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WO1998005766A1 - Procede d'amplification d'une sequence d'un acide nucleique cible - Google Patents

Procede d'amplification d'une sequence d'un acide nucleique cible Download PDF

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WO1998005766A1
WO1998005766A1 PCT/FR1997/001445 FR9701445W WO9805766A1 WO 1998005766 A1 WO1998005766 A1 WO 1998005766A1 FR 9701445 W FR9701445 W FR 9701445W WO 9805766 A1 WO9805766 A1 WO 9805766A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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function
nucleotide
reactive
chosen
prefunctionalized
Prior art date
Application number
PCT/FR1997/001445
Other languages
English (en)
Inventor
Françoise Guillou-Bonnici
Eric Defranc
Antoine Hoang
Ali Laayoun
Jean Lhomme
Emmanuelle Trevisiol
Original Assignee
Bio Merieux
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Merieux filed Critical Bio Merieux
Priority to EP97936732A priority Critical patent/EP0941314A1/fr
Priority to US09/214,658 priority patent/US6537783B1/en
Priority to CA2262019A priority patent/CA2262019C/fr
Priority to JP50768198A priority patent/JP4211948B2/ja
Publication of WO1998005766A1 publication Critical patent/WO1998005766A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a method for amplifying a sequence of a target nucleic acid.
  • a method for treating a nucleotide which consists in introducing onto one of the constituent elements of said nucleotide, namely sugar, the purine or pyrimidine base, and the phosphate groups, a functional group having various uses and in particular those of marking.
  • the nucleotide thus treated obtained could be incorporated into a polynucleotide, in particular in the double-stranded form without the double helix being destabilized by the presence of this nucleotide.
  • the functional groups attached to the nucleotide according to this prior art exhibit various phenomena such as, for example, steric hindrance, hydrophobic interactions or complexation phenomena, which prevent recognition of the polynucleotide having incorporated said treated nucleotide, by most enzymes, which would recognize the corresponding polynucleotide, in which said treated nucleotide has not been incorporated.
  • an amplification method which overcomes the drawbacks mentioned above and which in particular does not disturb the incorporation of the nucleotides and consequently does not significantly influence the yield and / or the sensitivity in a reaction. of target amplification and which also makes it possible to obtain an excellent labeling of the amplification products while avoiding phenomena of instability of the marker linked to a prior incorporation of the latter.
  • the subject of the present invention is a method for amplifying a sequence of a target nucleic acid, according to which:
  • the sequence of a target nucleic acid at least one oligonucleotide primer specific for the target sequence, for one or more enzymatic activities, for nucleotides,
  • the target sequence is amplified, under conditions adapted in particular to enzymatic activity or activities, process according to which at least one of the nucleotides is a pre-functionalized nucleotide, differing from the other nucleotides at least by the presence of at least one function covalent reactive, unprotected, arranged in at least one predetermined site of the base of said nucleotide, to obtain a pre-functionalized amplification product comprising at least one said pre-functionalized nucleotide.
  • a reagent comprising an anti-reactive covalent function, specific to the reactive function of the prefunctionalized nucleotide, and a functional group, is available, and
  • the prefunctionalized amplification product is reacted, directly or indirectly, with the reagent, to obtain a functionalized amplification product.
  • nucleotide By nucleotide according to the invention is meant a natural or modified nucleotide monomer as defined below.
  • the nucleotide monomer can be a natural nucleotide of nucleic acid whose constituent elements are a sugar, a phosphate group and a nitrogenous base; in RNA the sugar is ribose, in DNA the sugar is 2 '-deoxy-ribose; depending on whether it is DNA or RNA, the nitrogen base is chosen from Adenine, guanme, uracil, cytosine, thymine; or a nucleotide modified in at least one of the three constituent elements, - for example, the modification can take place at the level of the bases, generating modified products such as mosine, methyl- 5-deoxycytidine, deoxyuridine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2, 6-purine, bromo-5-deoxyuridine and any other modified base allowing hybridization, at the sugar level, namely for example the replacement at least one deoxyribose with an analog (example: PE Nielsen et al, Science
  • protective group is meant the groups conventionally used in the chemical synthesis of nucleosides, nucleotides and oligonucleotides (see for example: Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Edited by Leroy B. To nsend, Plénum Press, New York and London and Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Edited by Sudhir Agrawal, Humana Press, Totowa, New Jersey).
  • a functional labeling group of the invention is a molecule capable of directly or indirectly generating a detectable signal. It is in particular chosen from radioactive isotopes, enzymes notably chosen from peroxidase, alkaline phosphatase, b-galactosidase, and those capable of hydrolyzing a chromogenic, fluorigenic or luminescent substrate, chemical compounds chromophores, chromogens, fluorophores, fluorigenes or luminescent, analogs of nucleotide bases, and ligands such as biotin.
  • enzymes notably chosen from peroxidase, alkaline phosphatase, b-galactosidase, and those capable of hydrolyzing a chromogenic, fluorigenic or luminescent substrate, chemical compounds chromophores, chromogens, fluorophores, fluorigenes or luminescent, analogs of nucleotide bases, and ligands such as biotin.
  • the marker cannot directly generate a signal
  • the enzyme it is necessary to add a developer, for example a substrate corresponding to the enzyme, the enzyme / substrate reaction generating a detectable complex, for example a chromogenic or luminescent compound.
  • the revealing reagent can be ortho-phenylene diamine, 4-methyl-umbelliferyl-phosphate.
  • the reactive covalent function of the prefunctionalized nucleotide and the anti-reactive function of the reagent are respectively electrophilic and nucleophilic organic chemical functions, or vice versa.
  • the electrophilic organic chemical function is advantageously chosen from the aldehyde, activated ester, carboxylic acid, isothiocyanate, haloacyl derivatives and sulfonyl chloride functions.
  • the nucleophilic organic chemical function is advantageously chosen from the amine, thiol, oxyamine, hydrazine and hydrazide functions, preferably it is the alkoxyamine function.
  • the reactive covalent function of the modified nucleotide is grafted onto the base via a coupling arm and / or the anti-reactive covalent function of the reagent is grafted onto the functional group by through a coupling arm.
  • the coupling arm is in particular chosen from the hydrocarbon chains, saturated or unsaturated, optionally interrupted by amine, amide and oxy functions.
  • the reactive covalent function is the oxyamine function
  • the anti-reactive covalent function of the reagent is the aldehyde function
  • the latter is linked to a functional labeling group such as a fluorescent or luminescent group.
  • the aldehyde function is linked to the functional group by the coupling arm -NH-CS-NH- (CH2) 3- and the functional group of the reagent is fluore ⁇ cein.
  • the prefunctionalized nucleotide product can comprise one or more reactive covalent functions, identical or different, introduced by one or more nucleotides. Said reactive covalent functions can react with one or more reagents, identical or different, simultaneously or sequentially. The detection of the functional labeling groups of the functionalized product can be simultaneous or sequential.
  • the labeled functionalized amplification product can be detected qualitatively and / or quantitatively in the homogeneous or heterogeneous phase.
  • the reagent and the prefunctionalized nucleotide product interact in the same liquid medium.
  • the pre-functionalized product can be treated with the reagent before or after capture on a solid support, that is to say directly or indirectly. Capture on the solid support can be carried out by known means, such as adsorption, covalence, in particular by using anti-reactive covalent functions available on the surface of the solid support or by hybridization with a polynucleotide compound.
  • the solid support in all appropriate forms such as tube, cone, well, microtiter plate, sheet, chip or soluble polymer, is chosen from polystyrenes, styrene-butadiene copolymers, ⁇ tyrene-butadiene copolymers in admixture with polystyrenes, polypropylenes, polycarbonates, polystyrene-acrylonitrile copolymers, styrene-methyl methacrylate copolymers, among synthetic and natural fibers, among polysaccharides and cellulose derivatives, glass, silicon and their derivatives.
  • the target nucleic acid sequence is a DNA or RNA sequence
  • the enzymatic activities include the DNA polymerase activities RNA- and / or DNA-dependent
  • the enzymatic activities can also include ribonuclease H activity and DNA-dependent RNA polymerase activity, to amplify the target nucleic acid sequence according to a sequence of reverse transcription, transcription and digestion reactions.
  • the enzymatic activities ribonuclease H and DNA polymerase can be provided by a single enzyme or else each by a different enzyme.
  • the method of the invention can be used for the amplification of a target nucleic acid in a sample according to techniques well known to those skilled in the art, such as PCR (Polymerase Chain Reaction ), RT-PCR (Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction), TMA (Transcription Mediated Amplification) or the NASBA technique (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), or any other enzymatic amplification technique.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • RT-PCR reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction
  • TMA Transcription Mediated Amplification
  • NASBA Nucleic Acid Sequence Based Amplification
  • the invention also relates to a nucleotide analog or a nucleotide, prefunctionalized, capable of being subjected to an enzymatic treatment.
  • enzymatic treatment of a nucleotide analog or of a nucleotide all reactions are included, in vivo or in vi tro, during which at least one enzyme intervenes, the activity of which is linked to a nucleotide.
  • reactions are chosen from those used in molecular biology techniques such as transcription, ligation, elongation, cutting, and more particularly in amplification techniques, (WINN-DEEN, Journal of Clinical Assay, vol 19, p21-26 (1996).
  • the enzymes whose activities are related to the nucleotide may in particular be selected from the following non-exhaustive list • DNA dependent DNA polymerases such as Klenow fragment of DNA polymerase I of E. coli, Taq polymerase, the T7, T4 or T5 DNA polymerases, eukaryotic cellular or viral polymerases a, b, g, - DNA RNA dependent polymerases such as AMV (Avian Myoblastosi ⁇ Virus), MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) polymerases; RNA polymerases such as T7, T3, SP6, N4, PBSII RNA polymerases, RNA polymerase from E. col i; enzymes with nuclease activity such as restriction endonucleases, RNAse H; or else polyA polymerases, replicases, such as Q-beta-replicase, terminal transferases, or ligases.
  • the TMA technique for the amplification of a target nucleic acid sequence RNA or the amplification of a target nucleic acid sequence DNA after a reverse transcription step said technique being described in international application WO 91/01384 incorporated by reference.
  • a nucleotide analog, prefunctionalized according to the invention corresponds to the general formula (I)
  • Z represents a coupling arm
  • n is an integer equal to 0 or 1
  • X represents a reactive covalent function attached to at least one site of the nucleic base B
  • R 1 represents H or OH
  • R 2 represents H, OH, a mono-di- or tri-phosphate group, or an OR group in which R represents a protective group
  • R 3 represents H, a protective group, or a mono-, di- or tri-phosphate group.
  • R 1 and R 2 each independently of one another represent H, OH and R3 represent a mono-, di- or tri-phosphate group.
  • a prefunctionalized nucleotide of the invention is chosen from the following nucleotides:
  • nucleotide whose nucleic base is derived from cytosine and comprises, at least on the amino function in position 4 of the pyrimidine cycle, at least one reactive function of nucleophilic covalence, unprotected, and which does not significantly influence, the enzymatic treatment of said nucleotide, the reactive covalence function being chosen from the functions ⁇ 2, 0-NH2, SH, hydrazine and hydrazide and the reactive covalence function is linked to said amino function in position 4 of the pyrimidine cycle by an arm of coupling chosen from (-CH 2 -) n 1 , (-0-CH 2 -) n 1 in which n- ⁇ is an integer between 1 and 12; (-CH 2 -0-CH 2 -) n 2 , (-CH 2 -CH 2 -0-CH 2 -
  • n 2 is an integer between 1 and 6; and -NH-CH 2 -
  • the reactive covalent function is linked to said amino function via a coupling arm chosen from -CH 2 -, -CH 2 -CH 2 -, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -, - CH 2 - CH 2 -CH 2 -CH 2 -, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -.
  • a coupling arm chosen from -CH 2 -, -CH 2 -CH 2 -, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -, - CH 2 - CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -, and NH-CH 2 -0-CH 2 -CH 2 .
  • nucleotide the base of which is derived from adenine and comprises at least on the amino function in position 6 of the pyrimidine cycle, at least one reactive covalent function
  • RECTIFIED SHEET (RULE 91) ISA / EP nucleophile, unprotected, and not significantly influencing the enzymatic treatment, characterized in that the reactive covalent function is chosen from the NH 2 functions ( CH 2 -0-NH 2 / SH / hydrazine and hydrazide • the reactive covalent function is linked to said amino function via a coupling arm chosen from (-CH 2 -
  • n ⁇ _ represents an integer between 1 and 12, - (-CH 2 -0-CH 2 -) n 2 , (-CH 2 -CH 2 -0-CH 2 -CH 2 -) n 2 , (-CH 2 -CH 2 -) n 2 , (-CH 2 -CH 2 -)
  • n 2 is an integer between 1 and 6, - and NH- ⁇ CH 2 -0-CH -CH 2 .
  • the reactive covalent function is linked to said amino function via a coupling arm chosen from -CH 2 -, -CH 2 -CH 2 -, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -, - CH 2 -CH 2 -CH 2 -
  • the invention also relates to the use of a prefunctionalized nucleotide as defined above, in an enzymatic amplification treatment.
  • the pre-functionalized nucleotide analogue or nucleotide has, with respect to the enzymatic treatment, a behavior substantially identical to that of the nucleotide analogue or the corresponding nucleotide.
  • the function introduced into a site of the base of said analogue or nucleotide thanks to its biological and chemical inertness with respect to enzymes, does not significantly modify either the affinity or the specificity of the enzyme to with respect to its substrate.
  • FIG. 1 represents a general diagram of synthesis of cytidine nucleotides carrying an amino arm in position 4;
  • FIG. 2 represents a diagram of synthesis of the cytidine nucleotide carrying an alkyloxyamine arm in position 4;
  • FIG. 3 represents a synthesis scheme by transamination of nucleotides
  • FIG. 4 shows the effect of the incorporation of CTP- (N4) -C 6 0 2 -NH 2 (27a) on the sensitivity of TMA;
  • FIG. 5 shows the effect of the incorporation of CTP- (N4) -Cault-NH 2 (27b) on the sensitivity of TMA.
  • Figures • and b respectively show the results of semi-quantification by the ELOSA technique (described in PCT patent application WO 92/19812) of the number of amplicons produced from a target range of 16S RNA from Mycobact Umi um tubercul osi s in the presence of different ratios of nucleotides 21 a and 27b relative to their respective natural nucleotides.
  • the strategy generally used consists in the synthesis of protected nucleosides carrying a reactive function also protected. Deprotection of the hydroxyl function at position 5 'releases the modified nucleoside, which is finally triphosphorylated at this position according to the method of Lud ig-Eckstein (J. Lud ig, F. Eckstein, J. Org. Chem., 1989, 54 , 631-635).
  • Triazolo (2) (Samano, Miles, Robins, J. Am. Chem. Soc, 1994, 116, 9331-9332)
  • Adenosine-isopropylidene (1) (lg, 3.2 mmol) and amidine (1.4 g, 6.5 mmol) are stirred in pyridine (15 ml) at 100 ° C under argon for 48 h .
  • the pyridine is then evaporated and co-evaporated with toluene.
  • the oil obtained is then taken up in ethyl acetate and this organic phase is washed with water saturated with NaCl. After drying over Na2SO and evaporation, the product (2) is obtained in the form of a white powder with a yield of 60% (700 mg, 1.9 mmol).
  • Product 2 was characterized by mass spectrometry and proton NMR.
  • the product (2) (500 mg, 1.4 mmol) is dissolved in 20 ml of acetonitrile.
  • Compound (3) (1.31 g, 7 mmol) is then added.
  • the reaction medium is heated to 50 ° C for 2 days and analyzed by HPLC.
