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WO1998003869A1 - Methodes de diagnostic in vitro de maladies neurodegeneratives et trousses pour la mise en oeuvre de ces methodes - Google Patents

Methodes de diagnostic in vitro de maladies neurodegeneratives et trousses pour la mise en oeuvre de ces methodes Download PDF

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WO1998003869A1
WO1998003869A1 PCT/FR1997/001333 FR9701333W WO9803869A1 WO 1998003869 A1 WO1998003869 A1 WO 1998003869A1 FR 9701333 W FR9701333 W FR 9701333W WO 9803869 A1 WO9803869 A1 WO 9803869A1
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Denis Barritault
Marie-Claude Tournaire
Michel Troupel
Claire Banissi
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Valbiofrance
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders

Definitions

  • the present invention relates to new methods of in vitro diagnosis of human or animal neurodegenerative diseases, as well as kits (or kits) for the implementation of these methods.
  • the peak is found in the urine of certain demented subjects of the Alzheimer type (12 positive cases, 5 “doubtful” cases, 13 negative cases) and mixed dementia (1 positive case, 2 “doubtful” cases, 2 negative cases) and in two cases of Creutzfeldt-Jakob.
  • the peak has never been demonstrated in the urine from subjects with pure vascular dementia (13 negative cases).
  • it was found in the urine of one of the 38 non-demented subjects (1 positive case, 37 negative cases).
  • the monitoring over time of certain subjects suffering from dementia of the Alzheimer type has made it possible to show that the expression of this peak is subject to strong variations so that this peak is not permanently detectable in the urine of sick subjects .
  • the present invention aims to provide reliable methods of in vitro diagnosis of human or animal neurodegenerative diseases.
  • the object of the invention is more specifically to provide in vitro diagnostic methods, making it possible to confirm that a man or an animal is or is not suffering from a declared neurodegenerative disease, in particular in the case where the clinical signs observed in this man or this animal may leave a doubt as to the diagnosis of this disease.
  • Another object of the present invention is to provide in vitro diagnostic methods making it possible to detect that a man or an animal suffers or not from a neurodegenerative disease which is not yet declared, that is to say whose clinical signs are not yet apparent.
  • Another object of the present invention is to provide in vitro diagnostic methods making it possible to distinguish unambiguously within a herd of animals, those of animals suffering from a neurodegenerative disease (in particular of a spongiform encephalopathy) declared or no, of those not affected by such a disease, only the latter then being likely to be sent to a slaughterhouse for obtaining meat intended for food.
  • kits for the implementation of these in vitro diagnostic methods.
  • the present invention follows from the discovery made by the inventors, that the aforementioned peak, appearing on the voltammograms measured from the urine of men or animals suffering from declared neurodegenerative diseases, corresponds to the presence in these urines of a marker corresponding to a derivative comprising an indole or oxindole ring, in particular to a derivative corresponding to the general formula (I) indicated below, and more particularly to a derivative of formula (Ib2) corresponding to the oxidized form of the tautomeric form of formula (Ib indicated below.
  • FIG. 1 separation profile of samples by cyclic voltammetry of urine from healthy ewes (Figure la), scrapie ewes (Figure lb), cows with BSE ( Figure le), humans healthy elderly people (figure 1d), and humans suffering from senile dementia of the Alzheimer's type (figure le),
  • FIG. 9 ion chromatography of the abovementioned marker
  • FIG. 11 mass spectrum of the marker of formula (Ib2) mentioned above,
  • the subject of the invention is the use of any method of detection, and if necessary of assaying, of derivatives comprising an indole or oxindole ring, and more particularly of at least one derivative among those corresponding to the general formula (I) next :
  • Rj represents a hydrogen atom, or a sulphate group SO3 " , or a group R a , R a representing a conjugated group (such as a carbohydrate or carbohydrate group), in particular a glucuronide, a glucose, a deoxyribose, or a fructose,
  • R2 represents a hydrogen atom or a group R a as defined above
  • the invention relates more particularly to the abovementioned use of any detection device, and where appropriate of assay, of at least one derivative of formula (Ib) as defined above, in reduced form (Ib 1), in oxidized form (lb2)
  • the subject of the invention is also any method of in vitro diagnosis of neurodegenerative diseases as defined above, characterized in that it comprises a step of detection, and if necessary of assay, in a suitable human or animal biological sample at least one derivative comprising an indole or oxindole ring, and more particularly at least one derivative among those corresponding to the general formula (I) mentioned above.
  • the invention also relates to any method of in vitro diagnosis as defined above, comprising a step of detection, and if necessary of assay, of at least one derivative of formula (Ib) as defined above, under reduced form (Ibl), or in oxidized form (Ib2).
  • the subject of the invention is more particularly the application of the abovementioned methods to the in vitro diagnosis of the following pathologies Alzheimer type dementia in humans, mixed dementia in humans, Pick's disease in humans, human spongiform encephalopathies, especially sickness
  • the invention relates more particularly to the application of the abovementioned methods to the in vitro diagnosis of neurodegenerative diseases defined above, the clinical signs of which are already apparent in humans or animals, these methods making it possible in particular to follow the evolution of the sickness
  • the diagnostic methods of the invention allow the screening of these neurodegenerative diseases in apparently carriers healthy, in which the characteristic clinical signs of these diseases are not yet apparent
  • the biological sample used in the context of the implementation of the diagnostic methods of the invention is preferably urine, or blood, or other biological fluids, such as cerebrospinal fluid (CSF)
  • CSF cerebrospinal fluid
  • the above-mentioned diagnostic methods comprise a step, physical or biological separation of at least one derivative of formula (I) to be detected, in particular in its oxidized form, and more particularly the derivative of the formula (Ib2), of the other constituents of the biological sample, and if appropriate, of direct identification of the drift, in particular by HPLC, gas chromatography, or capillary electrophoresis,
  • a step of detecting the possible presence of said drift in this biological sample in particular using one (or more) react ⁇ f (s) brand (s)
  • a diagnostic method as described above by physical separation and direct identification of said drift is that carried out by implementing an HPLC method coupled with fluorescence detection.
  • Such a method can be carried out in particular according to the method described by Vohcer et al in the context of the detection of abnormal forms of 5-hydroxytryptophan and serotonin in CSF (Vohcer et al, Arch Neurol, 1985, vol 42, 1158-1161)
  • Another detection method which can be coupled with HPLC is that of electrochemistry (a Coulomet ⁇ c detection device such as an ESA 5100 makes it possible to carry out detection and quantitative measurement)
  • electrochemistry a Coulomet ⁇ c detection device such as an ESA 5100 makes it possible to carry out detection and quantitative measurement
  • the use of standard molecules produced in synthesis and corresponding to the formula to be detected will allow the measurements to be calibrated and the conditions for elution of the molecules described in the formulas la, Ib, and the, to be identified, in particular in the oxidized form tautomer Ib2.
  • Another measurement method consists in separating the molecules corresponding to the general formula on gas chromatography (depending on whether or not there is an OH group, sililation will be necessary). The samples will then be measured by mass spectrometry. It should be noted that the shape oxidized according to the formula Ib2 is detectable without prior sililation steps and that its mass is 147 or 148 (with two hydrogens or one hydrogen less than in the reduced form).
  • the above-mentioned diagnostic methods comprise a step of biological separation of the derivatives of formulas (I) which may be present in the biological sample, from the other constituents of this sample biological, in particular with the aid of antibodies directed against these derivatives of formula (I), in particular with the aid of antibodies directed against the derivative of formula (Ib2).
  • the invention more particularly relates to any in vitro diagnostic method as described above, and comprising the following steps:
  • the diagnostic methods of the invention are advantageously carried out according to the ELISA technique (Enzyme Linked
  • Immunosorbent Assay in which the anti-immunoglobulins used to reveal the complexes formed between the antibodies fixed on the solid support and the derivatives to be detected, are labeled by coupling to an enzyme itself capable of reacting specifically with a determined substrate.
  • an enzyme itself capable of reacting specifically with a determined substrate.
  • a subject of the invention is also the polyclonal or monoclonal antibodies directed against at least one derivative of formula (I) mentioned above, and more particularly against the derivative of formula (Ib2).
  • a more particular subject of the invention is polyclonal antibodies directed against one or more, or even all, of the derivatives of formula (I) mentioned above.
  • Such polyclonal antibodies can be obtained by immunization of an animal with one or more, or even all of the derivatives of formula (I), followed by the recovery of the antibodies produced by the immune system of said animal.
  • the invention also relates to the monoclonal antibodies directed against derivatives of the above-mentioned formula (I), and as produced by any hybridoma capable of being formed, by conventional methods, from the spleen cells of an animal, in particular of mice. or rat, immunized against one of the derivatives of formula (I) on the one hand, and cells of an appropriate myeloma on the other hand, and to be selected by its capacity to produce monoclonal antibodies recognizing the derivative of formula (I) above, initially used for the immunization of animals.
