+

WO1998003653A2 - Procede de preparation d'organes de mammiferes non humains transgeniques en vue de leur transplantation chez l'homme, et sequences nucleotidiques pour la mise en oeuvre de ce procede - Google Patents

Procede de preparation d'organes de mammiferes non humains transgeniques en vue de leur transplantation chez l'homme, et sequences nucleotidiques pour la mise en oeuvre de ce procede Download PDF

Info

Publication number
WO1998003653A2
WO1998003653A2 PCT/FR1997/001340 FR9701340W WO9803653A2 WO 1998003653 A2 WO1998003653 A2 WO 1998003653A2 FR 9701340 W FR9701340 W FR 9701340W WO 9803653 A2 WO9803653 A2 WO 9803653A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gly
ser
val
seq
glu
Prior art date
Application number
PCT/FR1997/001340
Other languages
English (en)
Other versions
WO1998003653A3 (fr
Inventor
Bernard Vanhove
Christine Pourcel
Jean-Paul Soulillou
Original Assignee
Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) filed Critical Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale)
Priority to JP10506648A priority Critical patent/JP2000516804A/ja
Priority to EP97935592A priority patent/EP0914434A2/fr
Priority to AU38525/97A priority patent/AU3852597A/en
Publication of WO1998003653A2 publication Critical patent/WO1998003653A2/fr
Publication of WO1998003653A3 publication Critical patent/WO1998003653A3/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/108—Swine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A01K2267/025—Animal producing cells or organs for transplantation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases

Definitions

  • the subject of the present invention is the use of nucleotide sequences for the implementation of a process for the preparation of organs of transgenic non-human mammals capable of being transplanted into humans by appreciably reducing the risks of rejection of grafts.
  • the porcine antigens recognized by the XANs have been analyzed: it is mainly a carbohydrate structure consisting of galactose branched in an ⁇ 1, 3 configuration on the N-acetyllactosamine ( ⁇ -galactosyl epitope) present on the glycolipids and membrane glycoproteins
  • IP-10 IP-10 , RANTES, MCP / JE, inhibitors pl5E, GFM-CSF, G-CSF), adhesion molecules (ELAM-1, VCAM-1, ICAM-1, c-sis, GPlb ⁇ , vWF, ligand LAM-1), transcription factors (c-fos, NFkB, Gem), regulators of vascular tone (iNO synthase, PGII synthase, endothelin), factors involved in coagulation (PAF acetyltransferase, tissue factor, PAI-1), immunocompetence factors (MHC) 1, CMH II). They are also receptors, expressed by the endothelium of the
  • the present invention aims to provide organs of transgenic non-human mammals capable of being transplanted in patients i s requiring an organ transplant, with reduction of the risk of graft rejection phenomenon, or even complete cancellation of this risk.
  • the present invention also aims to provide nucleotide sequences capable of being used for the genetic transformation of animals with a view to obtaining the above-mentioned organs.
  • the invention also aims to provide transgenic non-human mammals from which are likely to be removed the above organs.
  • the subject of the present invention is the use of nucleotide sequences coding for antibodies directed against any molecule involved in a graft rejection phenomenon (also referred to below as anti-molecule antibodies), and in particular against any molecule possessing such activity. that said molecule represents a xenoantigenic epitope, or participates in the biosynthesis of xenoantigenic epitopes in non-human mammalian cells (and more particularly on the surface of these cells), these epitopes being
  • nucleotide sequences used in the context of the present invention are advantageously those coding for antibodies directed against
  • cytokines and chemoattractors IL-1 , IL-6, IL-8, IP- 0 10, RANTES, MCP / JE, inhibitors pl5E, GM-CSF, G-CSF), adhesion molecules (ELAM-1, VCAM-1, ICAM-1, c-sis, GPlb ⁇ , vWF, ligand LAM- 1) transcription factors or modifying transcription (c-fos, NFkB, Gem), regulators of vascular tone (iNO synthase, PGH synthase, endothéhne) coagulation (PAF acetyltransferase. tissue factor 5, PAI-1), immunocompetence factors (MHC I, MHC II),
  • - membrane receptors for molecules present in the recipient the action of these molecules being directed towards transplant rejection, including, for example, C5aR, or TNF ⁇ R, or receptors for NK cells
  • the invention more particularly relates to the use of molecules 0 involved in a graft rejection phenomenon, as described above, for the implementation of a process for obtaining, in particular according to the methods described above.
  • nucleotide sequences coding for anticoips directed against the abovementioned molecules these nucleotide sequences themselves being capable of being used for the preparation of transgenic cells, j ", or of transgenic organs as defined above according to l 'invention
  • nucleotide sequences used in the context of the invention are obtained by selection of the above-mentioned anti-molecule antibodies to to know antibodies directed against the molecules implied in a phenomenon of graft rejection, this selection being carried out using said molecules used as target molecules recognized by said antibodies, and sequencing of the nucleotide sequences coding for said antibodies thus selected.
  • Said anti-molecule antibodies are themselves advantageously obtained from any hybridoma capable of being formed, by conventional methods, from spleen cells of an animal, in particular mouse or rat, immunized against one of said molecules involved in a
  • the DNA of the hybridomas thus selected is then cloned, according to the
  • Said anti-molecule antibodies can also be obtained by screening an antibody bank (such as the bank described in the article by
  • said antibody library being constructed from DNA sequences of human or murine immunoglobulins, or originating from another species, in a cellular host (in particular in phages) capable of expressing the antibodies encoded by said immunoglobulin DNA sequences.
  • the above-mentioned antibodies from which the nucleotide sequences used in the context of the present invention are deduced, are single-stranded antibodies (also designated ScFv antibodies).
  • ScFv antibodies can also be obtained by cloning complementary DNA (cDNA) derived from hybridomas, as described above, encoding for an immunoglobulin directed against one of said molecules involved in a graft rejection phenomenon, followed by treatment, as described above, so as to obtain single-stranded antibodies by joining all or part of the fraction of said coding cDNA for the heavy chain of the immunoglobulin with all or part of the fraction of said cDNA coding for the light chain of this immunoglobulin
  • cDNA complementary DNA
  • the nucleotide sequences used for the preparation of the abovementioned transgenic cells or organs are those coding for antibodies directed against any molecule involved in the biosynthesis of xenoantigenic epitopes in the cells of non-human mammals.
  • nucleotide sequences used in the context of the present invention are those coding for antibodies directed against at least one of the isoforms (and advantageously against all isoforms) of the galactosyltransferases present in non-human mammals, and more particularly against the at least one of the isoforms of ⁇ l, 3GT present in pigs, for the preparation of organs of transgenic non-human mammals in which the biosynthesis of the ⁇ -galactosyl epitopes in the cells of said organs is partially or totally inhibited.
  • the invention relates more particularly to the antibodies, if necessary single-stranded, directed against at least one of the isoforms of ⁇ l, 3GT, said antibodies being as obtained by using one of the methods described above performed using one or more isoforms of ⁇ l, 3GT, as molecules involved in a phenomenon ne of the transplant
  • the invention relates more particularly to the antibodies as described above, directed against at least one of the isoforms of ⁇ 1, 3GT present in pigs, and in particular against at least one of the isoforms represented by the sequences in amino acids SEQ ID NO 2 (corresponding to isotorm 1), SEQ ID NO 4 (corresponding to isoform 2), SEQ ID NO 6 (corresponding to isoform 3) and SEQ ID NO 8 (corresponding to isoform 4 ), these isoforms 1 d 4 being respectively coded by the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3. SEQ ID NO 5 and SEQ ID NO 7, or coded by any nucleotide sequences derived from the latter, in particular by degeneration of the genetic code
  • the invention relates more particularly to the antibodies as described above, directed against at least one of the isoforms 3 e (4 of the ⁇ l .3GT present in pigs and represented by the amino acid sequences SEQ ID NO 6 and SEQ ID NO 8.
  • the abovementioned anti- ⁇ 1, 3GT antibodies of the invention are single-stranded antibodies whose amino acid sequences are such that they contain the CDR1, CDR2 and CDR3 parts of the heavy chain of said linked anti- ⁇ 1, 3GT antibodies by a linker sequence (linker) of approximately 6 to approximately 36 amino acids, to all or part of the light chain V ⁇ 3 of the anti- ⁇ 1, 3GT antibodies mentioned above.
  • linker sequence linker
  • a particularly preferred linker is that consisting of three successive repetitions of the following acid sequence:
  • Specific antibodies according to the invention are those represented by the amino acid sequences SEQ ID NO 10 (antibody designated ScFv1), SEQ ID NO 12 (antibody designated ScFv2), SEQ ID NO 14 (antibody designated ScFv3), SEQ ID NO 16 (antibody designated ScFv4) and SEQ ID NO 18 (antibody designated ScFv1), SEQ ID NO 12 (antibody designated ScFv2), SEQ ID NO 14 (antibody designated ScFv3), SEQ ID NO 16 (antibody designated ScFv4) and SEQ ID NO 18 (antibody designated
  • ScFv5 or by any amino acid sequence derived therefrom, in particular by addition, deletion or substitution of one or more amino acids, or by any fragment of the above-mentioned sequences or of their derived sequences, said derived sequences and said fragments being likely to recognize at least one of the isoforms of ⁇ l, 3GT.
  • the subject of the invention is also the nucleotide sequences coding for an anti- ⁇ 1, 3GT antibody as described above, and comprising in particular the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO 9 (coding for ScFvl), SEQ ID NO 11 (coding for ScFv2), SEQ ID NO 13 (coding for ScFv3), SEQ ID NO 15 (coding for ScFv4), SEQ ID NO 17 (coding for
  • ScFv5 or any nucleotide sequence derived therefrom, in particular the sequences derived by degeneration of the genetic code, and nevertheless being capable of coding for the antibodies ScFvl, ScFv2, ScFv3.
  • ScFv4 or ScFv5 or the sequences derived by addition, deletion or substitution of one or more nucleotides, or any fragment of the above-mentioned nucleotide sequences or of their derived sequences, said derived sequences and said fragments being capable of coding for an antibody capable of recognizing at least one of the isoforms of ⁇ l, 3GT.
  • SEQ ID NO 9 SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13.
  • SEQ ID NO 15 and SEQ ID NO 17 above are advantageously obtained by sequencing the cDNAs encoding the antibodies represented by SEQ ID NO 10.
  • SEQ ID NO 12 SEQ ID NO 14.
  • SEQ ID NO 16 and SEQ ID NO 18 respectively, these cDNAs coming from cell clones selected for their capacity to produce said antibodies, the selection of said cell clones being carried out using isoform 2 of ⁇ 1, 3 GT (namely the polypeptide represented by SEQ ID NO 4) used as target molecule
  • said cell clones being themselves obtained by transformation of cells, in particular bacteria or phages. with nucleotide sequences originating from a cDNA library coding for antibodies, such as the aforementioned library described by Nissim et al, 1994, or from hybridomas obtained according to the technique indicated above.
  • the subject of the invention is also any vector, in particular plasmid, containing at least one of the nucleotide sequences described above according to the invention, in particular at least one of the sequences SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 or SEQ ID NO 17, and the elements
  • the invention also relates to any cellular host (such as a eukaryotic cell) containing at least one of the vectors as described above, according to the invention
  • the invention also relates to any non-human transgenic mammal, or any non-human transgenic mammal cell, comprising in their genome at least one nucleotide sequence described above, coding for anti-molecule antibodies as described above, and more particularly for the above-mentioned anti- ⁇ l, 3GT antibodies
  • the subject of the invention is more particularly any transgenic non-human mammal, or any transgenic mammalian cell, as described above, comprising in their genome at least one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 1 1.
  • non-human transgenic mammals according to the invention are as obtained by introduction, in particular by m ⁇ cro ⁇ n) ect ⁇ on, into a fertilized oocyte, of at least one nucleotide sequence such as
  • a subject of the invention is also any non-human transgenic mammal defined above, as produced by crossing transgenic animals expressing at least one nucleotide sequence as defined above, coding for an anti-molecule antibody, and more particularly at least one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 1 1, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 and SEQ ID NO 17, or their derived sequence or ⁇ o ti agment as defined above
  • non-human transgenic mammals according to the invention can be obtained according to the method described in the article by DePamphihs M L, et al, 1988
  • non-human transgenic mammals capable of being obtained within the framework of the present invention, mention may be made of the mouse, the rat. pork or rabbit
  • the subject of the invention is more particularly the transgenic pigs containing in their genome at least one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 0 15 and SEQ ID NO 17, or their derived sequence or fragment as defined above
  • the invention also relates to cells cultured from non-human transgenic animals as described above.
  • a subject of the invention is also the organs of non-human mammals, and more particularly the organs of pigs, in particular the rems, the liver, the pancreas or the heart, comprising in the genome of cells constituting them at least one nucleotide sequence such as defined above, coding for an anti-molecule antibody, and more particularly of at least one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 1 1, 30 SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 and SEQ ID NO 17, or their derived sequence or fragment as defined above, said organs being as obtained by removal from non-human transgenic mammals according to the invention
  • the invention also relates to any polypeptide comprising the amino acid sequence as represented by SEQ ID NO 6 (corresponding to
  • 35 isoform 3 of ⁇ l, 3GT) or SEQ ID NO 8 (corresponding to isoform 4 of ⁇ 1 .3GT), or any polypeptide containing any fragment of at least about 6 amino acids, of l 'one of the above amino acid sequences, said polypeptide containing this fragment being capable of generating antibodies recognizing at least one of the four isoforms of ⁇ 1, 3GT, or comprising any sequence derived from the latter, in particular by addition, deletion or modification of one or more amino acids, provided that the sequence
  • a subject of the invention is also the nucleotide sequences comprising the sequences represented by SEQ ID NO 5 and SEQ ID NO 7, or any derived sequences, in particular the sequences derived by degeneration
  • the invention also relates to any vector, in particular a plasmid, comprising at least one nucleotide sequence coding for the sequences represented by SEQ ID NO 5 or SEQ ID NO 6, or by a derived sequence
  • the invention also relates to any cell host transformed by a vector as described above, as well as any process for the preparation of isoforms 3 and
  • the invention also relates to any method, in particular surgical, of treatment of patients requiring a transplant of cells or organs, by implantation of said transgenic cells according to the invention in appropriate tissues of said patient, or pa removal of the defective organ from the patient and replacement of this defective organ with an organ ⁇ of a transgenic non-human mammal according to the invention
  • the pico organs were obtained from pigs of around 200 to 300 kg.
  • the enzymatic isolation and the culture of the pig aortic endotheal cells (PAEC) were carried out according to the method described in the article by Warren,
  • PAECs are stimulated with 100 U / ml of human TNF ⁇ (Genzyme,
  • oligonucleotide 5 5'-ATATACTAGTGGACTGGTTTAATC-3 'hybridizing to nucleotides 275 to 292 of the sequence SEQ ID NO 1, and introducing the same mutation of G26I into A as in the case of 1 Oligonucleotide 4,
  • oligonucleotide 6 5 '-GAGTC ACTTGTC ATCGTCGTCCTTGTAATCG ATGTTATTTCTA ACC ⁇ AATT-3' hybridizing to nucleotides 1105 to 1123 of the sequence SEQ ID NO 1, and added in phase to an oligonucleotide coding for a FLAG peptide (Kodak, New Haven, USA) codon stop and an Xhol site.
  • FLAG peptide Kodak, New Haven, USA
  • a 2 kb ⁇ 1, 3GT cDNA clone (pCDNA- ⁇ GT) was isolated from a cDNA library constructed in the vector pCDNA-1 (Invitrogen, Leek, The Netherlands) by transfer hybridization using a probe PCR amplified with primers 1 and 2 (derived from the sequence published in the article by Sandrin et al., 1994. This clone corresponds to that of isoform No. 2.
  • the isoforms 1, 3 and 4 of porcine ⁇ 1, 3GT were isolated by PCR amplification of a region comprising exons 4 to 7 with primers 1 and 2, using retro-transcribed TARN of the PAECs.
  • the amplified fragments are treated with Klenow polymerase to obtain blunt ends, and cloned into the SmaI site of the plasmid pUC18.
  • Three clones containing fragments of 300, 237 and 201 bp were obtained and used as a template to introduce, by secondary PCR amplification, an EcoRI site at the 5 ′ end (with oligo 3) and a Spel site in exon 7 (with oligo 4). The introduction of this Spel site does not modify the amino acid sequence.
  • PCR products were ligated into a plasmid pKS digested with EcoRI-Spel.
  • the remaining 3 'part of the coding sequence was amplified by PCR from the pCDNA- ⁇ GT clone with primers 5 and 6, treated to obtain ends. blunt and cloned into the EcoRV site of a plasmid pKS.
  • a Spel fragment carrying the coding region of nucleotide 262 to 1,125, in phase with a FLAG sequence (contained in oligonucleotide 6). was isolated and cloned into the Spel sites of the pKS plasmids containing the
  • HeLa cells cultured in RPMI - 10% FCS were treated with 15 trypsin, resuspended at a rate of 5.10 ⁇ cells / ml in ice-cold medium and mixed with 20 ⁇ g / ml of plasmid DNA carrying the transgene and a resistance gene neomycin.
  • the cells were treated by electroporation at 250 V, 350 ⁇ F, left in ice for 10 min and seeded at the rate of 2000 cells / cm ⁇ . After 24 h, 500 ⁇ g / ml G418 were added and the 0 cells were cultured for two weeks. The clones were isolated and cultured in the presence of G418.
  • the filters were pre-hyb ⁇ dés for 6 h in a solution containing 50% formamide, 5 X SSPE (0, 18 M NaCl, 10 mM sodium phosphate, pH 7.7, 1 mM EDTA), 5 X Denhart's, 0.5% SDS, and 100 ⁇ g / ml of denatured salmon sperm DNA RNA bound to membranes has been hybridized with cDNA probes labeled with 32 - corresponding to the coding region of isoform 1 of ⁇ l, 3 GT, to ⁇ -actin poicin or to 28S RNA.
  • the hybridization was carried out overnight at 42 ° C. in a pre-hybridization solution containing 10 ⁇ cpm / ml of a probe.
  • the filters were washed twice in 2 ⁇ SSPE, 0.5% SDS at temperature. ambient for 15 min, and three times in 0.5 X SSPE, 0.5% SDS at 65 ° C
  • RNA pig or cell in 30 T7.
  • the antisense RNA probes were synthesized and 32 p rjUTP was incorporated
  • the plasmid template DNA was digested with DNAase I. and 500,000 cp of each probe were hybridized for 16 h to 10 ⁇ g of total RNA pig or cell in 30 ⁇ l of hybridization buffer containing 80% formamide, at 50 ° C.
  • the control samples contain 10 ⁇ g
  • a porcine cDNA expression library constructed using the LLC-PK1 RNA was screened using a probe corresponding to the 5 'end of the coding sequence
  • This ⁇ l, 3 GT corresponds to isoform 2 represented by SEQ ID NO 4 and coded by the sequence SEQ ID NO 3