  • the residue After evaporation of the acetonitrile, the residue is taken up in ethyl acetate and this organic phase is washed with water saturated with NaCl. After drying and evaporation of the ethyl acetate, the residue is chromatographed on silica gel (eluent: CH2Cl2, then CH Cl / MeOH f 98/2, 95/5 (v / v)). After evaporation and precipitation in hexane, the product (4) is obtained in the form of a white powder with a yield of 80% (563 mg, 1.12 mmol). The nucleoside (4) was characterized by mass spectrometry and by proton NMR.
  • the nucleoside (4) (48 mg, 100 mmol) is dissolved in anhydrous pyridine and is evaporated 2 times. Then added under argon 100 ml of pyridine, 300 ml of dioxane and a freshly prepared solution of 2-chloro-4H-1,2,3-dioxaphosphorin-4-one in dioxane (130 ml, 130 mmol). The stirring is left for 20 minutes and then a 0.5 M solution of tributylammonium pyrophosphate in anhydrous DMF (320 ml) and simultaneously 130 ml of tributylamine are added.
  • the ditertbutyldicarbonate (1.2 eq., 0.019 mole, 4.18 g) dissolved in 20 ml of dioxane is then added dropwise, in ice, under argon. After 3 hours of reaction at 0 ° C., the dioxane is evaporated and then the pH is brought back to 3 with an aqueous solution of IN HCl and extraction is carried out with ether (3 ⁇ 50 ml). The organic phases are then washed with an aqueous solution of IN HCl then with a saturated aqueous NaCl solution. After drying over Na 2 SO 2 and evaporation, the product (8a) is obtained in the form of a yellow oil (2.56 g, 0.013 mol, 80%). It was characterized by proton and carbon 13 NMR.
  • the product (2) (246 mg, 0.68 mmol) is dissolved in 20 ml of 1 acetonitrile.
  • the chain (8b) (700 mg, 3.43 mmol) is then added.
  • the mixture is brought to 50 ° C.
  • the reaction is followed by HPLC: it progresses very slowly. After one week, the solvent is evaporated.
  • the residue obtained is dissolved in ethyl acetate and the organic phase is washed with water saturated with NaCl. After drying over Na 2 S0 4 and evaporation, a yellow oil is obtained which is chromatographed on silica gel (eluent: CH2Cl2 / MeOH: 97/3, v / v).
  • the product (9) is obtained in the form of a white powder (120 mg, 0.24 mmol, 35%).
  • the product (9) is characterized by proton NMR and by mass spectrometry.
  • nucleoside (9) into nucleotide (10) is carried out according to the protocol described in the ex € ⁇ mple I (preparation of nucleotide 5).
  • Ethyl orthoformate (166 ml, 148 mg, 1 mmol) is added under argon at room temperature. suspension of product (12) (200 mg, 0.5 mmol) in acetone (2 ml) containing APTS (9.5 mg, 0.05 mmol). The reaction is followed by TLC (CH 2 C1 2 / MeOH 90/10). After 2 hours, dichloromethane is added and the organic phase is washed with a 10% aqueous NaHCO 3 solution and then with a saturated aqueous NaCl solution. After drying and evaporation, the product (13) is obtained in the form of a yellow powder (167 mg, 0.38 mmol, 76%).
  • Nucleoside 13 (44 mg, 100 mmol) is dissolved in anhydrous pyridine and is evaporated 2 times. Then added under argon 100 ml of pyridine, 300 ml of dioxane and a freshly prepared solution of 2-chloro-4H-1,2,3-dioxaphosphorin-4-one in dioxane (130 ml, 130 mmol). Stirring is left for 20 minutes and then a 0.5 M solution of tributylammonium pyrophosphate in anhydrous DMF (320 ml) and 130 ml of tributylamine are added.
  • Carboxymethoxylamine hydrochloride (6.6 g, 60.4 mmol) is dissolved in 132 ml of water in the presence of sodium hydroxide (2 g, 50 mmol) and dioxane (66 ml). The solution is cooled in an ice bath. D-tert-butyldicarbonate (13.97 g, 64.1 mmol) dissolved in dioxane is added dropwise
  • the product (16) is obtained in the form of a white powder (10 g, 52 mmol, 86%).
  • the product (16) was characterized by proton NMR.
  • the product (16) (2 g, 10.4 mmol) is dissolved in freshly distilled THF. After the medium has cooled in ice, DCC is added (2.15 g, 10.4 mmol). The mixture is stirred cold for 15 minutes. The propargylic amine is then added. (714 ml, 10.4 mmol) The stirring is maintained at room temperature under argon for 2 hours. After filtration, the solvent is evaporated. The residue thus obtained is taken up in dichloromethane and is washed with an aqueous solution of IN HCl, then with a solution of NaHCO 3 at 5% and finally with an aqueous solution saturated with NaCl.
  • the nucleoside (19) (102 mg, 200 mmol) is dissolved in anhydrous pyridine and is evaporated 2 times. However, then add 200 ml of pyridine under argon, 600 ml of dioxane and a freshly prepared solution of 2-chloro-4H-1, 2, 3-dioxaphosphorin-4-one in dioxane (260 ml, 260 mmol). We leave the stirring for 20 minutes then add a 0.5 M solution of tributylammonium pyrophosphate in anhydrous DMF (640 ml) and simultaneously 260 ml of tributylamme
  • a 1% iodine solution is added in a pyridme / water mixture (98/2, v / v) (4 ml, 314 mmol). After 20 minutes of stirring, the excess iodine is destroyed with an aqueous solution of NaHS0 3 at 5% and the stirring is continued for 10 minutes. It is evaporated to dryness and then a water / dichloromethane extraction is carried out. The formation is checked.
  • the nucleophilic substitution of the tosyl group with a diamined alkyl chain followed by protection with ethyl trifluoroacetate of the free amino function of the introduced chain is carried out in one step.
  • the compound (24) (1 mmol) below in THF (5 ml) is treated with a molar solution of tetrabutylammonium fluoride (1.2 mmol, 1.2 eq) in THF. After 3 to 4 hours of stirring at room temperature and under argon, the reaction is neutralized with acetic acid (1 eq.) And then evaporated to dryness.
  • the reaction is oxidized by a 1% iodine solution in the pyridine-water mixture (98: 2, v: v) (4 ml) and stirring maintained for 30 min.
  • the excess iodine is then destroyed by an aqueous solution of sodium bisulfite at 5% and the reaction medium evaporated to dryness.
  • the residue obtained is dissolved in water (20 ml) and treated by washing with dichloromethane.
  • aqueous phase is recovered and analyzed by HPLC (DEAE 8 column HR Millipore 5x100 mm, buffer A: Tris HCl 20 mM pH 7.6, buffer B: Tris HCl 20 mM, 0.5 M NaCl pH 7.6, flow rate: 0.5 ml / min, gradient: 0 to 35% B in 40 min). Retention time: 24 to 29 min.
  • TLC: Rf 0.5, eluent: propanol: water: NH40H (6: 3: 1, V: v: v)
  • reaction medium is again evaporated and then co-evaporated to dryness with water.
  • desired compound is purified and desalted by
  • the fully protected nucleotide (32) is completely deprotected in 2 ′, 3 ′ by trifluoroacetic acid according to the protocol described in Example 10.
  • the deprotection of the alkoxyamine function is carried out in an aqueous solution of hydrazine for one overnight at room temperature.
  • the nucleotide (32) is then purified by HPLC under the same conditions as those described in Example 10.
  • Cytidine triphosphate (0.1 mmol) is added to the solution composed of sodium bisulfite (12 mmol, 120 eq.) And 2-2 'oxy-bis-ethylamine hydrochloride (7.5 mmol, 75 eq.) In the water (2.5 ml), the pH of which was previously adjusted to 7.0 with a 10 M sodium hydroxide solution, stirring being maintained at 37 ° C for 3 days.
  • the compound (33) is purified and desalted by HPLC (see HPLC conditions in Example 10).
  • EXAMPLE 17 Synthesis of [4-N- (adipic acid-hydrazide) -5 '-O-triphosphate] -cytidine (34) by transamination.
  • the nucleotide (34) was prepared by transamination according to the protocol described in Example 16, using adipic acid dihydrazide (83 mg, 0.44 mol) for the introduction of the hydrazide function. Its purification and its desalting were also carried out according to Example 10, its structure was confirmed by proton NMR.
  • the fluoresceem isothiocyanate (91 mg, 2.35 mmol, Aldrich, F 250-2) is dissolved in anhydrous DMF (10 ml), under argon. Aminobutylaldehyde diethylacetal (421 mg, 392 ml, 235 mmol) is then added. After one hour, the DMF was evaporated and the residue is chromatographed on silica gel (eluent: CH C1 2 / MeOH: 90/10, v / v). After evaporation in solvent, the product (35) is obtained in the form of an orange powder (1.21 g, 2.2 mmol, 94%). It has been characterized pa. Proton NMR and mass spectrometry.
  • the protected product (35) (342 mg, 0.62 mmol) is placed in 20 ml of a 30% aqueous solution of acetic acid. After one hour of reaction, the solvent is evaporated off and co-evaporated with acetonitrile. The residue obtained is chromatographed on silica gel (eluent: CH 2 C1, / MeOH 90/10, v / v). After evaporation of the solvent, the product (36) is obtained in the form of an orange powder (145 mg, 0.30 mmol, 48%). It was characterized by proton NMR and mass spectrometry.
  • EXAMPLE 19 Chemical synthesis of a prefunctionalized polynucleotide.
  • the synthesis of the starting nucleoside was carried out using the 2 '-deoxy-8-mercaptoadenosine precursor (37) obtained according to the strategy described by A. LAAYOUN, J.-L. DECOUT and J. LHOMME in Tetrahedron Lett., 1994 , 35, 4989-4990.
  • the starting nucleotide thus obtained is characterized by the usual spectroscopic methods.
  • exocyclic amine of adenine is protected by a benzoyl group, the 5 'hydroxyl is protected by dimethoxytrityl and the 3' hydroxyl by the group N, N-diisopropyl-2-cyanoethylphosphoramidite.
  • the purification of the synthesized polynucleotide is carried out by reverse phase HPLC (semi-preparative Macherey Nagel column 10 mm x 25 cm, - C18; 5 ⁇ m of porosity; eluent: 20 min gradient from 0 to 30% acetonitrile mixed with 0.1 M aqueous ammonium acetate solution at pH 6).
  • the fractions containing the polynucleotide are collected and lyophilized.
  • the nucleotide L incorporated in the preceding step is activated so as to obtain the polynucleotide diol 5 'CGCACMCACGC 3', in which
  • the labeling reaction is carried out using the reagent (40) consisting of a dansyl nucleus as a fluorescent functional group linked via a diethylene glycol chain to an oxyamine (nucleophilic) function.
  • This reagent was prepared according to the described method D. BOOTURYN et al. In Tetrahedron, 1997, 53, 5485-5492.
  • the labeling reaction is carried out in water in the presence of a slight excess of reagent (40) (1.5 equivalent) relative to the oligonucleotide.
  • reagent 40
  • HPLC HPLC indicates a rapid disappearance of the starting products and the formation of a new product corresponding to the functionalized polynucleotide (41).
  • Analysis of the proton NMR spectrum also confirms the attachment of the dansyl marker.
  • EXAMPLE 21 Enzymatic synthesis of a prefunctionalized polynucleotide by transcription.
  • a PCR is carried out on the HIVgag gene carried in a linearized pGEM plasmid, using a conventional primer, and a primer carrying the sense sequence of a promoter for ⁇ RNA polymerase of phage T7 upstream of a conventional primer sequence .
  • a product of 158 base pairs is obtained, which is purified by phenol / chloroform extraction and passage through microcon 30
  • the transcription reactions are carried out in Eppendorf tubes in a final volume of 25 ⁇ l, in a 40 mM buffer of Tris / HCl, pH 8.1, 20 mM of MgCl 2 , 5 mM of Dithiotreitol, 1 mM of spermid, 8 % of polyethylene glycol, 0.01% of Triton X 100, 50 ⁇ g / ml of bovine serum albumin
  • the pre-functionalized nucleotide (43) and the four ribonucleotides (CTP, GTP, ATP, UTP) are added respectively to the concentration 1.33 mM and 4 mM each.
  • the PCR matrix is added at the concentration of 10 9 copies / ⁇ l, and the phage T7 RNA polymerase (Patent Application FR 97 04166) at the concentration of 1 u / ⁇ l
  • the reaction is incubated for 60 mm at 37 ° C. .
  • 0.5 u / ⁇ l of DNAse 1 are added to the medium in order to destroy the DNA matrix.
  • the sample is incubated at 37 ° C. continuously for 15 mm.
  • the RNAs obtained are purified by passing through Sephadex G50.
  • a first control is carried out with a reaction without addition of T7 RNA polymerase
  • a second control is carried out without activated nucleotide, as a control of transcription
  • the purified transcripts are marked according to the experimental mode described in Example 2 and visualized under an ultra violet lamp after electrophoretic migration in agarose gel.
  • EXAMPLE 22 Synthesis of a prefunctionalized polynucleotide during a TMA amplification reaction.
  • prefunctionalized nucleotides 27a CTP- (N4) -C 6 0 2 -NH 2
  • 27b CTP- (N4) -C4 - NH 2
  • 32 CTP- (N4) -C 6 -0NH 2
  • Amplification reactions are carried out in parallel in the presence of a labeled nucleotide carrying a fluorescein, UTP-12-fluorescein (Boerhinger, ref 1 427 857.
  • the prefunctionalized nucleotides 27a, 27b, 32, and for comparison, the labeled nucleotide of Boerhinger, ref 1 427 857, are tested for their incorporation in the products of the TMA amplification reaction, according to the Gen-Probe amplified MTD2 kits. (amplified ⁇ yco-ac erium tuberculo ⁇ is direct test).
  • This reaction allows the amplification of a 136 base fragment of the 16S RNA of mycobacteria. It uses your enzymatic activities (DNA dependent RNA polymerase, DNA dependent DNA polymerase, DNA dependent RNA polymerase, and ribonucleaseH) and two enzymes, T7 RNA polymerase, and AMV reverse transcriptase.
  • RNA which resemble a cycle of replication of RNA viruses
  • this reaction allows the specific amplification of '' a nucleic acid sequence recognized by two primers (a single primer and a primer containing the T7 RNA polymerase promoter).
  • the amplification factor is very important (10) and the sensitivity very good (1 to 10 copies).
  • the products obtained are for 90% of single-stranded RNA, and for 10% of double-stranded DNA.
  • the amplification reactions are carried out from
  • 16S RNA 10 copies of 16S RNA from Mycobacter iu tuberculosis.
  • This target RNA is previously obtained and quantified according to the following method: the 16S RNA gene is cloned into a p asmid, under the control of a promoter. By transcription m vi tro, 16S RNA is obtained. This is purified by extraction with phenol-chloroform, and filtration on microcon 30 (Amicon).
  • Classic TMA reactions contain 4 mM of each of the natural rNTPs (ATP, CTP, GTP and UTP).
  • the reaction is carried out by including one of these modified nucleotides in the reaction buffer.
  • the reaction is studied in the presence of different concentration ratios between the modified nucleotide and the natural nucleotide, while keeping at 4 mM the total concentration of each nucleotide of the same series, modified or natural.
  • the ratios studied are 0%, 10%, 30%, 50% and 70% (except for UTP-fluorescein, for which we could not test 70%).
  • a negative control is carried out, consisting of a reaction comprising all the reagents, including the highest modified nucleotide ratio used (70 or 50%), except the enzymes (replaced by the buffer for taking up the lyophilized enzymes).
