WO1998005960A1

WO1998005960A1 - Methode et reactifs pour detecter le cancer du colon

Info

Publication number: WO1998005960A1
Application number: PCT/JP1997/002690
Authority: WO
Inventors: Keiichi Mitsuyama; Kyuichi Tanikawa; Mitsuya Hanatani; Isamu Matsubara; Katsuhiko Matsuo
Original assignee: Toagosei Co. Ltd.
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1997-08-01
Publication date: 1998-02-12

Description

明細書大腸癌の検査方法及び検査薬

技術分野

本発明は、糞便中の血管内皮細胞増殖因子/血管透過性因子の量を測定することによる大腸癌の検査方法及びそれに使用する検査薬に関するものであり、医療の診断技術及び検査薬技術に関するものである。背景技術

現在大腸癌患者は年々増加しており、早期発見のための検査方法が必要とされている。大腸癌は進行が比較的緩やかであり、進行癌でも治癒切除が完全に行われれば予後は比較的良好であるが、かなり進行するまで自覚症状が少なく確定診断時にすでに転移や浸潤等をおこして切除不可能な場合も少なくない。

大腸癌の検査として便の免疫潜血反応検査が現在広く用いられているが、その陽性率は 50~60%にすぎない。また大腸癌の腫瘍マーカーとしては、癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen, 以下「CEA」という）、 CA 1 9— 9、 NCC - ST— 439、 ST N等があり、治療効果の判定や再発のモニ夕一として用いられている力早期大腸癌の発見に関しては十分な腫瘍マーカーであるとはいいがたいものである。なぜなら、病期別腫瘍マ一カー陽性率は治癒切除可能な Dukes C においても C EA、 CA 19— 9、 NCC- ST-439, STNで各々 36%、 30%、 35%、 2 1 %にすぎないのである（大倉久直他「大腸がんの腫瘍マーカー」 CRC, 1 (4), 42-47(1992)) 。

—方、血管新生、即ち毛細血管内皮細胞の増殖、移動及び組織への浸潤は胎児の生長、創傷治癒、癌細胞の増殖等の生理的又は病理的現象において重要な役割を果たしていることが知られている [Folkman 丄， Cancer Res. 46:467 (1986)] 。

血管新生を誘導する因子としては、直接的に血管内皮細胞に作用する物質として塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor, b FGF) 、酸性線維芽細胞增殖因子（acidic fibroblast growth factor, a F G F) 、血管内皮細胞增殖因子 Z血管透過性因子（vascular endothelial growth factor/ vascular permeability factor, 以下「V E G F」としヽぅ) 、血小板由来内皮細胞増殖因子（platelet— derived endothelial cell growth factor, P D - E C G F ) 等が、また間接的に血管内皮細胞に作用する物質としてトランスフォーミング增殖因子 a (transforming growth factor- a , Ύ G F - a ) 、トランスフォーミング增殖因子 3 (transforming growth factor- β , TG F - β ) 、アンギオゲニン (angiogenin)、腫暴壊死因子 σ ( tumor necrosis factor- α , T N F— ひ）等が見つけられている [Folkman J. & Shing Y. , J. Biol. Chem. , 267:10931 (1992) ] 。

V EG Fに関しては、マウス、ラッ卜、モルモット、ゥシ及びヒ卜の正常又は腫瘍細胞株で分泌されており、また組織別では脳、下垂体、腎臓、卵巣に存在することが明らかにされている [Ferrara N. , et al.， Endocrine Reviews, 13:18 (1992) ] 。

またヒト V EG Fは乳癌の血管新生と転移 [Weider N. , et al. , Ν. Engl. J. Med. , 324:1 (1991) ]ゃ腎細胞癌の血管新生 [医学のあゆみ 168:231 (1994) ] 、あるいは網膜疾患における血管新生 [Adamis A. P. , et al. , Biochem. Biophys. Res. Co麵. , 193:631 (1993) ]に関与していること力報告されている。

ヒト V E G Fの遺伝子についてはその c DN Αがすでに単離されて塩基配列が決定され、アミノ酸配列も推定されている。この遺伝子では 1つの遺伝子からァミノ酸残基数の異なる 4種類の蛋白（アミノ酸残基数が 1 2 1個、 1 6 5個、 1 89個、 2 0 6個の 4種類）が作られ、それらの中で 1 2 1個のアミノ酸残基数のもの（V E G F ₁₂₁)と 1 6 5個のアミノ酸残基数のもの（V E G F ₁₆₅) 力 '分泌蛋白であるといわれている [Ferrara N. , et al.， Endocrine Reviews, 13:18 (1992)1 。 V EG F ₁₂₁ は V EG F ₁₆₅ のカルボキシル末端の 44個のァミノ酸が欠損したものである力 V EG F ₁₂₁ と V EG F _{l 65} の間に、血管内皮細胞に対する作用の違いがあるかどうかについては明らかでない。