  • This pcDNA- ⁇ GT clone contains a 3 'non ii translated region 770 bp long, a coding region of 1080 bp containing the porcine counterparts of what has been defined in the case of the mouse as being exons 4, and 6 to 9 (Joziasse et al, 1992) and a 5 'untranslated region of 150 bp Using primers adjacent to exons 4 and 7, PCR amplification of the DNA of the
  • isoform 3 namely the isoform represented by SEQ ID NO6 coded by the sequence SEQ ID N05 , does not have a 63 bp segment from nucleotide 1 17 to nucleotide 179 and the last product, isoform 4, namely the isoform represented by SEQ ID NO6
  • exons 5 and 6 determines four length variations in the stem region of ⁇ 1, 3GT. This region, located inside the Golgi apparatus, links the transmembrane anchor signal to the catalytically active luminal domain.
  • human HeLa cells were transformed with recombinant plasmids expressing each of the four isoforms of porcine ⁇ 1, 3GT under the control of the promoter. CMV. The product of this enzyme on the cell surfaces was analyzed by immunofluorescence, using the lectin IB-4 reacting specifically with the Gala residues.
  • the Gala epitope could be detected on the surface of HeLa cells translated with the four isoforms of the enzyme, as shown by the binding to the lectin IB-4 (Fig. 2), indicating that these isoenzymes all have ⁇ - activity. galactosyltransferase.
  • the expression levels of ⁇ 1, 3GT mRNAs in clones IIeLa- ⁇ l, 3GT from pigs were checked by Northern blot, and are slightly higher in the clones containing isoforms 1 and 2, and slightly lower for the clone containing isoforms 2 and 3, compared to the level found in the PAECs.
  • the Golgian localization of ⁇ 1, 3GT is due to the presence in exon 4 of an anchor signal domain. Variations in length in the stem region, i.e. the presence or absence of exons 5 and 6, can also influence retention in the Golgi (Dahdal et al., 1993) or exhibit a cleavage site sensitive to proteases on certain isoforms (Weinstein et al., 1987;
  • the four expression vectors based on the CMV described above express the isoforms ⁇ 1, 3 GT with a FLAG marker fused at the C-terminal end which makes it possible to detect the protein by indirect immunofluorescence in HeLa cells transfected with a anti-FLAG antibody As observed by fluorescence microscopy, the four isoforms are similarly located and form a compact luxtanuclear structure corresponding to that of the Golgi apparatus (Roth and Bergei, 1982) Surprisingly, while 100% cells express the enzyme, as demonstrated by uniform staining obtained with lectin IB4, the enzyme is not detectable on all of these cells using the anti-FLAG antibody This may be due to regular u expression of the enzyme associated with limited sensitivity of the antibody, or reorganization of the Golgi apparatus during the cell cycle
  • Gal ⁇ l, 3Gal epitope, resulting from the activity of ⁇ l, 3GT, is not homogeneously expressed in pig tissues (O ⁇ ol et al, 1993)
  • the level of transc ⁇ pts ⁇ 1, 3GT was studied by Northern blot, and the distribution of isoforms was studied by RNase protection test
  • RNA species The expression of the isoforms of ⁇ 1, 3GT was analyzed by an ARNase protection test in pig tissues Two antisense probes radiolabelled were used to analyze the four identified RNA species.
  • probe 1 with mRNA encoding isoform 2 leads to an 87 bp fragment delimited by nucleotides - 7 to 80, and a larger 150 bp fragment delimited by nucleotides 117 to 266.
  • L probe 1 with mRNA encoding isoform 2 leads to an 87 bp fragment delimited by nucleotides - 7 to 80, and a larger 150 bp fragment delimited by nucleotides 117 to 266.
  • the mRNA coding for isoform 3 leads to a 123 bp fragment delimited by nucleotides - 7 to 116 and a smaller 87 bp fragment delimited by nucleotides 180 to 266.
  • Hybridization of probe 1 with the 1, 3 GT isoform 4 mRNA leads to two 87 bp fragments bounded by nucleotides - 7 to 80 and nucleotides 180 to 266.
  • the second probe, probe 4 is a
  • the probe fragments protected by the mRNAs encoding isoforms 1, 2 and 3 are those of 273, 150 and 123 bp, respectively, the protected probe 4
  • isoform 4 20 by mRNA encoding isoform 4 leads to a band of 174 bp.
  • the distribution of transcription products differs from one tissue to another: in the kidney, isoform 3 alone is expressed, while in the ovaries, only isoform 4 is expressed. Isoforms 1 and 2 are found in the heart, lungs and spleen, while isoforms 2 and 4 are found in the liver.
  • 25 endothelial cells express isoforms 1, 2 and 4. In the thymus, the 4 isoforms can be observed.
  • the cDNA library originates from porcine epithelial cells LLC-PKl. It is constructed in the vector pCDNA-1.
  • the bacterial strains used are E coli-TGl sup E, E col ⁇ -XL-1, SURE, M15, MC 1061 / P3, and DH5 ⁇
  • the prokaryotic expression plasmid pQE-30 comes from Qiagen
  • the eukaryotic expiession plasmid pCDAAS-9 contains a gene for resistance to neomycin and causes the transcription of cDNA which it carries under the control of the promoter of the cytomegalovirus
  • the library of human immunoglobulins ScFv is constructed in the plasmid pHEN-1 and was used as described in the article of I Nissim et al, 1994 The preparation of recombinant folds is also described
  • the production and purification system of the recombinant ⁇ 1, 3GT comes from Qiagen Transcription was induced by culture of the E ⁇ ? // - M 15 transformed by the cDNA of the enzyme with 2mM IPTG, for 5 hours
  • La recombinant protein in the cell lysate was alois purified on an ion exchange column, under denaturing conditions
  • the purified protein was dialyzed in PBS and stored at -20 ° C. until its use
  • the cells were labeled with isolectin B4 from Bandeiraea sunplicifoha labeled with fluorescein (IB-4-FITC, Sigma), a lectin specific for ⁇ -galactose structures.
  • IB-4-FITC fluorescein
  • the cells were washed at 4 ° C in PBS-2% BSA, incubated at 4 ° C for 30 min with 20 ⁇ g / ml IB-4-FITC, rewashed 3 times and analyzed by cytofluorometry using a FACS-can (Becton Dickinson)
  • sequence reactions were carried out with D-taq (Ameisham), using as primers two oligonucleotides located in the 5 'part of the V ⁇ 3 Ohgo 1 segment, allowing the reading of the 5' part of the 5 'cDNA -
  • pig 3GT was amplified by RT-PCR from RNA from porcine aortic endotheleic cells This fragment served as a probe for the cloning of whole cDNA in a pig epithelial cell bank expressed in E Coli MCI 061 P3, in the plasmid pCDNA-1
  • the isolated clone measures approximately 2Kb.
  • the isolated poic cDNA is functional because it confers ⁇ l, 3GT activity on Cos cells, naturally devoid of this activity, after transfection This activity can be demonstrated by the acquisition of reactivity with the isolect B4 from Bandeiraea ⁇ o simplicifoha, specifically marking the ⁇ -galactosylated residues
  • the coding part of the ⁇ 1, 3GT was subcloned by PCR into the prokaryotic expression vector pQE30 (Quiagen), in fusion in 5 'with a tail
  • the human immunoglobulin (Ig) library consists of 50 sequences of variable parts of heavy chains of Ig in germinal configuration, associated with a peptide containing from 4 to 12 random amino acids,
  • the phages which can be derived from these plasmids therefore express a fragment (ScFv) of functional Ig in fusion with an envelope protein, and behave, in terms of their recognition properties.
  • the selected anti- ⁇ l, 3GT ScFv clones were sequenced to ensure that errors were not introduced during subcloning by PCR and to determine the heavy genomic chain-random peptide associations (from 4 to 12 amino acids) - light chain V ⁇ 3 which produce a reactive antibody against ⁇ l, 3GT Of the six sequences analyzed, two are identical (n ° 2 and 6), and two differ only by two amino acids in the CDR3 part (n ° 1 and 5) sequence no.
  • sequence of the clone ScFv2 and that of the clone ScFv6 correspond to the sequence represented by SEQ ID NO 1
  • sequence of the clone ScFv3 corresponds to the sequence represented by SEQ ID NO 13
  • sequence of the clone ScFv4 corresponds to the sequence represented by SEQ ID NO 1
  • sequence of the ScFv5 clone corresponds to the sequence represented by SEQ ID NO 17 Board
  • VH sequences of genomic origin and CDR3 of synthetic antibodies specific for porcine ⁇ 1, 3GT The nucleotide sequences of the ScFv clones selected in ELISA for their affinity against porcine ⁇ 1, 3GT were carried out.
  • the table shows the sequences of the third regions of antibody complementarity (CDR3).
  • CDR3 third regions of antibody complementarity
  • the presence of the xenoantigenic epitope ⁇ -galactosyl was evaluated by immunofluorescence with the lectin IB4-FITC (specific for galactose connected in ⁇ configuration), in comparison with the same cells, not transfected.
  • the results show that the ScFv antibody No. 2 (namely that represented by SEQ ID NO 12) encoding the VH DP-5 sequence, associated with an artificial CD3 part composed of the amino acids PEIDQ, linked to the V ⁇ 3 sequence, without the addition of signal and golgian retention sequences, when expressed in a cell pork, causes up to 95% decrease in the expression of galactose branched in ⁇ configuration.
  • the average fluorescence of LLC-PKl cells is 465 units when labeling is carried out with 20 ⁇ g / ml IB-4 FITC. and it drops to 49 units for the LLC-PKl -ScFv ⁇ clone.
  • the coding part of the ⁇ 1, 3GT, isoform No. 2 was subcloned by PCR into the prokaryotic expression vector pQE30 (Quiagen), fused in 5 'with a tail of six histidines used for the purification of the recombinant protein on a charged matrix (Ni-NTA).
  • the clone thus obtained was completely sequenced to ensure the absence of mutations with respect to the starting clone, which could have been introduced during the PCR amplification.
  • the plasmid pQE30- ⁇ l, 3GT was introduced into E. Coli M15 and the recombinant protein produced in vitro by induction of transcription at IPTG.
  • the ⁇ l, 3GT was dialyzed in PBS and injected into a BALB / C mouse at the rate of 3 injections of 40 ⁇ g each every 15 days. Splenic lymphocytes were collected and fused with the mouse hybridoma SP2-0.
  • the selection of hybridomas secreting an immunoglobulin recognizing the ⁇ 1, 3GT was carried out by ELISA test: microtitration plates were glazed with lOmicrog / ml of protein ⁇ 1, recombinant 3GT, 16 h at 4 ° C. at pH 9.5. then saturated for 2 h, 37 ° C. with PBS-BSA1%, Tween 20 0.5%.
  • hybridomas were incubated for 1 h, 37 ° C. and the immunoabsorbed antibodies revealed at using an anti-Ig labeled with peroxidase. Hybridomas providing an optical density at least three times greater than the background noise were retained.
  • RNA is prepared from 5x10 ⁇ hybridoma cells, and messenger RNA is selected on oligo (dT) -cellulose.
  • a first strand of cDNA is synthesized as follows: 10 ⁇ g of mRNA are incubated with 20 pmol of the VHI FOR or VKIFOR oligos
  • VK1BACK (Clackson et al., 1991), 250 ⁇ M of each dNTP, 67 mM Tris.HCl (pH 8.8), 17 mM (NH 4 ) 2 S0, 10 mM MgCl 2 , and 2 units of Taq polymerase, for 30 amplification cycles.
  • the fragments obtained are then purified and 1 ⁇ g of each is mixed with 300 ng of linker (g! Y4Ser) 3, and amplified by 7 cycles of PCR intended to link the fragments.
  • the linked VH and VL fragments are then amplified in 20 cycles with the VH1BACK and VK4FOR oligos.
  • the fragments obtained are then re-amplified with the VHIBACK-BamHI and VK4FOR-BamHI oligos, digested with BamHI and cloned in the eukaryotic expression vector PCDAAS, under the control of the CMV promoter.
  • transgenesis in rats is particularly suitable because its organs can be transplanted in monkeys, where they undergo rejection similar to rejection of xenograft in the pig-primate model.
  • pigs are the animal of choice.
  • the unicellular stage embryos are obtained after a super-ovulation protocol applied to CD strain rats aged 28 to 38 days (Amstrong and Opavoky, 1988). This protocol makes it possible to regularly obtain an average of 40 to 50 embryos per female.
  • the construct carrying the cDNA coding for the anti- ⁇ 1 antibody, 3GT (two examples of constructs which can be used are shown in FIGS. 4 and 5) is injected at the rate of a few thousand copies per embryo.
  • the treated embryos are then reimplanted in the matrix
  • the rats from these embryos are then tested to select the animals that have effectively incorporated tiansgenic DNA into their genome. These tests are carried out at the level of DNA and RNA, which can be detected by hybridization with a DNA probe corresponding to the transgene, * .
  • the detection of the ScFv protein can be carried out by leaction with an anti-human Fab antibody, or by an anti-epitope antibody, if the ScFv cDNA is in fusion with a cDNA coding for a peptide carrying this epitope
  • Pronuclearized fertilized embryos are obtained by laparotomy from the oviducts of mature sows aged 7 to 10 months, 50 hours after the induction of superovulation and 20 to 26 hours after insemination
  • the Pronucleus, into which is injected l DNA is visualized by cent ⁇ fugation of the oocyte at 15000 g for 3 minutes
  • the results after reimplantation of oocytes treated in this way show that 10% of them develop and give an animal, and that 15% of between them incorporated transgenic DNA, ie 1.5% of the treated oocytes. Of these animals positive for DNA integration, 67% actually express the protein 0 corresponding to the transgene (White et al., 1994, Cozzi and White, 1995)
  • the results of FIG. 6 show a significant decrease in the expression of the expression of the sugar Gal ⁇ l, 3GaI of the order of 30 to 40%.
  • Total cell lysates from the CL-1 porcine cell clones presented in FIG. 7 (expressing sequences coding for anti- ⁇ 1, 3GT ScFvs with or without the KDEL retention sequence in the endoplasmic reticulum) were analyzed by a biochemical technique specifically measuring the activity of the enzyme ⁇ 1, 3GT (Cho et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 3238).
  • the results are expressed as mean +/- SD of the activity percentages relative to those obtained from LLC-PKI cells not transfected. They show a significant decrease in enzymatic activity of the order of 40 to 60% when anti- ⁇ 1 ScFv sequences, 3GT ScFv-1 or ScFv-2, if appropriate associated with the sequence coding for KDEL. are expressed.
  • Gal ⁇ l 3Gal of 31% compared to the starting cells was observed in the cells expressing the vector.
  • Gal ⁇ l 3Gal of 31% compared to the starting cells was observed in the cells expressing the vector.
  • the expression in pig cells of the nucleotide sequences SEQ ID NO 9 and SEQ ID NO 1 1 leads to a significant decrease in the enzymatic activity ⁇ l, 3GT and a significant decrease in the presence of the sugar GaI ⁇ l, 3Gal to cell surface. This reduction is sufficient to bring about a very significant protection with respect to the lysis induced by the human complement.
  • the cDNAs of isoforms 1, 3 and 4 were cloned from retrotranscripts mRNA and amplified by PCR originating from PAEC and the cDNA corresponding to isoform 2 was cloned from an LLC-pKl library, as described above.
  • the nucleotide sequence was determined by using Sequenase (USB), and compared ⁇ o by control with the sequences corresponding to isoforms 1 and 2 described by
  • the cytoplasmic tail black box
  • the transmembrane region box with vertical lines
  • Exons 5 and 6 are spliced alternately in mice and pigs.
  • the catalytic domain is coded by exons 7, 8 and 9.
  • the 15 positive supernatants (numbered 1 to 15) are shown on the abscissa in the figure.
  • the negative control (-) consists of a blank and the positive control (+) by measuring the optical density obtained by the reaction of a phage M13 (Pharmacia) on a lgG of anti-phage mouse M13 (Pharmacia) deposited on the negative control (-) consists of a blank and the positive control (+) by measuring the optical density obtained by the reaction of a phage M13 (Pharmacia) on a lgG of anti-phage mouse M13 (Pharmacia) deposited on the
  • Reactivity measured by ELISA of purified phages corresponding to 6 clones recognizing the protein ⁇ 1, 3GT The six most positive clones in the above ELISA (FIG. 2) were amplified in order to prepare purified phages. The purified and concentrated phages were re-tested by ELISA, similar to what is described in FIG. 2. These phages were tested at a dilution of 1 to 1/8. The dilutions carried out are represented on the abscissa, and the optical density (OD) measured is indicated on the ordinate, the curve corresponding to the positive control passes through points represented by crosses, that
  • IO corresponding to the phage containing ScFvl passes through points represented by a black point in the center of white squares, that corresponding to the phage containing ScFv2 (M13-ScFv2) passes through points represented by black diamonds, that corresponding to the phage containing ScFv3 (M13-ScFv3) passes through points represented by points represented by a white point at
  • ScFv4 passes through points represented by white diamonds, that corresponding to the phage containing ScFv5 (M13-ScFv5) passes through points represented by black squares, that corresponding to the phage containing ScFv6 (M 13-ScFv6) passes through points represented by white squares, white 0 being represented by a black circle.
  • This example of construction consists in the use of the MHC-1 promoter of mouse H-2Kb, allowing the insertion of the transgene (cDNA ScFv; 5 0.7Kb) between the promoter part proper (promoter H-2kb; 4Kb) and a series of introns / exons (5.5 Kb) belonging to the H-2Kb gene, this series being followed by pA SV40 of 0.3 Kb.
  • These introns contain regulatory sequences making it possible to obtain good promoter activity, and therefore good expression of the transgene.
  • the H-2Kb promoter allows a constitutive and ubiquitous expression of the cDNA whose expression it controls (Kimura et al., 1986; Byrne et al., 1995).
  • This construction example consists of the use of the DAF minigene
  • ScFv (0.7 Kb) under the control of the promoter of the DAF, itself controlled by intronic sequences (the set consisting of the DAF promoter, the exons and the introns representing 4.6 Kb), the ScFv cDNA being followed by pA SV40 of 0.3 Kb
  • This figure represents the flow cytometry analysis (FACscan) of the recognition of the Gal ⁇ l, 3Gal epitopes by the lectin IB4-FITC, in comparison with LLC-PKl cells not transfected.
  • the results are average percentages +/- SD of fluorescence compared to the fluoiescenee obtained from the non-transfected LLC-PKl n number of independent clones analyzed by group, ScFv-neg untransfected LLC PKI cells, ScFv-1 LLC-PKl cells transfected with the clone ScFv-1, ScF ⁇ - 2/6 LLC-PKl cells transfected with the clone ScFv-2 or ScFv-6 the fluorescence assays are indicated on the ordinate
  • Figure 8 Measurement of lysis by the complement of LLC-PKl cells transfected or not transfected with anti- ⁇ l, 3GT ScFv sequences, and incubated with human serum containing natural xenoantibodies the serum dilutions are indicated on the abscissa, and the percentage of cytotoxicity on the ordinate (average of two independent experiments), hollow squares LLC-PKl cells not transfected. cai res full LLC-PKl cells transfected with a control plasmid, hollow circles LLC-PKl cells expressing the ScFv corresponding to the sequence SEQ
  • HDAF accelerating factor
  • Phenotypic knock out of the high-affinity interleukin 2 receptor by intracellular single-chain antibodies against the alpha subunit of the receptor Proc. Natl. Acad. U. S. A. 92, 3137-3141 (1995).
  • ATC TCC AGG ATG CCT TTG ATA GAG CTG GGT CCT CTG CGC TCC TTT AAA 576 Ile Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys 180 185 190
  • TTC CAA AAC AAC TTT GGG GTG GAG ACC CTG GGC CAG TCG GTG GCT CAG 720 Phe Gin Asn Asn Phe Gly Val Glu Thr Leu Gly Gin Ser Val Ala Gin 225 230 235 240
  • Tyr Tyr His Ala Ala lie Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gin Val Leu Asn 275 280 285
  • GCA GCC TAC ATT CCG TTT GGC CAG GGG GAT TTT TAT TAC CAC GCA GCC 768 Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gin Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala 245 250 255
  • AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGC 576 Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 180 185 190
  • GCA AGA CCT GAG ATT GAT CAG TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTG 336 Ala Arg Pro Glu Ile Asp Gin Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110
  • GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC 576 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 180 185 190 AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA 624
  • ATC TAT GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT 528 Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 165 170 175

