WO1998006424A1

WO1998006424A1 - Inhibiteurs des metastases cancereuses administres par voie orale

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Publication number: WO1998006424A1
Application number: PCT/JP1997/002685
Authority: WO
Inventors: Hiroyuki Tsuda; Masaaki Iigo; Mamoru Tomita; Seiichi Shimamura; Zenta Takatsu; Kazunori Sekine
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co., Ltd.
Priority date: 1996-08-15
Filing date: 1997-08-01
Publication date: 1998-02-19
Also published as: JPH1059864A

Description

明細塞経口がん耘移抑制剤技術分野

本発明は、経口的に投与し得るがん転移抑制剤に関するものである。更に詳しくは、本発明は、非鉄飽和ラクトフエリン、ラクトフエリン類の加水分解物、該加水分解物の薬学的に許容される誘導体、該加水分解物の薬学的に許容される塩類、ラクトフエリン類の加水分解物由来のペプチド類、該ペプチド類の薬学的に許容される誘導体及び該ペプチド類の薬学的に許容される塩類からなる群より選択される 1種又は 2種の物質を有効成分として含有する経口がん転移抑制剤に関するものである。背景技術

がんの診断、治療技術は著しく進歩し、早期に発見されたがんの治癒率は向上し続けている。しかし、一旦治癒したかに見えたがんが再び他の臓器で増殖する場合が多く、このためがんの臨床における転移抑制の問題は重要性が増加している。転移の概略は、原発巣からのがんの遊離、血管内又はリンパ節への侵入、血流又はリンパ液中での移動、血管内皮、基底膜又はリンパ節への接着、摞的臓器での増殖等、多数の過程を経ることが知られており (実験医学、第 1 2卷、第 8号、第 906 ~ 9 1 1ページ、 1 994年）、これらの過程のいずれか、又は全部を阻害することにより、がん細胞の転移を抑制することができる。

従来、多くの制がん剤が転移抑制の目的にも使用されてきたが、それらの転移抑制効果は明らかではなかった（平成 6年度日本癌学会総会記事、第 4 5 8ページ、 1 9 94年）。また、新たに多数の物質ががん転移抑制を主たる目的として開発され、例えば、細胞外マトリックスに存在する金属プロテアーゼ阻害剤として転移浸潤を抑制できるカルボスチリル誘導体（特開平 8— 814 43号公報）、細胞接着阻害活性を有する事により転移先の細胞にがん細胞の接着を防止するとされるアミノハロゲノナフトキノン誘導体（特開平 8— 113 555号公報）等が知られている。

これら種々の生理活性阻害因子は、その薬剤が経口投与であっても、非経口投与であっても、それらの有効量を投与した場合、がん細胞以外の細胞にも同様に作用するため強い副作用が現れ、有効量を投与することは患者の Q OL(quality of life) 上適切ではなく、そのため満足すべきがん転移抑制剤は経口、非経口を問わず未だ実用化されていない。

がんの耘移は、乳がん等の原発巣から早期に起こることも多いが、 5年後の生存率をもって一応の治癒と解釈されるように、 5年後、 10年後でも転移して再発する（豊島滋著、「ガンの再発と転移」、第 64ページ、自由国民社、 19 79年 9月 10日、及び内科、第 49卷、第 6号、第 1061〜 1066ページ、 19 82年）。従って、退院後のがん患者は、がん転移抑制剤を自宅療養段階において数年から 10年以上にわたって継続的に使用するのが普通であり、注射薬等は自宅療養又は社会復帰後の患者が用いるためには、たとえ有効であつても多大な時間を费やして通院することが必要で、多忙な患者にとって実用上使用が困難な薬剤である。このような状況から長年にわたり安心して容易に使用でき、かつ副作用の少ない経口投与薬剤が待望されていたのである。

天然物質であるドコサへキサェン酸（DHA)及びその誘導体（特開平 8— 5 3351号公報）、シソの葉抽出物（特開平 8— 73371号公報）等はこのような要望に合致する物質として開発されてきた。これら天然物由来の経口がん転移抑制剤は、一般に副作用は少ないが、効果は不十分であることが多く、また、独特な風味、性状を有し、更に、酸化されやすい等使用上不都合な性状を有する物質である。従って、個人の嗜好性が高く、混合できる食品にも限界があり、多くの患者にとってはがん転移抑制のため抵抗なく長期的、かつ継続的に用いるのは困難であった。

一方、ラク卜フェリン（lactofer n) は、乳汁及び唾液、涙、粘膜分泌液等のヒトを含む哺乳動物の体液に存在し、約 10%の糖鎖含量を有する分子量 8万前後の鉄結合性耱タンパク質であり、天然のラクトフエリンは通常飽和状態の 10~ 20%の鉄を結合している（以下、非鉄飽和ラクトフエリンを Lfと記載することがある）。

ラク卜フェリンは、大腸菌、カンジダ菌、クロストリジゥム菌等の有害微生物に対して抗菌作用を示すことが知られており [ジャーナル■ォブ _ぺディアトリクス（Journal of Pediatrics) 、第 94卷、第 1ページ、 1979年]、ブドウ球菌及び腸球菌に対して抗菌作用を有することも知られている [ジャーナル ·ォブ · デイリー.サイエンス（journal of Dairy Science),第 67巻、第 606ページ、 1984年]。

本発明者らは、ラク卜フェリンの抗菌性に着目し、哺乳類のラクトフエリン、アポラクトフエリン、及び金属飽和又は部分飽和ラクトフエリン（以下、これらをまとめて Lf類と記載することがある）の酸又は酵素による加水分解物が、望ましくない副作用（例えば、抗原性等）等がなしかも未分解のそれらよりも強い耐熱性及び抗菌性を有することを見い出し、既に特許出願を行った（特開平 5— 320068号公報、ョ一口ッノ《特許公開第 438750号）。

また、本発明者らは、 Lf類の加水分解物から強い抗菌活性を有するぺプチドを単離し、それらのペプチドと同一のアミノ酸配列を有するペプチド及びそれらのペプチドの誘導体を合成し、 20個のアミノ酸残基からなる抗菌性ぺプチド（特開平 5— 92994号公報）、 1 1個のアミノ酸残基からなる抗菌性ぺプチド（特開平 5— 78392号公報）、 6個のアミノ酸残基からなる抗菌性べプチド（特開平 5— 148297号公報）、 5個のアミノ酸残基からなる抗菌性べプチド（特開平 5— 1498296号公報）、 3〜 6個のアミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平 5— 148295号公報）を発明し、それぞれ既に特許出願し更に、本発明者らは、 Lf類の加水分解物と同一のアミノ酸配列を有するぺプチド又はこれらペプチドの誘導体に脳の保護作用（特開平 6— 172200号公報）、上皮細胞増殖因子による繊維芽細胞増殖を促進する作用（特開平 6 —48955号公報）及び神経成長因子産生促進作用（特開平 5— 23557号公報）があることを見い出し、それぞれ既に特許出願した。

