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WO1998007840A1 - Novel dnas and process for producing proteins by using the same - Google Patents

Novel dnas and process for producing proteins by using the same Download PDF

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WO1998007840A1
WO1998007840A1 PCT/JP1997/002859 JP9702859W WO9807840A1 WO 1998007840 A1 WO1998007840 A1 WO 1998007840A1 JP 9702859 W JP9702859 W JP 9702859W WO 9807840 A1 WO9807840 A1 WO 9807840A1
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WO
WIPO (PCT)
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dna
seq
inhibitory activity
protein
osteoclast differentiation
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Application number
PCT/JP1997/002859
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French (fr)
Inventor
Nobuaki Nakagawa
Hisataka Yasuda
Tomonori Morinaga
Original Assignee
Snow Brand Milk Products Co., Ltd.
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to a novel DNA, and a method for producing a protein having an activity of inhibiting osteoclast differentiation and maturation or maturation (hereinafter referred to as an osteoclast formation-inhibiting activity) by genetic engineering using the same. More specifically, the present invention relates to a genomic DNA encoding a protein 0CIF having osteoclast formation inhibitory activity, and a method for producing the protein by a genetic engineering technique using the genomic DNA.
  • Osteoporosis is a typical disease caused by abnormal bone metabolism that these cells are responsible for. This disease is caused by bone resorption by osteoclasts over bone formation by osteoblasts. The mechanism of this disease has not yet been fully elucidated, but it is a disease that causes bone pain and causes fractures due to bone weakness. With the growing elderly population, the disease, which causes bedridden elderly people due to fractures, has also become a social problem, and the development of therapeutics for it is urgently needed.
  • osteopenia caused by abnormal bone metabolism will be treated by suppressing bone resorption, promoting bone formation, or improving the balance between them.
  • Bone formation is expected to be promoted by promoting the proliferation, differentiation and activation of cells responsible for bone formation, or by suppressing the proliferation, differentiation and activation of cells responsible for bone resorption.
  • cytokines bioactive proteins
  • Proliferation or differentiation of osteoblasts As a site-inducing factor, fibroblast growth factor (FGF: Rodan SB et al., Endocrinology vol. 121, pl917. 1987).
  • Insulin-like growth factor [( insulin like growth factor-I; I GF-I: Hock
  • BMP bone morphogenic protein
  • cytokines that inhibit osteoclastogenesis include transforming growth factor-yS (transforming growth factor- ⁇ ; Chenu C. et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, vol.85, p5683,
  • interleukin-4 interleukin-4; asano K. et al., Bone-Miner., Vol. 21, pl79. 1993
  • site-in which suppresses bone resorption by osteoclasts includes calcitonin (calcitonin; Bone-Miner., Vol. 17, p347, 1992), macrophage colony-stimulating factor; Hattersley G. et al. J. Cell.Physiol, vol. 137, pl99, 1988), In Yuichi Leukin-1 4 (Watanabe, K. et al., Biochem. Biophys. Res. pl035, 1990), and interferon-a (Go en M. et al., J.
  • cytokines are expected to improve bone loss by promoting bone formation and suppressing bone resorption, such as insulin-like growth factor-1 and the ectopic bone formation factor family cytokines.
  • Calcitonin has already been marketed as a therapeutic agent for osteoporosis and a pain relieving agent.
  • active vitamin D 3 active vitamin D 3
  • calcitonin and its derivatives hormone preparations such as estradiol, ibriflavone or calcium preparations, etc. It is used.
  • the therapeutic methods using these are not always satisfactory in their effects and therapeutic results, and the development of new therapeutic agents to replace them has been desired.
  • the present inventors have conducted intensive searches and have found that the culture solution of human fetal lung fibroblasts IMR-90 (ATCC deposition-accession number CCL186) already has osteoclast formation inhibitory activity, A protein 0C IF having osteocyte formation inhibitory activity has been found (PCT / JP96 / 00374). Further studies on the origin of the protein having the activity of inhibiting osteoclast formation led to the determination of the nucleotide sequence of the genomic DNA of human-derived OCiF. It is an object of the present invention to provide a genomic DNA encoding a protein having 0CIF, and a method for producing the protein by genetic engineering using the same. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to a genomic DNA encoding a protein 0C IF having osteoclast formation inhibitory activity, and a method for producing the protein by a genetic engineering technique using the same.
  • the DNA of the present invention comprises the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2 in the Sequence Listing.
  • the present invention has the following physicochemical properties by inserting DNAs containing the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2 in the Sequence Listing, and has the following physicochemical properties to inhibit osteoclast differentiation and Z or maturation inhibitory activity. Create a vector that can express a certain protein and use it to The present invention relates to a method for producing the protein by a child engineering technique.
  • FIG. 1 shows the results of Western blotting of a protein obtained by expressing the genomic DNA of the present invention in Example 4 (iii).
  • 1 is a marker
  • 2 is a C0S7 cell culture supernatant transfected with the vector pWESR ⁇ 0F (Example 4 (iii))
  • 3 is a C0S7 cell culture supernatant transfected with the vector pWESR ⁇ (vs. ).
  • the genomic DNA encoding the protein OCiF having the osteoclast formation inhibitory activity of the present invention is prepared by preparing a cosmid library using human placenta genomic DNA and a cosmid vector, and using this library based on the OCIF cDNA. It can be obtained by screening the prepared DNA fragment as a probe. The genomic DNA thus obtained is inserted into an appropriate expression vector to prepare a 0CIF expression cosmid, which is transfected and expressed in a host such as various cells and strains by a conventional method. A recombinant 0CIF can be produced.
  • the obtained protein having osteoclast formation inhibitory activity is used as a pharmaceutical composition for the treatment and improvement of bone loss such as osteoporosis and other disorders of bone metabolism.
  • it is useful as an antigen for establishing an immunological diagnosis of such a disease.
  • the protein of the present invention can be formulated and administered orally or parenterally. That is, the preparation containing the protein of the present invention is safely administered to humans and animals as a pharmaceutical composition containing an osteoclast formation inhibitory factor as an active ingredient.
  • Examples of the form of the pharmaceutical composition include an injection composition, an infusion composition, a suppository, a recruitment agent, a sublingual agent, a transdermal absorption agent, and the like.
  • an injectable composition it is a mixture of a pharmacologically effective amount of the osteoclastogenesis inhibitor of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier, including amino acids, saccharides, cellulose derivatives, and others.
  • An excipient activator generally added to an injectable composition such as an organic compound or an inorganic compound, may also be used.
  • a PH adjuster, a buffer, a stabilizer, a solubilizer, and the like when preparing an injection using the osteoclast formation inhibitor of the present invention and these excipients Z ⁇ active agent, if necessary, a PH adjuster, a buffer, a stabilizer, a solubilizer, and the like.
