WO1998005771A1 - Steigerung der wirkung von anti-sinn-rna in zellen - Google Patents
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- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
Definitions
- the present invention relates to a method for increasing the activity of anti-sense RNA in cells and to a means for carrying out the method.
- New techniques for inhibiting gene expression often involve the use of anti-sense RNA.
- This is an RNA that is complementary to and binds to regions of the mRNA of a gene.
- a duplex molecule is formed that is not translated by the mRNA. An inhibition of gene expression can thus be achieved.
- duplex molecule is often not stable, i.e. the mRNA becomes free for translation again, whereby the inhibition of gene expression is weak or does not occur at all.
- the present invention is therefore based on the object of providing a means with which a strong inhibition of gene expression can be achieved.
- this is achieved by a method for increasing the activity of anti-sense RNA in cells, which comprises the expression of a (ds) RNAse in the cells containing the anti-sense RNA.
- anti-sense RNA encompasses any RNA molecule which is suitable as anti-sense RNA, ie is complementary to regions of an RNA, in particular mRNA and very particularly regulatory elements thereof, and by binding to these regions inhibits the Gene expression.
- the anti-sense RNA can also include DNA sequences.
- the anti-sense RNA can be present as such or in the form of a vector or vector construct encoding it, which is sometimes also referred to as "minigen".
- minigen a vector can be a common expression vector. It may be favorable if the expression of the sequence coding for the anti-sense RNA is under the control of a constitutive or inducible promoter, such as a tissue- or tumor-specific see promoter, stands.
- enhancement of activity indicates that the action of an anti-sense RNA, i.e. inhibition of gene expression is increased. According to the invention this is achieved in that duplex molecules from mRNA and anti
- Sense RNA can be degraded by a (ds) RNAse and thus only a reduced portion of the mRNA can be translated.
- (ds) RNAse encompasses any RNAse that can recognize and degrade double-stranded RNA.
- a (ds) RNAse is found e.g. in the yeast strain
- the (ds) RNAse can be present as such or in the form of a vector encoding it.
- a vector can be a common expression vector. It can be advantageous if the expression of the sequence coding for the (ds) RNAse is under the control of a constitutive or inducible promoter, such as a tissue- or tumor-specific one
- cells includes any cells in which an anti-sense RNA acts, i.e. can inhibit gene expression.
- Examples of such cells are plant and animal, especially mammalian and very particularly human cells.
- the cells can be in or outside an organism. The latter can be freshly isolated or kept in culture.
- RNAse if it is in the form of a vector encoding it. However, if it lies as such, i.e. as a protein, techniques such as
- RNAse Lipofection.
- the presence of the anti-sense RNA or (ds) RNAse in the cells can be demonstrated by conventional methods. These are, for example Southern and Northern blot for nucleic acids, while Western blot and functional analyzes (eg determination of enzyme activity) are to be regarded as suitable for proteins.
- the present invention further relates to cells which have a (ds)
- RNAse Such cells can be obtained by conventional methods. It is expedient to transfect cells as defined above with a vector coding for a (ds) RNAse. This can be done using conventional transfection techniques, such as electroporation. The vector can remain episomal or integrate into the genome of the cells. The expression of the (ds) RNAse can therefore be transposed or stable, the latter being preferred.
- Cells which express a (ds) RNAse represent a means of carrying out the method for increasing the action of anti-sense RNA in cells. Furthermore, they represent a system for designing and testing the action of anti-sense RNAs.
- Another object of the present invention is a combination of an anti-sense RNA and a (ds) RNAse.
- the anti-sense RNA can exist as such or in the form of a vector encoding it.
- the (ds) RNAse can be present as such or in the form of a vector encoding it. It may be advantageous if the combination consists in the presence of a vector which codes for both the anti-sense RNA and for the (ds) RNAse.
- a combination of an anti-sense RNA and a (ds) RNAse is suitable as a means of carrying out the method for increasing the action of anti-sense RNA in cells.
- the present invention it is possible to increase the effect of an anti-sense RNA in cells. A strong inhibition of the expression of the corresponding gene can thus be achieved.
- the present invention is thus widely used in medicine.
- the present invention makes it possible to find new inhibitors of gene expression and to test their effect.
- 1 shows the increase in activity of anti-sense RNA in cells.
- (1) is the expression rate of the CAT gene without an anti-sense RNA.
- (2) is the rate of expression of the CAT gene with an anti-sense RNA.
- (3) is the rate of expression of the CAT gene with an anti-sense RNA and a (ds) RNAse.
- Example 1 Production of expression vectors which contain the chloramphenicol acetyl transferase (CAT) gene in the 5 ' ⁇ 3' or 3'- 5 'direction.