疾病の治療剤にラクトフエリンを応用した例として、抗リウマチ剤（特開平 5 — 186368号公報）が知られており、ラクトフエリンの加水分解物については、チロシナーゼ活性阻害（ヨーロッパ特許公開第 438750号）、細胞への病原菌付着防止（特開平 3— 220130号公報）、抗ウィルス作用（特開平 1一 23 3226号公報）等が知られている。

ラクトフエリンを抗がん剤として使用することも検討され、例えば、鉄飽和ラクトフ：!:リンは抗腫痛効果を有することが知られている（特公平 5— 86932号公報）。本発明者らは、ラクトフエリンを酸又は酵素により加水分解した物質と同一のアミノ酸配列を有するペプチド又はこれらペプチドの誘導体が非経口抗腫瘍作用を有することを発見し、特許出願した（特開平 7— 309771号公報）。

がん転移抑制についてもいくつかの検討がなされ、ラクトフ Iリンは、非経口投与にょリ抗がん転移活性を有するとの研究結果が、腫癢細胞をマウスの静脈内に注射し、ラクトフエリンは腹腔内に投与するという特異な条件で報告されている [キャンサー 'リサーチ（Cancer Research) 、第 54巻、第 2310 -2312ページ、 1994年]。更に、ラク卜フェリン並びにラクトフエリンのアミノ酸配列中の特定な 25個アミノ酸からなるペプチドが非経口投与によるがん転移抑制活性を有することが発表されている（農芸化学会誌、第 69卷、臨時増干 lj号、第 143ページ、 1995年）。このように、いくつかの研究にもかかわらず、ラク卜フェリン、ラクトフエリン加水分解物又は特定のアミノ酸配列を有するラクトフ:!:リン由来のペプチド等が経口投与によりがん転移抑制活性を有するか否かについては、従来検討がなされていなかった。その理由は、ラクトフエリンが経口投与された場合、消化酵素の働きにより容易に分解されるため、生理活性、特にがん転移抑制活性のような高度な生理作用を示すはずがないと言う、タンパク質化学の一般的常識のためである。

更に、ラクトフエリン加水分解物、ラクトフ：!:リン由来のペプチドは、加水分解前のタンパク質以上に消化酵素によって分解されやすいことから、ラクトフェリンと同様に経口投与によるがん転移抑制活性に関しては何等検討がされていなかったのである。

以上のとぉリ、長期使用でき、副作用が少ない経口がん転移抑制剤が待望されていたが、未だに優れた物質は知られていないのが現実であり、またラクトフエリン、ラクトフエリンの加水分解物、ラクトフエリン由来のペプチドが経口投与によりがん転移抑制作用を有することは発表されておらず、文献にも記載されていない。

本発明は、以上の従来技術に鑑みてなされたものであり、副作用が少な長期間投与することができ、かつ経口的に投与し得るがん転移抑制剤を提供することを目的としている。発明の開示

本発明者らは、副作用が少なく、長期間投与することができ、かつ経口的に投与し得るがん転移抑制剤を検索していたが、意外にも消化酵素による分解が避けられないとされている Lfに経口投与によるがん転移抑制効果があることを見い出した。これを研究する過程で、更に意外な現象として、 Lf以上に消化酵素による分解を受けやすいと考えられるラク卜フェリン類の加水分解物及びラクトフエリン類由来のペプチドに、経口投与によるがん転移抑制効果があることを見い出し、有効性の確認試験を重ねて、本発明を完成した。

本発明は、非鉄飽和ラクトフ：!:リン、ラク卜フェリン類の加水分解物、該加水分解物の薬学的に許容される誘導体、該加水分解物の薬学的に許容される塩類、ラクトフエリン類の加水分解物由来のペプチド類、該ペプチド類の薬学的に許容される誘導体及び該ペプチド類の薬学的に許容される塩類からなる群より選択される 1種又は 2種の物質を有効成分として含有する経口がん転移抑制剤を提供する。

本発明の経口がん移転抑制剤は、非鉄飽和ラクトフリン、ラクトフエリン類の加水分解物、該加水分解物の薬学的に許容される誘導体、又は該加水分解物の薬学的に許容される塩類が、 3〜 3 2 0 0 m g Z曰体重 k gの割合で経口的に投与されることを望ましい態様としている。

また本発明の経口がん移転抑制剤は、ラクトフエリン類の加水分解物由来のペプチド類、該ペプチド類の薬学的に許容される誘導体、又は該ペプチド類の薬学的に許容される塩類が、 0 . 2 ~ 3 20 m g /曰体重 k gの割合で経口的に投与されることを望ましい態様としている。

さらに本発明の経口がん移転抑制剤は、該ペプチド類が、配列番号 1から配列番号 3 1のいずれかに記載のアミノ酸配列を有することを望ましい態様としてもいる。

さらに本発明は、前記の経口がん移転抑制剤を必須成分として含有する食品組成物、及び飼料組成物をも提供する。発明を実施するための最良の形態

本発明の経口がん転移抑制剤の有効成分の一つである Lfは、市販品又は哺乳動物の乳から常法により分離されたものであり、生産量が多いことから、牛乳から分離されたものが望ましい。 Lfの分離、精製の一例を示せば、次のとおりである。 C M—セファロース F F (フアルマシア社製）をカラムに充填し、塩酸を通液し、水洗し、イオン交換体を平衡化し、 4 °Cに冷却した p H 6 . 9の脱脂乳をカラムに通液し、透過液を回収し、再度同様にカラムに通液する。次いで、蒸留水をカラムに通液し、食塩水を通液し、イオン交換体に吸着した塩基性蛋白質溶出液を得る。

この溶出液に飽和度 8 0 %で硫酸アンモニゥ厶を添加し、蛋白質を沈殿させ、遠心分離して沈殿を回収し、飽和度 8 0 %の硫酸アンモニゥム溶液で洗浄し、脱イオン水を添加して溶解し、得られた溶液を限外濾過膜モジュール (例えば、旭化成社製の S L P 005 3 )を用いて限外濂過し、のち水を添加し、同装置を用いてダイァフィル卜レーシヨンを行い、脱塩し、凍結乾燥し、粉末状ゥシ ·ラクトフエリンを得る。

以上の方法により得られた Lfの純度を電気泳動法により測定した結果、 9 5 % (重量。以下、分解率を除き、特に断りのない限り同じ）以上の純度を有している。尚、凍結乾燥前の各精製工程におけるラクトフ Xリン含有液を本発明に使用できることは、言うまでもない。

また、ヒトの Lfは大量に製造することはできないが、組換え D N A技術によリ得られる組換え真菌、組換え乳牛（トランスジエニック 'カウ）等により生産されるヒ卜の Lfであっても本発明に使用することができる。

Lfの有効投与量は、動物試験の結果から積算して 3〜3200 m g 日ノ体重 k gの範囲である。

本発明の経口がん転移抑制剤の他の有効成分であるラクトフエリンの分解物又はペプチドをラクトフエリンから製造する場合、出発物質として使用するラク卜フェリンは、市販のラクトフエリン、哺乳類（例えば、ヒト、ゥシ、ヒッジ、ャギ、ゥマ等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、又はこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホェ一等から常法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー等）によリ分離した Lf、それらを塩酸、クェン酸等により脱鉄したアポラクトフ：！:リン、ァポラクトフエリンを鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートした金属飽和又は部分飽和ラクトフヱリンであり、市販品又は公知の方法により製造した調製品を使用することもできる。