  • derivatives of formula (I) mentioned above used for obtaining the antibodies described above, these can be obtained either in purified form from an appropriate biological sample, in particular from blood, d urine or cerebrospinal fluid, taken from a man or animal suffering from a neurodegenerative disease, for example according to the purification process described below.
  • the oxidized form of these derivatives in the aforementioned reduced form can be obtained by oxidation of the reduced form in an electric field not exceeding a few volts.
  • the reduced derivative is introduced into a solution which may consist of a mixture of water and one or more organic solvents (for example an alcohol, an amide or a nitrile) and made conductive of the electric current by adding a support electrolyte such as a mineral acid (HC1, H2SO4 ...) or a salt of an alkali metal.
  • the electrochemical cell is, in a conventional manner and well known to those skilled in the art, consisting of two glass containers separated by an ion exchange membrane or any other device making it possible to avoid the diffusion of the reduced or oxidized derivative towards the negative electrode (cathode).
  • the electro-oxidation of the reduced derivative is brought about at an anode which may consist of solid carbon or of fiber or of an unassailable metal, for example platinum. Electrolysis is carried out by imposing, using an original potentiostat
  • the sulfoconjugation of the derivatives of formulas (la). (Ib) or (le) above, in which R ⁇ represents H, can be obtained using an enzymatic reaction using a sulfotransferase type M (EC 2.8.2.1) purified from rat liver or human platelets according to R. Sekura, 5 M. Duf el, W. Jakoby (Methods in Enzymology, Jakoby W, ed., Académie Press,
  • the derivatives of formula (I) used for obtaining the antibodies described above can advantageously be coupled to carrier molecules usually used for haptens, according to techniques known to those skilled in the art, in particular in position a or c on formula (I), in order to increase the immunogenic properties of said derivatives, and thus to increase the production of antibodies.
  • the subject of the invention is also any method of in vitro diagnosis of neurodegenerative diseases as defined above, characterized in that the detection, or even the assay, of the derivative (s) of formula (I) is carried out without prior separation of said derivative and of the other constituents of the biological sample, in particular by carrying out a colorimetric reaction between said derivative and a molecule or group of molecules reacting specifically with said derivative by causing the appearance of a specific coloration of this reaction , this coloration being either that of the products resulting from the reaction between said derivative and the aforementioned molecule or group of molecules, or that of a substrate transformed by reaction with one of the products of the aforementioned reaction.
  • the subject of the invention is also the use of polymers synthesized by methods of combinatorial chemistry (polypeptides,
  • Another assay method for establishing a diagnostic kit is advantageously developed from molds produced by impression or "imp ⁇ nting” techniques (K Mosbach and O Ramstrom, Biotechnology, 14, 163-169, 1996)
  • the subject of the invention is also any diagnostic method as described above, including a prior step of treatment of the biological sample, in particular by acid hydrolysis, for example using hydrochloric acid (pHl) during 2 hours at 80 ° C., in order to desulfate those of the derivatives of formula (I) in which Rj represents SO ⁇ likely to be present in the biological sample, to obtain that derivatives of formula (I) in which R] repiescnte H in said sample, this step being followed by a step of detecting, or even assaying, the derivatives of formula (I) in which R ⁇ represents
  • kits for implementing one of the diagnostic methods of the invention
  • kits of the invention comprise
  • this marker excreted in the urine is common to human degenerative dementias (dementia of the Alzheimer type, mixed dementia and Pick disease) and human spongiform encephalopathies (Creutzfeldt-Jakob disease) and animal (scrapie and bovine spongiform encephalopathy).
  • the purification of the marker was carried out by usual methods such as: extraction, dialysis, chromatography on an ion exchange column, etc.
  • the characterization of the marker in its reduced form was carried out by standard analytical techniques: U .V spectroscopy. , ion chromatography, mass spectrometry, 1 H NMR.
  • the marker in its reduced form is identified by comparison with molecules synthesized as being a sulfated derivative of oxindole.
  • a voltammetric tracing is carried out in order to verify the presence in sufficient quantity of the marker.
  • Dialysis is carried out from the aqueous phase obtained after extraction of the neutral compounds with ethyl acetate.
  • the aqueous phase is evaporated under vacuum using a rotary evaporator at a temperature below 40 ° C after the fold has been brought to 5-6 by addition of sodium hydroxide in order to avoid degradation of the marker by acid hydrolysis. .
  • the residue is then taken up in HC1 10 ⁇ -> N and then subjected to a cross dialysis which is carried out using a conditioned anion exchange membrane (brand RAI model R n c 1030) in a glass dialysis cell specially made.
  • Dialysis is carried out for 24 to 48 hours with magnetic stirring in a cold room at 4 ° C. An aliquot of the concentration compartment is taken in order to check by voltammetry the presence of the marker. At the same time, a UV spectrum of the mixture is produced.
  • the dialysate is evaporated to dryness under vacuum, taken up in absolute ethanol, then filtered in order to remove the salts. After evaporation of the ethanol, the residue is dissolved in a minimum volume of 10 " 3 N HCl before being injected onto an open column of anion exchange poly ethylene imine cellulose (PEI).
  • PEI poly ethylene imine cellulose
  • the various anionic constituents are separated in a cold room with an NaCl gradient. Partially purified fractions are then obtained which show the characteristics of the marker in electrochemistry.
  • PEI anion exchange poly ethylene imine cellulose
  • the sample containing the marker is applied to the column with a flow rate of 1 ml / minute and the elution obtained and the position of the marker are presented in Figures 4 and 5.
  • the marker being negatively charged at pH 1, the inventors assumed that it was a compound excreted in the urine in form condensed with the sulfate ion (derivative "sulfo-conjugate"). In order to test this hypothesis, a small quantity of the purified product was subjected to acid hydrolysis at 80 ° C for 2 hours (this hydrolysis can be obtained by adding HCl so that the pH is
  • the fractions containing the marker are evaporated to dryness and taken up in a small volume of HCl 10 ⁇ 3 N before being deposited on cellulose plates for thin layer chromatography (Merck supplier).
  • the migration solvent is an 8: 2: 2 butanol / acetic acid / water mixture.
  • the different separated products are identified under UV light and detached with the adsorbent layer.
  • the cellulose-bound products are taken up in H2O and the cellulose is removed by centrifugation.
  • An electrochemical control is then carried out in order to locate the marker.
  • the purification by CCM is renewed in order to to obtain a sufficient quantity of product to carry out analyzes by NMR and by mass spectroscopy (FIG. 10).
  • These analyzes lead us to the sulfated (diagram (a)) and desulfated (diagram (b)) structures to represent this marker.
  • diagram (b) 2 Examples of dosage of the Marker.
  • the cyclic electro-amperometry described above is one of these methods which makes it possible to carry out a quantitative assay.
  • the marker can be dosed in its natural sulfated form or after desulfation. Desulfation can be obtained as before by acid hydrolysis.
  • HPLC high performance chromatography
  • ion exchanger like the one described above for the purification of the marker
  • electrophoresis capillary can be used.
  • Detection of the marker can be based on UV absorption, fluorescence, electrochemistry, mass spectrometry etc. , and the quantification by integration of the surfaces of the corresponding peaks and their comparison with that of two peaks obtained with known doses of the marker.
  • Another way of carrying out the assay is the implementation of a technique which calls for recognition by antibodies.
  • Obtaining poly or monoclonal antibodies and the assay is carried out according to conventional protocols for those skilled in the art and described for example for the assay of melatonin by Shang-Mian Yie,
  • the assays are carried out for example with the measurement of a radioactivity or an enzymatic or colorimetric reaction etc.
  • the protocol is as follows: 1 volume of plasma
  • the 100 ⁇ l sample is directly injected on HPLC.
  • a 1 ml sample of urine acidified to pH1 with hydrochloric acid is subjected to an oxidation-reduction by passing an electric current with cyclic scanning.
  • the redox potentials are noted on the abscissa (in mVolts) measured with respect to the normal hydrogen electrode. On the ordinate, the intensity of the current is measured in milliamps.
  • the cyclic voltammetry is a system with three electrodes, one in platinum, one with hydrogen and one working with graphite powder. We can note the characteristic peak of the marker at 850 mv indicated by the arrow.
  • FIG. 1 Electrovoltamperogram of sheep urine with scrapie after treatment of urine with a volume of ethyl acetate, centrifugation and recovery of the aqueous phase.
  • Electrovoltamperogram of the urine sample after extraction with ethyl acetate and membrane dialysis Electrovoltamperogram of the urine sample after extraction with ethyl acetate and membrane dialysis.
  • Electrovoltamperogram of the urine sample after purification by an anionic column (polyethylene imine) corresponding to fraction No. 70 of elution of this column by an NaCl gradient (0 and 1 M).
  • Electrovoltamperogram of the urine sample after purification by an anionic column (polyethylene imine) corresponding to fraction No. 95 of elution of this column by a NaCl gradient (0 and 1 M).
  • sample 88 had been hydrolyzed by HCl about 2 hours at 80 ° C. It can be noted that the peak at 249 nm is now at 254.6 nm.
