WO1998010055A1 - Methode d'activation de cellules immunosuppressives et dispositif de culture utilise a cette fin - Google Patents

Description

明 糸田 免疫抑制性細胞の 誘導法 お よ び そ れ に 用 い る 培養器具 技術分野

本発 明 は 免疫抑制性細胞 の 誘導方 法お よ び そ れ に 用 い る 器具 に 関 す る 。 さ ら に 詳 し く は 、 蛋 白 質 に 親和性を 有 す る 培養器 具 で ヒ ト 細胞 を 培養す る こ と に よ る 免疫抑制 性細胞の 誘導方法、 お よ び そ れ に 用 い る 培 養器具 に 関す る o 背景技術

自 己免疫疾患 お よ び移植時 の 拒絶反応 は 、 宿主 の 細胞 が 自 己の 細胞 や移植 さ れ た 臓器を異物 と し て 認識 し 、 破 壊す る こ と に よ り 引 き お こ さ れ る 疾患で あ り 、 免疫抑制 性細胞の 量 的 ま た は 質的 な 異常がそ の 原因で あ る と す る 例 が い く つ か 知 ら れ て い る （ マ ッ キ ン ト ッ シ ュ （ M a c i n t o s h ) お よ び ド ラ ク マ ン ( D r a c h m a n ) 、 サ イ ェ ン ス （ S c i e n c e ) 、 2 3 2 巻 、 4 0 1 頁 ( 1 9 8 6 年） 参照） 。 バ ラ シ ョ フ （ B a 1 a s h o V ) ら の 報告 （ ノ ラ シ ョ フ ら 、 ジ ャ ー ナ ル ' ォ ブ · ク リ ニ 力 ル · ィ ン ヘ ス テ ィ ゲ ー シ ヨ ン 、 J o u r n a l o f C 1 i n i c a 1 I n v e s t i g a t i o n ) 、 9 5 巻、 2 7 1 1 頁 （ 1 9 9 5 年） 参照） で は 、 M S ( 多 発性硬化症） 患者 に お い て は 、 自 己混合 リ ン パ球反応 に よ る 免疫抑制性 T 細胞 の 誘導効率 に い ち じ る し い 低下が み ら れ、 そ れが 同疾患発症 の 原 因で あ る と し て い る 。 し た が つ て、 そ の よ う な 患者の 免疫抑制性細胞 を 回復 さ せ る こ と は 、 そ の 治療法 と し て き わ め て有効で あ る と 考 え ら れ る 。 こ れま で、 免疫抑制性 T 細胞の誘導例 と し て は、 フ レ ズ ノ （ F r e s n o ) ら （ フ レ ズ ノ ら 、 ジ ャ ー ナ ル • ォ ブ · ェ ク ス ペ リ メ ン タ ル * メ デ ィ シ ン （ J 0 u r n a 1 o f E x p e r i m e n t a l M e d i c i n e ) 、 1 6 3 巻、 1 2 4 6 頁 （ 1 9 8 0 年） 参照） を は じ め 、 マ ウ ス な ど の 動物 を 用 い た 系 で い く つ か報告 さ れて い る 。 ま た 、 ヒ ト で の 誘導例 と し て、 最近報告 さ れ た前記文献 の 自 己混 合 リ ン パ球反応 を 利用 し た 方法が あ る 力く、 P H A、 C o n A ゃ 抗 C D 3 抗体で処理 し た ヒ ト 細胞培養液、 ま た は 複数の サ イ ト カ イ ン を 添加 し て培 養す る 必要が あ り 、 操作 と し て は 煩雑 で あ る 。 さ ら に 以 上 の 系 は 浮遊系 で あ る の で 、 処理 に 用 い た レ ク チ ン （ P H A、 C o n A ) な ど の 異物 は 細胞の 周 囲 に 接着 し 、 洗 浄 し て も 処理 し た 細胞か ら 完全 に は 除去で き な い た め 、 異物混入 の 危険性 も あ り 、 け っ し て 望 ま し い 方法 と は い え ず、 体外 で免疫抑制性細胞 を 誘導す る こ と を 狙 う 治療 に は 利用 で き な い 。 本発 明 は 患者の 血液細胞 を体外 に 取 り 出 し 、 固定系 で 効果的 に 免疫抑制性細胞、 と く に 免疫 抑制性 T 細胞 を 誘導 し 、 再 び戻す こ と に よ る 前記疾患 の 効率的治療 シ ス テ ム を提供す る も の で あ る 。 発 明 の 開示

本発明者 ら は、 前記の よ う な 自 己免疫疾患 を 引 き お こ す免疫系の 異常亢進 を選択 的 に 抑制 す る 細胞、 と く に 免 疫抑制性 T 細胞を 作製す る 技術の 開発 に つ い て検討 し 、 本発 明 を 完成 し た 。

本発 明 は 、 ヒ ト 細胞 を 、 （ 1 ) 蛋 白 質 に 親和性 を 有す る 培養器具 で あ ら 力、 じ め 抗体 も し く. は サ イ ト カ イ ン な ど の 蛋 白 質を コ ー テ ィ ン グ し た も の 、 ま た は な に も コ ー テ ィ ン グ し て い な い も の に 加え て培養、 あ る い は （ 2 ) 抗 体 も し く は サ イ ト カ イ ン な ど の 蛋 白 質を 同 時 に 同培養器

5 具 に 加 え 培養す る こ と に よ り 、 免疫抑制性細胞 を 誘導す る 方法 お よ び該方法 に 用 い る 培養器具 を 提供す る も の で あ る 。

す な わ ち 、 本発明 は 蛋 白 質 に 親和性 を有す る 培養器具 で ヒ ト 細胞 を 培養す る こ と に よ る 免疫抑制性細胞 の 誘導

10 方法 （請求 の 範囲第 1 項） に 関す る 。

さ ら に 本 発明 は あ ら か じ め 1 種以上の 細胞表面抗原 に 対す る 抗体 ま た は サ イ ト カ イ ン を コ 一 テ ィ ン グ し た 培養 器具 を 用 い る 請求 の 範囲第 1 項記載の 誘導方法 （請求の 範囲第 2 項） に 関す る 。

i s さ ら に 本発明 は細胞表面抗原 に 対す る 抗体 で あ り 、 異 な る ェ ピ ト ー プを認識す る 2 種以上 の 抗体 を コ ー テ ィ ン グ し た培養器具 を 用 い る 請求の 範囲第 1 項記載の 誘導方 法 （請求の 範囲第 3 項） に 関す る 。

さ ら に 本発明 は 1 種以上 の 細胞表面抗原 に 対す る 抗体 20 ま た は サ イ ト カ イ ン を ヒ ト 細胞 と 同時 に 添加す る 請求の 範囲第 1 項記載の 誘導方法 （請求の 範囲第 4 項） に 関す o

さ ら に 本発明 は細胞表面抗原 に 対す る 抗体 であ り 、 異 な る ェ ピ ト ー プを認識す る 2 種以上の 抗体 を ヒ ト 細胞 と 5 同時 に 添加 す る 請求 の 範囲第 1 項記載の 誘導方法 （請求 の 範囲第 5 項） に 関す る 。

さ ら に 本発明 は細胞表面抗原 に 対す る 抗体が抗 C D 2 抗体 ま た は 抗 C D 3 抗体 で あ る 請求 の 範囲第 2 項、 第 3 項、 第 4 項 ま た は 第 5 項記載 の 誘導方法 （請求 の 範囲第 6 項） に 関す る 。

さ ら に 本発 明 は 細胞表面抗原 に 対す る 抗体が抗 C D 2 抗体で、 C D 2 の L F A — 3 と の 結 合 に 関与す る 部分 と 結合す る 請求 の 範囲第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項 ま た は 第 6 項記載の 誘導方法 （請求 の 範囲第 7 項） に 関す る

さ ら に 本発明 は細胞表面抗原 に 対す る 抗体が抗 C D 2 抗体で、 C D 2 の L F A — 3 と の 結 合 に 関与す る 部分以 外 と 結合 す る 請求 の 範囲第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項 ま た は 第 6 項記載 の 誘導方 法 （請求 の 範囲第 8 項） に 関す る 。

さ ら に 本発 明 は細胞表面抗原 に 対す る 2 種以上 の 抗体 が抗 C D 2 抗体で、 C D 2 の L F A — 3 と の 結合 に 関与 す る 部分 と 結 合す る 抗体 1 種以上 と L F A — 3 と の 結合 に 関与 し な い 部分 と 結 合す る 抗体 1 種以上 と の組 み 合わ せ で あ る 請求 の 範囲 第 3 項 ま た は 第 5 項記載の誘導方法 (請求 の 範囲 第 9 項） に 関 す る 。