Lf類の分解物は、 Lfを酸又は酵素を用いて加水分解することによって得ることができる。酸による加水分解は、 Lfを 0. 1〜20%、望ましくは 5〜 15% の; 度で水又は精製水に溶解し、得られた溶液に塩酸、リン酸等の無機酸、又はクェン酸等の有機酸を添加し、溶液の pHを 1 ~4、望ましくは 2~3に調整し、調整した pHにより適当な温度で所定時間加熱し、加水分解する。例えば、 pH1〜2に調整した場合は、 80〜130°C、望まし<は90〜120°〇、 pH 2~4に調整した場合は、 100〜 130 °C、望ましくは 100〜 120° (：、でそれぞれ 1 ~ 120分間、望ましくは 5〜60分間加熱する。

酵素による加水分解は、 Lfを 0. 5〜20%、望ましくは 5〜 15%の濃度で水又は精製水に溶解し、溶液の pHを使用する酵素の至適 pHに調整し、 15 ~55°C、望ましくは 30〜50°Cの温度に加温し、 30〜600分間、望ましくは 60~300分間、保持して加水分解し、酵素反応液をそのまま、又は中和し、加熱して酵素を失活する。

使用する酵素は特に制限がな市販の酵素、例えば、モルシン（商標。盛進製薬社製。至適 PH2. 5〜3. 0)、ブタペプシン（和光純薬工業社製。至適 pH2〜3)、スミチーム AP (商標。新日本化学社製。至適 pH3. 0)、ァマノ M (商標。アマノ社製。至適 pH7. 0)、卜リブシン（ノボ社製。至適 pH8. 0)等を単用又は任意に併用する。

使用する酵素の量は、基質に対して 0. 1〜5. 0%の範囲、特に望ましくは 0. 5〜3. 0%である。

加水分解の分解率は、次の方法により測定したパーセンテージとして 4〜 50%、望ましくは 6〜40%である。即ち、この分解率は、ケルダール法によリ測定した全窒素量に対するホルモール滴定法により測定したホルモール態窒素量から式

分解率（％) = (ホルモール態窒素量全窒素量） X 100

により算出した値である。

Lf類加水分解物の有効投与量は、動物試験の結果から穣算して 3 ~ 320 Omg 日体重 kgの範囲である。

また、本発明のがん転移抑制剤の他の有効成分である Lf類由来のぺプチドは、前記 Lf類の加水分解物から公知の分離手段によって単離されるぺプチド、このペプチドと同一のアミノ酸配列若しくは相同なアミノ酸配列を有するぺプチド、これらのペプチドの薬学的に許容される誘導体、これらのペプチドの薬学的に許容される塩類、これらのペプチドと同一若しくは相同のアミノ酸配列を有する化学的に合成されたペプチド、又はこれらの任意の混合物（以下、これらをペプチド類と記載することがある）である。

ペプチドの単離は、例えば、前記 Lf類加水分解物の濾液を水酸化ナトリウム溶液で中和し、 80°Cで 10分間加熱して酵素を失活させ、室温に冷却し、遠心分離し、透明な上清を得る。この上清を逆相高速液体クロマトグラフィーにかけ、 0. 05WTFA (トリフルォロ酢酸）を含む 20〜60%のァセトニトリルのグラジェン卜で溶出し、 27~30%のァセトニトリル含量の画分を分別し、この画分を真空乾燥し、 Lf類由来のペプチド類が得られる。

または、ペプチド自動合成装 (フアルマシア LKBバイオテクノロジー社製。

LKBBiolynx4170)を用い、シェパード等による固相ペプチド合成法 [ジャ —ナル ·ォブ ·ケミカル'ソサイエティ一。パーキン ·トランザクション 1：オーガニック .アンド.ノヽィ才ーォ一力ニック 'ケミストリ一 (Journal of Chemical Society. Pe rki n Transaction 1 :0rganic and Bio-Organic Chemistry八第 538頁、 1981年]に基づいて次のとおりペプチドを合成することもできる。

ァミン官能基を 9 _フルォレニルメトキシカルボニル基で保護したアミノ酸 [以下 Fmoc—アミノ酸又は Fmoc—固有のアミノ酸の名称（例えば、 Fmoc— ァスパラギン）と記載することがある]に、 N, N—ジシクロへキシルカルポジィミドを添加して所望のアミノ酸の無水物を生成させ、この Fmoc—アミノ酸無水物を合成に用いる。ペプチド鎖を製造するために C一末端のアミノ酸残基に相当する Fmoc—アミノ酸無水物を、そのカルボキシル基を介し、ジメチルァミノピリジンを触媒としてウルトロシン A樹脂（フアルマシア LKBバイオテクノロジ一社製）に固定する。次いでこの樹脂をピペリジンを含むジメチルホルムアミドで洗浄し、 C一末端アミノ酸のァミン官能基の保護基を除去する。のちアミノ酸配列の C一末端から 2番目に相当する Fmoc—アミノ酸無水物を前記 C一末端アミノ酸残基を介して樹脂に固定されたアミノ酸の脱保護アミン官能基にカップリングさせる。以下同様にして順次アミノ酸を固定する。全部のアミノ酸のカップリングが終了し、所望のアミノ酸配列のペプチド鎖が形成された後、 94%TFA、 5%フエノール、及び 1 %エタンジオールからなる溶媒で保護基の除去及びペプチドの脱離を行ない、高速液体クロマトグラフィーによリぺプチドを精製し、この溶液を溏縮し乾燥すれば、合成により Lf類由来のペプチド類が得られる。

更に、これらのペプチド類と同一のアミノ酸配列若しくは相同なアミノ酸配列を有するペプチド類、これらのペプチド類の誘導体、これらのペプチド類の薬学的に許容される塩類又はこれらの任意の混合物は、例えば、前記特開平 5— 92994号公報、特開平 5— 78392号公報、特開平 5— 148297号公報、特開平 5— 1498296号公報及び特開平 5— 148295号公報の各発明に記載された方法によって得ることができる。

Lf類由来のペプチド類の有効投与量は、動物試験の結果から積算して 0. 2~320mgZ日ノ体重 kgの範囲である。

前記の方法によって得られるペプチド類としては、次のアミノ酸配列を有するペプチド類、その誘導体又は塩類を望ましい態様として例示することができる。例えば、配列番号 1、 2及び 27のアミノ酸配列を有するペプチド、その塩類又はその誘導体（特開平 5— 78392号公報）、配列番号 3、 4、 5及び 6のアミノ酸配列を有するペプチド、その塩類又はその誘導体（特開平 5— 1482 97号公報）、配列番号フ、 8、 9及び 31のアミノ酸配列を有するペプチド、その塩類又はその誘導体（特開平 5— 1498296号公報）、配列番号 10乃至 21のアミノ酸配列を有するペプチド、その塩類又はその誘導体（特開平 5— 1 48295号公報）、 S己列番号 22乃至 26、 28、 29及び 30のアミノ酸酉己列を有するペプチド、その塩類又はその誘導体（特開平 5— 92994号公報）である。