  • the amplification reactions are analyzed by electrophoresis of 5 ⁇ l of reaction on denaturing polyac trylamide gel (6% acrylamide, 7M urea, IX TBE, apparatus bioRad electrophoresis, 170 volts, 45 minutes) and staining with ethidium bromide, then by Northern.
  • the nucleic acids are transferred onto a membrane (Nylon N, semi-dry bioRad transfer device, 0.5 X TBE, 25V, 15 minutes) and hybridized with nucleic probes specific for Myco acté ium tuberculosis -.
  • the amplification products on gel are also visualized before staining with ethidium bromide by excitation of fluorescein on an ultraviolet table.
  • the expected amplification products are visualized in large quantities after staining with ethidium bromide. After Northern, these products hybridize with the specific probe.
  • Example 22 The amplification products obtained during the production of Example 22 are separated from the excess nucleotides in the reaction by filtration on Microcon 30 TM (from Amicon), and taken up in 50 ⁇ l of water.
  • Microcon 30 TM from Amicon
  • the purification is carried out on sephadex G50 (absorption of fluorescein on Microcon).
  • a step of digestion of the nucleic acids is then carried out up to the nucleoside stage:
  • nuclease PI Boerhinger, ref 236225, l ⁇ g / ⁇ l, 0.3u / ⁇ l. The reaction is incubated at 37 ° C for 30 minutes.
  • nucleoside composition is then determined by analysis on high pressure liquid chromatography (HPLC, Beckman, Gold system), and by comparison with nucleoside standards (injection of 50 ng of each nucleoside). 20 ⁇ l of the digestion are injected onto column C18 (Ultrasphere), heated to 45 ° C. The separation is carried out in 50 mM sodium phosphate buffer pH 7, comprising a methanol gradient (after 10 minutes, passage in 15 minutes from 0% to 30% of 95% methanol). The peaks are visualized by absorption at 254 nm, and the areas of the peaks are calculated by integration.
  • the ratio between the area of the peak of the prefunctionalized nucleotide and that of its natural analogue makes it possible to determine the incorporation efficiency, that is to say the ratio between the amount of prefunctionalized nucleotide incorporated and the total amount of nucleotide of the same incorporated series.
  • control without enzyme should not give rise to the appearance of peak. This control demonstrates the good efficiency of the step of removing excess nucleotides.
  • the quantity of fluorescein nucleotide incorporated is measured by the fluorescence intensity: the fluorescence intensity of a standard fluorescein range is read on a Perkin LS spectrofluorimeter 50. The fluorescence intensity of the different amplification reactions is measured. By comparison with the calibration curve, the quantity of fluorescein incorporated is determined. The incorporation yield is calculated relative to the amplicon concentration measured by absorption at 260 nm.
  • the HPLC analysis makes it possible to separate the eight natural nucleosides, as well as the three nucleosides analogous to the three pre-functionalized nucleotides tested.
  • TMA was performed from decreasing amounts of target
  • reaction products are studied inter alia by the method described in Example 22.
  • reaction products are also analyzed in quantitative fashion by ELOSA (PCT WO 92/19812), and comparison of the intensity of the signals with those of standard ranges.
  • pre-functionalized nucleotide (s) are analyzed by electrophoresis and staining, Northern, and ELOSA.
  • ELOSA which are representative of the different analytical methods used, are represented in FIGS. 4 and 5.
  • a concentration of prefunctionalized nucleotide (s) can be determined such that the sensitivity of the TMA reaction is not significantly affected, even with a very low number of copies of initial target.
  • the nucleotide 27b can replace the natural nucleotide.
  • the marking thus obtained is compared with that obtained in the presence of the nucleotide labeled UTP-12 -fluorescein (Boerhinger, ref 1 427 857).
  • the amplicons are obtained by the method described in Example 22 from 10 ⁇ copies of 16 ⁇ RNA target of Mycobac er iu tuberculosis, and in the presence of 50% of prefunctionalized nucleotide 27b.
  • the amplicons obtained are coupled to fluorescein-NHS (Boerhinger 8370042128), according to the following method: 30 ⁇ l of TMA amplification products are mixed with 30 ⁇ l of 0.2M carbonate buffer, 0.15 M NaCl, at pH8.8 , and 40 ⁇ l (approximately 200 equivalents) of NHS fluorescein (3.5 mg / ml in DMSO). After stirring for one hour at room temperature, the labeling is analyzed.
  • the labeled amplicons (15 ⁇ l) are analyzed by gel electrophoresis as described in Example 22, and viewed under ultraviolet, before and after staining with ethidium bromide. The profiles are compared with those obtained by labeling in the presence of 50% of UTP-12-fluorescein.
  • the signals obtained without coloring are more intense than those obtained by direct labeling with fluorescein.
  • the oxyamine function as carried by the nucleotide 32, such a good result will be possible after coupling with the fluorophore 36.
  • the reactivity of the oxyamine aldehyde couple allows reduced coupling times as shown in example 20.

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Abstract

L'invention concerne un procédé d'amplification d'une séquence d'un acide nucléique cible, selon lequel: on dispose au moins: de la séquence d'un acide nucléique cible, d'au moins une amorce oligonucléotidique spécifique de la séquence cible, d'une ou plusieurs activités enzymatiques, de nucléotides; on amplifie, dans des conditions adaptées notamment à l'activité ou les activités enzymatiques, la séquence cible, selon lequel au moins un des nucléotides est un nucléotide préfonctionnalisé, différent des autres nucléotides au moins par la présence d'au moins une fonction réactive de covalence, non protégée, disposée en au moins un site prédéterminé de la base dudit nucléotide, pour obtenir un produit d'amplification préfonctionnalisé comprenant au moins undit nucléotide préfonctionnalisé. L'invention concerne aussi des nucléotides pour mettre en oeuvre ce procédé.

Description

Procédé d'amplification d'une séquence d'un acide nucléique cible La présente invention concerne un procédé d'amplification d'une séquence d'un acide nucléique cible. On connaît selon le document EP-A-0 285 057, un procédé de traitement d'un nucléotide consistant à introduire sur l'un des éléments constitutifs dudit nucléotide, à savoir le sucre, la base purique ou pyrimidique, et les groupements phosphate, un groupement fonctionnel ayant diverses utilisations et notamment celles de marquage. Le nucléotide ainsi traité obtenu pourrait être incorporé dans un polynucléotide, notamment sous la forme double-brin sans que la double hélice ne soit déstabilisée par la présence de ce nucléotide.
Toutefois dans ce cas, les groupements fonctionnels fixés sur le nucléotide selon cet art antérieur présentent différents phénomènes tels que par exemple l'encombrement stérique, des interactions hydrophobes ou des phénomènes de complexation, qui empêchent la reconnaissance du polynucléotide ayant incorporé ledit nucléotide traité, par la plupart des enzymes, qui reconnaîtraient le polynucléotide correspondant, dans lequel ledit nucléotide traité n'a pas été incorporé.
Conformément à la présente invention, on apporte un procédé d'amplification qui pallie les inconvénients précédemment cités et qui notamment ne perturbe pas l'incorporation des nucleotides et en conséquence n'influence pas de manière significative le rendement et/ou la sensibilité dans une réaction d'amplification de cible et qui de plus permet d'obtenir un excellent marquage des produits d'amplification en évitant des phénomènes d'instabilité du marqueur liés à une incorporation préalable de ce dernier.
Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé d'amplification d'une séquence d'un acide nucléique cible, selon lequel :
- on dispose au moins : de la séquence d'un acide nucléique cible, d'au moins une amorce oligonucléotidique spécifique de la séquence cible, d'une ou plusieurs activités enzymatiques, de nucleotides,
- on amplifie, dans des conditions adaptées notamment à l'activité ou les activités enzymatiques, la séquence cible, procédé selon lequel au moins un des nucleotides est un nucléotide préfonctionnalisé, différant des autres nucleotides au moins par la présence d'au moins une fonction réactive de covalence, non protégée, disposée en au moins un site prédéterminé de la base dudit nucléotide, pour obtenir un produit d'amplification préfonctionnalisé comprenant au moins undit nucléotide préfonctionnalisé .
Selon un procédé avantageux de 1 ' invention i comprend en outre les étapes suivantes :
- on dispose d'un réactif comprenant une fonction anti-réactive de covalence, spécifique de la fonction réactive du nucléotide préfonctionnalisé, et un groupement fonctionnel, et
- on fait réagir, directement ou indirectement, le produit d'amplification préfonctionnalisé , avec le réactif, pour obtenir un produit d'amplification fonctionnalisé.
Avant d'exposer l'invention de manière détaillée, certains termes employés dans la présente description sont ci- après définis.
Par nucléotide selon l'invention, on entend un monomère nucléotidique naturel ou modifié tel que défini ci- dessous .
Ainsi, le monomère nucléotidique peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée; dans l'ARN le sucre est le ribose, dans l'ADN le sucre est le 2 ' -désoxy- ribose ; selon qu'il s'agit de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi L'adénine, la guanme, l'uracile, la cytosine, la thymine; ou un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ,- à titre d'exemple, la modification peut intervenir au niveau des bases, générant des produits modifiés telles que l'mosine, la méthyl- 5-désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5- désoxyuridine, la diamino-2 , 6-purine, la bromo- 5 -désoxyuridine et toute autre base modifiée permettant l'hybridation, au niveau du sucre, à savoir par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un analogue (exemple: P.E. Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991)), au niveau du groupement phosphate par exemple des dérivés boronates, alkylphosphonates ou phosphorothioates.
Par groupement protecteur, on entend les groupements utilisés de manière classique dans la synthèse chimique de nucléosides, nucleotides et oligonucléotides (voir par exemple: Chemistry of Nucléosides and Nucleotides, Edited by Leroy B. To nsend, Plénum Press, New York and London et Protocols for Oligonucléotides and Analogs, Synthesis and Properties, Edited by Sudhir Agrawal , Humana Press, Totowa, New Jersey) .
Un groupe fonctionnel de marquage de 1 ' invention est une molécule susceptible de générer directement ou indirectement un signal détectable. Il est notamment choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes notamment choisies parmi la peroxydase, la phosphatase alcaline, la b-galactosidase, et celles susceptibles d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chimiques chromophores , chromogènes, fluorophores, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, et des ligands tels que la biotine. Dans le cas où le marqueur ne peut générer directement un signal, par exemple, quand celui-ci est une enzyme, il est nécessaire d'ajouter un révélateur, par exemple un substrat correspondant à l'enzyme, la réaction enzyme/substrat générant un complexe détectable, par exemple un composé chromogène ou luminescent. A titre d'exemple, le réactif révélateur peut être 1 'ortho-phénylène-diamine, la 4 -méthyl -umbelliféryl -phosphate .
La fonction réactive de covalence du nucléotide préfonctionnalisé et la fonction anti- réactive du réactif, sont respectivement des fonctions chimiques organiques électrophiles et nucléophiles , ou inversement. La fonction chimique organique électrophile est avantageusement choisie parmi les fonctions aldéhyde, ester activé, acide carboxylique, isothiocyanate, dérivés haloacyles et chlorure de sulfonyle. La fonction chimique organique nucléophile est avantageusement choisie parmi les fonctions aminé, thiol , oxyamine, hydrazine et hydrazide, de préférence c'est la fonction alkoxyamine .
Selon une variante de l'invention, la fonction réactive de covalence du nucléotide modifié est greffée sur la base par l'intermédiaire d'un bras de couplage et/ou la fonction anti-réactive de covalence du réactif est greffée sur le groupement fonctionnel par l'intermédiaire d'un bras de couplage . Le bras de couplage est notamment choisi parmi les chaînes hydrocarbonéeε , saturées ou insaturées, éventuellement interrompues par des fonctions aminé, amide et oxy.
Selon un procédé préférentiel, la fonction -réactive de covalence est la fonction oxyamine, la fonction anti -réactive de covalence du réactif est la fonction aldéhyde, et cette dernière est liée à un groupement fonctionnel de marquage tel qu'un groupement fluorescent ou luminescent .
Avantageusement la fonction aldéhyde est liée au groupement fonctionnel par le bras de couplage -NH-CS-NH- (CH2) 3- et le groupement fonctionnel du réactif est la fluoreεcéine .
Le produit nucléotidique préfonctionnalisé peut comprendre une ou plusieurs fonctions réactives de covalence, identiques ou différentes, introduites par un ou plusieurs nucleotides. Lesdites fonctions réactives de covalence peuvent réagir avec un ou plusieurs réactifs, identiques ou différents, de manière simultanée ou séquentielle. La détection des groupements fonctionnels de marquage du produit fonctionnalisé peut être simultanée ou séquentielle.
Il est entendu que ce procédé de marquage peut être appliqué à un ou plusieurs produits nucléo idiques
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP préfonctionnalisés, notamment pour différencier des produits préfonctionnalisés issus de cibles différentes.
Le produit d'amplification fonctionnalisé marqué peut être détecté qualitativement et/ou quantitativement en phase homogène ou hétérogène .
En phase homogène, le réactif et le produit nucléotidique préfonctionnalisé interagissent dans le même milieu liquide. En phase hétérogène, le produit préfonctionnalisé peut être traité avec le réactif avant ou après capture sur un support solide, c'est à dire directement ou indirectement. La capture sur le support solide peut être réalisée par des moyens connus, tels que 1 ' adsorption, la covalence, notamment en utilisant des fonctions anti -réactives de covalence disponibles à la surface du support solide ou par hybridation avec un composé polynucléotidique .
Le support solide, sous toutes formes appropriées telles que tube, cône, puits, plaque de microtitration, feuille, puce ou polymère soluble, est choisi parmi les polystyrènes, les copolymères styrène-butadiène , les copolymères εtyrène-butadiène en mélange avec des polystyrènes, des polypropylènes, des polycarbonates, des copolymères polystyrène-acrylonitrile, des copolymères styrène-méthylméthacrylate de méthyle, parmi les fibres synthétiques et naturelles, parmi les polysaccharides et les dérivés de la cellulose, le verre, le silicium et leurs dérivés.
Selon des variantes préférentielles du procédé de 1 ' invention,
- la séquence d'acide nucléique cible est une séquence d'ADN ou d'ARN, et les activités enzymatiques comprennent les activités ADN polymérase ARN- et/ou ADN-dépendan es ,
- les activités enzymatiques peuvent en outre comprendre l'activité ribonucléase H et l'activité ARN polymérase ADN-dépendante, pour amplifier la séquence d'acide nucléique cible selon une suite de réactions de transcription inverse, de transcription et de digestion. Les activités enzymatiques ribonucléase H et ADN polymérase peuvent être apportées par une seule enzyme ou bien chacune par une enzyme différente.
A titre d'exemple, le procédé de l'invention peut être utilisé pour l'amplification d'un acide nucléique cible dans un échantillon selon des techniques bien connues de l'homme de l'art, telles que la PCR (Polymérase Chain Reaction), la RT-PCR (Reverse Transcription- Polymérase Chain Reaction) , La TMA (Transcription Mediated Amplification) ou la technique NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification) , ou toute autre technique d'amplification enzymatique.
L'invention concerne également un analogue de nucléotide ou un nucléotide, prefonctionnalisé, susceptible d'être soumis à un traitement enzymatique Par traitement enzymatique d'un analogue de nucléotide ou d'un nucléotide, on inclut toutes les reactions, in vivo ou in vi tro, au cours desquelles intervient au moins une enzyme dont l'activité est liée à un nucléotide Ainsi on comprend toutes réactions comprenant au moins une étape enzymatique dans laquelle un nucléotide sert de substrat à l'enzyme, que ledit nucléotide soit transformé ou non au cours de cette étape enzymatique ; à titre d'exemple de telles réactions sont choisies parmi celles utilisées dans les techniques de biologie moléculaire telles que la transcrip ion, la ligation, 1 ' élongation, la coupure, et plus particulièrement dans les techniques d'amplification, (WINN-DEEN, Journal of Clinical Assay, vol 19, p21-26 (1996) .