さ ら に 本発 明 は 1 種 の 細胞表面抗原 に 対す る 抗体が抗 C D 2 抗体 T S 2 Z 1 8 で あ る 請求 の 範囲第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項 ま た は 第 8 項記載 の 誘導方法 （請求 の 範囲第 1 0 項） に 関す る 。

さ ら に 本発 明 は 1 種 の 細胞表面抗原 に 対す る 抗体が抗 C D 2 抗体 T S 2 Z 1 8 の F ( a b ) ₂断 片 で あ る 請求 の 範囲第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項 ま た は 第 8 項記載 の 誘導方法 （請求の 範囲第 1 1 項） に 関す る 。

さ ら に 本発 明 は サ イ ト カ イ ン 力く I L _ 2 お よ び G M — C S F で あ る 請求の 範囲第 2 項 ま た は 第 4 項記載 の 誘導 方法 （請求 の 範囲第 1 2 項） に 関す る o

さ ら に 本発 明 は 培養時 に 培地 に 対 し て血清 を 0 . 5 〜 1 0 v Z v %添加す る 請求 の 範囲第 1 項、 第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項、 第 8 項、 第 9 項、 第 1 0 項、 第 1 1 項 ま た は 第 1 2 項記載 の 誘導方法 （請 求の 範囲第 1 3 項） に 関す る 。

さ ら に 本発明 は 培養時 に 血清 を 培地 に 添加 し な い 請求 の 範囲第 1 項、 第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項、 第 8 項、 第 9 項、 第 1 0 項、 第 1 1 項 ま た は第 1 2 項記載の 誘導方法 （請求 の 範囲第 1 4 項） に 関 す る 。

さ ら に 本発明 は 培養期 間 力 1 〜 7 日 間 で あ る 請求の 範 囲第 1 項、 第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項、 第 8 項、 第 9 項、 第 1 0 項、 第 1 1 項、 第 1 2 項、 第 1 3 項 ま た は 第 1 4 項記載 の 誘導方 法 （請求 の 範 囲第 1 5 項） に 関す る 。

さ ら に 本発明 は 培養器具 が蛋 白 質 に 対 し て親和性 を 有 す る 部材か ら な る 請求 の 範囲第 1 項、 第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項、 第 8 項、 第 9 項、 第

1 0 項、 第 1 1 項、 第 1 2 項、 第 1 3 項、 第 1 4 項 ま た は第 1 5 項記載の 誘導方法 （請求 の 範囲第 1 6 項） に 関 す る 。

さ ら に 本発明 は培養器具が プ ラ ス チ ッ ク 系部材 か ら な る 請求の範囲第 1 項、 第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項、 第 8 項、 第 9 項、 第 1 0 項、 第 1 1 項、 第 1 2 項、 第 1 3 項、 第 1 4 項、 第 1 5 項 ま た は 第 1 6 項記載の 誘導方法 （請求 の 範囲第 1 7 項） に 関す る 。 さ ら に本発 明 は培 養器具 が ガ ラ ス 系部材 か ら な る 請求 の 範囲第 1 項、 第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項、 第 8 項、 第 9 項、 第 1 0 項、 第 1 1 項、 第 1 2 項、 第 1 3 項、 第 1 4 項、 第 1 5 項 ま た は 第 1 6 項 5 記載の 誘導方 法 （請求 の 範囲第 1 8 項） に 関す る 。

さ ら に 本発 明 は培養器具が平板 プ レ ー ト 伏閉鎖系容器 ま た は 球形微粒子を 充塡 し た 閉鎖系容器 で あ る 請求 の 範 囲第 1 項、 第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項、 第 8 項、 第 9 項、 第 1 0 項、 第 1 1 項、 第 1 2 10 項、 第 1 3 項、 第 1 4 項、 第 1 5 項、 第 1 6 項、 第 1 7 項 ま た は第 1 8 項記載の誘導方法 （請求の 範囲第 1 9 項） に 関す る 。

さ ら に 本発 明 は ヒ 卜 細胞 を培養 す る こ と に よ り 免疫抑 制性細胞を 誘導す る た め に 用 い る 蛋 白 質 に 親和性 を 有す i s る 培養器具 （請求の 範囲第 2 0 項） に 関す る 。

さ ら に 本発 明 は あ ら 力、 じ め 1 種以上の 細胞表面抗原 に 対す る 抗体 ま た は サ イ ト カ イ ン を コ 一 テ ィ ン グ し た請求 の 範囲 第 2 0 項記載の 培養器具 （請求 の 範囲第 2 1 項） に 関 す る 。

20 さ ら に 本発 明 は細胞表面抗原 に 対す る 抗体で あ り 、 異 な る ェ ピ ト 一 プを認識す る 2 種以上の 抗体 を コ ー テ ィ ン グ し た 請求 の 範囲第 2 0 項記載の 培養器具 （請求 の 範囲 第 2 2 項） に 関す る 。

さ ら に 本発明 は細胞表面抗原 に 対す る 抗体が抗 C D 2

25 抗体 ま た は抗 C D 3 抗体で あ る 請求 の 範囲第 2 1 項 ま た は 第 2 2 項記載の 培養器具 （請求 の 範囲第 2 3 項） に 関 す る 。

さ ら に本発明 は異 な る ェ ピ ト ー プを認識す る 抗体の 1 種以上が抗 C D 2 抗体 T S 2 / 1 8 で あ る 請求の 範囲第 2 2 項 ま た は 第 2 3 項記載の 培養器具 （請求の 範囲第 2 4 項） に 関す る 。 図面 の 簡単 な 説明

図 1 は本発明の培養器具の一実施例の説明図であ つ て、 ( a ) は ヒ 卜 細胞添加時の 断面説 明 図、 （ b ) は 培 養時 ( a ) を 9 0 ° 回転 さ せ た 断面説 明 図、 お よ び （ c ) は ( b ) の上面説 明図 で あ る 。

図 2 は本発 明 の 培養器具 の 他 の 実施例 の 断面説 明 図で あ る 。

図 3 は 本発明 （実施例 1 の （ a ) ) に よ り え ら れ た 免 疫抑制性細胞 に よ る T 細胞活性化反応の 抑制効果 を 示す グ ラ フ で あ る 。

図 4 は 本発 明 （実施例 1 の （ b ) ) に よ り え ら れ た 免 疫抑制性細胞 に よ る T 細胞活性化反応の 抑制効果 を 示す グ ラ フ で あ る 。

図 5 は本 発 明 （実施例 1 の （ c ) ) に よ り え ら れ た 免 疫抑制性細胞 に よ る T 細胞活性化反応 の 抑制効果 を 示す グ ラ フ で あ る 。

図 6 は本発明 （実施例 1 の （ d ) 〜 （ f ) ) に よ り え ら れ た 免疫抑制性細胞 に よ る T 細胞活性化反 応の 抑制効 果 を 示す グ ラ フ で あ る 。

図 7 は 本発明 （実施例 2 ) に よ り え ら れ た 免疫抑制性 細胞 に よ る T 細胞活性化反応の 抑制効果 を 示す グ ラ フ で あ る 。 発 明 を 実施す る た め の 最良 の 形態 厂蛋 白 質 に 親和性 を 有す る 」 と は 、 蛋 白 質が疎水性、 共有 ロ ロ た は ィ ォ ン 結合 な ど の 結合 に よ っ て 固定化 さ れ う る 性質 を 有す る こ と を 意味す る

本発明 に 用 い る 培養器具 は 蛋 白 質 に 親和性 を 有す れば よ く 、 細胞毒性の な い 滅菌可能 で 、 好 ま し く は 、 蛋 白 質 に 親和性 を 有す る 部材 か ら な つ て お り 、 プ ラ ス チ ッ ク 系 ま た は ガ ラ ス 系 の 部材が好 ま し い o プ ラ ス チ ッ ク 系 部材 と は 熱硬化性樹脂 と 熱可塑性樹脂 を 意味 し 、 成型性 力"？す ぐ れ て い る と い う 理 由 で ポ リ マ 一が よ り 好 ま し く 、 蛋 白 に 対 す る 親和性が高 < 、 無色透 明 で あ る と い う 理 由 で ポ リ ス チ レ ン が と く に 好 ま し い o ガ ラ ス 系 部材 と は ゲ イ 酸