  • Various injections can be prepared according to a conventional method by adding the same.
  • Cosmid Library was prepared using human genomic DNA (Clonetech; Cat. No. 6550-2) and pWE15 Cosmidobek Yuichi (Stratagene). Basically, the procedure was performed according to the protocol attached to Strawe Gene's pWE15 cosmid vector kit. However, a specific method for treating DNA, E. coli, and phage is described in Molecular Cloning: A Laboratory Manua Cold Spring. Harbor boraton (1989)).
  • the E15 cosmid vector was ligated in a 20-1 reaction solution using a Pharmacia Ready-To-Go T4 DNA ligase.
  • the ligated DNA was packaged in vitro using a Gigapack II packaging extract (Stratagene) according to the protocol.
  • Bl ue MR sin Cikinase
  • a part of the reaction solution was serially diluted with SM buffer
  • E. coli was suspended in LOMM MgCl 2 XL1
  • the cells were plated on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / ml ampicillin, and the number of resulting colonies was counted. Based on the results, the number of colonies per 1 packaging reaction solution was calculated.
  • Escherichia coli XL1-Blue MR was mixed with the packaging reaction solution prepared by the above method, and plated on an agarose plate containing ampicillin so that 50,000 colonies per agarose plate having a diameter of 15 cm. After incubating the plate at 37 ° C overnight, 3 ml of LB medium was added per plate to suspend and collect E. coli colonies. The agarose plate was washed once more with 3 ml of LB medium and combined with the original E. coli suspension. E. coli collected from all agarose plates were collected in a single centrifuge tube, glycerol was added to a concentration of 20%, and ampicillin was further added to a concentration of 50 zg / ml. After thorough mixing, aliquot and keep the rest at 80 ° C. Existed. The collected E. coli was serially diluted and plated on an agar plate, and the number of colonies per 1 ml was calculated.
  • nitrocellulose fil (Millipore) on a 15 cm diameter LB agarose plate containing SO g / ml ampicillin, and place 50,000 E. coli colonies per plate on top of it.
  • the cosmid library was sown so as to cause the incubation, and incubated at 37 ° C overnight.
  • E. coli on the Nitrocellulose Filler was transferred to another nitrocellulose filter according to a conventional method to prepare two replica fills. According to the protocol attached to the Cosmid Vector Kit, E. coli on the replica filter was denatured and neutralized, and the DNA was fixed on the nitrocellulose filter using Strata Linker (Strata Gene). did. The filter was further heated in a vacuum oven at 80 ° C for 2 hours.
  • the nitrocellulose filter thus treated was hybridized as a probe with two types of DNAs prepared from the 5 'end and 3' end of human OClF cDNA.
  • plasmid was purified from Escherichia coli pBKAHF! O containing OC IFcDNA (deposited at the National Institute of Bioscience and Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry, accession number FERM BP-5267), and the plasmid containing OCIFcDNA was purified with the restriction enzyme Kpnl. After digestion with EcoRI, the resulting fragment was separated using an agarose gel, and the 0.2 kb ⁇ / ⁇ coRI fragment was purified using QIAEX 1 [Gel Extraction Kit (Qiagen)].
  • the DNA was labeled with 3 2 P using Megaprime DNA Raberi ring system (Amersham) (5 '- DNA probes). Separately, the resulting plasmid was purified similarly BamHl / EcoRV off Ragumen city of 0. 2 kb generated by digestion with the restriction enzymes EcoRV restriction enzyme BamHI, and 3 2 P-labeled by the above method (3 '- DNA probe).
  • One of the above replica filters was hybridized with a 5'-DNA probe, and the other was hybridized with a 3'-DNA probe. Colony hybridization and washing of the filters follow the procedures described in the protocol attached to the Cosmid Vector Kit. I went.
  • a purified colony was isolated by purifying a colony on an agar mouth plate corresponding to this signal.
  • Cosmid was purified from the purified colony according to a conventional method, and named pWE0C [F. The size of the human genomic DNA contained in this cosmid was approximately 38 kb.
  • the cosmid pWEOCIF is digested with the restriction enzyme EcoRl, the resulting fragment is separated on a 0.7% agarose gel, separated, and the DNA is applied to a nylon membrane (Hybond-N, Amersham) by the Southern blot method. The DNA was transferred and immobilized on a nylon membrane using Stratalinker-1 (Stratagene).
  • the plasmid pBKOC is digested with the restriction enzyme EcoR ⁇ , and a 1.6 kb fragment containing human 0C [FcDNA] is isolated using an agarose gel, followed by megaprime DNA labeling system (Amersham). and 3 2 P-labeled using.
  • expression plasmid pcDL-SR 296 (Molecular and Cellar Biology, vol. 8, P466-472, 1988) ) was inserted.
  • the expression plasmid pcDL-SR296 was digested with the restriction enzyme SalI, and an approximately 1.7 kb expression unit containing the SR hypromo overnight, the SV40 late splice signal, and the poly (A) additional signal was cut out.
  • purification was performed using a QIAEX II gel extraction kit (Qiagen).
  • cosmid vector PWE15 was digested with restriction enzyme EcoRi, separated by agarose gel electrophoresis, and 8.2 kl) of pWE DNA was purified using QIAEX II Gel Extrusion Kit (Qiagen). The ends of these two DNA fragments were blunted using a DNA blunting kit (Takara Shuzo), ligated using a DNA ligation kit (Takara Shuzo), and introduced into Escherichia coli DH5a (Gibco BRL). The resulting transformant was grown and the expression cosmid PWESR containing the expression unit was purified using a Qiagen column (Qiagen).
  • the pWESR human EcoRI-Xmni-Notl adapter (# 1105, # 1156; New England Biolabs) digested with this restriction enzyme EcoRI was ligated using T4 DNA ligase (Takara Shuzo) and freed by agarose gel electrophoresis. After separation from the adapter, purification was carried out using Q1AEX II Gel Extrusion Kit (Qiagen). Approximately 37 kb of 0F genomic DNA digested with the restriction enzyme Not 1 and pWESR ligated with an adapter were ligated using T4 DNA ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.). In vitro packaging was carried out using Ichigo Gene and infected with E.
  • recombinant 0CIF was expressed by the method described below, and its activity was measured. 8 X10 5 COS-7 cells (RIB Cell Bank, RIKEN, RCB0539) were added to each well of a 6-well plate using DMEM medium (Gibco BRL) containing 10% fetal bovine serum (Gibco BRL). After inoculation, the next day, the medium was removed, and the cells were washed with serum-free DMEM medium.