  • the samples corresponding to the fractionations enriched in markers after chromatography on a PEI column are separated by thin layer chromatography on cellulose.
  • the area indicated by an arrow corresponds to the marker. This area is removed from the plate and the marker eluted on cellulose gel in water, centrifuged and subjected to voltammetric analyzes.
  • Mass spectrum of the marker in its reduced form was measured by two techniques. The electronic impact
  • a main peak appears at a mass of 149 in FIG. 11a corresponding to the molecular mass of the marker, the minor peaks corresponding to contaminants or degradation products.
  • the spectrum after chemical ionization with ammonia shows a peak with a mass of 150, corresponding to the mass of the marker increased by that of hydrogen and a second peak at 167 corresponding to the mass of the marker increased by 18 (that of NH4).
  • Electrovoltamperogram of the synthesized product of the oxindole form The peak can be noted at 850 mV (and at 960 mV in oxidation at the second dotted scan)
  • Electrovoltampérogramme of the product synthesizes oxindole and sulfated by enzymatic way

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Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation de tout procédé de détection, et le cas échéant de dosage, de dérivés comportant un noyau indole ou oxindole, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de pathologies neurodégénératives humaines ou animales. L'invention concerne également les méthodes de diagnostic in vitro susmentionnées, ainsi que les trousses pour la mise en oeuvre de telles méthodes.

Description

METHODES DE DIAGNOSTIC IN VITRO DE MALADIES NEURODEGENERATIVES ET TROUSSES POUR LA MISE EN OEUVRE DE CES METHODES.
La présente invention a pour objet de nouvelles méthodes de diagnostic in vitro de maladies neurodégénératives humaines ou animales, ainsi que des trousses (ou kits) pour la mise en oeuvre de ces méthodes.
A partir de 1988, une technique de voltamétrie cyclique a permis de mettre en évidence sur les voltamogrammes urinaires obtenus, un pic (à 850 mV, visible pendant le cycle de réduction) commun aux démences dégénératives humaines
(démence de type Alzheimer, démence mixte et maladie de Pick) et aux encéphalopathies spongiformes humaines (maladie de Creutzfeldt-Jakob) et animales (tremblante du mouton ou scrapie et encéphalopathie spongiforme bovine). Les études réalisées par les inventeurs chez l'homme ont porté sur 88 sujets âgés répartis en cinq groupes : témoins non déments (n = 38), démences de type Alzheimer (n = 30), démences d'origine vasculaire (n **= 13), démences mixtes (π= 5), Creutzfeldt-Jakob (n=2). Le pic est retrouvé dans les urines de certains sujets déments de type Alzheimer (12 cas positifs, 5 cas "douteux" , 13 cas négatifs) et déments mixtes (1 cas positif, 2 cas "douteux", 2 cas négatifs) et dans les deux cas de Creutzfeldt-Jakob. Le pic n'a jamais été mis en évidence dans les urines provenant de sujets atteints de démence de type vasculaire pure (13 cas négatifs). Il a en revanche été retrouvé dans les urines d'un des 38 sujets non déments (1 cas positif, 37 cas négatifs). Le suivi au cours du temps de certains sujets atteints de démence de type Alzheimer a permis de montrer que l'expression de ce pic est soumise à de fortes variations si bien que ce pic n'est pas détectable en permanence dans les urines des sujets malades. I_-e pourcentage de cas dépistés à partir d'une analyse unique n'est donc que de 40% (12 cas/30) pour les sujets atteints de démence de type Alzheimer, (Banissi-Sabourdy C. et al. - Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 1992, 28 : 127 - 147).
Les études réalisées par les inventeurs chez les ruminants ont porté sur 35 moutons (16 atteints de scrapie et 19 sains) et 110 vaches atteintes d' encéphalopathie spongiforme (ESB), chacun des diagnostics ayant été ultérieurement confirmé par anatomopathologie. Le pic a été retrouvé dans les urines de 87% (14 cas positifs/ 16) des moutons à tremblante et de 95% (104 cas positifs/110) des vaches atteintes d'ESB. Le pic n'a jamais été retrouvé dans les urines des animaux témoins (19 cas négatifs/19 moutons sains, 12 cas négatifs/12 vaches saines). (Brugère H. et al. - Bull. Acad. Vét. de France, 1991 , 64 : 139 - 145 ; Brugère H . et al. - Commission of the European Communities, Brussels, 14- 15 Sept. 1993).
Il peut être conclu des travaux suivants que l 'utilisation de la voltampérométrie cyclique permet de dépister à partir d'une analyse unique 81 % et 85 % des cas d' encéphalopathie spongiforme déclarée, (c'est-à-dire dont le diagnostic peut être effectué par les signes cliniques), respectivement chez le mouton et la vache. La différence entre ces deux pourcentages n'est pas significative (p > 0,8). Il s'agit en effet dans les deux cas de maladies d'étiologies similaires, évoluant toutes deux dans des délais comparables, en général de l 'ordre de 1 à 6 mois.
Les études réalisées chez l'homme ont montré qu'une analyse unique de l 'urine par voltampérométrie cyclique ne permettait de dépister que 40% des cas de démence déclarée de type Alzheimer. Ce pourcentage est très significativement différent (p < 0,005) de celui observé chez les ruminants atteints d 'encéphalopathies spongiformes. En effet, nous comparons alors deux maladies d 'étiologies différentes, évoluant dans des délais également différents (quelques mois pour les encéphalopathies spongiformes des ruminants contre plusieurs années pour la démence de type Alzheimer).
La présente invention a pour but de fournir des méthodes fiables de diagnostic in vitro des maladies neurodégénératives humaines ou animales.
L' invention a plus précisément pour but de fournir des méthodes de diagnostic in vitro, permettant de confirmer qu'un homme ou un animal est atteint ou non d'une maladie neurodégénérative déclarée, notamment dans le cas où les signes cliniques relevés chez cet homme ou cet animal peuvent laisser subsister un doute quant au diagnostic de cette maladie.
Un autre but de la présente invention est de fournir des méthodes de diagnostic in vitro permettant de déceler qu'un homme ou un animal est atteint ou non d'une maladie neurodégénérative qui n'est pas encore déclarée, c'est-à-dire dont les signes cliniques ne sont pas encore apparents. Un autre but de la présente invention est de fournir des méthodes de diagnostic in vitro permettant de distinguer sans ambiguïté au sein d'un troupeau d'animaux, ceux des animaux atteints d'une maladie neurodégénérative (notamment d'une encéphalopathie spongiforme) déclarée ou non, de ceux n'étant pas atteints par une telle maladie, seuls ces derniers étant alors susceptibles d'être dirigés vers un abattoir pour l 'obtention de viandes destinées à l'alimentation.
Un autre but de la présente invention est de fournir des trousses (ou kits) pour la mise en oeuvre de ces méthodes de diagnostic in vitro. La présente invention découle de la découverte faite par les inventeurs, que le pic susmentionné, apparaissant sur les voltamogrammes mesurés à partir d'urines d'hommes ou d'animaux atteints de maladies neurodégénératives déclarées, correspond à la présence dans ces urines, d'un marqueur correspondant à un dérivé comportant un noyau indole ou oxindole, notamment à un dérivé répondant à la formule générale (I) indiquée ci-après, et plus particulièrement à un dérivé de formule (Ib2) correspondant à la forme oxydée de la forme tautomère de formule (Ib indiquée ci-après.
L' invention sera illustrée à l'aide des figures suivantes :
- figure 1 : profil de séparation d'échantillons par voltampérométrie cyclique d'urine provenant de brebis saines (figure la), de brebis atteintes de tremblante (figure lb), de vaches atteintes de l'ESB (figure le), d'humains âgés sains (figure ld), et d'humains atteints de démence sénile de type Alzheimer (figure le),
- figures 2 à 4, 8 et 13 (a et b) : suivi par électro-voltampérogramme de l'extraction et de la purification du marqueur susmentionné à partir d'urine de mouton atteint de tremblante,
- figures 6 et 7 : spectres UV du marqueur susmentionné,
- figure 9 : chromatographie ionique du marqueur susmentionné,
- figure 10 : chromatographie couche mince sur plaque de cellulose du marqueur susmentionné,
- figure 11 : spectre de masse du marqueur de formule (Ib2) susmentionné,
- figure 12 : spectre de RMN de protons du marqueur de formule (Ib2) susmentionné.