、 ホ ウ 酸塩、 リ ン 酸塩 な どが結日日 す る こ と な く 固化 し た も の （ ガ ラ ス 化 と い う ) を 意味 し 、 ガ ラ ス 化傾 向が強 い と い う 理 由 で ゲ イ 酸塩ガ ラ ス が よ り 好 ま し く 、 成形性 に 富 ^ 、 耐衝撃性が高 い と い う 理 由 で ゲ イ 酸塩 ガ ラ ス を 熱処理す る こ と に よ り つ く る 結 mィ匕 ガ ラ ス が と く に 好 ま し い 、 培養器具 に 蛋 白 質 に 対す る 親和性 を 付与す る た め、 部材 に 蛋 白 質 の 吸着性 を 高 め る 処理を 行 な っ て も よ い o 通常細胞培養 に 用 い ら れ る 培養器具 は コ ラ ー ゲ ン な ど の 蛋 白 質で コ ― テ イ ン グ さ れて い る の で 、 蛋 白 質 の 吸着性を 低下 さ せ て い る 力 、 こ の 点 は 本発明 に 用 い る 器具 に お い て は好 ま し く な い o 本発明 に 用 い る 細胞培養 器具 に お い て細胞が 直接接着す る 部材の 形状 と し て は、 蛋 白 質の 固定化を 均― に 行 な い 、 さ ら に 細胞 の 接着 を 均 一に 効率的 に 行 な う 必要が あ る の で 、 平板状 ま た は 球状 が好 ま し い 0 さ ら に 好 ま し く は 培養器具 は 平板 プ レ 一 卜 状閉鎖系容 ま た は 球形微粒子 を 充頃 し た 閉鎖系容器 で あ る 。 平板状 の も の で は通常の 培養 フ ラ ス コ 、 培養 デ ィ ッ シ ュ 、 培養 プ レ ー ト の形状を し た も の ま た は図 1 ( a ) 〜 （ c ) に 示 し た よ う な 多 段式 の プ レ ー ト が使用 可能で あ o

図 1 に 示 さ れ た 多 段式 プ レ ー ト は本発明 の 培養器具 の 実施 の 一形態で あ る 。 図 1 ( a ) に 示す よ う に 、 矢印 の 方 向 か ら ヒ ト 細胞 1 を 含む細胞懸濁液 2 が添加 さ れ る 。 図 1 ( b ) に 示す よ う に 培養時 は 図 1 ( a ) の 器具 を 9 0 ° 回転 さ せ る 。 培養 時 に は 通気性 フ ィ ル タ ー 3 を へ て 5 % C 0 ₂が送 ら れ、 誘導 さ れ た 免 疫 抑 制 性 細 胞 は や や 強 く 振 と う す る こ と に よ っ て は 力 さ れ細胞回収 口 4 か ら え ら れ る 。 図 1 ( c ) は 図 1 ( b ) を上か ら み た 図で あ る 。 こ の よ う な 多 段式 プ レ ー ト を 用 い る ば あ い、 一度 に 多 く の 細胞 を処理で き る だ け で な く 、 一度 に 複数の 異な る 機能を 有 す る 細胞 を誘導作製す る こ と がで き る 利点が あ る 。 た と え ば、 コ ー テ ィ ン グす る 抗体 を 変え る こ と に よ り 免疫抑制性 の 細胞 お よ び免疫抑制機構 を 賦活す る 能 力 を 有す る 細胞 を 同 時 に 誘導す る こ と が可能で あ る 。 部 材が球状形 の も の で は 微粒子 （小型球形 ビ ー ズ） を 図 2 に 示 し た よ う な 容器 に 入 れ使用 す る こ と が可能で あ る 。

図 2 に示 さ れた容器 は本発明の実施の別の形態であ る。 図 2 中、 5 % じ 0 ₂は 通気性 フ ィ ル 夕 ー 2 3 を へ て 、 ヒ ト 細胞を 含有す る 細胞懸濁液 2 2 に 送 ら れ る 。 球形微粒 子 2 5 は細胞懸濁液 2 2 中 に 存在 し ヒ 卜 細胞が接着 し て い る 。 誘導 さ れ た 免疫抑制性細胞 は球形微粒子 に 接着 し た ま ま コ ッ ク 2 6 を あ け て 回収 さ れ る 。 2 7 は側壁 を 示 す。 そ の の ち 、 生理食塩水 な ど で洗浄す る こ と に よ り 、 誘導 さ れ た 細胞が え ら れ る 。 本発明 で は主 に E L I S A 反応 に 用 い る 平板状 の ブ ラ ス チ ッ ク プ レ ー ト を 器具 と し て 用 い る の 力く と く に 好 ま し い o

「 ヒ ト 細胞」 と は 、 ヒ ト の 体 を 構成す る 細胞 お よ び こ 5 れ に 由 来す る 細胞 で あ る 。 本発 明 に 用 い る ヒ ト 細胞 と し て は 、 た と え ば ヒ ト 末梢血細胞、 ヒ ト 腹腔細胞、 ヒ ト 胸 腺細胞、 ヒ ト 骨髄細胞、 ヒ ト 株化 T 細胞 な どが あ げ ら れ る 。 細胞移入 と い う 方法で実際 に 患者の 治療 を 行 な う ば あ い 、 免疫 の 拒絶反応 ま た は抑制 効果 を 考 え て も 、 そ の 10 患者 自 身の 細胞 を 用 い る こ と が最 も 望 ま し く 、 そ の な か で も ヒ ト 末梢血細胞が採取 の 容易 さ の 点 で 好 ま し い 。 ヒ 卜 末梢血細胞 は 、 ヒ 卜 か ら の 採血 に よ り え た静脈血 を 5 0 m l の ポ リ ス チ レ ン チ ュ ー ブ に 入 れ た フ イ コ ー ル （ フ イ コ ー ル ノ、⁰ ッ ク （ F i c o 1 1 - P a q u e ) 、 フ ア ル i s マ シ ア 社製） の 上 に 重層 し 、 1 分 間 に 1 5 0 0 回転で 2 0 分 間遠心す る こ と に よ り 、 境界面 に 形成 さ れ る リ ン ノ 球、 単球画分 を分離 し 、 R P M I — 1 6 4 0 培地で 3 回 洗浄す る こ と に よ り え ら れ る （ フ ィ コ ー ル遠心分離法） 。 T 細胞 は 、 こ う し て え ら れ た ヒ ト 末 血細胞 を 培養液中

20 に 播種 し て一晩培養 し た の ち 、 浮遊細胞 を 集め る こ と に よ り え ら れ る 。

「細胞表面抗原 に 対す る 抗体」 と は 、 細胞 と 細胞の 接 着を媒介す る 機能 を 有す る 蛋 白 質 に 対す る 抗体、 ま た は 接着時 に 二次的 に相手細胞上の 分子 と の 結 合 に 関与す る

25 蛋 白 質 に 対す る 抗体、 そ し て 種 々 の サ イ ト カ イ ン に 対す る 受容体 に 対す る 抗体 を い う が、 た と え ば免疫 グ ロ プ リ ン · ス ー パ 一 · フ ア ミ リ ー 、 イ ン テ グ リ ン · ス ー パ 一 フ ア ミ リ ー 、 カ ドヘ リ ン な ど に 対す る 抗体 ま た は I L — 2 受容体 に 対す る 抗体が あ げ ら れ る 。 好 ま し く は 、 免疫 グ ロ ブ リ ン · ス ー パ 一 . フ ァ ミ リ ー 、 と く に 好 ま し く は、 ヒ 卜 T細胞 の C D 2 抗原 ま た は C D 3 抗原 に 対す る 親和 性を 有す る 抗体 お よ び そ の 類似体で あ る 。

「細胞表面抗原 に 対す る 抗体であ り 、 異 な る ェ ピ ト ー プを認識す る 2 種以上 の 抗体」 と は 、 表面抗原分子 の異 な る 部分 を 抗原 と し て認識 し 、 結合す る 2 種以上の 抗体 を意味す る 。 前記抗体の種類 は好ま し く は 2 種類であ り 、 前記抗体 の 具体例 と し て は 、 好 ま し く は C D 2 分子 を認 識す る 抗体 で あ っ て 異 な る ェ ピ ト ー プを 認識す る 2 種類 の 抗体で あ り 、 さ ら に 好 ま し く は 抗 C D 2 抗体 T S 2 Z 1 8 と ハ イ プ リ ド ー マ S 3 3 H 2 N 0 1 0 が産生す る 抗 体 （以下の 参考例 2 、 実施例 2 お よ び試験例 2 参照） と の 組み 合 わ せ が あ げ ら れ る 。 前記抗体 を組み 合 わ せ る 割 合 は 好 ま し く は 1 ： 9 〜 9 ： 1 (重量比） で あ り 、 と く に 好 ま し く は 等量 1 ： 1 で あ る 。