前記ペプチド類の薬学的に許容される塩類としては、塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩、クェン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩等の酸付加塩を例示でき、誘導体としては、カルボキシル基をアミド化又はァシル化した誘導体を例示することができる。

前記のとおり得られた Lf、 Lf類の加水分解物、 Lf類由来のペプチド類を、常法により糖衣錠、タブレット、カプセル等の経口投与剤、栄養剤に配合して経腸投与剤として製剤化することができる。更に、飲料若しくはゼリー等の食品に配合して食品組成物、又は飼料と配合して飼料組成物として提供することができる。

次に試験例を示して本発明を更に詳述する。試験例 1

この試験は、 Lf及び Lf類由来ペプチドの経口がん転移抑制効果を調べるために行った。

1：試験試料、試験動物及び腫瘍細胞株

(a)試験試料

市販の Lf粉末（森永乳業社製）と、この Lf粉末から参考例 2と同一の方法により調製した Lf由来ペプチドを使用した。

(b)試験動物

6週齡の CDF1マウス 90匹（日本チヤ一ルスリバ一社から購入）を、無作為に 9群（1群 10匹）に分けて使用した。

(c)腫瘍細胞

フィドラーらの方法 [ネイチヤー（Nature)、第 242卷、第 148〜149ぺージ、 1973年]を一部改良し、次のとおり調製した。マウス大腸がんコロン 26 細胞（以下 Co26細胞と記載することがある。財団法人癌研究会癌研究所、癌化学療法センターより入手） I X 10⁵個マウスを、 6週令 Balb/cマウス (日本チヤ一ルスリバ一社から購入） 3匹に尾静脈注射し、約 3週間後に生成した肺転移腫瘍を摘出して摩碎し、遊離した細胞の同数を再び同系統マウス 3匹の尾静脈に注射する。これを数回反復して、自然に肺に転移する高転移細胞系 Co26Luを選別し、本試験に使用した。尚、 Co26Luは、皮下移植後約 14曰で転移することが判明した。

2:試験方法

9群 90匹全ての CDF1マウスの背中皮下に 1 X 10⁵個の Co26Lu細胞を移植した（0日目）。各群のマウスに 5〜 9日目、 12〜 16曰目及び 19~21 曰目まで 300〜1000mg 曰 kg体重の Lf、又は 30〜100mg 曰 k g体重の Lf由来ペプチドを 1曰 1回経口投与し、対照群には何も投与しなかつた。

22曰目に肺を摘出し、アセトンで固定し、目視により肺転移巣の数を計数し、肺への転移の抑制効果を試験した。

尚、 Lf投与群中 1群には 150mgZ日/ "kg体重を 1 日 2回（表 1において 150 X 2と表示）、ペプチド投与群中 1群には 15mgZ日 Zkg体重を 1日 2 回（表 1において 15 X 2と表示）投与した。 3：試験結果

この試験の結果は、表 1に示すとおりである。表 1から明らかなとおり、 Lf 及び Lf由来のペプチド投与群は、投与量に応じて転移数はほぼ半減し、これらの物質のがん転移抑制効果が明らかに認められた。更に詳しくは、 Lf投与群では 300mgノ日 kg体重の投与量であっても、これを 1 日 2回に分割して投与した群がより有効であり、一方 Lf由来ペプチド投与群では 2回に分割して投与する意義は認められなかった。

また一般の転移抑制剤では、その毒性のため移植した腫殤の縮小が観察されるが、本試験では移植腫瘍の大きさは、対照群と Lf及び Lf由来ペプチド投与群との間で差がなく、これらの毒性が低いことが推定された。更に、各臓器の顕微鏡観察によっても、肝臓等他の臟器への転移は認められなかった。

以上の結果から、 Lf及び Lf由来のペプチドは、経口がん転移抑制効果があることが明らかであった。尚、他のペプチド類についても同様の試験を行つたが、ほぼ同様の結果が得られた。

表 1

投与量転移数

試験群

(mg/日/ kg体重）中央値範困

対照群 0 56.0 47- 95

1000 28.0 20 - 44

300 37.0 5- 53

Lf群 100 44.5 10 - 67

150 X 2 27.5 21-111

100 31.0 6 - 49

ペプチド 30 36.5 12 - 86

群 10 47.5 35 - 71

15 X 2 38.0 21 - 65 試験例 2

この試験は、 Lf、 Lf加水分解物、及び Lf類由来ペプチド類の経口がん転移抑制効果を調べるために行った。

1：試験試料、試験動物及び腫瘍細胞株

(a)試験試料

市販の Lf粉末（森永乳業社製。第 1群に投与）、参考例 1と同一の方法によりこの Lf粉末から調製した Lf加水分解物（第 2群に投与）、参考例 2と同一の方法によりこの加水分解物から調製した Lf由来ペプチド（第 3群に投与）、及び参考例 3と同一の方法により化学的に合成した Lf類由来ペプチド（有機合成ペプチド。第 4群に投与）を使用した。尚、対照としてゥシ血清アルブミン (シグマ社製のフラクション V。対照群に投与）を使用した。

(b)試験動物

6週齡の CDF1マウス 20匹（日本チヤ一ルスリバ一社から購入）を、無作為に 4群（ 1群 5匹）に分けて使用した。

(c)腫瘍細胞

試験例 1で調製した肺への高転移細胞系 Co26Luを使用した。

2:試験方法

Co26Lu細胞を移植後、各群に 5曰目から 27日目まで毎日 1回、表 2に示す投与量により投与したこと、及び 28日目に肺を摘出したことを除き、試験例 1と同一の方法により試験した。

3:試験結果

この試験の結果は表 2に示すとおりである。表 2から明らかなとおり、第 1 群から第 4群はいずれも対照群と比較して転移数が少なく、これらの投与によるがん転移抑制効果が認められた。尚、他の Lf、 Lf類加水分解物、及び Lf類由来ペプチド類についても同様の試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。表 2

試験例 3

この試験は、 Lf類加水分解物の急性毒性を調べるために行った。

1 :使用動物

6週齡の CD (SD)系のラット（日本 SLCから購入）の両性 20匹を用い、雄及び雌を無作為にそれぞれ 4群（ 1群 5匹）に分けて使用した。

2:試験方法

参考例 1と同一の方法により製造した Lf加水分解物を、注射用水（大塚製薬社製）に溶解し、 4mlZl00g体重の割合で金属製玉付き針を用いて単回強制経口投与し、急性毒性を試験した。投与量は 1000、 2000及び 4000

1718 1<£体でぁっに。

3:試験結果

この試験の結果は、表 3に示すとおりである。表 3から明らかなとおり、この加水分解物を 1 OOOmgZkg体重及び 2000mgZkg体重の割合で投与した群に死亡例は認められなかった。従って、この加水分解物の LD₅。は、 200 OmgZkg体重以上であり、毒性は極めて低いことが判明した。尚、他の Lf加水分解物及び Lf類由来のペプチド類についても同様の試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。表 3