Ainsi les enzymes dont les activités sont liées à des nucleotides peuvent en particulier être sélectionnées dans la liste non exhaustive suivante • les ADN polymérases ADN dépendantes telles que le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I de E. coli , la Taq polymérase, les T7 , T4 ou T5 ADN polymérases, les polymérases eucaryotes cellulaires ou virales a, b, g ,- les ADN polymérases ARN dépendantes telles que les polymérases de AMV (Avian Myoblastosiε Virus) , de MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) ; les ARN polymérases telles que les T7 , T3 , SP6, N4, PBSII ARN polymérases, l'ARN polymérase de E. col i ; les enzymes à activité nucléasique telles que les endonucléases de restriction, la RNAse H ; ou encore les polyA polymérases, les réplicaseε, telle que la Q-béta-réplicase, les terminal transférases, ou les ligases.
Selon un mode préféré, on choisira pour l'application du procédé de l'invention la technique TMA pour l'amplification d'une séquence d'acide nucléique cible ARN ou l'amplification d'une séquence d'acide nucléique cible ADN après une étape de transcription inverse, ladite technique étant décrite dans la demande internationale WO 91/01384 incorporée à titre de référence .
Un analogue de nucléotide, préfonctionnalisé selon l'invention répond à la formule générale (I)
Figure imgf000009_0001
dans laquelle B représente une base nucléique,
Z représente un bras de couplage, n est un entier égal à 0 ou 1 ,
X représente une fonction réactive de covalence fixée sur au moins un site de la base nucléique B, R1 représente H ou OH,
R2 représente H, OH, un groupement mono- di - ou tri- phosphate, ou un groupement O-R dans lequel R représente un groupement protecteur,
R3 représente H, un groupement protecteur, ou un groupement mono-, di- ou tri -phosphate . De préférence, R1 et R2 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre H, OH et R3 représente un groupement mono-, di- ou tri -phosphate .
Un nucléotide préfonctionnalisé de 1 ' invention est choisi parmi les nucleotides suivants :
-un nucléotide dont la base nucléique est dérivée de la cytosine et comporte, au moins sur la fonction aminée en position 4 du cycle pyrimidique, au moins une fonction réactive de covalence nucléophile, non protégée, et n'influençant pas, de manière significative, le traitement enzymatique dudit nucléotide, la fonction réactive de covalence étant choisie parmi les fonctions ^^2 , 0-NH2, SH, hydrazine et hydrazide et la fonction réactive de covalence est liée à ladite fonction aminée en position 4 du cycle pyrimidique par un bras de couplage choisi parmi (-CH2-)n1, (-0-CH2-)n1 dans lequel n-^ est un entier compris entre 1 et 12 ; ( -CH2-0-CH2- ) n2 , ( -CH2-CH2-0-CH2-
CH2-)n2, (-CH2_CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-)n2, ( -CH2 -0-CH2 -CH2 - ) n2 , dans lequel n2 est un entier compris entre 1 et 6 ; et -NH-CH2-
0-CH2-CH2. Avantageusement, la fonction réactive de covalence est liée à ladite fonction aminée par l'intermédiaire d'un bras de couplage choisi parmi -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2- , -CH2- CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-.( -CH2 -CH2 -0-CH2-CH2 - , - CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-, et NH-CH2 -0-CH2-CH2.
- un nucléotide dont la base est dérivée de l'uraicile et comporte au moins sur la position 5 du cycle pyrimidique, au moins une fonction réactive de covalence nucléophile, non protégée, et n'influençant pas, de manière significative, le traitement enzymatique, caractérisé en ce que la fonction réactive de covalence est choisie parmi les fonctions NH2 , O- NH2 , SH, hydrazine et hydrazide; avantageusement, la fonction réactive de covalence est liée à ladite fonction aminée par l'intermédiaire d'un bras de couplage choisi parmi =C CH2 - , et -C=C-CH2-NH-CO-CH2- , - CH=CH- CH2 -NH- CO-CH2 - et -CH=CH-CH2;
- un nucléotide dont la base est dérivée de l'adénine et comporte au moins sur la fonction aminée en position 6 du cycle pyrimidique, au moins une fonction réactive de covalence
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP nucléophile, non protégée, et n'influençant pas, de manière significative, le traitement enzymatique, caractérisé en ce que la fonction réactive de covalence est choisie parmi les fonctions NH2 ( CH2-0-NH2/ SH/ hydrazine et hydrazide • la fonction réactive de covalence est liée à ladite fonction aminée par l'intermédiaire d'un bras de couplage choisi parmi (-CH2-
) τι1 , (-0-CH2-)n1 dans lequel n→_ représente un entier compris entre 1 et 12 ,- ( -CH2-0-CH2- ) n2 , ( -CH2-CH2-0-CH2-CH2- ) n2 , (-CH2-
CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-)n2, ( -CH2 -0-CH2 -CH2 - ) n2 , dans lequel n2 est un entier compris entre 1 et 6 ,- et NH-^CH2-0-CH -CH2.
Avantageusement, la fonction réactive de covalence est liée à ladite fonction aminée par l'intermédiaire d'un bras de couplage choisi parmi -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2 -CH2-CH2- , -CH2-CH2-CH2-
CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2_ -CH2 -CH2 -0-CH2-CH2- , -CH2-CH2-0- CH2-CH2-0-CH2-CH2-, et NH-CH2-0-CH2-CH2 ,- et de manière préférée le bras de couplage est -CH2-CH2-CH2-CH2- .
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un nucléotide préfonctionnalisé tel que défini précédemment, dans un traitement enzymatique d'amplification. L'analogue de nucléotide ou le nucléotide, préfonctionnalisé, a, vis-à-vis du traitement enzymatique, un comportement sensiblement identique à celui de l'analogue de nucléotide ou le nucléotide correspondant. En effet, la fonction introduite en un site de la base dudit analogue ou nucléotide, grâce à son inertie biologique et chimique vis-à-vis des enzymes, ne modifie pas signi icativement ni l'affinité, ni la spécificité de l'enzyme à l'égard de son substrat.
Enfin les derniers objets de 1 ' invention consistent en des utilisations particulières de nucleotides tels qu'ils viennent d'être définis. De manière préférentielle, ils sont utilisés dans des techniques d'amplification, telles que celles décrites dans les documents suivants : EP-0 721 988, O- 95/03426, US-5 409 818, US-5 399 491. L'invention est maintenant décrite plus en détail par référence aux exemples et figures annexés qui vont suivre et dans lesquels:
La figure 1 représente un schéma général de synthèse de nucleotides cytidines portant un bras aminé en position 4;
La figure 2 représente un schéma de synthèse du nucléotide cytidine portant un bras alkyloxyaminé en position 4 ;
La figure 3 représente un schéma de synthèse par transamination de nucleotides; et La figure 4 met en évidence l'effet de l'incorporation de la CTP- (N4) -C602-NH2 (27a) sur la sensibilité de la TMA;
La figure 5 met en évidence l'effet de l'incorporation de la CTP- (N4) -C„-NH2 (27b) sur la sensibilité de la TMA.
Dans les figures 4 à 5 précitées sont représentés en abscisse le nombre de copies de la cible par réaction et en ordonnée le nombre d'amplicons obtenus par microlitre de réaction (volume final réactionnel = 100 microlitres I . Aux courbes des figures 4 et 5 sont affectés des symboles particuliers, par exemple B, -j, A, ), •, et un pourcentage. Ce pourcentage correspond au pourcentage du ou des nucleotides préfonctionnalisés par rapport aux nucleotides naturels dans la réaction d'amplification TMA. Les figures • et b montrent respectivement les résultats de la semi -quantification par la technique ELOSA (décrite dans la demande de brevet PCT WO 92/19812) du nombre d'amplicons produits à partir d'une gamme cible d'ARN 16S de Mycobacte∑i um tubercul osi s en présence de différents rapports des nucleotides 21 a e t 27b par rapport à leurs nucleotides naturels respectifs.
Dans les exemples qui suivent et qui permettent d'illustrer quelques avantages de l'invention, il est fait référence à un réactif comprenant un groupe fonctionnel de marquage mais la portée de l'invention n'est bien entendu pas limitée à de telles propriétés du groupe fonctionnel. SYNTHESE DE NUCLEOTIDES ET MARQUEURS PREFONCTIONNALISES .
Pour préfonctionnaliser les nucleotides sur la base nucléique, la stratégie généralement utilisée consiste en la synthèse des nucléosides protégés portant une fonction réactive également protégée. La déprotection de la fonction hydroxyle en position 5' libère le nucléoside modifié, lequel est finalement triphosphorylé sur cette position selon la méthode de Lud ig- Eckstein (J. Lud ig, F. Eckstein, J. Org . Chem . , 1989, 54, 631- 635) .
L'hydrolyse des groupements protecteurs des fonctions hydroxyles en 2' et 3 ' et de celui de la fonction réactive de la chaîne introduite sur la base, conduit aux nucleotides triphosphates préfonctionnalisés.
I- Série adénosine:
EXEMPLE 1 : Synthèse du nucléoside à chaîne aminé 4
Voie de synthèse :
Figure imgf000014_0001
Protection et fonctionnalisation de l'adenosine
Isopropylidène (1) : (Nucleic Acid Chemistry, part 2, Townεend, Tipson, p. 768, iley Interscience)
Figure imgf000014_0002
A une suspension d'adénosine (5g, 18,7 mmol, Aldrich
14659-5) dans de l'acétone (10 ml) contenant de l'APTS (3,9 g, 20,6 mmol), on ajoute goutte à goutte sous argon de 1 'orthoformate d'éthyle (12,44 ml, 74,8 mmol). Après une nuit de réaction, on ajoute 110 ml d'eau contenant 1,86 ml d'ammoniaque à 27 %. Après 30 minutes d'agitation, le milieu réactionnel est évaporé jusqu'à apparition de cristaux blancs. Après 12 h au frigo, on obtient un précipité blanc que l'on recristallise dans l'eau. On obtient 4,175 g (13,5 mmol, 72 %) de produit (1) sous forme d'un poudre blanche. Ce produit a été caractérisé par RMN du proton .
Triazolo (2) : (Samano, Miles, Robins, J. Am . Chem . Soc , 1994, 116, 9331-9332)
Figure imgf000015_0001
L' adénosine-isopropylidène (1) (lg, 3,2 mmol) et l'amidine (1,4 g, 6,5 mmol) sont agitées dans de la pyridine (15 ml) à 100°C sous argon pendant 48 h. La pyridine est alors évaporée et co-évaporée avec du toluène. L'huile obtenue est ensuite reprise par de l'acétate d'éthyle et cette phase organique est lavée avec de l'eau saturée en NaCl . Après séchage sur Na2S0 et évaporation, on obtient le produit (2) sous forme d'une poudre blanche avec un rendement de 60 % (700 mg, 1,9 mmol) . Le produit 2 a été caractérisé par spectrométrie de masse et RMN du proton.
Synthèse de l'amidine: (Bartlett et Humphreg, J". Chem . Soc . 1967, 1664-1666) DMF N-N OHC-NH-NH-CHO + SOCfe *- ^Jf %-→^ , 2HCJ
Le chlorure de thionyle (39,96 g, 24,5 ml, 0,338 mol) est ajouté goutte à goutte au N-N' -diformylhydrazine (12 g, 0,136 mol) dans le DMF (270 ml) à 10°C Le mélange devient jaune. On maintient l'agitation pendant ? -jours. Le précipité obtenu est filtré et lavé par du DMF puis par de l'éther. Après séchage sous vide, on obtient l'amidine avec un rendement de 95 % (28 g, 0,130 mol) .
Substitution du triazolo par le diaminobutane monoprotégé
Monoprotection du 1, 4 -diaminobutane synthèse de (3) (Hassen, Nielsen, Ehrbar, Buchardt , Synthesiε , 1982, 404 405)
Figure imgf000016_0001
La solution de 1 , 4 -diaminobutane (0,113 mol., 9,94 g 11,4 ml) dans le chloroforme (250 ml) est refroidie à 0°C. On ajoute alors goutte à goutte sous argon, une solution de ditertbutyldicarbonate (0,022 mol, 4,95 g, 5,22ml) dans du chloroforme (250 ml) . Le mélange est agité pendant une nuit à température ambiante. Le précipité formé est filtré et le filtrat est évaporé. L'huile résiduelle est reprise par une solution aqueuse saturée en NaCl (40 ml) - on élimine ainsi le produit bisprotégé par filtration. On extrait alors la phase aqueuse avec de l'éther ( 5 x 50 ml). Les phases organiques sont réunies, séchées sur Na2Sθ4 et évaporées On obtient ainsi le produit (3) sous forme d'huile avec un rendement de 99 % (3,8 g, 0,0218 mol). Le produit (3) a été caractérisé par spectrométrie de masse et par RMN du proton. Substitution du triazolo par le diaminobutane-monoboc : synthèse de (4)
Figure imgf000017_0001
On solubilise le produit (2) (500 mg, 1,4 mmol) dans 20 ml d' acétonitrile. On ajoute alors le composé (3) (1,31 g, 7 mmol). Le milieu réactionnel est mis à chauffer à 50°C pendant 2 jours et analysé par CLHP .
Après évaporation de 1 ' acétonitrile , on reprend le résidu par de l'acétate d'éthyle et on lave cette phase organique avec de l'eau saturée en NaCl . Après séchage et évaporation de l'acétate d'éthyle, le résidu est chromatographie sur gel de silice (éluant : CH2CI2, puis CH Cl /MeOHf 98/2, 95/5 (v/v) ) . Après évaporation et précipitation dans l'hexane, on obtient le produit (4) sous forme d'une poudre blanche avec un rendement de 80 % (563 mg, 1,12 mmol) . Le nucléoside (4) a été caractérisé par spectrométrie de masse et par RMN du proton.
Phos-phorylation par la méthode de Eckstein (Ludwig, Eckstein, J. Org . Chem . , 1989, 54 , 631-635)
Figure imgf000018_0001
= triphosphate
Le nucléoside (4) (48 mg, 100 mmol) est dissous dans de la pyridine anhydre et est évaporé 2 fois. On ajoute alors sous argon 100 ml de pyridine, 300 ml de dioxane et une solution fraichement préparée de 2-chloro-4H-l , 2 , 3-dioxaphosphorin-4-one dans du dioxane (130 ml, 130 mmol) . On laisεe l'agitation pendant 20 minutes puis on ajoute une solution 0,5 M de pyrophosphate de tributylammonium dans du DMF anhydre (320 ml) et simultanément 130 ml de tributylamine .
Après 30 minutes d'agitation, on ajoute 2 ml d'une solution d'iode à 1 % dans un mélange pyridine/eau (98/2, v/v) . Après 20 minutes d'agitation, on détruit l'excès d'iode avec une solution aqueuse de NaHS03 à 5 % et on maintient l'agitation pendant 10 minutes. On évapore à sec puis on effectue une extraction eau/dichlorométhane . On vérifie la formation du triphosphate 5 par HPLC (gradient : 0 à 35 . de B en 40 minutes ; A = Tris HC1 20 mM, pH 7 , 6 ; B = Tris HC1 20 M, pH 7,6 + 0,5 M NaCl) . Temps de rétention = 35 minutes.