こ こ で 「 C D 2 抗原 に 対す る 抗体 （抗 C D 2 抗体） 」 と し て は 、 C D 2 の 種 々 の ェ ピ ト ー プ に 対す る モ ノ ク ロ — ナ ル抗体 ま た は C D 2 分子 に 対す る ポ リ ク ロ 一 ナ ル抗 体 な どが あ げ ら れ る 。 ま た 、 こ れ ら の F ( a b ) ₂断片 も 使用 で き る 。 こ の 中 で さ ら に 好 ま し い も の は 、 C D 2 に 対 し て 強 い 親和性 を有 し て い る と い う 理 由 で、 抗 C D 2 抗体 T S 2 Z 1 8 お よ び そ の F ( a b ) ₂断片であ る 。

好 ま し い 細胞表面抗原 に 対す る 抗体 で あ る 「 C D 2 の L F A — 3 と の 結合 に 関与す る 部分 と 結合す る 抗 C D 2 抗体」 と は 、 L F A — 3 分子 と C D 2 分子 と の 結合 に お い て、 両分子 の 結合 を 阻害す る 能力 を 有す る 抗 C D 2 抗 体で あ り 、 具体的 に は ヒ ッ ジ 赤血球 と 末梢血 ヒ ト T 細胞 あ る い は ジ ャ ー カ ツ ト 細胞 （ ユ ー シ ュ ナ イ ダ ー （ U .

S c h n e i d e r ) ら 、 イ ン タ ー ナ シ ョ ナ ル ' ジ ャ ー ナ ゾレ • ォ ブ · キ ャ ン サ ー （ I n t . J . C a n c e r ) 、 1 9 巻、 6 2 1 頁 （ 1 9 7 7 年） 参照） な ど の ヒ ト T 細 胞株 と の 結合 （ ロ ゼ ッ ト 形成反応 ； カ レ ン ト プ ロ ト コ 一 ル ス * イ ン · ィ ム ノ ロ ジ ー （ C u r r e n t P r o t o c o l s i n I m m u n o l o g y 、 1 卷、. 7 . 2 . 1 章 （ 1 9 9 1 年） 参照） を 阻害す る か ど う か を 測定 し て 判 断す る 。

好 ま し い 細胞表面抗原 に 対す る 抗体で あ る 「 C D 2 の し F A - 3 と の 結合 に 関与す る 部分以外 と 結合す る 抗 C D 2 抗体」 と は 、 前記の ロ ゼ ッ ト 形成阻害能 を 有 し て い な い 抗体で め る 。

ま た 「 C D 3 抗原 に 対す る 抗体 （抗 C D 3 抗体） 」 と し て は 、 同 じ く C D 3 分子 を 認識す る モ ノ ク ロ 一 ナ ル抗 体 ま た は ポ リ ク ロ ー ナ ル抗体、 さ ら に は そ れ ら の F ( a b ) 断片 が使用 可能で あ る 。 こ れ ら の 中 で さ ら に 好 ま し い も の は 、 C D 3 に 対す る 強 い親和性 と T 細胞活性化 能を 有す る と い う 理 由 で 、 抗 C D 3 抗体 （ 0 K T 3 ) で あ る

厂サ イ ト 力 イ ン 」 と し て は 、 I L — 1 、 I L — 2 、 I

L 一 3 、 I L - 4 > I L — 5 、 I L — 6 、 I L _ 7 、 I L 一 8 、 I L 一 8 レ セ プ タ ー フ Ύ ^ リ 一 、 I L 一 9 、 I L 一 1 0 、 I L 一 1 1 、 — 1 2 、 I L 一 1 3 、 I L 一 1 5 、 G M — C S F 、 G — C S F 、 T G F — 、 T Ν F 一 a T N F - /9 、 I F N - a I F N — yS 、 I F N 一 7 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ 活性化因子、 マ ク ロ フ ァ ー ジ遊走 阻止因子 な ど が あ げ ら れ る が、 と く に I L 一 2 お よ び G M — C S F 力 T 細胞 の 増殖、 サ イ ト カ イ ン 産生 に 有効で あ る の で好 ま し い 。 こ れ ら の サ イ ト 力 イ ン は 、 単独 ま た は 2 種以上 を 併用 す る こ と が で き る 。 I L _ 2 お よ び G Μ — C S F は 末梢血 力、 ら 分離 し た も の で も 、 ま た 遺伝子 組み 換え に よ り 調製 し た も の で も よ い 。

「免疫抑制性細胞」 と は 、 免疫反応を 抑制 す る 能力 を 有す る 細胞 を い う 。 こ の 免疫応答抑制活性 の 測定 は 、 た と え ば異 な る 2 つ も し く は そ れ以上 の 数 の 個体か ら 調製 し た 末梢血細胞 を 混合す る 反応系 （ M L R ) 、 ま た は あ る 抗原に対す る 反応性を有す る Τ 細胞 （ メ モ リ 一 T 細胞） を持つ 個体 の 末梢血細胞 と そ の 抗原 と を 混合す る 反応系 な ど を 用 い て 行 な う こ と が で き る 。 以下 の 試験例 1 お よ び 2 に 説明 す る よ う に 、 イ ン ビ ト 口 に お い て 同——八力、 ら 新た に え た ヒ ト 末梢血細胞 （以下、 P B L と い う ） に 、 免疫抑制性 を 有す る と 思 わ れ る 細胞 を 加 え 、 さ ら に P P D ( ピ ュ ア リ フ ァ イ ド · プ ロ テ イ ン · デ リ バ チ ブ （ P u r i f i e d P r o t e i n D e r i v a t i V e ) 、 日 本 ビ ー シ ー ジ 一 社製） を 加 え て 3 7 °C 、 5 % C 0

2 の 条件下で数 日 間培養 し た の ち 、 [ ³ H ] チ ミ ジ ン を 添 加 し 、 3 7 °C で さ ら に 5 〜 1 6 時間培養 し た の ち 、 細胞 中 の 放射活性 を シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ ー で測定す る こ と に よ り 行 な う こ と 力 で き る 。

ヒ ト 細胞 を前記培養器具 で、 前記 の 細胞表面抗原 に 対 す る 抗体 お よ び Zま た は サ イ ト カ イ ン を 固定、 非固定 し た 前記培養器具 で、 ま た は前記の 細胞表面抗原 に 対す る 抗体 お よ び ま た は サ イ ト カ イ ン と ヒ 卜 細胞 と を 同 時 ま た は前後 し て添加す る 系で、 細胞を培養す る こ と に よ り 、 免疫抑制性細胞がえ ら れ る 。 た だ し 、 ヒ ト 細胞 を 先 に 添 加す る ば あ い は、 前記抗体 お よ び Zま た は サ イ ト カ イ ン の添加 ま で の 時間 が短 い方 （ 3 日 以 内 ） が好 ま し い 。 よ り 好 ま し く は ヒ ト 細胞 を後 （ 1 日 以 内） に 添加す る か 同 時添加す る こ と で あ り 、 と く に好 ま し く は 同時添加で あ る 。 こ れ ら 固定化 ま た は 添加す る 蛋 白 質の 量 は 、 用 い る 蛋 白 質 に よ っ て異 な り 、 と く に 限定 さ れ な い が、 添加す る 培地 に 対 し て 0 . l 〜 1 0 g / m l 力く好 ま し い。 少 な す ぎ る ば あ い に は 、 免疫抑制活性 の 誘導が行 な わ れな い お そ れ 力 < あ り 、 多 す ぎ る ば あ い に は 、 細胞 に 傷害.を与 え る 可能性力 あ る 。

用 い る こ と が で き る 培地 と し て は 、 た と え ば動物培養 用培地、 D — M E Mや R P M I — 1 6 4 0 力くあ げ ら れる 。 ま た、 培地 に 血清 を 添加 し な く て も よ い し 、 血清 を 含有 さ せ て も よ い 。 含有 さ せ る ば あ い 、 好 ま し く は 自 己 （ォ 一 ト ロ ー ガ ス ） 血清 を 用 い る 。 自 己血清 と は 、 培養 に 用 い る ヒ ト 細胞 と 同 じ 個体 よ り え ら れ た血清 を い う 。 自 己 血清 を 用 い る と 細胞増殖性が よ く 、 非特異的免疫反応 も お こ り に く く 、 最 も の ぞ ま し い。 血清の 添加量 は と く に 限定 さ れず 0 . 5 〜 ： L 0 v Z v %が一般的 で あ る 。 ヒ ト 細胞 を こ の よ う な 培地 中 で 、 通 常 3 7 °C、 5 % 。 0 ₂の 条件下で 好 ま し く は 1 〜 7 日 間、 よ り 好 ま し く は 1 〜 5 日 間、 と く に好ま し く は 1 〜 3 日 間培養す る こ と に よ り 、 免疫抑制性細胞が え ら れ る 。