—方、ヒ卜 V EG F ₁₂₁ に対するモノクローナル抗体はすでに本発明者らにより取得されている（特開平 8 - 1 69898号「ぺプチド及びモノクローナル抗体」）。更に、そのモノクローナル抗体及びヒ卜 V E G F ₁₂₁ に対するポリクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法により、数 pg/ml の VEGFが測定できることも明らかにされている（特開平 8— 313522号「血管透過性因子の測定方法」）。発明の開示

本発明者らは、以上のような状況の中で、大腸癌患者の糞便中の V EG Fの量を測定することにより、大腸癌の早期検査ができないか検討を行ったのである。即ち、本発明は大腸癌のスクリーニングとしての早期検査方法及びモニタリング Sを提供することを目的とするものである。

本発明者らは、大腸癌患者の糞便を試料として用い、糞便中の V EG F濃度を測定することにより、 80 %以上の陽性率で大腸癌の検査ができることを見い出し、本発明を完成させたのである。

即ち、本発明は、ヒト糞便中の血管内皮細胞増殖因子 Z血管透過性因子 (VEGF) の量を測定することを特徴とする大腸癌の検査方法、及び血管内皮細胞増殖因子 Z血管透過性因子（VEGF) と特異的に反応する物質を含むことを特徴とする大腸癌検査薬を提供するものである。

以下、本発明について詳説する。

血清中の VEGF濃度の測定には、 VEGFと特異的に反応する物質、例えば抗 V E G F抗体又は V E G F受容体等を用いる公知の標識免疫測定法が適しており、本発明においても好ましい方法である。

例えば、抗 VEGF抗体や VEGF受容体等を用いる際には、標識として放射性同位元素、酵素、発光物質、蛍光物質等を用いる標識免疫測定法等や、抗 VEGF抗体や VEGF受容体等を結合した赤血球、ラテックス、金属粒子、金属ゲル、パクテリオファージ等を用いる凝集反応やクロマト法等が適用される。特に、臨床で応用される場合は、酵素免疫測定法が好適であり、また実際に臨床で酵素免疫測定法は広く用いられている。酵素免疫測定法（E I A法）は、酵素活性を指標として抗原抗体反応を追跡し、これから抗原又は抗体の量を測定する方法であり、その詳細は、例えば北川等による「酵素免疫測定法 No.31蛋白質核酸酵素別冊 1987年」に明らかにされている。この測定法は、測定対象、標識物質、抗原抗体反応の形式、結合体 Z遊離体の分離方法（B/ F分離法）等の違いにより、競合法、非競合法、ホモジニァス法、ヘテロジニアス法等に分類されている力いずれも本発明に適用することができる。

本発明の大腸癌検査薬は、前記の V EG Fと特異的に反応する物質、例えば抗

V EG F抗体又は V E G F受容体を検査薬の主要成分として含むことを特徴とするものであり、その他、必要に応じて、大腸癌検査薬において許容される担体又は賦形剤等を適宜配合することができる。図面の簡単な説明

図 1は、大腸癌患者における糞便中 V E G F量の測定結果を示す。

図 2は、図 1に示した大腸癌患者を早期癌患者と進行癌患者に区別して糞便中

V EG F量の測定結果を示したものである。

図 3は、大腸癌患者の手術前後における糞便中 V E G F量の測定結果を示す。発明を実施するための最良の形態

実施例 1

( 1 ) 抗 V E G Fポリクロ一ナル抗体の作製

単離したヒト V E G F c D N Aをグル夕チオン S-トランスフェラ一ゼ (GST) との融合蛋白（GST— VEGF) として大腸菌で産生させ、得られた蛋白を抗原として常法に従ってゥサギ抗 V E G Fポリクロ一ナル抗体を作製した。抗体価の上昇したゥサギの血清を分離し、陰イオン交換カラムクロマ卜グラフィ一によりゥサギ抗 V EG Fポリクローナル抗体の I gG画分を得た。