  • 0CIF activity was measured by the method of Masayoshi Kumegawa (proteins, nucleic acids, Enzyme Vol. 34, p999 (1989)) and the method of Takahashi N. et. Al (Endocrihology vol. 122, pi 373 (1988)).
  • the activity of the active protein (0CIF) was taken as the activity.
  • each Ueru 96 ⁇ Weru microplate placed in the sample 100/1 diluted with flying one MEM medium (Gibco BRL) containing 2 10- 82 of activated vitamin D 3 and 10% fetal calf serum
  • flying one MEM medium Gibco BRL
  • activated vitamin D 3 Approximately 3 x 10 5 mouse bone marrow cells about the day after birth were suspended and seeded in 100% 1% MEM medium containing 10% fetal bovine serum, and seeded at 5% CO 2 , 37 and 100% humidity. Cultured for a week. On the third day and the fifth day of culture, discards 160/1 of culture solution, 1 X 10- 8 M active-form vitamin D 3 and Fukumuhi 10% fetal bovine serum - sample 160 diluted in MEM medium 1 was added.
  • COS— OC IF activity in culture expressed in 7 cells Dilution ratio 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320
  • the previously obtained 0CIF protein was incubated at 37 ° C for 2 hours together with a horseradish oxidase-labeled anti-OCIF antibody labeled with horseradish oxidative oxidase in a conventional manner. .
  • proteins bound to anti-0CIF antibody were detected using the ECL system (Amersham). As shown in FIG. 1, two bands of a molecular weight of about 120 kDa and a band of 60 kDa were detected in the culture supernatant of COS-7 cells transfected with pWESR / 0CIF.
  • a genomic DNA encoding a protein 0CIF having osteoclast formation inhibitory activity, and a method for producing the protein by genetic engineering using the same.
  • the protein obtained by expressing the gene of the present invention has osteoclast formation inhibitory activity, and has bone loss such as osteoporosis, a bone metabolism disorder such as rheumatism or osteoarthritis, or a multiple bone marrow tumor Treatment of bone metabolism disorders such as It is useful as a pharmaceutical composition for the purpose of improvement or as an antigen for establishing an immunological diagnosis of such a disease.
  • genomi c DNA human OC IF genome DNA-1
  • VOV IVV VOO 0V9 V33 30V VO OVIO OOIUIVIOO 113011VVV1 3V100VV0V0 69 9V0111V0DV VVOOOIOOIO 1V3000V0VV 1101010VVV V33111310V VVV010VVD3 60 VVVVV10V39 V10V1VVIV3 VV30101111 OVOVIDOIVV VV91VVVV0 10VV01VV13 6 1013110111 10VV901001 V91V0000VV V30013VVV9 V99V00VV3V 11V00111V3 68 OllOVOllVV VVOVODVVIO 0V1D11U03 OVOlVOlllV 3V01010011 1331113113 QZZ ⁇ 33VI333V3V VOIVVIOVOO 1300V0000V 010V030I3V I130003V3V VOV013001V 69 IVVOVVOIV
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Description

明 細 書 新規 D N A及びそれを用いた蛋白質の製造方法 技術分野
本発明は、 新規な D N A、 及びそれを用いて遺伝子工学的手法により破骨細胞 の分化及び Z又は成熟抑制活性 （以下、 破骨細胞形成抑制活性という） を有する 蛋白質を製造する方法に関する。 詳しくは、 破骨細胞形成抑制活性を有する蛋白 質 0CIFをコ一ドするゲノム D N A、 及びこのゲノ厶 D N Aを用いて遺伝子工学的 手法により該蛋白質を製造する方法に関する。 発明の背景