免疫抑制性細胞 は 固定系 に お い て誘導 さ れ る た め 、 通 常 の 方法、 た と え ば培養器 を や や 強 く 振 と う す る こ と に よ っ て遊離 さ れ、 回 収 さ れ る 。

本発 明 で誘導 さ れ た 免疫抑制性細胞の投与経路 は 限定 さ れ な い が、 カ テ ー テ ル な ど の 医療器具を 用 い 、 全身 ま た は局所 に 投与 さ れ る の が望 ま し い。

投与 さ れ る 細胞量 と し て は 、 投与 の 目 的、 す な わ ち 疾 病の 種類 お よ び投与す る 患者の 症状 の 程度 に よ っ て も 異 な る が、 成人一 日 あ た り 細胞数 と し て 1 0 ⁶〜 5 x 1 0 ⁸ 個 、 好 ま し く は 1 0 ⁶〜 1 0 ⁸個 、 と く に 好 ま し く は 1 0 ^Q個 で あ る 。

本発明 の 免疫抑制性細胞 の 誘導法 は 、 簡便 に かつ 効率 的 に 免疫抑制性細胞 を 誘導す る 方 法 を 提供す る も の で 、 種 々 の 自 己免疫疾患や 臓器移植 の 拒絶反応 の 抑制 を 目 的 と し た治療 に お い て、 副作用 が少 な く かつ 効率的 な 方法 を 提供す る も の で あ る 。

以下 に 実施例 を あ げ て 本発明 を さ ら に 詳 し く 説明す る が、 本発明 は かか る 実施例 の み に 限定 さ れ る も の で は な い o

参考例 1

抗 C D 2 抗体 T S 2 Z 1 8 の F ( a b ) 。断片の 調製

l O m g Z m l ( P B S ) の 濃度 の T S 2 1 8 ( A T C C ( A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l 1 e c t i o n ) ： H B 1 9 5 ) 抗体溶液 l m 1 を 2 0 m M酢酸緩衝液、 p H 4 . 5 、 2 0 0 m l に 対 し て一晚透析 し た。 透析後、 サ ン プ ル を あ ら か じ め 2 0 m M酢酸緩衝液で平衡化 し た ペ プ シ ン 固定化担体 （ ピ ア ー ス （ P I E R C E ) 社製） 0 . 2 5 m l に 加え 、 強 く 振 と う し な 力く ら 、 3 7 °C で 4 時間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た。 そ の の ち 、 1 0 m Mの T r i s — H C 1 、 p H 7 . 5 、 1 . 5 m l を 添加 し て 反 応 を 停止 さ せ た 。 生 成 し た F ( a b ) ₂断片 を ゲ ル濾過 カ ラ ム （ カ ラ ム ： セ フ ア タ リ ル S — 2 0 0 、 フ ア ル マ シ ア社製、 溶媒 ： P B S 、 流速 ： 0 . 6 m 1 m i n ) に よ り 分離 し た。

施例 1

ヒ ト 末梢血細胞を プ ラ ス チ ッ ク 系 プ レ ー 卜 力、 ら な る 培養 具 を 用 い て 培養 す る こ と に よ る 免疫抑制性細胞の 作製 正常 な ヒ ト か ら 採 取 し た 末 梢 血 力、 ら 、 1 0 v / V %

(以下、 1 0 % と い う ） の オ ー ト ロ ー ガ ス 血清 を 含 む R P M I - 1 6 4 0 ( シ グ マ 社 製 ） を 用 い て 1 • 5 X 1 0 ' m 1 の 正常 ヒ ト 末 梢 血細 胞 懸 濁 液 を 調製 し ゝ 9 6 穴 E L I S A プ レ ー ト （ コ ス タ ー （ C o s t a r ) 社 製 ) に 各 1 0 0 μ 1 ずつ 計 2 0 穴 に 播種 し 培養 を 開始 し た ( a ) 。 別 の 2 0 穴 に は P B S を 用 い あ ら か じ め G M

C S F ( ア ー ル デ ィ · シ ス テ ム ズ （ R D S y s t e m s ) 社製） お よ び I L — 2 (べ ク ト ン · デ イ ツ キ ン ソ ン 社製 ) を そ れぞれ l O n g Z m l お よ び 2 0 U / m 1 の 濃度 で コ ー テ ィ ン グ し た も の （ b ) 、 参考例 1 で調製 し た 抗 C D 2 抗体 T S 2 Z 1 8 の F ( a b ) ₂断 片 （以 下、 入手方 法同様） を 1 0 /z g Z m l で コ — テ ィ ン グ し た も の ( c ) 、 抗 C D 3 抗体 （ O K T 3 ) ( ォ ー ス · ダ ィ ァ グ ノ ス テ ィ ッ ク · シ ス テ ム · イ ン ク （ O r t h D i a g n o s t i c S y s t e m I n c . 社製、 以下、 入手先 同様） 単独 を l O g Z m l ( d ) で コ ー テ ィ ン グ し た も の 、 1 0 〃 g / m 1 の 抗 C D 3 抗体 お よ び 1 0 u g Z m l の 抗 C D 2 抗体 T S 2 Z 1 8 ( A T C

C ： H B 1 9 5 ) を コ ー テ ィ ン グ し た も の （ e ) 、 ま た は 1 0 u g Z m l の 抗 C D 3 抗体 と 1 1 の 抗 C D 2 抗体 T S 2 Z 1 8 F ( a b ) ₂断 片 を 同 時 に コ ー テ ィ ン グ （ 4 °C 、 一晚） し た も の （ ί ) を P B S で洗浄 し た の 6 / ち に 、 前述 の 細胞数 よ り 少 な い 1 . O x ] 0 m 1 の 正常 ヒ ト 末梢 血細胞懸濁液を 1 0 0 〖 添加 し 、 培養 を 開始 し た。 5 % C O ₂イ ン キ ュ ベ ー タ 一 中 、 3 7 °C で 7 日 間 の 培養の の ち 、 ピ ベ ッ テ ィ ン グ操作で細胞 を 回収 し 、 3 回 P B S で洗浄 し た の ち に 同細胞を 1 0 % の オ ー ト ロ ー ガ ス 血清 を 含 む R P M I 一 1 6 4 0 培地 に 3

6

X 1 0 m 1 に な る よ う に 懸濁 し た

比較例

通常の 培養器具 に お け る サ イ ト カ イ ン お よ び抗体 の コ ー テ ィ ン グ お よ び培養

培養器 を 通常 の 9 6 穴培養 プ レ ー ト （ コ 一 二 ン グ （ C

0 R N I N G ) 社製） に か え た ほ か は 実施例 1 と 同様 に コ ー テ ィ ン グ を行 な っ た が、 コ ー テ ィ ン グ し た サ イ ト カ イ ン も 抗体 も 洗浄操作 に よ っ て 除去 さ れ た 。

π ― テ ィ ン グを し て い な い 2 0 穴 に つ い て は 実施例 1 の （ a ) と 同様に ヒ ト 細胞を播種 し 培養を行な っ た の ち、 細胞懸濁液 を 調製 し た 。

試験例 1

ヒ ト 末梢血細胞 よ り え ら れ た 免疫抑制性細胞 に よ る 抗原 ( P P D ) 特異的 T 細胞活性化反応の 抑制

正常 な ヒ ト か ら 採取 し た 末梢血か ら 、 1 0 % の オ ー ト ロ ー ガ ス 血清 を 含む R P M I — 1 6 4 0 ( シ グ マ 社製） を 用 い て 1 X 1 0 m 1 の 正常 ヒ ト 末 梢 血細胞 懸 濁 液 を 調製 し 、 9 6 穴丸底 プ レ ー ト （ コ 一 二 ン グ社製） に 1

0 0 / 1 ずつ 分注 し た。 各 ゥ ヱ ル に P P D ( 日 本 ビ ー ン 一 ジ 一製造 （株） 製） を終濃度 l / g Z m l に な る よ う に 加 え 、 同 時 に 、 実施例 1 で え ら れ た （ a ) 力、 ら （ f ) の 細胞を 1 0 % の ォ ー ト ロ ー ガ ス 血清を 含 む R P M I 一

1 6 4 0 培地 に 懸濁 し 、 ゥ エ ル あ た り 0 . 2 5 x 0 お よ び Zま た は 0 . 5 X 1 0 ⁵個 を 含 む 細 胞 懸 濁 液 各 3

0 β I を 同 ゥ ヱ ル に 添 力 α し 、 5 日 間 培 養 し た （ 5 % C 0 イ ン キ ュ ベ ー タ 一 中 、 3 7 °C ) 。 そ の の ち 、 1 /