(2) 杭 V EG Fポリクローナル抗体の酵素標識

I gG画分の一部をペプシンで消化して F(ab')₂を調製後、ヒンジ法によりべルォキシダ一ゼ（西洋わさび）と結合させ、ペルォキシダ一ゼ標識したゥサギ抗

V E G Fポリクローナル抗体を得た。

( 3 ) 酵素免疫測定法による大腸癌患者糞便中 V E G F量の測定

大腸癌患者及び健常者の糞便中 V EG F量の測定を、以下に示すように、酵素免疫測定法により行った。即ち、（ 1 ) で得た抗 V EG Fポリクローナル抗体（5 /Li g/m l ) を 100 U 1 Zwellずつ 96穴プレー卜にまき 4°Cでー晚放置した後、 0. 1 %ゥシ血清アルブミン（B SA) を含むリン酸緩衝化生理食塩水（P H = 7. 4) (PBS) で 4回洗浄した。 1 %BSA、 0. 1 M塩化ナトリウム及び 0. 1 % アジ化ナトリウムを含む 0. 1 M炭酸ナトリウム緩衝液（pH= 6. 5) でブロッキング（37°Cで 4時間）した後、 1 %BSA、 0. 4%ゼラチン、 1 mM 塩化マグネシウム、 2 OmMエチレンジァミン四酢酸ナトリウム、 0. 1M塩化ナトリゥム及び 0. 1 %アジ化ナ卜リゥムを含む 5 OmMリン酸ナ卜リウム緩衝液（PH= 7. 0) (検体希釈液）で 20倍に希釈した糞便抽出液あるいは同検体希釈液に溶解した標準 V E G Fを入れ室温で 1時間放置した。糞便抽出液は、糞便 l g (湿重量）に対して PBS 2m 1を加えてホモジナイズし、穴径 0. 45/imのフィルタ一でろ過することにより調製した。 0. 1 %BSAを含む P B Sで 6回洗浄後、（2) で得たペルォキシダーゼ標識抗 V EG Fポリク口一ナル抗体を 100 1 Zweilずつ入れ、室温で 1時間反応させた。再度、 0. 1 %B S Aを含む PB Sで 8回洗浄後、 0. 125 % (w/v) オルトフエニレンジァミン及び 0. 015%過酸化水素を含む 0. 2M卜リス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン一クェン酸緩衝液（pH=5. 2) を l OOw l Zwellずつ入れ、室温で 30分間反応させた。 2 N硫酸を 100 1 /wellずつ入れ、反応を停止させた後、 650 nmの吸光度に対する 490 nmの吸光度をブレー卜リー ^ - ( -Vraax, Molecular Devices社製）で測定した。

大腸癌患者 26例及び健常者 10例の糞便抽出液中 V E G F量の測定結果を表 1及び図 1に ¾ ^した。

表 1 大腸癌患者及び健常者の糞便中 V E G F量

大腸癌患者 V EG F量（平均 ±標準偏差値）は、 1 1 16. 9± 1566. 3 71111でぁったのに対し、健常者は66. 3±36. 3 p gZmlであり、健常者と比較して大腸癌患者は有意に高値を示した。また、健常者 V EG F量の平均値 +2倍の標準偏差値の値（138. 9 pg/ml) をカットオフ値として陽性率を算出すると、大腸癌患者で 80. 8%であった。既存の大腸癌検査である免疫潜血反応検査や免疫へモグロビン検査の陽性率は、大腸癌患者で 50〜 60 %であることより、本方法による大腸癌検査方法は非常に有用であるといえる。前記の大腸癌患者を早期癌患者と進行癌患者に区別して糞便中 V E G F量を比較したものが表 2及び図 2である。

表 2 早期癌患者及び進行癌患者における糞便中 V E G F量

早期癌患者 VEGF量（平均 ±標準偏差値）は、 363. 4± 339. 7 pg /mlであり、健常者に比べ有意に高値であった。また、進行癌患者 VEGF量 (平均土標準偏差値）は、 1451. 8± 1781. 7 P gZmlであり、健常者及び早期癌患者に比べ有意に高値であった。健常者 V E G F量の平均値 + 2倍の標準偏差値の値（ 138. 9P g/ml) を力ッ卜オフ値とした場合、早期癌患者の陽性率は 62. 5%、進行癌患者の陽性率は 88. 9%であり、既存の大腸癌検査である免疫潜血反応検査や免疫へモグロビン検査に比べ、本方法は早期大腸癌検査方法にも非常に有用であるといえる。

同一の大腸癌患者 5例において、手術前後における糞便中 VEGF量を比較したものが表 3及び図 3である。表 3 手術前後における糞便中 V EG F量

V EG F量（平均 ±標準偏差値）は、手術前では 32 1 5. 2 ± 1 336. 9 P g/mlであり、手術後では 535. 7± 1 24. 8 p gZmlであり、手術前に比べ、手術後は有意に低値であった。これは、手術により大腸癌部位を取り除いたことにより、糞便中 VEGF量が減少したことを示しており、糞便中 VEGF 量の変動が手術後の経過を知る上で有用であることを示している。産業上の利用の可能性

糞便中の V E G F量を測定することにより、大腸癌の検査を行うという本発明の検査方法による診断は、大腸癌の早期発見、大腸癌の病態の進行や治療効果の判定、再発の予測等に広く利用することができる優れたものであり、また、糞便を用いることから、これまで用いられてきた検査方法に加えて、新たな検査方法としても利用することができるものである。更に、本発明による大腸癌の検査は、既存の腫瘍マーカーや便の潜血反応を用いた場合よりも非常に高率に大腸癌患者を発見することができるため、臨床上非常に有用なものである。

Claims

請求の範囲

1 . ヒ卜糞便中の血管内皮細胞増殖因子血管透過性因子の量を測定することを特徴とする大腸癌の検査方法。

2 . 血管内皮細胞増殖因子 Z血管透過性因子と特異的に反応する物質を含むことを特徴とする大腸癌検査薬。

3 . 血管内皮細胞増殖因子 Z血管透過性因子と特異的に反応する物質が、抗血管内皮細胞増殖因子 Z血管透過性因子抗体又は血管内皮細胞増殖因子血管透過性因子受容体である請求の範囲第 2項記載の大腸癌検査薬。