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans un phénomène de rejet de greffe (encore désignés ci-après anticorps anti-molécules), pour la préparation de cellules transgéniques, ou organes transgéniques, de mammifères non humains, au sein desquels lesdites molécules forment en totalité ou en partie des complexes immuns avec lesdits anticorps anti-molécules, de telle sorte que l'activité desdites molécules dans les phénomènes de rejet de greffe soit totalement ou partiellement inhibée, lesdites cellules ou lesdits organes transgéniques de mammifères non humains étant destinés à être greffés chez un patient.

Description

PROCEDE DE PREPARATION D'ORGANES DE MAMMIFERES NON HUMAINS TRANSGENIQUES EN VUE DE LEUR TRANSPLANTATION CHEZ L'HOMME, ET SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES POUR LA MISE EN OEUVRE DE CE PROCEDE
La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation d'organes de mammifères non humains transgéniques susceptibles d'être greffés chez l 'homme en réduisant sensiblement les risques de rejet de greffes.
La transplantation d'organes animaux chez l'homme, ou xénotransplantation, est une technique considérée actuellement comme une alternative possible, permettant de pallier le manque crucial de donneur en allogreffe. Des avancées spectaculaires dans ce domaine ont été réalisées depuis quelques années, et le porc comme animal donneur s'impose à la communauté scientifique et médicale. Les raisons de ce choix, par opposition au choix de primates comme donneurs d'organes sont multiples: le risque de transmission de virus pathogènes pour l'homme est bien moindre à partir du porc (Allan, 1996), l'élevage et le temps de reproduction des primates, à l'opposé du porc, rend leur utilisation difficile, et une barrière d'ordre éthique non négligeable existe pour l 'utilisation de singes à des fins de médecine humaine. L'obstacle majeur à l'utilisation de greffons de porc chez l'homme est avant tout immunologique: l'homme possède des anticorps naturels (appelés xénoanticorps naturels-XAN-) dirigés contre des molécules exprimées par les cellules porcines. Lorsqu'un organe de porc est greffé chez l'homme (et chez les primates supérieurs qui possèdent aussi ces anticorps), ces anticorps réagissent avec l'endothélium vasculaire entraînant un rejet suraigu de l'organe. Il s'agit en fait de la perte, induite par les XAN et le complément, de l'intégrité de l 'endothélium vasculaire entraînant un oedème, une infiltration cellulaire et une destruction de l'organe (Bach et al . , 1995). Les antigènes porcins reconnus par les XAN ont été analysés: il s'agit majoritairement d'une structure glucidique constituée de galactose branché en configuration αl ,3 sur le N-acétyllactosamine (épitope α- galactosyl) présent sur les glycolipides et les glycoprotéines de membrane
(Sandrin et al. , 1993). Les travaux réalisés par l'équipe de D White (Cambridge) ont permis de résoudre partiellement ce problème de rejet hyperaigu en bloquant l'activation du complément humain à la surface des cellules de l'endothélium porcin (Caπ mgton et al, 1995), ils sont parvenus à réaliser des greffes de coeur de
*> poic chez le macaque, dont la survie semble similaire a la survie d'une allogreffe (greffe d'un organe de la même espèce) réalisée dans les mêmes conditions, dans la mesure où le dépôt de XAN n'est pas ti op massif Techniquement, cela a ete réalisé par insertion, par transgenese germmale, d'une molécule régulatrice du complément humain, le DAF* (pour decay 0 acceleratmg factor, ou CD55), dans le génome de porc Cette molécule, spécifique d'espèce, empêche la C3 convertase humaine d'enclenchei la reaction en chaîne d'activation du complément à la surface des cellules porcines Cette molécule semble toutefois " dépassée " lorsque la quantité de complément fixée est trop importante Dans ce cas, un rejet survient quand même 5 La présence des épitopes α-galactosyl, le xenoantigene majeur sur les cellules porcines, est due à l'action d'une enzyme golgienne, UDP-Gal Galαl 4GlcNacαl,3-galactosyltransférase (encore désignée enzyme αl ,3GT) L'enzyme αl ,3GT participe à la fixation de galactose, en configuration αl ,3, sur le galactose du N-acétyllactosamme des glycoprotéines et glycohpides 0 membranaires, ce qui crée un épitope xenoantigénique appelé α-galactosyl constitué de l'ensemble Gal l ,3Gal-N-acétyllactosamιne L' inactivation du gène codant pour cette enzyme chez le porc pourrait bloquei la synthèse des épitopes α-galactosyl et induirait la non reconnaissance des cellules de porc par les XAN humains Cette inactivation, utilisée conjointement à l'expression de DΛF 5 humain chez le porc, pourrait représenter un bénéfice décisif pour la réussite de la xénogreffe d'organes de porc chez l'homme Cependant, l' inactivation d'un gène par recombinaison homologue ("gène noc out") est une technique dont l'utilisation est actuellement restreinte à la souris, car sa mise en oeuvre nécessite la disponibilité de cellules souches embryonnaires, dites cellules ES 0 Ces cellules, malgré d'intenses recherches, n'ont jamais pu être obtenues chez une autre espèce que la souris L'inactivation de l'αl ,3Gl chez le porc ne peut donc pas être réalisée par cette technique
A part les molécules xénoantigeniques et les molécules participant a la biosynthese de ces dernières, il existe d'autres molécules dont l' inhibition
" 5 pourrait être utile en xénotransplantation, en pai ticuhei les molécules dont l'activité biologique concourt au rejet de greffe, sans que ces molécules ne soient des xenoantigenes ou ne participent à la synthèse de xenoantigenes II s' agit notamment de l'ensemble des molécules à caractère inflammatoire produites par l 'endothélium du greffon, en particulier lors d'une xénogreffe : cytokmes (IL- 1 , IL-6), facteurs chémotactiques (IL-8. IP- 10, RANTES, MCP/JE, inhibiteurs pl5E, GFM-CSF, G-CSF), molécules d'adhésion (ELAM-1 , VCAM-1 , ICAM-1 , c-sis, GPlbα, vWF, ligand LAM-1 ), facteurs de transcription (c-fos, NFkB, Gem), régulateurs du tonus vasculaire (iNO synthase, PGII synthase, endothéline), facteurs intervenant dans la coagulation (PAF acétyltransférase, facteur tissulaire, PAI-1), facteurs d' immunocompétence (CMH 1, CMH II). Il s'agit aussi des récepteurs, exprimés par l 'endothélium du
10 greffon, à des molécules provenant du receveur et ayant une activité biologique concourant au rejet de greffe : récepteur au C5a, récepteur au TNFα, récepteur à l' INFγ, récepteurs aux cellules NK.
La présente invention a pour but de fournir des organes de mammifères non humains transgéniques susceptibles d'être greffés chez des patients i s nécessitant une greffe d'organes, avec diminution du risque de phénomène de rejet du greffon, voire complète annulation de ce risque.
La présente invention a également pour but de fournir des séquences nucléotidiques susceptibles d'être utilisées pour la transformation génétique d'animaux en vue d'obtenir les susdits organes. 0 L' invention a également pour but de fournir des mammifères non humains transgéniques à partir desquels sont susceptibles d'être prélevés les susdits organes.
La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans un 5 phénomène de rejet de greffe (encore désignés ci-après anticorps anti- molécules), et notamment contre toute molécule possédant une activité telle que ladite molécule représente un épitope xénoantigénique, ou participe à la biosynthèse d'épitopes xénoantigéniques dans des cellules de mammifères non humains (et plus particulièrement à la surface de ces cellules), ces épitopes étant
30 susceptibles d'être reconnus par des xénoanticorps naturels humains lorsque lesdites cellules, ou organes constitués de ces cellules, de mammifères non humains, sont greffés chez l'homme, pour la préparation de cellules transgéniques, ou organes transgéniques, de mammifères non humains, au sein desquels lesdites molécules forment en totalité ou en partie des complexes
35 immuns avec lesdits anticorps anti-molécules, de telle sorte que l 'activité desdites molécules dans les phénomènes de rejet de greffe soit totalement ou partiellement inhibée, en particulier que les xénoanticorps susmentionnés ne teconnaissent plus, en totalité ou en partie, les susdits épitopes, ou au sein desquels la biosynthèse desdits épitopes xenoantigeniques est partiellement ou totalement inhibée, lesdites cellules ou lesdits organes transgéniques de mammifères non humains étant destinés à être greffés chez un patient Les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de la présente invention sont avantageusement celles codant pour des anticorps dirigés contre
- tout épitope xénoantigénique, glucidique ou non glucidique, reconnu par des xénoanticorps humains, et plus particulièrement les épitopes glucidiques galactosylés situés à la surface des membranes de cellules de mammifères non 0 humains, notamment l'épitope α-galactosyl présent à la surface de cellules de porc et constitué de l'ensemble Galαl ,3Gal-N-acétyllactosamιne susmentionné,
- toute molécule participant à la biosynthèse d'épitopes xenoantigeniques chez l'homme, de nature glucidique ou non glucidique, et plus particulièrement les galactosyltransférases présentes dans les cellules de mammifères non humains, notamment l'enzyme αl,3GT présente dans les cellules de porc,
- toute molécule à caractère inflammatoire synthétisée dans l'endothélium de mammifères non humains, et dont l'activité biologique conduit notamment à la modification des propriétés anticoagulantes de l'endothélium in vivo en milieu xénogénique, telle que les cytokines et chemoattracteurs (IL-1 , IL-6, IL-8, IP- 0 10, RANTES, MCP/JE, inhibiteurs pl5E, GM-CSF, G-CSF), les molécules d'adhésion (ELAM-1 , VCAM-1 , ICAM-1 , c-sis, GPlbα, vWF, ligand LAM- 1 ) les facteurs de transcription ou modifiant la transcription (c-fos, NFkB, Gem), les régulateurs du tonus vasculaire (iNO synthase, PGH synthase, endothéhne), les facteurs intervenant dans la coagulation (PAF acétyltransférase. facteui 5 tissulaire, PAI-1), les facteurs d'immunocompétence (CMH I, CMH II),
- les récepteurs membranaires à des molécules présentes chez le receveur, l'action de ces molécules étant dirigée vers un rejet de greffe, dont par exemple le C5aR, ou le TNFαR, ou les récepteurs aux cellules NK
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de molécules 0 impliquées dans un phénomène de rejet de greffe, telles que décrites ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'un procédé d'obtention, notamment selon les méthodes décrites ci-dessous, de séquences nucléotidiques codant pour des anticoips dirigés contre les susdites molécules, ces séquences nucléotidiques étant elles- mêmes susceptibles d'être utilisées pour la préparation de cellules transgéniques, j", ou d'organes transgéniques tels que définis ci-dessus selon l'invention
Avantageusement, les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de l' invention sont obtenues par sélection des susdits anticorps anti-molecules à savoir des anticorps dirigés contre les molécules impliquées dans un phénomène de rejet de greffe, cette sélection étant effectuée à l 'aide desdites molécules utilisées en tant que molécules cibles reconnues par lesdits anticorps, et séquençage des séquences nucléotidiques codant pour lesdits anticorps ainsi 5 sélectionnés.
Lesdits anticorps anti-molécules sont eux-mêmes avantageusement obtenus à partir de tout hybridome susceptible d'être formé, par des méthodes classiques, à partir de cellules spléniques d'un animal, notamment de souris ou de rat, immunisés contre l'une desdites molécules impliquées dans un
I O phénomène de rejet de greffe, d'une part, et des cellules d'un myélome approprié d'autre part, ledit hybridome étant sélectionné par sa capacité à produire des anticorps monoclonaux reconnaissant ladite molécule initialement mise en oeuvre pour l'immunisation des animaux.
L'ADN des hybridomes ainsi sélectionné est ensuite clone, selon les
15 techniques bien connues de l'homme de métier, dans des hôtes cellulaires susceptibles de produire lesdits anticorps monoclonaux, les séquences nucléotidiques codant pour lesdits anticorps ainsi sélectionnés, étant ensuite séquencées.
Lesdits anticorps anti-molécules peuvent également être obtenus par 0 criblage d'une banque d'anticorps (telle que la banque décrite dans l'article de
Nissim et al. , 1994) avec lesdites molécules, ladite banque d'anticorps étant construite à partir de séquences d'ADN d'immunoglobulines humaines ou murines, ou issues d'une autre espèce, dans un hôte cellulaire (notamment dans des phages) susceptibles d'exprimer les anticorps codés par lesdites séquences 5 d'ADN d' immunoglobulines.
Avantageusement, les anticorps susmentionnés, à partir desquels sont déduites les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de la présente invention sont des anticorps simple brin (encore désignés anticorps ScFv).
Ces anticorps ScFv sont avantageusement obtenus à partir d'une banque
30 d'anticorps telle que décrite ci-dessus, dans laquelle les séquences d'ADN codant pour ces anticorps sont traitées, notamment selon la méthode décrite dans l 'article de Nissim et al. , 1994, de manière à obtenir des anticorps simple brin, notamment par jonction de tout ou partie d'une séquence d'ADN codant pour une chaîne lourde d' immunoglobuline avec tout ou partie d'une séquence
35 d 'ADN codant pour une chaîne légère d'immunoglobuline.
Ces anticorps ScFv peuvent également être obtenus par clonage de l 'ADN complémentaire (ADNc) issu d'hybridomes, tels que décrits ci-dessus, codant pour une immunoglobuline dirigée contre une desdites molécules impliquées dans un phénomène de rejet de greffe, suivi d'un traitement, tel que décrit ci- dessus, de manière a obtenir des anticorps simple brin par jonction de tout ou partie de la fraction dudit ADNc codant pour la chaîne lourde de l ' immunoglobuline avec tout ou partie de la fraction dudit ADNc codant pour la chaîne légère de cette immunoglobuline
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les séquences nucléotidiques utilisées pour la préparation de cellules ou organes transgéniques susmentionnés, sont celles codant pour des anticorps diriges contre toute molécule impliquée dans la biosynthesc d' épitopes xenoantigeniques dans les cellules de mammifères non humains
Avantageusement, les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de la présente invention sont celles codant pour des anticorps diriges contre 1 une au moins des isoformes (et avantageusement contre toutes les isoformes) des galactosyltransférases présentes chez les mammifères non humains, et plus particulièrement contre l 'une au moins des isoformes de l 'α l ,3GT présente chez le porc, pour la préparation d'organes de mammifères non humains transgéniques au sein desquels la biosynthèse des épitopes α-galactosyl dans les cellules desdits organes est partiellement ou totalement inhibée A ce titre, l' invention a plus particulièrement poui objet les anticorps, le cas échéant simple brin, dirigés contre l'une au moins des isoformes de l'α l ,3GT lesdits anticorps étant tels qu'obtenus par mise en oeuvre d'une des méthodes décrites ci-dessus effectuées à l'aide d'une ou plusieurs isoformes de l 'αl ,3GT, en tant que molécules impliquées dans un phénomène de lejet de greffe
L'invention concerne plus particulièrement les anticorps tels que décrus ci-dessus, dirigés contre l'une au moins des isoformes de l'αl ,3GT présentes chez le porc, et notamment contre l'une au moins des isoformes représentées par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 2 (correspondant a l' isotorme 1 ), SEQ ID NO 4 (correspondant à l' isoforme 2), SEQ ID NO 6 (correspondant a l' isoforme 3) et SEQ ID NO 8 (correspondant à l' isoforme 4), ces isoformes 1 d 4 étant respectivement codées par les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 3. SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 7 , ou codées pai toutes séquences nucléotidiques dérivées de ces dernières, notamment par dégénérescence du code génétique
L' invention vise plus particulièrement les anticorps tels que décrits ci- dessus, dirigés contre l 'une au moins des isoformes 3 e( 4 de l'α l .3GT présentes chez le porc et représentées par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8.
Avantageusement les anticorps anti-αl ,3GT susmentionnés de l 'invention sont des anticorps simple brin dont les séquences en acides aminés sont telles qu 'elles contiennent les parties CDRl , CDR2 et CDR3 de la chaîne lourde desdits anticorps anti-α l ,3GT reliés par une séquence liante (linker) d'environ 6 à environ 36 acides aminés, à tout ou partie de la chaîne légère Vλ3 des anticorps anti-αl ,3GT susmentionnés.
Un linker particulièrement préféré est celui constitué de trois répétitions successives de la séquence en acides suivante :
Gly - Gly- Gly- Gly- Ser
Des anticorps particuliers selon l'invention sont ceux représentés par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 10 (anticorps désigné ScFvl), SEQ ID NO 12 (anticorps désigné ScFv2), SEQ ID NO 14 (anticorps désigné ScFv3), SEQ ID NO 16 (anticorps désigné ScFv4) et SEQ ID NO 18 (anticorps désigné
ScFv5), ou par toute séquence en acides aminés dérivée de ces dernières, notamment par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, ou par tout fragment des séquences susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de reconnaître l 'une au moins des isoformes de l'αl ,3GT.
L' invention a également pour objet les séquences nucléotidiques codant pour un anticorps anti-αl,3GT tel que décrit ci-dessus, et comportant notamment les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9 (codant pour ScFvl ), SEQ ID NO 11 (codant pour ScFv2), SEQ ID NO 13 (codant pour ScFv3), SEQ ID NO 15 (codant pour ScFv4), SEQ ID NO 17 (codant pour
ScFv5), ou toute séquence nucléotidique dérivée de ces dernières, notamment les séquences dérivées par dégénérescence du code génétique, et étant néanmoins capables de coder pour les anticorps ScFvl , ScFv2, ScFv3. ScFv4 ou ScFv5 , ou les séquences dérivées par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides, ou tout fragment des séquences nucléotidiques susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de coder pour un anticorps susceptible de reconnaître l 'une au moins des isoformes de l'αl ,3GT.
Les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11 , SEQ ID NO 13. SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17 susmentionnées sont avantageusement obtenues par séquençage des ADNc codant pour les anticorps représentés par SEQ ID NO 10. SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 14. SEQ ID NO 16 et SEQ ID NO 18 respectivement, ces ADNc provenant de clones cellulaires sélectionnés poui leui capacité à produire lesdits anticorps, la sélection desdits clones cellulaires étant effectuée à l'aide de l'isoforme 2 de l'αl ,3 GT (à savoir du polypeptide représenté par SEQ ID NO 4) utilisée en tant que molécule cible
*> leconnue par lesdits anticorps, lesdits clones cellulaires, étant eux-mêmes obtenus par transformation de cellules, notamment de bactéries ou de phages. avec des séquences nucléotidiques provenant d'une banque d'ADNc codant poui des anticorps, telle que la banque susmentionnée décrite par Nissim et al , 1994, ou piovenant d'hybπdomes obtenus selon la technique indiquée ci-dessus pai
H) immunisation d'un animal avec ladite isoforme n° 2 de l'αl ,3GT
L'invention a également pour objet tout vecteur, notamment plasmide, contenant l 'une au moins des séquences nucléotidiques décrites ci-dessus selon l' invention, notamment l'une au moins des séquences SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 1 1 , SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 ou SEQ ID NO 17, et les éléments
1 nécessaires à l'expression des anticorps anti-molécules, et plus particulièrement des anticorps antι-αl ,3GT susmentionnés
L' invention concerne également tout hôte cellulaire (telle qu'une cellule eucaryote) contenant l'un au moins des vecteurs tels que décrits ci-dessus, selon l'invention
20 L'invention concerne également tout mammifère transgénique non humain, ou toute cellule de mammifère transgénique non humain, comprenant dans leui génome au moins une séquence nucléotidique décrite ci-dessus, codant pour des anticorps anti-molécules tels que décrits ci-dessus, et plus particulièrement poui des anticorps antι-αl ,3GT susmentionnés
25 L'invention a plus particulièrement pour objet tout mammifère transgénique non humain, ou toute cellule de mammifère transgénique non humain, tels que décrits ci-dessus, comprenant dans leur génome au moins une des séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 1 1 . SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17, ou au moins une séquence
30 dérivée ou fragment tels que définis ci-dessus, desdites séquences nucléotidiques
Avantageusement, les mammifères transgéniques non humains, selon l'invention sont tels qu'obtenus par introduction, notamment par mιcroιn)ectιon, dans un ovocyte fécondé, d'au moins une séquence nucléotidique telle que
35 définie ci-dessus, codant pour un anticorps anti-molécules tel que défini ci- dessus, et plus particulièrement d'au moins une des séquences nucléotidiques teprésentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11 , SEQ ID NO 13, SEQ NO 15 et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dérivée ou fragment tels que définis ci dessus, et insertion de l 'embryon dans la matrice d'une mère de substitution et développement de l'embryon à terme
L' invention a également pour objet tout mammifère transgénique non humain défini ci-dessus, tel que produit par croisement d'animaux transgéniques exprimant au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, codant pour un anticorps anti-molécules, et plus particulièrement au moins une des séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 1 1 , SEQ ID NO 13 , SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dérivée ou ι o ti agment tels que définis ci-dessus
A titre d' illustration, les mammifères transgéniques non humains, selon l ' invention, peuvent être obtenus selon la méthode décrite dans l'article de DePamphihs M L , et al , 1988
Parmi les mammifères transgéniques non humains susceptibles d'être 1 5 obtenus dans le cadre de la présente invention, on peut citer la souris, le rat. le porc ou le lapin
L' invention a plus particulièrement pour objet les porcs transgéniques contenant dans leur génome au moins une des séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11 , SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 0 15 et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dérivée ou fragment tels que définis ci- dessus
L' invention concerne également les cellules cultivées à partir des animaux transgéniques non humains tels que décrits ci-dessus
L'invention a également pour objet les organes de mammifères non 25 humains, et plus particulièrement les organes de porc, notamment les rems, le foie, le pancréas ou le coeur, comprenant dans le génome des cellules les constituant au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, codant pour un anticorps anti-molécules, et plus particulièrement d'au moins une des séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 1 1 , 30 SEQ ID NO 13 , SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dérivée ou fragment tels que définis ci-dessus, lesdits organes étant tels qu'obtenus par prélèvement sur des mammifères transgéniques non humains selon l' invention
L' invention concerne également tout polypeptide comprenant la séquence d 'acides aminés telle que représentée par SEQ ID NO 6 (correspondant a
35 l' isoforme 3 de l'αl ,3GT) ou SEQ ID NO 8 (correspondant à l' isoforme 4 de l 'α l .3GT), ou tout polypeptide contenant tout fragment d'au moins environ 6 acides aminés, de l'une des susdites séquences d'acides aminés, ledit polypeptide contenant ce fragment étant susceptible de générer des anticorps reconnaissant l'une au moins des quatre isoformes de l'αl ,3GT, ou comprenant toute séquence dérivée de ces dernières, notamment par addition, suppression ou modification d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que la séquence
-> dérivée soit susceptible de générer des anticorps reconnaissant l'une au moins des quatre susdites isoformes
