No 2 kodieren Start für die Kodierung von Protein ID No 2 ist die Position 1 1
Seq ID No 2 die aus der Nucleotidsequenz Seq ID No 1 abgeleitete Amino- sauresequenz des ersten Proteins aus dem gastrointesünalen Nematoden
Haemonchus contortus In dieser Sequenz liegen auf den Positionen
a) 1-18 NH2-termιnales Signalpepüd, Spaltstelle zwischen Aminosäuren 18 und 19, b) 174-190 eine Transmembranregion, c) 69-75 eine anügene Determinante, d) 157-162 eine anügene Determinante, e) 159-164 eine anügene Determinante, f) 167 eine Stelle für N-Glycosyherungen
Seq ID No 3 die Nucleotidsequenz der erfindungsgemaßen cDNA (pHC- 1) aus dem gastrointesünalen Nematoden Haemonchus contortus Die aus mehreren cDNAs charakterisierte mRNA besteht aus 3 539 Basen, die für 986 Aminosäuren des Proteins gemäß Seq ID No 4 kodieren Start für die Kodierung von Protein ID No 4 ist die Position 99 Seq ID No 4 die aus dei Nucleoüdsequenz Seq ID No 3 abgeleitete Aminosauresequenz des zweiten Proteins aus dem gastrointestinalen Nematoden Haemonchus confortu s In dieser Sequenz liegen auf den Positionen
a) 1-18 NH,-termιnales Signalpepüd, Spaltstelle zwischen Aminosäuren 18 und 19, b) 531 -562 erste Transmembrandomane, c) 595-615 zweite Transmembrandomane, d) 673-700 dritte Transmembrandomane, e) 725-744 vierte Transmembrandomane, f) 750-774 fünfte Transmembrandomane, g) 26 eine Stelle für N-Glycosylierungen, h) 499 eine Stelle für N-Glycosylierungen,
I) 862 eine Stelle für N-Glycosylierungen, j) 150-156 eine anügene Determinante, k) 428-434 eine antigene Determinante,
1) 799-804 eine antigene Determinante
Abbildung 1 zeigt die Nucleotidsequenz aus Seq ID 1 und zugeordnet die Aminosäuren des Proteins aus Seq ID 2
Abbildung 2 zeigt die Nucleotidsequenz aus Seq ID 3 und zugeordnet die Aminosäuren des Proteins aus Seq ID 4
SEQUENCE LISTING
i) GENERAL INFORMATION:
(l) APPLICANT:
(A) NAME: BAYER AG
(B) STREET: BAYERWERK
(C) CITY: LEVERKUSEN
(E) COUNTRY: GERMANY
(F) POSTAL CODE (ZIP): D- 51368
(G) TELEPHONE: 0214/ 30 61285 (H) TELEFAX: 0214/ 30 3482
(ii) TITLE OF INVENTION: Proteine, dafuer kodierende DNA- Sequenzen, dagegen spezifische Ant koerper und ihre Verwendung zum Auffinden nematizider Wirkstoffe
(m) NUMBER OF SEQUENCES : 4
(iv) COMPUTER READABLE FORM:
(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:
( ) SEQUENCE CHARACTERISTICΞ :
(A) LENGTH: 972 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: Single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) ( li) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Haemonchus contortus