L' invention a pour objet l'utilisation de tout procédé de détection, et le cas échéant de dosage, de dérivés comportant un noyau indole ou oxindole, et plus particulièrement d'au moins un dérivé parmi ceux répondant à la formule générale (I) suivante :
Figure imgf000005_0001
dans laquelle :
- Rj représente un atome d'hydrogène, ou un groupe sulfate SO3", ou un groupe Ra, Ra représentant un groupe conjugué (tel qu'un groupe carbohydrate ou glucidique), notamment un glucuronide, un glucose, un désoxyribose, ou un fructose,
- R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe Ra tel que défini ci- dessus,
- n - , n2, et n3, indépendamment l'un de l'autre, représentent zéro ou un, lesdits dérivés correspondant aux trois formes tautomères suivantes :
1 ) celle de formule (la) dans laquelle :
- la forme réduite correspond aux dérivés de formule (Ial) suivante :
Figure imgf000006_0001
dans laquelle R et R2 ont les significations indiquées ci-dessus,
- la forme oxydée correspond aux dérivés de formule (Ia2) suivante :
Figure imgf000006_0002
dans laquelle R\ a la signification indiquée ci-dessus,
2) celle de formule (Ib) dans laquelle :
- la forme réduite correspond aux dérivés de formule (Ibl) suivante
( I b 1 )
Figure imgf000006_0003
dans laquelle R\ a la signification indiquée ci-dessus,
- la forme oxydée correspond au dérivé de formule (Ib2) suivante
Figure imgf000007_0001
3) celle de formule (le) dans laquelle :
- la forme réduite correspond aux dérivés de formule (Ici ) suivante
Figure imgf000007_0002
dans laquelle R et R2 ont les significations indiquées ci-dessus, - la forme oxydée correspond aux dérivés de formule (Ic2) suivante
Figure imgf000007_0003
dans laquelle R2 a la signification indiquée ci-dessus,
pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de pathologies neurodegeneratives humaines ou animales, notamment des maladies dégénératives du système nerveux central, et plus particulièrement les démences dégénératives humaines, ou les encéphalopathies humaines et animales
Il est bien entendu que les pointillés représentés sur la formule générale (I) susmentionnée indiquent la présence possible de double liaisons entre les différents atomes constituant le cycle et/ou l'hétérocycle des composés de formule (I)
L' invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de tout pi ocede de détection, et le cas échéant de dosage, d 'au moins un dérivé de formule (Ib) telle que définie ci-dessus, sous forme réduite (Ib l ), au sous forme oxydée (lb2) L' invention a plus particulièrement pour objet l 'utilisation susmentionnée de tout procédé de détection, et le cas échéant de dosage, du dérivé de formule (Ibl ) dans laquelle RI = H, ou de sa forme oxydée correspondante de formule (Ib2)
L' invention a également pour objet toute méthode de diagnostic in vitro de maladies neurodegeneratives telles que définies ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de détection, et le cas échéant de dosage, dans un échantillon biologique humain ou animal approprié d'au moins un dérivé comportant un noyau indole ou oxindole, et plus particulièrement d'au moins un dérivé parmi ceux repondant à la formule générale (I) susmentionnée.
L' invention concerne également toute méthode de diagnostic in vitro telle que définie ci-dessus, comprenant une étape de détection, et le cas échéant de dosage, d 'au moins un dérivé de formule (Ib) telle que définie ci-dessus, sous forme réduite (Ibl), ou sous forme oxydée (Ib2).
L' invention concerne plus particulièrement toute méthode de diagnostic in vitro telle que définie ci-dessus, comprenant une étape de détection, et le cas échéant de dosage, du dérivé de formule (Ibl) dans laquelle Rj = H, ou de sa forme oxydée correspondante de formule (Ib2).
L' invention a plus particulièrement pour objet, l'application des méthodes susmentionnées au diagnostic in vitro des pathologies suivantes démence de type Alzheimer chez l 'homme, démence mixte chez l'homme, maladie de Pick chez l'homme, encéphalopathies spongiformes humaines, notamment maladie de
Creutzfeldt-Jakob, encéphalopathies spongiformes animales, notamment tremblante (ou scrapie) du mouton et encéphalopathie spongiforme bovine (E S B )
L'invention vise plus particulièrement l'application des méthodes susmentionnées au diagnostic m vitro des maladies neurodegeneratives définies ci- dessus dont les signes cliniques sont déjà apparents chez l'homme ou l'animal, ces méthodes permettant notamment de suivre l'évolution de la maladie
Avantageusement, les méthodes de diagnostic de l' invention permettent le dépistage de ces maladies neurodegeneratives chez des porteurs apparemment sains, chez lesquels les signes cliniques caractéristiques de ces maladies ne sont pas encoie apparents
L échantillon biologique utilisé dans le cadre de la mise en oeuvre des méthodes de diagnostic de l'invention, est de préférence l'urine, ou le sang, ou autres liquides biologiques, tels que le liquide céphalo-rachidien (LCR)
Selon un mode de réalisation préfère de l ' invention, les méthodes de diagnostic susmentionnées comprennent une étape de séparation, physique ou biologique d'au moins un dérive de formule (I) a détecter, notamment sous sa forme oxydée, et plus particulièrement le dérive de lormule (Ib2), des autres constituants de l'échantillon biologique, et le cas échéant, d' identification directe du dérive, notamment par HPLC, chromatographie gazeuse, ou electrophorese capillaire,
- le cas échéant, une étape de détection de la présence éventuelle dudit dérive dans cet échantillon biologique, notamment à l'aide d'un (ou plusieurs) reactιf(s) marque(s)
Une méthode de diagnostic telle que décrite ci-dessus par séparation physique et identification directe dudit dérive, particulièrement préférée est celle effectuée pai mise en oeuvre d'un procédé HPLC couplé a une détection par fluorescence Un tel procédé peut être effectue notamment selon la méthode décrite par Vohcer et al dans le cadre de la détection des formes anormales de 5-hydroxytryptophane et de serotonine dans le LCR (Vohcer et al , Arch Neurol , 1985, vol 42, 1158- 1161)
Une autre méthode de détection qui peut être couplée a l'HPLC est celle de l 'électrochimie (un appareil de détection Coulometπc comme un ESA 5100 permet de réaliser une détection et une mesure quantitative) Avantageusement, l'utilisation de molécules standard réalisées en synthèse et correspondant a la formule à détecter, permettront d'étalonner les mesures et de repérer les conditions d'élution des molécules décrites dans les formules la, Ib, et le, notamment dans la forme oxydée tautomère Ib2. La détection de cette dernière forme nécessitera un premiei cycle d'oxydation, sans effet sur cette molécule, suivi d'une réduction permettant de détecter un signal correspondant a celui décrit a 850 V dans la technique d'électrovoltampérométπe cyclique (voir la figure 1) Le marqueur sera ensuite avantageusement détecte lors d'un deuxième cycle d'oxydation
Une autre méthode de mesure consiste à séparer sur chromatographie gazeuse les molécules correspondant à la formule générale (selon l'existence ou non de groupement OH, une sililation sera nécessaire) Les échantillons seront ensuite mesurés par spectrometπe de masse II est à noter que la forme oxydée selon la formule Ib2 est détectable sans étapes préalables de sililation et que sa masse est de 147 ou 148 (avec deux hydrogènes ou un hydrogène de moins que dans la forme réduite).
Une autre méthode de détection est la spectrométrie de masse disposée en série (HPLC, Masse, Masse). Selon un autre mode particulièrement avantageux de réalisation de l ' invention, les méthodes de diagnostic susmentionnées comprennent une étape de séparation par voie biologique des dérivés de formules (I) susceptibles d'être présents dans l 'échantillon biologique, des autres constituants de cet échantillon biologique, notamment à l 'aide d'anticorps dirigés contre ces dérivés de formule (I), notamment à l 'aide d'anticorps dirigés contre le dérivé de formule (Ib2).
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet toute méthode de diagnostic in vitro telle que décrite ci-dessus, et comprenant les étapes suivantes :
- mise en présence de l'échantillon biologique avec des anticorps, dirigés contre au moins un dérivé de formule (I) susmentionnée, lesdits anticorps étant fixés sur un support solide, ce qui conduit à l 'obtention de complexes entre lesdits anticorps et lesdits dérivés susceptibles d'être présents dans l'échantillon biologique,
- rinçage du support solide avec une solution appropriée,
- addition sur le support solide d'un réactif marqué susceptible de reconnaître spécifiquement les complexes susmentionnés, notamment des anti- immunoglobulines marquées, reconnaissant lesdits complexes,
- rinçage du support solide,
- détection de la présence éventuelle du réactif marqué sur le support solide. A titre d'illustration, les méthodes de diagnostic de l' invention sont avantageusement effectués selon la technique ELISA (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay) dans laquelle les anti-immunoglobulines utilisées pour révéler les complexes formés entre les anticorps fixés sur le support solide et les dérivés à détecter, sont marquées par couplage à une enzyme elle-même susceptible de réagir spécifiquement avec un substrat déterminé. Une telle méthode peut par exemple être effectuée selon le procédé décrit dans l'article de Yie et al. - Clinical
Chemistry, 1993, vol. 39, 2322-2325.
L'invention a également pour objet les anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre au moins un dérivé de formule (I) susmentionnée, et plus particulièrement contre le dérivé de formule (Ib2). L' invention a plus particulièrement pour objet les anticorps polyclonaux dirigés contre un ou plusieurs, voire la totalité, des dérivés de formule (I) susmentionnée. De tels anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec un ou plusieurs, voire la totalité des dérivés de formule (I), suivie de la récupération des anticorps produits par le système immunitaire dudit animal.