- CAT chloramphenicol acetyl transferase
- the CAT gene was isolated from a conventional CAT vector and into the "multiple cloning site" of the expression vector pJ3 ⁇ (cf. Nucleic acids res. 18, (1990),
- the insertion was in the 5 ' ⁇ 3' direction and the expression vector pJ3 ⁇ -CAT was obtained. In the other case, the insertion was carried out in the 3 '- »5' direction and the expression vector pJ3 ⁇ -TAC was obtained.
- Example 2 Preparation of an expression vector which codes for a (ds) RNAse.
- the gene coding for a (ds) RNAse was converted from a common genomic library of Schizosaccharomyces pombe by means of PCR amplification
- pad + isolated.
- primers which were derived from the known sequence of the pad + gene (cf. database: embl: S78982) were.
- the pad + gene was cloned in the known vector pBluescript and confirmed by sequencing. After cloning into the usual expression vector pcDNA3 (InVitrogen), the expression vector pcDNA3-pad + was obtained.
- Ehrlich ascites tumor cells (10 7 cells / ml) were transfected with the expression vectors pJ3 ⁇ -CAT, pJ3 ⁇ -TAC and pcDNA3-pad + (see Table 1). The transfection was carried out by means of electroporation (366V / 950 ⁇ F / electrode spacing
- FIG. 1 It can be seen from FIG. 1 that an inhibition of the expression of CAT is obtained by transfection of pJ3 ⁇ -TAC (cf. FIG. 1 (2)). This is significantly increased if pJ3 ⁇ -TAC and pcDNA3-pad + are cotransfected (see Fig. 1 (3). It is thus clear that an increase in the activity of anti-sense RNA in cells can be obtained by the expression of a (ds) RNAse.
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Wirkungssteigerung von Anti-Sinn-RNA in Zellen, umfassend die Expression einer (ds)RNAse in den die Anti-Sinn-RNA enthaltenden Zellen sowie Zellen, die eine (ds)RNAse exprimieren und eine Kombination aus einer Anti-Sinn-RNA und einer (ds)RNAse, wobei beide durch einen oder mehrere Vektoren kodiert sind.
Description
Steigerung der Wirkung von Anti-Sinn-RNA in Zellen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Wirkungssteigerung von Anti-Sinn-RNA in Zellen sowie ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens.
Neue Techniken zur Hemmung der Genexpression umfassen häufig den Einsatz von Anti-Sinn-RNA. Dies ist eine RNA, die zu Bereichen der mRNA eines Gens komplementär ist und an diese bindet. Es entsteht ein Duplexmolekül, das der Translation der mRNA entzogen ist. Damit kann eine Hemmung der Genexpression erreicht werden.
Es hat sich allerdings gezeigt, daß das Duplexmolekül häufig nicht stabil ist, d.h. die mRNA wird wieder frei für die Translation, wodurch die Hemmung der Genexpression schwach ist oder gar nicht eintritt.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu- stellen, mit dem eine starke Hemmung der Genexpression erzielt werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch ein Verfahren zur Wirkungssteigerung von Anti-Sinn-RNA in Zellen erreicht, das die Expression einer (ds)RNAse in den die Anti-Sinn-RNA enthaltenden Zellen umfaßt.
Der Ausdruck "Anti-Sinn-RNA" umfaßt jegliches RNA-Molekül, das sich als Anti- Sinn-RNA eignet, d.h. komplementär zu Bereichen einer RNA, insbesondere mRNA und ganz besonders Regulationselementen dieser, ist und durch Bindung an diese Bereiche eine Hemmung der Genexpression bewirkt. Die Anti-Sinn-RNA kann auch DNA-Sequenzen umfassen. Ferner kann die Anti-Sinn-RNA als solche oder in Form eines sie kodierenden Vektors bzw. Vektorkonstrukts, das gelegentlich auch als "Minigen" bezeichnet wird, vorliegen. Ein solcher Vektor kann ein üblicher Expressionsvektor sein. Günstig kann es sein, wenn die Expression der für die Anti-Sinn-RNA kodierenden Sequenz unter der Kontrolle eines kon- stitutiven oder induzierbaren Promotors, wie eines Gewebe- oder Tumor-spezifi-
sehen Promotors, steht.
Der Ausdruck "Wirkungssteigerung" weist darauf hin, daß die Wirkung einer Anti-Sinn-RNA, d.h. die Hemmung der Genexpression, gesteigert ist. Erfindungs- gemäß wird dies dadurch erreicht, daß Duplexmoleküle aus mRNA und Anti-
Sinn-RNA durch eine (ds)RNAse abgebaut werden und somit nur ein reduzierter Anteil der mRNA translatiert werden kann..