Après évaporation, on reprend le résidu dans de l'eau
(10 ml) puis on ajoute 10 ml d'une solution aqueuse de TFA à 50 % pour effectuer la déprotection des groupements Boc et isopropylidène . Après 30 minutes, le TFA est évaporé et coévaporé avec de l'eau. On observe ainsi la formation d'un nouveau produit avec un temps de rétention de 19 minutes. EXEMPLE 2 : Synthèse du nucléotide adénosine à chaîne oxyamine .
Voie de synthèse de la chaîne
K2C03 N≡C-(CH2) 3 - Br + HO-N-Pht *- N=C-(CH2) 3 - O-N-Pht g
N2H4
LiAIH, (BocbO H2N-(CH2) -, - 0-NH-Boc,« - N=C-(CH2) 3 - O-NH-Boc -i — N≡C-(CH2) 3- 0-NH2
9 8 7
Synthèse du produit (6) N≡C-(CH2) 3 - O-N-Pht -$
On dissout l' hydroxyphtalimide (10 g, 0,061 mole) dans du DMF (300 ml). On ajoute alors du K2C03 (1,05 eq., 9 g). On observe la formation d'un précipité. Après 1 h d'agitation à 50°C, on ajoute le dérivé brome (1 eq., 9,03 g) et on maintient l'agitation à 50°C pendant 2 h. Après filtration sur coton et évaporation du DMF, on reprend le résidu par de l'acétate d'éthyle puis on lave la phase organique avec HC1 IN puis avec une solution de NaHC03 à 10 % et enfin avec une solution aqueuse saturée en NaCl. Après séchage et évaporation, on obtient le produit (6) avec un rendement de 69 % (9,66 g). Il a été caractérisé par RMN du proton, du carbone 13 et par spectrométrie de masse. Hydrazinolyse : préparation de la chaîne (7)
N≡C-(CH2) 3- 0-NH2 7 Le produit (6) (9,51 g, 0,041 mole) est mis dans 150 ml d'éthanol à 95 %. L'addition d'hydrazine (2 eq., 4 ml) entraîne une solubilisation immédiate du précipité de départ. On observe ensuite la formation d'un précipité blanc de phtalhydrazide . Après 3 heures de réaction à 50°C, on filtre et on lave le précipité avec de l'ethanol. Après évaporation, la pâte obtenue est chromatographiée sur gel de silice (CH2CI2/CH3CN : 9/1, v/v) . Après évaporation des fractions contenant 1 ' oxyamine libre (7) , on ajoute de l'éther puis de l'acide chlorhydrique concentré. On obtient ainsi le produit (7) sous forme d'une poudre blanche avec un rendement de 40 % (2,30 g) . Il a été caractérisé par RMN du proton et du carbone 13.
Protection sous forme de Boc de l' oxyamine
1^C-(CH2) 3 ** O-NH-Boc 8a
On dissout 2,3 g (0,016 mole) de produit (7) dans 10 ml de dioxane. On ajoute alors une solution aqueuse de soude IN (2 eq. : 0,032 mole, 32 ml).
On additionne ensuite goutte à goutte, dans la glace, sous argon, le ditertbutyldicarbonate (1,2 eq . , 0,019 mole, 4,18 g) dissous dans 20 ml de dioxane. Après 3 h de réaction à 0°C on évapore le dioxane puis on ramène le pH à 3 avec une εolution aqueuse d'HCl IN et on extrait à l'éther (3x50 ml). Cn lave ensuite les phases organiques avec une solution aqueuse d'HCl IN puis avec une solution aqueuse saturée en NaCl. Après séchage sur Na2SO„ et évaporation on obtient le produit (8a) sous forme d'une huile jaune (2,56 g, 0,013 mol, 80 %). Il a été caractérisé par RMN du proton et du carbone 13.
Réduction du nitrile par LiAlH„
H2N-(CH2) ** O-NH-Boc
8b
Le composé (8a) (2,56 g, 0,013 mol) est solubilisé dans de l'éther éthylique anhydre (50 ml). Le mélange est refroidi dans un bain de glace. On ajoute alors LiAlH4 (3 g, 0,079 mol) en trois fois. L'agitation est maintenue pendant une nuit puis on ajoute de l'eau (10 ml) et une solution aqueuse de soude à 15 %. Après filtration du précipité blanc ainsi formé on lave la phase organique avec une solution aqueuse saturée en NaCl. Après séchage sur Na2S04 et évaporation on obtient le produit 9 sous forme d'huile (769 mg, 0,0037 mol, 29 %). Il a été caractérisé par RMN du proton et du carbone 13. La chaîne (8b) a été caractérisée par RMN du proton et du carbone 13
Substitution du triazolo par la chaîne oxyamine :
Figure imgf000022_0001
Le produit (2) (246 mg, 0,68 mmol) est dissous dans 20 ml d1 acétonitrile. On ajoute alors la chaîne (8b) (700 mg, 3,43 mmol) . Le mélange est porté à 50 °C. La réaction est suivie par HPLC : elle évolue très lentement. Après une semaine, le solvant est évaporé. Le résidu obtenu est dissous dans de l'acétate d'éthyle et la phase organique est lavée avec de l'eau saturée en NaCl. Après séchage sur Na2S04 et évaporation on obtient une huile jaune que l'on chromatographie sur gel de silice (éluant : CH2Cl2/MeOH : 97/3, v/v) . Après évaporation du solvant on obtient le produit (9) sous forme d'une poudre blanche (120 mg, 0,24 mmol, 35 %) . Le produit (9) est caractérisé par RMN du proton et par spectrométrie de masse.
Phosphorylation du nucléoside (9) . :
La phosphorylation du nucléoside (9) en nucléotide (10) est réalisée selon le protocole décrit dans l'ex€≥mple I (préparation du nucléotide 5) .
Figure imgf000023_0001
II- Série uridine:
EXEMPLE 3 : synthèse de l' uridine à chaîne amine (15)
Voie de synthèse
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000024_0003
Figure imgf000024_0002
Synthèse de la chaîne
'NH-Boc
11
5 ml de propargylamine (73 mmol) sont dissous dans un mélange NaOH IN/dioxane (146 ml/50ml) . On ajoute alors goutte à goutte, à 0°C, sous argon, 20 ml de BocO dissous dans 50 ml de dioxane. On observe la formation d'un précipité. Après S h, le précipité de carbonate est filtré puis on ramène le pH à 3 avec une solution aqueuse d'HCl IN et on extrait avec du dichlorométhane. La phase organique est ensuite lavée avec une solution aqueuse saturée en NaCl puis séchée sur Na2SO. et enfin évaporée. Par addition d'hexane le produit (11) précipite. On récupère ainsi 8,92 g (0,057 mmol, 79 %) . Le produit (111 a été caractérisé par RMN du proton et par spectrométrie de masse.
Introduction de la chaîne sur la base Couplage de Heck (Hobbs, J. Org. Chem. , 1989, 54 , 3420-3422).
Figure imgf000025_0001
10 ml de DMF sont dégazés et placés sous argon. On ajoute alors de la iodouridine (1 g, 2,56 mmol, Aldrich, 85529- 7) et de l'iodure de cuivre (97,5 mg, 0,512 mmol) . La réaction est placée à l'obscurité puis on ajoute, toujours sous argon, de la triéthylamine (713 ml, 518 mg, 5,12 mmol) et la chaine-Boc (11) (1,2 g, 7,68 mmol) . Le mélange est laissé sous argon pendant 10 minutes. Le démarrage de la réaction est réalisé par addition du catalyseur tétrakistriphénylphosphine palladium (296 mg, 0,256 mmol). La réaction est suivie par HPLC. Après une nuit, le DMF est évaporé et coévaporé avec de l' acétonitrile . Le résidu obtenu est chromatographie sur gel de silice (dépôt solide, éluant : CH2C12, CH2C12 /MeOH : 98/2, 95/5, 90/10, 85/15- v/v). Après évaporation on obtient 528 mg de produit (12) (1,3 mmol, 52 %) . Le produit (12) a été caractérisé par RMN du proton et par spectrométrie de masse.
Protection sous forme d' isopropylidène (Townsend, Tipson, Nucleic acid chemistry, part 2, p. 765, Wiley-interscience) .
Figure imgf000025_0002
On ajoute , sous argon à température ambiante , l ' orthoformate d' éthyle ( 166 ml , 148 mg , 1 mmol ) à une suspension de produit (12) (200 mg, 0,5 mmol) dans l'acétone (2 ml) contenant de l'APTS (9,5 mg, 0,05 mmol). La réaction est suivie par CCM (CH2C12 /MeOH 90/10) . Après 2 heures on ajoute du dichlorométhane et on lave la phase organique avec une solution aqueuse de NaHC03 à 10 % puis avec une solution aqueuse saturée en NaCl. Après séchage et évaporation on obtient le produit (13) sous forme d'une poudre jaune (167 mg, 0,38 mmol, 76 %) .
Phosphorylation par la méthode de Eckstein et déprotection (Ludwig, Eckstein, J. Org. Chem . , 1989, 54 , 631-635)
Figure imgf000026_0001
Le nucléoside 13 (44 mg, 100 mmol) est dissous dans de la pyridine anhydre et est évaporé 2 fois. On ajoute alors sous argon 100 ml de pyridine, 300 ml de dioxane et une solution fraichement préparée de 2-chloro-4H-l, 2 , 3- dioxaphosphorin-4-one dans du dioxane (130 ml, 130 mmol). On laisse l'agitation pendant 20 minutes puis on ajoute une solution 0,5 M de pyrophosphate de tributylammonium dans du DMF anhydre (320 ml) et simultanément 130 ml de tributylamine.
Après 30 minutes d'agitation, on ajoute 2 ml d'une solution d'iode à 1 % dans un mélange pyridine/eau (98/2, v/v). Après 20 minutes d'agitation, on détruit l'excès d'iode avec une solution aqueuse de NaHS03 à 5 % et on maintient l'agitation pendant 10 minutes. On évapore à sec puis on effectue une extraction eau/dichlorométhane . On vérifie la formation du triphosphate par CLHP (gradient : 0 à 35 % de B en 40 minutes ; A = Tris HC1 20 mM, pH 7,6 ; B = Tris HC1 20 mM, pH 7,6 + 0,5 M NaCl). Temps de rétention = 36 minutes. Après évaporation, on reprend le résidu dans de l'eau (10 ml) puis on ajoute 10 ml d'une solution aqueuse de TFA à 50 % pour effectuer la déprotection des groupements Boc et isopropylidène . Après 30 minutes, le TFA est évaporé et coévaporé avec de l'eau. On observe ainsi la formation d'un nouveau produit (15) avec un temps de rétention de 20 minutes.
EXEMPLE 4 : Synthèse de l' uridine à chaîne alcoxyamine
21.
Voie de synthèse
Figure imgf000027_0001
Synthèse de la carboxyméthoxyamine-boc 16 ( Kurth et al , J. Med . Chem. , 1993 , 1255- 1261 . )
Figure imgf000027_0002
Le chlorhydrate de carboxyméthoxylamine (6,6 g, 60,4 mmol) est dissous dans 132 ml d'eau en présence de soude (2 g, 50 mmol) et de dioxane (66 ml) . La solution est refroidie dans un bain de glace. On ajoute goutte à goutte du d -tert- butyldicarbonate (13,97 g, 64,1 mmol) dissous dans le dioxane
(66 ml) . L'agitation est maintenue pendant une nuit à température ambiante. On évapore à sec le mélange réactionnel .
Au précipité obtenu, on additionne 250 ml d'eau puis on extrait à l'éther (2x250 ml). On acidifie la phase aqueuse par HCl IN jusqu'à pH 3. Ensuite, on extrait cette phase par de l'éther éthylique (3x50 ml) et par de l'acétate d'éthyle (3x250 ml). Les phases organiques sont réunies et séchées sur sulfate de sodium.
Après évaporation on obtient le produit (16) sous forme d'une poudre blanche (10 g, 52 mmol, 86 %) . Le produit (16) a été caractérisé par RMN du proton.
Synthèse de la chaîne par couplage peptid que (Costa, Dommguez, Cutts, Williams, Bowen, J. Med . Chem . , 1994, 3 , 314-321.
DCC 9
HOOC-CH2-ONHBoc + ≡ — ^ »- == — s A DNHBoc
NH2 N v
H 17
On dissout le produit (16) (2 g, 10,4 mmol) dans du THF fraichement distillé. Après refroidissement du milieu dans la glace, on ajoute (2,15 g, 10,4 mmol) de DCC. Le mélange est agité à froid pendant 15 minutes. On ajoute alors l'aminé propargylique . (714 ml, 10,4 mmol) L'agitation est maintenue à température ambiante sous argon pendant 2 heures . Après filtration, le solvant est évaporé. Le résidu ainsi obtenu est repris dans du dichlorométhane et est lavé avec une solution aqueuse de HCl IN, puis avec une solution de NaHC03 à 5 % et enfin avec une solution aqueuse saturée en NaCl . Après séchage sur Na2S04 , le dichlorométhane est évaporé et le résidu est chromatographie sur gel de silice (éluant : acétate d' éthyle/hexane 60/40, v/v). On obtient ainsi le produit (17) sous forme d'une poudre blanche (1,23 g, 5,4 mmol, 52 %). Le produit (17) a été caractérisé par RMN du proton et par spectrométrie de masse.
Couplage de Heck: Hobbs, J. Org . Chem. , 1989,54,3420-3422.
Figure imgf000029_0001
10 ml de DMF sont dégazés et placés sous argon. On ajoute alors de la iodouridine (lg, 2,56 mmol ) et de l'iodure de cuivre (97,5 mg, 0,512 mmol). La réaction est placée à l'obscurité puis on ajoute, toujours sous argon, de la triéthylamine (713 ml, 518 mg, 5,12 mmol) et la chaine (17)
(1,75 g, 7,68 mmol) . Le mélange est laissé sous argon pendant 10 minutes. Le démarrage de la réaction est réalisé par addition du catalyseur tétrakistriphénylphosphine palladium (296 mg, 0,256 mmol) . La réaction est suivie par HPLC. Après une nuit, le DMF est évaporé et co-évaporé avec de l' acétonitrile . On reprend le résidu obtenu par de l'acétate d'éthyle et on lave cette phase organique avec une solution aqueuse saturée en NaCl . Après évaporation de l'acétate d'éthyle le résidu est chromatographie sur gel de silice (éluant : CH2Cl2 /MeOH : 90/10, 85/15, 80/20, v/v). Après évaporation on obtient 747 mg de produit (18) (1,6 mmol, 62 %) . Le nucléoside (18) a été caractérisé par RMN du proton et par spectrométrie de masse.
Protection sous forme d' isopropylidène (Townsend, Tipson, Nucleic acid chemistry, part 2, p765, Wiley-Interscience) :
Figure imgf000030_0001
On ajoute, sous argon à température ambiante, 1 Orthoformate d'éthyle (355 ml, 316 mg, 2,13 mmol) à une suspension de produit (18) (500 mg, 1,06 mmol) dans l'acétone (3 ml) contenant de l'APTS (20,2 mg, 0,10 mmol). La réaction est suivie par CCM (CH2C12 /MeOH 90/10) . Après 3 heures on ajoute du dichlorométhane et on lave la phase organique avec une solution aqueuse de NaHC03 à 10 % puis avec une solution aqueuse saturée en NaCl. Après séchage et évaporation on obtient le produit (19) sous forme d'une poudre jaune (395 mg, 0,77 mmol, 73 %) . Le nucléoside protégé 19 a été caractérisé par RMN du proton du carbone 13 et par spectrométrie de masse.