人の骨は絶えず吸収と再形成を繰り返しているが、 この過程で中心的な働きを している細胞が、 骨形成を担当する骨芽細胞と骨吸収を担当する破骨細胞である。 これらの細胞が担当している骨代謝の異常により発生する疾患の代表として骨粗 鬆症が举げられる。 この疾患は骨芽細胞による骨形成を破骨細胞による骨吸収が 上回ることにより発生する疾患である。 この疾患の発生メカニズムについては未 だ完全には解明されていないが、 この疾患は骨の疼痛を発生し、 骨の脆弱化によ る骨折の原因となる疾患である。 高齢人口の増加に伴い、 骨折による寝たきり老 人の発生の原因となるこの疾患は社会問題にもなつており、 その治療薬の開発が 急務となっている。 このような骨代謝異常による骨量減少症は骨吸収の抑制、 骨 形成の促進、 或いはこれらのバランスの改善により治療することが期待される。 骨形成は、 骨形成を担当する細胞の増殖、 分化、 活性化を促進すること、 或い は骨吸収を担当する細胞の増殖、 分化、 活性化を抑制することにより促進するこ とが期待される。 近年、 このような活性を有する生理活性蛋白質 （サイ トカイン） への関心が高まり、 精力的な研究が行われている。 骨芽細胞の増殖或いは分化を 促進するサイ ト力インとして、 線維芽細胞増殖因子ファ ミ リ一（fibroblast grow th factor ； FGF ： Rodan S. B. et al. , Endocrinology vol. 121, pl917. 1987). インシュ リ ン様増殖因子一 [(insulin like growth factor-I ; I GF - I ： Hock
J. M. et al., Endocrinology vol. 122, p254, 1988)、 イ ンシュ リ ン様増殖因 子— Π ( I GF— Iに McCarthy T. et al. , Endocrinology vol.124, p301, 198 9)、 ァクチビン A(Activin A ； Centrella M. et al. , Mol. Cell. Biol. vol. 11， p250, 1991) 、 トランスフォーミ ング増殖因子— 5 (transforming growth f actor- yS ； Noda M. , The Bone, vol. 2, p29, 1988) 、 バスキュロ ト口ピン（Vas culotropin ； Varonique M. et al. , Biochem. Biophys. Res. Co画 n. vol. 19 9, p380， 1994)、 及び異所骨形成因子ファ ミ リ一（bone morphogenic protein ； BMP ： BMP- 2 ； Yamaguchi. A et al.. J. Cell Biol. vol. 113, p682. 1991. OP-1 ； Sampath T. K. et al., J. Biol. Chem. vol. 267, p20532. 1992, Knut sen R. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. vol.194, pl352. 1993) 等の サイ トカインが報告されている。
一方、 破骨細胞形成、 即ち破骨細胞形成の分化及び/又は成熟を抑制するサイ トカインとしては、 トランスフォーミ ング増殖因子— yS (transforming growth factor- β ； Chenu C. et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA, vol.85, p5683,
1988)やインターロイキン一 4 (interleukin-4 ； asano K. et al. , Bone-Mine r.， vol. 21, pl79. 1993)等が報告されている。 又、 破骨細胞による骨吸収を抑 制するサイ ト力インとしては、 カルシトニン（calcitonin ； Bone-Miner., vol.1 7, p347, 1992 ) 、 マクロファージコロニ一刺激因子（macrophage colony- stimulating factor; Hattersley G. et al. J. Cell. Physiol, vol.137, pl99, 1988) 、イン夕一ロイキン一 4(Watanabe, K. et al. , Biochem. Biophys. Res. Co隱 un. vol. 172, pl035, 1990)、 及びイ ン夕一フヱロン -ァ（interferon-ァ； Go en M.et al., J. Bone Miner. Res., vol. 1, p469, 1986)等が報告されてい る o これらのサイ トカインは、 骨形成の促進や骨吸収の抑制による骨量減少症の改 善剤となることが期待され、 インシュリン様増殖因子一 1 や異所骨形成因子ファ ミ リーのサイ トカイン等、 上記のサイ トカインの一部については骨代謝改善剤と して臨床試験が実施されている。 又、 カルシトニンは、 骨粗鬆症の治療薬、 疼痛 軽減薬として既に市販されている。 又、 現在、 骨に関わる疾患の治療及び洽療期 間の短縮を図る医薬品として、 臨床では活性型ビタミ ン D 3 、 カルシトニン及び その誘導体、 エストラジオール等のホルモン製剤、 イブリフラボン又はカルシゥ ム製剤等が使用されている。 しかし、 これらを用いた治療法はその効果並びに治 療結果において必ずしも満足できるものではなく、 これらに代わる新しい治療薬 の開発が望まれていた。
本発明者らは、 このような状況に鑑み鋭意探索の結果、 既にヒ ト胎児肺線維芽 紬胞 I M R - 90 (ATCC寄託 -受託番号 CCL186)の培養液に破骨細胞形成抑制活性、 即ち破骨細胞形成抑制活性を有する蛋白質 0C IFを見出している （PCT/JP96/00374 号） 。 この破骨細胞形成抑制活性を有する蛋白質 の由来について、 さらに鋭 意探索したところ、 ヒ 卜由来 OCiFのゲノム D N Aの塩基配列を決定するに至った c 即ち、 本発明は破骨細胞形成抑制活性を有する蛋白質 0CIFをコードするゲノム D N A、 及びそれを用いて遺伝子工学的手法により該蛋白質を製造する方法を提供 することを課題とする。 発明の開示
本発明は、 破骨細胞形成抑制活性を有する蛋白質 0C IFをコ一ドするゲノム D N A、 及びそれを用いて遺伝子工学的手法により該蛋白質を製造する方法に関する。 本発明の D N Aは、 配列表配列番号 1及び 2の塩基配列を含む。
また、 本発明は、 配列表配列番号 1及び 2の塩基配列を含む D N Aを発現べク 夕一に挿入して次の物理化学的性質をもち、 破骨細胞の分化及び Z又は成熟抑制 活性のある蛋白質を発現することのできるベクタ一を作成し、 これを用いて遺伝 子工学的手法により該蛋白質を製造する方法に関する。
(a) 分子量（SDS- PAGE による） ；
(i) 還元条件下で約 60kD
(ii) 非還元条件下で約 60kD及び約 120kD
(b) ァミノ酸配列；
配列表配列番号 3のァミノ酸配列を有する。
(c) 親和性；
陽イオン交換体及びへパリ ンに親和性を有する。
(d) 熱安定性；
(i) 70°C、 10分間または 56°C、 30分間の加熱処理により破骨細胞の分化 .成熟 抑制活性が低下する。
(ii) 90°C、 10分間の加熱処理により破骨細胞の分化 ·成熟抑制活性が失われる c 本発明の遺伝子を発現させることにより得られる蛋白質は、 破骨細胞形成抑制 活性を有し、 骨粗鬆症などの骨量減少症、 リウマチ又は変形性関節症などの骨代 謝異常疾患、 あるいは多発性骨髄腫瘍などの骨代謝異常疾患の治療及び改善を目 的とした医薬組成物として、 あるいはこのような疾患の免疫学的診断を確立する ための抗原として有用である。 図面の簡単な説明