L'invention a également pour objet les séquences nucléotidiques comprenant les séquences représentées par SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 7, ou toutes séquences dérivées, notamment les séquences dérivées par dégénérescence
I O du code génétique, et étant néanmoins capables de codci pour les polypeptides représentés par les séquences en acides aminés représentées par SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8 respectivement, ou les séquences dérivées par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides, ou tout fragment des séquences nucléotidiques susmentionnées ou de leur séquences dérivées, lesdites
15 séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de coder pour un anticorps susceptible de reconnaître l'une au moins des isoformes de l'αl ,3GT
L'invention concerne également tout vecteui , notamment plasmide, comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour les séquences représentées par SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6, ou par une séquence dérivée
20 ou fragment ce ces dernières, tels que définis ci-dessus, ainsi que les éléments nécessaires à l'expression des isoformes de l'αl ,3GT codées pai lesdites séquences nucléotidiques.
L'invention vise également tout hôte cellulaire transformé pai un vecteur tel que décrit ci-dessus, ainsi que tout procédé de préparation des isoformes 3 et
25 4 susmentionnées de l'αl,3GT par mise en culture dudit hôte cellulaire dans un milieu de culture approprié, et séparation desdites isoformes des autres constituants du milieu de culture.
L'invention a plus particulièrement pour objet toutes séquences nucléotidiques avantageusement obtenues par séquençage des ADNc codant pour
30 les anticorps dirigés contre les isoformes 3 et 4 susmentionnées de l'αl .3GT, ces ADNc provenant de clones cellulaires sélectionnés pour leur capacité a produire lesdits anticorps, la sélection desdits clones cellulaires étant effectuée a l'aide de l'isoforme 3 et/ou 4 de l'αl ,3 GT (à savon des polypeptides lepresentés par SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8, respectivement) utilisées en tant
35 que molécules cibles reconnues par lesdits anticorps, lesdits clones cellulaires, étant eux-mêmes obtenus par transformation de cellules, notamment de bactéries ou de pliages, avec des séquences nucléotidiques provenant d'une banque d' ADNc codant pour des anticorps, telle que la banque susmentionnée décrite par Nissim et al , 1994, ou provenant d'hybπdomes obtenus selon la technique indiquée ci-dessus pai immunisation d'un animal avec ladite isoforme 3 ou ladite isoforme 4 de l 'α l ,3GT i L' invention a également pour objet toute méthode, notamment chirurgicale, de traitement de patients nécessitant une greffe de cellules ou d organes, par implantation desdites cellules transgéniques selon l'invention dans des tissus appropriés dudit patient, ou pai suppression de l 'organe défectueux du patient et remplacement de cet organe défectueux par un organe ι de mammifère non humain transgénique selon l'invention
L' invention sera davantage illustrée à l'aide de la descnption détaillée qui suit de l 'obtention des différentes isoformes de l 'αl ,3GT de porc, ainsi que de la tiansformation de cellules animales à l'aide de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps antι-αl ,3GT selon l' invention, et de procédures d 'obtention d'animaux transgéniques selon l' invention
Obtention des différents isoformes de l'αl ,3 GT
1) Procédures expérimentales 0 a) Cellules et tissus
Les organes poicins ont été obtenus à partir de porcs d 'environ 200 a 300 kg L' isolement enzymatique et la culture des cellules endothéhales aortiques de porc (PAEC) ont ete réalisés selon la méthode décrite dans l 'article de Warren,
25 1990 Les PAEC sont stimulées avec 100 U/ml de TNFα humain (Genzyme,
Cambridge, USA) en présence ou non delO μg/ml de cycloheximide
b) Oligonucléotides
Les oligonucléotides suivants ont été utilisés 30 - oligonucléotide 1
5 -AGGAAGAGTGGTTCTGTC-3 ' hybπdant aux nucleotides 24 à 41 de la séquence SEQ ID NO 1 , -oligonucléotide 2 5* GTTATGGTCACGACCTCT-3' hybπdant aux nucleotides 323 a 306 de la 35 séquence SEQ ID NO 1 ,
-oligonucléotide 3 5 ' TATAGAATTCGAAAATAATGAATGTCAAAGGAATAGTGGTTCTGTC -3' hybridant à un site EcoRI situé en amont des nucleotides 1 à 41 de la séquence SEQ ID NO 1 ,
- oligonucléotide 4 5 -ATATAACTAGTGGAAGCTCTCCTCTGTTG-3' hybridant aux nucleotides 278 à 255 de la séquence SEQ ID NO 1 , et introduisant une mutation de G en A dans la troisième base du codon codant pour une proline,
- oligonucléotide 5 5'-ATATACTAGTGGACTGGTTTAATC-3' hybridant aux nucleotides 275 à 292 de la séquence SEQ ID NO 1 , et introduisant la même mutation de G26I en A comme dans le cas de 1 Oligonucléotide 4,
- oligonucléotide 6 5 ' -GAGTC ACTTGTC ATCGTCGTCCTTGTAATCG ATGTTATTTCTA ACCΛ AATT-3' hybridant aux nucleotides 1105 à 1123 de la séquence SEQ ID NO 1 , et additionné en phase à un oligonucléotide codant pour un peptide FLAG (Kodak, New Haven, USA) un codon stop et un site Xhol.
c) clonage et construction
Un clone d'ADNc αl,3GT de 2 Kb (pCDNA-αGT) a été isolé d'une banque d'ADNc construite dans le vecteur pCDNA-1 (Invitrogen, Leek, Pays- Bas) par hybridation de transfert en utilisant une sonde PCR amplifiée avec les amorces 1 et 2 (dérivées de la séquence publiée dans l'article de Sandrin et al. , 1994. Ce clone correspond à celui de l'isoforme n° 2.
Les isoformes 1, 3 et 4 de l'αl ,3GT porcine ont été isolées par amplification par PCR d'une région comprenant les exons 4 à 7 avec les amorces 1 et 2, en utilisant TARN rétro-transcript des PAEC. Les fragments amplifiés sont traités par la polymérase de Klenow, pour obtenir des extrémités franches, et clones dans le site Smal du plasmide pUC18. Trois clones contenant des fragments de 300, 237 et 201 pb ont été obtenus et utilisés en tant que matrice pour introduire, par amplification PCR secondaire, un site EcoRI à l 'extrémité 5' (avec l'oligo 3) et un site Spel dans l'exon 7 (avec l'oligo 4). L' introduction de ce site Spel ne modifie pas la séquence en acides aminés. Les produits de PCR ont été ligués dans un plasmide pKS digéré par EcoRI-Spel. La partie 3' restante de la séquence codante a été amplifiée par PCR à partir du clone pCDNA-αGT avec les amorces 5 et 6, traitée pour obtenir des extrémités franches et clonée dans le site EcoRV d'un plasmide pKS. A partir de ce plasmide recombinant, un fragment Spel portant la région codante du nucléotide 262 à 1 125, en phase avec une séquence FLAG (contenue dans l 'oligonucléotide 6). a été isolée et clonée dans les sites Spel des plasmides pKS contenant les
5 régions 5' variables. Les construits résultant ont été contrôlés par séquençage, et les fragments EcoRI, contenant les séquences codantes entières ont été sous- clonés dans le vecteur d'expression encaryotique pCDAAS-néo conduisant l'expression du transgène sous contrôle du promoteur du CMV. L'isoforme 2 de l 'αGT porcine a été isolée de la même manière, en utilisant le clone pcDNA-α
I O GT comme matrice initiale.
d) transfection de cellules
Des cellules HeLa cultivées en RPMI - 10 % FCS ont été traitées par la 15 trypsine, resuspendues à raison de 5.10^ cellules/ml dans un milieu glacé et mélangées avec 20 μg/ml d'ADN plasmidique portant le transgène et un gène de résistance à la néomycine. Les cellules ont été traitées par électroporation à 250 V, 350 μF, laissées dans la glace pendant 10 mn et ensemencées à raison de 2000 cellules/cm^. Après 24 h, 500 μg/ml G418 ont été additionnés et les 0 cellules ont été cultivées pendant deux semaines. Les clones ont été isolés et cultivés en présence de G418.
e) immunofluorescence
Les clones de cellules HeLa exprimant une des quatre isoformes de l 'a
25 1 ,3GT ont été ensemencées sur des lamelles à 4 chambres pour microscope
(Nunc, Rookilde, Danemark), pour l'analyse de l'expression des épitopes α-galactosyl sur les membranes cellulaires. Deux jours après l'ensemencement, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, fixées pendant 10 mn à température ambiante avec du paraformaldéhyde 3 % , lavées encore et incubées
30 pendant une heure à température ambiante avec l'isolectine B4 - FITC de
Banderaea simplicifolia (Sigma, St Louis, USA), dilution au 1.100 dans du
PBS. Les lamelles ont été lavées 4 fois dans du PBS avant montage. Pour la localisation subcellulaire, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 3
% et perméabilisées par trois incubations séquentielles de 5 mn avec 50 % , 100
35 % et 50 % d'acétone glacée. Après trois lavages avec du PBS/Tween-20 0,5 , les cellules ont été incubées avec l'anticorps anti-FLAG M2 (1 :200 ; Kodak,
New Haven, USA), puis incubées pendant une heure avec un anticorps secondaue d'âne anti-souris marqué au FITC (1 500 , Jackson, Baltimore, USA) Les préparations ont été montées dans un fluide FA (Ditco, Grayson, USA) et visualisées avec un microscope à epifluorescence Nikon
t) Analyses par transfert d'ADN (Northern blot)
L'ARN cellulaire total a été isolé à partir de cellules cultivées et d'organes décrits par Zipfel et al ., 1989 Dix μg d'ARN total ont été fractionnes sur un gel d'agarose/formaldéhyde, transférés sur une membrane Hybond N (Amersham, Little Chalfont, UK) par action capillaire dans 20 X SSC pendant ι o 16 h et immobilisés par réticulation aux UV Les filtres ont été pre-hybπdés pendant 6 h dans une solution contenant 50 % de formamide, 5 X SSPE (0, 18 M NaCl, 10 mM phosphate de sodium, pH7,7, 1 mM EDTA), 5 X Denhart's, 0.5 % SDS, et 100 μg/ml d'ADN dénatuié de sperme de saumon L'ARN lie aux membranes a ete hybride avec des sondes d'ADNc marquées au 32 -- correspondant à la région codante de l'isoforme 1 de l'αl ,3 GT, à la β-actine poicine ou à l'ARN 28S. L'hybridation a été réalisée pendant une nuit a 42 °C dans une solution de pré-hybridation contenant 10^ cpm/ml d'une sonde Les filtres ont été lavés deux fois dans 2 X SSPE, 0,5 % de SDS à température ambiante pendant 15 mn, et trois fois dans 0,5 X SSPE, 0,5 % SDS a 65 °C
20 pendant 15 mn. L'hybridation a été visualisée et les signaux quantifiés avec un dispositif phosphoπmage (Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA)
g) test de protection à la RNase
Les tests de protection à la RNase ont été réalisés selon la méthode décrite
2^ par Melton et al , 1984 Deux sondes d'ARN, complémentaires des exons 5 et
6, et des exons 4 et 7, ont été préparées de la manière suivante deux fragments EcoRI-Spel, correspondant aux nucleotides 7 à 266 du clone αG Tiso 1 , et aux nucleotides - 7 à 174 du clone αGT ιso4 (Fig. 1) ont été sous clones dans les sites EcoRI-Spel des plasmides pKS En utilisant l'ARN polymerase
30 T7. les sondes d'ARN antisens ont été synthétisées et du 32p rjUTP a été încorpoié L'ADN plasmidique matrice a été digéré avec l'ADNase I. et 500 000 cp de chaque sonde ont été hybrides pendant 16 h à 10 μg d'ARN total d'oi ganes porcins ou de cellules dans 30 μl de tampon d'hybridation contenant 80 % de formamide, a 50 °C Les échantillons de contrôle contiennent 10 μg
35 d'ARN de levure Les mélanges d'hybridation été dilués a 400 μl avant l'addition de 5 μg/ml de RNase A et 10 U/ml de RNase Tl Après 1 h à 30 °C, 50 g de protéinase K et de SDS à 0,5 % ont été ajoutés Le mélange a ensuite ete extiait au phenol/chloroforme et précipité a l'éthanol Les produits de digestion ont ete analysés sur des gels de polyacrylamide à 6 % Les gels ont ete exposes pendant 16 h contre des films Kodak AR a - 80°C
i 2) Résultats
a) Clonage de quatre isoformes de l'αl,3GT
Comme décrit piecedemment, une banque d'expression d'ADNc porcin construite en utilisant l'ARN LLC-PKl (Guerif et al, 1995), a été criblée en i n utilisant une sonde correspondant à l'extrémité 5' de la séquence codante Un clone d'ADNc, pcDNA- GT, avec la région codante correspondant à une αl ,3GT porcine déjà décrite (Sandπn et al, 1994), a été isolé Cette αl ,3 GT correspond a l'isoforme 2 représentée par SEQ ID NO 4 et codée par la séquence SEQ ID NO 3 Ce clone pcDNA-αGT contient une région 3 ' non i i traduite longue de 770 pb, une région codante de 1080 pb contenant les homologues porcins de ce qui a été défini dans le cas de la souris comme étant les exons 4, et 6 à 9 (Joziasse et al , 1992) et une région 5' non traduite de 150 pb En utilisant des amorces adjacentes aux exons 4 et 7, l'amplification PCR de l'ADN des PAEC a été réalisée Des produits d'amplification d'environ
20 200 pb a 300 pb ont été trouvés, suggérant l'existence de transcrits supplémentaires Trois produits différents ont été clones, l'un deux étant identique a la séquence décrite par Strahan et al, 1995 (et designée ici comme étant l' isoforme 1 , Fig 1 , à savoir l'isoforme représentée par SEQ ID NO 2 codée par la séquence SEQ ID NO 1) En comparaison avec l' isoforme 2
2 susmentionnée (provenant du clone pcDNA-αGT), il contient un segment supplémentaire de 36 pb après le nucléotide 80. Un autre produit, l' isoforme 3 , a savoir l'isoforme représentée par SEQ ID NO6 codée par la séquence SEQ ID N05 , ne comporte pas un segment de 63 pb du nucléotide 1 17 au nucléotide 179 et le dernier produit, l' isoforme 4, à savoir l' isoforme représentée par SEQ
30 ID NO 8, et codée par la séquence SEQ ID NO7, ne comporte pas le segment de 36 pb du nucléotide 81 au nucléotide 116, et le segment de 63 pb du nucléotide 1 17 au nucléotide 179 (Fig 1) La traduction des ARNm correspondant a chacun des transcπpts identifiés, prédit la synthèse de quatre tonnes du polypeptide αl ,3GT, de 372, 360, 351 et 339 acides aminés qui
3 - diffeient seulement dans la longueur de leurs régions "stem" (tiges) respectives
La situation décrite ici est comparable à celle décrite dans le cas de la souris (Joziasse et al , 1992), puisque quatre ARNm différents ont été trouvés, contenant les exons 5 et 6, ou contenant seulement l'exon 5 ou l'exon 6, ou ne contenant ni l'exon 5 ni l'exon 6. Les segments porcins de 36 pb et 63 pb correspondent bien aux exons 5 et 6 murins, à l'exception du fait que, dans la souris, l 'exon 6 est long de 66 pb au lieu de 63 pb chez le porc (Fig. 1).
b) Activité αl ,3GT des isoformes
La présence ou l'absence des exons 5 et 6 détermine quatre variations de longueur dans la région stem de l'αl,3GT. Cette région, localisée à l'intérieur de l'appareil de Golgi, lie le signal d'ancrage transmembranaire au domaine luminal catalytiquement actif. Afin de vérifier si les quatre isoformes définies par l'épissage alternatif des exons 5 et 6 sont catalytiquement actifs, des cellules HeLa humaines ont été transformées avec des plasmides recombinants exprimant chacune des quatre isoformes de l'αl,3GT porcine sous le contrôle du promoteur CMV . Le produit de cette enzyme sur les surfaces des cellules a été analysé par immuno fluorescence, en utilisant la lectine IB-4 réagissant spécifiquement avec les résidus Gala. L'épitope Gala pouvait être détecté à la surface des cellules HeLa traduites avec les quatre isoformes de l'enzyme, comme le montre la liaison à la lectine IB-4 (Fig. 2), indiquant que ces isoenzymes possèdent toutes une activité α-galactosyltransférase. Les niveaux d'expression des ARNm de l'αl ,3GT dans les clones IIeLa-αl,3GT de porc, ont été contrôlés par Northern blot, et sont légèrement supérieurs dans les clones contenant les isoformes 1 et 2, et légèrement inférieurs pour le clone contenant les isoformes 2 et 3, par rapport au niveau trouvé dans les PAEC.
c) Localisation subcellulaire des isoformes αl ,3GT
La localisation Golgienne de l'αl ,3GT est due à la présence dans l'exon 4 d'un domaine signal d'ancrage. Les variations de longueur dans la région stem, c'est-à-dire la présence ou l'absence des exons 5 et 6, peuvent également influencer la rétention dans le Golgi (Dahdal et al. , 1993) ou exposent un site de clivage sensible aux protéases sur certaines isoformes (Weinstein et al., 1987 ;
Lammers and Jamieson, 1989, Shaper et al. , 1986 ; Yadav and Brew, 1991). Afin de vérifier si ces variations de la région stem de l'αl ,3GT pourraient modifier la localisation dans le Golgi, la localisation cellulaire des différentes isoformes a été analysée. Les quatre vecteurs d'expression basés sur le CMV décrits ci-dessus, expriment les isoformes αl,3 GT avec un marqueur FLAG fusionné à l'extrémité C-terminale ce qui permet de détecter la protéine par immunofluorescence indirecte dans les cellules HeLa transfectées avec un anticorps anti-FLAG Comme observé par microscopie a fluorescence, les quatie isoformes sont localisées de façon similaire et forment une structure luxtanucléaire compacte coi respondant à celle de l'appareil de Golgi (Roth et Bergei , 1982) De façon surprenante, alors que 100 % des cellules expriment l'enzyme, comme cela a été mis en évidence par coloration unifoime obtenue avec la lectine IB4, l'enzyme n'est pas détectable sur la totalité de ces cellules en utilisant l'anticorps anti-FLAG Cela peut être due a une expression u régulière de l'enzyme associée à une sensibilité limitée de l'anticorps, ou a la reorganisation de l'appareil de Golgi durant le cycle cellulaire
d) Expression des isoformes de l'αl,3GT
L'epitope Galαl ,3Gal, résultant de l'activité de l'αl ,3GT, n'est pas exprime de façon homogène dans les tissus de porc (Oπol et al , 1993) Dans le but d'étudier ces variations au niveau enzymatique, le niveau des transcπpts α 1 ,3GT a été étudié par Northern blot, et la distribution des isoformes a ete étudiée par test de protection à la RNase
L'analyse par Northern blot montre l'expression dans tous les tissus étudiés, mais avec une différence frappante entre les tissus Les reins contiennent environ 50 % de ce que l'on trouve dans la rate, le thymus 40 % et le coeui et les ovaires, 20 à 25 % Les poumons et le foie contiennent moins de
10 % de ce qui a ete trouvé dans la rate La stimulation des cellules endothéhales avec les cytokines inflammatoires induit une augmentation de la régulation ou la synthèse de beaucoup de gènes, dont les molécules d'adhésion, à savon les molécules liées à l'inflammation et la coagulation Une augmentation de la régulation de l'αl ,3GT n'a jamais été décrite dans les cellules endothéhales En utilisant des PAEC stimulées pendant 6 heures avec 100 U/ml de TNFα humain, une augmentation de deux fois le niveau global d'ARNm codant pour l'αl ,3GT a été observée L'incubation des PAEC en présence de cycloheximide augmente également le niveau d'ARNm codant pour l'αl ,3GT probablement par stabilisation du messager De façon surprenante, la stimulation par TNFα -I- cycloheximide ne conduit pas a une augmentation du niveau de l 'ARNm codant pour l'αl,3GT, mais plutôt à une légère diminution Cet effet est peut-être relie à la découverte du fait que la cycloheximide facilite l'apoptose due au TNFα conduisant à une diminution de la régulation de certains antigènes (Malorni et al , 1993)
L'expression des isoformes de l'αl ,3GT a été analysée par test de protection a l'ARNase dans les tissus de porc Deux sondes antisens radiomarquées ont été utilisées pour analyser les quatre espèces d'ARN identifiées.
Le transcript de l'ARNm de l'isoforme 1 hybride avec un fragment de 273 pb sur la sonde 1 correspondant à une séquence délimitée par les
5 nucleotides 7 à 266 sur le transcript (les numéros des nucleotides correspondent à la séquence représentée sur la figure 1 , isoforme 1). L'hybridation de la sonde 1 avec l'ARNm codant pour l'isoforme 2 conduit à un fragment de 87 pb délimité par les nucleotides - 7 à 80, et un fragment plus grand de 150 pb délimité par les nucleotides 117 à 266. L'hybridation de la sonde 1 avec
K) l'ARNm codant pour l'isoforme 3 conduit à un fragment de 123 pb délimité par les nucleotides - 7 à 116 et un plus petit fragment de 87 pb délimité par les nucleotides 180 à 266. L'hybridation de la sonde 1 avec l'ARNm de l'isoforme 4 de l'a 1 ,3 GT conduit à deux fragments de 87 pb délimités par les nucleotides - 7 à 80 et par les nucleotides 180 à 266. La deuxième sonde, sonde 4, est un
15 fragment d'ARNm de 174 pb correspondant à l'isoforme 4. Il est entièrement protégé par l'ARNm codant pour l'isoforme 4, et conduit à deux fragments de 87 pb avec les isoformes 1 , 2 et 3.
Les fragments de sonde protégés par les ARNm codant pour les isoformes 1 , 2 et 3 sont ceux de 273, 150 et 123 pb, respectivement, la sonde 4 protégée
20 par l'ARNm codant pour l'isoforme 4 conduit à une bande de 174 pb. La répartition des produits de transcription diffère d'un tissu à un autre : dans le rein, l'isoforme 3 seule est exprimée, alors que dans les ovaires, seule l' isoforme 4 est exprimée. Dans le coeur, les poumons et la rate, on trouve les isoformes 1 et 2, alors que les isoformes 2 et 4 sont trouvées dans le foie. Les
25 cellules endothéliales expriment les isoformes 1. 2 et 4. Dans les thymus, on peut observer les 4 isoformes.
30 II - Transformation de cellules animales à l'aide de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps anti-αl ,3 GT selon l' invention
1 ) Matériels et méthodes
35 a) Banques d'ADNc, cellules et plasmides :
La banque d'ADNc provient de cellules épithéliales porcines LLC-PKl . Elle est construite dans le vecteur pCDNA-1. Les souches bactériennes utilisées sont E coli-TGl sup E, E colι-XL-l , SURE, M15, MC 1061/P3, et DH5α Le plasmide d'expression procaryote pQE-30 vient de Qiagen Le plasmide d'expiession eucaryote pCDAAS-9, contient un gène de résistance a la neomycine et entraîne la transcription d'ADNc qu'il porte sous le contrôle du promoteui du cytomegalovirus La banque d'immunoglobulines humaines ScFv est construite dans le plasmide pHEN-1 et a ete utilisée comme décrit dans I ai ticle de Nissim et al , 1994 La préparation des pliages recombinants est également décrite
b) Système d'expression recombinante et purification
Le système de production et de purification de l'αl,3GT recombinante provient de Qiagen La transcription a été induite par culture des E α?//-M 15 transformées par l'ADNc de l'enzyme avec 2mM IPTG, pour 5 heures La protéine recombinante dans le lysat cellulaire a ete alois purifiée sur une colonne echangeuse d'ions, en conditions dénaturantes La protéine purifiée a ete dialysee en PBS et stockée a -20°C jusqu'à son utilisation
c) ΕLISA Des plaques de microtitration (Nunc) ont été glacées une nuit a 4°C avec
5 μ/ml de protéine αl ,3GT purifiée, en tampon carbonate a pH 9,5 Elles ont ensuite ete saturées 2h a 37 °C en 2% lait ecreme, puis incubées 2h, 37 °C avec une suspension de phages recombinants exprimant un fragment ScFv d'anticorps provenant de la banque ScFv Après lavage, les plaques ont ete incubées lh, 37 °C avec un anticorps anti-phage M13 marqué a la peroxydase (Pharmacia), dilue 1/500 La révélation a été effectuée par réaction de la peroxydase avec de la diaminobenzidine en présence d'eau oxygénée
d) Transfection et cellules porcines Des cellules de porc LLC-PKl ont été transfectees avec des plasmides pCDAAS portant l'ADNc de clones antι-αl ,3 GT positifs La transfection a ete lealisee par electroporation d'un mélange de 500 000 cellules et de 20 μg d'ADN plasmidique, a 250V et 350μF Les clones ont ete sélectionnes pai cultui e de 15 jours en présence de 1500 μ/ml de neomycine (G418) isoles a l 'aide d'anneaux de clonage et cultivés séparément en présence de G418 jusqu'à l'analyse e) Immunofluorescence et cytofluorométπe
Les cellules ont été marquées par l'isolectine B4 de Bandeiraea sunplicifoha marquée à la fluorescéine (IB-4-FITC, Sigma), lectine spécifique des structures α-galactose. les cellules ont été lavées à 4°C en PBS-2%BSA, incubées à 4°C pendant 30 mn avec 20 μg/ml IB-4-FITC, relavees 3 fois et analysées par cytofluorométπe en utilisant un FACS-can (Becton Dickinson)
f) Séquence
Les reactions de séquence ont été effectuées avec la D-taq (Ameisham), en utilisant comme amorces deux oligonucléotides situes dans la partie 5 ' du segment Vλ3 Ohgo 1 , permettant la lecture de la partie 5 ' de l'ADNc 5 '-
TTCTGAGGCTGTCTCCTT-3' . Ohgo 2, permettant la lecture de la partie 3 ' de l'ADNc 5'-ATCGTCTGAGCTGACTCA-3'
g) Ciblage moléculaire des ScFv anti-αl ,3-GT dans le Golgi
Dans le but de faire exprimer les anticorps ScFv dans le même compartiment cellulaire que l'αl ,3 GT, c'est-à-dire dans le Golgi, des séquences signal et de rétention golgienne ont été ajoutées aux clones ScFv en N-terminal et en C-terminal, respectivement Les séquences signal et de létention choisies ont été adaptées à partn des données rapportées par