死亡数ノ例数

用量

(mg/kg) 雄

0 0 / 5 0 / 5

1000 0 / 5 0 / 5

2000 0 / 5 0 / 5

4000 4 1 5 3 / 5 試験例 4

この試験は、ペプチド類の急性毒性を調べるために行った。

1.使用動物

6週齡の CD(SD)系のラッ卜（日本 SLCから購入）の両性 35匹を用し、、雄及び雌を無作為にそれぞれ 7群（ 1群 5匹)に分けて使用した。

2:試験方法

参考例 2と同一の方法で製造した Lf由来のペプチド（加水分解物より精製したペプチド）及び参考例 3と同一の方法にょリ製造したペプチド（有機合成によるペプチド）を、注射用水（大塚製薬社製）に溶解し、 4ml / 100g体重の割合で金属製玉付き針を用いて単回強制経口投与し、急性毒性を試験した。投与量は 1000、 2000及び 4000m gZ kg体重であった。

3:試験結果

この試験の結果は、表 4に示すとおりである。表 4から明らかなとおり、いずれのペプチドを投与した場合も 1000m gZ kg体重及び 2000mg/ kg体重の割合で投与した群に死亡例は認められなかった。従って、これらのぺプチドの LD 50 は、 2000mgZkg体重以上であリ、毒性は極めて低いことが判明した。尚、他のペプチド類についても同様の試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。表 4

次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものでない。尚、各実施例で使用した Lf加水分解物及びペプチド類は、以下の参考例と同一の方法により調製した。参考例 1： Lf加水分解物の調製

ゥシの Lfを使用して加水分解物を次の方法により調製した。

市販されているゥシの Lf (ミライ社製） 500gを精製水 9. 5リットルに溶解し、得られた溶液に塩酸を添加して pHを 3. 0に調整し、のち市販の豚ぺプシン（和光純薬工業社製）を 1 Og添加し、 37°Cで 6時間加水分解した。次に 6 規定の水酸化ナトリウムで pHを 7. 0に調整し、 80°Cで 10分間加熱して酵素を失活させ、室温に冷却し、セライト濾過し、濾液を凍結乾燥し、粉末状の Lf加水分解物約 470_gを得た。得られた加水分解物の分解率を前記と同一の方法により測定した結果、 30%であった。参考例 2:ペプチド類の調製

市販されているゥシの Lf (シグマ社製） 50m gを精製水 0. 9mlに溶解し、 0. 1規定の塩酸で pHを 2. 5に調整し、のち市販のブタペプシン（シグマ社製） 1 mgを添加し、 37°Cで 6時間加水分解した。次いで 0. 1規定の水酸化ナトリウムで pHをフ. 0に調整し、 80°Cで 10分間加熱して酵素を失活させ、室温に冷却し、 15, OOOrpmで 30分間遠心分離し、透明な上清を得た。この上清 1 OO ju Iを TSKゲル ODS— "! 20T (東ソ一社製）を用いた高速液体ク口マトグラフィーにかけ、 0. 8mlZ分の流速で試料注入後 10分間 0. 05% TFA (トリフルォロ鲊酸）を含む 20%ァセトニトリルで溶出し、のち 30分間 0. 05 TFAを含む 20〜60%のァセトニトリルのグラジェントで溶出し、 24〜 25分の間に溶出する画分を集め、真空乾燥した。この乾燥物を 2% (W V) の濃度で精製水に溶解し、再度 TSKゲル ODS— 1 20T (東ソ一社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、 0. 8mlZ分の流速で試料注入後 10 分間◦. 05%TFAを含む 24%ァセトニトリルで溶出し、のち 30分間◦. 0 5%TFAを含む 24〜32%のァセトニトリルのグラジェントで溶出し、 33. 5 〜35. 5分の間に溶出する画分を集め、真空乾燥し、ペプチドを得た。

前記のペプチドを 6規定塩酸で加水分解し、アミノ酸分析計を用いて常法によりアミノ酸組成を分析した。同一の試料を気相シーク工ンサ一（アプライド'バイオシス亍ムズ社製）を用いて 25回のエドマン分解を行ない、 25個のアミノ酸残基の配列を決定した。また DTNB[ 5, 5—ジチ才一ビス（2—二ト口べンゾイツク 'ァシド）]を用いたジスルフイド結合分析法 [アナリ亍ィカル -バィォケミストリー（Analytical Biochemistry )、第 67巻、第 493頁、 1975 年]によりジスルフイド結合が存在することを確認した。

その結果、このペプチドは、 25個のアミノ酸残基からなり、 3番目と 20番目のシスティン残基がジスルフイド結合し、 3番目のシス于イン残基から N— 末端側に 2個のアミノ酸残基が、 20番目のシスティン残基から C一末端側に 5個のアミノ酸がそれぞれ結合した、配列番号 26に記載のアミノ酸配列を有していることが確認された。参考例 3:ペプチド類の有機合成

ペプチド自動合成装置（フアルマシア LKBバイオテクノロジー社製。 LKB Biolynx4170)を用い、シェパード等による固相ペプチド合成法 [ジャーナル '才ブ ·ケミカル'ソサイエティ一。パーキン'トランザクション 1：才一ガニック -アンド■ノヽィォ一才一力ニック 'ケミストリ一 (Journal of Chemical Society. Perki n Ί ransaction 1 :Organic and Bio - Organic Chemistryリ、第 538頁、 1981年]により、ペプチドを次のとおり合成した。

ァミン官能基を 9一フル才レニルメトキシカルボニル基で保護したアミノ酸に、 N, N—ジシクロへキシルカルボジイミドを添加して所望のアミノ酸の無水物を生成させ、この Fmoc—アミノ酸無水物を合成に用いた。ペプチド鎖を製造するために C一末端のァスパラギン残基に相当する Fmoc—ァスパラギン無水物を、そのカルボキシル基を介し、ジメチルァミノピリジンを触媒としてゥル卜ロシン A樹脂（フアルマシア LKBバイオテクノロジー社製）に固定する。次いでこの樹脂をピペリジンを含むジメチルホルムアミドで洗浄し、 C一末端アミノ酸のアミン官能基の保護基を除去する。のちアミノ酸配列の C一末端から 2 番目に相当する Fmoc —アルギニン（ Pmc:2,2,5,7,8— Pentamethy卜 chroman-6-sulphonyl 基）無水物を前記 C—末端アミノ酸残基を介して榭脂に固定されたァスパラギンの脱保護アミン官能基にカップリングさせた。以下同様にして順次グルタミン、トリブトファン、グルタミン、及びフエ二ルァラ二ンを固定した。全部のアミノ酸のカップリングが終了し、所望のアミノ酸配列のペプチド鎖が形成された後、 94%TFA、 5%フエノール、及び 1 %エタンジォールからなる溶媒で保護基の除去及びペプチドの脱離を行ない、高速液体ク口マトグラフィ一によりペプチドを精製し、この溶液を濃縮し、乾燥し、ペプチド粉末を得た。

