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WO1998059040A2 - Humane katalytische telomerase-untereinheit und deren diagnostische und therapeutische verwendung - Google Patents

Humane katalytische telomerase-untereinheit und deren diagnostische und therapeutische verwendung Download PDF

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WO1998059040A2
WO1998059040A2 PCT/EP1998/003468 EP9803468W WO9859040A2 WO 1998059040 A2 WO1998059040 A2 WO 1998059040A2 EP 9803468 W EP9803468 W EP 9803468W WO 9859040 A2 WO9859040 A2 WO 9859040A2
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WO
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telomerase
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leu
arg
htc
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Gustav Hagen
Hans-Ulrich Siegmund
Walter Weichel
Maresa Wick
Dmitry Zubov
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Bayer Aktiengesellschaft
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • telomeres The genetic material of eukaryotic cells is distributed on linear chromosomes.
  • the ends of the genes are derived from the Greek words telos (end) and meros (part, segment) as telomeres.
  • Most telomeres consist of repetitions of short sequences, which are mainly composed of thymine and guanine (Zakian, 1995).
  • the telomeric sequences of related organisms are often similar and even conserved between more distant species. It is remarkable that in all vertebrates examined so far, the telomeres are built up from the sequence TTAGGG (Meyne et al., 1989).
  • telomeres perform various important functions. They prevent the fusion of chromosomes (McClintock, 1941) and thus the development of dicentric inheritance. Such chromosomes with two centromeres can lead to the development of cancer by loss of heterozygosity or doubling or loss of genes.
  • telomeres serve to distinguish intact hereditary systems from damaged ones. For example, yeast cells stopped dividing when they contained a chromosome without telomer (Sandeil and Zakian, 1993).
  • telomeres Another important task is performed by telomeres in the replication of eukaryotic DNA
  • RNA primers are required to initiate DNA replication. After cleavage of the RNA primer, extension of the Okazaki fragments and subsequent ligation, the newly synthesized DNA strand lacks the 5 'end, because there the RNA
  • telomeres also play an important role in regulating cellular aging (Olovnikov, 1973). Human somatic cells show a limited culture
  • telomeres have central functions in the aging of cells and the stabilization of genetic material and prevention of cancer.
  • telomeres synthesize the telomeres
  • telomere As described above, organisms with linear chromosomes can only partially replicate their genome without a special protective mechanism. Most eukaryotes use a special enzyme, telomerase, to regenerate the telomer sequences. Telomerase is constitutively expressed in the unicellular organisms examined so far. In contrast, telomerase activity was only measured in germ cells and tumor cells in humans, whereas neighboring somatic tissue contained no telomerase (Kim et al, 1994).
  • telomere like the telomeres, was first identified in the ciliate Tetrahymena thermophila. Telomerase activity was demonstrated by extending the single-stranded oligonucleotide d (TTGGGG) 4 in the presence of dTTP and dGTP (Greider and Blackbum, 1985). The 7etr 2y “2e” ⁇ -telomer sequence TTGGGG was repeatedly attached to the primer. Even if as a starting material
  • telomeres Oligonucleotide with the irregular telomer sequence from Saccharomyces cerevisiae, T (G) ⁇ _3, the telomerase extended the primer with the telomer sequence von Tetrahymena (Greider and Blackburn, 1985) From these results it was concluded that the telomerase itself carries with it the template for the sequence of the telomeres
  • RNA component in telomerase After the existence of an RNA component in telomerase could first be demonstrated (Greider and Blackburn, 1987), the gene for the RNA subunit of telomerase was cloned a short time later (Greider and Blackburn, 1989).
  • This RNA contains a region with the Complement to the telomeric sequence of Tetrahymena (hereinafter referred to as "complement region")
  • complement region Complement region
  • telomerase belongs to the class of RNA-dependent DNA polymerases
  • telomeres The first protein subunits of 7etr? Y / we «telomerase, p80 and p95, were identified in 1995 (Collins et al, 1995) The observation that p95 anchors the enzyme to the DNA and p80 binds the RNA component led to following model The complement region of the telomerase RNA attaches to the single-stranded 3 'overhang. The 3' overhang is extended by incorporating the corresponding nucleotides in the 5 '-3' direction. The de «ovo synthesis of telomeres likely includes an elongation and a translocation step.
  • telomere Once a telomeric sequence has been synthesized, the telomerase will likely move along the DNA until it is back in position to add a complete telomeric sequence. This model does not have to be general, since telomerases of different species exist large differences in the number of nucleotides that the enzyme adds before it dissociates from the telomer (Prowse et al, 1993)
  • telomerase subunits from other organisms were also recently identified. Two protein subunits, pl23 and p43, were found in the ciliate Euplotes aediculatus, which have no homology to the Tetrahymena T ⁇ omerasQ-
  • the telomerase subunit pl23 has one at its N-terminus basic domain and a domain for a reverse transcriptase (RT) at the C-terminus, which indicates a catalytic function of this protein (Lingner et al, 1997). Furthermore, a significant homology of pl23 to the protein Est2 found by Lundblad from Saccharomyces cerevisiae was found described (Lingner et al, 1997)
  • telomeres While no essential function for telomerase activity has been demonstrated for p80 and p95, a key function was clearly demonstrated for the potential catalytic subunits of telomerase pl23 / est2p. A mutation of the RT activity center of est2p led to a significant shortening of the telomeres in yeast cells (Lingner et al, 1997)
  • RNA components of telomerases have been cloned from various organisms, including Saccharomyces cerevisiae, mice and humans (Singer and Gottschling, 1994, Blasco et al, 1996, Feng et al, 1995). All previously known telomerase RNAs contain a region that is complementary to the telomeric sequence of the respective organism
  • the primary sequence of human telomerase RNA (hTR) is not similar to the RNA components of the ciliates or Saccharomyces cerevisiae. In contrast, conserved areas exist between human and murine telomerase.
  • hTR human telomerase RNA
  • telomerase-associated protein hTPI
  • telomeres are composed of 2627 amino acids and shows three domains in N-Teminus, which are maximally 46% homologous to p80.
  • 16 repeats of the amino acids could be found in the C-terminal region Tryptophan and asparagine are shown, which presumably mediate a protein-protein interaction Activation of telomerase in human tumors
  • telomere et al An activity of telomerase was originally only detectable in germline cells, but not in normal somatic cells (Hastie et al, 1990, Kim et al, 1994). After the development of a more sensitive detection method (Kim et al,
  • telomere activity was not yet clear in 1994, low telomerase activity was also detected in hematopoietic cells (Broccoli et al, 1995, Counter et al, 1995, Hiyama et al, 1995) However, these cells nevertheless showed a reduction in telomeres (Vaziri et al, 1994, Counter et al , 1995) It is not yet clear whether the amount of enzyme in these cells is not sufficient to compensate for telomer loss, or whether the measured telomerase activity stems from a subpopulation, e.g. incompletely differentiated CD34 + 38 + precursor cells (Hiyama et al, 1995) For clarification, evidence of telomerase activity in a single cell would be necessary
  • telomere activity was detected in a large number of the tumor tissues tested to date (1734/2031, 85%, Shay, 1997), while no activity was found in normal somatic tissue (1/196, ⁇ 1%, Shay, 1997)
  • telomeres continued to shrink and telomerase could only be discovered in the subpopulation that survived the growth crisis (Counter et al, 1992). These cells were also in these immortalized cells the telomeres are stable (Counter et al, 1992)
  • Similar findings from studies on mice support the assumption that reactivation of telomerase is a late event in tumorigenesis
  • telomerase hypothesis was developed that links the loss of telomer sequences and cell aging with the activity of telomerase and the development of cancer.
  • shrinking of telomeres can be seen as a mechanism for tumor suppression Cells that do not contain telomerase stop their cell division at a certain length of the telomeres. If such a cell mutates, a tumor can only develop from it if the cell can extend its telomeres. Otherwise the cell became telomer sequences continue to lose until their chromosomes become unstable and they eventually perish. Reactivation of telomerase is believed to be the main mechanism for tumor cells to stabilize their telomeres.
  • telomere inhibition should allow therapy of tumors.
  • Conventional cancer therapies with cytostatics or short-wave radiation damage not only the tumor cells, but all the cells that divide in the body.
  • telomerase inhibitors would attack the tumor cells more specifically and thus cause fewer undesirable side effects.
  • Telomerase activity has been demonstrated in all tumor tissues tested so far, so that these therapeutic agents could be used against all types of cancer.
  • the effect of telomerase inhibitors would occur when the telomeres of the cells have shortened to such an extent that the genome becomes unstable. Since tumor cells usually have shorter telomeres than normal somatic cells, cancer cells would first be
  • telomeres like the germ cells, would only be damaged much later. Telomerase inhibitors are therefore a pioneering way of treating cancer.
  • telomerase inhibitors will only be possible if the protein structures of the enzyme with their functions have been identified and the knowledge about various telomer-binding proteins has been deepened.
  • the invention relates to the catalytically active human telomerase subunit (phTC), if appropriate in purified form, active parts of the protein, modulators, in particular agonists of the protein, substances imitating the function of the protein and combinations of these components. continues to affect
  • genomic sequences of hTC homologous genes the genomic sequences of hTC homologous genes, the cDNA sequences of hTC homologous genes, the sequences of the mRNAs which are transcribed by hTC homologous genes,
  • the phTC protein labeled with a detection reagent, the detection reagent preferably being an enzyme, a radioactively labeled element or a fluorescent chemical.
  • this is a polyclonal antibody.
  • this is a monoclonal antibody.
  • Such antibodies can be produced, for example, by injecting a substantially immunocompetent host with an amount of a phTC polypeptide or a fragment thereof which is effective for antibody production and by subsequently obtaining this antibody.
  • an immortalized cell line which produces monoclonal antibodies can be obtained in a manner known per se.
  • the antibodies can optionally be labeled with a detection reagent.
  • fragments can also be used which have the desired specific binding properties.
  • Preferred examples of such a detection reagent are enzymes, radioactively labeled elements, fluorescent chemicals or biotin. Oligonucleotides in purified form with a sequence which is identical or exactly complementary to a 10 to 500 nucleotide long, contiguous sequence of the above-described genomic DNA, cDNA or mRNA.
  • Such an oligonucleotide can in particular be an oligodeoxyribonucleotide or an oligoribonucleotide or a peptide nucleotide acid (PNA)
  • PNA peptide nucleotide acid
  • oligonucleotides which inhibit, repress or block the activity of the telomerase when they bind to the hTC mRNA.
  • a recombinant DNA molecule which contains a DNA sequence or a degenerate variation of this sequence which encodes phTC or a fragment of phTC, the latter sequence preferably containing the DNA sequence from FIG. 1, or which contains such a DNA sequence which corresponds to the preceding one DNA sequence listed hybridized under standard hybridization conditions.
  • the DNA described is preferably linked to an expression control sequence.
  • Particularly preferred expression control sequences are e.g. the early or late
  • Promoter of SV40 or adenovirus the lac system, the trp system, the TAC system, the TRC system, the main operator and promoter regions of the phage ⁇ , the control regions of the fd coat protein, the promoter of the 3-phosphoglycerate kinase, the promoter the acid phosphatase and the promoter of the yeast ⁇ -mating factor.
  • a unicellular host which has been transformed with a recombinant DNA molecule described above, which contains the DNA sequence or a degenerate variant of this sequence which codes for the phTC protein or a part of this protein.
  • the said DNA sequence is also in this recombinant DNA molecule linked to an expression control sequence
  • Preferred examples of the unicellular host are E. coh, Psendomonas, Bacilhis, Streptomyces, yeasts, CHO, Rl 1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 and BMT10 cells, plant cells, insect cells and sucker cells in cell culture
  • a method for inhibiting telomerase activity in human cells preferably neoplastic cells, in which an exogenous polynucleotide consisting of a transcription unit is transferred into the cells.
  • This transcription unit contains a polynucleotide sequence of at least 29 consecutive nucleotides that are substantially identical or substantially complementary to the hTC RNA Is sequence and is linked to a heterologous transcription regulatory sequence which said transcription of the linked polynucleotide in said
  • heterologous transcription regulatory sequence preferably contains a promoter which is constitutively active in human cells
  • the heterologous transcription-regulatory sequence can contain a promoter that can be induced or repressed in human cells by adding a regulatory substance.
  • a promoter that can be induced or repressed in human cells by adding a regulatory substance.
  • inducible and repressible tetracycline-dependent promoters Heatshock promoters, metal ion-dependent promoters
  • the above-mentioned exogenous polynucleotide can be, for example, a viral genome with a transcription unit from the human hTC DNA component
  • the said transcription unit particularly preferably produces antisense RNA, which is substantially complementary to the human hTC RNA component
  • exogenous polynucleotide can particularly preferably contain the sequence from FIG. 1
  • Polynucleotide consists of a transcription unit which contains a polynucleotide sequence of at least 9 consecutive nucleotides, which is substantially identical or substantially complementary to the hTC RNA sequence and which is linked to a heterologous transcription regulatory sequence which controls the transcription of the linked polynucleotide in said cells
  • a method for the detection of telomerase-associated conditions in a patient comprising the following steps
  • C detection of diagnostic values that are higher or lower than standard comparison values indicate a telomerase-associated state, which in turn indicates a pathogenic state
  • This method is preferably used for the detection of a neoplastic disease of a patient.
  • the method then comprises the following steps A detection of the phTC protein in cellular samples to make a diagnostic
  • a method of determining the presence of the phTC protein in a cell or cellular sample that is complementary to the amplification of an hTC polynucleotide or hybridization of an hTC polynucleotide, primer, or hTC
  • a test kit for the detection of phTC in cellular samples and body fluids, whereby labeled, immunochemically reactive components can be, for example, polyclonal antibodies against phTC, monoclonal antibodies against phTC,
  • Telomerase its functional equivalents or its catalytically active fragments is also conceivable the use of a substance that requires the production and / or activity of phTC, a substance that can mimic the activity of phTC, a substance that inhibits the production and / or Can inhibit the activity of phTC or a mixture of these substances. Furthermore, a specific binding partner can be used
  • the method is preferably used to prevent or treat aging or cancer
  • telomerase assays are given in the context of example 15
  • Modulators of phTC are interesting for the treatment of diseases with
  • telomerase The prevention or treatment of aging processes or cancer can be mentioned here in particular
  • An antisense nucleic acid against the hTC mRNA which contains a nucleotide sequence which hybridizes with said mRNA, the antisense nucleic acid being a
  • the antisense nucleic acid preferably binds to the start codon of the respective mRNAs
  • a recombinant DNA molecule with a DNA sequence from which an antisense ribonucleic acid is produced against the hTC mRNA during transcription contains a nucleic acid sequence which can hybridize with the said hTC mRNA
  • Such a DNA molecule can be used to produce a cell line with reduced expression of phTC by transfecting a phTC-producing cell line with this recombinant DNA molecule
  • This is preferably a Tetrahymena-type ribozyme or a hammerhead-type ribozyme
  • This recombinant DNA molecule can be used to transfect a phTC-producing cell line
  • a compilation consisting of a pair of human hTC polynucleotide PCR primers, the primers preferably consisting of sequences which correspond to the sequence of the human hTC mRNA or are complementary to this sequence
  • telomerase / telomer regulation Animal models with which the telomerase / telomer regulation can be investigated in vivo. For example, tumor formation and aging can be examined directly with knockout or transgenic animals
  • Fig. 1 cDNA sequence of the human catalytic telomerase subunit (hTC) (SEQ ID No. 1).
  • Fig. 2 Derived amino acid sequence from the hTC DNA sequence shown in Fig. 1 (SEQ ID No. 2).
  • the DNA sequence shown in FIG. 1 can be completely translated into an amino acid sequence from position 64 to position 3461.
  • the amino acid residues are shown according to their one-letter code.
  • the picture shows an 0.8% agarose gel stained with ethidium bromide.
  • Two different DNA size standards are plotted in lanes 1 and 8, the DNA fragment lengths 3, 2, 0.5 and 0.4 kb being highlighted.
  • the AA281296 DNA in pT7T3D was with the restriction enzymes Eco RI / Not I (lane 3), Pst I
  • Lane 6 (Lane 6) and Xho 1 (lane 7) digested. Undigested AA281296 DNA was applied to lane 2 in pT7T3D. Lanes 4 and 5 were 1/10 of a PCR approach (1 minute 94 ° C, 2 minutes 60 ° C, 3 minutes 72 ° C) with the hTC cDNA in pT7T3D and the primers 1 (5 'GAGTGTGTACGTC-GTCGAGCTGCTCAGGTC 3 ') and 4 (5' CACCCTCGAGGTGAGACGCTCGGCC 3 ' ) [lane 4] or with the
  • Fig. 4 Detail from a protein sequence comparison of the catalytic telomerase subunits of Euplotes pl23 ( ⁇ l23) and humans (phTC).
  • Rectangles symbolize sequence sections coding for protein, while the light gray areas 5 'and 3' symbolize untranslated cDNA regions or represent intron sequences.
  • the dark gray blocks in the rectangle for the filling length cDNA either represent the telomerase-specific motif (T) or the seven Reverse transcriptase motifs (number 1-7)
  • the DNA fragments that are necessary to display the complete hTC cDNA are also shown as rectangles and marked according to their origin. All rectangles are arranged in their position relative to each other.
  • the origin of the DNA fragment, for which the rectangle AA261296 stands, is in Describe Example 2
  • Fig. 13 Detail sections from a protein sequence comparison of the catalytic telomerase subunits of Euplotes and humans (hTC).
  • the figure shows excerpts from a protein sequence comparison between the catalytic telomerase subunits of Euplotes and humans (hTC).
  • the motifs for reverse transcriptase are highlighted in the outlined boxes. The numbers below the borders relate to the respective amino acid position in FIG. 2.
  • the amino acid residues are shown in accordance with their one-letter code. Identical amino acids are printed in bold.
  • RT consensus consensus sequence for the reverse transcriptase
  • telomerase-specific motif is described in Example 9.
  • Fig. 14 Generated DNA sequence from Example 11 (3 'variant) (SEQ ID No. 7). The region that is not homologous to the DNA sequence shown in FIG. 1 is highlighted in bold.
  • Fig. 15 hTC expression in cancer cells and in normal human tissue.
  • Fig. A According to the manufacturer (Clontech), about 2 ⁇ g poly A + RNA from various human cell lines were immobilized on the Northern blot. Specifically, the RNA came from melanoma (G361), lung carcinoma (A549), colon adenocarcinoma (SW480), Burkitt's lymphoma Raji, leukemia cell line (MOLT-4), chronic leukemia cell line (K - 562), from a cervical tumor (HeLa) and from the leukemia cell line HL60. The labeled 4.4 kb, 6 kb and 9.5 kb transcripts are specific for hTC (see Example 10).
  • Fig. B According to the manufacturer (Clontech), approximately 2 ⁇ g poly A + RNA from various human tissues were immobilized on the Northern blot. In detail, the RNA from the heart, brain, placenta,
  • RNA size standard is shown.