第 1図は、 実施例 4 (iii) における、 本発明ゲノム DNAを発現して得られた 蛋白質の、 ウェスタンブロッテイ ングの結果を示す。 ここで 1はマーカ一、 2 はベクター pWESR «0 Fをトランスフ ク 卜した C0S7 細胞培養上清 （実施例 4 (iii))、 3はベクター pWESR αをトランスフ ク トした C0S7細胞培養上淸 （対 照） である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の破骨細胞形成抑制活性を有する蛋白質 OCiFをコードするゲノム D N A は、 ヒ ト胎盤ゲノム D N Aとコスミ ドベクタ一を用いてコスミ ドライブラリーを 作製し、 このライブラリ一を OCIF c D N Aをもとに作製した D N A断片をプロ一 ブとしてスクリ一ニングすることにより得られる。 このようにして得られたゲノ ム D N Aを適当な発現ベクターに挿入して 0CIF発現コスミ ドを作製し、 常法によ り各種の細胞及び菌株などの宿主にトランスフエク トして発現させることにより、 組み換え型 0CIFを製造することができる。 得られた破骨細胞形成抑制活性を有す る蛋白質 （破骨細胞形成抑制因子） は、 骨粗鬆症等の骨量減少症或いはその他の 骨代謝異常疾患の治療及び改善を目的とした医薬組成物として、 或いはこのよう な疾患の免疫学的診断を確立するための抗原として有用である。 本発明の蛋白質 は、 製剤化して経口或いは非経口的に投与することができる。 即ち、 本発明の蛋 白質を含む製剤は、 破骨細胞形成抑制因子を有効活性成分として含む医薬組成物 としてヒ ト及び動物に対して安全に投与されるものである。 医薬組成物の形態と しては、 注射用組成物、 点滴用組成物、 坐剤、 経募剤、 舌下剤、 経皮吸収剤等が 挙げられる。 注射用組成物の場合は、 本発明の破骨細胞形成抑制因子の薬理的有 効量及び製薬学的に許容しうる担体の混合物であり、 その中にはアミノ酸、 糖類、 セルロース誘導体、 及びその他の有機ノ無機化合物等の一般的に注射用組成物に 添加される賦形剤 賦活剤を用いることもできる。 又、 本発明の破骨細胞形成抑 制因子とこれらの賦形剤 Z陚活剤を用い注射剤を調製する場合は、 必要に応じて P H調整剤、 緩衝剤、 安定化剤、 可溶化剤等を添加して常法によって各種注射剤 とすることができる。
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、 これらは単に例示する のみであり、 本発明はこれらにより限定されるものではない。
実施例 1
コスミ ドライブラリ一の作製 ヒ ト眙盤ゲノム DNA (クローンテツク社； Cat. No. 6550 - 2)と pWE15 コスミ ドべク 夕一 （ストラタジーン社） を用いてコスミ ドライブラリーを作製した。 基本的に は、 ストラ夕ジーン社の pWE15 コスミ ドベクタ一キッ 卜に添付されたプロ トコ一 ルに従って実施したが、 DNA 、 大腸菌、 ファージを扱う一^的方法は、 Molecula r Cloning ： A Laboratory ManuaKCold Spring Harbor boraton( 1989))を参 考に従った。
(i ) ヒ ト 'ゲノム DNA 制限酵素分解物の調製
1. 5ml のエツペン ドルフチューブ 4本 （チューブ A 、 B 、 C 、 D)に lOmM Tri s- HC1 、 10m MgCl 2 、 lOOmM NaClを含む溶液 750〃 1 に溶かしたヒ ト胎盤ゲノ厶 DNAをそれぞれ 100 g入れ、 チューブ A には 0. 2ュニッ ト、 チューブ B には 0. 4 ュニッ ト、 チューブ C には 0. 6ュニッ ト、 チューブ D には 0. 8ュニッ 卜の制限酵 素 Mboiを添加して 1時間消化した。 その後、 それぞれのチューブに 20mMになるよ うに E D T Aを添加して反応を止め、 フエノール/クロ口ホルム （ 1 ： 1 ) で抽 出し、 水相に 2倍量のエタノールを加えて DNA を沈殿させた。 遠心分離で DNA を 回収したあと、 70%エタノールで洗い、 それぞれのチューブの中の DNAを 100〃 1 の TE に溶解した。 4本のチューブの DNA を 1 本にまとめ、 68°Cにて 10分保温し たのち室温に戻し、 これを遠心管 （38 ml)の中で作製した 10%— 40%直線状ショ 糖密度勾配に重層した。 ショ糖密度勾配は 20mM Tris- HCl (pH8. 0)、 5mM EDTA、 1M NaCl を含む緩衝液のなかで作製した。 この遠心管を日立製作所 SRP28SA ロー夕 —を用いて 20°Cで 26，000rpm にて 24時間遠心したのち、 フラショ ンコレクタ一を 用いてショ糖密度勾配を 0. 4ml ずつのフラクショ ンに分画した。 各フラクション の一部を 0. 4 %ァガロース電気泳動にかけて DNA のサイズを確認したのち、 およ そ 30kb (キロべ一スペア） から 40kbの長さの DNA を含むフラクショ ンを集め、 糖 濃度を 10%以下になるよう TEで希釈したのちエタノールを 2. 5倍量加ぇて0^ を 沈殿させた。 DNA は TE (10mM HCl (pH8. 0) + ImM EDTA緩衝液 （以下 TE という）） に溶解したのち 4 °Cで保存した。 (i i )コスミ ド ·ベクターの準備
ストラ夕ジーン社の pWE15コスミ ドベクタ一をコスミ ドベクタ一キッ 卜に添付 されたブロ トコールに従って制限酵素 BamHI によって完全消化したのち、 ェ夕ノ —ル沈殿によって DNA を回収し、 lmg/mlの濃度になるよう TEに溶解した。この DNA の 5'末端のリン酸を子牛小腸アル力リ性フォスファターゼを用いて除いた後、 フ エノ一ル抽出とエタノール沈殿によって DNA を回収し、 lmg/mlの濃度になるよう TEに溶解した。
(i i i ) ゲノム DNA のベクターへのライゲ一ション及び i n vi troパッケージング 1. 5〃g のサイズ分画したゲノム DNA と 3〃g の制限酵素 BamHIで消化した pW
E15 コスミ ドベクタ一をフアルマシア社の Ready- To- Go T4DNA ライゲ一スを用い て 20〃1 の反応溶液中でライゲ一シヨンした。 ライゲ一シヨンした DNA を、 ギガ パック I Iパッケージングェクストラク ト （ストラ夕ジーン社） を用い、 プロ トコ ールに従って in vi troパッケージングした。 パッケージング反応後、 反応液の一 部を SM緩衝液で段階的に希釈し、 lOmM MgCl 2に懸濁した大腸菌 XL1 - Bl ue MR (スト ラタジーン社） と混合してファージを感染させたのち、 50〃g/mlのアンピシリ ン を含む LBァガ一プレートに蒔き、 生ずるコロニーの数を計数した。 この結果を基 にパッケージンング反応液 1 〃1 当たりのコロニー数を算出した。
(i v)コスミ ドライブラリーの作製
上記の方法で作製したパッケージング反応液と大腸菌 XL1- Blue MR を混合し、 直径 15cmのァガロースプレート当たり 50, 000個のコロニーが生ずるようにアンピ シリンを含むァガロースプレー卜に蒔いた。 一夜 37°Cでプレー卜を保温したのち 、 プレート一枚当たり 3ml の LB培地を加えて大腸菌のコロニーを懸濁し、 回収し た。 ァガロースプレートをさらに 3ml の LB培地で 1 回洗い、 これを基の大腸菌懸 濁液と合わせた。 すべてのァガロースプレートから回収した大腸菌を一本の遠心 管にまとめ、 グリセロールを 20%となるように添加し、 さらにアンピシリンを 50 z g/mlとなるように加えた。 十分混合したのち一部を分取し、 残りを一 80°Cに保 存した。 分取した大腸菌を段階希釈してァガープレートに蒔き、 1ml 当たりのコ ロニ一数を算出した。