前記のペプチドについてアミノ酸分析計を用いて常法によリアミノ酸組成を分析し、次に参考例 2と同一のシークェンサ一により配列を決定した結果、配列番号 10に記載のアミノ酸配列を有することを確認した。参考例 4:アポラクトフエリンの調製

脱脂乳から調製した市販のゥシ Lf粉末（ドモ社製） 1 kgを精製水 20リットルに溶解し、透析チューブ（三光純薬社製。 1—7Z8)に入れ、 400リットルの 0. 1 Mクェン酸溶液（pH2. 2)に対して 4°Cで 36時間透析し、更にクェン酸を除去するため、 400リットルの脱イオン水に対して、 4°Cで 24時間透析し（2回脱イオン水を交換）、透析内液を遠心分離して固形物を除去し、凍結乾燥し、粉末状のアポラクトフエリン約 950gを得た。得られたアポラクトフエリンを分光光度計（日立製作所製。 2000U)を用い、 450nmの吸光度により、鉄の飽和度を測定した結果、飽和度は 0%であった。参考例 5:アポラクトフ;！:リン加水分解物の調製

参考例 4のゥシアポラクトフエリンを使用し、その加水分解物を次の方法により調製した。アポラクトフエリン 500gを精製水 9. 5リットルに溶解し、得られた溶液に 1 M塩酸を添加して _PHを 2. 0に調整し、 120°Cで 15分間加熱し、冷却して加水分解物を得た。次に、 6M水酸化ナトリウムで pHをフ. 0に調整し、セライト漉過し、濂液を凍結乾燥し、粉末状のアポラクトフ:！:リン加水分解物約 400gを得た。この加水分解物の分解度は 9%であった。参考例 6:アポラクトフエリン由来ペプチド類の調製

参考例 5のゥシアポラクトフエリン加水分解物 50mgを、精製水 0. 9rrHに溶解し、以下参考例 2と同一の方法で精製した。精製の最後の TSKゲル 0D S— 120T (東ソ一社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーでは 35. 5〜3 7. 5分の間に溶出する画分を集め、真空乾燥し、アポラク卜フェリン由来のぺプチドを得た。

前記のペプチドを参考例 2と同一の方法で加水分解し、アミノ酸組成を分祈し、アミノ酸配列を決定し、更に DTNBを用いたジスルフイド結合分析法によりジスルフイド結合が存在することを確認した。

その結果、このペプチドは、 32個のアミノ酸残基からなり、 10番目と 27番目のシスティン残基がジスルフイド結合し、 10番目のシス亍イン残基から N— 末端側に 9個のアミノ酸残基が、 27番目のシスティン残基から C一末端側に 5個のアミノ酸がそれぞれ結合した、配列番号 29に記載のアミノ酸配列を有していることが確認された。実施例 1： Lfを含有する動物用粉末飼料の調製

ゥシの Lf (ミライ社製） 60g及び MF粉末飼料（オリエンタル酵母社製） 3k gを粉末混合機（関東混合機社製。 SS機種、型式 No. 151 )で 30分間混合し、 500gずつポリエチレン製の袋に分包し、 2%Lf含有飼料を得た。尚、この飼料を冷蔵庫内に保存した。実施例 2: Lfを配合した経腸栄養剤の調製

粉末状ゥシの Lf (ミライ社製） 2g及び市販の経腸栄養剤（エーザィ社製。クリニミール） 1包（89g)に 50〜60°Cの温湯 100mlを添加し、泡立て器で均一に混合し、更に温湯 240mlを添加して完全に溶解し、これを 1日数回分に分けて投与した。実施例 3: Lfを添加した飲料の調製

脱脂粉乳（森永乳業社製） 90gを、 50°Cの温湯 800mlに溶解し、砂糖 (日新精糖社製） 30g、インスタントコーヒー粉末（ネスレ社製） 14g、カラメル (昭和化工社製） 2g及びコーヒーフレーバー（三栄化学社製） 0. 01gを撹拌しながら順次添加して溶解し、 10°Cに冷却し、ゥシの Lf (森永乳業社製） 1g を水 75mlに溶解した液を添加し、 LfO. 1%を含む乳飲料を調製した。実施例 4: Lf散剤の調製

予め 6号ふるい（井内盛栄堂社製）で分別した市販のゥシの Lf粉末（ミライ社製） 10g及び乳糖（森永乳業社製） 50gを乳鉢中で混和し、これに予め 5号ふるい（井内盛栄堂社製）で分別した乳糖 40gを添加して混和し、全量を再度 5号ふるいで分別し、 1包 5gずつ分包機（東京商会。 OMP— 90A)で分包し、 10%Lf散剤を得た。尚、この散剤を冷暗所に保存した。実施例 5: Lf配合レアチーズケーキの調製

(1) ビスケット（森永製菓社製） 8枚計約 160gを細切し、加温して溶融したバター（森永乳業社製） 30gと混合した。

(2) ビスケットバター混合物（1)を 18cmの丸底容器に敷き詰め、 $圣く押し固めた。

(3) 粉末ゼラチン（マルハ社製） 5gを水 30mlに膨潤させ、加温して溶解した。

(4) ゥシの Lf (ミライ社製） 10gを、 50°Cに加温した牛乳（森永乳業社製） 60mlに；、容 |¾¥した。

(5) クリームチーズ（森永乳業社製） 250gを加温して軟化し、クリーム状とし、グラニュー糖（三井精糖社製） 50gを添加して混練した。

(6) クリームチーズ（5)にゼラチン液（3)、牛乳（4)、レモン汁 1 /2個分を添加して混合し、冷却した。

(7) 生クリーム（森永乳業社製） 60mlを泡立ててクリームチーズ混合物 (6)に添加し、容器（2)に充填し、冷蔵庫で冷却して固化した。実施例 6: Lf錠剤の調製

約 1リットルの乳鉢（中島製作所製）に結晶セルロース（和光純薬工業社製） 20gを取り、水 20mlを添加して混和し、次いで予め 48メッシュのふるい (和科盛社製）で分別した乳糖（森永乳業社製） 25g及びゥシの Lf (森永乳業社製） 55gを添加して混和した。得られた湿塊をステンレス製 20メッシュふるし、（和科盛社製）上に取り、乾燥用ステンレス板 2枚の上に手で押し出して顆粒を形成し、手早く均等に分布させ、乾燥機に入れ、 25°Cで 2日間乾燥し、微細な顆粒を得た。

乾燥した顆粒を、ポリエチレン製 20メッシュふるいで分別し、ふるいを通過した顆粒を、広い紙上に広げ、予め 48メッシュで分別したステアリン酸マグネシゥ厶（関東化学社製） 2gを添加し、手で混ぜて均質にした。これを打錠機 (木村製作所製。 KT一 2型）により直径 8mmの R杵を使用して、打錠数を 1 0、錠剤重量を 0. 62g及びモンサン卜硬度 3. 5〜5. Okgの圧縮圧力を設定して打錠し、 50%Lf含有剤を得た。この錠剤を遮光したデシケーター（日本理化学機器社製。 NRT— 90B)中に保存した。実施例 7:カプセル入り Lf加水分解物の調製