(vil) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: pHC-2 cDNA- Klon
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1: GTTTTTCACA ATGAGGTTCA TCACCTCATT GACGCTCCTG GCTTTGGTGA CGATCACCTG 60 CGGTATTCGT TTCCACGTAC CCGCGAATAA TAAGAAATGT ATGAAAGAAG AAATTCATAA 120 AAATATCGTT GTCACCGGTG AATACGAGTT CAGCGAAGGA ATCGGCTATA CAGGCAGTGT 180
CCATGTGACA GACACACGAG GACATACGCT GTACAAACGG GAGAAGTTCA GCGATTTGAA 240
GGGGAAGTTC GCTTTCACAG CTGATGAGTA CGACATTTTC GAAATCTGCA TCAGTAATCA 300
TGCTCCTATT ACGACAGGTC ATGTACAACC CCGAGAAGTA TCGTTGAAGA TGAAACATGG 360
AGTCGAAGCG AAGAACTACG AAGATCTCGC CAAAGCAGAG CAGCTGAAGC CGCTTGAGGT 420
CGAATTGCGA CGTCTAGAAG ATCTGTCTGA TCAGATTGTG AAGGATTTCG CCTTCATGCG 480
ACAGCGAGAA GAGGAAATGA GAAACACAAA CGAGTCCACA AACAGCCGTG TATTATACCT 540
ATCAATTTTC TCTATGCTTT GTCTTCTGGC CTTGGCTATA TGGCAGGTGA TGTTCTTGCG 600
CAATTATTTC AAGGCAAAGA AGCTCATTGA CTGAGCAGCT AGTCGGATTA GGTAGAAACG 660
CGTGATTTTT TCCTTGATTT ATGAAGTTAA TTTTTCTGGG TGACTGCCAT TCTTGTCTCA 720
AAGTTCCCGA AAATCGACTA GACTGTGGTT ATCTATGGCA CTACGTGTGA TACGCTAACC 780
TTTTCTCTTT TTTAATGCGA GTCACCTGAA TTTTGGCTAA ATCTAGATGT GATGTTGCTG 840
ACTAATCTTG TTTGTACTCC GTAATGATGA TGTGGGTAAC ATGGTTTAAG CTACCTTGTA 900
CTTATTATTT ATTGTTGATG AATTCGTTAT AATAAATTTG TTTCTTCCAA AAAAAAAAAA 960
AAAAAAAAAA AA 972 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:
(l) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 207 amino aciαs
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS:
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(lll) HYPOTHETICAL: NO
( v) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Haemonchus contortus (C) INDIVIDUAL ISOLATE: PHC 2-Protem
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:
Met Arg Phe Ile Thr Ser Leu Thr Leu Leu Ala Leu Val Thr Ile Thr 1 5 10 15 Cys Gly Ile Arg Phe His Val Pro Ala Asn Asn Lys Lys Cys Met Lys 20 25 30
Glu Glu Ile His Lys Asn Ile Val Val Thr Gly Glu Tyr Glu Phe Ser 35 40 45
Glu Gly Ile Gly Tyr Thr Gly Ser Val His Val Thr Asp Thr Arg Gly 50 55 60
His Thr Leu Tyr Lys Arg Glu Lys Phe Ser Asp Leu Lys Gly Lys Phe 65 70 75 80
Ala Phe Thr Ala Asp Glu Tyr Asp Ile Phe Glu Ile Cys Ile Ser Asn 85 90 95
His Ala Pro Ile Thr Thr Gly His Val Gin Pro Arg Glu Val Ser Leu 100 105 110
Lys Met Lys His Gly Val Glu Ala Lys Asn Tyr Glu Asp Leu Ala Lys 115 120 125
Ala Glu Gin Leu Lys Pro Leu Glu Val Glu Leu Arg Arg Leu Glu Asp 130 135 140
Leu Ser Asp Gin Ile Val Lys Asp Phe Ala Phe Met Arg Gin Arg Glu 145 150 155 160
Glu Glu Met Arg Asn Thr Asn Glu Ser Thr Asn Ser Arg Val Leu Tyr 165 170 175