実施例 2
三ス ドラィブラリ一のスクリ一二ングとコロニーの純化
SO g/mlのァンピシリンを含む直径 15cmの LBァガロ一スプレートに直径 14. 2cm のニトロセルロースフィル夕一 （ミ リポア社） を乗せ、 その上にプレート一枚当 たり 50， 000個の大腸菌コロニーが生ずるようにコスミ ドライブラリーを蒔き、 37 °Cにて一夜保温した。 常法に従って二トロセルロースフィル夕一上の大腸菌を別 のニトロセルロースフィルターに転写してレプリカフィル夕一を 2枚作製した。 コスミ ドベクタ一キッ 卜に添付されたプロ トコールに従い、 レプリカフィルター 上の大腸菌をアル力リ変成、 中和し、 ストラ夕リ ンカ一 （ストラ夕ジーン社） を 用いて DNA をニトロセルロースフィルター上に固定した。 さらにこのフィルター を減圧オーブン中で 80°Cで 2 時間加熱した。 このように処理したニトロセルロー スフィルタ一を、 ヒト OClFcDNAの 5'末端と 3'末端から作製した 2種の DNA をプ α —ブとしてハイブリダィズした。 即ち、 OC IFcDNAを含む大腸菌 pBKAHF!O (通商 産業省工業技術院生命工学工業技術研究所寄託、 受託番号 FERM BP- 5267) よりプ ラスミ ドを精製し、 OCIFcDNAを含むプラスミ ドを制限酵素 Kpnlと EcoRI で消化し 、 生ずるフラグメントをァガロースゲルを用いて分離したのち、 0. 2kb の Κρηί/Ε coRIフラグメントを QIAEX 1【ゲルェクストラクションキッ ト （キアゲン社） を用 いて精製した。 この DNA をメガプライム DNA ラベリ ングシステム （アマシャム社 製） を用いて3 2 P で標識した （5' - DNAプローブ） 。 また別に、 得られたプラスミ ドを制限酵素 BamHIと制限酵素 EcoRVで消化して生ずる 0. 2kb の BamHl/EcoRV フ ラグメン トを同様に精製し、 上記の方法で3 2 P 標識した （3' - DNAプローブ） 。 上 記レプリカフィルターのうち一枚を 5' -DNAプローブと、 別の一枚を 3' - DNAプロ一 ブとハイブリダイズした。 コロニーハイブリダイゼーション及びフィルターの洗 浄はコスミ ドベクタ一キッ トに添付されたプロトコールに述べられた方法に従つ て行った。 オートラジオグラフィ一の結果それぞれのプローブで複数個の陽性シ グナルが検出されたが、 両方のプローブにハイプリダイズする陽性シグナルがー 個検出された。 このシグナルに相当するァガ口一スプレート上のコロニーを精製 することにより純化したコロニーを単離した。 純化されたコロニーから常法に従 つてコスミ ドを精製し pWE0C [F と命名した。 このコスミ ドに含まれるヒ 卜ゲノム DNA のサイズはおよそ 38kbであった。
実施例 3
ヒ 卜 0C IFゲノム DNA の塩基配列の決定
(i ) 0C IF ゲノム DNA のサブクローニング
コスミ ド pWEOCIFを制限酵素 EcoRlを用いて消化し、 生じたフラグメントを 0. 7 %ァガロースゲルに供与して分離したのち、 サザンブ πッ ト法によって DNA をナ イロン膜 （Hybond-N、 アマシャム社） に移し、 ストラタリンカ一 （ストラタジ一 ン社） を用いて DNA をナイロン膜に固定した。 一方、 プラスミ ド pBKOC を制限 酵素 EcoR〖 によって消化し、 ヒ ト 0C【FcDNAを含む 1. 6kb のフラグメントをァガロ ースゲルを用いて単離したのち、 メガプライム DNA ラベリ ングシステム （アマシ ャム社） を用いて3 2 P 標識した。 常法に従って上記ナイロン膜と3 2 P 標識した 1. 6kb の O FcDNAをハイブリダィズさせた結果、 6kb 、 4kb 、 3. 6kb 、 2. 6kbの DNA フラグメン卜がハイプリダイズすることがわかった。 ヒト OC IFcDNAとハイプリダ ィズするこれらのフラグメントをァガロースゲルを用いて単離したのち、 それぞ れ pBluescri pt I I SK+ベクター （ストラタジーン社） の EcoR〖 サイ 卜に常法に従 つてサブクローニングし、 得られたプラスミ ドをそれぞれ pBSE6 、 pBSE4 、 pBSE 3. 6 、 pBSE2. 6 と命名した。
(i i) 塩基配列の決定
上記プラスミ ドにサブクローニングされたヒ ト 0C IFゲノム DNA の塩基配列の決 定には ABI ダイデォキシ夕一ミネーターサイクルシークェンシングレディ一リア クシヨンキッ ト （パーキンエルマ一社） と 373 シークェンシングシステム （ァプ ライ ドバイオシステムズ社） を使用した。 塩基配列決定用プライマーはヒト 0C1F cDNAの塩基配列 （配列表配列番号 4 ) をもとに合成した。 また、 塩基配列が決定 された部分をもとにしてさらにプライマーを合成した。 決定された塩基配列を配 列表配列番号 1及び 2に示す。 配列番号 1には 0CIF遺伝子の第 1ェクソンが含ま れ、 配列番号 2には第 2、 第 3、 第 4、 第 5ェクソンが含まれる。 第 1ェクソン と第 2ェクソンの間にはおよそ 17kbのヌクレオチドが介在する。
実施例 4
COS- 7細胞による組み換え型 OC!Fの生産
(i) 0CIFゲノム DNA発現コスミ ドの作製
0CIFゲノム DN Aを動物細胞で発現させるために、 コスミ ドベクター pWE15(ス トラ一夕ジーン社） に発現プラスミ ド pcDL- SR ひ 296(Molecular and Cellar Bio logy, vol.8, P466-472, 1988)の発現ユニッ トを挿入した。 まず、 発現プラスミ ド pcDL-SR 296 を制限酵素 Sal Iで消化して SRひプロモ一夕一、 SV40後期スプラ イス信号、 ポリ （A)付加信号などを含む約 1.7kbの発現ユニッ トを切り出し、 ァ ガロース電気泳動によって分離後、 QIAEX IIゲルェクストラクションキッ 卜 （キ ァゲン社） を用いて精製した。 一方、 コスミ ドベクタ一 PWE15 を制限酵素 EcoRi で消化し、 ァガロース電気泳動によって分離後、 8.2kl) の pWE DNA を QIAEX II ゲルェクストラクシヨンキッ ト （キアゲン社） を用いて精製した。 これら二つの DNA断片末端を DNAブランティ ングキッ ト （宝酒造社） を用いて平滑化し、 DNAライゲーションキッ ト （宝酒造社） を用いて結合させ、 大腸菌 DH 5 a (ギブコ BR L社） に導入した。 得られた形質転換株を増殖させ、 発現ュニッ 卜 を含む発現コスミ ド PWESR ひをキアゲンカラム （キアゲン社） を用いて精製した c 前記（i) で得られた約 38kbの 0CIFゲノム DNAが挿入されたコスミ ド pWE0C[F を制限酵素 Notlで消化して約 38kbの 0CIFゲノ厶 DNAを切り出し、 ァガロース電 気泳動によって分離後、 QIAEX I【ゲルェクストラクシヨンキッ 卜 （キアゲン社） を用いて精製した。 