Phosphorylation par la méthode de Eckstein et déprotection (Ludwig, Eckstein, J. Org. Chem . , 1989, 54 , 631-635)
Figure imgf000030_0002
Le nucléoside (19) (102 mg, 200 mmol) est dissous dans de la pyridine anhydre et est évaporé 2 fois. Or ajoute alors sous argon 200 ml de pyridine, 600 ml de dioxane et une solution fraichement préparée de 2-chloro-4H- 1, 2 , 3- dioxaphosphorin-4-one dans du dioxane (260 ml, 260 mmol). On laisse l'agitation pendant 20 minutes puis on ajoute une solution 0,5 M de pyrophosphate de tributylammonium dans du DMF anhydre (640 ml) et simultanément 260 ml de tributylamme
Après 30 minutes d'agitation, on ajoute une solution d'iode à 1 % dans un mélange pyridme/eau (98/2, v/v) (4 ml, 314 mmol). Après 20 minutes d'agitation, on détruit l'excès d'iode avec une solution aqueuse de NaHS03 à 5 % et on maintient l'agitation pendant 10 minutes On évapore à sec puis on effectue une extraction eau/dichlorométhane On vérifie la formation du triphosphate par CLHP (gradient 0 à 35 % de B en 40 minutes , A = Tris HCl 20 mM, pH 7 , 6 , B = Tris HCl 20 mM, pH 7,6 -f 0,5 M NaCl ; colonne DEAE Waters Protem-Pak 8HR lOxlOOmm) Temps de rétention = 35 minutes
Après évaporation, on reprend le résidu dans de l'eau (5 ml) puis on ajoute 5 ml d'une solution aqueuse de TFA à 50 % pour effectuer la déprotection des groupements Boc et isopropylidène. Après 30 minutes, le TFA est évaporé et co- évaporé avec de l'eau. On observe ainsi par HPLC la formation d'un nouveau produit (21) avec un temps de rétention de 30 minutes. Ce produit est purifié par HPLC dans les conditions décrites précédemment , puis dessalé (Eau milliQ en isocratic, Colonne Macherey Nagel C18 nucleosil)
III- Série cytidine:
I- Synthèse des nucleotides triophosphates modifiés en position 4 par la présence d'une chaîne alkylaminée
Afin d'introduire une chaîne alkyl aminée en position
4 de la base, cette dernière a été activée par l'introduction du groupe tosyle selon la méthode de Czernecki et coll. ( S. Czernecki , T. Lediguarher, J.M. Valéry, Nucléosides & Nucleotides , 1989, 54, 631-635) à partir de la [2',3'-0- isopropylidène, 5'-0- butyldiméthylsilyl] -uridine .
La substitution nucléophile du groupe tosyle par une chaîne alkyl diaminée suivie de la protection par le trifluoroacétate d'éthyle de la fonction amino libre de la chaîne introduite, est réalisée en une étape.
La déprotection de la fonction hydroxyle en position
5' libère le nucléoside modifié, lequel est finalement triphosphorylé sur cette position selon la méthode de Ludwig-
Eckstein (J. Ludwig, F. Eckstein, J. Org . Chem . , 1989, 54, 631-
635) décrite dans les exemples précédents.
L'hydrolyse des groupes protecteurs des fonctions hydroxyles en 2' et 3 ' ainsi que de celui de la fonction amino de la chaîne introduite en 4, conduit aux nucleotides triphosphates désirés (Figure 1) .
Une autre stratégie qui consiste en l'introduction directe de la chaîne aminée en position 4 du nucléotide par transami a ion a été utilisée pour préparer les nucleotides (33) et (34) (Figure 3) .
EXEMPLE 5: Synthèse de la [2 ' , 3 ' -O-iEopropylidène, 5' -0-butyldiméthylsilyl]-uridine (22) .
La solution de la 2', 3' -O- isopropylidène-ur Ldine (Immole, Sigma, 1-5127) dans la pyridine (5 ml) est traitée par le chlorure de t-butyldimétylsilyl pendant une nuit sous argon à température ambiante. La réaction est ensuite arrêtée par l'addition de l'ethanol absolu (2 ml) évaporée puis co-évaporée avec le toluène. Le produit (22) est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant : acétate d' éthylehexane 1 -. 1 , v :v, Rf = 0.3) .
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP EXEMPLE 6: Synthèse de la [2 ' , 3 ' -O-isopropylidène, 5' -O-t-butyldiméthylsilyl-4 -p-toluène suifonyl]-uridine (23).
Le composé (22) (1 mmole) dans l' acétonitrile (17 ml) est porté au reflux en présence du carbonate de potassium (1.3 mmoles, 1.3 éq.) et du chlorure de p-toluène sulfonyle (1.2 mmoles, 1.2 éq ) pendant 3 heures. Après disparition totale du produit de départ, la réaction est hydrolysée à température ambiante par addition de l'eau (2 ml) puis évaporée à sec. Le résidu obtenu est traité par une partition acétate d'éthyle-eau et est utilisé tel quel pour l'étape suivante.
CCM : Rf = 0 7 (éluant : acétate d' éthyle-hexane 1:1, v:v). Le nucléoside 23 a été caractérisé par
RMN du proton (200MHz, CDC13) • d = 8,3 ppm (1H, d, H-6) , 6,8(2H, d, H-aroma) ; 7,3(2H, d, H aroma) , 6,1(1H, d, H-5) , 5,8(1 H, s, H-l') ; 4,7 (2H, s, H-2', H-3') ; 4,4 (1 H, m, H- 4'); 4,0-3,7(2H, m, H-5'a, H-5'b), 2,4 (3 H, s, CH3) ; 1,6 - 1,3(2 x 3H, 2 x s, 2xCH3-ιsoprop) , 0,8 (9H,s, 3xCH3 ) , 0,1(6 H, s, 2x CH3) .
EXEMPLE 7: Synthèse de la [4-N-alkyl trifluoroacétyl amino-2' , 3' -O-isopropylidène, 5' -O-t-butyldiméthylsilyl]- cytidine (24) .
A une solution de (23) (1 mmole) dans le dichlorométhane (5 ml) est ajouté à température ambiante et sous argon, le réactif alkyl diammé (5 mmoles, 5 éq) . Après 5 mm d'agitation, un excès de trifluoroacétate d'éthyle (15 mmoles, 15 éq.) est additionné au milieu réactionnel et l'agitation maintenue durant 15 mm. Le nucléoside désiré (24) est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant • acétone-hexane 1:2, v:v, Rf = 0.2). La structure des nucléosides intermédiaires (24) complètement protégés est confirmée par RMN du proton.
Exemple du nucléoside (24a) : RMN (200MHz, CDC13), d =7,7 - 7,5 ppm (2H, m, H-6, NH) ; 5,9(1 H, s, H-l') ; 5,7 (1H, si, NH) ; 5,6 (1H, d, H-5); 4,7 (2H, 1, H-2', H-3'); 4,3(1 H, m, H-4'); 4,0 -
3,7 (2H, m, H-5'a, H-5'b); 3,7 - 3,5 (m, 12 H, 6 x CHg) ,- 1,6 -
1,3 (2 x 3 H, 2 x 1, 2 x CH 3 isoprop) ; 0,8 (9H, 1, 3xCH3) , 0,1 (1, 6H, 2xCH 3)
EXEMPLE 8: Synthèse de la [4-N-alkyl trifluoroacétyl amino-2 ' , 3 ' -O-isopropylidène]- cytidine (25) :
Le composé (24) (1 mmole) dessous dans le THF (5 ml) est traité par une solution molaire de fluorure de tétrabutylammonium (1,2 mmoles, 1,2 éq) dans le THF. Après 3 à 4 heures d'agitation à température ambiante et sous argon, la réaction est neutralisée par l'acide acétique (1 éq.) puis évaporée à sec. Le composé (25) est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant acétone-hexane 1 :1, v :v, Rf == 0.3) .
EXEMPLE 9: Synthèse de la [4-N-alkyl trifluoroacétyl a ino-2' ,3' -O-isopropylidêne-5' -0-triphosphate]-cytidine (26) .
Le composé (25) (0.2 mmoles) est co-évaporé avec la pyridine (2 x 1 ml) puis mis en solution dans 400 ml d'un mélange pyridine-dioxane (1:3, v :v) . Une solution de chlorure de dioxaphosphorinone (260 μl) est ajoutée à la réaction. Un précipé blanc se forme au bout de 5 à 10 min et après 20 min d'agitation une solution de pyrophosphate de butylammonium dans le DMF (0,5 M, 640 μl , 1,6 éq.) suivie de la tributylamine (230 ml) est ajoutée à la réaction. Après 30 min d'agitation, la réaction est oxydée par une solution d'iode à 1 % dans le mélange pyridine-eau (98 :2, v :v) (4 ml) et l'agitation maintenue pendant 30 min. L'excès d'iode est ensuite détruit par une solution aqueuse de bisulfite de sodium à 5 % et le milieu réactionnel évaporé à sec. Le résidu obtenu est dissout dans l'eau (20 ml) et traité par un lavage au dichlorométhane. La phase aqueuse est récupérée et analysée en HPLC (colonne DEAE 8 HR Millipore 5x100 mm, tampon A : Tris HCl 20 mM pH 7.6, tampon B : Tris HCl 20 mM, 0.5 M NaCl pH 7.6, débit : 0.5 ml/min, gradient : 0 à 35 % B en 40 min) . Temps de rétention : 24 à 29 min. CCM : Rf = 0.5, éluant : propanol : eau : NH40H (6:3 :1, V :v :v)
EXEMPLE 10: Synthèse de la [4-N-alkyl amino-5'-0- triphosphate]-cytidine (27) .
A la solution de (26) (0.2 mmole) dans l'eau (20 ml) est ajouté de l'ammoniac aqueux (10 ml) et l'agitation maintenue durant 1 heure. Le milieu réactionnel est évaporé à sec, puis repris dans l'eau (20 ml) suivi de l'acide trifluoroacétique aqueux à 50 % (10 ml) et l'agitation maintenue pendant 30 min.
Le milieu réactionnel est de nouveau évaporé puis co-évaporé à sec avec l'eau. Le composé désiré est purifié et dessalé par
HPLC. HPLC analytique : temps de rétention : 17 à 20 min.
Purification : colonne préparative Protein Pack 8 HR DEAE 10 x
100 mm, mêmes tampons et gradient utilisés dans l'exemple 9, débit 2 ml/min. Dessalage : colonne RP 18, tampon A : eau, tampon B : méthanol . CCM : Rf = 0.2, éluant : propanol : eau :
NH40H (4 : 5 :1, v :V :v)
II- Synthèse des nucleotides triphosphates modifiés en position 4 par la présence d'une chaîne alkyloxyaminée :
Dans un premier temps, on a introduit une chaîne alkyle, hydroxylée à son extrémité, par substitution nucléophile du groupe tosyle en position 4 de la cytidine. Ensuite, nous avons réalisé la réaction de Mitsunobu entre la fonction hydroxyle de la chaîne introduite et la N-phtalamido- hydroxylamine . L'obtention du nucléotide triphosphate alkyloxyaminé correspondant suit les mêmes étapes de synthèse que celles des nucleotides triphosphates alkylaminés (Figure 2) .
EXEMPLE 11: Synthèse de la [4-N-hexanyl-6-ol-2 ' , 3 ' -O- isopropylidène-5' -t-butyldiméthylsilyl-cytidine (28) .
A une solution de (23) (1 mmole) dans le dichlorométhane (5 ml) est ajouté à température ambiante et sous argon, le 6-amino-hexanol (Smmoles, 5 éq.). Après 30 min de réaction le solvant est évaporé à sec, et le composé 128) est purifié par chromatographie sur gel de sil ce.
EXEMPLE 12: Synthèse de la [4-N-hexanyl-6-N- phtalaπιido-oxyamino-2' , 3' -O-isopropylidène- 5' -t- butyldiméthylsilyl]-cytidine (29) .
A la solution de (28) (1 mmole) en présence*; de la triphénylphosphine (3 mmoles, 3 éq . ) et de la N-phtalamido- hydroxylamine (3 mmoles, 3 éq.) dans le THF (10 ml) est ajouté le diéthyle azodicarboxylate (le DEAD, 1 mmoles, 3 mmoles, 3 éq.) à température ambiante et sous argon. Après une heure d'agitation, le solvant est évaporé à sec et le composé (29) est purifié par chromatographie sur gel de silice.
EXEMPLE 13: Synthèse de la [4 -N-hexanyl-6-N- phtala ido-oxyamino-2' ,3' -0-isopropylidène]-cytidine (30).
Le composé (30) a été synthétisé selon le protocole décrit dans l'exemple 8. EXEMPLE 14: Synthèse de la [4-N-hexanyl-6-N- phtalamido-oxyamino-2' ,3' -O-isopropylidène-5' -O-triphosphate]- cytidine (31) .
Le composé (31) a été synthétisé selon le protocole décrit dans l'exemple 9. HPLC analytieque (conditions dans l'exemple 10) : temps de rétention : 44 min. CCM : Rf = 0.5, éluant : propanol : eau : NH40H ( 6 :3 :1, v :v :v)
EXEMPLE 15: Synthèse de la [4-N-hexanyl-6-oxyamine-5' - O- triphosphate]-cytidine (32) .
Le nucléotide totalement protégé (32) totalement protégé est déprotégé en 2 ',3' par l'acide trifluoroacétique selon le protocole décrit dans l'exemple 10. La déprotection de la fonction alkoxyamine est réalisée dans une solution aqueuse de l'hydrazine pendant une nuit à température ambiante. Le nucléotide (32) est ensuite purifié par HPLC dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple 10.
EXEMPLE 16: Synthèse de la [4-N- (2 , 2-oxy-bis- éthylamine) -5' -0- triρhosphate]-cytidine (33) par transamination .
La cytidine triphosphate (0.1 mmole) est ajoutée à la solution composée du bisulfite de sodium (12 mmoles, 120 éq.) et du chlorhydrate de la 2-2' oxy-bis-éthylamine (7.5 mmoles, 75 éq.) dans l'eau (2.5 ml) dont le pH a été préalablement ajusté à 7.0 par une solution de soude à 10 M, l'agitation étant maintenue à 37°C pendant 3 jours. Le composé (33) est purifié et dessalé par HPLC (voir conditions HPLC dans l'exemple 10) .
EXEMPLE 17: Synthèse de la [4-N- (acide adipique- hydrazide) -5' -O-triphosphate]-cytidine (34) par transamination. Le nucléotide (34) a été préparé par transamination selon le protocole décrit dans l'exemple 16, en utilisant l'acide adipique dihydrazide (83mg, 0,44moles) pour l'introduction de la fonction hydrazide. Sa purification et son dessalage ont été aussi réalisés selon l'exemple 10, sa structure a été confirmée par RMN du proton.
IV- Fluorophore fonctionnalisé:
EXEMPLE 18 : Synthèse de fluorescéine-aldéhyde (36)
Voie de synthèse :
Figure imgf000039_0001
CH3COOH 30%
Figure imgf000039_0002
Couplage du FITC avec l'aldéhyde protégé
Figure imgf000040_0001
L ' isothiocyanate de fluorescéme (91. mg, 2,35 mmol, Aldrich, F 250-2) est dissous dans du DMF anhydre (10 ml) , sous argon. On ajoute alors l' aminobutylaldéhyde diéthylacétal (421 mg, 392 ml, 235 mmol). Au bout d'une heure le DMF est évaporé et le résidu est chromatographie sur gel de silice (éluant : CH?C12 /MeOH : 90/10, v/v) . Après évaporation au solvant on obtient le produit (35) sous forme d'une poudre orange (1,21 g, 2,2 mmol, 94 %) . Il a été caractérisé pa. RMN du proton et par spectrométrie de masse.