L' invention concerne également les anticorps monoclonaux dirigés contre des dérivés de formule (I) susmentionnée, et tels que produits par tout hybridome susceptible d'être formé, par des méthodes classiques, à partir des cellules spléniques d 'un animal , notamment de souris ou de rat, immunisés contre l 'un des dérivés de formule (I) d'une part, et des cellules d'un myélome approprié d'autre part, et d 'être sélectionné par sa capacité à produire des anticorps monoclonaux reconnaissant le dérivé de formule (I) susmentionné, initialement utilisé pour l ' immunisation des animaux.
S'agissant des dérivés de formule (I) susmentionnée, utilisés pour l'obtention des anticorps décrits ci-dessus, ceux-ci pouvant être obtenus soit sous forme purifiée à partir d'un échantillon biologique approprié, notamment à partir de sang, d'urine ou de liquide céphalo-rachidien, prélevé chez un homme ou un animal atteint d'une maladie neurodégénérative, par exemple selon le procédé de purification décrit ci-après.
Ces dérivés de formule (I) sous forme réduite, et plus particulièrement ceux de formules (lai), (Ibl) ou (Ici) susmentionnées, dans lesquelles Ri et/ou R2 représentent H, peuvent également être obtenus par synthèse chimique, notamment selon la méthode décrite dans l'article de Yamaguchi et al. - Wakayama Med.
Rept. , 1971 , vol . 15, 127-134, ou encore selon la méthode décrite dans l'article de Beckett A. H . et al. - Tetrahedron, 1968, vol. 24, 6093-6109.
La forme oxydée de ces dérivés sous forme réduite susmentionnée, peut être obtenue par oxydation de la forme réduite dans un champ électrique ne dépassant pas quelques volts. Le dérivé réduit est introduit dans une solution qui peut être constituée d'un mélange d'eau et d'un ou plusieurs solvants organiques (par exemple un alcool, un amide ou un nitrile) et rendue conductrice du courant électrique par ajout d'un électrolyte support tel un acide minéral (HC1 , H2SO4...) ou un sel d'un métal alcalin. La cellule électrochimique est, de façon classique et bien connue par l'homme de l'art, constituée de deux récipients en verre séparés par une membrane échangeuse d'ions ou tout autre dispositif permettant d'éviter la diffusion du dérivé réduit ou oxydé vers l'électrode négative (cathode). L'électro oxydation du dérivé réduit est provoquée à une anode qui peut être constituée de carbone massif ou en fibre ou d'un métal inattaquable, par exemple du platine. L'électrolyse est effectuée en imposant, à l'aide d'un potentiostat d'origine
Radiometer Tacussel ou autre, par rapport à une électrode de référence, par exemple au Calomel, un potentiel tel que l'on provoque l'oxydation du dérivé réduit. La sulfoconjugaison des dérivés de formules (la). (Ib) ou (le) susmentionnées, dans lesquelles R\ représente H, peut être obtenue en utilisant une réaction enzymatique à l'aide d'une sulfotransférase de type M (EC 2.8.2.1) purifiée à partir de foie de rat ou de plaquettes humaines selon R. Sekura, 5 M. Duf el, W. Jakoby (Methods in Enzymology, Jakoby W, éd. , Académie Press ,
New York, 1981 , volume 77, pages 197 à 206) et le protocole de sulfoconjugaison est celui décrit par H. Soliman, P. Boudou, J.M. Vilette et J. Fiet (J.Steroid Biochem. Molec.Biol. , 1993, vol 46, Pages 631 à 634) pour la sulfoconjugaison du 5-Pregnen-3-ol-20-one (PREG). On obtient ainsi les dérivés susmentionnés dans l() lesquels R\ représente SO3". 'agissant de la préparation des dérivés de formules (la), (Ib) ou (le) susmentionnées, dans lesquelles R\ et/ou R2 représentenl un groupe Ra, Ra étant tel que défini ci-dessus, celle-ci peut être effectuée selon un protocole dérivé de ceux décrits dans les articles de Yamaguchi et al. , et de Beckett A. H. et al. 15 susmentionnés, ou dans l'ouvrage suivant . Methods in Enzymology, Jakoby W, éd. , Académie Press , New York, 1981 , volume 77.
Les dérivés de formule (I) utilisés pour l'obtention des anticorps décrits ci- dessus, peuvent avantageusement être couplés à des molécules porteuses habituellement utilisées pour les haptènes, selon des techniques connues de 20 l'homme du métier, notamment en position a ou c sur la formule (I), afin d'augmenter les propriétés immunogéniques desdits dérivés, et ainsi d'augmenter la production des anticorps.
L' invention a également pour objet toute méthode de diagnostic, in vitro de maladies neurodegeneratives telles que définies ci-dessus, caractérisée en ce que la 25 détection, voire le dosage, du ou des dérivés de formule (I) est effectuée sans séparation préalable dudit dérivé et des autres constituants de l'échantillon biologique, notamment par mise en oeuvre d'une réaction colorimétrique entre ledit dérivé et une molécule ou groupe de molécules réagissant spécifiquement avec ledit dérivé en entraînant l'apparition d'une coloration spécifique de cette réaction, celle 30 coloration étant soit celle des produits issus de la réaction entre ledit dérivé et la molécule ou groupe de molécules susmentionnées, soit celle d'un substrat transformé par réaction avec l'un des produits de la réaction susmentionnée.
L' invention a pour objet également la mise en oeuvre de polymères synthétisés par des procédés de chimie combinatoire (polypeptides,
35 polyoligosaccharides par exemple), et criblés sur des critères d'affinité avec les composés correspondants à la formule I, permettant ainsi un repérage spécifique de ces composés et de sélectionner les polymères les plus affins (ces méthodes, techniques, d'aptameres ou méthode Selex, étant décrites dans "Methods in enzymology" , Volume 267, édité par John Abelson, Académie press)
Une autre méthode de dosage permettant d'établir une trousse de diagnostic est avantageusement développée à partir de moules réalisés par les techniques d 'empreinte ou " impπnting" (K Mosbach et O Ramstrom, Biotechnology, 14, 163- 169, 1996)
L' invention a également pour objet toute méthode de diagnostic telle que decnte ci-dessus, compienant une étape préalable de traitement de l'échantillon biologique, notamment par hydrolyse acide, par exemple a l'aide d'acide chloi hydπque (pHl) pendant 2 heures à 80°C, afin de désulfater ceux des dérivés de formule (I) dans laquelle Rj représente SO ^ susceptibles d'être présents dans l 'échantillon biologique, pour obtenir que des dérivés de formule (I) dans laquelle R ] repiescnte H dans ledit échantillon, cette étape étant suivie par une étape de détection, voire de dosage, des dérivés de formule (I) dans lesquelles R\ représente
H, tel que le dérivé de formule (Ibl), notamment selon les techniques décrites ci- dessus
L' invention a également pour objet les trousses (ou kits) pour la mise en oeuvie d'une des méthodes de diagnostic de l' invention Avantageusement les trousses de l 'invention comprennent
- des anticorps tels que décrits ci-dessus, dirigés contre l'un ou moins des dérivés de formule (I), notamment des anticorps dirigés contre le dérivé de formule (Ib2), ces anticorps étant avantageusement fixés sur un support solide, notamment dans des puits de plaques de titration, - le cas échéant un milieu propice à l'établissement d'une reaction îmmunologique entre lesdits anticorps, et le (ou les) dérivés de formule (I) susceptιble(s) d'être présent(s) dans l'échantillon biologique analysé, une solution de rinçage du support solide, des réactifs appropriés pour la détection des complexes éventuellement formes entre lesdits anticorps et lesdits dérivés de formule (I), notamment des anti- îmmunoglobulines marquées, par exemple de façon radioactive, enzymatique ou par fluorescence
L' invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de la purification et la caractéπsation d'un marqueur potentiel de maladies dégénératives du système nerveux central.
Comme nous l'avons vu précédemment, ce marqueur excrété dans les urines est commun aux démences dégénératives humaines (démence de type Alzheimer, démence mixte et maladie de Pick) et aux encéphalopathies spongiformes humaines (maladie de Creutzfeldt-Jakob) et animales (tremblante du mouton et encéphalopathie spongiforme bovine).
La présence de ce marqueur est mise en évidence directement sur des échantillons urinaires humains ou animaux par une technique de voltamétrie cyclique sur une électrode à poudre de graphite (figures la à le).
La purification du marqueur a été effectuée par des méthodes usuelles telles que : extraction, dialyse, chromatographie sur colonne échangeuse d'ions, ...
La caractérisation du marqueur sous sa forme réduite a été effectuée par des techniques analytiques classiques : spectroscopie U .V. , chromatographie ionique, spectrométrie de masse, RMN 1 H .
Le marqueur sous sa forme réduite est identifié par comparaison avec des molécules synthétisées comme étant un dérivé sulfaté de l 'oxindole.