2

C i の [ ³ H ] チ ミ ジ ン を 各 ゥ ヱ ル に 添 加 し 、 1 5 時 間 培養 し た の ち に 細胞 を セ ル ハ ー べ ス タ ー （ ラ ボマ ッ シ ュ

( し A B 0 M A S H ) 、 ラ ボサ イ エ ン ス （ L A B O

S C I E N C E ) 社製） を 用 い て 集 め 、 そ の 細胞 中 に取 り 込 ま れ た ³ H の 放射活性 を シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ 一 L S C — 7 0 0 ( ァ ロ カ （ A l o k a ) 社製） を.用 い て 測定 し た 。 ポ ジ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル と し て 、 実施例 1 の 細胞を 加 え る か わ り に 、 3 0 1 の 1 0 % の ォ 一 卜 口 一 ガ ス 血清 を 含 む R P M I 一 1 6 4 0 培地 を 加 え た ゥ ヱ ル を 測定対象 と し た。

そ の 結果、 図 3 〜 6 に 示 し た よ う に 、 P P D — T細胞 活性化系 に 供せ ら れ た ヒ ト 細胞 に 対 し て 、 そ の 4 分の 1 ま た は 2 分の 1 量の 実施例 1 の （ a ) で処理 し た 細胞 を 加 え る こ と に よ り 、 約 3 0 % の 抑制 を 示 し た （図 3 ) 。 実施例 1 の （ b ) の サ イ ト カ イ ン 存在下 で 処理 し た ば あ い は約 5 5 % の 抑制 （図 4 ) 、 実施例 1 の （ c ) の 処理 で約 2 0 %の 抑制 （図 5 ) 、 実施例 1 の （ d ) 、 ( e ) お よ び （ f ) で は そ れ ぞ れ約 5 0 %、 6 7 %、 7 8 %の 抑制 を 示 し た （図 6 ) 。

比較例 1 で え ら れ た細胞 は 、 前記 と 同様 に 培地 に 懸濁 し 、 ゥ ヱ ノレ あ た り 1 . 0 x 1 0 ⁵お よ び 0 . 5 x 1 0 ⁵個 を 含む細胞懸濁液各 3 0 β 1 を 同 ゥ エ ル に 添加 し 前記 と 同様 し た。

そ の 結果 は そ れ ぞれ約 — 5 0 %お よ び約 — 3 0 % の抑 制 を 示 し た 。 す な わ ち 、 通常 の 培養器具 で ヒ ト 細胞 を培 養 し て も 免疫抑制性細胞の 誘導 は認 め ら れず、 かえ っ て 免疫反 応 を 几進 し た 。

参考例 2

抗 ヒ 卜 C D 2 抗体 の 作製

抗 ヒ 卜 C D 2 抗体 は 、 （ a ) ヒ ト T 細胞株 ジ ャ ー カ ツ 卜 細胞 （ A T C C T I B ( チ ュ ー モ ア ィ ム ノ ロ ジ ー バ ン ク （ u m o r I m m u n o l o g y B a n k )

) 1 5 2 ) よ り 調製 し た C D 2 蛋 白 を ( b ) マ ウ ス に 免 疫 し 、 え ら れ た ハ イ プ リ ド ー マ を （ c ) 同 C D 2 蛋 白 を 用 い た E L I S A を 行 う こ と に よ り 抗 C D 2 抗体 を 産生 す る も の を 選択 し た 。 以下 に そ の 手順 を 示 す。

( a ) ジ ヤ ー カ ツ ト 細胞 力、 ら の C D 2 蛋 白 の 調製

、

刖 記 ジ ヤ ー カ ッ ト 細胞 ク ロ ー ン 5 . 8 < 1 0 ⁸個 を 1 0 % F C 5 ( ゥ シ 胎児血清 （ F e t a l C a l f S e r u m ) ) を 含 む R P M I — 1 6 4 0 ( シ グ マ 社製） 2 5 0 0 m l で 3 7 °C 、 5 % C 0 ₂イ ン キ ュ ベ ー タ 一 中 で Ί X 1 0 ⁵Z m l ま で培養 し 、 1 . 7 5 X 1 0 ⁹個 の 細 胞 を 1 回 の 精製 に 用 い た。 細胞 は 溶解用 緩衝液 （ 0 . 0 1 M T r i s - H C 1 ( p H 8 . 0 ) 、 0 . 1 5 M N a C 1 、 1 % ト リ ト ン （ T r i t o n ) X - 1 0 0 、 丄 m M ョ 一 ド ア セ ト ア ミ ド （ シ グ マ 社製） 、 1 m M P M S F ) 4 0 m 1 に 懸濁 し 、 4 °C で 1 時間 ミ ニ デ ィ ス ク p ― 夕 一 ( バ イ オ ク ラ フ ト 社製） で処理 し た。 つ ぎ に 3 6 1 5 G で 1 5 分間、 室温 に て遠心後、 N a D 0 C ( デ ォ キ シ — ノレ酸 ナ ト リ ウ ム S o d i u m d e o x y c h 0 1 a t e ) ； シ グ マ 社製） を終濃度 0 . 5 % に な る よ う に 添加 し 、 超遠心 に て上清 を取得 し た （ 1 5 8 0 0 0 G 、 6 0 分、 4 °C ) 。 以上の よ う に し て え ら れ た サ ン プ ノレ を ジ ャ ー カ ツ ト 精製上清 と し て 抗体 カ ラ ム で の 精

¾ς { ^έ し ο

抗体 カ ラ ム は ァ フ ィ ゲ ル 1 0 ( バ イ オ ラ ッ ド社製） を 担体 と し 、 抗 C D 2 抗体 T S 2 Z 1 8 ( A T C C H B 1 9 5 ) を固定化 し た も の を用 い た （ l m g Z m 1 ゲ ル） 。 前記固定化 ゲ ル 5 m l を 入れ た ェ コ ノ カ ラ ム （ ø ： 1 c m、 高 さ ： 1 0 c m オ ラ ッ ド社製） に 前記サ ン プ ル を 充頃 し （ l m l / m i n ) 、 P B S 5 0 m 1 で洗 浄後、 溶 出 用 緩衝液 （ 0 . 1 M ク ェ ン 酸三 ナ ト リ ウ ム ( p H 3 ) ) 1 0 0 m 1 で溶 出 し た 。 溶 出 サ ン プ ル は 中 和用 緩衝液 （ 1 M T r i s - H C 1 ( H 1 1 ) ) で 中性 p H に し た。

溶出 サ ン プ ル は透析 カ セ ッ ト （ ピ ア ス （ P I E R C E ) 社製） に よ っ て P B S に 置換 し 、 蛋 白 定量を 実施 し た。 そ の 結果、 約 1 5 0 ^ g の C D 2 蛋 白 が え ら れた こ と が 確認 さ れ た 。 さ ら に 免疫用 抗原 は P E G 2 0 0 0 0 ( ヮ コ ゥ （ W A K O ) 社製） で精製 し た も の を 用 い た 。

( b ) C D 2 蛋 白 の マ ウ ス へ の 免疫 と ハ イ ブ リ ド ー マ の 分離

前記 （ a ) で え ら れ た 精製 ヒ ト C D 2 を 完全 ア ジ ュ ' ン ト タ イ タ ー マ ッ ク ス （ T i t e r M A X ) ( サ イ ト ア ー ル エ ッ ク ス （ C y t R X ) 社製） と と ち に B a l b Z c マ ウ ス （ 日 本 S L C 社 よ り 入手） 5 週 令 の 腹膣 内 に 1 週間 間隔で計 4 回 注射 し た （ 2 5 g / 1 回 / マ ウ ス ） 。 免疫 さ れ た マ ウ ス 中 に 産生 さ れ た 抗体 に つ い て C D 2 蛋 白 を コ ー テ ィ ン グ し た プ レ ー ト を 用 い た E L 1 S A 法 に よ り タ イ タ ー 確認 （充分 な 抗体価が え ら れ て い る かの 確認） を行 っ た の ち に 、 前記 マ ウ ス よ り 脾臓を 摘 出 し 、 I M D M ( シ グ マ 社製） Z 1 0 % F C S 培地で脾 細胞懸濁液 1 5 m 1 を調製 し た 。 つ ぎ に 、 同懸濁液を 室 温 で 1 0 0 0 r p m、 1 0 分 間遠心 し 、 細胞 を 回収 し 、 0 . 1 7 M N H C 1 を 1 O m 1 添 加 し 、 赤 血 球 を 溶 解 さ せ た。 再度前記 と 同様 に 遠心 し 、 I M D M 0 % F C S 培地 1 0 m 1 に 懸濁 し 1 X 0 ^u個 の 脾 細 胞 溶 液を 調製 し た