Richardson et al , 1995 Elles ont été introduites pai amplification PCR des clones ScFv de départ, a l'aide d'amorces contenant l'ADNc de ces séquences, et des sites de restriction pour le clonage La séquence de ces amorces est la suivante - amorce encodant la séquence signal .
5 ' -TTTG A ATTC ATGG AAAGGC ACTGG ATCTTTCTCTTCC AGGT GC AGCTGGTGC AG-3 '
- amorce encodant la séquence de rétention golgienne 5 ' TTTCTCG AGTTATTACAGCTCGTCCTTTTCGCT ACCT AGG A CGGTGCAGCTT-3'
2) RESULTATS
a) Clonage de l'αl ,3GT de porc Un fragment de 313bp correspondant à l'extrémité 5' de l'ADNc de l'a
1 ,3GT de porc a été amplifié par RT-PCR à partit d'ARN de cellules endothéhales aortiques de porc Ce fragment a servi de sonde poui le clonage de l 'ADNc entier dans une banque de cellules épithéhales de porc exprimée en E Coli MCI 061 P3, dans le plasmide pCDNA-1 Le clone isolé mesure environ 2Kb. comporte une partie 5 ' non codante de 147 pb suivie d'une phase ouverte de lecture de 1 104 pb et d'une partie 3 ' non codante d'environ 750 pb II -ι conespond a l' isoforme de l'enzyme dont l'exon 5 est absent (a savon l ' isoforme 2 représentée par SEQ ID NO 4) L'ADNc poicin isolé est fonctionnel car il confère une activité αl ,3GT à des cellules Cos, naturellement dépourvues de cette activité, après transfection Cette activité peut être démontrée par l'acquisition d'une réactivité avec l' isolect e B4 de Bandeiraea ι o simplicifoha, marquant spécifiquement les résidus α-galactosylés
b) Expression protéique de l'αl ,3GT recombinante
La partie codante de l'αl ,3GT a été sous-clonée par PCR dans le vecteur d'expression procaryote pQE30 (Quiagen), en fusion en 5' avec une queue de
1 5 six histidines servant à la purification de la protéine recombinante sur une matrice chargée (Ni-NTA) Le clone ainsi obtenu a été entièrement séquence poui s'assurer de l'absence de mutations par rapport au clone de départ, qui auraient pu être introduites lors de l'amplification PCR Le plasmide pQE30-α 1.3GT a été introduit dans E Coli M15 et la protéine recombinante produite in 0 vitro pai induction de la transcription à l'IPTG, et purifiée c) Production d'anticorps ScFv antι-αl ,3GT
La banque d'immunoglobulines (Ig) humaines est constituée par 50 séquences de parties variables de chaînes lourdes d'Ig en configuration germinale, associées à un peptide contenant de 4 à 12 acides aminés aléatoπes,
25 codant par la partie CDR3 de la chaîne lourde, et insérées dans le phagemide pHENl -Vλ3 , en fusion avec la partie plasmidique codant pour la protéine g3p de l'enveloppe phagique. Les phages pouvant être dérivés de ces plasmides expriment donc un fragment (ScFv) d'Ig fonctionnel en fusion avec une protéine d 'enveloppe, et se comportent, au niveau de leur propriétés de reconnaissance
30 d'un antigène, comme ITg dont ils expriment la séquence Les phages dérivés de cette banque d'Ig ont fait l'objet de 4 tris successifs par "panning" sur la protéine recombinante purifiée, comme décrit dans Nissim et al , 1994
d) Test ELISA de la positivité des anticorps ScFv antι-αl ,3GT.
35 Quatre-vingt-seize colonies individuelles de bacténes E Coli-TG supE contenant chacune un clone pHENl-ScFv ont été isolées, de manière aléatoire, api es les 4 cycles d'enrichissement à rencontre de la protéine αl ,3GT Ces colonies ont été cultivées une nuit dans 200μl de milieu LB, en plaque de microtitration Le surnageant, contenant des phages exposant sur leur enveloppe 1 a 3 molécules de fragment ScFv d'anticorps, a été testé par ELISA poui mesurer la reactivite relative des différents clones à encontre de l 'α l .3GT Sur les 96 clones testés, 15 montraient une réactivité supérieure a tiois fois le niveau du contiôle (Figure 2) Les six clones les plus positifs ont été réamplifiés et des phages purifies ont été prépares à partir de 500 ml de surnageant de bactéries TG- 1 Les phage purifiés, et concentrés par précipitation et resuspension en PBS ont un titre supérieur à 10^ cfu/ml Cette préparation de phages concentres a ete te-testee en ELISA Les résultats, montrés à la figure 2, reproduisent l 'ordre de reactivité observé dans la Fig 2
e) Séquence de l'ADNc des fragments d'anticorps ScFv antι-αl ,3GT
Les clones ScFv antι-αl ,3GT sélectionnés ont été séquences pour s'assurer de la non introduction d'erreurs lors du sous-clonage par PCR et pour déterminer les associations chaîne lourde génomique-peptide aléatoire (de 4 a 12 acides amιnés)-chaîne légère Vλ3 qui produisent un anticorps reactif a encontre de l 'αl ,3GT Sur les six séquences analysées, deux sont identiques (n° 2 et 6), et deux ne diffèrent que par deux acides aminés dans la partie CDR3 (n° 1 et 5) La séquence n° 3 présente un codon ambre (codon reconnu comme un stop traductionnel dans un système eucaryote, mais considéré comme une glutamine dans la souche E coh-TGl supE utilisée pour le clonage) a la jonction CD3-peptιde linker reliant les chaînes lourdes à la chaîne légère Vλ3 Un codon stop à cette position est une conséquence prévisible de l'association aléatoire des fragments d'ADNc qui se produit lors de la fabrication de la banque ScFv Le remplacement du nucléotide T en position 313 par un C permet d'obtenir un codon correspondant à une glutamine en position 105 (voir SEQ ID NO 13) Les chaînes lourdes (désignées séquences VH) sélectionnées ainsi que la séquence des régions CDR3 sont décrites dans le tableau 1 , la séquence de clone ScFvl correspond à la séquence représentée par SEQ ID NO
9, la séquence du clone ScFv2 et celle du clone ScFv6 correspondent a la séquence représentée par SEQ ID NO 1 1 , la séquence du clone ScFv3 correspond à la séquence représentée par SEQ ID NO 13 , la séquence du clone ScFv4 correspond à la séquence représentée par SEQ ID NO 1 et la séquence du clone ScFv5 correspond à la séquence représentée par SEQ ID NO 17 Tableau
Clone n° Segment VH Séquence CDR3
ScFvl DP - 25 Ser - Gly - Met - Phe
ScFv2 DP - 5 Pro - Glu - Ile - Asp - Gin
ScFv3 DP - 21 Ser - Asn - Asp - Pro - Ala Asp - Glu
ScFv4 DP - 51 Ala - Trp - Arg - Thr - Asp
ScFv5 DP - 25 Ser - Gly - Val - Tyr
ScFv6 DP - 5 Pro - Glu - Ile- Asp - Gin
Séquences VH d'origine génomique et CDR3 des anticorps synthétiques spécifiques de l'αl ,3GT porcine: Les séquences nucléotidiques des clones ScFv sélectionnés en ELISA pour leur affinité à rencontre de l'αl ,3GT de porc ont été effectuées. Le tableau montre les séquences des troisièmes régions de complémentarité des anticorps (CDR3). La nomenclature des segments variables des chaînes lourdes en configuration germinale est celle utilisée dans Tomlinson ét al. , 1992.
g) Evaluation de l'efficacité de l'immunisation intracellulaire Les ADNc codant pour les anticorps anti-αl ,3GT n° 1 à 6, natifs ou possédant les séquences signal et de localisation golgienne, ont été sous-clonés dans le vecteur d'expression eucaryote pCDAAS, sous le contrôle du promoteur de CMV. Pour tester la conséquence de l'expression des ScFv anti-αl ,3GT sur la diminution de l'expression de l'épitope α-galactosyl sur la membrane des cellules de porc, des cellules LLC-PKl ont été transfectées avec les différents plasmides pCDAAS-ScFv, et des clones ont été isolés. La présence de l'épitope xénoantigénique α-galactosyl a été évaluée en immunofluorescence avec la lectine IB4-FITC (spécifique du galactose branché en configuration α), en comparaison avec les mêmes cellules, non transfectées. Les résultats montrent que l 'anticorps ScFv n° 2 (à savoir celui représenté par SEQ ID NO 12) encodant la séquence VH DP-5, associée une partie CD3 artificielle composée des acides aminés PEIDQ, reliée à la séquence Vλ3, sans adjonction de séquences signal et de rétention golgienne, lorsqu'il est exprimé dans une cellule de porc, entraîne jusqu'à 95% de diminution de l'expression du galactose branché en configuration α. En effet, la fluorescence moyenne des cellules LLC-PKl est de 465 unités lorsque le marquage est réalisé avec 20 μg/ml IB-4- FITC. et elle tombe à 49 unités pour le clone LLC-PKl -ScFvό.
En conclusion, dans le contexte de la xénotransplantation, la possibilité d' inhiber dans une cellule de porc l'expression de l'αl ,3GT en utilisant cette technique, conduit à des applications très claires : la disponibilité de porcs transgéniques n'exprimant pas ou peu d'épitopes α-galactosyl, conséquence de l ' inhibition de l'αl ,3GT, et exprimant un inhibiteur du complément humain, comme cela existe déjà, permet d'effectuer des xénogreffes en évitant la réaction des cellules du greffon avec les anticorps et avec le complément du receveur humain.
Les résultats qui sont présentés ci-dessus, montrent que des cellules d'origine porcine exprimant un anticorps ScFv anti-αl ,3GT peuvent être obtenues, et que cette expression résulte en une diminution importante du niveau de xénoépitopes exprimés
III - Anticorps monoclonaux anti-αl,3GT
La partie codante de l'αl ,3GT, isoforme n° 2 a été sous-clonée par PCR dans le vecteur d'expression procaryote pQE30 (Quiagen), en fusion en 5' avec une queue de six histidines servant à la purification de la protéine recombinante sur une matrice chargée (Ni-NTA). Le clone ainsi obtenu a été entièrement séquence pour s'assurer de l'absence de mutations par rapport au clone de départ, qui auraient pu être introduites lors de l'amplification PCR. Le plasmide pQE30-αl,3GT a été introduit dans E. Coli M15 et la protéine recombinante produite in vitro par induction de la transcription à l'IPTG. Après purification, l'αl ,3GT a été dialysée en PBS et injectée à une souris BALB/C à raison de 3 injections de 40 μg chacune tous les 15 jours. Les lymphocytes spléniques ont été collectés et fusionnés avec l'hybridome de souris SP2-0. La sélection des hybridomes sécrétant une immunoglobuline reconnaissant l'αl ,3GT s'est effectuée par test ELISA: des plaques de microtitration ont été glacées avec lOmicrog/ml de protéine αl ,3GT recombinante, 16h à 4°C à pH 9.5. puis saturées 2h, 37°C avec PBS-BSA1 % , Tween 20 0.5% . Les surnageants de hybridomes ont été incubés lh, 37 °C et les anticorps immunoabsorbés révélés à l 'aide d'un anti-Ig marqué à la peroxydase. Les hybridomes fournissant une densité optique au moins trois fois supérieure au bruit de fond ont été retenus.
IV - Clonage d'anticorps ScFv (Single chain Fv) à partir d' hybridomes
Le clonage de fragments d'immunoglobulines sous forme de fragments ScFv est décrit dans Clackson et al. (1991)). En bref, de l'ARN est préparé à partir de 5x10^ cellules d'hybridome, et l'ARN messager est sélectionné sur oligo(dT)-cellulose. Un premier brin d'ADNc est synthétisé comme suit : lOμg d'ARNm sont incubés avec 20 pmoles des oligos VHI FOR ou VKIFOR
(Clackson et al. , 1991), 250 μM de chaque dNTP, 10 m M DTT, 100 m M Tris.HCl (pH8.3), 10 mM MgCl2, et 140 mM KCI, 10 min. à 70°C, puis lh à 42 °C en présence de 50 unités de Transcriptase Reverse. L'amplification par PCR des fragments VH et VL est réalisée en mélangeant 2 μl de réaction RT avec 25 pmoles des amorces VHIFOR ou VKIFOR, et VH1BACK ou
VK1BACK (Clackson et al.. , 1991), 250 μM de chaque dNTP, 67 mM Tris.HCl (pH 8.8), 17 mM (NH4)2S0 , 10 mM MgCl2, et 2 unités de Taq polymérase, pour 30 cycles d'amplification. Les fragments obtenus sont alors purifiés et 1 μg de chaque sont mélangés avec 300 ng de linker (g!y4Ser)3, et amplifiés par 7 cycles de PCR destinés à relier les fragments. Les fragments VH et VL reliés sont alors amplifiés en 20 cycles avec les oligos VH1BACK et VK4FOR. Les fragments obtenus sont alors ré-amplifiés avec les oligos VHIBACK-BamHl et VK4FOR-BamHl, digérés par BamHl et clones dans le vecteur d'expression eucaryote PCDAAS, sous le contrôle du promoteur CMV.
V -Voies d'action intracellulaire des anticorps anti-αl ,3GT
Le mécanisme moléculaire par lequel un anticorps exprimé dans une cellule interfère avec la fonction d'une molécule portant le site antigénique contre lequel cet anticorps est exprimé n'est pas élucidé. Cependant, plusieurs explications ont été proposées. Dans le cas de l'inhibition de la reverse transcriptase de HIV (Maciejewski et al., 1995), l'anticorps anti-RT n'est pas neutralisant dans un test in vitro. Les auteurs proposent que le complexe antigène/anticorps formé dans la cellule puisse bloquer stériquement le mouvement de l'enzyme le long de la molécule d'ARN, ou bien puisse modifier sa structure secondaire. Dans le cas de l'inhibition de la chaîne α du récepteur à ! 'IL-2 (Richardson et al. , 1995), un processus de dégradation du complexe antigène/anticorps a été proposé. Ce processus semble non lysosomial, car la méthionine méthyl ester (un inhibiteur lysosomial) n'entraîne pas d'accumulation du complexe. La dégradation ne se produit pas non plus dans le compartiment Golgien car la brefeldin A (qui détruit le Golgi) est sans effet. La dégradation se produit donc précocement, sans doute au niveau du réticulum endoplasmique. Dans plusieurs cas où la localisation intracellulaire de la molécule cible conditionne sa fonction, il est possible que l'anticorps intracellulaire retienne cette molécule dans un compartiment qui lui est étranger. Richardson et al. ont en effet montré que l'expression d'un anticorps anti-RT, retenu dans le réticulum endoplasmique par incorporation d'une séquence de rétention KDEL, retient la RT dans ce compartiment.
Dans le cas de l' inhibition de l'αl ,3GT par des anticorps ScFv, on peut supposer que : 1) soit les anticorps modulent l'activité de l'enzyme (par exemple en modifiant sa structure), 2) soit ils la retiennent dans un compartiment intracellulaire autre que le trans-Golgi (compartiment dans lequel le branchement de galactose en αl ,3 sur le galactose du N-acélyllactosamine est effectué), 3) soit ils entraînent la dégradation du complexe antigène/anticorps par un mécanisme non élucidé. Il pourrait s'agir par exemple d'une ubiquitination suivie d'une dégradation par le complexe protéasome.
VI - Construction d'animaux transgéniques avec les ScFv proposés
L'obtention d'animaux transgéniques pour un ScFv anti-αl ,3GT présente des intérêts en recherche et en clinique. Pour la recherche, la transgenèse chez le rat convient particulièrement car ses organes peuvent être greffés chez le singe, où ils subissent un rejet semblable au rejet de xénogreffe dans le modèle porc-primate Pour l'utilisation thérapeutique de greffons, le porc est l'animal de choix.
a) Transgenèse chez le rat :
Les embryons au stade unicellulaire sont obtenus à l'issue d'un protocole de super-ovulation appliqué à des rates de souche CD âgées de 28 à 38 jours (Amstrong et Opavoky, 1988). Ce protocole permet d'obtenir de façon régulière une moyenne de 40 à 50 embryons par femelle. La construction portant l'ADNc codant pour l'anticorps anti-αl ,3GT (deux exemples de constructions pouvant être utilisées sont montrés sur les figures 4 et 5) est injectée à raison de quelques milliers de copies par embryon. Les embryons traités sont alors réimplantés dans la matrice Les rats issus de ces embryons sont ensuite testés pour sélectionner les animaux ayant effectivement incorpore dans leur génome l'ADN tiansgenique Ces tests sont effectués au niveau de l'ADN et de l'ARN, que l'on peut détecter par hybridation avec une sonde ADN correspondant au transgene, *. et au niveau protéique La détection de la protéine ScFv peut être effectuée pai leaction avec un anticorps anti Fab humain, ou par un anticorps anti-epitope, si l'ADNc ScFv est en fusion avec un ADNc codant pour un peptide portant cet epitope
b) Transgenese chez le porc
Des embryons fécondés au stade pronucleaire sont obtenus par laparotomie a partir des oviductes de truies matures âgées de 7 à 10 mois, 50 heuies après l'induction de la superovulation et 20 à 26 heures après l ' insémination Le Pronucleus, dans lequel est injecté l'ADN, est visualise par une centπfugation de l'ovocyte à 15000 g pendant 3 minutes Les résultats après réimplantation d'ovocytes traités de cette manière montrent que 10 % d'entre eux se développent et donnent un animal, et que 15 % d'entre eux ont incorpore l'ADN transgénique, soit 1,5 % des ovocytes traités Parmi ces animaux positifs quant a l'intégration d'ADN, 67 % expriment effectivement la protéine 0 correspondant au transgène (White et al., 1994, Cozzi et White, 1995)
VII Etude de l'expression intracellulaire des séquences nucléotidiques codant pour des anticorps antι-αl,3GT selon l'invention, sur la production de l'épitope Galαl ,3Gal i
Une analyse des conséquences de l'expression intracellulaire des séquences nucléotidiques codant pour des anticorps single chain (ScFv) antι-αl ,3 galactosyltransférase porcine (αl ,3GT), sur la production de l'épitope sucré Galαl ,3Gal par des cellules porcines, a été effectuée au niveau de l'expression membranaire du sucre lui-même, et au niveau de l'activité enzymatique intracellulaire L'analyse porte également sur les conséquences de la diminution de 1 expression de ce sucre sur la toxicité du sérum humain vis à vis des cellules poicmes
Dans le but d'étudier l'incidence de la valence de l'anticorps intracellulaire antι-αl ,3GT sur le fonctionnement de cette enzyme, un anticorps ScFv a ete di- et tetrameπse, et testé in vitro dans des cellules de porc a) Etude de la diminution de l'expression de l'épitope Galαl ,3Gal à la surface de cellules porcines LLC-PKl exprimant des ScFv anti-αl ,3GT.
Les séquences nucléotidiques indiquées dans la figure 6, ainsi qu'une séquence contrôle (codant pour un anticorps ScFv analogue mais ne reconnaissant pas l'αl ,3GT), ont été clonées dans un vecteur d'expression eucaryote, sous le contrôle du promoteur du CMV. Des cellules porcines LLC- PKl ont été transfectées avec ces vecteurs d'expression et des clones ont été dérivés. Les résultats de la figure 6 montrent une diminution significative de l'expression de l'expression du sucre Galαl,3GaI de l'ordre de 30 à 40 % .
b) Etude de la diminution de l'activité enzymatique αl ,3GT dans les cellules porcines LLC-PKl exprimant des ScFv anti-αl ,3GT.
Des lysats cellulaires totaux provenant des clones de cellules porcines LLC-PK l présentés à la figure 7 (exprimant des séquences codant pour des ScFv anti-αl ,3GT, avec ou sans la séquence KDEL de rétention dans le réticulum endoplasmique) ont été analysés par une technique biochimique mesurant spécifiquement l'activité de l'enzyme αl ,3GT (Cho et al. , 1996, J . Biol. Chem. 271 :3238). Les résultats sont exprimés en moyennes +/- SD des pourcentages d'activité par rapport à celles obtenues à partir de cellules LLC- PKI non transfectées. Ils montrent une diminution significative de l'activité enzymatique de l 'ordre de 40 à 60 % lorsque des séquences ScFv anti-αl ,3GT ScFv-1 ou ScFv-2, le cas échéant associées à la séquence codant KDEL. sont exprimées.
c) Etude de la diminution de la cytotoxicité du sérum humain à encontre des cellules porcines LLC-PKl exprimant des ScFv anti- l ,3GT.
Certains clones de cellules porcines LLC-PKl présentés à la figure 8 (exprimant des séquences codant pour des ScFv anti-α l ,3GT) ont été marqués au 51Cr puis incubés en présence de sérum humain contenant des xénoanticorps anti-Galαl ,3Gal et du complément. Le relargage de 51Cr, comme estimation de la lyse cellulaire, a été mesuré. 100 % de lyse correspond à une lyse totale induite par un agent chimique, et 0 % de lyse correspond à une incubation avec le sérum décomplémenté. Les résultats montrent une diminution importante de la sensibilité à la lyse par le complément humain des clones exprimant les séquences SEQ ID NO 9 (ScFv-1) ou SEQ ID NO 11 (ScFv-2/6). d) Etude de l'augmentation de la valence d'un ScFv anti-αl ,3GT intracellulaire sur le fonctionnement de l'enzyme.
Cette augmentation a été testée par fusion des séquences de dimérisation et de tetramerisation zip et T-zip dérivées du facteur GCN4 (Pack et al. , 1995) à
5 l'extrémité C-terminale de la séquence nucléotidique SEQ ID NO 1 1 ; les séquences résultantes sont désignées ScFv-zip et ScFv-tetrazip sur la figure 9.
Les constructions obtenues ont été sous-clonées dans le vecteur d'expression eucaryote pHook (Invitrogen) permettant l'identification en cytométrie de flux des cellules exprimant ces plasmides (car possédant une séquence codant pour
10 un marqueur membranaire identifiable). Après transfection transitoire de cellules porcines LLC-PKl avec la séquence SEQ ID NO 1 1 comportant une séquence de dimérisation (ScFv-zip), une diminution de l'expression de l'épitope
Galα l ,3Gal de 31 % par rapport aux cellules de départ a été observée dans les cellules exprimant le vecteur. Dans les mêmes cellules transfectées avec la
15 séquence SEQ ID NO 11 comportant une séquence de tetramerisation (ScFv- tetrazip), une diminution de l 'expression de l'épitope Galαl ,3Gal de 45 % par rapport aux cellules de départ a été observée.
En conclusion, l'expression dans des cellules de porc des séquences 20 nucléotidiques SEQ ID NO 9 et SEQ ID NO 1 1 entraînent une diminution importante de l'activité enzymatique αl ,3GT et une diminution significative de la présence du sucre GaIαl ,3Gal à la surface des cellules. Cette diminution est suffisante pour entraîner une protection très importante vis à vis de la lyse induite par le complément humain. Ces résultats démontrent l'intérêt de 25 l'expression des séquences ScFv anti-αl ,3GT chez le porc dans une situation de xénogreffe porc-homme. L'augmentation de la valence de l'anticorps intracellulaire codé par la séquence SEQ ID NO 1 1 entraîne une augmentation de son efficacité inhibitrice.
30
J-1 Légendes des figures :
- Figure 1 :
Analyse des séquences des transcripts des isoformes de l 'αl ,3GT de porc,
5 et alignement sur une carte de transcript primaire murine. Les ADNc des isoformes 1 , 3 et 4 ont été clones à partir d'ARNm rétrotranscripts et amplifiés par PCR provenant de PAEC et l'ADNc correspondant à l 'isoforme 2 a été clone à partir d'une banque LLC-pKl , comme décrit ci-dessus. La séquence nucléotidique a été déterminée par utilisation de Séquenase (USB), et comparée ι o par contrôle avec les séquences correspondant aux isoformes 1 et 2 décrites par
Strahan et al. , 1995 et Sandrin et al. , 1994. Les numéros en gras sur le côté gauche de la figure correspondant aux isoformes 1 à 4. Les premières bases des exons 5 , 6 et 7 sont numérotées sur la séquence correspondant à l' isoforme 1 . Les chiffres représentés en italique indiquent le nombre de bases manquantes
15 dans l'exon épissé correspondant. La carte primaire de transcription de la souris avec ses 9 exons, telle que décrite par Joziasse et al . , 1992, est comparée avec les séquences des isoformes 1 à 4.
La queue cytoplasmique (encadré noir) et la région transmembranaire (encadré avec lignes verticales) sont codées par l'exon 4. Les régions d'origine
20 (encadré grise) comprend les exons 5 et 6. Les exons 5 et 6 sont épissés alternativement chez la souris et le porc. Le domaine catalytique est codé par les exons 7, 8 et 9.
- Figure 2 :
25 Réactivité mesurée par ELISA de préparations non purifiées de phages correspondant à 15 clones reconnaissant la protéine αl ,3GT: Quatre vingt seize colonies individuelles de bactéries TG1 contenant un clone pHEN-1-ScFv, présélectionnées par une procédure d'enrichissement décrite dans Nissim et al. , 1994, ont été cultivées et leur surnageant (contenant les phages exprimant
30 l'anticorps) testé en ELISA comme décrit dans Matériels et Méthodes ci-dessus.
Les 15 surnageants positifs (numérotés 1 à 15) sont représentés en abscisse sur la figure. Le contrôle négatif (-) est constitué d'un blanc et le contrôle positif ( + ) par la mesure de la densité optique obtenue par la réaction d'un phage M13 (Pharmacia) sur une lgG de souris anti-phage M13 (Pharmacia) déposée sur la
35 plaque . Les valeurs de densité optique (DO) sont indiquées en ordonnée. - Figure 3 :
Réactivité mesurée par ELISA de phages purifiés correspondant à 6 clones reconnaissant la protéine αl ,3GT: Les six clones les plus positifs dans l'ELISA ci-dessus (Fig.2) ont été amplifiés en vue de la préparation de phages purifiés. 5 Les phages purifiés et concentrés ont été re-testés en ELISA, de manière similaire à ce qui est décrit dans la figure 2. Ces phages ont été testés à une dilution de 1 à 1/8. Les dilutions effectuées sont représentées en abscisse, et la densité optique (DO) mesurée est indiquée en ordonnée, la courbe correspondant au contrôle positif passe par des points représentés par des croix, celle