Leu Ser Ile Phe Ser Met Leu Cys Leu Leu Ala Leu Ala Ile Trp Gin 180 185 190
Val Met Phe Leu Arg Asn Tyr Phe Lys Ala Lys Lys Leu Ile Asp 195 200 205 INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:
(l) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 3539 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: smgle
(D) TOPOLOGY: linear
(11) MOLECULE TYPE: cDNA (lll) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Haemonchus contortus
(vn) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: PHC-l(full) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:
TTCTGGCCGT CATCGCCGTT GATGCTGTCG CTTTCAGAAC GTCTCTTCTA TTACTAATTC 60
GAAAATTGAC GTGAATGAGC AGTTCGGTTT AATACCAACA TGAGGAATGT ATATATTCTT 120
CTGCTATCCG TCGTTGGGAC GTTTACCGTC GCAGAAGAAT TGCCAGCTCA ATCAAACAGT 180
TCCATTGTAG TATGCGAAGG TGGTACAGCC GAATTGGAAT GTCCCCATGG TATGGTCATT 240
TCAATAGCTC TGGCAAATTA TGGCCGATAT TCGGCTCGGG TTTGCTACGA GAACGAGGAA 300
CTGGACGATG TGGTACCGAT GACTCAATGC CATAACCCTA AAACGATGCC GACCCTTAGG 360
AAAAGTTGTG ATGGACGTCG TGAATGTCAT TTTGTGGTTG GTAACGACTT CTTCGTACAT 420
GATCCATGCC CAGGAGTGAA GAAATACCTT GAAGTCACAT ATCTGTGTGT TGCTGATGTG 480
ACTACCACAA CAACCACTAC GACGACGACC ACCACCACTA CCACTACATC CACCACAACA 540
GAGGTGGAGG ATGATGTTAA AGAAGATATG AGCGCGAAAT CTGCACCATC GACGTGTGCA 600
GCGACTTCGA GAAGAGGAAT CGAATGGCCT GCGACCATTT CTGGGACGAC GGTGAACCGG 660
CCATGTCCCG AAGGCACGAG AGGCACGTCC TCATGGAAAT GTTCCGCCGA GGGGCTGTGG 720
TCTGAACCTG GTCCAAATAC AATAGAGTGT CGCAGTGATT GGACCATTCA GCGGCAGGAT 780
GCTCTTGAAG AGACGATAAA AGATCAGGAT GCAAGCGGAA TTCCGGAGCT TCTTCGAGCG 840
ATGACGTCTG ATACCCGAAG ACCTATGGTA GCTGGTGATT TGCCAAAACT TCTAAACATT 900
CTTGACATCG TTCAAGATGT TGTTGGCAGA GAAGTGTGGG CAAAAAGTAG CCAGAAGTTG 960
GTGAACCAGC TTATTGTGAA TGTCGTACAT AATGCCCTTC GAGCG.AAGGA AATGTGGCAG 1020
AACTGGCCGT CAGTGAAGCG TCAAACTTTC GCCACAAGAC TTTTGAATGG TGTTGAACGA 1080
GCCATGACCT CCTCCTCAAC AACTGTCTAT TCGTCTGAGA ACTATGTGCA ACCGTTGGTG 1140
ATGACAGAGA TGAGCGAAAG CATTCGGACT TCTTCGCAAC CATCGAACTA CTTCCTATTC 1200
CCTTCAATGG CCTTGTGGGC TGGTGAAAAT AACGTGGATA GCGTTGACGT TCCAAGGGAA 1260
GCTCTCGAAA TGACAGGATT GGACCGTGCC CGAGTCTACT ATGCGTCTTT TGCGAACATT 1320
GGTGAGGAAA TGGAACCTCC GGTGGAGATA TCAGCAGGAT CTGAACAGAA GCCGACTGGA 1380
CTAGAAAGAC GTCGCCGAAT TGTTTCACGT GTGGTGGCCG TGTCGCTTGT TCTCGATGGC 1440
AAAGTCATAA GGCTACCAAT ACTTCCTAAG CCGATCATCA TCACATTCCA TCATTACCCT 1500
GAGGCTTTAC GGCGGATGTC CTCACCTGAA TGTTCTTGGT GGGATACTGA AGACATGAAG 1560 - JJ -
TGGTCTACAA GTGGATGCTC CCTACAATCG CATAATTCTA CTCATACCGT ATGCGCTTGT 1620
AGTCATATGA CTCACTTTGC CGTTTTGATG GATTATGTCG GTCATGAGAT TTCCTCCGAG 1680