一方、 発現コスミ ド pWESR ひを制限酵素 EcoRI で消化し、 フ ェノール、 ク□口ホルムで抽出した後、 エタノール沈殿し、 TEに溶解した。 この 制限酵素 EcoRI で消化された pWESR ひと EcoRI - Xmni-Notl アダプター（#1105、 #1 156 ； ニューイングラン ドバイオラボ社） を T4 DNAリガ一ゼ （宝酒造社） を用い て結合し、 ァガロース電気泳動によってフリーのアダプタ一と分離後、 Q1AEX II ゲルェクストラクシヨンキッ ト （キアゲン社） を用いて精製した。 制限酵素 Not 1 で消化された約 37kbの 0 Fゲノム DNAとアダプタ一を付加した pWESR ひを T4 D NAリガーゼ （宝酒造社） を用いて結合し、 ギガパック Πパッゲイジングェクス ト ラク 卜 （ストラ一夕ジーン社） を用いてインヴィ トロパッケイジングを行い、 大 腸菌 XL1- Blue MR (ストラー夕ジーン社） に感染させた。 得られた形質転換株を 増殖させ、 0CIFゲノム DNAが挿入された発現コスミ ド pWESR ひ 0CIFをキアゲン カラム （キアゲン社） を用いて精製した。 0CIF発現コスミ ド pWESR ひ 0C[Fをェ夕 ノールによって沈澱させた後、 無菌蒸留水に溶解し以下の操作に用いた。
(ii)0C【Fゲノム DNAの卜ランジェントな発現及び 0CIF活性の測定
前記（i) で得られた 0CIF発現コスミ ド pWESR ひ 0CIFを用いて、 以下に述べる方 法で組み換え型 0CIFを発現させ、 その活性を測定した。 8 X105 個の COS- 7 細胞 (理化学研究所細胞開発銀行、 RCB0539)を 6ゥエルプレートの各ゥエルに 10%牛 胎児血清 （ギブコ BRL社） を含む DMEM培地 （ギブコ BRL社） を用いて植 え込み、 翌日、 培地を除いた後、 無血清 DMEM培地で細胞を洗浄した。 トラン スフエクシヨン用試薬リボフヱクタミン （ギブコ BRL社） 添付のプロ トコール に従い、 あらかじめ 0PTI- MEM培地 （ギブコ BRL社） を用いて希釈しておいた 0C IF発現コスミ ド pWESR ひ 0CIFとリポフエクタミ ンを混合した後、 この混合液を各 ゥエルの細胞に加えた。 対照として発現コスミ ド pWESR ひを用い、 細胞に同様に 加えた。 用いたコスミ ド DNA及びリポフエクタミ ンの量はそれぞれ 3 g 及び 12 i であった。 24時間後、 培地を除き 1.5ml の新しい EX-CELL301培地 （JRH バイオサイエンス社） を加え、 さらに 48時間後、 培地を回収し、 これを 0CIF活性 測定用サンプルとした。 0CIFの活性測定は久米川正好らの方法 （蛋白質 ·核酸 · 酵素 Vol.34, p999 (1989)) 及び Takahashi N. et. alの方法（Endocr ihology vol .122, pi 373 (1988)) に従い測定した。 生後約 17日のマウス骨髄細胞からの活性 型ビタミ ン D3 存在下での破骨細胞形成を酒石酸耐性酸性ホスファタ一ゼ活性の 誘導で試験し、 その抑制活性を測定し、 破骨細胞形成抑制活性を有する蛋白質 (0CIF) の活性とした。 すなわち、 96ゥヱルマイクロプレートの各ゥエルに、 2 10—82の活性型ビタミ ン D3 と 10%牛胎児血清を含むひ一 MEM培地 （ギブコ BRL社） で希釈したサンプル 100 /1 を入れ、 生後約 日のマウス骨髄細胞 3 X 105 個を 100〃1 の 10%牛胎児血清を含むひ一 MEM培地に懸濁させて播種し、 5 % C02、 37 、 湿度 100%にて一週間培養した。 培養 3日目と 5日目に、 培養 液のうち 160 /1 を廃棄し、 1 X 10— 8M活性型ビタミ ン D3 及び 10%牛胎児血清 を含むひ— MEM培地で希釈したサンプル 160 1 を添加した。 培養 7 H後に細 胞をリ ン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄した後エタノール/アセトン （ 1 ： 1 ) 溶液 で紬胞を室温にて 1分間固定し、 破骨細胞形成を酸性ホスファターゼ活性測定キ ッ ト（Acid Phosphatase. Leucocyte. Cat. No.387- A； シグマ社） を用いた染色で 検出した。 酒石酸存在下での酸性ホスファターゼ活性陽性細胞の減少を 0CIF活性 とした。 結果を表 1に示す。 この結果より、 IMR- 90の培養液から得られた天然型 0CIF及び CHO細胞で生産した組み換え型 0CIFと同様の活性を、 この培養液が有 することが確認された。
表 1
COS— 7钿胞で発現させた培養液中の OC I F活性 希釈率 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320
OCIF genomic DNA導入 十 + ++ ++ ++ + ―
ベクタ一導入 — — — — 一 一 未処理 一 — — 一 一 一 〔表中、 + +は破骨細胞形成が 8 0 %以上抑制される活性を、 十は破骨細胞形成 が 3 0〜8 0 %抑制される活性を、 一は活性が検出されないことを示す。 〕
(iii)ウエスタンプロッティ ングによる生産物の確認
上記（ii)で得られた 0 F活性測定用サンプルを 10 1 取り、 10 1 の SDS- PAGE 用サンプルバッファ一 （0.5M Tris- HC1 、 20% グリセロール、 4 % SDS、 20 / g/mlブロムフエノールブル一、 pH 6.8) を加えて 100 でで 3 分間煮沸したのち、 非還元状態で 10%SDS ポリアクリルアミ ド電気泳動を行った。 電気泳動後、 セミ ドライブロッティ ング装置 （バイオラッ ド社） を用いて蛋白質をゲルから PVDFメ ンブレン （ProBlott、 パーキンエルマ一社） にブロッテイ ングした。 そのメ ンブ レンをブ αッキング後、 先に得られた 0CIF蛋白質を西洋ヮサビバーオキシダ一ゼ で常法により標識した西洋ヮサビバ一ォキシダ一ゼ標識抗 0CIF抗体とともに 37°C で 2 時間保温した。 洗浄後、 ECL システム （アマシャム社） を用いて抗 0CIF抗体 が結合している蛋白質を検出した。 第 1図に示すように pWESR ひ 0CIFをトランス フエク トした COS- 7細胞の培養上清からは、 分子量約 120キロダルトンと 60キ□ ダルトンの 2本のバンドが検出された。 一方、 pWESR ひべクタ一のみをトランス フエク トした COS- 7 細胞の培養上清を同様の方法で解析した結果、 120 キロダル トンと 60キロダルトンのバンドは検出されなかった。 この結果より、 得られた蛋 白質は 0CIFであることが確認された。 産業上の利用の可能性
本発明によると破骨細胞形成抑制活性を有する蛋白質 0CIFをコ一ドするゲノム DN A、 及びそれを用いて遺伝子工学的手法により該蛋白質を製造する方法が提 供される。 本発明の遺伝子を発現させることにより得られる蛋白質は、 破骨細胞 形成抑制活性を有し、 骨粗鬆症などの骨量減少症、 リウマチ又は変形性関節症な どの骨代謝異常疾患、 あるいは多発性骨髄腫瘍などの骨代謝異常疾患の治療及び 改善を目的とした医薬組成物として、 あるいはこのような疾患の免疫学的診断を 確立するための抗原として有用である。 微生物への言及