I O correspondant au phage contenant ScFvl (M13-ScFv.l) passe par des points représentés par un point noir au centre de carrés blancs, celle correspondant au phage contenant ScFv2 (M13-ScFv2) passe par des points représentés par des losanges noirs, celle correspondant au phage contenant ScFv3 (M13-ScFv3) passe par des points représentés par des points représentés par un point blanc au
15 centre de carrés noirs, celle correspondant au phage contenant ScFv4 (M13-
ScFv4) passe par des points représentés par des losanges blancs, celle correspondant au phage contenant ScFv5 (M13-ScFv5) passe par des points représentés par des carrés noirs, celle correspondant au phage contenant ScFv6 (M 13-ScFv6) passe par des points représentés par des carrés blancs, le blanc 0 étant représenté par un rond noir.
- Figure 4 :
Cet exemple de construction consiste en l'utilisation du promoteur du CMH-1 de souris H-2Kb, permettant l'insertion du transgène (ADNc ScFv ; 5 0,7Kb) entre la partie promotrice proprement dite (promoteur H-2kb ; 4Kb) et une série d' introns/exons (5,5 Kb) appartenant au gène H-2Kb, cette série étant suivie par pA SV40 de 0,3 Kb. Ces introns contiennent des séquences régulatrices permettant d'obtenir une bonne activité du promoteur, et donc une bonne expression du transgène. Le promoteur H-2Kb permet une expression 0 constitutive et ubiquitaire de l'ADNc dont il contrôle l'expression (Kimura et al . , 1986; Byrne et al. , 1995).
- Figure 5 :
Cet exemple de construction consiste en l'utilisation du minigène DAF
35 (Cozzi et al. , 1996), dont l'efficacité a déjà été démontrée en transgenèse chez le porc. De manière analogue à la construction H-2Kb, ce minigène place l'ADNc
ScFv (0,7 Kb) sous le contrôle du promoteur du DAF, lui-même contrôlé par des séquences introniques (l'ensemble constitué par le promoteui DAF, les exons et les introns représentant 4,6 Kb), l'ADNc ScFv étant suivie par pA SV40 de 0,3 Kb
- Figure 6
Cette figure représente l'analyse en cytométπe de flux (FACscan) de la îeconnaissance des épitopes Galαl ,3Gal par la lectine IB4-FITC, en comparaison avec des cellules LLC-PKl non transfectées Les résultats sont des pourcentages moyens +/- SD de fluorescence par rapport à la fluoiescenee obtenue a partir des LLC-PKl non transfectées n nombre de clones indépendants analysés par groupe, ScFv-neg cellules LLC PKI non tiansfectees, ScFv-1 cellules LLC-PKl transfectées avec le clone ScFv-1 , ScF\ -2/6 cellules LLC-PKl transfectées avec le clone ScFv-2 ou ScFv-6 les pouicentages de fluorescence sont indiques en ordonnée
- Figure 7
Mesure de l'activité αl ,3GT dans les cellules porcines LLC-PKl transfectées avec le clone ScFv-1 , ou ScFv-2, avec ou sans la séquence KDEL de letention dans le réticulum endoplasmique n nombre de clones indépendants analysés par groupe, ScFv-neg cellules LLC PKI non tiansfectees, ScFv-1 cellules LLC-PKl transfectées avec le clone ScFv- 1 , ScFv-2 cellules LLC-PKl transfectées avec le clone ScFv-2, ScFv- 1 KDEL cellules LLC-PKl transfectées avec le clone ScFv-1 et contenant la séquence codant KDEL, ScFv-2KDEL cellules LLC-PKl transfectées avec le clone ScFv 2 et contenant la séquence codant KDEL, les pourcentages d'activité α
1 ,3G1 sont indiqués en ordonnée
Figure 8 Mesure de la lyse par le complément des cellules LLC-PKl transfectées ou non avec des séquences ScFv antι-αl,3GT, et incubées avec du sérum humain contenant des xenoanticorps naturels les dilutions de sérum sont indiquées en abscisse, et le pourcentage de cytotoxicité en ordonnée (moyenne de deux expenences indépendantes), carrés creux cellules LLC-PKl non transfectées. cai res pleins cellules LLC-PKl transfectées avec un plasmide contrôle, cercles creux cellules LLC-PKl exprimant le ScFv correspondant à la séquence SEQ
ID NO 9 (clone 1 7-7), cercles pleins cellules LLC-PKl exprimant le ScFv coπespondant à la séquence SEQ ID NO 11 (clone 2 6-2) - Figure 9 :
Mesure de l'augmentation de la valence d'un ScFv anti-αl ,3GT intracellulaire sur le fonctionnement de l'enzyme. L'intensité de fluorescence est indiquée en ordonnée (unités arbitraires); LLC-PKl : cellules LLC-PKl non transfectées; ScFv-neg : cellules LLC-PKl transfectées avec un plasmide de contrôle ne contenant pas de séquence ScFv; ScFv2zip : cellules LLC-PKl transfectées avec la séquence SEQ ID NO 1 1 comportant une séquence de dimérisation (ScFv-zip); ScFv2tetrazip : cellules LLC-PKl transfectées avec la séquence SEQ ID NO 11 comportant une séquence de tetramerisation (ScFv- tetrazip).
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Allan, J.S. Xenotransplantation at a crossroads: prévention versus progress. Nature Medicine 2, 18-21 (1996).
Amstrong, D. T. , and M. A. Opavoky. 1988. Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone. Biol Reprod 39:51 1 .
20
Bach, F. H. et al. Barriers to xenotransplantation. Nature Medicine 1 , 869- 873 ( 1995).
Byrne, G. W. , K. R. McCurry, D. Kagan, C. Quinn, M. J. Martin, J. L. 25 Platt, and J. S. Logan. 1995. Protection of xenogenic cardiac endothelium from human complément by expression of CD59 or DAF in transgenic micc. Transplantation 60: 1149-1156.
Carrington, C.A. et al. Expression of human DAF and MCP on pig 30 endothelialm cells protects from human complément. Transpl. Proc. 27, 321 -
323 ( 1995).
Clackson, T. , H. R. Hoogenboom, A. D. Griffiths, and G. Winter. 1991 . Making antibody fragments using phage display libraries. Nature 352:624-628.
3.ι
Cozzi, E. , and D. J. G. White. 1995. The génération of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine 1 :964-966. Cozzi, E., Langford, G. A., Pino-Chavez, G., Wright, L., Levy, N.,
Miller. N., Davies, H., Chatterjee, M., Lancaster, R., Tolan, M.J., White,
D.J.G. 1996. Longitudinal analysis of the expression of human decay
5 accelerating factor (HDAF) on lymphocytes, in the plasma, and in the skin biopsies of transgenic pigs. Xenotransplantation, 3128-133.
Dahdal, R. Y., and Colley, K.J. (1993) J. Biol. Chem.268 (35), 26310- 26319 o
DePamphilis, M.L., Herman, S.A., Martinez-Salas, E., Chalifour, L.E., Wirak, D.O., Cupo, D.Y., Miranda, M.,. 1988. Microinjecting DNA into mouse ova to study DNA replication and gène expression and to produce transgenic animais. BioTechniques, 6, 662-680. 5
Guerif, F., Anegon, L., Mauff, B.L., Soulillou, J.P., and Pourcel, C. (1995)Transpl. Proc.27,2491
Joziasse, D.H., Shaper, N.L., Kim, D., Eijnden, D.H.V. d., and Shaper, 0 J.H. (1992) J. Biol. Chem.267 (8), 5534-5541
Kimura, A., A. Israël, O. L. Bail, and P. Koursilsky. 1986. Detailed analysis of the mouse H-2Kb promoter: enhancer-like séquences and their rôle in the régulation of class I gène expression. Cell 44:261-272. 5
Lammers, G., and Jamieson, J.C. (1989) Biochem. J.261, 389-393
Maciejewski, J. P., F. F. Weichold, N. S. Young, A. Cara, D. Zella, M. S. Reitz, and R. C. Gallo. 1995. Intracellular expression of antibody fragments 30 directed against HIV reverse transcriptase prevents HIV infection in vitro.
Nature Medicine 1:667-673.
Malorni, W., Rivabene, R., Santini, M. T., Paradisi, S., Losi, F., and Donelli, G. (1993) FEBS Lett 336, 335-339 i.*-
Melton, D.A., Krieg, P. A. Rebagliati, M.R., Maniatis, T., Zinn, K.. and Green, M.R. (1984) Nucl. Acids Res.12, 7035-7056 Nissim, A. et al. Antibody fragments from a single pot phage display library as immunological reagents. EMBO. J . 13, 692-698 (1994).
Oriol , R. , Ye, Y. , Koren, E. , and Cooper, D. K. C. (1993)
Transplantation 56, 1433-1442
Pack et ai , 1995 , J. Mol. Biol. 246:28
Richardson, J.H . , Sodroski, J.G. , Waldman, T. A. & Marasco, W.A.
Phenotypic knock out of the high-affinity interleukin 2 receptor by intracellular single-chain antibodies against the alpha subunit of the receptor. Proc. Natl. Acad. U. S. A . 92, 3137-3141 (1995).
Roth, J. , and Berger, E.G. (1982) J. Cell. Biol. 93, 223-229
Sandrin, M. S. , Vaughan, H. A. , Dabkowski, P.L. & McKenzie, I.F.C. Anti-pig IgM antibodies in human sérum react predominantly with Gal(alphal- 3)Gal épitopes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 11391-1 1395 (1993).
Sandrin, M. S. Dabkowski, P.L. Henning, M. M. Mouhtouris, E. , and McKenzie, I.F.C. (1994) Xenotransplantation 1 , 81-88
Shaper, N.L. Shaper, J.L. , Meuth, J.L. , Fox, J.L. , Chang, H. , Kirsh, I. R. , and Hollis, G. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 83, 1573-1577
Strahan, K. M. , Gu, F. , Pearce, A. F. , Gustavsson, L , Andersson, L. , and Gustavsson, K. (1995) Immunogenetics 41 , 101-105
Tomlinson, I.M. , Walter, G. , Marks, J.D. , Llewelyn, M.B. & Winter, G.
The répertoire of human germline VH séquences reveals about fifty groups of VH segments with différent hypervariable loops. J. Mol. Biol. 227, 776-798 (1992).
Warren, J.B. (1990) in The endothelium, an introduction to current research. (Warren, ed), pp. 263-272, Wiley-Liss, New-York Weinstein, J. , Lee, E.U. , McEntee, K. , Lai, P. H. , and Paulson, J.C. (1987) J . Biol. Chem. 262 (36), 17735-17743
White, D. J. G. , E. Gozzi, G. Langford, T. Oglesby, N. M. Wang, L. Wright, and J. Wallwork. 1994. Contrôle du rejet hyperaigu de xénogreffe pat- modification génétique du donneur. Flammarion Médecine -Sciences-Actualités Nephrologiques: 1-10.
Yadav, S. P. and Brew, K. (1991) J. Biol. Chem. 266, 698-703
Zipfel, P. F. Irving, S.G. Kelly, K. , and Siebenlist, U. (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 1041 -1048
LISTE DE SEQUENCES
il) INFORMATION GENERALE
U' DEPOSANT
(A) NOM INSERM
(B) RUE 101, rue de Tolbiac
(C) VILLE Paris
(E) PAYS FRANCE
(F) CODE POSTAL 75654 Cedex 13
(n) TITRE DE 1 INVENTION PROCEDE DE PREPARATION D'ORGANES DE MAMMIFERES NON HUMAINS TRANSGENIQUES EN VUE DE LEUR TRANSPLANTATION CHEZ L'HOMME, ET SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES POUR LA MISE EN OEUVRE DE CE PROCEDE
(m) NOMBRE DE SEQUENCES 18
(îv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR
(A) TYPE DE SUPPORT Floppy disk
(B) ORDINATEUR IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL Patentln Release #1 0, Version #1 25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO 1
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR 1128 paires de bases
(B) TYPE acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS simple
(D) CONFIGURATION linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE ADNc pour ARNm
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE
(A) NOM/CLE CDS
(B) EMPLACEMENT 1 1128
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID NO 1
AAT TCG AAA ATA ATG AAT GTC AAA GGA AGA GTG GTT CTG TCA ATG CTG 48
Asn Sei Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu 1 5 10 15
CTT GTC TCA ACT GTA ATG GTT GTG TTT TGG GAA TAC ATC AAC AGC CCA 96
Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Ser Pro 20 25 30
GAA GGT TCT TTG TTC TGG ATA TAC CAG TCA AAA AAC CCA GAA GTT GGC 144
Glu Glv Ser Leu Phe Trp Ile Tyr Gin Ser Lys Asn Pro Glu Val Gly 35 40 45 AGC AGT GCT CAG AGG GGC TGG TGG TTT CCG AGC TGG TTT AAC AAT GGG 192 Ser Ser Ala Gin Arg Gly Trp Trp Phe Pro Ser Trp Phe Asn Asn Gly 50 55 60
ACT CAC AGT TAC CAC GAA GAA GAA GAC GCT ATA GGC AAC GAA AAG GAA 240 Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu 65 70 75 80
CAA AGA AAA GAA GAC AAC AGA GGA GAG CTT CCA CTA GTG GAC TGG TTT 288 Gin Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe 85 90 95
AAT CCT GAG AAA CGC CCA GAG GTC GTG ACC ATA ACC AGA TGG AAG GCT 336 Asn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala 100 105 110
CCA GTG GTA TGG GAA GGC ACT TAC AAC AGA GCC GTC TTA GAT AAT TAT 384 Pro Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr 115 120 125
TAT GCC AAA CAG AAA ATT ACC GTG GGC TTG ACG GTT CTT GCT GTC GGA 432 Tyr Ala Lys Gin Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly 130 135 140
AGA TAC ATT GAG CAT TAC TTG GAG GAG TTC TTA ATA TCT GCA AAT ACA 480 Arg Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr 145 150 155 160
TAC TTC ATG GTT GGC CAC AAA GTC ATC TTT TAC ATC ATG GTG GAT GAT 528 Tyr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp 165 170 175
ATC TCC AGG ATG CCT TTG ATA GAG CTG GGT CCT CTG CGC TCC TTT AAA 576 Ile Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys 180 185 190
GTG TTT GAG ATC AAG TCC GAG AAG AGG TGG CAA GAC ATC AGC ATG ATG 624 Val Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gin Asp Ile Ser Met Met 195 200 205
CGC ATG AAG ACC ATC GGG GAG CAC ATC CTG GCC CAC ATC CAG CAC GAG 672 Arg Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gin His Glu 210 215 220
GTG GAC TTC CTC TTC TGC ATG GAC GTG GAT CAG GTC TTC CAA AAC AAC 720 Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gin Val Phe Gin Asn Asn 225 230 235 240
TTT GGG GTG GAG ACC CTG GGC CAG TCG GTG GCT CAG CTA CAG GCC TGG 768 Phe Gly Val Glu Thr Leu Gly Gin Ser Val Ala Gin Leu Gin Ala Trp 245 250 255
TGG TAC AAG GCA CAT CCT GAC GAG TTC ACC TAC GAG AGG CGG AAG GAG 816 Trp Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu 260 265 270 TCC GCA GCC TAC ATT CCG TTT GGC CAG GGG GAT TTT TAT TAC CAC GCA 864 Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gin Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala 275 280 285
GCC ATT TTT GGG GGA ACA CCC ACT CAG GTT CTA AAC ATC ACT CAG GAG 912
Ala Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gin Val Leu Asn Ile Thr Gin Glu
290 295 300
TGC TTC AAG GGA ATC CTC CAG GAC AAG GAA AAT GAC ATA GAA GCC GAG 960 Cys Phe Lys Gly Ile Leu Gin Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu 305 310 315 320
TGG CAT GAT GAA AGC CAT CTA AAC AAG TAT TTC CTT CTC AAC AAA CCC 1008 Trp His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro
325 330 335
ACT AAA ATC TTA TCC CCA GAA TAC TGC TGG GAT TAT CAT ATA GGC ATG 1056 Thr Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met 340 345 350
TCT GTG GAT ATT AGG ATT GTC AAG ATA GCT TGG CAG AAA AAA GAG TAT 1104
Ser Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gin Lys Lys Glu Tyr
355 360 365
AAT TTG GTT AGA AAT AAC ATC TG 1128
Asn Leu Val Arg Asn Asn Ile
370 375
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 2:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 375 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 2:
Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu 1 5 10 15
Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Ser Pro 20 25 30
Glu Gly Ser Leu Phe Trp Ile Tyr Gin Ser Lys Asn Pro Glu Val Gly 35 40 45
Ser Ser Ala Gin Arg Gly Trp Trp Phe Pro Ser Trp Phe Asn Asn Gly
50 55 60
Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu 65 70 75 80 Gin Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe 85 90 95
Asn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala 100 105 110
Pro Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr 115 120 125
Tyr Ala Lys Gin Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly 130 135 140
Arg Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr 145 150 155 160
Tyr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp 165 170 175
Ile Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys 180 185 190
Val Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gin Asp Ile Ser Met Met 195 200 205
Arg Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gin His Glu 210 215 220
Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gin Val Phe Gin Asn Asn 225 230 235 240
Phe Gly Val Glu Thr Leu Gly Gin Ser Val Ala Gin Leu Gin Ala Trp 245 250 255
Trp Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu 260 265 270
Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gin Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala 275 280 285
Ala Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gin Val Leu Asn Ile Thr Gin Glu 290 295 300
Cys Phe Lys Gly Ile Leu Gin Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu 305 310 315 320
Trp His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro 325 330 335
Thr Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met 340 345 350
Ser Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gin Lys Lys Glu Tyr 355 360 365
Asn Leu Val Arg Asn Asn Ile 370 375 !2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO 3
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR 1092 paires de bases
(B) TYPE acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS simple
(D) CONFIGURATION linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE ADNc pour ARNm
,ιx) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE
(A) NOM/CLE CDS
(B) EMPLACEMENT 1 1092
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID NO 3
AAT TCG AAA ATA ATG AAT GTC AAA GGA AGA GTG GTT CTG TCA ATG CTG 48 Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu 1 5 10 15
CTT GTC TCA ACT GTA ATG GTT GTG TTT TGG GAA TAC ATC AAC AGA AAC 96 Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Arg Asn 20 25 30
CCA GAA GTT GGC AGC AGT GCT CAG AGG GGC TGG TGG TTT CCG AGC TGG 144 Pro Glu Val Gly Ser Ser Ala Gin Arg Gly Trp Trp Phe Pro Sei Trp 35 40 45
TTT AAC AAT GGG ACT CAC AGT TAC CAC GAA GAA GAA GAC GCT ATA GGC 19? Phe Asn Asn Gly Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly 50 55 60
AAC GAA AAG GAA CAA AGA AAA GAA GAC AAC AGA GGA GAG CTT CCA CTA 240 Asn Glu Lys Glu Gin Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu 65 70 75 80
GTG GAC TGG TTT AAT CCT GAG AAA CGC CCA GAG GTC GTG ACC ATA ACC 288 Val Asp Trp Phe Asn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr 85 90 95
AGA TGG AAG GCT CCA GTG GTA TGG GAA GGC ACT TAC AAC AGA GCC GTC 336 Arg Trp Lys Ala Pro Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val 100 105 110
TTA GAT AAT TAT TAT GCC AAA CAG AAA ATT ACC GTG GGC TTG ACG GTT 384 Leu Asp Asn Tyr Tyr Ala Lys Gin Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val 115 120 125
CTT GCT GTC GGA AGA TAC ATT GAG CAT TAC TTG GAG GAG TTC TTA ATA 432 Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile 130 135 140 TCT GCA AAT ACA TAC TTC ATG GTT GGC CAC AAA GTC ATC TTT TAC ATC 480 Ser Ala Asn Thr Tyr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile 145 150 155 160
ATG GTG GAT GAT ATC TCC AGG ATG CCT TTG ATA GAG CTG GGT CCT CTG 528 Met Val Asp Asp Ile Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu 165 170 175
CGC TCC TTT AAA GTG TTT GAG ATC AAG TCC GAG AAG AGG TGG CAA GAC 576 Arg Ser Phe Lys Val Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gin Asp 180 185 190
ATC AGC ATG ATG CGC ATG AAG ACC ATC GGG GAG CAC ATC CTG GCC CAC 624 Ile Ser Met Met Arg Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His 195 200 205
ATC CAG CAC GAG GTG GAC TTC CTC TTC TGC ATG GAC GTG GAT CAG GTC 672 Ile Gin His Glu Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gin Val 210 215 220
TTC CAA AAC AAC TTT GGG GTG GAG ACC CTG GGC CAG TCG GTG GCT CAG 720 Phe Gin Asn Asn Phe Gly Val Glu Thr Leu Gly Gin Ser Val Ala Gin 225 230 235 240
CTA CAG GCC TGG TGG TAC AAG GCA CAT CCT GAC GAG TTC ACC TAC GAG 768 Leu Gin Ala Trp Trp Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu 245 250 255
AGG CGG AAG GAG TCC GCA GCC TAC ATT CCG TTT GGC CAG GGG GAT TTT 816 Arg Arg Lys Glu Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gin Gly Asp Phe 260 265 270
TAT TAC CAC GCA GCC ATT TTT GGG GGA ACA CCC ACT CAG GTT CTA AAC 864 Tyr Tyr His Ala Ala Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gin Val Leu Asn 275 280 285
ATC ACT CAG GAG TGC TTC AAG GGA ATC CTC CAG GAC AAG GAA AAT GAC 912 Ile Thr Gin Glu Cys Phe Lys Gly Ile Leu Gin Asp Lys Glu Asn Asp 290 295 300
ATA GAA GCC GAG TGG CAT GAT GAA AGC CAT CTA AAC AAG TAT TTC CTT 960 Ile Glu Ala Glu Trp His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu 305 310 315 320
CTC AAC AAA CCC ACT AAA ATC TTA TCC CCA GAA TAC TGC TGG GAT TAT 1008 Leu Asn Lys Pro Thr Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr 325 330 335
CAT ATA GGC ATG TCT GTG GAT ATT AGG ATT GTC AAG ATA GCT TGG CAG 1056 His Ile Gly Met Ser Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gin 340 345 350
AAA AAA GAG TAT AAT TTG GTT AGA AAT AAC ATC TG 1092
Lys Lys Glu Tyr Asn Leu Val Arg Asn Asn Ile 355 360 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE.
(A) LONGUEUR- 363 acides aminés
(B) TYPE, acide aminé
(D) CONFIGURATION, linéaire
(u) TYPE DE MOLECULE protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO- 4-
Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu 1 5 10 15
Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Arg Asn 20 25 30
Pro Glu Val Gly Ser Ser Ala Gin Arg Gly Trp Trp Phe Pro Ser Trp 35 40 45
Phe Asn Asn Gly Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly 50 55 60
Asn Glu Lys Glu Gin Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu 65 70 75 80
Val Asp Trp Phe Asn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr 85 90 95
Arg Trp Lys Ala Pro Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val 100 105 110
Leu Asp Asn Tyr Tyr Ala Lys Gin Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val 115 120 125
Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ile Glu H s Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile 130 135 140
Ser Ala Asn Thr Tyr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile 145 150 155 160
Met Val Asp Asp Ile Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu 165 170 175
Arg Ser Phe Lys Val Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gin Asp 180 185 190
Ile Ser Met Met Arg Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His 195 200 205
Ile Gin His Glu Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gin Val 210 215 220
Phe Gin Asn Asn Phe Gly Val Glu Thr Leu Gly Gin Ser Val Ala Gin 225 230 235 240 Leu Gin Ala Trp Trp Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu 245 250 255
Arg Arg Lys Glu Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gin Gly Asp Phe 260 265 270
Tyr Tyr His Ala Ala lie Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gin Val Leu Asn 275 280 285
Ile Thr Gin Glu Cys Phe Lys Gly Ile Leu Gin Asp Lys Glu Asn Asp 290 295 300
Ile Glu Ala Glu Trp His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu 305 310 315 320
Leu Asn Lys Pro Thr Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr 325 330 335
His Ile Gly Met Ser Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gin 340 345 350
Lys Lys Glu Tyr Asn Leu Val Arg Asn Asn Ile 355 360
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1065 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE :
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..1065
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 5:
AAT TCG AAA ATA ATG AAT GTC AAA GGA AGA GTG GTT CTG TCA ATG CTG 48
Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu 1 5 10 15
CTT GTC TCA ACT GTA ATG GTT GTG TTT TGG GAA TAC ATC AAC AGC CCA 96 Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Ser Pro 20 25 30
GAA GGT TCT TTG TTC TGG ATA TAC CAG TCA AAG ACT CAC AGT TAC CAC 144 Glu Gly Ser Leu Phe Trp Ile Tyr Gin Ser Lys Thr His Ser Tyr His 35 40 45 GAA GAA GAA GAC GCT ATA GGC AAC GAA AAG GAA CAA AGA AAA GAA GAC 192 Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu Gin Arg Lys Glu Asp 50 55 60
AAC AGA GGA GAG CTT CCA CTA GTG GAC TGG TTT AAT CCT GAG AAA CGC 240 Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe Asn Pro Glu Lys Arg 65 70 75 80
CCA GAG GTC GTG ACC ATA ACC AGA TGG AAG GCT CCA GTG GTA TGG GAA 288 Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala Pro Val Val Trp Glu 85 90 95
GGC ACT TAC AAC AGA GCC GTC TTA GAT AAT TAT TAT GCC AAA CAG AAA 336 Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr Tyr Ala Lys Gin Lys 100 105 110
ATT ACC GTG GGC TTG ACG GTT CTT GCT GTC GGA AGA TAC ATT GAG CAT 384 Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ile Glu His 915 120 125
TAC TTG GAG GAG TTC TTA ATA TCT GCA AAT ACA TAC TTC ATG GTT GGC 432 Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr Tyr Phe Met Val Gly 130 135 140
CAC AAA GTC ATC TTT TAC ATC ATG GTG GAT GAT ATC TCC AGG ATG CCT 480 His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp Ile Ser Arg Met Pro 145 150 155 160
TTG ATA GAG CTG GGT CCT CTG CGC TCC TTT AAA GTG TTT GAG ATC AAG 528 Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys Val Phe Glu Ile Lys 165 170 175
TCC GAG AAG AGG TGG CAA GAC ATC AGC ATG ATG CGC ATG AAG ACC ATC 576 Ser Glu Lys Arg Trp Gin Asp Ile Ser Met Met Arg Met Lys Thr Ile 180 185 190
GGG GAG CAC ATC CTG GCC CAC ATC CAG CAC GAG GTG GAC TTC CTC TTC 624 Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gin His Glu Val Asp Phe Leu Phe 195 200 205
TGC ATG GAC GTG GAT CAG GTC TTC CAA AAC AAC TTT GGG GTG GAG ACC 672 Cys Met Asp Val Asp Gin Val Phe Gin Asn Asn Phe Gly Val Glu Thr 210 215 220
CTG GGC CAG TCG GTG GCT CAG CTA CAG GCC TGG TGG TAC AAG GCA CAT 720 Leu Gly Gin Ser Val Ala Gin Leu Gin Ala Trp Trp Tyr Lys Ala His 225 230 235 240