Der Ausdruck "(ds)RNAse" umfaßt jegliche RNAse, die doppelsträngige RNA erkennen und abbauen kann. Eine (ds)RNAse findet sich z.B. in dem Hefestamm
Schizosaccharomyces pombe (pad + Gen). Ferner kann die (ds)RNAse als solche oder in Form eines sie kodierenden Vektors vorliegen. Ein solcher Vektor kann ein üblicher Expressionsvektor sein. Günstig kann es sein, wenn die Expression der für die (ds)RNAse kodierenden Sequenz unter der Kontrolle eines konstituti- ven oder induzierbaren Promotors, wie eines Gewebe- oder Tumor-spezifischen
Promotors, steht.
Der Ausdruck "Zellen" umfaßt jegliche Zellen, in denen eine Anti-Sinn-RNA wirken, d.h. die Genexpression hemmen kann. Beispiele solcher Zellen sind Pflanzen- und tierische, insbesondere Säugetier- und ganz besonders menschliche Zellen. Die Zellen können in einem Organismus oder außerhalb eines solchen vorliegen. Letztere können frisch isoliert oder in Kultur gehalten sein.
Der Ausdruck "Expression einer (ds)RNAse in Zellen, die eine Anti-Sinn-RNA enthalten" weist darauf hin, daß eine Anti-Sinn-RNA und eine (ds)RNAse in
Zellen eingeführt werden. Dies kann durch übliche Verfahren erfolgen. Liegt die Anti-Sinn-RNA als solche oder in Form eines sie kodierenden Vektors vor, eignen sich z.B. Transfektionstechniken, wie Elektroporation. Gleiches gilt für die (ds)RNAse, wenn sie in Form eines sie kodierenden Vektors vorliegt. Liegt sie allerdings als solche, d.h. als Protein vor, sind insbesondere Techniken, wie
Lipofektion, zu nennen. Das Vorliegen der Anti-Sinn-RNA bzw. der (ds)RNAse in den Zellen kann durch übliche Verfahren nachgewiesen werden. Dies sind z.B.
Southern- und Northern-Blot für Nukleinsäuren, während Western-Blot und funktionelle Analysen (z.B. Enzymaktivitätsbestimmung) für Proteine als geeignet anzusehen sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Zellen, die eine (ds)
RNAse exprimieren. Solche Zellen können durch übliche Verfahren erhalten werden. Günstig ist es, Zellen, wie vorstehend definiert, mit einem für eine (ds)RNAse kodierenden Vektor zu transfizieren. Dies kann durch übliche Trans- fektionstechniken, wie Elektroporation, erfolgen. Der Vektor kann episomal verbleiben oder in das Genom der Zellen integrieren. Die Expression der (ds)RNA- se kann daher transiert oder stabil sein, wobei letzteres bevorzugt ist. Zellen, die eine (ds)RNAse exprimieren, stellen ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens zur Wirkungssteigerung von Anti-Sinn-RNA in Zellen dar. Ferner stellen sie ein System dar, Anti-Sinn-RNAs zu konzipieren und in ihrer Wirkung zu testen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Kombination aus einer Anti-Sinn-RNA und einer (ds)RNAse. Die Anti-Sinn-RNA kann als solche oder in Form eines sie kodierenden Vektors vorliegen. Ebenso kann die (ds)RNA- se als solche oder in Form eines sie kodierenden Vektors vorliegen. Günstig kann es sein, wenn die Kombination darin besteht, daß ein Vektor vorliegt, der sowohl für die Anti-Sinn-RNA als auch für die (ds)RNAse kodiert. Hinsichtlich des Vektors wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen. Eine Kombination aus einer Anti-Sinn-RNA und einer (ds)RNAse eignet sich als Mittel zur Durchführung des Verfahrens zur Wirkungssteigerung von Anti-Sinn-RNA in Zellen.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Wirkung einer Anti-Sinn-RNA in Zellen zu steigern. Damit kann eine starke Hemmung der Expression des entsprechenden Gens erreicht werden. Die vorliegende Erfindung findet somit eine breite Anwendung in der Medizin. Insbesondere kann an die Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen gedacht werden, bei denen einzelne Proteine auslösend oder verstärkend sind. Dies sind z.B. Erkrankungen, bei denen Hormone eine große Rolle spielen, Tumorerkrankungen und virale Infektionen,
wie HIV und AIDS. Desweiteren ermöglicht die vorliegende Erfindung, neue Inhibitoren der Genexpression zu finden und ihre Wirkung zu testen.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Fig. 1 zeigt die Wirkungssteigerung von Anti-Sinn-RNA in Zellen. ( 1 ) ist die Expressionsrate des CAT-Gens ohne eine Anti-Sinn-RNA. (2) ist die Expressionsrate des CAT-Gens mit einer Anti-Sinn-RNA. (3) ist die Expressionsrate des CAT-Gens mit einer Anti-Sinn-RNA und einer (ds)RNAse.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1 : Herstellung von Expressions-Vektoren, die das Chloramphenicol- acetyltransferase (CAT)-Gen in 5'→ 3' bzw. 3'- 5' Richtung enthalten.