  • Fig. 16 Western blot analysis of the rabbit sera against peptides from the human telomerase amino acid sequence (Example 12). In each case 20 ⁇ l of the bacterial lysates from Example 13 were analyzed with the aid of the antisera from Example 12 in a Western blot (Ausubel et al, 1987). In lanes 1, 2, 6 and 7, lysates from bacteria containing the pMALEST construct were applied. Lanes 3 from bacteria, which contain the pMALAl construct, were applied in lanes 3, 4, 8 and 9. In lanes 1, 3, 6 and 8, lysates are not made with IPTG
  • Fig. A with lanes 1 to 4 was incubated with preimmune sera against peptide B (compare example 12).
  • the PNDF membrane in Fig. B with lanes 6 to 9 was incubated with preimmune sera against peptide C (see example 12).
  • the PVDF membrane in Fig. B with lanes 1 to 4 was incubated with immune sera against peptide B (see example 12).
  • Fig. 17 Autoradiogram of 35 S-labeled, in vitro translated protein. The complete in vitro translated hTC was plotted in lane 1 (see example
  • Lane 3 shows one supplied by the manufacturer (see example 15) Positive control for in vitro translation
  • a protein size standard is marked on the right side
  • TRAP assay approach with partially purified human telomerase from HeLa cells was applied as a positive control.
  • lanes 5 and 6 a TRAP assay approach with in vitro translated was applied undiluted phTC
  • lanes 7 and 8 a TRAP assay approach with in vitro translated phTC was applied in a 1 4 dilution.
  • lanes 9 and 10 a TRAP assay approach with in vitro translated phTC in a 1 16 dilution was applied In lanes 1 1 and 12, a TRAP assay approach with in vitro translated luciferase was applied as a negative control
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • Reading frame +1 is referred to below as EST +] .
  • the homology between pl23 and the EST + i is most noticeable in two sequence regions, which are separated by 30 amino acids.
  • the second homology block extends from amino acid 513 to 530 in the pl23 protein and has a 44% identity to the corresponding sequence section in the identified EST + i, taking amino acid residues into account similar properties there is a match of 61%
  • P Probabi ty
  • P indicates the probability with which a specific segment pair was also found in a BLAST search with a random sequence and ranges numerically between 0 (result highly significant) and 1 (result irrelevant)
  • hTPl Telomerase-associated protein 1
  • the corresponding gene is therefore abbreviated to hTC (human telomerase, catalytic) and the derived protein to phTC.
  • the EST identified by comparison with pl23 was entered in the EST database on April 2, 1997 and is not published in any journal.
  • the cDNA library in which this EST clone is present was prepared as follows, according to the National Center for Biotechnology Information:
  • Restriction enzyme interfaces Not I and Eco RI cloned into the vector pT7T3D-Pac.
  • the 389 bp fed into the EST database was sequenced using the - 28ml3 rev2 primer from Amersham (DNA sequence see FIG. 1 position 1685 to 2073).
  • the derived protein sequence from EST + i is composed of 129 amino acids, including 27 basic, 11 acidic, 51 hydrophobic and 28 polar amino acid residues.
  • the EST (AA 281296) identified in Example 1 was purchased commercially from Research Genetics, Inc. (Huntsville) in the form of a plasmid transformed in E. coli and analyzed experimentally: As shown in the ethidium bromide-stained agarose gel of FIG. 3, an approximately 2.2 kb fragment from the vector pT7T3D is released after restriction digestion of the plasmid DNA produced by EST AA 281296 using a polymerase chain (PCR) reaction carried out in parallel with specific internal reactions The AA AA121296 was checked for primers. The length of the expected PCR products is 325 and 380 bp and corresponds to the length of the fragments found experimentally (cf. lanes 4 and 5 in FIG. 3). It was thus possible to show that the length obtained by Research Genetics, Int (Huntsville) sent E coli clone contains the identified EST as a plasmid
  • the DNA sequence of clone AA281296 is thus composed of the sequence information from FIG. 1 (positions 1685 to 2351 and positions 2534 to 4042)
  • pl23 from Euplotes aediculatus and est2p from Saccharomyces cerevisiae are homologous to each other around the degree of relationship
  • the region of pl23 (amino acids 437-554) described above was also compared with est2p using the Lipman-Pearson protein comparison using identical parameters. It was found that p123 and est2p are 21% identical in this selected region or 22% identical amino acids or biochemically similar amino acid residues (see FIG. 5). Accordingly, the homology between EST +] and the pl23 of Euplotes is significantly higher than between the pl23 and est2p.
  • est2p was compared to EST + i under the conditions mentioned in Example 3 (see FIG. 6). It turned out that EST + i has 20% identity to est2p, a comparable one
  • hydrophobic amino acids such as leucine and isoleucine and the amino acids lysine and arginine in certain positions (Fig. 7 and 13)
  • Subunit of human telomerase represents
  • sequence information from the RACE rounds was used to amplify the individual fragments as a coherent cDNA clone by PCR
  • the PCR product was diluted 1,50. Five ⁇ l of this dilution were mixed in a second “nested” PCR together with 10 pmol dNTP mix in 1 ⁇ Kien Taq PCR reaction buffer and 1 ⁇ Advantage Kien Taq polymerase mix as well 10 pmol of the primer GSP2 and 10 pmol of the “nested” marathon adapter primer AP2 (5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3 ', Clontech) were used.
  • the PCR conditions corresponded to the parameters selected in the first PCR. The only exception were in the last PCR step only 16 cycles selected instead of 22 cycles A 1,153 bp DNA fragment was obtained as the product of this nested RACE PCR. This was cloned into the TA cloning vector pCR2 1 from InVitrogen and completely double-stranded sequenced (FIG. 8 and SEQ ID No. 3).
  • Nucleotides 974 to 1153 represent the nucleotide region 1629 to 1808 of the hTC cDNA shown in FIG. 1.
  • the nucleotide region extending from bp 1-973, which has no homology to the hTC cDNA sequence shown in FIG. 1, is intron sequences of the hTC gene (data not shown)
  • a 3'-splice consensus sequence can be found at the exon-intron junction.
  • the presence of intron sequences could be due to incompletely spliced mRNA as the starting substance for cDNA synthesis. Genomic DNA contamination in the cDNA could explain the discovery of intron sequences
  • a second RACE was carried out with the gene-specific primer GSP5 from the 5 'region of RACE product 1 (5'-GGCAGTGACCAGGAGGCAACGAGAGG-3') and the API primer.
  • Marathon was used as the cDNA source -Ready cDNA from human testis (Clontech, catalog number 7414-1) was used.
  • the same PCR conditions were used as in the first
  • PCR selected in RACE round 1 Also in RACE round 2, a 2 "nested” PCR with diluted PCR product was connected to the 1 PCR as a cDNA source.
  • the gene-specific primer GSP6 from FIG. 5 ' was used as the "nested” PCR primer.
  • Region of RACE product 1 (5'-GGCACACTCGGCAGGAAACGCACATGG-3 ') and the AP2 primer used. The conditions corresponded to the parameters of the nested PCR from the RACE round
  • the 412 bp long PCR product of the nested PCR from RACE round 2 was cloned into the TA cloning vector pCRII-Topo from Invitrogen and completely sequenced (FIG. 9 and SEQ ID No 4).
  • the sequence section from bp 267 to bp 412 is completely homologous to the 5 'area of the product from RACE 1
  • This RACE product 2 is probably completely an intron region of the hTC gene (data not shown).
  • a third round of RACE led to the identification of further 5'-located hTC cDNA regions.
  • a gene-specific primer GSP9 (5'-CCTCCTCTGTTCACTGCTCTGGCC-3 ') from the 5' range of RACE product 2 was selected and together with the API primer and marathon-ready cDNA from human Testis (from Clontech) used in a new RACE.
  • RACE conditions were the same as for the 1st PCR in RACE 1 and 2.
  • a 1012 bp fragment (Fig. 10 and SEQ ID No. 5) was amplified and into the TA-cloning vector pCRII-
  • Consensus sequence can be found at the exon-intron junction.
  • a PCR was carried out on RACE 2 and the clone AA281296. Marathon-Ready cDNA from human testis (Clontech; catalog number 7414-1) was used as the cDNA source. The PCR was carried out as described under RACE 1 (compare Example 6), but with the primers C5F (5'-CGAGTGGACACGGTGATCTCTGCC-3 ') from the 5' region of RACE 2 and the primer C3B (5'-GCACACCTTTGGTCACTCCAAATTCC-
  • a 2486 bp DNA fragment hereinafter referred to as the C5F fragment, was obtained as the product of this PCR. This was used in the TA cloning vector pCRII-TOPO
  • Clontech, cat. No. HL5016b from the human leukemia cell line K562. About 3x10 p soda of this random and oligo dT primed library were plated as in Ausubel et al, (1987) and used for screening. A 719 bp long (position 1685 to 2404, corresponding to FIG. 1) radioactively labeled hTC-DNA fragment was used as the sample.
  • ⁇ clone 12 was verified as positive after rescreening with the same hTC probe. After plaque purification and ⁇ DNA preparation (Ausubel et al, 1987), the 4 kb insert was cloned into the vector pBluescript and sequenced (FIG. 11 and SEQ ID No. 6). A comparison of the ⁇ clone 12 sequence with the sequences of the RACE clones and the DNA sequence from clone AA281296 showed that this clone identified in the homology screening codes for a 5 ' part of the hTC cDNA and a putative ATG start codon in position 63 corresponding to FIG. 1.
  • Reading frame over about 400 bp is identical to various ESTs that are not related to the hTC cDNA.
  • the ⁇ clone 12 is thus a chimeric clone, which is composed essentially of the 5 'end of the hTC cDNA and another cDNA clone of unknown function.
  • FIG. 1 A summary schematic representation with the relative orientation of the RACE products and the homology screening is shown in FIG. The complete sequence of the hTC cDNA (FIG. 1) was obtained from the ⁇ clone 12 (positions 21 to 1655 corresponding to FIG. 11), the PCR product C5F (positions 1636 to 3908 corresponding to FIG. 1) and the EST AA281296 (Position 3909 to 4042 according to FIG. 1) composed.
  • RT motifs motifs for reverse transcriptases
  • FIG. 13 A consensus sequence of reverse transcriptases (Poch et al., 1989, Xiong and Eickbush, 1990) identified a total of seven motifs for reverse transcriptases (RT motifs) (FIG. 13). Within these motifs, some amino acids are highly conserved not only between the RT consensus sequence and the phTC, but also in comparison to the telomerase protein from Euplotes. For example, in RT motif 5 two aspartic acids
  • telomerase motif positions 553 and 565 in FIG. 2 is a structure specific for this protein family, since it does not occur in any protein known to date.
  • Another feature only identified in the catalytic telomerase proteins is the distance between the RT motifs 3 and 4, which at 107 amino acids is significantly larger than in other RTs.
  • telomerase RNA subunit does not correlate with the telomerase activity, but is observed ubiquitously (Feng et al, 1995). This raises the question of whether the expression of the catalytic telomerase subunit is associated with the telomease activity.
  • Northern blot experiments (Ausubel et al, 1987) were carried out to analyze the level of hTC expression.
  • the commercially available Northern blots were either with a series of RNA preparations from normal human tissue (Clontech; catalog number 7760-1) or with RNA samples from human cancer cells (Clontech;
  • RNA transcripts were approximately the size 9.5 kb and 4.4 kb and an RNA subtranscript of approximately 6 kb were detected, which cross-hybridize with the sample (FIG. 15, FIG. A).
  • the hTC mRNA was most strongly expressed in the leukemia cell lines K-562 and HL-60 (FIG. 15, FIG. A).
  • the hTC transcript could not be detected in the normal tissues tested (heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney and pancreas)
  • PCR reaction took place in 3 steps. First the DNA was denatured for 3 min at 94 ° C. 34 cycles followed, in which the DNA was denatured successively for 45 sec at 94 ° C, then for 1 min at 68 ° C the primer was attached and then the DNA chain was extended for 3 min at 72 ° C. In the last PCR step, a final chain extension was carried out for 10 min at 72 ° C. The resulting PCR products were added to the TA cloning vector pCR2 1 cloned by InVitrogen
  • the cDNA synthesis kit from Boehringer Mannheim made from 2 ⁇ g DNasel-treated poly A-RNA of the human pramyeloid cell line, was first used
  • HL60 a cDNA synthesis was carried out according to the manufacturer's instructions. In a final volume of 50 ⁇ l, 1 ⁇ l of this HL60 cDNA was then mixed with 10 pmol each of the primers GSPlvor and HTRT3A and 10 pmol of dNTP mix and after addition of 1.25 ⁇ l of DMSO A PCR reaction was carried out in 1 x Kien Taq PCR reaction buffer and 1 x Advantage Kien Taq Polymerase Mix (Clontech). The PCR reaction was carried out in 3 steps.
  • Variant 1 of the human hTC cDNA is distinguished by a 182 bp deletion of nucleotides 2345 to 2526. This deletion results in a shift in the ORF and a shortened hTC protein is read, which lacks the RT motifs 4 to 7
  • Variant 2 of the human hTC cDNA has a 36 bp deletion of nucleotides 2184 to 2219.
  • the RT motif 3 is lost as a result of this deletion. However, the reading frame is retained and a protein is produced which selectively lacks the RT motif 3
  • Variant 3 of the human hTC cDNA represents a combination of variants 1 and 2. It has both a deletion of bp 2184 to 2219 and bp 2345 to 2526
  • Variant 4 of the human hTC cDNA is characterized by the loss of the nucleotide region from bp 3219 to 3842. This missing sequence is replaced by a sequence which is not homologous to hTC. From bp 3843, the sequence is again completely identical to the hTC shown in FIG Sequence The sequence of variant 4 is shown in FIG. 14. According to the selected 5 'primer, it begins with bp 1783 of the hTC cDNA shown in FIG 14 and SEQ ID No 7) at DNA level 98.7% with an EST (Accession No. AA299878) from a human uterine tumor
  • FIG. 1 In order to obtain antisera with specificity for the catalytic subunit of human telomerase, the existing nucleotide sequence (FIG. 1) was translated into an amino acid sequence (FIG. 2) with the aid of a program for secondary structure prediction (PROTEAN, from the software package DNAStar, DNASTAR Ine, Madison, WI, USA), two peptides were selected that are likely to elicit an immune response The following peptides are shown in the one-letter code for amino acids:
  • underlined cysteines do not come from the telomerase sequence, but have been added as linkers for the coupling
  • the peptides were isolated via the thiol-reactive coupling reagent m-maleimido-benzoyl-N-
  • MMS Hydroxysuccinimide ester
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • pMalAl contains the nucleotide sequence of FIG. 1 from position 1789 to position 3908. This DNA fragment was PCR-primed with the primers C5A (5'- ACCGGAAGAGTGTCTGGAGCAAGTTG-3 ') and C3B (5'-
  • TA cloning vector pCRII-TOPO from Invitrogen.
  • the PCR conditions were carried out as described in Example 7.
  • the insert was cut out with the restriction enzyme Eco RI, the cut-outs filled in with the Klenow fragment (Ausubel et al, 1987) and in the bacterial expression vector pMAL-C2 (Fa.
  • the protein expression using these constructs was carried out in the bacterial strain E. coli DH5 ⁇ .
  • the expression conditions were as described in the operating instructions from New England Biolabs (catalog number 800).
  • the bacterial lysates produced were tested in a Western blot experiment (Ausubel et al, 1987).
  • Example 13 The bacterial lysates from Example 13 were analyzed with the aid of the antisera from Example 12 in a Western blot (Ausubel et al, 1987).
  • fusion proteins in the size of approximately 74 kDa and 106 kDa are expected for the constructs pMalEST and pMalAl, respectively.
  • Protein component can be reconstituted together with the RNA component in vitro
  • HTR2BAM (5'-CGCGGATCCCGGCGAGGGGTGACGGATGC-3) from a 293 cell cDNA library containing a PCR of 293 cell cDNA in one of the nucleotides HTRotid 100 AMP 3 ⁇ l cDNA from 293 cells were mixed with 10 pmol dNTP mix and in 1 x PCR reaction buffer with 0.5 ⁇ l
  • Taq polymerase (Gibco) carried out a PCR reaction. 10 pmol each of the primers HTR9BAM and HTR2BAM were added. The PCR was carried out in 3 steps. A ten-minute denaturation at 94 ° C was followed by 35 PCR cycles, in which the DNA was first denatured for one minute at 94 ° C and then the primers were attached for 2 min at 62 ° C and the DNA chain was extended This was followed by a chain extension at 72 ° C for 4 min. The resulting PCR products were cloned into the Bam HI site of the vector pUC19 after restriction digestion with Bam HI, so that the RNA component is under the control of the T7 promoter. This construct is referred to below as HTR504
  • the 341 1 bp long cDNA fragment (position 60 to position 3470, FIG. 1) was cloned into the vector PCRII TOPO (Invitrogen). Detailed information on the cloning is provided described in Examples 8 and 7, and in Fig. 12, respectively.
  • the T7 promoter lies 5 'in front of the hTC cDNA.
  • the catalytic telomerase protein component was synthesized after addition of the hTC FL construct in a commercially available transcription / translation system according to the manufacturer's instructions (Promega; catalog number L4610).
  • the successful in vitro translation of the expected 127 kDa product was checked using 35 S-labeled cysteine in an SDS-PAGE (Ausubel et al, 1987) (FIG. 17).
  • telomerase RNA component was carried out with a transcription system according to the manufacturer (Ambion; catalog number 1344) or according to the method described by Pokrovskaya and Gurevich (1994).
  • Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Be. 89, 10114-10118.
  • RNA component of human telomerase Science 269, 1236-1241.
  • telomere terminal transferase of Tetrahymena IS a ⁇ bonucleoprotein enzyme with two kinds of p ⁇ mer specificity Cell 51, 887-898
  • TCGTGGAGAC CATCTTTCTG GGTTCCAGGC CCTGGATGCC AGGGACTCCC CGCAGGTTGC 1200
  • TGCAAGCCAC CGTGCCCGGC ATACCTTGAT CTTTTAAAAT GAAGTCTGAA ACATTGCTAC 540
  • TTTTATGTCA CGGAGACCAC GTTTCAAAAG AACAGGCTCT TTTTCTACCG GAAGAGTGTC 1140
  • MOLEK type cDNA
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO
  • GCCGCTGTAC CAGCTCGGCG CTGCCACTCA GGCCCGGCCC CCGCCACACG CTAGTGGACC 660
  • CCGAAGGCGT CTGGGATGCG AACGGGCCTG GAACCATAGC GTCAGGGAGG CCGGGGTCCC 720 CCTGGGCCTG CCAGCCCCGG GTGCGAGGAG GCGCGGGGGC AGTGCCAGCC GAAGTCTGCC 780
  • CTCTGTGGCG GCCCCCGAGG AGGAGGACAC AGACCCCCGT CGCCTGGTGC AGCTGCTCCG 1440
  • GGTGTGCACC AACATCTACA AGATCCTCCT GCTGCAGGCG TACAGGTTTC ACGCATGCGT 1320

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Abstract

Diese Erfindung betrifft die Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete Proteinsequenz, die für die humane katalytische Telomerase-Untereinheit codiert. Darüberhinaus betrifft diese Erfindung Methoden, die eine pharmazeutische, diagnostische oder therapeutische Verwendung von diesem Gen/Protein beinhaltet, vor allem in der Behandlung von Krebs und Alterung.