1 ) Purification du marqueur urinaire et caractérisation.
Ayant constaté que les ruminants atteints d 'encéphalopathies spongiformes excrétaient le marqueur à des concentrations relativement plus importantes que les sujets humains atteints de maladie d'Alzheimer, nous avons choisi d'utiliser l 'urine de brebis atteintes de tremblante. Toutefois ce protocole s'applique aux urines quelqu'en soit l'origine.
Après acidification à pH = 1 de l'urine par HC1 aqueux, un tracé voltampérométrique est réalisé afin de vérifier la présence en quantité suffisante du marqueur.
1 . 1 .) Traitement par l'acétate d'éthyle
Après centrifugation, l'urine est soumise à plusieurs extractions par l'acétate d'éthyle afin d'éliminer le maximum de composés urinaires non chargés à ce pH (catécholamines, p-crésol, ...), le composé correspondant au marqueur n'étant apparemment pas soluble dans la plupart des solvants organiques classiques (éther, chloroforme, dichlorométhane, acétate d'éthyle, isopropanol, ...). Ainsi à un volume d'urine (20 ml) on additionne à température ambiante 20 ml d'acétate d'éthyle et on agite le mélange fortement dans une ampoule à décanter et l'on centrifuge à 10 000 tours minute pendant 10 minutes afin de séparer les phases. La phase d'acétate d'éthyle est éliminée et la même expérience est répétée 4 fois. Après extraction des composés neutres, un nouveau contrôle électrochimique est effectué sur une aliquote de 1 ml de la phase aqueuse (figure 2).
1 .2.) Dialyse croisée Le marqueur n'étant pas soluble dans la plupart des solvants organiques, même à pH *= 1 , les inventeurs en ont déduit qu' il s'agissait d'un produit très hydrophile, probablement chargé à ce pH. Les inventeurs ont donc tenté de l'extraire à partir des urines par des expériences de dialyse croisée réalisées à l 'aide de membranes ioniques. Ils ont constaté que le marqueur ne traverse pas les membranes cationiques mais qu' il est au contraire retrouvé dans les dialysats lorsque l 'expérience est réalisée à l'aide d'une membrane anionique. Il s'agit donc d 'une espèce chargée négativement, même en milieu très acide. Ils ont de plus observé que le dialysat se présente sous la forme d 'un liquide pratiquement incolore et limpide, ce qui n'est évidemment pas le cas des urines de départ, si bien que toutes les expériences ultérieures ont été systématiquement réalisées après dialyse à travers une membrane anionique.
La dialyse est réalisée à partir de la phase aqueuse obtenue après extraction des composés neutres par l'acétate d'éthyle. La phase aqueuse est évaporée sous vide à l 'aide d'un évaporateur à rotation à température inférieure à 40 °C après que le pli ait été ramené à 5-6 par addition de soude afin d'éviter une dégradation du marqueur par hydrolyse acide. Le résidu est ensuite repris par HC1 10~-> N puis soumis à une dialyse croisée laquelle est effectuée à l'aide d'une membrane échangeuse d'anions conditionnée (marque RAI modèle R nc 1030) dans une cellule de dialyse en verre fabriquée spécialement. Le compartiment de concentration contient NaCl 1 M à pH = 3, ces conditions ayant été choisies afin d 'optimiser les échanges transmembranaires. La dialyse est effectuée pendant 24 à 48 heures sous agitation magnétique en chambre froide à 4°C. Une aliquote du compartiment de concentration est prélevée afin de contrôler par voltampérométrie la présence du marqueur. Parallèlement, on réalise un spectre U.V. du mélange
(figure 3).
1.3.) Purification sur colonne échangeuse d'ions
Le dialysat est évaporé à sec sous vide, repris par de l'éthanol absolu, puis filtré afin d'éliminer les sels. Après évaporation de l 'éthanol, le résidu est dissous dans un volume minimum d'HCl 10"3 N avant d'être injecté sur une colonne ouverte de Poly Ethylène Imine cellulose (PEI) échangeuse d'anions. Les différents constituants anioniques sont séparés en chambre froide par un gradient de NaCl . On obtient alors des fractions partiellement purifiées présentant en électrochimie les caractéristiques du marqueur. Nous avons utilisé une colonne de Poly Ethylène
Imine de 15 cm de hauteur et 1 cm de diamètre. L'échantillon contenant le marqueur est appliqué sur la colonne avec un débit de 1 ml/minute et l'élution obtenue et la position du marqueur sont présentés dans les figures 4 et 5. Le volume d'élution est de 400 ml de NaCl et les fractions de 1 ml sont collectées et soumise à l'électrovoltampérométrie (Co = 4,5 x 10-2 M - Cl = 9,5 x 10-2 M).
1 .4. ) Spectroscopie U.V.
Les spectres U.V. des fractions contenant le marqueur présentent un maximum d'absorption tel que λmax = 249-250 nm (figures 6 et 7). L'épaulement à 280 nm montre l'existence d'une liaison C = O.
1 .5. ) Détection des ions sulfates
Le marqueur étant chargé négativement à pH = 1 , les inventeurs ont supposé qu ' il s'agissait d'un composé excrété dans les urines sous forme condensée à l ' ion sulfate (dérivé "sulfo-conjugué"). Afin de tester cette hypothèse une petite quantité du produit purifié a été soumise à une hydrolyse acide à 80°C durant 2 heures (cette hydrolyse pouvant être obtenue par addition de HC1 afin que le pH soit de
1 ). De même, le spectre U.V. correspondant à l'échantillon hydrolyse diffère de celui obtenu avant hydrolyse (figure 7). Nous pouvons donc en déduire que le marqueur est sensible à l'hydrolyse acide. Un voltampérogramme de l'échantillon après hydrolyse a été réalisé et s'est révélé différent de celui du même échantillon avant hydrolyse, (figure 8). Les ions sulfates, phosphates, nitrates et chlorures ont été dosés dans les échantillons avant et après hydrolyse par chromatographie ionique sur une colonne DIONEX anionique ION/PAC AS4A-SC Analytical colonne (séparation isocratique - détection par conductivité - éluent : 1 ,8 mM Na2Cθ l ,7 mM NaHC03 conductimétrique. L'analyse a révélé la présence de sulfates libres en quantité quatre fois plus importante dans l'échantillon hydrolyse que dans l 'échantillon avant hydrolyse pris comme référence. Ce résultat confirme l'hypothèse selon laquelle le marqueur serait un dérivé éliminé dans les urines sous forme sulfo-conjuguée (figure 9).
1.6.) Purification par chromatographie en couche mince (CCM)
Les fractions contenant le marqueur sont évaporées à sec et reprises par un faible volume de HC1 10~3 N avant d'être déposées sur des plaques de cellulose pour chromatographie en couche mince (Fournisseur Merck). Le solvant de migration est un mélange butanol/acide acétique/eau 8:2:2. Après migration, les différents produits séparés sont repérés sous lumière U.V. et détachés avec la couche adsorbante. Les produits liés à la cellulose sont repris par H2O et la cellulose est éliminée par centrifugation. Un contrôle électrochimique est ensuite effectué afin de localiser le marqueur. La purification par CCM est renouvelée afin d'obtenir un quantité suffisante de produit pour réaliser des analyses par RMN et par spectroscopie de masse (figure 10).
1 .7.) Analyses par spectrométrie de masse et RMN 1H
L'analyse par spectrométrie de masse (figure 1 1 ) (impact électronique et ionisation chimique) du marqueur sous sa forme réduite purifié par CCM, indique qu' il s'agit d'un composé présentant une masse moléculaire (ou un fragment) égale à 149. Cette valeur, ainsi que celles observées pour diverses fragmentations de la molécule peuvent laisser supposer qu'il s'agit d'un composé de type hydroxy- oxindole, la position du radical hydroxyle n'étant pas résolue. On ne met pas en évidence le groupe sulfate, ce qui n'a rien de surprenant dans la mesure où l 'analyse par spectrométrie de masse dans les mêmes conditions d'un composé témoin, le MHPG-sulfate, donne comme pic moléculaire celui du MHPG (ayant perdu le groupement sulfate).
Le spectre RMN 1 H (figure 12) obtenu est compatible avec l'existence d'un noyau indole ou oxindole ce qui, compte tenu de la détection UV du groupement C = O, donne comme seule possibilité celle d'un noyau oxindole. Par ailleurs, on note également en position 5 la présence d'un groupement OH. Ces analyses nous conduisent aux structures sulfatées (schéma (a)) et désulfatées (schéma (b)) pour représenter ce marqueur.
schéma (a)
Figure imgf000017_0002
schéma (b) 2) Exemples de dosage du Marqueur.
Afin d'effectuer un dosage du marqueur dans les urines plusieurs méthodes peuvent être utilisées. L'électroampérométrie cyclique décrite ci dessus est une de ces méthodes qui permet d'effectuer un dosage quantitatif. Le marqueur peut être dosé sous sa forme naturelle sulfatée ou après désulfatation. La désulfatation pouvant être obtenue comme précédemment par hydrolyse acide.