Das CAT-Gen wurde aus einem üblichen CAT-Vektor isoliert und in die "multiple cloning site" des Expressionsvektors pJ3Ω (vgl. Nucleic acids res. 18, (1990),
1068) inseriert. In einem Fall erfolgte die Insertion in 5'→3' Richtung und es wurde der Expressionsvektor pJ3Ω-CAT erhalten. Im anderen Fall erfolgte die Insertion in 3'-»5' Richtung und es wurde der Expressionsvektor pJ3Ω-TAC erhalten.
Beispiel 2: Herstellung eines Expressionsvektors, der für eine (ds) RNAse kodiert.
Aus einer üblichen genomischen Bibliothek von Schizosaccharomyces pombe wurde mittels einer PCR-Amplifikation das für eine (ds)RNAse kodierende Gen
(pad + ) isoliert. Hierzu wurden Primer verwendet, die aus der bekannten Sequenz des Gens pad + (vgl. Datenbank: embl: S78982) abgeleitet worden
waren. Das Gen pad + wurde in dem bekannten Vektor pBluescript kloniert und durch Sequenzierung bestätigt. Nach Umklonierung in den üblichen Expressionsvektor pcDNA3 (InVitrogen) wurde der Expressionsvektor pcDNA3-pad + erhalten.
Beispiel 3: Steigerung der Wirkung von Anti-Sinn-RNA in Zellen
Ehrlich Ascites Tumorzellen ( 107 Zellen/ml) wurden mit den Expressionsvektoren pJ3Ω-CAT, pJ3Ω-TAC und pcDNA3-pad + transfiziert (vgl. Tabelle 1 ) . Die Transfektion wurde mittels Elektroporation (366V/950μF/Elektrodenabstand
D = 4mm) durchgeführt. 24 h nach Transfektion wurden die Zellen geerntet, lysiert und Aliquote mit radioaktiv markiertem Chloramphenicol inkubiert. Es wurde die Konversionsrate (in Ac-, Di-Ac-Chloramphenicol) nach DC durch Messung der Radioaktivität bestimmt.
Tabelle 1 :
pJ3Ω-CAT 3 g 3μg 3 vg
pJ3Ω-TAC 7,5 yg 7,5/vg
pcDNA3-pad + - - 7,5μg
pJ3Ω 7,5 g
pcDNA3 7,5y- g 7, 5μg
Aus Fig. 1 geht hervor, daß durch Transfektion von pJ3Ω-TAC eine Hemmung der Expression von CAT erhalten wird (vgl. Fig. 1 (2)) . Diese wird erheblich gesteigert, wenn pJ3Ω-TAC und pcDNA3-pad + kotransfiziert werden (vgl. Fig. 1 (3) .
Somit wird deutlich, daß eine Wirkungssteigerung von Anti-Sinn-RNA in Zellen durch die Expression einer (ds) RNAse erhalten werden kann.
Claims
1 . Verfahren zur Wirkungssteigerung von Anti-Sinn-RNA in Zellen, umfassend die Expression einer (ds)RNAse in den die Anti-Sinn-RNA enthaltenden Zellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen tierische Zellen sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Anti-Sinn-RNA durch einen Vektor kodiert ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß die (ds)RNAse durch einen Vektor kodiert ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Anti-Sinn-RNA und die (ds)RNAse durch den gleichen Vektor kodiert sind.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß die (ds)RNAse durch das Genom der Zellen kodiert ist.
7. Zellen, die eine (ds)RNAse exprimieren.
8. Zellen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen tierische Zellen sind.
9. Kombination aus einer Anti-Sinn-RNA und einer (ds)RNAse, wobei beide durch einen oder mehrere Vektoren kodiert sind.
Applications Claiming Priority (2)
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| DE1996131918 DE19631918A1 (de) | 1996-08-07 | 1996-08-07 | Steigerung der Wirkung von Anti-Sinn-RNA in Zellen |
| DE19631918.8 | 1996-08-07 |
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Also Published As
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| DE19631918A1 (de) | 1998-02-12 |
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