Description

Humane katalvtische Telomerase-Untereinheit und deren diagnostische und therapeutische Verwendung
Aufbau und Funktion der Chromosomenenden
Das genetische Material eukaryontischer Zellen ist auf linearen Chromosomen verteilt. Die Enden der Erbanlagen werden, abgeleitet von den griechischen Wörtern telos (Ende) und meros (Teil, Segment), als Telomere bezeichnet. Die meisten Telomere bestehen aus Wiederholungen von kurzen Sequenzen, die überwiegend aus Thymin und Guanin aufgebaut sind (Zakian, 1995). Die Telomersequenzen verwandter Organismen sind oft ähnlich und sogar zwischen phyllogenetisch weiter entfernten Spezies konserviert. Bemerkenswert ist, daß in allen bislang untersuchten Wirbeltieren die Telomere aus der Sequenz TTAGGG aufgebaut werden (Meyne et al., 1989).
Die Telomere üben verschiedene wichtige Funktionen aus. Sie verhindern die Fusion von Chromosomen (McClintock, 1941) und damit die Entstehung von dizentrischen Erbanlagen. Solche Chromosomen mit zwei Centromeren können durch Verlust der Heterozygotie bzw. Verdopplung oder Verlust von Genen zur Entwicklung von Krebs fuhren.
Desweiteren dienen Telomere dazu, intakte Erbanlagen von beschädigten zu unterscheiden. So stellten Hefezellen ihre Zellteilung ein, wenn sie ein Chromosom ohne Telomer enthielten (Sandeil und Zakian, 1993).
Eine weitere wichtige Aufgabe erfüllen Telomere bei der DNA-Replikation eukaryontischer
Zellen. Im Gegensatz zu den zirkulären Genomen von Prokaryonten können die linearen Chromosomen der Eukaryonten von dem DNA Polymerase-Komplex nicht vollständig repliziert werden. Zur Initiation der DNA-Replikation sind RNA-Primer notwendig. Nach Abspaltung der RNA-Primer, Verlängerung der Okazaki-Fragmente und anschließender Ligation fehlt dem neu-synthetisierten DNA-Strang das 5'-Ende, denn dort kann der RNA-
Primer nicht durch DNA ersetzt werden. Ohne besondere Schutzmechanismen würden daher die Chromosomen mit jeder Zellteilung schrumpfen ("end-replication problem"; Harley et al, 1990). Die nicht-kodierenden Telomersequenzen stellen vermutlich eine Pufferzone dar, um dem Verlust von Genen vorzubeugen (Sandeil und Zakian, 1993).
Darüberhinaus spielen Telomere auch eine wichtige Rolle bei der Regulation der zellulären Alterung (Olovnikov, 1973). Humane somatische Zellen zeigen in Kultur eine limitierte
Replikationskapazität; sie werden nach einer gewissen Zeit seneszent. In diesem Zustand teilen sich die Zellen selbst nach Stimulierung mit Wachstumsfaktoren nicht mehr, sterben aber nicht, sondern bleiben metabolisch aktiv (Goldstein, 1990). Verschiedene Beobachtungen sprechen für die Hypothese, daß eine Zelle anhand der Länge ihrer Telomere bestimmt, wie oft sie sich noch teilen kann (Allsopp et al., 1992).
Zusammenfassend besitzen die Telomere somit zentrale Funktionen bei der Alterung von Zellen sowie der Stabilisierung des genetischen Materials und Verhinderung von Krebs.
Das Enzym Telomerase synthetisiert die Telomere
Wie oben beschrieben können Organismen mit linearen Chromosomen ohne einen speziellen Schutzmechanismus ihr Genom nur unvollständig replizieren. Die meisten Eukaryonten verwenden zur Regeneration der Telomersequenzen ein spezielles Enzym, die Telomerase. In den bislang untersuchten Einzellern wird Telomerase konstitutiv expremiert. Dagegen wurde in Menschen die Telomerase- Aktivität nur in Keimzellen und Tumorzellen gemessen, wogegen benachbartes somatisches Gewebe keine Telomerase enthielt (Kim et al, 1994).
Telomerase in Ciliaten
Die Telomerase wurde, wie auch die Telomere, zuerst im Ciliaten Tetrahymena thermophila identifiziert. Die Telomerase-Aktivität wurde durch Verlängerung des einzel- strängigen Oligonukleotides d(TTGGGG)4 in Gegenwart von dTTP und dGTP nachgewiesen (Greider und Blackbum, 1985). Dabei wurde an den Primer wiederholt die 7etr 2y»2e«α-Telomersequenz TTGGGG angehängt. Selbst wenn als Ausgangsmaterial ein
Oligonukleotid mit der unregelmäßigen Telomersequenz von Saccharomyces cerevisiae, T(G)ι_3, angeboten wurde, verlängerte die Telomerase den Primer mit der Telomersequenz von Tetrahymena (Greider und Blackburn, 1985) Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, daß die Telomerase selbst die Vorlage für die Sequenz der Telomere mit sich führt
Nachdem zunächst die Existenz einer RNA-Komponente in der Telomerase nachgewiesen werden konnte (Greider und Blackburn, 1987), wurde kurze Zeit spater das Gen für die RNA-Untereinheit der Telomerase kloniert (Greider und Blackburn, 1989) Diese RNA enthalt eine Region mit dem Komplement zur Telomersequenz von Tetrahymena (nachfolgend "Komplement-Region" genannt) Die Telomerase-Aktivitat war abhangig von der RNA-Komponente, was durch Verdau der RNA mit nachfolgendem Verlust der
Aktivität gezeigt werden konnte Wurde die Telomerase-RNA in ihrer Komplement-Region mutiert, so wurden die entsprechenden Mutationen in vivo in die Telomere von Tetrahymena eingebaut (Yu et al, 1990) Die Telomerase gehört demnach zur Klasse der RNA-abhangigen DNA-Polymerasen
Die ersten Protein-Untereinheiten der 7etr ?y/we« -Telomerase, p80 und p95, wurden 1995 identifiziert (Collins et al, 1995) Die Beobachtung, daß p95 das Enzym an der DNA verankert und p80 die RNA-Komponente bindet, führte zu folgendem Modell Die Telomerase-RNA lagert sich mit ihrer Komplement-Region an den einzelstrangigen 3'- Überhang an Die Verlängerung des 3 '-Überhangs geschieht durch Einbau der entsprechenden Nukleotide in 5 '-3 '-Richtung Die de «ovo-Synthese von Telomeren beinhaltet wahrscheinlich einen Elongations- und einen Translokationsschπtt Ist eine Telomersequenz synthetisiert worden, bewegt sich die Telomerase vermutlich an der DNA entlang, bis sie wieder in einer Position ist, um eine vollständige Telomersequenz hinzuzufügen Dieses Modell muß nicht allgemeingültig sein, denn zwischen Telomerasen unterschiedlicher Spezies bestehen große Unterschiede in der Anzahl der Nukleotide, die das Enzym addiert bevor es vom Telomer dissoziiert (Prowse et al, 1993)
Darüberhinaus wurden kurzlich auch Telomerase-Untereinheiten anderer Organismen identifiziert In dem Ciliaten Euplotes aediculatus wurden zwei Protein-Untereinheiten, pl23 und p43, gefunden, welche keine Homologie zu den Tetrahymena-TύomerasQ-
Proteinen zeigen Die Telomerase-Untereinheit pl23 weist an ihrem N-Terminus eine basische Domäne und am C-Terminus eine Domäne für eine Reverse Transkriptase (RT) auf, was auf eine katalytische Funktion dieses Proteins hindeutet (Lingner et al, 1997) Darüberhinaus wurde eine signifikante Homologie von pl23 zu dem von Lundblad gefundenen Protein Est2 aus Saccharomyces cerevisiae beschrieben (Lingner et al , 1997)
Wahrend für p80 und p95 bisher keine essentielle Funktion für die Telomeraseaktivitat nachgewiesen wurde, konnte für die potentiellen katalytischen Untereinheiten der Telomerase pl23/est2p eindeutig eine Schlusselfünktion aufgezeigt werden Eine Mutation des RT-Aktivitatzentrums von est2p führte zu einer signifikanten Verkürzung der Telomere in Hefezellen (Lingner et al , 1997)
Telomerase-Komponenten aus Saugerzellen
Inzwischen wurden die RNA-Komponenten der Telomerasen von verschiedenen Or- ganismen, unter anderem von Saccharomyces cerevisiae, Mausen und Menschen (Singer und Gottschling, 1994, Blasco et al, 1996, Feng et al, 1995), kloniert Alle bislang bekannten Telomerase-RNAs enthalten eine Region, die komplementär zu der Telomersequenz des jeweiligen Organismus ist Die Primarsequenz der humanen Telomerase-RNA (hTR) weist jedoch keine Ähnlichkeiten mit den RNA-Komponenten der Ciliaten oder Saccharomyces cerevisiae auf Dagegen existieren konservierte Bereiche zwischen der humanen und der murinen Telomerase-RNA (Feng et al , 1995)
Vor kurzem wurde die Isolation eines humanen Telomerase-assoziertes Proteins (hTPl) beschrieben (Harrington et al, 1997) Das korrespondierende Gen wurde aufgrund seiner Homologie zu der Tetrahymena Telomerase Untereinheit p80 in einer nicht der
Allgemeinheit zuganglichen EST Datenbank gefunden (Harrington et al , 1997) hTPl ist aus 2627 Aminosäuren zusammengesetzt und zeigt im N-Teminus drei Domänen, welche maximal zu 46% homolog zu p80 sind Als weiteres Strukturelement konnten im C- terminalen Bereich 16 Wiederholungen aus den Aminosäuren Tryptophan und Asparagin aufgezeigt werden, die vermutlich eine Protein-Protein Interaktion vermitteln Aktivierung der Telomerase in menschlichen Tumoren
Eine Aktivität der Telomerase konnte in Menschen ursprunglich nur in Keimbahnzellen, nicht aber in normalen somatischen Zellen (Hastie et al, 1990, Kim et al, 1994) nach- gewiesen werden Nach der Entwicklung eines sensitiveren Nachweisverfahrens (Kim et al,
1994) wurde auch in hematopoietischen Zellen eine geringe Telomeraseaktivitat detektiert (Broccoli et al, 1995, Counter et al, 1995, Hiyama et al, 1995) Allerdings wiesen diese Zellen trotzdem eine Reduktion der Telomere auf (Vaziri et al, 1994, Counter et al , 1995) Noch ist nicht geklart, ob die Menge an Enzym in diesen Zellen nicht ausreichend für eine Kompensation des Telomerverlustes ist, oder ob die gemessene Telomerase-Aktivitat von einer Subpopulation, z B unvollständig ausdifferenzierten CD34+38+- Vorlauferzellen, herrührt (Hiyama et al, 1995) Zur Klarung wäre ein Nachweis der Telomerase-Aktivitat in einer einzelnen Zelle notig
Interessanterweise wurde jedoch in einer großen Zahl der bislang getesteten Tumorgeweben eine signifikante Telomerase-Aktivitat nachgewiesen (1734/2031, 85%, Shay, 1997), wahrend in normalem somatischen Gewebe keine Aktivität gefunden wurde (1/196, <1%, Shay, 1997) Verschiedene Untersuchungen zeigten außerdem, daß in seneszenten Zellen, die mit viralen Oncoproteinen transformiert wurden, die Telomere weiterhin schrumpften und Telomerase nur in der Subpopulation entdeckt werden konnte, die die Wachstumskrise überlebte (Counter et al , 1992) In diesen immortahsierten Zellen waren auch die Telomere stabil (Counter et al, 1992) Ahnliche Befunde aus Untersuchungen an Mausen (Blasco et al, 1996) stutzen die Annahme, daß eine Reaktivierung der Telomerase ein spates Ereignis in der Tumorgenese ist
Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine "Telomerase-Hypothese" entwickelt, die den Verlust von Telomersequenzen und Zellalterung mit der Aktivität von Telomerase und der Entstehung von Krebs verbindet In langlebigen Spezies wie dem Menschen kann das Schrumpfen der Telomere als ein Mechanismus zur Tumorsuppression angesehen werden Ausdifferenzierte Zellen, die keine Telomerase enthalten, stellen bei einer bestimmten Lange der Telomere ihre Zellteilung ein Mutiert eine solche Zelle, so kann aus ihr nur dann ein Tumor entstehen, wenn die Zelle ihre Telomere verlangern kann Ansonsten wurde die Zelle weiterhin Telomersequenzen verlieren, bis ihre Chromsomen instabil werden und sie schließlich zugrunde geht. Die Reaktivierung der Telomerase ist vermutlich der Hauptmechanismus von Tumorzellen zur Stabilisation ihrer Telomere.
Aus diesen Beobachtungen und Überlegungen ergibt sich, daß eine Inhibition der Telomerase eine Therapie von Tumoren erlauben sollte. Konventionelle Krebstherapien mit Zytostatika oder kurzwelligen Strahlen schädigen nicht nur die Tumorzellen, sondern alle sich teilenden Zellen des Körpers. Da aber außer Tumorzellen nur Keimbahnzellen eine signifikante Telomerase-Aktivitat enthalten, würden Telomerase-Inhibitoren spezifischer die Tumorzellen angreifen und somit weniger unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen. In allen bislang getesteten Tumorgeweben wurde eine Telomerase-Aktivitat nachgewiesen, so daß diese Therapeutika gegen alle Krebsarten eingesetzt werden könnten. Die Wirkung von Telomerase-Inhibitoren würde dann eintreten, wenn die Telomere der Zellen sich soweit verkürzt haben, daß das Genom instabil wird. Da Tumorzellen meist kürzere Telomere aufweisen als normale somatische Zellen, würden zuerst Krebszellen durch Telomerase-
Inhibitoren eliminiert werden. Zellen mit langen Telomeren, wie die Keimzellen, würden dagegen erst viel später geschädigt werden. Telomerase-Inhibitoren stellen somit einen zukunftsweisenden Weg für die Therapierung von Krebs dar.
Eindeutige Antworten auf die Frage nach der Art und den Angriffspunkten physiologischer
Telomerase-Inhibitoren werden aber erst möglich sein, wenn auch die Proteinstrukturen des Enzyms mit ihren Funktionen identifiziert und die Erkenntnisse über verschiedene Telomer- bindende Proteine vertieft sind.
Die Erfindung betrifft die katalytisch aktive humane Telomerase-Untereinheit (phTC) gegebenenfalls in aufgereinigter Form, aktive Teile des Proteins, Modulatoren, insbesondere Agonisten des Proteins, die Funktion des Proteins imitierende Substanzen sowie Kombinationen aus diesen Komponenten. ndung betrifft weiterhin
Die Nucleinsauresequenz, die für das humane Protein phTC kodiert, im einzelnen
- die genomische Sequenz des hTC-Gens, die cDNA-Sequenz des hTC-Gens , die DNA-Sequenz von hTC-Varianten die Sequenz der mRNA, die vom hTC Gen transkribiert wird, Teile aus den oben genannten Sequenzen, darunter die in der Fig 1 gezeigte DNA Sequenz (SEQ ID No 1) von hTC
Die Nucleinsauresequenzen, die in anderen Saugern für dem hTC homologe Proteine kodieren, im einzelnen
- die genomischen Sequenzen hTC-homologer Gene, die cDNA- Sequenzen hTC-homologer Gene, die Sequenzen der mRNAs, die von hTC-homologen Genen transkribiert werden,
Teile aus den oben genannten Sequenzen
Nucleinsauresequenzen, die für dem Protein phTC verwandte Proteine im Menschen und anderen Saugern kodieren, im einzelnen-
die genomischen Sequenzen hTC-verwandter Gene in Mensch und anderen Saugern, die cDNA-Sequenzen hTC-verwandter Gene in Mensch und anderen
Saugern, die Sequenzen der mRNAs, die von hTC-verwandten Genen transkribiert werden in Mensch und anderen Saugern, - Teile aus den oben genannten Sequenzen Das oben beschriebene phTC Protein, isoliert aus Säugerzellen (vgl. Fig. 2 und SEQ ID No. 2).
Das phTC Protein, markiert mit einem Nachweis-Reagenz, wobei das Nachweis- Reagenz bevorzugt ein Enzym, ein radioaktiv markiertes Element oder eine fluoreszierende Chemikalie ist.
Einen Antikörper, der gegen das phTC Protein gerichtet ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist dies ein polyklonaler Antikörper.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist dies ein monoklonaler Antikörper.
Solche Antikörper können beispielsweise produziert werden durch die Injektion eines substantiell immunkompetenten Wirts mit einer für die Antikörper-Produktion effektiven Menge eines phTC Polypeptids oder eines Fragments davon und durch nachfolgende Gewinnung dieses Antikörpers.
Weiterhin läßt sich in an sich bekannter Weise eine immortalisierte Zellinie erhalten, die monoklonale Antikörper produziert.
Die Antikörper können gegebenenfalls mit einem Nachweisreagenz markiert sein.
Anstelle des vollständigen Antikörpers können auch Fragmente eingesetzt werden, die die gewünschten spezifischen Bindungseigenschaften besitzen.
Bevorzugte Beispiele für ein solches Nachweis-Reagenz sind Enzyme, radioaktiv markierte Elemente, fluoreszierende Chemikalien oder Biotin. Oligonukleotide in aufgereinigter Form mit einer Sequenz, die identisch oder exakt komplementär ist zu einer 10 bis 500 Nukleotide langen, zusammenhängenden Sequenz der oben beschriebenen genomischen DNA, cDNA oder mRNA.
Ein solches Oligonukleotid kann insbesondere ein Oligodesoxyribonucleotid oder ein Oligoribonucleotid oder eine Peptidnukleotidsäure (PNA) sein
Bevorzugt sind Oligonukleotide, welche die Aktivität der Telomerase inhibieren, reprimieren oder blockieren, wenn sie an die hTC mRNA binden.
Eine DNA Sequenz oder eine degenerierte Variation dieser Sequenz, die das Protein phTC oder ein Fragment dieses Proteins kodiert, gegebenenfalls enthaltend die DNA Sequenz aus Abbildung 1, oder DNA Sequenz, die mit der vorgehend aufgeführten DNA Sequenz unter Standard-Hybridisierungsbedingungen hybridisiert.
Ein rekombinantes DNA Molekül, das eine DNA Sequenz oder eine degenerierte Variation dieser Sequenz beinhaltet, die phTC oder ein Fragment von phTC kodiert, wobei letztere Sequenz bevorzugt die DNA Sequenz aus Abbildung 1 enthält, oder das eine solche DNA Sequenz beinhaltet, die mit der vorgehend aufgeführten DNA Sequenz unter Standard-Hybridisierungsbedingungen hybridisiert.
Bevorzugt ist in dem oben genannten rekombinanten DNA Molekül die beschriebene DNA mit einer Expressions-Kontrollsequenz verbunden.