寄託機関：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
住 所： 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号
寄託日 ：平成 7年 6月 2 1 日
(平成 7年 6月 2 1 日に原寄託され、 平成 7年 1 0月 2 5日にブダ ぺスト条約に基づく国際寄託へ移管）
受託番号： F ERM B P - 5 2 6 7
配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 1 3 1 6
配列の型 ：核酸
鎖の数： 2
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： genomi c D N A (ヒ 卜 OC IFゲノム D N A— 1 )
配列：
CTGGAGACAT ATAACTTGAA CACTTGGCCC TGATGGGGAA GCAGCTCTGC AGGGACTTTT 60 TCAGCCATCT GTAAACAATT TCAGTGGCAA CCCGCGAACT GTAATCCATG AATGGGACCA 120 CACTTTACAA GTCATCAAGT CTAACTTCTA GACCAGGGAA TTAATGGGGG AGACAGCGAA 180
CCCTAGAGCA AAGTGCCAAA CTTCTGTCGA TAGCTTGAGG CTAGTGGAAA GACCTCGAGG 240
AGGCTACTCC AGAAGTTCAG CGCGTAGGAA GCTCCGATAC CAATAGCCCT TTGATGATGG 300
TGGGGTTGGT GAAGGGAACA GTGCTCCGCA AGGTTATCCC TGCCCCAGGC AGTCCAATTT 360
TCACTCTGCA GATTCTCTCT GGCTCTAACT ACCCCAGATA ACAAGGAGTG AATGCAGAAT 420
AGCACGGGCT TTAGGGCCAA TCAGACATTA GTTAGAAAAA TTCCTACTAC ATGGTTTATG 480
TAAACTTGAA GATGAATGAT TGCGAACTCC CCGAAAAGGG CTCAGACAAT GCCATGCATA 540
AAGAGGGGCC CTGTAATTTG AGGTTTCAGA ACCCGAAGTG AAGGGGTCAG GCAGCCGGGT 600
ACGGCGGAAA CTCACAGCTT TCGCCCAGCG AGAGGACAAA GGTCTGGGAC ACACTCCAAC 660
TGCGTCCGGA TCTTGGCTGG ATCGGACTCT CAGGGTGGAG GAGACACAAG CACAGCAGCT 720
GCCCAGCGTG TGCCCAGCCC TCCCACCGCT GGTCCCGGCT GCCAGGAGGC TGGCCGCTGG 780
CGGGAAGGGG CCGGGAAACC TCAGAGCCCC GCGGAGACAG CAGCCGCCTT GTTCCTCAGC 840
CCGGTGGCTT TTTTTTCCCC TGCTCTCCCA GGGGACAGAC ACCACCGCCC CACCCCTCAC 900
GCCCCACCTC CCTGGGGGAT CCTTTCCGCC CCAGCCCTGA AAGCGTTAAT CCTGGAGCTT 960
TCTGCACACC CCCCGACCGC TCCCGCCCAA CCTTCCTAAA AAAGAAAGGT GCAAAGTTTG 1020
GTCCAGGATA GAAAAATGAC TGATCAAAGG CAGGCGATAC TTCCTGTTGC CGGGACGCTA 1080
TATATAACGT GATGAGCGCA CGGGCTGCGG AGACGCACCG GAGCGCTCGC CCAGCCGCCG 1140 9ΐ 01 9
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Leu Trp Arg He Lys Asn Gly Asp Gin Asp Thr Leu Lys Gly Leu
310 315 320
Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr
325 330 335
Val Thr Gin Ser Leu Lys Lys Thr He Arg Phe Leu His Ser Phe
340 345 350
Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gin Lys Leu Phe Leu Glu Met lie Gly
355 360 365
Asn Gin Val Gin Ser Val Lys He Ser Cys Leu
370 375 380 配列番号： 4
配列の長さ ： 1 20 6
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー：直鎖状
配列の種類： c DNA
配列： d 6s∞lo OS卜 0/86 OAV
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Claims

請 求 の 範 囲
1. 配列表配列番号 1及び 2の塩基配列を含む DNA。
2. 配列番号 1には 0CIF遺伝子の第 1ェクソンが含まれ、 配列番号 2には第 2、 第 3、 第 4、 第 5ェクソンが含まれ、 且つ、 第 1ェクソンと第 2ェクソンの 問におよそ 17kbのヌクレオチドが介在する、 クレーム 1 に記載の DNA。
3. 次の物理化学的性質をもち、 破骨細胞の分化及び 乂は成熟抑制活性のあ る蛋白質。
(a) 分子量 （SDS- PAGEによる）；
(i) 還元条件下で約 60kD
(ii)非還元条件下で約 60kD及び約 120kD
(b) ァミノ酸配列：
配列表配列番号 3のァミノ酸配列を有する。
(0 親和性；
陽イオン交換体及びへパリ ンに親和性を有する。
(d) 熱安定性；
(i) 70°C、 10分間または 56で、 30分間の加熱処理により破骨細胞の分化 -成 熟抑制活性が低下する。
(ii) 90°C、 10分間の加熱処理により破骨細胞の分化，成熟抑制活性が失われ
4. 配列表配列番号 1及び 2の塩基配列を含む DNAを発現ベクターに挿入し て次の物理化学的性質をもち、 破骨細胞の分化及び/又は成熟抑制活性のある 蛋白質を発現することのできるベクターを作成し、 これを用いて遺伝子工学的 手法により該蛋白質を製造することを特徴とする破骨細胞の分化及び/又は成 熟抑制活性のある蛋白質の製造法。
(a) 分子量 （SDS- PAGEによる）； (i) 還元条件下で約 60kD
(ii)非還元条件下で約 60kD及び約 120kD
(b) Ύミノ酸配列；
配列表配列番号 3のァミ ノ酸配列を有する。
(c) 親和性；
陽イオン交換体及びへパリ ンに親和性を有する。
(d) 熱安定性；
(i) 70°C、 10分間または 56で、 30分間の加熱処理により破骨細胞の分化 .成 熟抑制活性が低下する。
(ii) 90°C、 10分間の加熱処理により破骨細胞の分化 ·成熟抑制活性が失われ る。
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