乳糖（和光純薬社製） 60g、トウモロコシデンプン（日清製粉社製） 40g、結晶セルロース（和光純薬社製） 40_g及び参考例 1と同一の方法により調製したゥシ Lf加水分解物 60gを 50メッシュふるい（ャマト科学社製）により分別し、厚さ 0. 5mmのポリエチレン製の袋にとり、転倒混合し、全自動カプセル充填機（Cesere Pedini 社製。プレス式）を用い、前記粉末をカプセル（日本エランコ社製。 1号ゼラチンカプセル、 Op. Yellow No.6 Body、空重量は 75m g)に内容量 275m gで充填し、ゥシ Lf加水分解物 82m g入りのカプセル剤を得た。尚、このカプセル剤を室温で保存した。実施例 8: Lf加水分解物を含有する固形飼料の調製

参考例 1と同一の方法により調製したゥシの Lf加水分解物粉末 5g及び固形げつ歯類用飼料（船橋農場社製。 F2) 1. 5kgを厚さ 0. 2mmの透明ポリエチレン製袋に入れ、開口部をポリエチレン製のひもで閉鎖し、手で上下左右に約 10分間振通し、粉末を固形試料の微細な穴に入り込ませると同時に均一に混合し、のち 200gずつポリ袋に分包し、 0. 33%Lf加水分解物含有固形飼料を得た。尚、この飼料を冷暗所に保存した。実施例 9: Lf加水分解物由来ペプチドを含有する錠剤

Lf加水分解物から得られたペプチド

(参考例 2と同一の方法により製造） 50 (mg) 結晶セルロース 170

コーンスターチ 66

タルク 11

ス亍アリン酸マグネシウム 3

1錠当り前記の割合の各原料を常法により均一に混合し、造粒し、乾燥し、打錠し、 17%のペプチドを含有する錠剤を得た。なお、 Lf類加水分解物から得られたペプチド以外の原料はいずれも市販品を用いた。実施例 10: Lf類加水分解物由来ペプチドを配合したババロアの調製

板ゼラチン（マルハ社製） 3枚約 9gを水で膨潤させ、チョコレート（森永製菓社製。製菓用） 30gを、細切して湯せんにつけて溶融した。これとは別にボールに卵黄 3個分を入れ、砂糖（三井精糖社製） 70gを添加し、白みを带びるまで泡立て器で授拌し、これに前記溶融チョコレートを添加し、更に攪拌して混合し、 50°Cに加温した牛乳（森永乳業社製） 220m Iを徐々に添加し、鍋に移し替えて弱火にかけ、絶えず攪拌しながら加熱し、のち火を止めて膨潤させたゼラチンを添加し、攪拌しながら溶解し、ステンレス製こし器で濾過し、氷水中で冷却し、約 50°Cに冷却したとき 30mlの牛乳に懸濁したゥシの Lf由来べプチド（参考例 2と同一の方法により調製） 1 gを添加し、攪拌して混合した。 —方、生クリーム（森永乳業社製。脂肪分 45%ホイップクリーム） 100mlをボールに入れ、泡立て器で泡立て、これを前記の混合液に流し入れ、手早く混合してステンレスの型に流し入れ、冷蔵庫内で固化し、チョコレートババロァを得た。実施例 11： Lf由来有機合成ペプチドを含有する散剤

Lf類由来の有機合成ペプチド

(参考例 3と同様の方法により製造） 50 (mg) 結晶セルロース 375

コーンスターチ 575

1袋当り前記各材料を均一に混合し、常法により散剤 15袋を調製した。尚、有機合成ペプチド以外の原料はいずれも市販品を用いた。実施例 12:有機合成ペプチドを含有するカプセル剤

Lf類由来の有機合成ペプチド

(参考例 3と同一の方法により製造） 10 (mg) 乳糖 120

結晶セルロース 42

カルボキシメチルセルロース 10

タルク 15

ス亍アリン酸マグネシウム 3 1錠当り前記の割合の各原料を、常法により均一に混合し、カプセル充填機を用いてカプセル剤を調製した。尚、有機合成ペプチド以外の原料はいずれも市販品を用いた。実施例 1 3 : Lf類加水分解物を含有する固形飼料の調製

参考例 6と同一の方法により調製したゥシのアポラクトフ：!:リン加水分解物の粉末 5 gを用い、実施例 8と同一の方法により、 0. 3 3 %アポラクトフエリン加水分解物含有固形飼料を得た。尚、この飼料を冷暗所に保存した。実施例 1 4 :アポラクトフエリン加水分解物由来ペプチドを含有する錠剤

アポラクトフエリン加水分解物から得られたペプチド

(参考例 6と同一の方法により製造） 5 0 ( m g ) 結晶セル口一ス 1 7 0 コーンスターチ 66 タルク 1 1

ステアリン酸マグネシウム 3

1錠当り前記の割合の各原料を常法により均一に混合し、造粒し、乾燥し、打錠し、 1 7 %のペプチドを含有する錠剤を得た。尚、アポ Lf加水分解物から得られたペプチド以外の原料はいずれも市販品を用いた。産業上の利用可能性

本発明のがん転移抑制剤は、食品、医薬品等として経口的に容易に摂取してがんの転移を抑制できる。また、本発明のがん転移抑制剤は、食品である乳に由来する蛋白質である Lf、 Lf類の加水分解物又は Lf類に由来するべプチド類を有効成分としているので、長期間使用しても副作用がなく、安全である。 iH列表

配列番号： 1

配列の長さ： 1 1

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列の特徴：本ペプチド、及び本ペプチドをフラグメントとして含むペプチド。

次の配列において、 R01 は Cys を除く任意のアミノ酸残基を示す。

配列：

し ys 01 R01 R01 R01 G i n R01 R01 Met Lys Lys

1 5 10

配列番号： 2

配列の長さ： 1 1

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列：

し ys R01 R01 R01 R01 G i n R01 R01 Met Arg Lys

1 5 10

配列番号： 3

配列の長さ： 6

配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

次の配列において、 R01 は Gys を除く任意のアミノ酸残基を示す。

配列：

Ar g R01 R01 R01 R01 Ar g

1 5

配列番号： 4

配列の長さ： 6

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列：

Lys R01 R01 R01 R01 Ar g

1 5

配列番号： 5

配列の長さ： 6

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列：

Lys R01 R01 R01 R01 し ys

1 5

配列番号： 6

配列の長さ： 6

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列：

Arg R01 R01 R01 R01 Lys

1 5

配列番号： 7

配列の長さ： 5

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列：

Arg R01 R01 R01 Arg

1 5 配列番号： 8

配列の長さ： 5

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列：

し ys R01 R01 R01 Arg

1 5

配列番号： 9

配列の長さ： 5

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列：

Arg R01 R01 R01 し ys

1 5

配列番号： 10

配列の長さ： 6

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

配列の特徴：本ペプチド、及び本ペプチドをフラグメントとして含むペプチド配列：

Phe Gin T r p Gin A r g As n

1 5

配列番号： 1 1

配列の長さ： 5

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列の特徴：本ペプチド、及び本ペプチドをフラグメントとして含むペプチド ₍ 配列：