Besonders bevorzugt als Expressions-Kontrollsequenz sind z.B. der frühe oder späte
Promotor des SV40- oder Adenovirus, das lac System, das trp System, das TAC System, das TRC System, die Haupt-Operator- und Promotorregionen des Phagen λ, die Kontrollregionen des fd Hüllproteins, der Promotor der 3-Phospoglycerat Kinase, der Promotor der Sauren Phosphatase und der Promotor des α-Mating Faktors der Hefe. Einen einzelligen Wirt, der mit einem oben beschriebenen rekombinanten DNA Molekül transformiert wurde, das die DNA Sequenz oder eine degenerierte Variante dieser Sequenz enthalt, die für das phTC Protein oder einen Teil dieses Protein kodiert In diesem rekombinanten DNA-Molekul ist die besagte DNA Sequenz mit einer Expressions-Kontrollsequenz verknüpft
Bevorzugte Beispiele für den einzelligen Wirt sind E. coh, Psendomonas, Bacilhis, Streptomyces, yeasts, CHO, Rl 1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 und BMT10 Zellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen und Saugerzellen in Zellkultur
Einen rekombinanten Virus, der mit einem der vorstehend beschriebenen DNA Moleküle oder einem Derivat oder Fragment dieses Moleküls transformiert wird
Eine Methode zur Inhibition der Telomeraseaktivitat in humanen Zellen, bevorzugt neoplastische Zellen, bei der ein exogenes Polynukleotid in die Zellen transferiert wird, das aus einer Transkriptionseinheit besteht Diese Transkriptionseinheit beinhaltet eine Polynukleotidsequenz aus mindestens 29 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die substantiell identisch oder substantiell komplementär zur hTC RNA Sequenz ist und die mit einer heterologen Transkriptions-regulatorischen Sequenz verknüpft ist, die die Transkription des verknüpften Polynukleotids in besagten
Zellen steuert
Bevorzugt enthalt die oben genannte heterologe Transkriptions-regulatorische Sequenz einen Promotor, der in humanen Zellen konstitutiv aktiv ist
Alternativ kann die heterologe Transkriptions-regulatorische Sequenz einen Promotor enthalten, der in humanen Zellen durch Zugabe einer regulatorischen Substanz induziert oder reprimiert werden kann Dazu zahlen beispielsweise induzierbare und reprimierbare Tetrazyklin- abhangige Promotoren, Heatshock- Promotoren, Metallionen-abhangige Promotoren Das obengenannte exogene Polynukleotid kann beispielsweise ein virales Genom mit einer Transkriptionseinheit aus der humanen hTC DNA-Komponente sein
Besonders bevorzugt produziert die besagte Transkriptionseinheit antisense RNA, die substantiell komplementär zur humanen hTC RNA-Komponente ist
Weiterhin besonders bevorzugt kann das exogene Polynukleotid die Sequenz aus Abb 1 enthalten
Ein Polynukleotid für die Gentherapie einer menschlichen Krankheit Dieses
Polynukleotid besteht aus einer Transkriptionseinheit, die eine Polynukleotidsequenz aus mindestens 9 aufeinanderfolgenden Nukleotiden enthalt, die substantiell identisch oder substantiell komplementär zur hTC RNA Sequenz ist und die mit einer heterologen Transkriptions-regulatorischen Sequenz verknüpft ist, die die Transkription des verknüpften Polynukleotids in besagten Zellen steuert
Eine Methode zur Detektion Telomerase-assoziierter Zustande in einem Patienten, die folgende Schritte umfaßt
A Detektion des phTC Proteins in Korperflussigkeiten oder zellularen Proben, um einen diagnostischen Wert zu erhalten, B Vergleich des diagnostischen Werts mit Standardwerten für das phTC
Protein in standardisierten normalen Zellen oder Korperflussigkeiten des gleichen Typs wie die Testprobe, C Detektion diagnostischer Werte, die hoher oder niedriger als Standardvergleichswerte liegen, indizieren einen Telomerase-assoziierten Zustand, der wiederum einen pathogenen Zustand indiziert
Bevorzugt wird diese Methode eingesetzt zur Detektion einer neoplastischen Erkrankung eines Patienten Die Methode umfaßt dann folgende Schritte A Detektion des phTC Proteins in zellularen Proben, um einen diagnostischen
Wert zu erhalten, B Vergleich des diagnostischen Werts mit Standardwerten für das phTC
Protein in nicht-neoplastischen Zellen des gleichen Typs wie die Testprobe, C Diagnostische Werte, die deutlich hoher als Standardvergleichswerte liegen, indizieren einen neoplastischen Zustand
Eine Methode zur Bestimmung der Gegenwart des phTC Proteins in einer Zelle oder zellularen Probe, die auf der Amplifikation eines hTC-Polynukleotids oder Hybridisierung eines hTC-Polynukleotids, Primers oder einer hTC komplementären
Sequenz mit einem hTC Polynukleotid beruhen
Ein Testkit zum Nachweis von phTC in zellularen Proben und Korperflussigkeiten, wobei markierte, immunchemisch-reaktive Komponenten beispielsweise sein können polyklonale Antikörper gegen phTC, monoklonale Antikörper gegen phTC,
Fragmente dieser Antikörper oder einem Gemisch aus diesen Komponenten
Eine Methode zur Verhinderung und/oder Behandlung zellularer (Zer-) Störung und/oder Fehlfünktion und/oder anderer Krankheitsbilder im Menschen, die auf der Gabe einer therapeutisch effektiven Menge an katalytisch aktiver humaner
Telomerase, ihrer fünktionellen Äquivalente oder ihrer katalytisch aktiven Fragmente beruht Ebenfalls denkbar ist der Einsatz einer Substanz, die die Produktion und/oder Aktivität von phTC fordert, eine Substanz, die die Aktivität von phTC imitieren kann, einer Substanz, die die Produktion und/oder Aktivität von phTC inhibieren kann oder eines Gemisches dieser Substanzen Weiterhin kann ein spezifischer Bindungspartner eingesetzt werden
Bevorzugt wird die Methode eingesetzt zur Verhinderung oder Behandlung der Alterung oder von Krebserkrankungen
Substanzen, die die Aktivität von phTC beeinflussen, d h inhibieren oder fordern, können, werden hier als Modulatoren bezeichnet Solche Modulatoren können in an sich bekannter Weise gefunden werden, wenn man in einem Telomerase-Assay ihren Einfluß auf die Telomerase-Aktivitat prüft Beispiele für Telomerase- Assays sind im Rahmen von Beispiel 15 angegeben
Modulatoren der phTC sind interessant zur Behandlung von Krankheiten, die mit
Telomerase in Zusammenhang stehen Insbesondere seien hier die Verhinderung oder Behandlung von Alterungsprozessen oder von Krebserkrankungen genannt
Eine antisense-Nukleinsaure gegen die hTC mRNA, die eine Nukleotidsequenz enthalt, die mit besagter mRNA hybridisiert, wobei die antisense-Nukleinsaure eine
RNA oder eine DNA ist
Bevorzugt bindet die antisense-Nukleinsaure an das Start-Kodon der jeweiligen mRNAs
Ein rekombinantes DNA Molekül mit einer DNA Sequenz, von der bei der Transkription eine antisense-Ribonukleinsaure gegen die hTC mRNA produziert wird Diese besagte antisense-Ribonukleinsaure enthalt eine Nukleinsauresequenz, die mit der besagten hTC mRNA hybridisieren kann
Ein solches DNA-Molekul kann zur Herstellung einer Zellime mit reduzierter Expression von phTC eingesetzt werden, indem man eine phTC-produzierende Zellinie mit diesem rekombinanten DNA Molekül transfiziert
- Ein Ribozym, das die hTC mRNA spaltet
Bevorzugt ist dies ein Tetrahymena-Typ Ribozym oder ein Hammerhead-Typ Ribozym
- Ein rekombinantes DNA Molekül mit einer DNA Sequenz, deren Transkription zur
Produktion eines solchen Ribozyms führt Dieses rekombinante DNA-Molekul kann eingesetzt werden um eine phTC- produzierende Zellinie zu transfizieren
Eine Zusammenstellung, bestehend aus einem Paar von humanen hTC Polynukleotid-PCR Primern, wobei die Primer bevorzugt aus Sequenzen bestehen, die mit der Sequenz der humanen hTC mRNA korrespondieren oder zu dieser Sequenz komplementär sind
Eine Zusammenstellung, die eine Polynukleotid-Hybridisierungssonde für das humane hTC Gen enthält, wobei die Sonde bevorzugt mindestens 29 aufeinanderfolgende Nukleotide enthält, die mit der Sequenz des humanen hTC Gens korrespondieren oder zu dieser komplementär sind
Tiermodelle, mit denen die Telomerase/Telomer-Regulation in vivo untersucht werden kann. So können z.B. mit Knockout- oder transgenen Tieren Tumorentstehung und Alterung direkt untersucht werden
Funktionelle Äquivalente sind im Fall von Proteinen oder Peptiden solche Verbindungen, die sich zwar hinsichtlich der Aminosauresequenz unterscheiden können, aber im wesentlichen dieselben Funktionen haben
Bekannte Beispiele hierfür sind Isoenzyme bzw sogenannte Mikroheterogenitaten bei Proteinen.
Im Fall der Oligo- oder Polynucleinsauren sollten unter fünktionellen Äquivalenten solche
Verbindungen verstanden werden, die sich in der Nucleotid-Sequenz unterscheiden, aber für das selbe Protein codieren Dies ist z B auf den degenerierten genetischen Code zurückzuführen
Erläuterung der Abbildungen Fig. 1 : cDNA Sequenz der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit (hTC) (SEQ ID No. 1).
Fig. 2: Abgeleitete Aminosäuresequenz von der in Fig. l dargestellten hTC DNA Sequenz (SEQ ID No. 2).
Die in Fig. 1 dargestellte DNA Sequenz läßt sich von Position 64 bis Position 3461 vollständig in eine Aminosäuresequenz translatieren. Die Aminosäurereste sind entsprechend ihrem Einbuchstabencode dargestellt.
Fig. 3: Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel mit unterschiedlich vorbehandelter DNA von
AA281296.
Die Abbildung zeigt ein Ethidiumbromid-gefärbtes 0,8%iges Agarosegel. In den Spuren 1 und 8 sind zwei verschiedene DNA Größenstandards aufgetragen, wobei die DNA Fragmentlängen 3, 2, 0.5 und 0.4 kb hervorgehoben sind. Die AA281296 DNA in pT7T3D wurde mit den Restriktionsenzymen Eco RI /Not I (Spur 3), Pst I
(Spur 6) und Xho 1 (Spur 7) verdaut. Auf die Spur 2 wurde unverdaute DNA von AA281296 in pT7T3D aufgetragen. In den Spuren 4 und 5 wurde 1/10 eines PCR- Ansatzes (1 Minute 94°C, 2 Minuten 60°C, 3 Minuten 72°C) mit der hTC cDNA in pT7T3D und den Primern 1 (5' GAGTGTGTACGTC-GTCGAGCTGCTCAGGTC 3 ') und 4 (5' CACCCTCGAGGTGAGACGCTCGGCC 3 ') [Spur 4] bzw. mit den
Primern 6 (5' GCTCGTAGTTGAGCACGCTGAACAGTG 3') und 7 (5' GCCAAGTTCCTGCACTGGCTGATGAG 3') [Spur 5] appliziert.
Fig. 4: Ausschnitt aus einem Proteinsequenzvergleich der katalytischen Telomerase- Untereinheiten von Euplotes pl23 (ρl23) und Mensch (phTC).
Die Bedingungen (Ktuple, Gap Penalty und Gap Length Penalty) für den in dieser Abbildung dargestellten Lipman-Pearson Proteinvergleich mit der Lasergene Programmsoftware (Dnastar, Inc.) sind aufgelistet. Die Aminosäurereste sind entsprechend ihrem Einbuchstabencode dargestellt. Die zwischen pl23 von Euplotes aedicidatus und dem identifizierten EST+i identischen Aminosäuren sind ebenfalls durch den entsprechenden Buchstaben aus dem Einbuchstabencode hervorgehoben. Nicht identische, aber in der Funktion ähnliche oder vergleichbare Aminosäuren sind durch ein : gekennzeichnet.
Fig. 5: Ausschnitt aus einem Proteinsequenzvergleich der katalytischen Telomerase-Unter- einheiten von Euplotes pl23 (pl23), und Hefe (est2p).
Die Bedingungen (Ktuple, Gap Penalty und Gap Length Penalty) für den in dieser Abbildung dargestellten Lipman-Pearson Proteinvergleich mit der Lasergene Programmsoftware (Dnastar, Inc.) sind aufgelistet. Die Aminosäurereste sind entsprechend ihrem Einbuchstabencode dargestellt. Die zwischen pl23 von Euplotes aediculatus und est2p von Hefe identischen Aminosäuren sind ebenfalls durch den entsprechenden Buchstaben aus dem Einbuchstabencode hervorgehoben. Nicht identische, aber in der Funktion ähnliche oder vergleichbare Aminosäuren sind durch ein : gekennzeichnet.
Fig. 6: Ausschnitt aus einem Proteinsequenzvergleich der katalytischen Telomerase-
Untereinheiten von Hefe (est2p) und Mensch (phTC).
Die Bedingungen (Ktuple, Gap Penalty und Gap Length Penalty) für den in dieser Abbildung dargestellten Lipman-Pearson Proteinvergleich mit der Lasergene Programmsoftware (Dnastar, Inc.) sind aufgelistet. Die Aminosäurereste sind entsprechend ihrem Einbuchstabencode dargestellt. Die zwischen est2p von Hefe und dem identifizierten EST+i identischen Aminosäuren sind ebenfalls durch den entsprechenden Buchstaben aus dem Einbuchstabencode hervorgehoben. Nicht identische, aber in der Funktion ähnliche oder vergleichbare Aminosäuren sind durch ein : gekennzeichnet.
Fig. 7: Ausschnitt aus einem Proteinsequenzvergleich der katalytischen Telomerase- Untereinheiten von Euplotes pl23 (pl23), Hefe (est2p) und Mensch (phTC). Der in der Fig. 5 dargestellte Vergleich zwischen Euplotes pl23 (ρl23), Hefe (est2p) und Mensch (phTC) wurde mit dem Clustal Method Subprogramm der Lasergene Programmsoftware (Dnastar, Inc. ) unter Standardtbedingungen durchgeführt. Die Aminosäurereste sind entsprechend ihrem Einbuchstabencode dargestellt. Die zwischen est2p von Hefe, pl23 von Euplotes aediculatus und dem ldentifizierten EST+] identischen Aminosäuren sind ebenfalls durch den entsprechenden Buchstaben aus dem Einbuchstabencode hervorgehoben Zusätzlich sind die Bereiche, die zwischen allen drei Proteinen identisch sind, durch einen hellgrauen Balken oberhalb der Proteinsequenz gekennzeichnet
Generierte DNA Sequenz aus Beispiel 6 (RACE Runde 1) (SEQ ID No 3)
Generierte DNA Sequenz aus Beispiel 6 (RACE Runde 2) (SEQ ID No 4)
Generierte DNA Sequenz aus Beispiel 6 (RACE Runde 3) (SEQ ID No 5)
Generierte DNA Sequenz aus Beispiel 8 (RACE Runde 3) (SEQ ID No 6)
Übersicht zur Klonierung der vollständigen hTC cDNA Die Positionen der Start- und Stopcodons sind mit Pfeilen gekennzeichnet Die schwarzen Bereiche der
Rechtecke symbolisieren für Protein kodierende Sequenzabschnitte, wahrend die hellgrauen Bereiche 5' und 3 ' untranslatierte cDNA Regionen symbolisieren bzw für Intronsequenzen stehen Die dunkelgrauen Blocke im Rechteck für die Füll length cDNA stehen entweder für das Telomerase-spezifische Motiv (T), oder für die sieben Reverse Transkriptase Motive (Nummer 1-7)
Die DNA-Fragmente, die zur Darstellung der vollständigen hTC cDNA notwendig sind, sind ebenfalls als Rechtecke dargestellt und entsprechend ihrer Herkunft gekennzeichnet Alle Rechtecke sind in ihrer Position relativ zueinander angeordnet Die Herkunft des DNA-Fragments, für das das Rechteck AA261296 steht, ist in Beispiel 2 beschreiben Die relative Position der 182 bp Deletion in diesem Fragment
(vergleiche Beispiel 2) ist durch eine Lücke im Rechteck gekennzeichnet Die Herkunft der DNA-Fragmente, für die die Rechtecke RACE1, RACE2 und RACE3 stehen, sind in Beispiel 6 beschreiben Die Herkunft des DNA-Fragments, für das das Rechteck C5F-Fragment steht, ist in Beispiel 7 beschreiben Die Herkunft des DNA-Fragments, für das das Rechteck Lambdal2 steht, ist in Beispiel 9 beschreiben Der 3 ' Teil in dem DNA-Fragment Lambda 12, der für eine nicht mit hTC in Verbindung stehende cDNA codiert (vergleiche Beispiel 9), ist in dieser Ab- bildung nicht dargestellt. Die vollständige hTC-cDNA Sequenz wurde unter Verwendung der in dieser Abbildung dargestellten DNA-Fragmente Lambda 12 und C5F an den 5' und 3' Splicestellen zusammengefügt (vergleiche Beispiel 7) Diese Splicestellen wurden in diversen Fragmenten identifiziert (RACE 1, RACE 3, Lambda 12 und C5F).
Fig.13 : Detailausschnitte aus einem Proteinsequenzvergleich der katalytischen Telomerase- Untereinheiten von Euplotes und Mensch (hTC). Die Abbildung zeigt Ausschnitte aus einem Proteinsequenzvergleich zwischen den katalytischen Telomerase-Untereinheiten von Euplotes und Mensch (hTC). In den umrandeten Boxen sind die Motive für die Reverse Transkriptase hervorgehoben. Die Ziffern unter den Umrandungen beziehen sich auf die jeweilige Aminosäureposition in der Fig. 2. Die Aminosäurereste sind entsprechend ihrem Einbuchstabencode dargestellt. Identische Aminosäuren sind fett gedruckt. In der Konsensussequenz für das Reverse Transkriptase (RT consensus)-Motiv steht h für eine hydrophobe Aminosäure und p bezeichnet eine polare Aminosäure Sind diese Gruppen von Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von Euplotes und hTC erhalten, sind p bzw. h fettgedruckt. Sehr hoch konservierte Aminosäuren sind grau unterlegt. In RT3 ist die umrandete Box erweitert, um zusätzliche homologe Aminosäuren zu erfassen. Das Telomerase-spezifische Motiv ist in Beispiel 9 beschrieben.
Fig.14: Generierte DNA-Sequenz aus Beispiel 11 (3 ' Variante) (SEQ ID No. 7). Der nicht zu der in Fig. 1 dargestellten DNA-Sequenz homologe Bereich ist fett hervor- gehoben.
Fig.15: hTC Expression in KrebszeUinien und in normalem humanen Gewebe. Abb. A: Auf dem Northern-Blot wurden nach Angaben des Herstellers (Fa. Clontech) etwa 2 μg poly A+ RNA aus verschiedenen humanen Zellinien immobilisiert. Im einzelnen stammte die RNA aus einem Melanom (G361), einem Lungenkarzinom (A549), aus einem Adenokarzinom des Kolons (SW480), aus einem Burkitt Lymphom Raji, aus einer Leukämie Zellinie (MOLT-4), aus einer chronischen Leukämie Zellinie (K- 562), aus einem Cervixtumor (HeLa) und aus der Leukämie Zellinie HL60. Die gekennzeichneten 4,4 kb, 6 kb und 9,5 kb Transkripte sind spezifisch für hTC (vergleiche Beispiel 10). Abb. B: Auf dem Northern-Blot wurden nach Angaben des Herstellers (Fa. Clontech) etwa 2 μg poly A+ RNA aus verschiedenen humanen Geweben immobilisiert. Im einzelnen wurde die RNA aus Herz, Gehirn, Plazenta,
Lunge, Leber, Skelettmuskulatur, Niere und Pankreas isoliert. Ein RNA- Größenstandard ist dargestelt.