GATAATCAGC TTCTTACATT TCTCACATAT ACCGGTTGCA CGCTGTCAAT AGTCTGCCTT 1740
ACTCTGACAT TCTTCTGTTT TGTTGTCTTC ATCAAAGGAG GAGGCGATAG GGTTTTCATT 1800
CATAAAAATC TCTGCGCTTC TCTTGGTATA GCCGAACTGG TGTTCCTCGC TGGAATTTGG 1860
AGGACAGAAG AAAAGTTTGA ATGCGGTATG ATCGCTGGTT GCCTCCTTTA TTTCTTTCTA 1920
TCGGCTTTAA CCTGGATGTT ACTCGAGGGC TACCAGCTTT ACCAGATGCT TGTTGAGGTG 1980
TTCCCTGCCT CGCGACGTCG ATTCACCTTT TTCCTTGTTG GCTATGGCCT GCCAGCTATC 2040
ATTACTGGAG CAGCCGCTTA TTACGACCCG ACTGGTTTTG GAACACGCAA TCATTGCTGG 2100
TTACGCACCG ACAACCTTTT CATTTTATTC TTTGTCGCAC CAGCAGCTGT GATTTTACTG 2160
ACGAATACGA TGTTCCTGTT CATGACTATG TGCATTGTAT ACAGACATTC GAAGTATATC 2220
CCCTGTAGGC ATGCTGCGGA TAATGGAGGT GACATAAGGA CTTGGGTCAA AGGAGCGATG 2280
GGTCTGGTCT GTCTACTTGG TGTCACATGG ACTTGTGGCC TTCTCTGGAT CGATGATGGC 2340
CATTCGATAG TGATGGCATA CGCGTTTACC ATTGCGAATT CCCTTCAGGG TCTTTTCATC 2400
TTTGTCTTCC ATGTGCTCTG CTCAGAGAAG ATGCGTTACG ATATTGCCCG ATGGTGTGGC 2460
AAGCATGGCC TTTCATGTAT CAGCTCTGGC TCCCGTGATA CCTCTAGGGA TCTACAAAAA 2520
CGTGGAACTA TGTCACCGTC GGAGAGGAGT GGCAGCGAAT TCATCTATCC CACATCGGAG 2580
AAGATGCACA CATCTCCTCG TGGATTGGAA TCCTCTCTCA GCTCGGCCTA TCCTCAACAA 2640
CCACTCATCC ACCACTATCA GCGTCGTCCA CCGCAACAGC CTAATGGAAC TTATGACTAC 2700
GCAACAATTG CGTATGGCGA GATGGTACCA GGCCATATGT TACCACGCAT GGCCTCCTCG 2760
TTTCCTCATC CAGGTGTTGC CATCCATTAT CCCTCATTCG ATCTGGATTC CTCCTACCAA 2820
CCCCAGATCT TCCATCATCG CCCTCCACCA GACTTTTCTC CACCACCGCC ACCTCCTGCC 2880
CAGGGTACAA CACCTTCAAA AGTAATCCGT CCCCCATCAT CCAAGATGAG TGACGACTCG 2940
GCCTATTCCG ATGGTGGATC GTCGTCCGTA CTCACCACGG AAGTCACACC GTCTGGAGCG 3000
ACTGTGCTTC GAATGGATTT GGGCAGAAAT CAACCGCCTA ACTATTGGCG AAATGTTTGA 3060
GCATGTGTCC CTGTAAATGT TTCCTCGAGA GAGATTTTTG CCGAGGTTGT GCGCTTCAGT 3120
CACGGTTTAT GACGATCCGG GTGCTTTTGC AATCATTTTG ATGTGTTCGA TTTGTTCTTC 3180
CTTGGTATCC AAGGGCTTTC ATCGTCTTCC GGACATTCTG TCACTTTTCT ACACTCTAAT 3240 GCTCCAACTG TCGTTAATAT CAGCATATCA TCGTCACAAT TATGCGCCAT TTTTTCTCAG 3300
ATTACCGGTT TCCTTTGTAC ATTTGTGGAT TGTAGTTGTA GCTAAACTGT AGCTATTCAG 3360
AGGTATTTTT GATCTAGTCG ATAATAGCGC AATATTGTTT TACTAATTAC TAAGTACTAA 3420
TTGTTTTTTT AAGTCCGATT CCTGCCTTCT ATGGAAAAAT TTTGTTTTCG TTTCCATCCC 3480
GTATCATACT TTTAGGTTGA GATCAATAAA AACGTAAAAT TTGAAAAAAA AAAAAAAAA 3539 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:
(l) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 986 ammo acids
(B) TYPE: amino ac d
(C) STRANDEDNESS:
(D) TOPOLOGY: unkno n
(n) MOLECULE TYPE: protein (lll) HYPOTHETICAL: YEΞ
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Haemonchus contortus
(vn) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: PHC1