CCT GAC GAG TTC ACC TAC GAG AGG CGG AAG GAG TCC GCA GCC TAC ATT 768 Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu Ser Ala Ala Tyr Ile 245 250 255
CCG TTT GGC CAG GGG GAT TTT TAT TAC CAC GCA GCC ATT TTT GGG GGA 816 Pro Phe Gly Gin Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala Ile Phe Gly Gly 260 265 270 ACA CCC ACT CAG GTT CTA AAC ATC ACT CAG GAG TGC TTC AAG GGA ATC 864 Thr Pro Thr Gin Val Leu Asn Ile Thr Gin Glu Cys Phe Lys Gly Ile 275 280 285
CTC CAG GAC AAG GAA AAT GAC ATA GAA GCC GAG TGG CAT GAT GAA AGC 912 Leu Gin Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu Trp His Asp Glu Ser 290 295 300
CAT CTA AAC AAG TAT TTC CTT CTC AAC AAA CCC ACT AAA ATC TTA TCC 960 His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro Thr Lys Ile Leu Ser 305 310 315 320
CCA GAA TAC TGC TGG GAT TAT CAT ATA GGC ATG TCT GTG GAT ATT AGG 1008 Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met Ser Val Asp Ile Arg 325 330 335
ATT GTC AAG ATA GCT TGG CAG AAA AAA GAG TAT AAT TTG GTT AGA AAT 1056 Ile Val Lys Ile Ala Trp Gin Lys Lys Glu Tyr Asn Leu Val Arg Asn 340 345 350
AAC ATC TG 1065
Asn Ile
355
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 354 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 6:
Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu 1 5 10 15
Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Ser Pro 20 25 30
Glu Gly Ser Leu Phe Trp Ile Tyr Gin Ser Lys Thr His Ser Tyr His 35 40 45
Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu Gin Arg Lys Glu Asp 50 55 60
Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe Asn Pro Glu Lys Arg 65 70 75 80
Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala Pro Val Val Trp Glu 85 90 95 Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr Tyr Ala Lys Gin Lys 100 105 110
Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ile Glu His 115 120 125
Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr Tyr Phe Met Val Gly 130 135 140
His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp Ile Ser Arg Met Pro 145 150 155 160
Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys Val Phe Glu Ile Lys 165 170 175
Ser Glu Lys Arg Trp Gin Asp Ile Ser Met Met Arg Met Lys Thr Ile 180 185 190
Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gin His Glu Val Asp Phe Leu Phe 195 200 205
Cys Met Asp Val Asp Gin Val Phe Gin Asn Asn Phe Gly Val Glu Thr 210 215 220
Leu Gly Gin Ser Val Ala Gin Leu Gin Ala Trp Trp Tyr Lys Ala His 225 230 235 240
Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu Ser Ala Ala Tyr Ile 245 250 255
Pro Phe Gly Gin Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala Ile Phe Gly Gly 260 265 270
Thr Pro Thr Gin Val Leu Asn Ile Thr Gin Glu Cys Phe Lys Gly Ile 275 280 285
Leu Gin Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu Trp His Asp Glu Ser 290 295 300
His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro Thr Lys Ile Leu Ser 305 310 315 320
Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met Ser Val Asp Ile Arg 325 330 335
Ile Val Lys Ile Ala Trp Gin Lys Lys Glu Tyr Asn Leu Val Arg Asn 340 345 350
Asn Ile (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1029 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: Simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
dx) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE :
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..1029
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 7:
AAT TCG AAA ATA ATG AAT GTC AAA GGA AGA GTG GTT CTG TCA ATG CTG 48 Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu
1 5 10 15
CTT GTC TCA ACT GTA ATG GTT GTG TTT TGG GAA TAC ATC AAC AGG ACT 96 Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Arg Thr 20 25 30
CAC AGT TAC CAC GAA GAA GAA GAC GCT ATA GGC AAC GAA AAG GAA CAA 144 His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu Gin 35 40 45
AGA AAA GAA GAC AAC AGA GGA GAG CTT CCA CTA GTG GAC TGG TTT AAT 192 Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe Asn 50 55 60
CCT GAG AAA CGC CCA GAG GTC GTG ACC ATA ACC AGA TGG AAG GCT CCA 240 Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala Pro 65 70 75 80
GTG GTA TGG GAA GGC ACT TAC AAC AGA GCC GTC TTA GAT AAT TAT TAT 288 Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr Tyr 85 90 95
GCC AAA CAG AAA ATT ACC GTG GGC TTG ACG GTT CTT GCT GTC GGA AGA 336 Ala Lys Gin Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly Arg 100 105 110
TAC ATT GAG CAT TAC TTG GAG GAG TTC TTA ATA TCT GCA AAT ACA TAC 384 Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr Tyr 115 120 125
TTC ATG GTT GGC CAC AAA GTC ATC TTT TAC ATC ATG GTG GAT GAT ATC 432 Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp Ile 130 135 140 TCC AGG ATG CCT TTG ATA GAG CTG GGT CCT CTG CGC TCC TTT AAA GTG 480
Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys Val 145 150 155 160
TTT GAG ATC AAG TCC GAG AAG AGG TGG CAA GAC ATC AGC ATG ATG CGC 528 Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gin Asp Ile Ser Met Met Arg 165 170 175
ATG AAG ACC ATC GGG GAG CAC ATC CTG GCC CAC ATC CAG CAC GAG GTG 576 Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gin His Glu Val 180 185 190
GAC TTC CTC TTC TGC ATG GAC GTG GAT CAG GTC TTC CAA AAC AAC TTT 624 Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gin Val Phe Gin Asn Asn Phe 195 200 205
GGG GTG GAG ACC CTG GGC CAG TCG GTG GCT CAG CTA CAG GCC TGG TGG 672 Gly Val Glu Thr Leu Gly Gin Ser Val Ala Gin Leu Gin Ala Trp Trp 210 215 220
TAC AAG GCA CAT CCT GAC GAG TTC ACC TAC GAG AGG CGG AAG GAG TCC 720 Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu Ser 225 230 235 240
GCA GCC TAC ATT CCG TTT GGC CAG GGG GAT TTT TAT TAC CAC GCA GCC 768 Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gin Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala 245 250 255
ATT TTT GGG GGA ACA CCC ACT CAG GTT CTA AAC ATC ACT CAG GAG TGC 816 Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gin Val Leu Asn Ile Thr Gin Glu Cys 260 265 270
TTC AAG GGA ATC CTC CAG GAC AAG GAA AAT GAC ATA GAA GCC GAG TGG 864 Phe Lys Gly Ile Leu Gin Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu Trp 275 280 285
CAT GAT GAA AGC CAT CTA AAC AAG TAT TTC CTT CTC AAC AAA CCC ACT 912 His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro Thr 290 295 300
AAA ATC TTA TCC CCA GAA TAC TGC TGG GAT TAT CAT ATA GGC ATG TCT 960 Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met Ser 305 310 315 320
GTG GAT ATT AGG ATT GTC AAG ATA GCT TGG CAG AAA AAA GAG TAT AAT 1008 Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gin Lys Lys Glu Tyr Asn 325 330 335
TTG GTT AGA AAT AAC ATC TG 1029
Leu Val Arg Asn Asn Ile 340 ( 2 ) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 8 :
( a ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
( A) LONGUEUR . 342 ac ides aminés
( B ) TYPE : acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu 1 5 10 15
Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Arg Thr 20 25 30
His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu Gin 35 40 45
Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe Asn 50 55 60
Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala Pro 65 70 75 80
Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr Tyr 85 90 95
Ala Lys Gin Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Va] Gly Arg 100 105 110
Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr Tyr 115 120 125
Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp Ile 130 135 140
Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys Val 145 150 155 160
Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gin Asp Ile Ser Met Met Arg 165 170 175
Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gin His Glu Val 180 185 190
Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gin Val Phe Gin Asn Asn Phe 195 200 205
Gly Val Glu Thr Leu Gly Gin Ser Val Ala Gin Leu Gin Ala Trp Trp 210 215 220
Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu Ser 225 230 235 240 5!
Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gin Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala 245 250 255
Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gin Val Leu Asn Ile Thr Gin Glu Cys 260 265 270
Phe Lys Gly Ile Leu Gin Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu Trp 275 280 285
His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro Thr 290 295 300
Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met Ser 305 310 315 320
Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gin Lys Lys Glu Tyr Asn 325 330 335
Leu Val Arg Asn Asn Ile 340
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 708 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléiejue
(C) NOMBRE DE BRINS: Simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
:ιx) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE :
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..708
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC 48
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC ACT AGC TAT 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
GCT ATG CAT TGG GTG CGC CAG GCC CCC GGA CAA AGG CTT GAG TGG ATG 144
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45
GGA TGG ATC AAC GCT GGC AAT GGT AAC ACA AAA TAT TCA CAG AAG TTC 192
Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gin Lys Phe 50 55 60 CAG GGC AGA GTC ACC ATT ACC AGG GAC ACA TCC GCG AGC ACA GCC TAC 240
Gin Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAA GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
GCA AGA AGT GGT ATG TTT TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTG TCG 336 Ala Arg Ser Gly Met Phe Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110
AGA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG 384 Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125
TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACA 432 Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gin Thr 130 135 140
GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA AGC 480 Val Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 145 150 155 160
TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT 528 Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly 165 170 175
AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGC 576 Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 180 185 190
TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT 624 Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu Asp 195 200 205
GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT AAC CAT GTG 672 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val 210 215 220
GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 708
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 235
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 236 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Gly Met Phe Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125
Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gin Thr 130 135 140
Val Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 145 150 155 160
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly 165 170 175
Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 180 185 190
Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu Asp 195 200 205
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val 210 215 220
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 235
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 11:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 711 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(îi) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE :
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..711
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 11:
CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC 48 Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GTT TCC GGA TAC ACC CTC ACT GAA TTA 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30
TCC ATG CAC TGG GTG CGA CAG GCT CCT GGA AAA GGG CTT GAG TGG ATG 144 Ser Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
GGA GGT TTT GAT CCT GAA GAT GGT GAA ACA ATC TAC GCA CAG AAG TTC 192 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
CAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GAG GAC ACA TCT ACA GAC ACA GCC TAC 240 Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
GCA AGA CCT GAG ATT GAT CAG TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTG 336 Ala Arg Pro Glu Ile Asp Gin Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110
TCG AGA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA 384 Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125
TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG 432 Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gin 130 135 140
ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA 480 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 145 150 155 160
AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT 528 Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 165 170 175
GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC 576 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 180 185 190 AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA 624
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 195 200 205
GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT AAC CAT 672
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His 210 215 220
GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 711
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
225 230 235
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 237 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Pro Glu Ile Asp Gin Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125
Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gin
130 135 140
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 145 150 155 160
Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 165 170 175 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 180 185 190
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 195 200 205
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His 210 215 220
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 235
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 717 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE :
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..717
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC 48 Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC ACT AGC TAT 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
GCT ATG AAT TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT GAG TGG ATG 144 Ala Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
GGA TGG ATC AAC ACC AAC ACT GGG AAC CCA ACG TAT GCC CAG GGC TTC 192 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gin Gly Phe 50 55 60
ACA GGA CGG TTT GTC TTC TCC TTG GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT 240 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
CTG CAG ATC TGC AGC CTA AAG GCT GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT 288 Leu Gin Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCA AGA TCT AAT GAT CCT GCT GAT CAG TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC 336
Ala Arg Ser Asn Asp Pro Ala Asp Gin Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
ACC GTG TCG AGA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT 384
Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
GGC GGA TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG 432
Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu 130 135 140
GGA CAG ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT 480
Gly Gin Thr Val Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
145 150 155 160
TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC 528
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val 165 170 175
ATC TAT GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT 576
Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
180 185 190
GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG 624
Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin 195 200 205
GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT 672
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly 210 215 220
AAC CAT GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 717
Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
225 230 235
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 239 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gin Gly Phe 50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Asn Asp Pro Ala Asp Gin Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125
Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu 130 135 140
Gly Gin Thr Val Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr 145 150 155 160
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val 165 170 175
Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 180 185 190
Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin 195 200 205
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly 210 215 220
Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 235
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 762 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(li) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(îx) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE :
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..762 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
CGA TTC ATG GAA AGG CAC TGG ATC TTT CTC TTC CAG GTG CAG CTG GTG 48 Arg Phe Met Glu Arg His Trp Ile Phe Leu Phe Gin Val Gin Leu Val 1 5 10 15
CAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC 96 Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 20 25 30
TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT AGC ATG AAC TGG GTC 144 Cys Ala A] a Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val 35 40 45
CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTT TCA TAC ATT AGT AGT 192 Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser 50 55 60
AGT AGT AGT ACC ATA TAC TAC GCA GAC TCT GTG AAG GGC CGA TTC ACC 240 Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 65 70 75 80
ATC TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC TCA CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC 288 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser 85 90 95
CTG AGA GAC GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT ACA AGA GCT TGG AGG 336 Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ala Trp Arg 100 105 110
ACG GAT TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTG TCG AGA GGT GGA GGC 384 Thr Asp Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly 115 120 125
GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG TCT GAG CTG ACT 432 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr 130 135 140
CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACA GTC AGG ATC ACA 480 Gin Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gin Thr Val Arg Ile Thr 145 150 155 160
TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG 528 Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gin Gin 165 170 175
AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT AAA AAC AAC CGG 576 Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg 180 185 190
CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA 624 Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr 195 200 205 GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT 672
Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
210 215 220
TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT AAC CAT GTG GTA TTC GGC GGA 720
Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly 225 230 235 240
GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT AGC GAA AAG GAC GAG CTG 762
Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu 245 250
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO. 16:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 254 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE- protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
Arg Phe Met Glu Arg His Trp Ile Phe Leu Phe Gin Val Gin Leu Val 1 5 10 15
Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 20 25 30
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val 35 40 45
Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser 50 55 60
Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 65 70 75 80
Ile Sei Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Sei 85 90 95
Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ala Trp Arg 100 105 110
Thr Asp Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly 115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr 130 135 140
Gin Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gin Thr Val Arg Ile Thr 145 150 155 160
Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gin Gin 165 170 175 Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg 180 185 190
Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr 195 200 205
Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 210 215 220
Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly 225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu 245 250
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 687 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(îx) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE :
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..687
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC 48 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 1 5 10 15
ACT AGC TAT GCT ATG CAT TGG GTG CGC CAG GCC CCC GGA CAA AGG CTT 96 Thr Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu 20 25 30
GAG TGG ATG GGA TGG ATC AAC GCT GGC AAT GGT AAC ACA AAA TAT TCA 144 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser 35 40 45
CAG AAG TTC CAG GGC AGA GTC ACC ATT ACC AGG GAC ACA TCC GCG AGC 192 Gin Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser 50 55 60
ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAA GAC ACG GCC GTG 240 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 65 70 75 80
TAT TAC TGT GCA AGA AGT GGG GTG TAT TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC 288 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Val Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 85 90 95 ACC GTG TCG AGA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT 336
Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110
GGC GGA TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG 384 Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu 115 120 125
GGA CAG ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT 432 Gly Gin Thr Val Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr 130 135 140
TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC 480 Tyr Ala Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val 145 150 155 160
ATC TAT GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT 528 Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 165 170 175
GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG 576 Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin 180 185 190
GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT 624 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly 195 200 205
AAC CAT GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT AGC 672 Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser 210 215 220
GAA AAG GAC GAG CTG 687
Glu Lys Asp Glu Leu
225
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 18.
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE.
(A) LONGUEUR: 229 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO- 18:
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 1 5 10 15
Thr Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu 20 25 30
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser 35 40 45 Gin Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser 50 55 60
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Val Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 85 90 95
Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110
Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu 115 120 125
Gly Gin Thr Val Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr 130 135 140
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val 145 150 155 160
Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 165 170 175
Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin 180 185 190
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly 195 200 205
Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser 210 215 220
Glu Lys Asp Glu Leu 225