Fig.16: Western-Blot Analyse der Kaninchenseren gegen Peptide aus der humanen Telomerase- Aminosäuresequenz (Beispiel 12). Jeweils 20 μl der bakteriellen Lysate aus Beispiel 13 wurden unter Zuhilfenahme der Antiseren aus Beispiel 12 in einem Western-Blot (Ausubel et al, 1987) analysiert. In den Spuren 1, 2, 6 und 7 wurden Lysate aus Bakterien, die das pMALEST-Konstrukt beinhalten, aufgetragen. In den Spuren 3, 4, 8 und 9 wurden Lysate aus Bakterien, die das pMALAl-Konstrukt beinhalten, aufgetragen. In den Spuren 1, 3, 6 und 8 sind Lysate aus nicht mit IPTG
(Isopropyl-beta-thiogalaktopyranosid) induzierten Bakterien aufgetragen. In den Spuren 2, 4, 7 und 9 sind Lysate aus mit IPTG induzierten Bakterien aufgetragen. In der Spur 5 wurde ein Standardgrößenmmarker (10 kDa Protein-Leiter der Firma Life Technologies, Kat. Nr. 10064-012) aufgetragen. Die 50 kDa- und 120 kDa- Banden sind am Rande der Membranen gekennzeichnet. Die PVDF-Membran in der
Abb. A mit den Spuren 1 bis 4 wurde mit Preimmunseren gegen das Peptid B (vergleiche Beispiel 12) inkubiert. Die PNDF-Membran in Abb. B mit den Spuren 6 bis 9 wurde mit Preimmunseren gegen das Peptid C (vergleiche Beispiel 12) inkubiert. Die PVDF-Membran in der Abb. B mit den Spuren 1 bis 4 wurde mit Immunseren gegen das Peptid B (vergleiche Beispiel 12) inkubiert. Die PVDF-Membran in Abb.
B mit den Spuren 6 bis 9 wurde mit Immunseren gegen das Peptid C (vergleiche Beispiel 12) inkubiert.
Fig.17: Autoradiogramm von 35 S-markiertem, in vitro translatiertem Protein. In der Spur 1 wurde das vollständige in vitro translatierte hTC aufgetragen (vergleiche Beispiel
15). In der Spur 2 wurde eine C-terminal verkürzte Version von phTC aufgetragen.
Die Spur 3 zeigt eine vom Hersteller (vergleiche Beispiel 15) gelieferte Positivkontrolle für die in vitro Translation Zur Abschätzung der Proteingroßen ist auf der rechten Seite ein Proteingroßenstandard gekennzeichnet
Autoradiogramm von 32P-markierten Produkten aus dem TRAP-Assay (vergleiche Beispiel 15) In den Spuren 1 und 2 wurde als Negativkontrolle ein TRAP-Assay
Ansatz ohne Zugabe von Enzym oder Protein aufgetragen In den Spuren 3 und 4 wurde als Positivkontrolle ein TRAP-Assay-Ansatz mit partiell aufgereinigter humaner Telomerase aus HeLa-Zellen aufgetragen In den Spuren 5 und 6 wurde ein TRAP-Assay-Ansatz mit in vitro translatiertem phTC unverdünnt aufgetragen In den Spuren 7 und 8 wurde ein TRAP-Assay Ansatz mit in vitro translatiertem phTC in einer 1 4 Verdünnung aufgetragen In den Spuren 9 und 10 wurde ein TRAP- Assay Ansatz mit in vitro translatiertem phTC in einer 1 16 Verdünnung aufgetragen In den Spuren 1 1 und 12 wurde als Negativkontrolle ein TRAP-Assay Ansatz mit in vitro translatierter Luziferase aufgetragen
Autoradiogramm von 2P-markierten Produkten aus dem direkten Telomerase Assay (vergleiche Beispiel 15) In der Spur 1 wurde ein radioaktiv markierter 10 bp- Marker aufgetragen In der Spur 2 wurde ein 5' radioaktiv markiertes Telo- meroligonukleotid ([TTAGGG] ) aufgetragen Bei der Spur 3 handelt es sich um eine leere Spur In der Spur 4 wurde als Positivkontrolle partiell aufgereinigte humane
Telomerase aus HeLa-Zellen im direkten Assay verwendet und das Syntheseprodukt aufgetragen In der Spur 5 wurde das in vitro translatierte phTC aus Beispiel 15 im direkten Assay verwendet und das Syntheseprodukt aufgetragen
Beispiele
Beispiel 1
Es wird heute angenommen, daß weniger als 5 % des humanen Genoms tatsächlich transkribiert und in Protein translatiert werden. Durch die gezielte Untersuchung dieser kodierenden Genomanteile könnten bereits vor der kompletten Sequenzierung des Genoms wichtige Informationen über die 60 000 - 70 000 Gene in einer humanen Zelle gewonnen werden. Die Automatisierung der Hochdurchsatz-DNA-Sequenziertechnologie in den letzten 10 bis 15 Jahren ermöglichte es, viele cDNAs aus Plasmid-cDNA-Bibliotheken unterschiedlichsten Ursprungs zu sammeln und das jeweilige 5'- bzw. 3 '-Ende zu sequenzieren. Diese typischerweise 300 bis 400 bp kurzen DNA-Sequenzen werden „Expressed Sequence Tags" oder kurz ESTs genannt und sind in verschiedenen spezialisierten Datenbanken zusammengefaßt. Der EST-Ansatz wurde zuerst von Okubo et al (1992) beschrieben und von Adams et al. (1992) auf einen größeren Maßstab übertragen. Gegenwärtig sind etwa 50 000 Gene aus humanen Zellen teilweise sequenziert und als EST-Eintragung dokumentiert.
Durch den Vergleich mit DNA- und Aminosäuresequenzen bekannter Gene können ver- wandte, aber bislang unbekannte Gene in diesen EST-Datenbanken identifiziert werden
(Gerhold and Caskey, 1996). Ein Suchalgorithmus, der sich hierfür besonders bewährt hat, ist das tBLASTn (Altschul et al, 1990). Dieser Algorithmus translatiert jede DNA-Sequenz in der EST-Datenbank in alle sechs möglichen Leserahmen und vergleicht diese Aminosäuresequenzen mit der bekannten Proteinsequenz.
Mit der kürzlich publizierten Proteinsequenz für die katalytische Telomerase-Untereinheit aus Euplotes aediculatus, pl23 (Lingner et al, 1997), wurde die EST-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) durchsucht. Als Resultat wurde ein humaner EST mit der Accession Nummer AA281296 identifiziert, der im Leserahmen +1 eine signifikante Homologie zu pl23 aufweist. Diese Aminosäuresequenz mit dem
Leserahmen +1 wird im folgenden als EST+] bezeichnet. Die Homologie zwischen pl23 und dem EST+i ist am auffälligsten in zwei Sequenzbereichen, die durch 30 Aminosäuren getrennt sind Der längere Sequenzbereich, der sich bei pl23 von Aminosäure 438 bis 484 erstreckt, ist zu 38% identisch zu dem korrespondierenden Bereich im EST+i Werden auch ahnliche Aminosäuren berücksichtigt, egt die Übereinstimmung sogar bei 59% Der zweite Homologieblock erstreckt sich im pl23-Protein von Aminosäure 513 bis 530 und weist eine 44%ige Identität zu dem entsprechenden Sequenzabschnitt im identifizierten EST+i auf Unter Ber cksichtigung von Aminosaureresten mit ahnlichen Eigenschaften findet sich eine Uberstimmung von 61%
Ein wichtiger Parameter zur Beurteilung einer BLAST-Suche ist der Wert P (Probabi ty) P gibt an, mit welcher Wahrscheinlichkeit ein spezifisches Segmentpaar auch in einer BLAST- Suche mit einer Zufallssequenz gefunden wurde und bewegt sich numerisch zwischen 0 (Resultat hoch signifikant) und 1 (Ergebnis ohne Bedeutung) So verlief z B der Vergleich des pl23 Äquivalents aus Hefe (est2p) mit der NCBI-EST-Datenbank negativ Der gefundene EST hatte eine Wahrscheinlichkeit von P=l (Tab 1) Dagegen weist das humane
Telomerase- assoziierte Protein 1 (hTPl), das in einer der Allgemeinheit nicht zuganglichen EST-Datenbank gefunden wurde (Harrington et al , 1997), eine Wahrscheinlichkeit von P=0 004 auf
Figure imgf000024_0001
Tab 1 Vergleich dreier tBlastn-Suchlaufe mit verschiedenen bekannten Genen
Der durch den Vergleich mit pl23 identifizierte humane EST AA281296 hat eine Wahrscheinlichkeit von P=3 5x10"06 Diese Daten legen nahe, daß der identifizierte EST aller Wahrscheinlichkeit nach für ein Fragment der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase kodiert. Daher wird das korrespondierende Gen im folgenden mit hTC (human Telomerase, catalytic) und das abge- leitete Protein mit phTC abgekürzt.
Beispiel 2
Der durch den Vergleich mit pl23 identifizierte EST wurde am 2. April 1997 in die EST- Datenbank eingespeist und ist in keiner Zeitschrift publiziert. Die cDNA-Bibliothek, in welcher dieser EST-Klon vorliegt, wurde laut Angaben des National Center for Biotechnology Information wie folgt hergestellt:
Nach Präparation der mRNA aus den Keimzentren der Tonsillen wurde eine cDNA- Synthese durchgeführt und die doppelsträngigen cDNA-Fragmente gerichtet über die
Restriktionsenzymschnittstellen Not I und Eco RI in den Vektor pT7T3D-Pac kloniert.
Die Sequenzierung der in die EST-Datenbank eingespeisten 389 bp erfolgte über den - 28ml3 rev2-Primer der Firma Amersham (DNA-Sequenz siehe Fig. lPosition 1685 bis 2073).
Unter Verwendung der Lasergene Programmsoftware (Dnastar Inc.) wurde die DNA- Sequenz von EST AA281296 entsprechend des humanen genetischen Codes translatiert. Die resultierende Aminosäuresequenz (EST+i) enstpricht der Position 542 bis 670 in Fig. 2.
Die abgeleitete Proteinsequenz von EST+i setzt sich aus 129 Aminosäuren zusammen, darunter 27 basische, 11 saure, 51 hydrophobe und 28 polare Aminosäurereste.
Der in Beispiel 1 identifizierte EST ( AA 281296) wurde kommerziell von der Research Genetics, Inc. (Huntsville) in Form eines in E. coli transformierten Plasmids erworben und experimentiell analysiert: Wie in dem Ethidiumbromid-gefarbten Agarosegel der Fig 3 gezeigt, wird nach Restriktionsverdau der hergestellten Plasmid DNA vom EST AA 281296 ein etwa 2,2 kb großes Fragment aus dem Vektor pT7T3D freigesetzt Anhand einer parallel durchgeführten Polymeraseketten- (PCR) -Reaktion mit spezifischen internen Primern wurde der EST AA281296 überprüft Die Lange der erwarteten PCR Produkte liegt bei 325 und 380 bp und stimmt mit der Lange der experimentell gefundenen Fragmente uberein (vergl Spur 4 und 5 in Fig 3) Damit konnte gezeigt werden, daß der vom Research Genetics, Int (Huntsville) zugesandte E coli-Klon den identifizierten EST als Plasmid beinhaltet
Nach DNA-Praparation wurden die insgesamt 2176 bp des Inserts durch Doppelstrangsequenzierung identifiziert Ein Sequenzvergleich des Klons AA281296 mit der DNA- Sequenz des C5F-Fragments (vergleiche Beispiel 7) ergab, daß eine 182 bp Deletion vorliegt (Position 2352 bis 2533, Fig 1) und sich somit der offene Leserahmen in diesem Bereich verschiebt Zusammenfassend setzt sich die DNA-Sequenz von Klon AA281296 somit aus den Sequenzinformationen der Fig 1 (Position 1685 bis 2351 und Position 2534 bis 4042) zusammen
Beispiel 3
Im tBLASTn Vergleich werden nur die Bereiche mit den höchsten Übereinstimmung zwischen pl23 und EST+i identifiziert (Aminosäuren 438-530, in pl23), wogegen die dazwischenliegenden Aminosäuren nicht berücksichtigt werden Um Aussagen über die Verwandtschaft der Proteinsequenzen über einen größeren Bereich (Aminosäuren 437-554, in p 123) zu treffen, wurde ein „Lipman-Pearson Proteinvergleich" durchgeführt (siehe Fig 4)
Hierbei wurden 34% identische Aminosäuren bzw 59% Aminosäuren, die entweder identisch oder biochemisch ahnlich sind, gefunden Dieses Ergebnis zeigt, daß sich auch außerhalb der mit dem tBLASTn gefundenen Homologiebereiche die Verwandtschaft zwischen diesen Proteinen fortsetzt
Wie kurzlich berichtet (Lingner et al, 1997), sind pl23 aus Euplotes aediculatus und est2p aus Saccharomyces cerevisiae zueinander homolog Um den Grad der Verwandtschaft zwischen pl23 und est2p ins Verhältnis zu der hier beschriebenen Homologie zwischen pl23 und EST+i zu stellen, wurde die oben beschriebene Region von pl23 (Aminosäuren 437-554) mit Hilfe des Lipman-Pearson Proteinvergleichs unter Verwendung identischer Parameter auch mit est2p verglichen. Dabei zeigte sich, daß pl23 und est2p in diesem aus- gewählten Bereich zu 21%) identisch sind bzw. 22% identische Aminosäuren oder biochemisch ähnliche Aminosäurereste aufweisen (siehe Fig. 5). Demnach ist die Homologie zwischen EST+] und dem pl23 von Euplotes signifikant höher als zwischen die pl23 und est2p.
Beispiel 4
Die Homologie von pl23 zu EST+ι und est2p legt die Schlußfolgerung nahe, daß alle 3 Proteine zur gleichen Proteinfamilie gehören. Um diese Annahme zu bestätigen, wurde est2p unter den in Beispiel 3 erwähnten Bedingungen mit EST+i verglichen (siehe Fig. 6). Dabei zeigte sich, daß EST+i 20% Identität zu est2p hat, also eine vergleichbare
Homologie wie pl23 zu est2p aufweist. Diese vergleichsweise geringe Übereinstimmung bestätigt auch den Befund, daß in der tBLASTn-Suche mit est2p kein signifikanter EST identifiziert wurde (siehe Beispiel 1).
Beispiel 5
Um für die Proteinfamilie der katalytischen Telomerase-Untereinheiten aus verschiedenen Spezies wichtige, unter Umständen fünktionelle Domänen, zu identifizieren, wurde ein Computervergleich mit pl23, est2p und phTC durchgeführt (siehe Fig. 7). Bei dieser Analyse fallen insbesondere zwei Bereiche auf, die in allen drei Proteinen enthalten sind
(siehe Fig. 7). Dem Bereich, der bei pl23 den Aminosäuren 447 bis 460 entspricht (Fig. 13, Telomerase Motiv ) kann gegenwärtig keine eindeutige Funktion zugeordnet werden. Eine Motiv-Suche mit dem „Wisconsin Sequence Analysis Package" von der „Genetics Computer Group" (GCG) und eine Suche in einer Protein-Datenbank (Swissprot, Ausgabe vom 8.6.1997) ergaben keine signifikanten Erkenntnisse. Dagegen weist ein zweiter, zwischen pl23, est2p und phTC homologer Bereich, der bei pl23 den Aminosäuren 512-526 entspricht, ein Konsensus-Motiv für eine Reverse Transkriptase (RT) auf (Fig 7 und 13) Lingner et al. (1997) konnten zeigen, daß pl23/est2p insgesamt 6 solcher RT-Motive enthalten, die für die katalytische Funktion von pl23/est2p essentiell sind Wie in Fig 7 und 13 dargestellt, sind in der untersuchten
Sequenz von phTC auch zwei solcher RT-Motive konserviert Hierbei handelt es sich um die RT-Motive, welche bei pl23/est2p am weitesten N-terminal lokalisiert sind (Lingner et al, 1997)
Die Primarsequenzen von Reversen Transkriptasen sind stark divergent, nur wenige Aminosäuren sind innerhalb eines separaten Motivs vollständig konserviert (Poch et al, 1989 und Xiong and Eickbush, 1990) Außerdem unterscheiden sich Reverse Transkriptasen, die von Retroviren oder Long Terminal Repeat (LTR) Retrotransposons kodiert werden, durch verschiedene Abstände zwischen den konservierten RT-Motiven von solchen Reversen Transkriptasen, die von Nicht-LTR Retrotransposons oder der Gruppe II Introns kodiert werden (Xiong and Eickbush, 1990) Entsprechend des Aufbaus ihrer RT-Motive sind pl23, est2p und phTC letzterer RT-Gruppe zuzuordnen Interessanterweise entsprechen dabei die Konsensussequenzen der RT-Motive in phTC am genauesten dem postulierten RT-Konsensus-Motiv Von acht Aminosaureresten innerhalb der zwei RT-Motive sind bei phTC 6, bei pl23 und est2p hingegen nur 5 Aminosäuren zu finden (Fig 7 und 13 )
Auffällig sind hierbei insbesondere die hydrophoben Aminosäuren wie Leucin und Isoleucin sowie die Aminosäuren Lysin und Arginin in bestimmten Positionen (Fig 7 und 13)
Zusammenfassend konnte hiermit auf deskriptiver Ebene gezeigt werden, daß der aufgrund seiner Homologie zu pl23 identifizierte Klon AA281296 ein Fragment der katalytischen
Untereinheit der humanen Telomerase darstellt
Beispiel 6
Zur Klonierung des 5'-Endes der hTC-cDNA wurden zusatzlich zu dem in Beispiel 8 aufgeführten Homologiescreening drei aufeinanderfolgende RACE (rapid amplification of cDNA ends)-Reaktionen durchgeführt Als cDNA-Quelle wurde Marathon-Ready cDNA (Fa Clontech) aus der humanen Leukamiezellinie K562 bzw aus humanem Testisgewebe eingesetzt Nachfolgend ist die Durchführung sowie das Ergebnis der einzelnen RACE- Runden beschrieben
Darüberhinaus wurden die Sequenzinformationen der RACE-Runden genutzt, um per PCR die Einzelfragmente als einen zusammenhangenden cDNA-Klon zu amplifizieren
RACE-Runde 1
In einem Endvolumen von 50 μl wurden 5 μl K562 Marathon-Ready cDNA (Fa Clontech,
Katalognummer 7441-1) mit 10 pmol dNTP-Mix versetzt und in 1 x Kien Taq PCR- Reaktionspuffer und 1 x Advantage Kien Taq Polymerase Mix (Fa Clontech) eine PCR- Reaktion durchgeführt Als Primer wurden 10 pmol des internen genspezifischen Primers GSP2 (5'-GCAACTTGCTCCAGACACTCTTCCGG-3') aus dem 5'-Bereich des hTC- EST-Klons sowie 10 pmol des Marathon Adaptor Primers API (5'-
CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3', Fa Clontech) zugefügt Die PCR wurde in 4 Schritten durchgeführt Nach einer einminutigen Denaturierung bei 94°C wurde über 5 Zyklen für 30 sec bei 94°C denaturiert und anschließend für 4 min bei 72°C die Primer angelagert und die DNA-Kette verlängert Es folgten 5 Zyklen, bei denen für 30 sec die DNA bei 94°C denaturiert wurde, die anschließende Primerverlangerung aber für 4 min bei
70°C erfolgte Abschließend wurden dann 22 Zyklen durchgeführt, bei denen nach den 30 sec DNA-Denaturierung die Primeranlagerung und Kettenverlangerung für 4 min bei 68°C stattfand.