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:
Met Arg Asn Val Tyr Ile Leu Leu Leu Ser Val Val Gly Thr Phe Thr 1 5 10 15
Val Ala Glu Glu Leu Pro Ala Gin Ser Asn Ser Ser Ile Val Val Cys 20 25 30
Glu Gly Gly Thr Ala Glu Leu Glu Cys Pro His Gly Met Val Ile Ser 35 40 45
Ile Ala Leu Ala Asn Tyr Gly Arg Tyr Ser Ala Arg Val Cys Tyr Glu 50 55 60
Asn Glu Glu Leu Asp Asp Val Val Pro Met Thr Gin Cys His Asn Pro 65 70 75 80
Lys Thr Met Pro Thr Leu Arg Lys Ser Cys Asp Gly Arg Arg Glu Cys 85 90 95
His Phe Val Val Gly Asn Asp Phe Phe Val His Asp Pro Cys Pro Gly 100 105 110
Val Lys Lys Tyr Leu Glu Val Thr Tyr Leu Cys Val Ala Asp Val Thr 115 120 125 Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser 130 135 140
Thr Thr Thr Glu Val Glu Asp Asp Val Lys Glu Asp Met Ser Ala Lys 145 150 155 160
Ser Ala Pro Ser Thr Cys Ala Ala Thr Ser Arg Arg Gly Ile Glu Trp 165 170 175
Pro Ala Thr Ile Ser Gly Thr Thr Val Asn Arg Pro Cys Pro Glu Gly 180 185 190
Thr Arg Gly Thr Ser Ser Trp Lys Cys Ser Ala Glu Gly Leu Trp Ser 195 200 205
Glu Pro Gly Pro Asn Thr Ile Glu Cys Arg Ser Asp Trp Thr Ile Gin 210 215 220
Arg Gin Asp Ala Leu Glu Glu Thr Ile Lys Asp Gin Asp Ala Ser Gly 225 230 235 240
Ile Pro Glu Leu Leu Arg Ala Met Thr Ser Asp Thr Arg Arg Pro Met 245 250 255
Val Ala Gly Asp Leu Pro Lys Leu Leu Asn Ile Leu Asp Ile Val Gin 260 265 270
Asp Val Val Gly Arg Glu Val Trp Ala Lys Ser Ser Gin Lys Leu Val 275 280 285
Asn Gin Leu Ile Val Asn Val Val His Asn Ala Leu Arg Ala Lys Glu 290 295 300
Met Trp Gin Asn Trp Pro Ser Val Lys Arg Gin Thr Phe Ala Thr Arg 305 310 315 320
Leu Leu Asn Gly Val Glu Arg Ala Met Thr Ser Ser Ser Thr Thr Val 325 330 335
Tyr Ser Ser Glu Asn Tyr Val Gin Pro Leu Val Met Thr Glu Met Ser 340 345 350
Glu Ser Ile Arg Thr Ser Ser Gin Pro Ser Asn Tyr Phe Leu Phe Pro 355 360 365
Ser Met Ala Leu Trp Ala Gly Glu Asn Asn Val Asp Ser Val Asp Val 370 375 380
Pro Arg Glu Ala Leu Glu Met Thr Gly Leu Asp Arg Ala Arg Val Tyr 385 390 395 400
Tyr Ala Ser Phe Ala Asn Ile Gly Glu Glu Met Glu Pro Pro Val Glu 405 410 415
Ile Ser Ala Gly Ser Glu Gin Lys Pro Thr Gly Leu Glu Arg Arg Arg 420 425 430
Arg Ile Val Ser Arg Val Val Ala Val Ser Leu Val Leu Asp Gly Lys 435 440 445
Val Ile Arg Leu Pro Ile Leu Pro Lys Pro Ile Ile Ile Thr Phe His 450 455 460
His Tyr Pro Glu Ala Leu Arg Arg Met Ser Ser Pro Glu Cys Ser Trp 465 470 475 480
Trp Asp Thr Glu Asp Met Lys Trp Ser Thr Ser Gly Cys Ser Leu Gin 485 490 495
Ser His Asn Ser Thr His Thr Val Cys Ala Cys Ser His Met Thr His 500 505 510