Claims

REVENDICATIONS
1 . Utilisation de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans un phénomène de rejet de greffe
(encore désignés ci-après anticorps anti-molécules), et notamment contre toute molécule possédant une activité telle que ladite molécule représente un épitope xénoantigénique, ou participe à la biosynthèse d' épitopes xenoantigeniques dans des cellules de mammifères non humains (et plus particulièrement à la surface de ces cellules), ces épitopes étant susceptibles d'être reconnus par des xénoanticorps naturels humains lorsque lesdites cellules, ou organes constitués de ces cellules, de mammifères non humains, sont greffés chez l'homme, pour la préparation de cellules transgéniques, ou organes transgéniques, de mammifères non humains, au sein desquels lesdites molécules forment en totalité ou en partie des complexes immuns avec lesdits anticorps antimolécules, de telle sorte que l'activité desdites molécules dans les phénomènes de rejet de greffe soit totalement ou partiellement inhibée, en particulier que les xénoanticorps susmentionnés ne reconnaissent plus, en totalité ou en partie, les susdits épitopes, ou au sein desquels la biosynthèse desdits épitopes xenoantigeniques est partiellement ou totalement inhibée, lesdites cellules ou lesdits organes transgéniques de mammifères non humains étant destinés à être greffés chez un patient.
2. Utilisation selon la revendication 1 , de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre :
- tout épitope xénoantigénique, glucidique ou non glucidique, reconnu par des xénoanticorps humains, et plus particulièrement les épitopes glucidiques galactosylés situés à la surface des membranes de cellules de mammifères non humains, notamment l'épitope α-galactosyl présent à la surface de cellules de porc et constitué de l'ensemble Galαl,3Gal-N-acétyllactosamine susmentionné,
- toute molécule participant à la biosynthèse d 'épitopes xenoantigeniques chez l'homme, de nature glucidique ou non glucidique, et plus particulièrement les galactosyltransférases présentes dans les cellules de mammifères non humains, notamment l'enzyme αl,3GT présente dans les cellules de porc, - toute molécule à caractère inflammatoire synthétisée dans l'endothélium de mammifères non humains, et dont l'activité biologique conduit notamment à la modification des propriétés anticoagulantes de l'endothélium in vivo en milieu xénogénique, telle que les cyto ines et chemoattracteurs (IL- 1 , IL-6, IL-8, IP- 10, RANTES, MCP/JE, inhibiteurs pl5E, GM-CSF, G-CSF), les molécules d 'adhésion (ELAM-1 , VCAM-1 , ICAM-1 , c-sis, GPlbα, vWF, ligand LAM-1) les facteurs de transcription ou modifiant la transcription (c-fos, NFkB. Gem), les régulateurs du tonus vasculaire (iNO synthase, PGH synthase, endothéline), les facteurs intervenant dans la coagulation (PAF acétyltransférase, facteur tissulaire, PAI-1), les facteurs d'immunocompétence (CMH I, CMH II),
- les récepteurs membranaires à des molécules présentes chez le receveur, l 'action de ces molécules étant dirigée vers un rejet de greffe, dont par exemple le C5aR, ou le TNFαR, ou les récepteurs aux cellules NK.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre l'une au moins des isoformes (et avantageusement contre toutes les isoformes) des galactosyl transférases présentes chez les mammifères non humains, et plus particulièrement de l'enzyme α-l ,3GT présente chez le porc, pour la préparation d'organes de mammifères non humains transgéniques au sein desquels la biosynthèse des épitopes α-galactosyl dans les cellules desdits organes est partiellement ou totalement inhibée.
4. Anticorps, le cas échéant simple brin, dirigés contre l'une au moins des isoformes de l'α-l ,3GT, et plus particulièrement dirigés contre l'une au moins des isoformes de l'α-l ,3GT présentes chez le porc et représentées par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 2 (correspondant à l'isoforme 1), SEQ ID NO 4 (correspondant à l'isoforme 2), SEQ ID NO 6 (correspondant à l'isoforme 3) et SEQ ID NO 8 (correspondant à l'isoforme 4), ces isoformes 1 à 4 étant respectivement codées par les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 7, ou codées par toutes séquences nucléotidiques dérivées de ces dernières, notamment par dégénérescence du code génétique.
5. Anticorps selon la revendication 4, dirigés contre l'une au moins des isoformes 3 et 4 de l'α-l ,3GT présentes chez le porc et représentées par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8.
6. Anticorps selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisés en ce qu' ils sont représentés par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 10 (anticorps désigné ScFvl), SEQ ID NO 12 (anticorps désigné ScFv2), SEQ ID NO 14 (anticorps désigné ScFv3), SEQ ID NO 16 (anticorps désigné ScFv4) et SEQ ID NO 18 (ScFv5), ou par toute séquence en acides aminés dérivée de ces dernières, notamment par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, ou par tout fragment des séquences susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences et lesdits fragments étant susceptibles de reconnaître l'une au moins des isoformes de l'α-l ,3GT.
7. Séquences nucléotidiques codant pour un anticorps selon l'une des revendications 4 à 6, et comportant notamment les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9 (codant pour ScFvl), SEQ ID NO 11 (codant pour ScFv2), SEQ ID NO 13 (codant pour ScFv3), SEQ ID NO 15 (codant pour ScFv4), SEQ ID NO 17 (codant pour ScFv5), ou toute séquence nucléotidique dérivée de ces dernières, notamment les séquences dérivées par dégénérescence du code génétique, et étant néanmoins capables de coder pour les anticorps
ScFvl , ScFv2, ScFv3, ScFv4 ou ScFv5, ou les séquences dérivées par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, ou tout fragment des séquences nucléotidiques susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de coder pour un anticorps susceptible de reconnaître l'une au moins des isoformes de l'a
1 ,3GT.
8. Vecteur contenant l'une au moins des séquences nucléotidiques selon la revendication 7 et les éléments nécessaires à l'expression des anticorps selon l'une des revendications 4 à 6.
9. Hôte cellulaire contenant l'un au moins des vecteurs selon la revendication 8.
10. Mammifère transgénique non humain, ou cellules de mammifères, comprenant dans son génome au moins une séquence nucléotidique codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans un phénomène de rejet de greffe (encore désignés ci-après anticorps anti-molécules), et notamment contre toute molécule possédant une activité telle que ladite molécule représente un épitope xénoantigénique, ou participe à la biosynthèse d' épitopes xenoantigeniques dans des cellules de mammifères non humains (et plus particulièrement à la surface de ces cellules), ces épitopes étant susceptibles d'être reconnus par des xénoanticorps naturels humains lorsque lesdites cellules, ou organes constitués de ces cellules, de mammifères non humains, sont greffés chez l 'homme, et plus particulièrement au moins une séquence nucléotidique selon la revendication 7.
1 1 . Mammifère transgénique non humain tel qu'obtenu par introduction, notamment par microinjection, dans un ovocyte fécondé, d'au moins une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 10, et plus particulièrement de l'une des séquences nucléotidiques selon la revendication 7, et insertion de l'embryon dans la matrice d'une mère de substitution et développement de l'embryon à terme.
12. Mammifère transgénique non humain selon l'une des revendications 10 à 1 1 , tel que produit par croisement d'animaux transgéniques exprimant au moins une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 10, et plus particulièrement au moins une des séquences nucléotidiques selon la revendication 7.
13. Cellules cultivées à partir des animaux transgéniques non humains selon l'une des revendications 10 à 12.
14. Organes de mammifères non humains, comprenant dans le génome des cellules les constituant au moins une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 10, et plus particulièrement au moins une des séquences nucléotidiques selon la revendication 7, tels qu'obtenus par prélèvement sur des mammifères transgéniques non humains selon l'une des revendications 10 à 12.
15. Polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés telle que représentée par la SEQ ID NO 6 (correspondant à l'isoforme 3 de l'αl ,3-GT) ou SEQ ID NO 8 (correspondant à l'isoforme 4 de l'αl ,3-GT), ou tout polypeptide contenant tout fragment d'au moins environ 6 acides aminés, de l'une des susdites séquences d'acides aminés, ledit polypeptide contenant ce fragment étant susceptible de générer des anticorps reconnaissant l'une au moins des quatre isoformes de l'α-l ,3GT, ou toute séquence dérivée de ces dernières, notamment par addition, suppression ou modification d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que la séquence dérivée soit susceptible de générer des anticorps reconnaissant l'une au moins des quatre susdites isoformes.
16. Séquences nucléotidiques comprenant les séquences représentées par SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 7, ou toutes séquences dérivées, notamment par les séquences dérivées par dégénérescence du code génétique, et étant néanmoins capables de coder pour les polypeptides représentés par les séquences en acides aminés représentées par SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8 respectivement, ou les séquences dérivées par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, ou tout fragment des séquences nucléotidiques susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de coder puis un anticorps susceptible de reconnaître l'un au moins des isoformes de l'a 1 ,3 GT.
PCT/FR1997/001340 1996-07-19 1997-07-18 Procede de preparation d'organes de mammiferes non humains transgeniques en vue de leur transplantation chez l'homme, et sequences nucleotidiques pour la mise en oeuvre de ce procede WO1998003653A2 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP10506648A JP2000516804A (ja) 1996-07-19 1997-07-18 トランスジェニック非ヒト哺乳動物臓器のヒトへの移植の目的のためのそれらの調製方法およびその方法を実施するためのヌクレオチド配列
EP97935592A EP0914434A2 (fr) 1996-07-19 1997-07-18 Procede de preparation d'organes de mammiferes non humains transgeniques en vue de leur transplantation chez l'homme, et sequences nucleotidiques pour la mise en oeuvre de ce procede
AU38525/97A AU3852597A (en) 1996-07-19 1997-07-18 Method for preparing transgenic non-human mammalian organs for transplantation to humans, and nucleotide sequences therefor

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9609077A FR2751346A1 (fr) 1996-07-19 1996-07-19 Procede de preparation d'organes de mammiferes non humains transgeniques en vue de leur transplantation chez l'homme, et sequences nucleotidiques pour la mise en oeuvre de ce procede
FR96/09077 1996-07-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO1998003653A2 true WO1998003653A2 (fr) 1998-01-29
WO1998003653A3 WO1998003653A3 (fr) 1998-03-26

Family

ID=9494242

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1997/001340 WO1998003653A2 (fr) 1996-07-19 1997-07-18 Procede de preparation d'organes de mammiferes non humains transgeniques en vue de leur transplantation chez l'homme, et sequences nucleotidiques pour la mise en oeuvre de ce procede

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0914434A2 (fr)
JP (1) JP2000516804A (fr)
AU (1) AU3852597A (fr)
CA (1) CA2258872A1 (fr)
FR (1) FR2751346A1 (fr)
WO (1) WO1998003653A2 (fr)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6399578B1 (en) 1998-12-09 2002-06-04 La Jolla Pharmaceutical Company Conjugates comprising galactose α1,3 galactosyl epitopes and methods of using same
JP2002531072A (ja) * 1998-11-20 2002-09-24 インペリアル・カレッジ・イノベイションズ・リミテッド 異種移植拒絶の抑制
US7763244B2 (en) 2002-07-01 2010-07-27 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to Reg IV

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6787638B1 (en) 1998-12-02 2004-09-07 Applied Molecular Evolution, Inc. Tumor specific human monoclonal antibodies and methods of use
JP4738101B2 (ja) * 2005-08-29 2011-08-03 花王株式会社 吸収性シート

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2813982B2 (ja) * 1989-01-11 1998-10-22 コニカ株式会社 癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素
US5821117A (en) * 1993-03-16 1998-10-13 The Austin Research Institute Xenotransplantation therapies
AU6904794A (en) * 1993-04-30 1994-11-21 Scripps Research Institute, The Transgenic animals having an engineered immune response
JPH09508277A (ja) * 1994-01-27 1997-08-26 ブレサゲン リミテッド ヒト異種移植における超急性拒絶の管理のための物質及び方法
US5750176A (en) * 1994-03-09 1998-05-12 Abbott Laboratories Transgenic non-human mammal milk comprising 2'-fucosyl-lactose
EP0764207A1 (fr) * 1994-06-03 1997-03-26 Diacrin, Inc. Modification cellulaire et procedes d'inhibition des reactions suraigues de rejet des xenogreffes

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002531072A (ja) * 1998-11-20 2002-09-24 インペリアル・カレッジ・イノベイションズ・リミテッド 異種移植拒絶の抑制
US6399578B1 (en) 1998-12-09 2002-06-04 La Jolla Pharmaceutical Company Conjugates comprising galactose α1,3 galactosyl epitopes and methods of using same
US7763244B2 (en) 2002-07-01 2010-07-27 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to Reg IV

Also Published As

Publication number Publication date
EP0914434A2 (fr) 1999-05-12
AU3852597A (en) 1998-02-10
FR2751346A1 (fr) 1998-01-23
CA2258872A1 (fr) 1998-01-29
JP2000516804A (ja) 2000-12-19
WO1998003653A3 (fr) 1998-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11230697B2 (en) Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals
JP6017763B2 (ja) ヒト化免疫グロブリン遺伝子座
JP6824807B2 (ja) 抗体産生非ヒト哺乳動物
JP6705650B2 (ja) ヒトイディオタイプを有するげっ歯類抗体をコードするポリヌクレオチド及びそれを含む動物
ES2581239T3 (es) Aislamiento de cinco genes novedosos que codifican nuevos melanomas de tipo receptor de Fc implicados en la patogénesis del linfoma/melanoma
JP2021061863A (ja) ヒトλ可変領域およびマウス定常領域を含む軽鎖を発現するマウス
EP1680449B1 (fr) Mammifere non-humain transgenique pour la region constante de la chaine lourde des immunoglobulines humaines de classe a et ses applications
US20150017130A1 (en) Methods and compositions for inhibition of immune responses
WO1997007671A1 (fr) Animal chimerique et procede de constitution
JP2002514895A (ja) ブタ細胞相互作用タンパク質
JP2009504183A5 (fr)
JP2009219499A (ja) 遺伝子破壊、それに関連する組成物および方法
CA2187802A1 (fr) Porc negatif pour l'.alpha.(1,3) galactosyltranferase
HU228045B1 (en) Graft rejection suppressing agents
JPH09511393A (ja) キメラ補体インヒビタータンパク質
JP2023155267A (ja) 複数の重鎖免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックげっ歯類由来のヒト抗体
JPH10504707A (ja) 異種移植片の超急性拒否反応を減少させる方法
ES2224713T3 (es) Supresion de rechazo de xenotransplantes.
US10370641B2 (en) Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals
EP0601585B1 (fr) Acide nucléique pour l'inhibition ou la régulation des fonctions d'un gène de la réponse immunitaire, méthode employant le-dit acide nucléique et système immuno-compatible contenant le-dit acide nucléique
EP0914434A2 (fr) Procede de preparation d'organes de mammiferes non humains transgeniques en vue de leur transplantation chez l'homme, et sequences nucleotidiques pour la mise en oeuvre de ce procede
JP2008154468A (ja) ヒトｃｄ１６トランスジェニック非ヒト動物とその利用
EP1470222A2 (fr) Animal transgenique avec immunoglobulines intracellulaires pour la xenotransplantation
WO2003066848A1 (fr) Fgl-2 porcin
CA2340594A1 (fr) Procede pour remodeler le genome d'un animal par transfert zygotique d'une recombinase specifique de site

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CU CZ DE DK EE ES FI GB GE GH HU IL IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT UA UG US UZ VN YU ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH KE LS MW SD SZ UG ZW AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CU CZ DE DK EE ES FI GB GE GH HU IL IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT UA UG US UZ VN YU ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): GH KE LS MW SD SZ UG ZW AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2258872

Country of ref document: CA

Ref country code: CA

Ref document number: 2258872

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1997935592

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09230091

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1997935592

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1997935592

Country of ref document: EP

点击 这是indexloc提供的php浏览器服务，不要输入任何密码和下载