Im Anschluß an diese PCR wurde das PCR-Produkt 1 50 verdünnt Fünf μl dieser Verdünnung wurden in einer zweiten „nested" PCR zusammen mit 10 pmol dNTP-Mix in 1 x Kien Taq PCR-Reaktionspuffer und 1 x Advantage Kien Taq Polymerase-Mix sowie 10 pmol des Primers GSP2 und 10 pmol des „nested" Marathon Adaptor Primers AP2 (5'- ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3', Fa Clontech) eingesetzt Die PCR-Bedingungen entsprachen den in der ersten PCR gewählten Parametern Als einzige Ausnahme wurden im letzten PCR-Schritt statt 22 Zyklen nur 16 Zyklen gewählt Als Produkt dieser Nested-RACE-PCR wurde ein 1 153 bp langes DNA-Fragment erhalten Dieses wurde in den TA-Cloning Vektor pCR2 1 der Fa InVitrogen kloniert und vollständig doppelstrangig sequenziert (Fig 8 und SEQ ID No. 3).
Die Nukleotide 974 bis 1153 repräsentieren die in Fig 1 dargestellte Nukleotidregion 1629 bis 1808 der hTC-cDNA Bei dem von bp 1-973 reichenden Nukieotidbereich, der keine Homologie zu der in Fig 1 gezeigten hTC-cDNA-Sequenz aufweist, handelt es sich um Intronsequenzen des hTC-Gens (Daten nicht gezeigt) Eine 3'-Splice-Konsensussequenz ist am Exon-Intron-Ubergang zu finden Die Präsenz von Intronsequenzen konnte auf unvollständig gesplicte mRNA als Ausgangssubstanz für die cDNA-Synthese zurückzuführen sein Auch genomische DNA-Kontaminationen in der cDNA konnten das Auffinden von Intronsequenzen erklaren
RACE-Runde 2'
Basierend auf den Sequenzdaten der ersten RACE-Runde wurde eine zweite RACE mit dem genspezifischen Primer GSP5 aus der 5'-Region von RACE-Produkt 1 (5'- GGCAGTGACCAGGAGGCAACGAGAGG-3') sowie dem API -Primer durchgeführt Als cDNA-Quelle wurde Marathon-Ready cDNA aus humanem Testis (Fa Clontech, Katalognummer 7414-1) verwendet Es wurden gleiche PCR-Bedingungen wie bei der 1
PCR in RACE-Runde 1 gewählt Auch in RACE-Runde 2 wurde an die 1 PCR eine 2 „nested" PCR mit verdünntem PCR-Produkt als cDNA-Quelle angeschlossen Als „nested" PCR-Primer wurden der genspezifische Primer GSP6 aus der 5'-Region von RACE- Produkt 1 (5'-GGCACACTCGGCAGGAAACGCACATGG-3') sowie der AP2-Primer genutzt. Die Bedingungen entsprachen den Parametern der Nested-PCR aus RACE-Runde
1
Das 412 bp lange PCR-Produkt der Nested-PCR aus RACE-Runde 2 wurde in den TA- Cloning Vektor pCRII-Topo der Fa Invitrogen kloniert und vollständig sequenziert (Fig 9 und SEQ ID No 4) Der Sequenzabschnitt von bp 267 bis bp 412 ist komplett homolog zu dem 5 '-Bereich des Produktes aus RACE 1 Die Region von bp 1 bis bp 266 verlängert RACE-Produkt 1 am 5 '-Ende. Bei diesem RACE-Produkt 2 handelt es sich wahrscheinlich komplett um einen Intronbereich des hTC-Gens (Daten nicht gezeigt).
RACE-Runde 3 :
Eine dritte RACE-Runde führte zur Identifizierung von weiter 5 '-gelegenen hTC-cDNA- Regionen. Ausgehend von den Sequenzergebnissen der RACE-Runde 2 wurde ein genspezifischer Primer GSP9 (5'-CCTCCTCTGTTCACTGCTCTGGCC-3') aus dem 5'- B ereich des RACE-Produkts 2 gewählt und zusammen mit dem API -Primer und Marathon- Ready cDNA aus humanem Testis (Fa. Clontech) in einer neuen RACE eingesetzt. Die
RACE-Bedingungen glichen denen der 1. PCR in RACE 1 und 2. In der nachfolgenden „nested" RACE, die, entsprechend der „nested"-RACE in Runde 1 und 2, mit dem genspezifischen Primer GSP 10 aus dem 5'-Bereich von RACE-Produkt 2 (5'- CGTAAGTTTATGCAAACTGGACAGG-3') und AP2 erfolgte, wurde ein 1012 bp langes Fragment (Fig. 10 und SEQ ID No. 5) amplifiziert und in den TA-Cloning Vektor pCRII-
TOPO kloniert. Die nachfolgende Sequenzierung zeigte, daß die 3 '-Region dieses RACE- Fragments (bp 817 - bp 1012) offensichtlich noch Intronsequenz des hTC-Gens darstellt. Komplett homolog zur 5'-Region von RACE-Produkt 2 ist der Bereich von bp 889-1012. Dagegen ist der 5'-Bereich dieses Fragments von bp 1-bp 816 identisch mit der in Fig. 1 gezeigten Region von bp 814 - bp 1629 der hTC-cDNA. Eine potentielle 5'-Splice-
Konsensussequenz ist am Exon-Intron-Ubergang zu finden.
Beispiel 7
Zur Klonierung eines zusammenhängenden Fragments aus den Sequenzinformationen von
RACE 2 und dem Klon AA281296 wurde eine PCR durchgeführt. Als cDNA-Quelle wurde Marathon-Ready cDNA aus humanem Testis (Fa. Clontech; Katalognummer 7414-1) verwendet. Der PCR Ansatz erfolgte wie unter RACE 1 (vergleiche Beispiel 6) beschrieben, allerdings mit den Primern C5F (5'-CGAGTGGACACGGTGATCTCTGCC-3') aus der 5' Region von RACE 2 und dem Primer C3B (5'- GCACACCTTTGGTCACTCCAAATTCC-
3 ') aus der 3 ' Region vom Klon AA281296. Die PCR wurde in 2 Schritten durchgeführt. Nach einer einminütigen Denaturierung bei 94°C wurde über 36 Zyklen für 30 sec bei 94°C denaturiert und anschließend für 4 min bei 68°C die Primer angelagert und die DNA-Kette verlängert.
Als Produkt dieser PCR wurde ein 2486 bp langes DNA-Fragment, im folgenden als C5F- Fragment bezeichnet, erhalten. Dieses wurde in den TA-Cloning Vektor pCRII-TOPO der
Fa. Invitrogen kloniert und vollständig doppelsträngig sequenziert. Ein Sequenzvergleich von dem C5F-Fragment mit DNA-Sequenz vom Klon AA281296 ergab, daß zwischen dem RT-Motiv 3 und RT-Motiv 4 eine 182 bp lange in frame Insertion vorliegt (Position 2352 bis 2533, Fig. l). Ein weiterer Vergleich der DNA vom C5F-Fragment mit den Sequenzen der drei RACE-Runden machte deutlich, daß am 3' Ende von C5F ein bereits in RACE 2 identifiziertes Intron vorliegt. Eine 3'-Splice-Konsensussequenz ist am Exon-Intron- Übergang zu finden. Zusammenfassend setzt sich die DNA-Sequenz vom C5F-Fragment somit aus den Sequenzinformationen der Fig. 9 (Position 64 bis 278) und den Sequenzdaten der Fig. 1 (Position 1636 bis 3908) zusammen.
Beispiel 8
Zur Klonierung des 5 '-Endes der hTC-cDNA wurden zusätzlich zu dem in Beispiel 6 aufgeführten RACE-Protokoll ein Homologiescreening (Ausubel et al, 1987) durchgeführt. Als cDNA-Quelle wurde eine humane Erythroleukemia 5 '-Stretch Plus cDNA Bibliothek (Fa.
Clontech, Kat. Nr. HL5016b) aus der humanen Leukämiezellinie K562 verwendet. Etwa 3x10 Pfü dieser random und oligo dT geprimten Bibliothek wurden wie bei Ausubel et al, (1987) ausplattiert und zum Screening eingesetzt. Als Probe wurde ein 719 bp langes (Position 1685 bis 2404, entsprechend der Fig. 1) radioaktiv markiertes hTC-DNA- Fragment benutzt.
Von 20 putativ positiven λ Klonen konnte nach einem Rescreening mit der gleichen hTC- Sonde der λ Klon 12 als positiv verifiziert werden. Nach Plaqueaufreinigung und λ DNA- Präparation (Ausubel et al, 1987) wurde das 4kb Insert in den Vektor pBluescript umkloniert und durchsequenziert (Fig. 11 und SEQ ID No. 6). Ein Vergleich der λ Klon 12-Sequenz mit den Sequenzen der RACE-Klone und der DNA- Sequenz vom Klon AA281296 ergab, daß dieser im Homologie Screening identifizierte Klon für einen 5' Teil der hTC-cDNA kodiert und ein putatives ATG-Startcodon in Position 63 entsprechend der Fig. l aufweist. 5' von diesem ATG liegt kein Stopcodon im gleichen Leserahmen vor. Weitere Sequenzanalysen machen deutlich, daß der λ Klon 12 von Position 1656 bis 2004 wahrscheinlich ein Intron enthält. Sehr gut konservierte 5' und 3 ' Splicestellen belegen diese Hypothese. Die für die hTC-cDNA kodierende Sequenz setzt sich dann von Position 2005 bis Position 2382 fort. Die Sequenz von 2383 bis zum 3 ' Ende vom λ Klon 12 weist einen auffälligen offenen Leserahmen in Leseraster -4 auf. Eine bioinformatorische Analyse der entsprechenden DNA-Sequenz zeigte, daß dieser
Leserahmen über etwa 400 bp identisch zu diversen ESTs ist, die in keinem Zusammenhang zur hTC-cDNA stehen. Somit handelt es sich bei dem λ Klon 12 um einen Chimären Klon, der sich im wesentlichen aus dem 5' Ende der hTC cDNA und einem weiteren cDNA-Klon unbekannter Funktion zusammensetzt.
Eine zusammenfassende schematische Darstellung mit der relativen Orientierung der RACE-Produkte und des Homologiescreenings ist in Fig. 12 dargestellt. Die vollständige Sequenz der hTC-cDNA (Fig. 1) wurde aus dem λ Klon 12 (Position 21 bis 1655 entsprechend der Fig. 11), dem PCR-Produkt C5F (Position 1636 bis 3908 entsprechend der Fig. 1) und dem EST AA281296 (Position 3909 bis 4042 entsprechend der Fig. 1) zusammengesetzt.
Beispiel 9
Durch einen Vergleich der phTC-Proteinsequenz (Fig. 2 und SEQ ID No. 2) mit einer
Konsensussequenz von Reversen Transkriptasen (Poch et al., 1989, Xiong and Eickbush, 1990) wurden insgesamt sieben Motive für Reverse Transkriptasen (RT-Motive) identifiziert (Fig. 13). Innerhalb dieser Motive sind einige Aminosäuren nicht nur zwischen der RT-Konsensussequenz und dem phTC, sondern auch im Vergleich zu dem Telomerase- protein aus Euplotes hoch konserviert. So sind z.B. in RT-Motiv 5 zwei Asparaginsäuren
(Position 868 und 869 in Fig. 2) völlig konserviert (Fig. 13). Das aus anderen Reverse Transkriptasen abgeleitete RT-Motiv 7 (Poch et al., 1989, Xiong and Eickbush, 1990) wurde nur in der humanen katalytischen Telomeraseuntereinheit aufgezeigt, nicht in dem Euplotes-Protem (Fig. 13).
Auffällig sind weiterhin Strukturmerkmale, die sich nur in den Telomeraseproteinen, nicht jedoch in anderen Reverse Transkriptasen aufzeigen lassen. Das Telomerase Motiv (Position 553 und 565 in Fig. 2) ist eine für diese Proteinfamilie spezifische Struktur, da es in keinem bisher bekannten Protein vorkommt. Ein weiteres nur in den katalytischen Telomeraseproteinen identifiziertes Merkmal ist der Abstand zwischen den RT -Motiven 3 und 4, der mit 107 Aminosäuren deutlich größer ist als in anderen RTs. Diese
Besonderheiten erlauben die Schlußfolgerung, daß die katalytischen Untereinheiten der Telomerasen aus verschiedenen Spezies wahrscheinlich eine eigene Untergruppe der RNA- abhängigen DNA-Polymerasen darstellt.
Beispiel 10
Die Expression der Telomerase RNA-Untereinheit (hTR) korreliert nicht mit der Telomeraseaktivitat, sondern wird ubiquitär beobachtet (Feng et al, 1995). Somit stellt sich die Frage, ob die Ausprägung dier katalytischen Telomerase-Untereinheit mit der Telomeaseaktivität einhergeht.
Um das hTC-Expressionslevel zu analysieren, wurden Northern Blot-Experimente (Ausubel et al, 1987) durchgeführt. Die kommerziell erhältlichen Northern Blots waren entweder mit einer Reihe von RNA-Präparationen aus normalem, humanem Gewebe (Fa. Clontech; Katalognummer 7760-1) oder mit RNA-Proben aus humanen KrebszeUinien (Fa. Clontech;
Katalognummer 7757-1) bestückt. Als Probe wurde ein 719 bp langes (Position 1685 bis 2404, entsprechend der Fig. l) radioaktiv markiertes hTC-DNA-Fragment benutzt. Die Inkubation der Membranen mit der Probe erfolgte nach Angaben des Herstellers (Fa. Clontech).
In den acht getesteten humanen Zellinien (3 Leukämiezellinien, 3 Carcinomzellinien, ein Melanom und ein Lymphom) wurden zwei RNA-Haupttranskripte in der Größe von etwa 9,5 kb und 4,4 kb und ein RNA-Nebentranskript von etwa 6 kb nachgewiesen, die mit der Probe kreuzhybridisieren (Fig. 15, Abb. A). Die hTC mRNA wurde im Vergleich am stärksten in den Leukämie Zellinien K-562 und HL-60 exprimiert (Fig. 15, Abb. A). Im Gegensatz dazu war das hTC-Transkript in den getesteten normalen Geweben (Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas) nicht nachzuweisen
(Fig. 15, Abb. B). Diese Beobachtung ist nicht überraschend, da in diesen Geweben auch keine Telomeraseaktivitat nachgewiesen werden konnte (Kim et al, 1994).
Diese Daten deuten darauf hin, daß die Induktion der hTC Expression für die Aktivierung der Telomerase während der Tumorentstehung eine wesentliche Rolle spielt.
Beispiel 11
Bei der PCR-Amplifikation der hTC-cDNA-Fragmente aus verschiedenen cDNA-Banken (Marathon Ready cDNA der Fa. Clontech aus der humanen Leukämiezellinie K562 und aus humanem Testis sowie cDNA aus der humanen prämyeloischen Leukämiezellinie HL60) wurden stets mehrere PCR-Produkte erhalten, die in ihrer Größe minimal voneinander abwichen. Um die Unterschiede zwischen den verschiedenen hTC-PCR-Produkten aufzuklären, wurde mit den Primern C5A (5'-CCGGAAGAGTGTCTGGAGCAAGTTGC- 3') und C3B (5'-GCACACCTTTGGTCACTCCAAATTCC-) ein von bp 1783 bis bp 3901 reichendes Fragment der in Fig. 1 dargestellten hTC-cDNA amplifiziert. Als cDNA-Quelle wurde Marathon-Ready cDNA aus K562-Leukämiezellen (Fa. Clontech; Katalognummer
7441-1) verwendet (PCR1 und 2). In einer dritten PCR wurde mit den Primern GSPlvor
(5'-GGCTGATGAGTGTGTACGTCGTCGAG-3') und HTRT3A (5'- GGGTGGCCATCAGTCCAGGATGG-3 ') ein hTC-Fragment von bp 1695 bis bp 3463 der hTC-cDNA in Fig. 1 aus HL60-cDNA amplifiziert.