Phe Ala Val Leu Met Asp Tyr Val Gly His Glu Ile Ser Ser Glu Asp 515 520 525
Asn Gin Leu Leu Thr Phe Leu Thr Tyr Thr Gly Cys Thr Leu Ser Ile 530 535 540
Val Cys Leu Thr Leu Thr Phe Phe Cys Phe Val Val Phe Ile Lys Gly 545 550 555 560
Gly Gly Asp Arg Val Phe Ile His Lys Asn Leu Cys Ala Ser Leu Gly 565 570 575
Ile Ala Glu Leu Val Phe Leu Ala Gly Ile Trp Arg Thr Glu Glu Lys 580 585 590
Phe Glu Cys Gly Met Ile Ala Gly Cys Leu Leu Tyr Phe Phe Leu Ser 595 600 605
Ala Leu Thr Trp Met Leu Leu Glu Gly Tyr Gin Leu Tyr Gin Met Leu 610 615 620
Val Glu Val Phe Pro Ala Ser Arg Arg Arg Phe Thr Phe Phe Leu Val 625 630 635 640
Gly Tyr Gly Leu Pro Ala Ile Ile Thr Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Asp 645 650 655
Pro Thr Gly Phe Gly Thr Arg Asn His Cys Trp Leu Arg Thr Asp Asn 660 665 670
Leu Phe Ile Leu Phe Phe Val Ala Pro Ala Ala Val Ile Leu Leu Thr 675 680 685
Asn Thr Met Phe Leu Phe Met Thr Met Cys Ile Val Tyr Arg His Ser 690 695 700
Lys Tyr Ile Pro Cys Arg His Ala Ala Asp Asn Gly Gly Asp Ile Arg 705 710 715 720 Thr Trp Val Lys Gly Ala Met Gly Leu Val Cys Leu Leu Gly Val Thr 725 730 735
Trp Thr Cys Gly Leu Leu Trp Ile Asp Asp Gly His Ser Ile Val Met 740 745 750
Ala Tyr Ala Phe Thr Ile Ala Asn Ser Leu Gin Gly Leu Phe Ile Phe 755 760 765
Val Phe His Val Leu Cys Ser Glu Lys Met Arg Tyr Asp Ile Ala Arg 770 775 780
Trp Cys Gly Lys His Gly Leu Ser Cys Ile Ser Ser Gly Ser Arg Asp 785 790 795 800
Thr Ser Arg Asp Leu Gin Lys Arg Gly Thr Met Ser Pro Ser Glu Arg 805 810 815
Ser Gly Ser Glu Phe Ile Tyr Pro Thr Ser Glu Lys Met His Thr Ser 820 825 830
Pro Arg Gly Leu Glu Ser Ser Leu Ser Ser Ala Tyr Pro Gin Gin Pro 835 840 845
Leu Ile His His Tyr Gin Arg Arg Pro Pro Gin Gin Pro Asn Gly Thr 850 855 860
Tyr Asp Tyr Ala Thr Ile Ala Tyr Gly Glu Met Val Pro Gly His Met 865 870 875 880
Leu Pro Arg Met Ala Ser Ser Phe Pro His Pro Gly Val Ala Ile His 885 890 895
Tyr Pro Ser Phe Asp Leu Asp Ser Ser Tyr Gin Pro Gin Ile Phe His 900 905 910
His Arg Pro Pro Pro Asp Phe Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Gin 915 920 925
Gly Thr Thr Pro Ser Lys Val Ile Arg Pro Pro Ser Ser Lys Met Ser 930 935 940
Asp Asp Ser Ala Tyr Ser Asp Gly Gly Ser Ser Ser Val Leu Thr Thr 945 950 955 960
Glu Val Thr Pro Ser Gly Ala Thr Val Leu Arg Met Asp Leu Gly Arg 965 970 975
Asn Gin Pro Pro Asn Tyr Trp Arg Asn Val 980 985

Claims

Patentansprüche
1 Proteine, sowie Teilstucke dieser Proteine, die mit gegen parasitierende Nematoden wirkenden Stoffen aus der Gruppe der cyclischen oder offen- kettigen Depsipeptide, die aus Aminosäuren und Hydroxycarbonsauren bestehen, reagieren.