ハ イ プ リ ド一マ は 前記脾細胞 と マ ウ ス ミ エ ロ ー マ 細胞 S P 2 / 0 — A g 1 ( A T C C C R L ( セ ノレ リ ポ ジ ト リ ー ラ イ ン ズ （ C e l l R e p o s i t o r y L i n e s ) ) 1 5 8 1 ) を 使用 し た， I M D M培地 で洗浄 し 、 最終的 に 2 ~ 3 1 0 '個の細胞を調製 し た。

細胞融合 は 、 脾細胞 と ミ エ ロ ー マ を 5 ： 1 (脾細胞 1 X 1 0 ⁸個、 ；： エ ロ ー マ 2 X 1 0 ⁷個） で混 合 し 、 室温 で 1 0 0 0 r p m、 5 分間遠心 し 回収 し た 。 3 0 m l の I M D M培地 で洗浄後、 5 0 % P E G 1 5 0 0 (ベ ー リ ン ガ ー マ ン ノヽ ィ 厶 社製） 2 m 1 を 徐 々 に 力 α え 、 つ ぎ に 1 分 間激 し く 振 と う し な 力く ら 4 m 1 の I M D M培地 を ゆ つ く り （ 2 分間） 添加 し た 。 さ ら に 1 6 m l の I M D M培地 を 2 〜 3 分か け て添加 し 、 再度前記 と 同様 に 遠心 し ism 、 TO 胞 を 回収 し た。 つ ぎ に 5 % ブ ラ イ ク ロ ー ン （大 日 本製薬 社製） — H A T ( ギ ブ コ ビ ー ア ー ノレ エ ル （ G I B C 0 B R L ) 社製） 一 I M D M Z 1 0 % F C S 培地 に 懸衝 し 、 3 x 1 0 ⁶/ m l の 細胞 液 を え た 。 同 細胞 を 9 6 穴 平底 プ レ ー ト ( イ ワ キ （ I W A K I ) 社製） に 1 0 0 β 1 / ゥ ヱ ル ずつ 播種 し た 。 3 7 °C 、 5 % C O 。イ ン キ ュ ベ ー タ 一 中 7 日 培養 し た の ち 、 H T (ギ ブ コ （ G I B C

0 ) 社製） 一 I M D M / 1 0 % F C S 培地 に 交換 し 、 以 後 3 日 お き に 培地 交 換 し 、 ハ イ プ リ ド ー マ を 分離 し た 。

( c ) 抗 C D 2 抗 体 産生 ハ イ プ リ ド ー マ の 選 択

前記方 法 （ a ) で 調製 し た ヒ 卜 C D 2 溶 液 （ 5 g Z m 1 P B S ) を ゥ ヱ ル あ た り 5 0 ju l 加 え 、 4 °C、 一晩、

9 6 穴 E L I S A プ レ ー ト （ コ ス タ ー 社製 ） に コ ー テ ィ ン グ し た。 P B S / 0 . 0 5 % ト ウ ィ ー ン （ T w e e n )

2 0 で 洗 浄 後 、 ブ ロ ッ ク エ ー ス （ ナ カ ラ イ テ ッ ク 社 製 ） の 4 I口 A釈 液 で 2 時 間 、 室 温 で ブ ロ ッ キ ン グ処理 し た 。

P B s / 0 . 0 5 % ト ウ ィ ー ン 2 0 で 洗 浄 後 、 ハ イ プ リ ド一 マ 培 養 上 清 を ゥ ヱ ル あ た り 5 0 1 添力 Π し 、 室 温 で 1 時 間放 置 し た 。 P B S Z 0 . 0 5 % 卜 ウ ィ ー ン 2 0 で 洗 、净後、 H R P ( ホ ー ス ラ デ ィ ッ シ ュ ペ ル ォ キ シ ダ ー ゼ

( H 0 r s e R a d i s h P e r o x i d a s e ) ; の 抗 マ ウ ス I g G 抗体 （ カ ッ ペ ル （ C a p p e 1 ) 社製 ) の 1 0 0 0 倍 希釈 液 を 添加 し 、 1 時 間 、 室 温 で お の ち に P B S Z 0 . 0 5 % ト ウ ィ ー ン 2 0 で洗浄 し 、 発 色 液 （ 0 — フ エ 二 レ ン ジ ァ ミ ン U ( p h e n y 1 e n e d 1 a m i n e t a b l e t ) ( シ グ マ 社製） 1 0 m g と H ₂o ₂を 1 0 β 1 を ク ェ ン 酸 リ ン 酸緩 衝 液 に 溶解 し た も の ) を 1 0 0 1 添 加 し 、 1 0 分 間 反 応後 、 発 色 す る ク □ 一 ン を 抗 C D 2 抗 体産生ハ イ プ リ ド ー マ と し て 選択 し た

実施例 2

抗体 固定化 プ ラ ス チ ッ ク 系 プ レ ー 卜 で 培 養 し た ヒ ト 末梢 血細 胞 の 調 製

考 例 2 で え ら れ た ハ イ ブ リ ド ー マ の う ち E L I S A の 反 応性 の 高 か っ た ク ロ ー ン 7 株 に つ い て 無 血清培地 で

3 7 °C、 5 % C 0 ₂イ ン キ ベ ー タ 一 中 ₄ 日 間 培 養 し 、 各 々 抗体含有培養液 を え た 。 つ ぎ に こ れ ら 各 々 の 抗体含 有培養液 と 抗 C D 2 抗体 T S 2 Z 1 8 を 9 6 穴 E L I S

A プ レ ー ト （ コ ス タ ー 社 製 ） の 2 0 穴 に コ ー テ ィ ン グ

(各 ク ロ ー ン の 培養 液 1 0 / 1 と 0 . 5 // g の T S 2 Z

1 8 を 各 ゥ ヱ ノレ に 入 れ 1 晚 4 °C で放置） し た。 そ の の ち

P B S で洗 浄 し 、 1 0 % の オ ー ト ロ ー ガ ス 血清 を 含 む R

P M I — 1 6 4 0 ( シ グ マ 社 製 ） で 1 . 0 X 1 0 ⁶ Z m 1 の 濃度 に 調製 し た 正常 ヒ ト 末梢血細胞懸濁液を 各 ゥ ニ ル 1 0 0 1 ずつ 播種 し た。 ま た 0 . 5 u g の T S 2 / 1 8 の み を コ 一 テ ィ ン グ し た も の 2 0 穴 あ る い は な に も コ 一 テ ィ ン グ し て い な い 2 0 穴 に も 同 じ く 前記細胞懸濁 液を 1 0 0 1 播種 し た 。 3 7 °C、 5 % C 0 ₂イ ン キ ュ ベ ー タ — 中 で 7 日 間培養 し た の ち 、 各 2 0 穴の 細胞 を 回 収 し 、 3 回 P B S で 洗浄 し た の ち に 同細胞 を 1 0 %の ォ 一 ト ロ 一ガ ス 血清 を 含 む R P M I — 1 6 4 0 培地 （ シ グ

6

マ 社製 ) に 3 X 0 m 1 に な る よ う に 懸濁 し た。

試験例 2

前言己 の 固定化抗体で処理 し た細胞 の 抗原 （ P P D ) 特異 的 τ 細胞活性化反応 の 抑制能の 評価

1 0 % の ォ 一 ト ロ ー ガ ス 血清 を 含 む R P M I — 1 6 4

0 ( シ グ マ 社製） で 1 X 1 0 V m 1 の 濃 度 に 調 製 し た 正常 ヒ ト 末梢血細胞 を 9 6 穴丸底 プ レ ー ト （ コ 一 二 ン グ 社 製 ） に 1 0 0 / 1 ず つ 分 注 し た 。 各 ゥ ヱ ル に P P D ( 曰 本 ビ ー シ ー ジ 一製造 （株） 製） を終濃度 1 g Z m

1 に な る よ う に 加え 、 同 時 に 、 実施例 2 で 調製 し た細胞 を ゥ ェ ル あ た り 1 0 ⁵個 を 含 む 細胞 懸 濁 液 各 3 0 β 1 を 同 ゥ ル に 添力□ し 、 5 日 間 培 養 し た （ 5 % C 0 ₂イ ン キ ュ ベ ー タ ー 中 、 3 7 °C ) 。 そ の の ち 、 1 / C i の [ ³H ] チ ミ ジ ン を 各 ゥ ュ ル に 添カ卩 し 、 1 5 時間培 養 し た の ち に 細胞 を セ ルノヽ 一べ ス タ 一 （ ラ ボ マ ッ シ ュ 、 ラ ボ サ イ ェ ン ス 社製） を 用 い て集 め 、 そ の 細胞 中 に 取 り 込 ま れ た ³ H の放射活性 を シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ ー L S C — 7 0 0 ( ァ ロ 力 社製 ) を 用 い て 測定 し た 。