Nachfolgend sind die Bedingungen der 3 PCR-Reaktionen beschrieben:
In der ersten PCR wurden in einem Endvolumen von 50 μl 5 μl K562 Marathon-Ready cDNA mit 10 pmol dNTP-Mix versetzt und in 1 x Kien Taq PCR-Reaktionspuffer und 1 x Advantage Kien Taq Polymerase Mix (Fa. Clontech) eine PCR-Reaktion durchgeführt. Je 10 pmol der Primer C5A und C5B wurden zugefügt Die PCR wurde in 3 Schritten durchgeführt An eine einminutige Denaturierung bei 94°C schlössen sich 35 PCR-Zyklen an, in denen die DNA zunächst für 30 sec bei 94°C denaturiert wurde und anschließend für 4 min bei 68°C die Primer angelagert und die DNA-Kette verlängert wurde Zum Abschluß folgte für 10 min eine Kettenverlangerung bei 68°C Die entstandenen PCR-Produkte wurden in den TA-Cloning Vektor pCRII-TOPO der Fa InVitrogen kloniert
In einer zweiten PCR wurden 5 μl K562 Marathon-Ready cDNA mit je 10 pmol der Primer C5A und C3B, 10 pmol dNTP-Mix und 2 U Taq-DNA-Polymerase (Fa Gibco-BRL) versetzt und in einem Endvolumen von 50 μl eine PCR-Reaktion in lx PCR-Puffer der Fa
Perkin Eimer durchgeführt Die PCR-Reaktion erfolgte in 3 Schritten Zunächst wurde die DNA für 3 min bei 94°C denaturiert Es folgten 34 Zyklen, bei denen aufeinanderfolgend die DNA für 45 sec bei 94°C denaturiert wurde, anschließend für 1 min bei 68°C die Primeranlagerung erfolgte und danach für 3 min bei 72°C die DNA-Kette verlängert wurde Im letzten PCR-Schritt wurde für 10 min bei 72°C eine abschließende Kettenverlangerung durchgeführt Die entstandenen PCR-Produkte wurden in den TA-Cloning Vektor pCR2 1 der Fa InVitrogen kloniert
Für die dritte PCR wurde zunächst mit dem cDNA-Synthese-Kit der Fa Boehringer Mann- heim aus 2 μg DNasel-behandelter Poly A-RNA der humanen pramyeloischen Zellinie
HL60 eine cDNA-Synthese entsprechend den Angaben der Hersteller durchgeführt In einem Endvolumen von 50 μl wurde anschließend 1 μl dieser HL60-cDNA mit je 10 pmol der Primer GSPlvor und HTRT3A sowie 10 pmol dNTP-Mix gemischt und nach Zusatz von 1,25 μl DMSO in 1 x Kien Taq PCR-Reaktionspuffer und 1 x Advantage Kien Taq Polymerase Mix (Fa Clontech) eine PCR-Reaktion durchgeführt Die PCR-Reaktion verlief in 3 Schritten Nach einer Denaturierung für 3 min bei 94°C wurde über 37 Zyklen die DNA zunächst für 1 min bei 94°C denaturiert und anschließend für 4 min bei 68°C die Primer angelagert und die DNA-Kette verlängert Abschließend erfolgte noch eine Inkubation für 10 min bei 68°C Die PCR-Produkte wurden in den TA-Cloning Vektor pCR 2 1-TOPO kloniert Die vollständige Doppelstrangsequenzierung der aus PCR 1 und 2 Monierten hTC-cDNA- Fragmente sowie die partielle Sequenzierung der aus PCR 3 erhaltenen hTC-cDNA- Fragmente zeigte, daß zusatzlich zu der in Fig 1 dargestellten hTC-cDNA 4 Varianten dieser cDNA in humanen Zellen existieren
Variante 1 der humanen hTC-cDNA zeichnet sich durch eine 182 bp lange Deletion der Nukleotide 2345 bis 2526 aus Durch diese Deletion kommt es zu einer Verschiebung im ORF und es wird ein verkürztes hTC-Protein abgelesen, dem die RT-Motive 4 bis 7 fehlen
Variante 2 der humanen hTC-cDNA weist eine 36 bp lange Deletion der Nukleotide 2184 bis 2219 auf Durch diese Deletion geht das RT-Motiv 3 verloren Der Leserahmen bleibt jedoch erhalten und es wird ein Protein hergestellt, dem selektiv das RT-Motiv 3 fehlt
Variante 3 der humanen hTC-cDNA stellt eine Kombination der Varianten 1 und 2 dar Sie weist sowohl eine Deletion der bp 2184 bis 2219 als auch der bp 2345 bis 2526 auf
Variante 4 der humanen hTC-cDNA zeichnet sich durch den Verlust des Nukleotidbereichs von bp 3219 bis 3842 aus Diese fehlende Sequenz ist durch eine nicht zu hTC homologe Sequenz ersetzt Ab bp 3843 ist die Sequenz wieder völlig identisch zu der in Fig 1 darge- stellten hTC-Sequenz Die Sequenz der Variante 4 ist in Fig 14 dargestellt Entsprechend des gewählten 5'-Primers beginnt sie mit bp 1783 der in Fig 1 dargestellten hTC-cDNA Der nicht-homologe Bereich ist fett hervorgehoben und stimmt von Position 3219 bis Position 3451 (Fig 14 und SEQ ID No 7) auf DNA Ebene zu 98,7% mit einem EST (Accession Nr AA299878) aus einem humanen Uterustumor uberein
Beispiel 12
Zur Gewinnung von Antiseren mit Spezifitat für die katalytische Untereinheit der humanen Telomerase wurde die vorhandene Nukleotidsequenz (Fig 1) in eine Aminosauresequenz übersetzt (Fig 2) Mit Hilfe eines Programms zur Sekundarstrukturvorhersage (PROTEAN, aus dem Softwarepaket DNAStar, DNASTAR Ine , Madison, WI, USA) wurden zwei Peptide ausgewählt, die mit gewisser Wahrscheinlichkeit eine Immunantwort hervorrufen Es handelt sich um folgende Peptide, die im Einbuchstabencode für Aminosäuren dargestellt sind:
B: C-K-R-V-Q-L-R-E-L-S-E-A-E-V-R-Q - CONH2 / Pos. 594 - 608 C: C-Q-E-T-S-P-L-R-D-A-V-V-I-E-Q-S-S-S-L-N-E - CONH2 / Pos. 781-800
Die unterstrichenen Cysteine stammen nicht aus der Telomerasesequenz, sondern wurden als Linker für die Kopplung zusätzlich angefügt
Die Peptide wurden über das Thiol-reaktive Kopplungsreagenz m-Maleimido-benzoyl-N-
Hydroxysuccinimidester (MBS) an Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) gekoppelt. Damit wurden je zwei Kaninchen im Abstand von 2 bis 4 Wochen immunisiert. Vor der Immunisierung wurden 5 ml Blut zur Gewinnung von Preimmunseren entnommen. Nach 4 Immunisierungen wurden ebenfalls 5 ml Blut zur Gewinnung von Immunseren entnommen. Diese Seren wurden in einem Western-Blot Experiment (Ausubel et al, 1987) auf
Reaktivität mit Fusionsproteinen (Beispiel 13) getestet.
Beispiel 13
Um das Protein der katalytischen Telomerase-Untereinheit analysieren zu können, wurden bakterielle Expressionversuche durchgeführt.
Die Konstrukte für diese Experimente sind im Folgenden beschrieben:
Für das Expressionskonstrukt pMalEST wurde das Insert des in Beispiel 2 erwähnten Klons
AA281296 mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Not I herausgeschnitten, die Schnittstellen mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt (Ausubel et al, 1987) und in den vorgegebenen Leserahmen des Maltose bindenden Proteins des bakteriellen Expressionvektors pMAL-C2 (Fa. New England Biolabs) kloniert. Der Vektor pMAL-C2 wurde mit dem Restriktionsenzym Pst I verdaut und die überstehenden Einzelstrangenden mit der T4 DNA Polymerase entfernt (Ausubel et al, 1987). Das Expressionskonstrukt pMalAl beinhaltet die Nukleotidsequenz der Fig. 1 von Position 1789 bis Position 3908. Dieses DNA-Fragment wurde über PCR mit den Primern C5A (5'- ACCGGAAGAGTGTCTGGAGCAAGTTG-3') und C3B (5'-
GCACACCTTTGGTCACTCCAAATTCC-3 ') aus einer kommerziell erhältlichen K562 Marathon-Ready cDNA Library (Fa. Clontech, Katalognummer 7441-1) amplifiziert und in
TA-Cloning Vektor pCRII-TOPO der Fa. Invitrogen kloniert. Die PCR-Bedingungen wurden wie im Beispiel 7 beschrieben durchgeführt. Für das Expressionskonstrukt pMalAl wurde das Insert mit dem Restriktionsenzym Eco RI herausgeschnitten, die Schnittstellen mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt (Ausubel et al, 1987) und in den mit dem Restriktionsenzym Xmn I geschnittenen bakteriellen Expressionvektors pMAL-C2 (Fa.
New England Biolabs) kloniert.
Die Proteinexpression unter Verwendung dieser Konstrukte erfolgte in dem Bakterienstamm E. coli DH5α. Die Expressionsbedingungen erfolgten wie in der Betriebsanleitung der Fa. New England Biolabs (Katalognummer 800) beschrieben. Die hergestellten bakteriellen Lysate wurden in einem Western-Blot Experiment (Ausubel et al, 1987) getestet.
Beispiel 14
Die bakteriellen Lysate aus Beispiel 13 wurden unter Zuhilfenahme der Antiseren aus Beispiel 12 in einem Western Blot (Ausubel et al, 1987) analysiert.
Da der Fusionsanteil für das Maltose bindende Protein etwa 43 kDa groß ist, werden für die Konstrukte pMalEST und pMalAl Fusionsproteine in der Größe von etwa 74 kDa bzw 106 kDa erwartet.
Im Vergleich der Pre-Immunseren mit den Seren nach der ersten Immunisierung wird ersichtlich, daß spezifische Antikörper gegen die Epitope B und C gebildet wurden (Fig. 16). Darüber hinaus wurden neben den erwarteten 74 kDa, bzw. 106 kDa-Proteinen auch kleinere Proteinfragmente beobachtet, die mit den Antiseren reagieren. Diese kleineren
Produkte gehen wahrscheinlich auf vorzeitige zurück. Auf dem Fusionsprotein aus der Expression mit pMal EST befindet sich nur das Epitop für Serum B Im Gegensatz dazu befinden sich auf dem Fusionsprotein von pMalAl die Epitope der Seren B und C Aus diesem Grunde erkennt das Antiserum C nicht das Expressionsprodukt von pMalEST und lediglich die größeren Proteinfragmente aus den Expressionversuchen mit pMalAl. Diese Beobachtung unterstreicht die hohe Spezifitat der generierten Antiseren
Beispiel 15
Um das Protein der katalytischen Telomerase-Untereinheit analysieren zu können, sollen die
Proteinkomponente zusammen mit der RNA-Komponente in vitro rekonstituiert werden
Die Konstrukte für diese Experimente sind im folgenden beschrieben
Die 504 nt lange RNA Komponente (Feng et al, 1995) wurde mit den Primern HTR9BAM
(5 '-CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGGTTGCGGAGGGTGGGCCTG-3 ') und HTR2BAM (5'-CGCGGATCCCGGCGAGGGGTGACGGATGC-3) aus einer 293 Zell-cDNA-Bibliothek amplifiziert Der Primer HTR9BAM beinhaltet von Nukleotid 10 bis 29 einen T7 Promotor In der PCR wurden in einem Endvolumen von 100 μl 3 μl cDNA aus 293-Zellen mit 10 pmol dNTP-Mix versetzt und in 1 x PCR-Reaktionspuffer mit 0,5 μl
Taq-Polymerase (Fa Gibco) eine PCR-Reaktion durchgeführt Je 10 pmol der Primer HTR9BAM und HTR2BAM wurden zugefügt. Die PCR wurde in 3 Schritten durchgeführt. An eine zehnminutige Denaturierung bei 94°C schlössen sich 35 PCR-Zyklen an, in denen die DNA zunächst für eine Minute bei 94°C denaturiert wurde und anschließend für 2 min bei 62°C die Primer angelagert und die DNA-Kette verlängert wurde Zum Abschluß folgte für 4 min eine Kettenverlangerung bei 72°C. Die entstandenen PCR-Produkte wurden nach einem Restriktionsverdau mit Bam HI in die Bam HI-Schnittstelle des Vektor pUC19 kloniert, so daß die RNA Komponente unter Kontrolle des T7-Promotors steht Dieses Konstrukt wird im folgenden als HTR504 bezeichnet
Das 341 1 bp lange cDNA Fragment (Position 60 bis Position 3470, Fig 1) wurde in den Vektor PCRII TOPO (Fa. Invitrogen) kloniert Detailliertere Angaben zur Klonierung sind in Beispiel 8 und 7, bzw. in Fig. 12 beschrieben. In diesem als HTC FL bezeichneten Konstrukt liegt der T7 Promotor 5' vor der hTC cDNA.
Die Synthese der katalytischen Telomerase-Proteinkomponente erfolgte nach Zugabe des hTC FL-Konstruktes in einem kommerziell erhältlichen Transkriptions/Translation-System nach Angaben des Herstellers (Fa. Promega; Katalognummer L4610). Die erfolgreiche in vitro Translation des erwarteten 127 kDa Produktes wurde mittels 35S-markiertem Cystein in einer SDS-PAGE (Ausubel et al, 1987) kontrolliert (Fig. 17).
Die Synthese der Telomerase-RNA-Komponente erfolgte mit einem Transkriptions-System nach Angaben des Herstellers (Fa. Ambion; Katalognummer 1344) oder nach der von Pokrovskaya und Gurevich (1994) beschriebenen Methode.
Für die in vitro Rekonstitution wurden 50 μl des oben beschriebenen Translations- Ansatzes mit dem hTC FL-Konstrukt mit 0,5 μg hTRNA versetzt und 10 min bei 37°C inkubiert. 2 μl dieser Mischung wurden auf ihre enzymatische Aktivität mit Hilfe des TRAP-Assays untersucht (N.W. Kim et al, 1994). Als Positivkontrolle diente eine Aktivitätsmessung nach gleicher Methode von aus HeLa-Zellen gereinigter Telomerase (Shay et al, 1994). Wie in Fig. 18 zu sehen, erzeugen sowohl das rekonstituierte Enzym als auch das native Enzym das gleiche Produktmuster, die für die Telomerase charakteristische Nukleotidleiter. Mit diesem
Ergebnis wurde darüberhinaus belegt, daß eine einzige Proteinkomponente zusammen mit der RNA für die enzymatische Telomeraseaktivitat ausreichend ist.
Zusätzlich zu dem beschriebenen TRAP-Assay wurden 5 μl der Rekonstitutionsmischung im direkten Telomerase- Assay (Shay et al, 1994) auf ihre Aktivität geprüft. Auch in diesem
Experiment belegt die charakteristische Nukleotidleiter die erfolgreiche Rekonstitution von rekombinantem hTC Protein und Telomerase-RNA-Komponente.
Zusammenfassend konnte hiermit auf fünktioneller Ebene gezeigt werden, daß die identifizierte und vollständig klonierte hTC cDNA die katalytische Untereinheit der humanen Telomerase darstellt. Literaturvereichnis
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SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Bayer AG
(B) STRASSE: Bayerwerk
(C) ORT: Leverkusen
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: D-51368
(G) TELEFON: 0214-303688 (H) TELEFAX: 0214-303482
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Humane katalytische Telomerase- Untereinheit und deren diagnostische und therapeutische Verwendung
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 7
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRDGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30B (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LUNGE: 4042 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKsLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRsNLICHE HERKUNFT:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: Human
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
GTTTCAGGCA GCGCTGCGTC CTGCTGCGCA CGTGGGAAGC CCTGGCCCCG GCCACCCCCG 60
CGATGCCGCG CGCTCCCCGC TGCCGAGCCG TGCGCTCCCT GCTGCGCAGC CACTACCGCG 120
AGGTGCTGCC GCTGGCCACG TTCGTGCGGC GCCTGGGGCC CCAGGGCTGG CGGCTGGTGC 180
AGCGCGGGGA CCCGGCGGCT TTCCGCGCGC TGGTGGCCCA GTGCCTGGTG TGCGTGCCCT 240
GGGACGCACG GCCGCCCCCC GCCGCCCCCT CCTTCCGCCA GGTGTCCTGC CTGAAGGAGC 300
TGGTGGCCCG AGTGCTGCAG AGGCTGTGCG AGCGCGGCGC GAAGAACGTG CTGGCCTTCG 360
GCTTCGCGCT GCTGGACGGG GCCCGCGGGG GCCCCCCCGA GGCCTTCACC ACCAGCGTGC 420 GCAGCTACCT GCCCAACACG GTGACCGACG CACTGCGGGG GAGCGGGGCG TGGGGGCTGC 480 TGCTGCGCCG CGTGGGCGAC GACGTGCTGG TTCACCTGCT GGCACGCTGC GCGCTCTTTG 540 TGCTGGTGGC TCCCAGCTGC GCCTACCAGG TGTGCGGGCC GCCGCTGTAC CAGCTCGGCG 600 CTGCCACTCA GGCCCGGCCC CCGCCACACG CTAGTGGACC CCGAAGGCGT CTGGGATGCG 660 AACGGGCCTG GAACCATAGC GTCAGGGAGG CCGGGGTCCC CCTGGGCCTG CCAGCCCCGG 720 GTGCGAGGAG GCGCGGGGGC AGTGCCAGCC GAAGTCTGCC GTTGCCCAAG AGGCCCAGGC 780 GTGGCGCTGC CCCTGAGCCG GAGCGGACGC CCGTTGGGCA GGGGTCCTGG GCCCACCCGG 840 GCAGGACGCG TGGACCGAGT GACCGTGGTT TCTGTGTGGT GTCACCTGCC AGACCCGCCG 900 AAGAAGCCAC CTCTTTGGAG GGTGCGCTCT CTGGCACGCG CCACTCCCAC CCATCCGTGG 960
GCCGCCAGCA CCACGCGGGC CCCCCATCCA CATCGCGGCC ACCACGTCCC TGGGACACGC 1020
CTTGTCCCCC GGTGTACGCC GAGACCAAGC ACTTCCTCTA CTCCTCAGGC GACAAGGAGC 1080
AGCTGCGGCC CTCCTTCCTA CTCAGCTCTC TGAGGCCCAG CCTGACTGGC GCTCGGAGGC 1140
TCGTGGAGAC CATCTTTCTG GGTTCCAGGC CCTGGATGCC AGGGACTCCC CGCAGGTTGC 1200
CCCGCCTGCC CCAGCGCTAC TGGCAAATGC GGCCCCTGTT TCTGGAGCTG CTTGGGAACC 1260
ACGCGCAGTG CCCCTACGGG GTGCTCCTCA AGACGCACTG CCCGCTGCGA GCTGCGGTCA 1320
CCCCAGCAGC CGGTGTCTGT GCCCGGGAGA AGCCCCAGGG CTCTGTGGCG GCCCCCGAGG 1380
AGGAGGACAC AGACCCCCGT CGCCTGGTGC AGCTGCTCCG CCAGCACAGC AGCCCCTGGC 1440
AGGTGTACGG CTTCGTGCGG GCCTGCCTGC GCCGGCTGGT GCCCCCAGGC CTCTGGGGCT 1500
CCAGGCACAA CGAACGCCGC TTCCTCAGGA ACACCAAGAA GTTCATCTCC CTGGGGAAGC 1560
ATGCCAAGCT CTCGCTGCAG GAGCTGACGT GGAAGATGAG CGTGCGGGAC TGCGCTTGGC 1620
TGCGCAGGAG CCCAGGGGTT GGCTGTGTTC CGGCCGCAGA GCACCGTCTG CGTGAGGAGA 1680
TCCTGGCCAA GTTCCTGCAC TGGCTGATGA GTGTGTACGT CGTCGAGCTG CTCAGGTCTT 1740
TCTTTTATGT CACGGAGACC ACGTTTCAAA AGAACAGGCT CTTTTTCTAC CGGAAGAGTG 1800