2 DNA-Sequenzen, die für Proteine bzw. für Teilstücke dieser Proteine kodieren, die mit gegen parasitierenden Nematoden wirkenden Stoffen aus der Gruppe der cyclischen oder offenketügen Depsipeptide, die aus Aminosäuren und Hydroxycarbonsauren bestehen, reagieren
3 Proteine oder ihre Teilstucke, die mit gegen parasitierenden Nematoden wirkenden Stoffen aus der Gruppe der cyclischen oder offenketügen Depsipeptide, die aus Aminosäuren und Hydroxycarbonsauren bestehen, reagieren, zur Identifizierung von Stoffen mit Wirkung gegen parasitierende Nematoden aus der Gruppe der cyclischen oder offenketügen Depsipeptide. die aus Aminosäuren und Hydroxycarbonsauren bestehen.
4 Verfahren zur Identifizierung der Proteine und ihrer Teilstucke, die mit gegen parasitierenden Nematoden wirkenden Stoffen aus der Gruppe der cyclischen oder offenketügen Depsipepüde, die aus Aminosäuren und Hydroxycarbonsauren bestehen, reagieren, sowie die Herstellung der Pro- teine oder ihrer Teilstücke über rekombinante Technologie
5 Protein, das mit gegen parasitierenden Nematoden wirkenden Stoffen aus der Gruppe der cyclischen oder offenketügen Depsipeptide, die aus Aminosäuren und Hydroxycarbonsauren bestehen, reagiert, isoliert aus einer parasitären Nematodenspezies, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Sequenz von 207 Aminosäuren aufweist und ein Molekulargewicht von 23 991g/mol besitzt.
6 Protein gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es di e Aminosauresequenz gemäß Sequenzprotokoll ID Seq No 2 aufweist
7 Protein gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es eine Transmem- branregion, eine N-Glycosylierungsstelle, drei Determinanten sowie ein Signalpepüd aufweist, die den folgenden Positionen und Sequenzen des Proteins in Sequenzprotokoll ID No. 2 entsprechen
a) 1-18 NH2-terminales Signalpepüd, b) 174-190 eine Transmembranregion, c) 69-75 eine antigene Determinante, d) 157-162 eine antigene Determinante, e) 159-164 eine antigene Determinante, f) 167 eine Stelle für N-Glycosylierungen
Protein, das mit gegen parasiüerenden Nematoden wirkenden Stoffen aus der Gruppe der cyclischen oder offenketügen Depsipeptide, die aus Aminosäuren und Hydroxycarbonsauren bestehen, reagiert, isoliert aus einer parasitären Nematodenspezies, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Sequenz von 986 Aminosäuren aufweist und ein Molekulargewicht von 109 740 s g/' mol besitzt.