Afin de pouvoir effectuer une quantification de ce marqueur, il est nécessaire de réaliser un étalonnage à l'aide d'un produit de référence. Nous avons donc synthétisé la forme oxindole (schéma b) selon le protocole décrit par A. H Beckett,
R.Daisley et J.Walker (Tetrahedron, 1968, volume 24,pages 6093 à 6109). La sulfoconjugaison de l'oxindole en position 5 a été obtenue en utilisant une réaction enzymatique à l'aide de sulfotransférase de type M (EC 2.8.2.1) purifié à partir de foie de rat ou de plaquettes humaine selon R. Sekura, M.Duffel, W. Jakoby (Methods in Enzymology, Jakoby W, éd. , Académie Press , New York, 1981 , volume 77 , pages 197 à 206) et le protocole de sulfoconjugaison est celui décrit par
H. Soliman, P. Boudou, J.M. Vilette et J. Fiet (J.Steroid Biochem. Molec.Biol . ,
1993, vol 46, Pages 631 à 634) pour la sulfatation du 5-Pregnen-3-ol-20-one
(PREG). Ce protocole permet en remplaçant le PREG par l'oxindole d'obtenir une sulfatation radiomarquée par le soufre si nécessaire.
Les deux formes (schémas a et b) obtenues par synthèse et sulfatation enzymatiques, donnent un voltampérogramme superposable à ceux obtenus à partir des composés naturels des deux formes (figures 12 et 13).
Plusieurs techniques de chromatographie peuvent être utilisées pour le dosage, soit de la forme naturelle soit de la forme désulfatée.
Sans que la liste en soit exhaustive, des techniques de chromatographie à haute performance (HPLC) en phase reverse (colonne C18 par exemple), ou à échangeur d'ions (comme celle décrite plus haute pour la purification du marqueur), ou par électrophorèse capillaire, peuvent être utilisées. La détection du marqueur peut être basée sur l'absorption par U.V. , la fluorescence, l' électrochimie, la spectrométrie de masse etc. , et la quantification par intégration des surfaces des pics correspondant et leur comparaison avec celle deux pics obtenues avec des doses connues du marqueur.
Une autre façon d'effectuer le dosage est la mise en oeuvre de technique faisant appel à la reconnaissance par des anticorps. L'obtention d'anticorps poly ou monoclonaux et le dosage se fait selon des protocoles classiques pour l'homme de l'art et décrits par exemple pour le dosage de la mélatonine par Shang-Mian Yie,
Erika Johansson et Gregory Brown dans Clin.Chem. 1993 , volume 39 pages 2322 à 2325). Les dosages se réalisent par exemple avec la mesure d'une radioactivité ou une réaction enzymatique ou colorimétrique etc.
Le protocole mis en oeuvre en routine pour ce dosage a été celui de l 'HPLC sur C18, selon la publication de Mills M. IL, Finlay D.C. , Haddad P.R. dans J. Chromatography, 1991 , vol . 164, 441-445 , et Van Haarel A. et Pavel S. , J .
Chromatography, 1988, vol . 429, 59-94.
Pour des échantillons d'urine, nous prélevons 1 ml auquel on ajoute 9 ml d'une solution(50/50) Ethanol/ Acétone. Le mélange est centrifugé à basse vitesse
( l OOORPM) 10 minutes et un échantillon de 100 μl du surnageant est lyophilisé et redissous dans 100 μl de ImM d'HCl. Ce volume est injecté sur la colonne de
HPLC.
Pour le dosage dans le sang, le protocole est le suivant : 1 volume de plasma
(200μl) est mélangé à 3 volumes de la solution(50/50) Ethanol /Acétone. Le mélange est conservé à 4 °C pendant 30 minutes puis centrifugé à 1000 rpm 10 minutes à 4°C. Un échantillon de 100 μl du surnageant est lyophilisé et redissous dans 100 μl de ImM d'HCl . Ce volume est injecté sur la colonne de HPLC.
Pour le dosage dans le liquide céphalo rachidien, l'échantillon de 100 μl est directement injecté sur HPLC.
Il peut être souhaitable de traiter préalablement les échantillons par une solution acide pour atteindre le pH de 1 .
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 Profil de séparation d'échantillons d'urine provenant de :
- la : brebis saines
- Ib : brebis atteintes de tremblante
- le : vaches atteintes de l' encéphalopathie spongiforme
- ld : humains âgés sains - le : humains atteints de démence sénile de type Alzheimer.
Un échantillon de 1 ml d'urine acidifié à pHl par l'acide chlorhydrique est soumis à une oxydoréduction par passage d'un courant électrique à balayage cyclique.
Les potentiels d' oxydoréduction sont notés en abscisse (en mVolts) mesurés par rapport à l'électrode normale d'hydrogène. En ordonnée, l' intensité du courant est mesurée en milliampères.
La voltampérométrie cyclique est un système à trois électrodes, une en platine, une à hydrogène et une de travail à base de poudre de graphite. On peut noter le pic caractéristique du marqueur à 850 mv indiqué par la flèche.
Figure 2 Electrovoltampérogramme d'urine de mouton atteint de tremblante après traitement des urines par un volume d'acétate d'éthyle, centrifugation et récupération de la phase aqueuse.
On peut noter le pic caractéristique du marqueur à 850 mv indiqué par la flèche .
Figure 3
Electrovoltampérogramme de l'échantillon d'urine après extraction à l 'acétate d'éthyle et dialyse membranaire.
On peut noter le pic caractéristique du marqueur à 850 mv indiqué par la flèche.
Figure 4
Electrovoltampérogramme de l'échantillon d'urine après purification par colonne anionique (polyéthylene imine) correspondant à la fraction n° 70 d'élution de cette colonne par un gradient de NaCl (0 et 1 M).
Figure 5
Electrovoltampérogramme de l'échantillon d'urine après purification par colonne anionique (polyéthylene imine) correspondant à la fraction n° 95 d'élution de cette colonne par un gradient de NaCl (0 et 1 M).
Figure 6
Spectre UV des fractions récupérées et réunies comprises entre la fraction n° 70 et 95 de la colonne de PEI. En abscisse, la longueur d'onde (nm), en ordonnée, la densité optique.
Le pic principal à 249 nm (flèche) est celui à 286, 1 nm correspondant à un groupement C = 0.
On note sur tous ces voltampérogrammes la présence d'un pic en réduction (partie inférieure du graphe, notée par une flèche) à 850 m volts, nettement distinct dans les figures lb, le, le, correspondant aux pathologies spongiforme et
Alzheimer. Figure 7
Idem à la figure 6, l'échantillon 88 avait été hydrolyse par HC1 environ 2 heures à 80° C. On peut noter que le pic à 249 nm est maintenant à 254,6 nm.
Figure 8
Voltampérogramme du produit (fraction 88 de la colonne PEI). Noter le pic à 850 mV en oxydation (partie supérieure du graphe) au deuxième balayage.
Figure 9
Chromatographie ionique du marqueur urinaire sur une colonne Dionex anionique après hydrolyse acide. L'abscisse représente une mesure de la conductivité. Les temps de rétention sont présentés en ordonnée. 11 apparaît un pic de sulfate au temps de rétention d'étalonnage des sulfates et un pic de chlorure lié à l'utilisation d'HCl pour l'hydrolyse du marqueur.
Figure 10
Purification du marqueur par chromatographie couche mince sur plaque de cellulose.
Les échantillons correspondant aux fractionnements enrichis en marqueurs après la chromatographie sur colonne de PEI sont séparés par chromatographie en couche mince sur cellulose.
La zone indiquée par une flèche correspond au marqueur. Cette zone est prélevée de la plaque et le marqueur élue sur gel de cellulose dans de l'eau, centrifugé et soumis aux analyses voltampérométriques.
Figure 11
Spectre de masse du marqueur sous sa forme réduite. Le spectre de masse a été mesuré par deux techniques. L' impact électronique
(figure l ia) et l'ionisation chimique à l'ammoniaque (figure 11b).