そ の 結果、 図 7 に 示 し た よ う に 、 7 ク ロ ー ン の う ち 4 ク ロ ー ン ( S 3 1 A 2 N 0 1 、 S 3 2 D 7 N 0 9 、 S 3

3 H 2 N 0 1 0 お よ び L 1 2 A 9 N 0 2 2 ) が T S 2 / 1 8 と の 組み 合 わ せ の 系 で 処理 さ れ た 細胞 が、 有意 に P P D - T 細胞活性化反応 を 抑制す る こ と 力 < わ か っ た 。 そ の 抑制度 は S 3 1 A 2 N 0 1 ( 4 7 % ) . S 3 2 D 7 N 0 9 ( 2 9 % ) 、 S 3 3 H 2 N 0 1 0 ( 7 4 % ) 、 L 1 2 A 9 N 0 2 2 ( 3 4 % ) で と く に ク ロ ー ン S 3 3 H 2 N 0 1 0 を 用 い た 系 で 強 い 免疫抑制性細胞 の 誘導が観察 さ れ た 。 な お、 本実験 は n = 2 で実施 し 、 図 中 の 値 は そ の 平均値 で あ る 産業上の 利 用可能性

本発明 に よ れ ば、 固定培養 に よ り 効率 よ く 免疫抑制性 細胞 を誘導 し 、 免疫系 の 異常亢進 を と も な う 疾患 の 効率 的 で副作用 の 少 な い 治療 シ ス テ ム を 提供す る こ と が で き

Ό o

Claims

請 求 の 範 囲

1. 蛋 白 質 に 親和性 を 有す る 培養器具で ヒ ト 細胞 を培養 す る こ と に よ る 免疫抑制性細胞 の 誘導方法。

2. あ ら か じ め 1 種以上の 細胞表面抗原 に 対す る 抗体 ま た は サ イ ト カ イ ン を コ 一 テ ィ ン グ し た培養器具 を用 い る 請求 の 範囲第 1 項記載の 誘導方法。

3. 細胞表面抗原 に 対す る 抗体で あ り 、 異 な る ェ ピ ト ー プを 認識す る 2 種以上 の 抗体 を コ ー テ ィ ン グ し た.培養 器具 を 用 い る 請求 の 範囲第 1 項記載の 誘導方法。

4. 1 種以上 の 細胞表面抗原 に 対す る 抗体 ま た は サ イ ト カ イ ン と ヒ ト 細胞 と を 添加 す る 請求 の 範囲第 1 項記載 の 誘導方法。

5. 細胞表面抗原 に 対す る 抗体で あ り 、 異 な る ェ ピ ト ー プを 認識す る 2 種以上の 抗体 と ヒ ト 細胞 と を添加す る 請求の 範囲第 1 項記載の 誘導方法。

6. 細胞表面抗原 に 対す る 抗体が抗 C D 2 抗体 ま た は 抗 C D 3 抗体で あ る 請求 の 範囲第 2 項、 第 3 項、 第 4 項 ま た は 第 5 項記載の 誘導方 法。

7. 細胞表面抗原 に 対す る 抗体が抗 C D 2 抗体で 、 C D 2 の L F A — 3 と の 結合 に 関与す る 部分 と 結合す る 請 求の 範囲第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項 ま た は 第 6 項記載の 誘導方法。

8. 細胞表面抗原 に 対す る 抗体が抗 C D 2 抗体で 、 C D 2 の L F A — 3 と の 結合 に 関与す る 部分以外 と 結合す る 請求 の 範囲第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項 ま た は 第 6 項記載の 誘導方法。

9. 細胞表面抗原 に 対す る 2 種以上の 抗体が抗 C D 2 抗 体で、 C D 2 の L F A — 3 と の 結合 に 関与す る 部分 と 結 合す る 抗体 1 種以上 と L F A - 3 と の 結合 に 関与 し な い 部分 と 結合す る 抗体 1 種以上 と の 組み 合 わ せ で あ る 請求の 範囲第 3 項 ま た は 第 5 項記載 の 誘導方法。

10. 1 種の 細胞表面抗原 に 対す る 抗体 が抗 C D 2 抗体 T S 2 / 1 8 であ る 請求の範囲第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項 ま た は第 8 項記載の誘導方法。

11. 1 種 の 細胞表面抗原 に 対す る 抗体が抗 C D 2 抗体 T 3 2 1 8 の ？ ( a b ) _n断 片 で あ る 請 求 の 範 囲 第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項 ま た は 第 8 項記載の 誘導方法。

12. サ イ ト 力 イ ン カ < I L 一 2 お よ び G M — C S F で あ る 請求 の 範囲第 2 項 ま た は第 4 項記載の 誘導方法。

13. 培養時 に 培地 に 対 し て血清 を 0 . 5 〜 ： L 0 v Z v % 添加す る 請求の範囲第 1 項、 第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項、 第 8 項、 第 9 項、 第 1 0 項、 第 1 1 項 ま た は 第 1 2 項記載 の 誘導方法。

14. 培養時に血清を培地に添加 し な い請求の 範囲第 1 項、 第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項、 第 8 項、 第 9 項、 第 1 0 項、 第 1 1 項 ま た は 第 1 2 項 記載の 誘導方法。

15. 培養期 間が 1 〜 7 日 間 で あ る 請求 の 範囲第 1 項、 第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項、 第 8 項、 第 9 項、 第 1 0 項、 第 1 1 項、 第 1 2 項、 第 1 3 項 ま た は 第 1 4 項記載の 誘導方法。

16. 培養器具が蛋 白 質 に 対 し て親和性 を 有す る 部材か ら な る 請求 の 範囲第 1 項、 第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項、 第 8 項、 第 9 項、 第 1 0 項、 第 1 1 項、 第 1 2 項、 第 1 3 項、 第 1 4 項 ま た は 第 1 5 項記載 の 誘導方法。

17. 培養器具が プ ラ ス チ ッ ク 系 部材か ら な る 請求の 範囲 第 1 項、 第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項、 第 8 項、 第 9 項、 第 1 0 項、 第 1 1 項、 第 1 2 項、 第 1 3 項、 第 1 4 項、 第 1 5 項 ま た は 第 1 6 項 記載の 誘導方法。

18. 培養器具がガラ ス系部材か ら な る 請求の範囲第 1 項、 第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項、 第 8 項、 第 9 項、 第 1 0 項、 第 1 1 項、 第 1 2 項、 第 1 3 項、 第 1 4 項、 第 1 5 項 ま た は 第 1 6 項記載の 誘 導方法。

19. 培養器具 が平板 プ レ ー ト 状閉鎖系容器 ま た は 球形微 粒子を 充壙 し た 閉鎖系容器で あ る 請求の 範囲第 1 項、 第 2 項、 第 3 項、 第 4 項、 第 5 項、 第 6 項、 第 7 項、 第 8 項、 第 9 項、 第 1 0 項、 第 1 1 項、 第 1 2 項、 第 1 3 項、 第 1 4 項、 第 1 5 項、 第 1 6 項、 第 1 7 項 ま た は 第 1 8 項記載 の 誘導方法。

20. ヒ ト 細胞 を 培養す る こ と に よ り 免疫抑制性細胞 を誘 導す る た め に用 い る 蛋白質に親和性を有す る 培養器具。

21. あ ら か じ め 1 種以上の 細胞表面抗原 に 対す る 抗体 ま た は サ イ 卜 力 イ ン を コ ー テ ィ ン グ し た請求の 範囲第 2 0 項記載 の 培養器具。

22. 細胞表面抗原 に 対す る 抗体で あ り 、 異 な る ェ ピ ト ー プを 認識す る 2 種以上の 抗体 を コ ー テ ィ ン グ し た 請求 の 範囲第 2 0 項記載の 培養器具。

23. 細胞表面抗原 に 対す る 抗体が抗 C D 2 抗体 ま た は 抗 C D 3 抗体 で あ る 請求 の 範囲第 2 1 項 ま た は 第 2 2 項 記載の 培養器具。

24. 異 な る ェ ピ ト ー プ を 認識す る 抗体の 1 種以上が抗 C D 2 抗体 T S 2 / \ 8 で あ る 請求 の 範囲第 2 2 項 ま た は第 2 3 項記載 の 培養器具。