9 Protein gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosauresequenz gemäß dem Sequenzprotokoll ID Seq No 4 aufweist
10 Protein gem ß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es fünf Transmembranregionen, drei N-Glycosylierungsstellen, drei Determinanten sowie ein Signalpepüd aufweist, die den folgenden Positionen und Sequenzen des Proteins in Sequenzprotokoll ID No 4 entsprechen
a) 1-18 NH,-terminales Signalpepüd, b) 531-562 erste Transmembrandomane c) 595-615 zweite Transmembrandomane d) 673-700 dritte Transmembrandomane e) 725-744 vierte Transmembrandomane f) 750-774 fünfte Transmembrandomane g) 26 eine Stelle für N-Glycosylierungen h) 499 eine Stelle für N-Glycosylierungen i) 862 eine Stelle für N-Glycosylierungen j) 150-156 eine antigene Determinante k) 428-434 eine antigene Determinante 1) 799-804 eine antigene Determinante 1 Verwendung des Proteins gemäß Anspruch 1 zur Unterscheidung von nemaüzid wirkenden cyclischen oder offenketügen Depsipeptiden, bestehend aus Aminosäuren und Hydroxycarbonsauren als Bausteine
2 Testsysteme unter Verwendung der Proteine gemäß Anspruch 1 zur Identifizierung von nemaüzid wirkenden cyclischen oder offenketügen
Depsipeptiden, bestehend aus Aminosäuren und Hydroxycarbonsauren als Bausteine
3 Komplexe, bestehend aus einem cyclischen oder offenketügen Depsipepüd, das aus Aminosäuren oder Hydroxycarbonsauren besteht und geeigneten Liganden zur Erzeugung von Antikörpern gegen diese Depsipepüde
4 Polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen cyclische oder offenketüge Depsipepüde, bestehend aus Aminosäuren und Hydroxycarbonsauren als Bausteine, hergestellt unter Verwendung der Komplexe gemäß Anspruch 10
15 Verwendung der Antikörper gemäß Anspruch 1 1 als nemaüzide Wirkstoffe
16 DNA-Sequenz gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die gesamte cDNA die Sequenz gemäß Sequenzprotokoll ID No 1 aufweist
17 DNA-Sequenz gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die gesamte cDNA die Sequenz gemäß Sequenzprotokoll ID No 3 aufweist
18 Rekombinant hergestellte DNA, die für die gesamte Aminosauresequenz,
Aminosaurepartialsequenzen, Analoga, Homologa, Derivate oder daraus resultierende Kombinationen der Aminosauresequenz der Proteine gemäß Anspruch 1, kodiert und die gegebenenfalls in ein geeignetes Expressionssystem eingebaut ist
19 Ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) einen nemaüziden Wirkstoff aus der Gruppe der cyclischen oder offenkettigen Depsipeptide, bestehend aus Aminosäuren und Hydroxycarbonsauren als Bausteine, als Hapten mit einem Carπer- molekul konjugiert,
b) ein Donor-Tier mittels geeigneter Applikation mit diesem Hapten- Carrier-Konjugat immunisiert,
c) die Spezifitat der gebildeten Antikörper bestimmt,
d) gegebenenfalls die Konzentration der gebildeten spezifischen Anti- korper bestimmt,
e) die aus Seren oder Antikörper produzierenden Lymphozyten gewonnenen spezifischen Antikörper abtrennt und gegebenenfalls reinigt
20 Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als
Carπermolekul makromolekulare Verbindungen verwendet, die frei zugangliche reaktive Gruppen für die Kupplungsreaktion mit offenkettigen oder cyclischen Depsipeptiden aufweisen und in der Lage sind, besagten Verbindungen eine immunogene Potenz zu verleihen
21 Verfahren gemäß dem Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man ein lysinreiches Protein mit einem Molekulargewicht zwischen 10 000 und 1 500 000 verwendet
22 Ein Verfahren gemäß dem Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Protein auswählt aus der Gruppe bestehend aus "Bovine Serum Albumin" (BSA), "Keyhole Limpet Protein" (KLP), Humanes Serum- albumin (HSA), "Porcine Thyreoglobulin", B2 Microglobuhn, Haemo- cyamn, Immunoglobuline, Toxine, Polysacchaπde, Lipopolysaccharide, naturliche oder synthetische Polyadenyl- und Polyuπdylsauren, Polyalanyl- und Polylysin-Polypeptide, oder Zellmembrankomponenten verwendet
PCT/EP1997/005314 1996-10-10 1997-09-29 Nematodenproteine, dafür kodierende dna-sequenzen, dagegen spezifische antikörper und ihre verwendung zum auffinden nematizider wirkstoffe WO1998015625A1 (de)

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CN111735959A (zh) * 2019-03-25 2020-10-02 重庆乾泰生物医药有限公司 一种检测pf1022a的酶联免疫试剂盒

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