Déprotection de l'aldéhyde :
Figure imgf000040_0002
Le produit protégé (35) (342 mg , 0,62 mmol) est placé dans 20 ml d'une solution aqueuse d'acide acétique à 30 %. Après une heure de réaction on évapore le solvant et on co-évapore avec de 1 ' acétonitrile . Le résidu obtenu est chromatographie sur gel de silice (éluant : CH2C1, /MeOH 90/10, v/v). Après évaporation du solvant on obtient le produit (36) sous forme d'une poudre orange (145 mg, 0,30 mmol, 48 %). Il a été caractérisé par RMN du proton et par spectrométrie de masse. EXEMPLE 19 : Synthèse chimique d'un polynucléotide préfonctionnalisé .
Synthèse du nucléoside de départ 2'-désoxy-8- (pentényl) -thioadénosme (38):
La synthèse du nucléoside de départ a été réalisée en utilisant le précurseur 2 ' -désoxy-8-mercaptoadénosιne (37) obtenu selon la stratégie décrite par A. LAAYOUN, J.-L. DECOUT et J. LHOMME dans Tetrahedron Lett., 1994, 35, 4989-4990.
Figure imgf000041_0001
Le 2 ' -désoxy-8-mercaptoadénosιne (16,68 mmol) est dissous dans du DMF (Diméthyl formamide) anhydre en présence d'un excès de carbonate de potassium (33,00 mmol) . Après addition sous argon de l-bromopent-4-ène (18,37 mmol) et une incubation de trois heures sous agitation à température ambiante, les sels minéraux sont filtrés sur célite et la DMF est évaporée. Un résidu marron est obtenu et lavé à 1 ' hexane puis à l'éther éthylique. Le produit est ensuite purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant: CH2CI2/CH3OH -
95/5 (v/v) puis 90/10 (v/v) ) . Le nucléotide de départ ainsi obtenu est caractérisé par les méthodes spectroscopiques usuelles.
Synthèse chimique d'un polynucléotide prefonctionnalisé Dans un premier temps, le nucléoside synthétisé précédemment est incorporé dans un oligonucléotide A cet effet, un synthon phosphoramidite (39) correspondant au nucléoside de départ, protégé, a été préparé selon la stratégie décrite par A. J. ROGERS dans "Oligonucleotide synthesis" (1984), p23-34, M.J. GAIT Ed., IRL Press, Oxford.
Figure imgf000042_0001
'iPr Bz = Benzoyl
DMT = diméthoxytrityl
L'aminé exocyclique de l'adénine est protégée par un groupement benzoyle, l 'hydroxyle en 5' est protégé par le diméthoxytrityle et 1 ' hydroxyle en 3' par le groupemeint N,N- diisopropyl-2-cyanoéthylphosphoramidite .
Le polynucléotide 5 ' CGCACLCACGC 3', dans lequel L est la 2 ' -désoxy-8- (pentényl) -thioadénosine , a été synthétisé sur un appareil Milligen/Biosearch 8700 selon la méthode au phosphoramidite par voie automatique conformément au protocole proposé par le constructeur.
La purification du polynucléotide synthétisé est réalisée par HPLC en phase inverse (colonne semi-préparative Macherey Nagel 10 mm x 25 cm,- C18; 5 μm de porosité; éluant: gradient de 20 min de 0 à 30% d ' acétonitrile en mélange avec une solution aqueuse d'acétate d'ammonium 0,1 M à pH 6). Les fractions contenant le polynucléotide sont collectées et lyophilisées . Après traitement de 1 ' oligonucleotide par de l'acide acétique (80% dans l'eau) pendant 10min à température ambiante, la position 5 ' du polynucléotide est détritylée puis isolé après extraction à l'éther.
Dans un second temps, le nucléotide L incorporé à l'étape précédente est activé de façon à obtenir le polynucléotide diol 5 ' CGCACMCACGC 3', dans lequel
Figure imgf000043_0001
340 nmol de polynucléotide 5 ' CGCACLCACGC 3' sont traités avec une solution composée de 170 μl de tétroxyde d'osmium 0,02%, 2 μl de N-méthylmorpholine-N- oxyde et de 2 μl de H2°2 3 % - Après une incubation d'une nuit à température ambiante, le polynucléotide 5 ' CGCACMCACGC 3' est purifié par HPLC selon les conditions décrites précédemment.
Enfin, le polynucléotide aldéhyde 5 ' CGCACNCACGC 3' dans lequel
Figure imgf000043_0002
est obtenu en ajoutant à l'obscurité 200 μl du metaperiodate de sodium 54 μM à 200 μl d'une solution aqueuse 110 nM d' oligonucleotide diol 5 ' CGCACMCACGC 3'. Après 15 min, le polynucléotide aldéhyde 5 ' CGCACNCACGC 3' est purifié par HPLC (colonne semi-préparative Macherey Nagel 10 mm x 25 cm; C18; 7 μm de porosité; éluant: gradient de 20 min de 0 à 30% de méthanol en mélange avec une solution aqueuse de dihydrogénophosphate de sodium 20mM à pH6) .
EXEMPLE 20 : Marquage du polynucléotide préfonctionnalisé obtenu a l'exemple 19 :
La réaction de marquage est réalisée à l'aide du réactif (40) consistant en un noyau dansyle comme groupement fonctionnel fluorescent lié par l'intermédiaire d ' une chaîne diéthylène glycol à une fonction oxyamine (nucléophile) . Ce réactif a été préparé selon la méthode décri e D. BOOTURYN et al. Dans Tetrahedron, 1997, 53, 5485-5492.
Figure imgf000044_0001
La réaction de marquage est réalisée dans l'eau en présence d'un léger excès de réactif (40) (1,5 équivalent) par rapport à 1 'oligonucleotide . Le suivi de la réaction par HPLC indique une disparition rapide des produits de départ et la formation d'un nouveau produit correspondant au polynucléotide fonctionnalisé (41) . L'analyse du spectre de RMN du proton confirme par ailleurs l'accrochage du marqueur dansyle.
Figure imgf000045_0001
EXEMPLE 21 : Synthèse enzymatique d ' un polynucléotide préfonctionnalisé par transcription .
Synthèse du nucléotide préfonctionnalisé: 2'-désoxy-8- (butanal) -thioadénosine- 5 ' triphosphate (43):
Cette synthèse est réalisée en utilisant le 2 ' -désoxy- 8- (pentényl) -thioadénosine (38) (voir Exemple 19). Le nucléotide de départ (42) est obtenu selon la méthode décrite par J. LUDWIG et F. ECKSTEIN dans J. Org. Chem., 1989, 54, 631-635.
HO
Figure imgf000045_0002
Les étapes d'oxydation nécessaires à l'obtention du nucléotide prefonctionnalisé 43 sont réalisées comme indiqué dans l'Exemple 19 :
Incorporation enzymatique du nucléotide préfonctionnalisé (43): a) Préparation de la matrice ADN portant un promoteur
Une PCR est réalisée sur le gène HIVgag porté dans un plasmide pGEM linéarisé, en utilisant un primer classique, et une amorce portant la séquence sens d'un promoteur poαr l'ARN polymérase du phage T7 en amont d'une séquence d'amorce classique .
Séquence des amorces Amorce classique (n° 4014)
5 ' - AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA 3 '
Amorce promoteur (n°4003) :
5 ' AATTCTAATACGACTCACTATAGGGTGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTCA- 3 '
On obtient un produit de 158 paires de bases, qui est purifié par extraction phénol/chloroforme et passage sur microcon 30
b) Réaction de transcription
Les réactions de transcription sont réalisées en tubes Eppendorf dans un volume final de 25 μl, dans un tampon 40 mM de Tris/HCl, pH 8,1, 20 mM de MgCl2, 5 mM de Dithiotreitol , 1 mM de spermid e, 8% de polyéthylène glycol, 0,01% de Triton X 100, 50 μg/ml de d'albumine de sérum bovin Le nucléotide prefonctionnalisé (43) et les quatre ribonucléotides (CTP, GTP, ATP, UTP) sont ajoutés respectivement à la concentration de 1,33 mM et 4 mM chacun. La matrice PCR est ajoutée à la concentration de 109 copies/μl, et l'ARN polymérase du phage T7 (Demande de brevet FR 97 04166) à la concentration de 1 u/μl La réaction est incubée durant 60 mm à 37 °C. 0,5 u/μl de DNAse 1 sont ajoutés au milieu afin de détruire la matrice ADN L'échantillon est incubé à 37°C continue pendant 15 mm Les ARN obtenus sont purifiés par un passage sur Sephadex G50
En parallèle, un premier contrôle est effectué avec une réaction sans addition de T7 ARN polymérase Un second contrôle est réalisé sans nucléotide activé, comme témoin de la transcription Les produits de transcription purifiés sont marqués selon le mode expérimental décrit à l'Exemple 2 et visualisés sous lampe ultra violette après migration électrophorétique en gel d'agarose.
EXEMPLE 22 : Synthèse d'un polynucléotide prefonctionnalisé au cours d'une réaction d'amplification TMA.
Pour permettre le marquage intense des produits d'amplification TMA, on incorpore des nucleotides préfonctionnalisés 27a (CTP- (N4) -C602-NH2) , 27b (CTP- (N4) -C4 - NH2) , 32 (CTP- (N4) -C6-0NH2) , dans les amplicons. Des réactions d'amplification sont menées en parallèle en présence d'un nucléotide marqué portant une fluorescéine, 1 'UTP- 12- fluorescéine (Boerhinger, ref 1 427 857.
Les nucleotides préfonctionnalisés 27a, 27b, 32, et à titre de comparaison, le nucléotide marqué de Boerhinger, ref 1 427 857, sont testés pour leur incorporation dans les produits de la réaction d'amplification TMA, selon les kits Gen-Probe amplified MTD2 (amplified Λyco-ac erium tuberculoεis direct test) . Cette réaction permet l'amplification d'un fragment de 136 bases de l'ARN 16S des mycobactéries . Elle utilise juatre activités enzymatiques (ARN polymérase ADN dépendante, ADN polymérase ADN dépendante, ADN polymérase ARN dépendante, et ribonucléaseH) et deux enzymes, la T7 ARN polymérase, et la transcriptase inverse AMV. Par des réactions récurrentes impliquant des étapes de transcription, de reverse transcription, et de digestion de l'ARN contenu dans les double brin ADN:ARN, qui ressemblent à un cycle de réplication des virus à ARN, cette réaction permet l'amplification spécifique d'une séquence d'acide nucléique reconnue par deux amorces (une amorce simple et une amorce contenant le promoteur de la T7 ARN polymérase) . Le facteur d'amplification est très important (10 ) et la sensibilité très bonne (1 à 10 copies) . Les produits obtenus sont pour 90% des ARN simple brin, et pour 10% des ADN double brin.
On réalise les réactions d'amplification à péirtir de
10 copies d'ARN 16S de Mycobacter iu tuberculosis . Cet ARN cible est préalablement obtenu et quantifié selon la méthode suivante: le gène de l'ARN 16S est clone dans un p asmide, sous le contrôle d'un promoteur. Par transcription m vi tro, on obtient l'ARN 16S. Celui ci est purifié par extraction au phénol -chloroforme, et filtration sur microcon 30 (Amicon) .
11 est dosé par son absorption à 260 nm
Les réactions TMA classiques contiennent 4 mM de chacun des rNTP naturels (ATP, CTP, GTP et UTP) . Pour l'incorporation des nucleotides préfonctionnalisés dans les produits d'amplification, la réaction est effectuée en incluant un de ces nucleotides modifiés dans le tampon réactionnel. On étudie la réaction en présence de différents rapports de concentrations entre le nucléotide modifié et le nucléotide naturel, tout en gardant à 4 mM la concentration totale de chaque nucléotide de la même série, modifié ou naturel. Les rapports étudiés sont 0 %, 10 %, 30 %, 50 % et 70 % (sauf pour l'UTP-fluorescéine, pour lequel on n'a pas pu tester 70 %) . On effectue un contrôle négatif, consistant en une réaction comportant tous les réactifs, dont le plus haut rapport de nucleotides modifiés utilisé (70 ou 50 %) , sauf les enzymes (remplacées par le tampon de reprise des enzymes lyophilisées) .
Les réactions d'amplification sont analysées par électrophorèse de 5 μl de réaction sur gel de polyac trylamide dénaturant (6% acrylamide, 7M urée, IX TBE, appareil d' électrophorèse bioRad, 170 volts, 45 minutes) et coloration au bromure d'ethidium, puis par Northern. Les acides nucléiques sont transférés sur membrane (Nylon N, appareil de transfert semi-sec de bioRad, 0,5 X TBE, 25V, 15 minutes) et hybrides avec des sondes nucléiques spécifiques de Myco acté ium tuberculosis -.
(séquence : 5 ' -CGGGATGCATGTCTTGTGGT)
marquées à la péroxydase (préincubation à 37°C durant 30 minutes en PEG, puis incubation à 37°C durant Iheure en présence de PEG contenant 0,1 ng/μl de sonde péroxydase) . La révélation est colorimétrique (substrat Diaminobenzidine, Sigma) .
Pour les réactions contenant le nucléotide fluorescent (UTP-12-fluorescéine) , on visualise aussi les produits d'amplification sur gel avant coloration au bromure d'ethidium par excitation de la fluorescéine sur une table ultraviolet .
Pour toutes les réactions, y compris celles incluant les nucleotides préfonctionnalisés, on visualise après coloration au bromure d'ethidium les produits d'amplification attendus, en grande quantité. Après Northern, ces produits s'hybrident avec la sonde spécifique.
EXEMPLE 23 : Analyse des rendements d'incorporation dans les produits d'amplification TMA.
Pour évaluer la préfonctionnalisation des amplicons obtenus en présence des nucleotides préfonctionnalisés 27a (CTP- (N4) -C602-NH2) , 27b (CTP- (N4 ) -C4-NH2) , et à titre de comparaison, du nucléotide marqué UTP- 12 -fluorescéine
(Boerhinger, ref 1 427 857) , on détermine le rapport entre le nucléotide préfonctionnalisé incorporé, et le nucléotide naturel analogue .
Les produits d'amplification obtenus lors de la réalisation de l'exemple 22 sont séparés des nucleotides en excès dans la réaction par filtration sur Microcon 30 ™ (de chez Amicon), et repris dans 50 μl d'eau. Pour l'amplification en présence d'UTP-12-fluorescéine, la purification est effectuée sur sephadex G50 (absorption de la fluorescéine sur Microcon) .
Ils sont ensuite dosés pour leur absorption à 260 nm (le contrôle sans enzyme doit avoir une concentration très faible) .
Pour les réactions d'amplification incluant les nucleotides préfonctionalisés (et leurs contrôles) , on procède ensuite à une étape de digestion des acides nucléiques jusqu'au stade nucléoside :
5 1014 copies de produits d'amplification (environ 35 μg) sont dilués dans un volume final de 86 μl d'eau (pour le contrôle sans enzyme, un volume égal au volume d'échantillon le plus important est utilisé) . On rajoute 10 μl de tampon 10X pour la nucléase PI (tampon CH3COONa pH 5,3, 300mM, 1 mM
ZnS04) et 4 μl de nucléase PI (Boerhinger, ref 236225, lμg/μl, 0,3u/μl). La réaction est incubée à 37 °C durant 30 minutes.