Il apparaît un pic principal à une masse de 149 sur la figure l i a correspondant à la masse moléculaire du marqueur, les pics mineurs correspondant à des produits contaminants ou de dégradation. Le spectre après de l'ionisation chimique à l 'ammoniaque fait apparaître un pic d'une masse de 150, correspondant à la masse du marqueur augmentée de celle de l'hydrogène et un second pic à 167 correspondant à la masse du marqueur augmentée de 18 (celle de NH4). Figure 12
Spectre de RMN de protons
En abscisse les ppm qui montrent la présence du groupement NH au-delà de 10 ppm, la zone de 7,55 à 6,95 a été élargie et est représentée dans la partie basse de la figure Ceci permet de voir que les protons sont en position 7, 6, 4 et que la position 5 est occupée par l' hydroxyle Cette interprétation résulte de l'intégration des pics Ha, Hb, Hc
Figures 13 a et 13 b
Electrovoltampérogramme du produit synthétisé de la forme oxindole On peut noter le pic à 850 mV (et à 960 mV en oxydation au deuxième balayage en pointillé)
Electrovoltampérogramme du produit synthétise oxindole et sulfaté par voie enzymatique
On peut noter le pic à 850 mV en réduction au premier balayage et le pic a 1 100 mV en oxydation, caractéristique des sulfates
Le pic d'oxydation à 960 mV au deuxième balayage (en pointillé) que l'on observait également dans les figures 2, 3, 4 et 5

Claims

REVENDICATIONS
I . Utilisation d'un procédé de détection ou de dosage de dérivés comportant un noyau indole ou oxindole, et plus particulièrement d'au moins un dérivé parmi ceux répondant à la formule générale (I) suivante :
Figure imgf000023_0001
dans laquelle :
- Rj représente un atome d'hydrogène, ou un groupe sulfate SO3", ou un groupe Ra, Ra représentant un groupe conjugué (tel qu'un groupe carbohydrate ou glucidique), notamment un glucuronide, un glucose, un désoxyribose, ou un fructose,
- R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe Ra tel que défini ci- dessus,
- n- , n2, et n3, indépendamment l'un de l'autre, représentent zéro ou un, lesdits dérivés correspondant aux trois formes tautomères suivantes :
1) celle de formule (la) dans laquelle :
- la forme réduite correspond aux dérivés de formule (Ial) suivante :
Figure imgf000023_0002
dans laquelle Rj et R2 ont les significations indiquées ci-dessus, la forme oxydée correspond aux dérivés de formule (Ia2) suivante
Figure imgf000024_0001
dans laquelle R\ a la signification indiquée ci-dessus,
2) celle de formule (Ib) dans laquelle :
- la forme réduite correspond aux dérivés de formule (Ibl ) suivante
Figure imgf000024_0002
dans laquelle Rj a la signification indiquée ci-dessus,
- la forme oxydée correspond au dérivé de formule (Ib2) suivante
Figure imgf000024_0003
3) celle de formule (le) dans laquelle :
- la forme réduite correspond aux dérivés de formule (Ici) suivante
Figure imgf000024_0004
dans laquelle Rj et R2 ont les significations indiquées ci-dessus, - la forme oxydée correspond aux dérivés de formule (Ic2) suivante
dans laquelle R2 a la signification indiquée ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de pathologies neurodegeneratives humaines ou animales, notamment des maladies dégénératives du système nerveux central, et plus particulièrement les démences dégénératives humaines, ou les encéphalopathies humaines et animales.
2. Méthode de diagnostic in vitro de pathologies neurodegeneratives humaines ou animales, notamment les maladies dégénératives du système nerveux central, et plus particulièrement les démences dégénératives humaines, ou les encéphalopathies humaines et animales, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de détection, voire de dosage, dans un échantillon biologique humain ou animal approprié, de la présence d'au moins un dérivé comportant un noyau indole ou oxindole, notamment d'au moins un composé parmi ceux répondant à la formule générale (I) suivante :
Figure imgf000025_0002
dans laquelle :
- R\ représente un atome d'hydrogène, ou un groupe sulfate SO3", ou un groupe Ra, Ra représentant un groupe conjugué (tel qu'un groupe carbohydrate ou glucidique), notamment un glucuronide, un glucose, un désoxyribose, ou un fructose, - R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe Ra tel que défini ci- dessus,
- n i , n2, et n3, indépendamment l'un de l'autre, représentent zéro ou un, lesdits dérivés correspondant aux trois formes tautomeres suivantes
1 ) celle de formule (la) dans laquelle
- la forme réduite correspond aux dérivés de formule (Ial) suivante
Figure imgf000026_0001
I 5 dans laquelle R] et R2 ont les significations indiquées ci-dessus, - la forme oxydée correspond aux dérivés de formule (Ia2) suivante
Figure imgf000026_0002
25 dans laquelle R\ a la signification indiquée ci-dessus,
2) celle de formule (Ib) dans laquelle *
- la forme réduite correspond aux dérivés de formule (Ibl) suivante
Figure imgf000026_0003
dans laquelle Ri a la signification indiquée ci-dessus, la forme oxydée correspond au dérivé de formule (Ib2) suivante
Figure imgf000027_0001
3) celle de formule (le) dans laquelle :
- la forme réduite correspond aux dérivés de formule (Ici) suivante
Figure imgf000027_0002
dans laquelle Ri et R2 ont les significations indiquées ci-dessus, - la forme oxydée correspond aux dérivés de formule (Ic2) suivante
Figure imgf000027_0003
dans laquelle R2 a la signification indiquée ci-dessus,
3. Méthode de diagnostic selon la revendication 2, caractérisée en ce que les pathologies susceptibles d'être détectées sont les suivantes : démence de type Alzheimer chez l'homme, démence mixte chez l'homme, maladie de Pick chez l'homme, encéphalopathies spongiformes humaines, notamment maladie de Creutzfeldt-Jakob, encéphalopathies spongiformes animales, notamment tremblante du mouton et encéphalopathie spongiforme bovine (E.S.B.)
4. Méthode de diagnostic selon revendication 2 ou la revendication 3, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est de l'urine, du sang, ou du liquide céphalo rachidien (LCR).
5. Méthode de diagnostic selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- une étape de séparation, physique ou biologique d'au moins un dérivé de formule (I) à détecter, des autres constituants de l'échantillon biologique, et le cas échéant, d' identification directe du dérivé, notamment par HPLC,
- le cas échéant, une étape de détection de la présence éventuelle dudit dérivé dans cet échantillon biologique, notamment à l'aide d'un (ou plusieurs) réactif(s) marqué(s).
6. Méthode de diagnostic selon l'une des revendications 2 à 5 caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes :
- mise en présence de l'échantillon biologique avec des anticorps, dirigés contre au moins un dérivé de formule (I) susmentionnée, lesdits anticorps étant fixés sur un support solide, ce qui conduit à l'obtention de complexes entre lesdits anticorps et lesdits dérivés susceptibles d'être présents dans l'échantillon biologique,
- rinçage du support solide avec une solution appropriée,
- addition sur le support solide d'un réactif marqué susceptible de reconnaître spécifiquement les complexes susmentionnés, notamment des anti- immunoglobulines marquées, reconnaissant lesdits complexes,
- rinçage du support solide,
- détection de la présence éventuelle du réactif marqué sur le support solide.
7. Anticorps polyclonaux ou monoclonaux susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro selon l'une des revendications 2 à 6, lesdits anticorps étant dirigés contre au moins un composé parmi ceux répondant à la formule générale (I) suivante :
Figure imgf000028_0001
dans laquelle :
- Rj représente un atome d'hydrogène, ou un groupe sulfate SO3", ou un groupe Ra. Ra représentant un groupe conjugué (tel qu'un groupe carbohydrate ou glucidique), notamment un glucuronide, un glucose, un désoxyribose, ou un f ructose,
- R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe Ra tel que défini ci- dessus,
- ι , n2, et 113 , indépendamment l'un de l'autre, représentent zéro ou un, lesdits dérivés correspondant aux trois formes tautomeres suivantes .
) celle de formule (la) dans laquelle :
- la forme réduite correspond aux dérivés de formule (Ial) suivante
Figure imgf000029_0001
dans laquelle R\ et R2 ont les significations indiquées ci-dessus, - la forme oxydée correspond aux dérivés de formule (Ia2) suivante
Figure imgf000029_0002
dans laquelle R a la signification indiquée ci-dessus,
2) celle de formule (Ib) dans laquelle :
- la forme réduite correspond aux dérivés de formule (Ibl) suivante
( I b 1 )
Figure imgf000029_0003
dans laquelle Rj a la signification indiquée ci-dessus,
- la forme oxydée correspond au dérivé de formule (Ib2) suivante
Figure imgf000030_0001
3) celle de formule (le) dans laquelle :
- la forme réduite correspond aux dérivés de formule (Ici ) suivante
Figure imgf000030_0002
dans laquelle R\ et R2 ont les significations indiquées ci-dessus, - la forme oxydée correspond aux dérivés de formule (Ic2) suivante
Figure imgf000030_0003
dans laquelle R2 a la signification indiquée ci-dessus.
8. Trousse (ou kit) pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisée en ce qu'elle comprend : - des anticorps tels que définis dans la revendication 7, dirigés contre l'un ou moins des dérivés de formule (I), ces anticorps étant avantageusement fixés sur un support solide, notamment dans des puits de plaques de titration,
- le cas échéant :
. un milieu propice à l'établissement d'une réaction immunologique entre lesdits anticorps, et le (ou les) dérivés de formule (I) susceptible(s) d'être présent(s) dans l 'échantillon biologique analysé,
. une solution de rinçage du support solide,
. des réactifs appropriés pour la détection des complexes éventuellement formés entre lesdits anticorps et lesdits dérivés de formule (1), notamment des anti- immunoglobulines marquées, par exemple de façon radioactive, enzymatique ou par fluorescence.
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