Phe Gin Trp Gin Ar g

1 5

配列番号： 12

配列の長さ： 4

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列の特徴：本ペプチド、及び本ペプチドをフラグメントとして含むペプチド。配列：

Gin Trp Gin Ar g

1

配列番号： 13

配列の長さ： 3

配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列の特徴：本ペプチド、及び本ペプチドをフラグメントとして含むペプチド, 配列：

Trp Gin Arg

1

配列番号： 14

配列の長さ： 5

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列の特徴：本ペプチド、及び本ペプチドをフラグメントとして含むペプチド , 配列：

Ar Ar Trp Gin Trp

1 5

配列番号： 15

配列の長さ： 4

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

Arg Ar Trp Gin

1

配列番号： 16

配列の長さ： 4 配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

Trp Gin T r p A r g

1

配列番号： 17

配列の長さ： 3

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

Gin Trp Arg

1

配列番号： 18

配列の長さ： 6

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

Leu ftr g Trp Gin As n Asp

1 5

配列番号： 19 配列の長さ： 5

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

Leu A r g T r p Gin As n

1 5

配列番号： 20

配列の長さ： 4

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

Leu A r g Trp Gin

1

配列番号： 21

配列の長さ： 3

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

Arg Trp Gin

1 配列番号： 22

配列の長さ： 20

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

次の配列において、 2番の Cysと 19番の Cysがジスルフイド結合している。

配列：

Ly s Cys Ar g A r g T r p Gin T r p Ar g Met L s Ly s Leu G ι y Ala Pro 1 5 10 15

Ser l ie Thr Cys Va I

20

配列番号： 23

配列の長さ： 20

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

次の配列において Cys*は、ジスルフイド結合の形成を防止するため、チオール基を化学的に修飾したシスティンを示す。配列：

Ly s Cys* Ar g Ar g T r p Gin Trp Ar g Met Ly s Ly s Leu G I y A I a Pro 1 5 10 15 Ser Me Thr Cys* Va I

20 配列番号： 24

配列の長さ： 20

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

次の配列において、 2番の Cysと 19番の Cysがジスルフイド糸 o σしししゝ Ό ο

配列：

し ys Cys Phe Gin T r p Gin A r g Asn Met Ar g し ys Va I A r g G I y Pro

1 5 10 15

Pro Va I Ser Cys I I e

20

配列番号： 25

配列の長さ： 20

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

次の配列において C *は、ジスルフイド結合の形成を防止するため、チオール基を化学的に修飾したシスティンを示す。配列：

Ly s Cys* Phe Gin T r p Gin Ar g Asn Met Ar g Ly s Va I Ar g G I y Pro 1 5 10 15 Pro Va I Ser Cys* I I e

20 配列番号： 26

配列の長さ： 25

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

次の配列において、 3番の Gysと 20番の Cysがジスルフイド結合している。

配列：

Phe Ly s Cys Ar g Ar g I'rp Gin T r p A r g Met Ly s Ly s Leu G I y Ala

1 5 10 15

Pro Se r l ie Th r Cys Va I Ar g Ar g A I a Phe

20 25

配列番号： 27

配列の長さ： 1 1

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列の特徴：本ペプチド、及び本ペプチドをフラグメントとして含むぺプチ

配列：

Ly s Th r Ar g Ar g i'rp Gin Trp Ar g Met Ly s Ly s

1 5 10

配列番号： 28

配列の長さ： 38

配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

次の配列において、 16番の Cysと 33番の Cysとがジスルフイド結合している。

配列：

し ys As n Va I Ar g T r p Cys Th r I I e Ser Gin Pro G I u T r p Phe し ys 1 5 10 15

Cys Ar g A r g T r p Gi n T r p Ar g Met Ly s し ys Leu G I y A I a Pro Ser

20 25 30 l ie Thr Cys Va I Ar g Ar g A I a Phe

35

配列番号： 29

配列の長さ： 32

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

下記配列において、 10番の Cysと 27番の Cysとがジスルフイド結合している。

配列：

Thr l ie Ser Gin Pro Glu T r p Phe Ly s Cys Ar g Ar g T r p Gin Tr p 1 5 10 15

Ar g Met Ly s Ly s Leu G I y Ala Pro Ser I I e Thr Cys Va I Ar g Ar g

20 25 30

Ala Phe 配列番号： 30

配列の長さ：47

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類. 'ペプチド

次の配列において、配列の長さ 36であって 9番、 26番、及び 35番に Cysを有するペプチドの、 9番の Gys と 26番の Cys とがジスルフイド結合し、上記配列の長さ 36のペプチドの 35 番の Cys力《、配列の長さ" Mであって 10番に Cysを有するぺプチドの 10番の Cysとがジスルフイド結合している。

配列：

Va I Ser Gin Pro Glu A I a Thr Lys Cys Phe Gin Trp Gin Ar Asn 1 5 10 15 Met Ar g Lys Va I Ar g G I y Pro Pro' Va I Ser Cys I I e Lys Ar g Asp

20 25 30

Ser Pro l ie Gin Cys l ie

35

G I y Ar g Ar g Ar g Ar g Ser Va I Gin Trp Cys A I a

1 5 10

配列番号： 31

配列の長さ： 5

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列の特徴：本ペプチド、及び本ペプチドをフラグメントとして含むペプチド。次の配列において、 R01 は Cys を除く任意のアミノ酸残基を示す。

配列：

Lys R01 R01 R01 Lys

1 5

Claims

請求の範囲

1 . 非鉄飽和ラク卜フェリン、ラクトフエリン類の加水分解物、該加水分解物の薬学的に許容される誘導体、該加水分解物の薬学的に許容される塩類、ラクトフ:！:リン類の加水分解物由来のペプチド類、該ペプチド類の薬学的に許容される誘導体及び該ペプチド類の薬学的に許容される塩類からなる群より選択される 1種又は 2種の物質を有効成分として含有する経口がん転移抑制剤。

2. 非鉄飽和ラク卜フェリン、ラクトフエリン類の加水分解物、該加水分解物の薬学的に許容される誘導体、又は該加水分解物の薬学的に許容される塩類が、 3〜 3200 m gZ曰 Z体重 kgの割合で経口的に投与される請求項 1に記載の経口がん転移抑制剤。

3. ラクトフエリン類の加水分解物由来のペプチド類、該ペプチド類の薬学的に許容される誘導体、又は該ペプチド類の薬学的に許容される塩類が、 0. 2

〜 320 m gZ曰ノ体重 kgの割合で経口的に投与される請求項 1に記載の経口がん転移抑制剤。

4. 該ペプチド類が、配列番号 1から配列番号 3 1のいずれかに記載のァミノ酸配列を有する請求項 1又は請求項 3に記載の経口がん転移抑制剤。

5. 請求項 1から 4のいずれかに記載の経口がん移転抑制剤を必須成分として含有する食品組成物。

6. 請求項 1から 4のいずれかに記載の経口がん移転抑制剤を必須成分として含有する飼料組成物。