On ajoute ensuite 12 μl de tampon 10X pour la phosphatase alcaline (Boerhinger, ref 1246283) et 1 μl de phosphatase alcaline (Boerhinger, ref 713023, lU/μl), et l'incubation à
37°C est continuée durant 15 minutes. La réaction est arrêtée dans la glace. La composition en nucléosides est alors déterminée par analyse sur chromatographie liquide haute pression (HPLC, Beckman, système Gold) , et par comparaison à des standards nucléosides (injection de 50 ng de chaque nucléoside) . On injecte 20 μl de la digestion sur colonne C18 (Ultrasphere) , chauffée à 45°C. La séparation est effectuée en tampon sodium phosphate 50 mM pH 7, comportant un gradient de methanol (au bout de 10 minutes, passage en 15 minutes de 0% à 30% de methanol à 95%) . Les pics sont visualisés par absorption à 254 nm, et les aires des pics sont calculées par intégration.
Le rapport entre l'aire du pic du nucléotide préfonctionnalisé, et celui de son analogue naturel permet de déterminer le rendement d'incorporation, c'est à dire le rapport entre la quantité de nucléotide préfonctionnalisé incorporé et la quantité totale de nucléotide de la même série incorporée .
Le contrôle sans enzyme ne doit pas donner lieu à l'apparition de pic. Ce contrôle témoigne de la bonne efficacité de l'étape d'élimination des nucleotides en excès.
Pour les réactions d'amplification incluant l'UTP- fluorescéine, la quantité de nucléotide fluorescéine incorporé est mesurée par l'intensité de fluorescence : la lecture de l'intensité de fluorescence d'une gamme étalon de fluorescéine est effectuée sur un spectrofluorimètre Perkin LS 50. L'intensité de fluorescence des différentes réactions d'amplification est mesurée. Par comparaison avec la courbe d'étalonnage, on détermine la quantité de fluorescéine incorporée. On calcule le rendement d'incorporation par rapport à la concentration en amplicons mesurée par absorption à 260 nm. L'analyse HPLC permet de séparer les huit nucléosides naturels, ainsi que les trois nucléosides analogues aux trois nucleotides préfonctionnalisés testés.
Les résultats, présentés dans le tableau ci -dessous montrent que tous les nucleotides CTP préfonctionnalisés étudiés ont un meilleur rendement d'incorporation dans les produits d'amplification TMA que 1 'UTP-12-fluorescéine, nucléotide marqué classiquement utilisé.
% [nucl.préfonctionnalisé] / 70 50 30 10 0
[nue1. na ure1]
27a (CTP- (N4) -C602-NH2) /CTP naturel 1/3 1/5 1/9 1/33 0
27b (CTP- (N4) -C4-NH2) /CTP naturel 1/6 1/15 1/48 ND 0
Boerhinger, ref 1 427 857 ND 1/30 1/45 1/200 0
(UTP-12-fluorescéine) / CTP naturel
ND : non déterminé. Nucl. : nucléotide
Ces résultats montrent que la préfonctionnalisation du nucléotide CTP permet une meilleure incorporation que le marquage avec une fluorescéine. La très bonne préfonctionnalisation des amplicons permet d'obtenir, après fonctionnalisation, un marquage plus intense qu' vec le nucléotide fluorescéine.
De même, d'autres fonctions réactives intoduites sur la position N4 de la cytidine, telle que la fonction oxyamine du nucléotide 32, permettent un meilleur rendement d ' incorporation . EXEMPLE 24 : Analyse de 1 ' impact de 1 ' incorporation des nucleotides préfonctionnalisés sur la sensibilité TMA.
Pour étudier la sensibilité de la TMA incluant l'incorporation de nucleotides préfonctionnalisés, on a effectué la TMA à partir de quantités décroissantes de cible
(ARN 16 S de Mycobacteriu tuberculosi s , décrit dans l'exemple
22) (10 000, 1 000, 100, 10 et 0 copies), en présence de différents rapports entre le nucléotide préfonctionnalisé et son analogue naturel (100%, 70%, 50% 30% 10% 0%) . Les mêmes nucleotides préfonctionnalisés sont testés, 27a (CTP-(N4)-
C602-NH2) , 27b (CTP- (N4) -C4-NH2) .
Les produits réactionnels sont étudiés entre autre par la méthode décrite dans l'exemple 22.
Les produits réactionnels sont aussi analysés de façon se i -quantitative par ELOSA (PCT WO 92/19812) , et comparaison de l'intensité des signaux avec ceux de gammes étalons .
Les réactions effectuées en présence de nucléotide (s) préfonctionnalisé (s) sont analysés par électrophorèse et coloration, Northern, et ELOSA. Les résultats obtenus en ELOSA, qui sont représentatifs des différentes méthodes analytiques utilisées, sont représentés aux figures 4 et 5. Quelque soit le nucléotide préfonctionnalisé utilisé (27a, 27b) on peut déterminer une concentration en nucléotide (s) préfonctionnalisé (s) telle que la sensibilité de la réaction TMA ne soit pas affectée de manière significative, même avec un très faible nombre de copies de cible initiale. Comme cela ressort plus spécifiquement de la figure 5 annexée le nucléotide 27b peut remplacer le nucléotide naturel .
EXEMPLE 25 : Marquage des amplicons préfonctionnalisés :
Les amplicons préfonctionnalisés obtenus par la méthode utilisée lors de la réalisation de l'exemple 22 , en présence du nucléotide préfonctionalisé, 27b (CTP- (N4) -C4- NH2) , sont marqués par une réaction chimique de couplage entre la fonction nucléophile portée par les amplicons et amenée par les nucleotides préfonctionnalisés incorporés, et une fonction anti -réactive électrophile préalablement couplée à la fluorescéine. Le martquage ainsi obtenu est comparé à celui obtenu en présence du nucléotide marqué UTP-12 -fluorescéine (Boerhinger, ref 1 427 857) .
Les amplicons sont obtenus par la méthode décrite dans l'exemple 22 à partir de 10^ copies de cible ARN 16Ξ de Mycobac er iu tuberculosis, et en présence de 50% de nucléotide préfonctionalisé 27b.
Les amplicons obtenus sont couplés à la fluorescéine-NHS (Boerhinger 8370042128) , selon la méthode suivante : 30 μl de produits d'amplification TMA sont mélangés avec 30 μl de tampon carbonate 0,2M, NaCl 0,15 M, à pH8,8, et 40 μl (environ 200 équivalents) de fluorescéine NHS (3,5 mg/ml en DMSO) . Après agitation durant une heure à température ambiante, le marquage est analysé.
Les amplicons marqués (15 μl ) sont analysés par électrophorèse sur gel comme décrit dans l'exemple 22, et visualisés sous ultraviolet, avant et après coloration au bromure d'ethidium. Les profils sont comparés avec ceux obtenus par marquage en présence de 50 % d'UTP-12- fluorescéine .
Les signaux obtenus sans coloration sont plus intenses que ceux obtenus par marquage direct à la fluorescéine. En utilisant la fonction oxyamine telle que portée par le nucléotide 32, un résultat aussi bon sera possible après couplage avec le fluorophore 36. La réactivité du couple oxyamine aldéhyde permet des temps de couplage réduits comme montré dans l'exemple 20.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Procédé d'amplification d'une séquence d'un acide nucléique cible, selon lequel : - on dispose au moins : de la séquence d'un acide nucléique cible, d'au moins une amorce oligonucléotidique spécifique de la séquence cible, d'une ou plusieurs activités enzymatiques, de nucleotides,
- on amplifie, dans des conditions adaptées notamment à l'activité ou les activités enzymatiques, la séquence cible, caractérisé en ce qu'au moins un des nucleotides est un nucléotide prefonctionnalisé, différant des autres nucleotides au moins par la présence d'au moins une fonction réactive de covalence, non protégée, disposée en au moins un site prédéterminé de la base dudit nucléotide, et en ce «qu'on obtient un produit d'amplification prefonctionnalisé comprenant au moins undit nucléotide préfonctionnalisé.
2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'en outre : - on dispose d'un réactif comprenant une fonction anti-réactive de covalence, spécifique de la fonction réactive du nucléotide préfonctionnalisé, et un groupement fonctionnel, et
- on fait réagir., directement- ou indirectement, le produit d'amplification préfonctionnalisé, avec le réactif, pour obtenir un produit d'amplification fonctionnalisé.
3/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fonction réactive de covalence du nucléotide préfonctionnalisé est une fonction chimique organique électrophile ou nucléophile.
4/ Procédé selon la revendication 2 et 3 , caractérisé en ce que la fonction anti-réactive du réactif est choisie parmi (i) les fonctions chimiques organiques nucléophiles si la fonction réactive de covalence du nucléotide préfonctionnalisé est une fonction électrophile, et (ii) les ..onctions chimiques
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP organiques électrophiles si la fonction réactive de covalence du nucléotide préfonctionnalisé est une fonction nucléophile.
5/ Procédé selon la revendication 3 ou 4 , caractérisé en ce que la fonction chimique organique électrophile est choisie parmi les fonctions aldéhyde, ester activé, acide carboxylique, isothiocyanate, dérivés haloacyles et chlorure de suifonyle .
6/ Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que la fonction chimique organique nucléophile est choisie parmi les fonctions amine, thiol , oxyamine, alkoxyamine, hydrazine et hydrazide.
7/ Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la fonction réactive de covalence est la fonction méthoxyamine . 8/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la fonction réactive de covalence du nucléotide modifié est greffée sur la base par l'intermédiaire d'un bras de couplage.
9/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que la fonction anti -réactive de covalence du réactif est greffée sur le groupement fonctionnel par l'intermédiaire d'un bras de couplage.
10/ Procédé selon la revendication 8 et/ou 9, caractérisé en ce que le bras de couplage est choisi parmi les chaînes hydrocarbonées, saturées ou insaturées, éventuellement interrompues par des fonctions amine, amide et oxy.
11/ Procédé selon la revendication 7 ou 9, caractérisé en ce que la fonction anti -réactive de covalence du réactif est la fonction aldéhyde, et cette dernière est liée à un groupement fonctionnel de marquage tel qu'un groupement fluorescent ou luminescent .
12/ Procédé selon les revendications 9 et 11 , caractérisé en ce la fonction aldéhyde est liée au groupement fonctionnel par le bras de couplage -NH-CS-NH- (CH2) 3 - et en ce que le groupement fonctionnel du réactif est la fluorescéine.
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISAEP 13/ Procédé selon l'une (quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le produit d'amplification fonctionnalisé marqué, est détecté qualitativement et/ou quantitativement en phase homogène ou hétérogène. 14/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique cible est une séquence d'ADN ou d'ARN et en ce que les activités enzymatiques comprennent les activités ADN polymérase ARN- et/ou ADN-dépendantes . 15/ Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que les activités enzymatiques comprennent en outre l'activité ribonucléase H et l'activité ARN polymérase ADN- dépendante, et en ce qu'on amplifie selon une suite de réactions de transcription inverse, de transcription et de digestion. 16/ Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que les activités enzymatiques ribonucléase H et ADN polymérase sont apportées par une seule enzyme.
17/ Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que les activités enzymatiques ribonucléase" H et ADN polymérase sont apportées chacune par une enzyme différente.
18/ Analogue de nucléotide, préfonctionnalisé susceptible d'être soumis à un traitement enzymatique, répondant à la formule générale (I)
Figure imgf000058_0001
dans laquelle
B représente une base nucléique, Z représente un bras de couplage, n est un entier égal à 0 ou 1 ,
X représente une fonction réactive de covalence fixée sur au moins un site de la base nucléique B,
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP R1 représente H ou OH,
R2 représente H, OH, un groupement mono-, di- ou triphosphate ou un groupement protecteur,
R3 représente H, un groupement protecteur, ou un groupement mono-, di- ou tri-phosphate .
19/ Analogue de nucléotide selon la revendication 18, caractérisé en ce que R→^→ et R2 représentent indépendamment l'un de l'autre chacun H ou OH, et R3 représente un groupement mono-, di- ou tri -phosphate . 20/ Nucléotide préfonctionnalisé susceptible d'être soumis à un traitement enzymatique, dont la base nucléique est dérivée de la cytosine et comporte, au moins sur la - fonction aminée en position 4 du cycle pyrimidique, au moins une fonction réactive de covalence nucléophile, non protégée, et n'influençant pas, de manière significative, le traitement enzymatique dudit nucléotide, caractérisé en ce que la fonction réactive de covalence est choisie parmi les fonctions NH2 O-
NH2, SH, hydrazine et hydrazide-
21/ Nucléotide selon la revendication 20, caractérisé en ce que la fonction réactive de covalence est liée à ladite fonction aminée en position 4 du cycle pyrimidique par l'intermédiaire d'un bras de couplage choisi parmi (-CH2-)n1, (-
0-CH2-)n3_ dans lecjuel n-^ est un entier compris entre 1 et 12 ; ( -CH2 -0-CH2 - ) n2 , ( -CH2-CH2 -0-CH2 -CH2 - ) 2 , ( -CH2 -CH2 -0-CH2 -CH2-0- CH2-CH2-)n , ( -CH2-0-CH2-CH2- ) n , dans leejuel n2 est Un entier compris entre 1 et 6 ; et NH—CH2-0-CH2-CH2.
22/ Nucléotide selon la revendication 21, caractérisé en ce que le bras de couplage est choisi parmi -CH2-, -CH -CH2-
, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2 -CH2-CH2 -CH2 -CH2 , - CH2-CH2-0-CH2-CH2-, -CH2-CH2 -0-CH2 -CH2 -0-CH2 -CH2 - , et NH--CH2-0-
CH2-CH2.
23/ Nucléotide préfonctionnalisé susceptible d'être soumis à un traitement enzymatique, dont la base est dérivée de l'uracile et comporte au moins sur la position 5 du cycle pyrimidique, au moins une fonction réactive de covalence nucléophile, non protégée, et n'influençant pas, de manière
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP significative, le traitement enzymatique, caractérisé en ce que la fonction réactive de covalence est choisie parmi les fonctions -NH2, -0-NH2, SH, hydrazine et hydrazide-
24/ Nucléotide selon la revendication 23, caractérisé en ce que la fonction réactive de covalence est liée à la position 5 du cycle pyrimidique par l'intermédiaire d'un bras de couplage choisi parmi -C≡.C-CH2-, -C=C-CH2 -NH-C0-CH - , -CH=CH- CH2- et -CH=CH-CH2-NH-CO-CH2-.
25/ Nucléotide préfonctionnalisé susceptible d'être soumis à un traitement enzymatique, dont la base est dérivée de l'adénine et comporte au moins sur la fonction aminée en position 6 du cycle pyrimidique, au moins une fonction réactive de covalence nucléophile, non protégée, et n'influençant pas, de manière significative, le traitement enzymatique, caractérisé en ce que la fonction réactive de covalence est choisie parmi les fonctions NH2/ CH2-0-NH2f SH/ hydrazine et hydrazide-
26/ Nucléotide selon la revendication 25, caractérisé en ce que la fonction réactive de covalence est liée à ladite fonction aminée en position 6 du cycle pyrimidique par l'intermédiaire d'un bras de couplage choisi parmi (-CH2*-)n1, (- 0-CH2~)n1 dans lequel nx est un entier compris entre 1 et 12 ; (-CH2-0-CH2-)n2, (-CH2-CH2-0-CH2-CH2-)n2, (-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0- CH2-CH2-)n2, (-CH2*-0-CH2-CH2-)n2 , dans lequel n2 est un entier compris entre 1 et 6 ; et NH--CH2-0-CH2-CH2. 27/ Nucléotide selon la revendication 26, dans lequel le bras de couplage est choisi parmi -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH -
CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2f -CH2-CH2-0- CH2-CH2-, -CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-, et NH—CH2 -0-CH2-CH2 •
28/ Utilisation d ' un nucléotide selon l ' une quelconque des revendications 12 à 27 , dans un traitement enzymatique d ' amplif ication .
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP
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