TCTGGAGCAA GTTGCAAAGC ATTGGAATCA GACAGCACTT GAAGAGGGTG CAGCTGCGGG 1860
AGCTGTCGGA AGCAGAGGTC AGGCAGCATC GGGAAGCCAG GCCCGCCCTG CTGACGTCCA 1920
GACTCCGCTT CATCCCCAAG CCTGACGGGC TGCGGCCGAT TGTGAACATG GACTACGTCG 1980
TGGGAGCCAG AACGTTCCGC AGAGAAAAGA GGGCCGAGCG TCTCACCTCG AGGGTGAAGG 2040
CACTGTTCAG CGTGCTCAAC TACGAGCGGG CGCGGCGCCC CGGCCTCCTG GGCGCCTCTG 2100
TGCTGGGCCT GGACGATATC CACAGGGCCT GGCGCACCTT CGTGCTGCGT GTGCGGGCCC 2160
AGGACCCGCC GCCTGAGCTG TACTTTGTCA AGGTGGATGT GACGGGCGCG TACGACACCA 2220 TCCCCCAGGA CAGGCTCACG GAGGTCATCG CCAGCATCAT CAAACCCCAG AACACGTACT 2280
GCGTGCGTCG GTATGCCGTG GTCCAGAAGG CCGCCCATGG GCACGTCCGC AAGGCCTTCA 2340
AGAGCCACGT CTCTACCTTG ACAGACCTCC AGCCGTACAT GCGACAGTTC GTGGCTCACC 2400
TGCAGGAGAC CAGCCCGCTG AGGGATGCCG TCGTCATCGA GCAGAGCTCC TCCCTGAATG 2460
AGGCCAGCAG TGGCCTCTTC GACGTCTTCC TACGCTTCAT GTGCCACCAC GCCGTGCGCA 2520
TCAGGGGCAA GTCCTACGTC CAGTGCCAGG GGATCCCGCA GGGCTCCATC CTCTCCACGC 2580
TGCTCTGCAG CCTGTGCTAC GGCGACATGG AGAACAAGCT GTTTGCGGGG ATTCGGCGGG 2640
ACGGGCTGCT CCTGCGTTTG GTGGATGATT TCTTGTTGGT GACACCTCAC CTCACCCACG 2700
CGAAAACCTT CCTCAGGACC CTGGTCCGAG GTGTCCCTGA GTATGGCTGC GTGGTGAACT 2760
TGCGGAAGAC AGTGGTGAAC TTCCCTGTAG AAGACGAGGC CCTGGGTGGC ACGGCTTTTG 2820
TTCAGATGCC GGCCCACGGC CTATTCCCCT GGTGCGGCCT GCTGCTGGAT ACCCGGACCC 2880
TGGAGGTGCA GAGCGACTAC TCCAGCTATG CCCGGACCTC CATCAGAGCC AGTCTCACCT 2940
TCAACCGCGG CTTCAAGGCT GGGAGGAACA TGCGTCGCAA ACTCTTTGGG GTCTTGCGGC 3000
TGAAGTGTCA CAGCCTGTTT CTGGATTTGC AGGTGAACAG CCTCCAGACG GTGTGCACCA 3060
ACATCTACAA GATCCTCCTG CTGCAGGCGT ACAGGTTTCA CGCATGTGTG CTGCAGCTCC 3120
CATTTCATCA GCAAGTTTGG AAGAACCCCA CATTTTTCCT GCGCGTCATC TCTGACACGG 3180
CCTCCCTCTG CTACTCCATC CTGAAAGCCA AGAACGCAGG GATGTCGCTG GGGGCCAAGG 3240
GCGCCGCCGG CCCTCTGCCC TCCGAGGCCG TGCAGTGGCT GTGCCACCAA GCATTCCTGC 3300
TCAAGCTGAC TCGACACCGT GTCACCTACG TGCCACTCCT GGGGTCACTC AGGACAGCCC 3360
AGACGCAGCT GAGTCGGAAG CTCCCGGGGA CGACGCTGAC TGCCCTGGAG GCCGCAGCCA 3420
ACCCGGCACT GCCCTCAGAC TTCAAGACCA TCCTGGACTG ATGGCCACCC GCCCACAGCC 3480
AGGCCGAGAG CAGACACCAG CAGCCCTGTC ACGCCGGGCT CTACGTCCCA GGGAGGGAGG 3540
GGCGGCCCAC ACCCAGGCCC GCACCGCTGG GAGTCTGAGG CCTGAGTGAG TGTTTGGCCG 3600
AGGCCTGCAT GTCCGGCTGA AGGCTGAGTG TCCGGCTGAG GCCTGAGCGA GTGTCCAGCC 3660
AAGGGCTGAG TGTCCAGCAC ACCTGCCGTC TTCACTTCCC CACAGGCTGG CGCTCGGCTC 3720
CACCCCAGGG CCAGCTTTTC CTCACCAGGA GCCCGGCTTC CACTCCCCAC ATAGGAATAG 3780
TCCATCCCCA GATTCGCCAT TGTTCACCCC TCGCCCTGCC CTCCTTTGCC TTCCACCCCC 3840
ACCATCCAGG TGGAGACCCT GAGAAGGACC CTGGGAGCTC TGGGAATTTG GAGTGACCAA 3900
AGGTGTGCCC TGTACACAGG CGAGGACCCT GCACCTGGAT GGGGGTCCCT GTGGGTCAAA 3960
TTGGGGGGAG GTGCTGTGGG AGTAAAATAC TGAATATATG AGTTTTTCAG TTTTGAAAAA 4020
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 4042 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LGNGE: 1132 Aminos„uren
(B) ART: Aminos„ure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKsLS: Protein
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRsNLICHE HERKUNFT:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: Human
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser 1 5 10 15
His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly 20 25 30
Pro Gin Gly Trp Arg Leu Val Gin Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg 35 40 45
Ala Leu Val Ala Gin Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60
Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gin Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu 65 70 75 80
Val Ala Arg Val Leu Gin Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val 85 90 95
Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro 100 105 110
Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr 115 120 125
Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val 130 135 140
Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val 145 150 155 160
Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gin Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr 165 170 175
Gin Leu Gly Ala Ala Thr Gin Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly 180 185 190
Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg 195 200 205
Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg 210 215 220
Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240
Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gin Gly Ser Trp 245 250 255
Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val 260 265 270
Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala 275 280 285
Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gin His His 290 295 300
Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320
Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly 325 330 335
Asp Lys Glu Gin Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro 340 345 350
Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser 355 360 365
Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gin 370 375 380
Arg Tyr Trp Gin Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His 385 390 395 400
Ala Gin Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg 405 410 415
Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gin 420 425 430
Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu 435 440 445
Val Gin Leu Leu Arg Gin His Ser Ser Pro Trp Gin Val Tyr Gly Phe 450 455 460
Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser 465 470 475 480
Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser 485 490 495
Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gin Glu Leu Thr Trp Lys Met 500 505 510
Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys 515 520 525
Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe 530 535 540 Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560
Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gin Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr 565 570 575
Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gin Ser Ile Gly Ile Arg Gin His 580 585 590
Leu Lys Arg Val Gin Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gin 595 600 605
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 610 615 620
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val 625 630 635 640
Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser 645 650 655
Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg 660 665 670
Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg 675 680 685
Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gin Asp Pro Pro Pro 690 695 700
Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile 705 710 715 720
Pro Gin Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gin 725 730 735
Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gin Lys Ala Ala His 740 745 750
Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp 755 760 765
Leu Gin Pro Tyr Met Arg Gin Phe Val Ala His Leu Gin Glu Thr Ser 770 775 780
Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gin Ser Ser Ser Leu Asn Glu 785 790 795 800
Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His 805 810 815
Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gin Cys Gin Gly Ile Pro 820 825 830
Gin Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp 835 840 845
Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu 850 855 860 Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala 865 870 875 880
Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys 885 890 895
Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu 900 905 910
Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gin Met Pro Ala His Gly Leu Phe 915 920 925
Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gin Ser 930 935 940
Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe 945 950 955 960
Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly 965 970 975
Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gin Val Asn 980 985 990
Ser Leu Gin Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gin 995 1000 1005
Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gin Leu Pro Phe His Gin Gin 1010 1015 1020
Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala 1025 1030 1035 1040
Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu 1045 1050 1055
Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gin Trp 1060 1065 1070
Leu Cys His Gin Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr 1075 1080 1085
Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gin Thr Gin Leu Ser 1090 1095 1100
Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn 1105 1110 1115 1120
Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp 1125 1130
[2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LGNGE: 1153 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKsLS: cDNA (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRsNLICHE HERKUNFT:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: Human
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
GTGCCTGCAG AGACCCGTCT GGTGCACTCT GATTCTCCAC TTGCCTGTTG CATGTCCTCG 60
TTCCCTTGTT TCTCACCACC TCTTGGGTTG CCATGTGCGT TTCCTGCCGA GTGTGTGTTG 120
ATCCTCTCGT TGCCTCCTGG TCACTGGGCA TTTGCTTTTA TTTCTCTTTG CTTAGTGTTA 180
CCCCCTGATC TTTTTATTGT CGTTGTTTGC TTTTGTTTAT TGAGACAGTC TCACTCTGTC 240
ACCCAGGCTG GAGTGTAATG GCACAATCTC GGCTCACTGC AACCTCTGCC TCCTCGGTTC 300
AAGCAGTTCT CATTCCTCAA CCTCATGAGT AGCTGGGATT ACAGGCGCCC ACCACCACGC 360
CTGGCTAATT TTTGTATTTT TAGTAGAGAT AGGCTTTCAC CATGTTGGCC AGGCTGGTCT 420
CAAACTCCTG ACCTCAAGTG ATCTGCCCGC CTTGGCCTCC CACAGTGCTG GGATTACAGG 480
TGCAAGCCAC CGTGCCCGGC ATACCTTGAT CTTTTAAAAT GAAGTCTGAA ACATTGCTAC 540
CCTTGTCCTG AGCAATAAGA CCCTTAGTGT ATTTTAGCTC TGGCCACCCC CCAGCCTGTG 600
TGCTGTTTTC CCTGCTGACT TAGTTCTATC TCAGGCATCT TGACACCCCC ACAAGCTAAG 660
CATTATTAAT ATTGTTTTCC GTGTTGAGTG TTTCTTTAGC TTTGCCCCCG CCCTGCTTTT 720
CCTCCTTTGT TCCCCGTCTG TCTTCTGTCT CAGGCCCGCC GTCTGGGGTC CCCTTCCTTG 780
TCCTTTGCGT GGTTCTTCTG TCTTGTTATT GCTGGTAAAC CCCAGCTTTA CCTGTGCTGG 840
CCTCCATGGC ATCTAGCGAC GTCCGGGGAC CTCTGCTTAT GATGCACAGA TGAAGATGTG 900
GAGACTCACG AGGAGGGCGG TCATCTTGGC CCGTGAGTGT CTGGAGCACC ACGTGGCCAG 960
CGTTCCTTAG CCAGGGTTGG CTGTGTTCCG GCCGCAGAGC ACCGTCTGCG TGAGGAGATC 1020
CTGGCCAAGT TCCTGCACTG GCTGATGAGT GTGTACGTCG TCGAGCTGCT CAGGTCTTTC 1080
TTTTATGTCA CGGAGACCAC GTTTCAAAAG AACAGGCTCT TTTTCTACCG GAAGAGTGTC 1140
TGGAGCAAGT TGC 1153
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LDNGE: 412 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKsLS: cDNA (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN
URSPRsNLICHE HERKUNFT: (C) INDIVIDUUM/ISOLAT: Human
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
CAGAGCCCTG GTCCTCCTGT CTCCATCGTC ACGTGGGCAC ACGTGGCTTT TCGCTCAGGA 60
CGTCGAGTGG ACACGGTGAT CTCTGCCTCT GCTCTCCCTC CTGTCCAGTT TGCATAAACT 120
TACGAGGTTC ACCTTCACGT TTTGATGGAC ACGCGGTTTC CAGGCACCGA GGCCAGAGCA 180
GTGAACAGAG GAGGCTGGGC GCGGCAGTGG AGCCGGGTTG CCGGCAATGG GGAGAAGTGT 240
CTGGAAGCAC AGACGCTCTG GCGAGGGTGC CTGCAGAGAC CCGCCTGGTG CACTCTGATT 300
CTCCACTTGC CTGTTGCATG TCCTCGTTCC CTTGTTTCTC ACCACCTCTT GGGTTGCCAT 360
GTGCGTTTCC TGCCGAGTGT GTGTTGATCC TCTCGTTGCC TCCTGGTCAC TG 412 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LDNGE: 1012 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKsLS: cDNA (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRsNLICHE HERKUNFT:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: Human
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
GGGGTCCTGG GCCCACCCGG GCAGGACGCG TGGACCGAGT GACCGTGGTT TCTGTGTGGT 60
GTCACCTGCC AGACCCGCCG AAGAAGCCAC CTCTTTGGAG GGTGCGCTCT CTGGCACGCG 120
CCACTCCCAC CCATCCGTGG GCCGCCAGCA CCACGCGGGC CCCCCATCCA CATCGCGGCC 180
ACCACGTCCC TGGGACACGC CTTGTCCCCC GGTGTACGCC GAGACCAAGC ACTTCCTCTA 240
CTCCTCAGGC GACAAGGAGC AGCTGCGGCC CTCCTTCCTA CTCAGCTCTC TGAGGCCCAG 300
CCTGACTGGC GCTCGGAGGC TCGTGGAGAC CATCTTTCTG GGTTCCAGGC CCTGGATGCC 360
AGGGACTCCC CGCAGGTTGC CCCGCCTGCC CCAGCGCTAC TGGCAAATGC GGCCCCTGTT 420
TCTGGAGCTG CTTGGGAACC ACGCGCAGTG CCCCTACGGG GTGCTCCTCA AGACGCACTG 480
CCCGCTGCGA GCTGCGGTCA CCCCAGCAGC CGGTGTCTGT GCCCGGGAGA AGCCCCAGGG 540 CTCTGTGGCG GCCCCCGAGG AGGAGGACAC AGACCCCCGT CGCCTGGTGC AGCTGCTCCG 600
CCAGCACAGC AGCCCCTGGC AGGTGTACGG CTTCGTGCGG GCCTGCCTGC GCCGGCTGGT 660
GCCCCCAGGC CTCTGGGGCT CCAGGCACAA CGAACGCCGC TTCCTCAGGA ACACCAAGAA 720
GTTCATCTCC CTGGGGAAGC ATGCCAAGCT CTCGCTGCAG GAGCTGACGT GGAAGATGAG 780
CGTGCGGGAC TGCGCTTGGC TGCGCAGGAG CCCAGGTGAG GAGGTGGTGG CCGTCGAGGG 840
CCCAGGCCCC AGAGCTGAAT GCAGTAGGGG CTCAGAAAAG GGGGCAGGCA GAGCCCTGGT 900
CCTCCTGTCT CCATCGTCAC GTGGGCACAC GTGGCTTTTC GCTCAGGACG TCGAGTGGAC 960
ACGGTGATCT CTGCCTCTGC TCTCCCTCCT GTCCAGTTTG CATAAACTTA CG 1012 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LDNGE: 3972 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKsLS: cDNA (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN
URSPRsNLICHE HERKUNFT:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: Human
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
GAATTCGCGG CCGCGTCGAC GTTTCAGGCA GCGCTGCGTC CTGCTGCGCA CGTGGGAAGC 60
CCTGGCCCCG GCCACCCCCG CGATGCCGCG CGCTCCCCGC TGCCGAGCCG TGCGCTCCCT 120
GCTGCGCAGC CACTACCGCG AGGTGCTGCC GCTGGCCACG TTCGTGCGGC GCCTGGGGCC 180
CCAGGGCTGG CGGCTGGTGC AGCGCGGGGA CCCGGCGGCT TTCCGCGCGC TGGTGGCCCA 240
GTGCCTGGTG TGCGTGCCCT GGGACGCACG GCCGCCCCCC GCCGCCCCCT CCTTCCGCCA 300
GGTGTCCTGC CTGAAGGAGC TGGTGGCCCG AGTGCTGCAG AGGCTGTGCG AGCGCGGCGC 360
GAAGAACGTG CTGGCCTTCG GCTTCGCGCT GCTGGACGGG GCCCGCGGGG GCCCCCCCGA 420
GGCCTTCACC ACCAGCGTGC GCAGCTACCT GCCCAACACG GTGACCGACG CACTGCGGGG 480
GAGCGGGGCG TGGGGGCTGC TGCTGCGCCG CGTGGGCGAC GACGTGCTGG TTCACCTGCT 540
GGCACGCTGC GCGCTCTTTG TGCTGGTGGC TCCCAGCTGC GCCTACCAGG TGTGCGGGCC 600
GCCGCTGTAC CAGCTCGGCG CTGCCACTCA GGCCCGGCCC CCGCCACACG CTAGTGGACC 660
CCGAAGGCGT CTGGGATGCG AACGGGCCTG GAACCATAGC GTCAGGGAGG CCGGGGTCCC 720 CCTGGGCCTG CCAGCCCCGG GTGCGAGGAG GCGCGGGGGC AGTGCCAGCC GAAGTCTGCC 780
GTTGCCCAAG AGGCCCAGGC GTGGCGCTGC CCCTGAGCCG GAGCGGACGC CCGTTGGGCA 840
GGGGTCCTGG GCCCACCCGG GCAGGACGCG TGGACCGAGT GACCGTGGTT TCTGTGTGGT 900
GTCACCTGCC AGACCCGCCG AAGAAGCCAC CTCTTTGGAG GGTGCGCTCT CTGGCACGCG 960
CCACTCCCAC CCATCCGTGG GCCGCCAGCA CCACGCGGGC CCCCCATCCA CATCGCGGCC 1020
ACCACGTCCC TGGGACACGC CTTGTCCCCC GGTGTACGCC GAGACCAAGC ACTTCCTCTA 1080
CTCCTCAGGC GACAAGGAGC AGCTGCGGCC CTCCTTCCTA CTCAGCTCTC TGAGGCCCAG 1140
CCTGACTGGC GCTCGGAGGC TCGTGGAGAC CATCTTTCTG GGTTCCAGGC CCTGGATGCC 1200
AGGGACTCCC CGCAGGTTGC CCCGCCTGCC CCAGCGCTAC TGGCAAATGC GGCCCCTGTT 1260
TCTGGAGCTG CTTGGGAACC ACGCGCAGTG CCCCTACGGG GTGCTCCTCA AGACGCACTG 1320
CCCGCTGCGA GCTGCGGTCA CCCCAGCAGC CGGTGTCTGT GCCCGGGAGA AGCCCCAGGG 1380
CTCTGTGGCG GCCCCCGAGG AGGAGGACAC AGACCCCCGT CGCCTGGTGC AGCTGCTCCG 1440
CCAGCACAGC AGCCCCTGGC AGGTGTACGG CTTCGTGCGG GCCTGCCTGC GCCGGCTGGT 1500
GCCCCCAGGC CTCTGGGGCT CCAGGCACAA CGAACGCCGC TTCCTCAGGA ACACCAAGAA 1560
GTTCATCTCC CTGGGGAAGC ATGCCAAGCT CTCGCTGCAG GAGCTGACGT GGAAGATGAG 1620
CGTGCGGGAC TGCGCTTGGC TGCGCAGGAG CCCAGGTGAG GAGGTGGTGG CCGTCGAGGG 1680
CCCAGGCCCC AGAGCTGAAT GCAGTAGGGG CTCAGAAAAG GGGGCAGGCA GAGCCCTGGT 1740
CCTCCTGTCT CCATCGTCAC GTGGGCACAC GTGGCTTTTC GCTCAGGACG TCGAGTGGAC 1800
ACGGTGATCT CTGCCTCTGC TCTCCCTCCT GTCCAGTTTG CATAAACTTA CGAGGTTCAC 1860
CTTCACGTTT TGATGGACAC GCGGTTTCCA GGCGCCGAGG CCAGAGCAGT GAACAGAGGA 1920
GGCTGGGCGC GGCAGTGGAG CCGGGTTGCC GGCAATGGGG AGAAGTGTCT GGAAGCACAG 1980
ACGCTCTGGC GAGGGTGCCT GCAGGGGTTG GCTGTGTTCC GGCCGCAGAG CACCGTCTGC 2040
GTGAGGAGAT CCTGGCCAAG TTCCTGCACT GGCTGATGAG TGTGTACGTC GTCGAGCTGC 2100
TCAGGTCTTT CTTTTATGTC ACGGAGACCA CGTTTCAAAA GAACAGGCTC TTTTTCTACC 2160
GGAAGAGTGT CTGGAGCAAG TTGCAAAGCA TTGGAATCAG ACAGCACTTG AAGAGGGTGC 2220
AGCTGCGGGA GCTGTCGGAA GCAGAGGTCA GGCAGCATCG GGAAGCCAGG CCCGCCCTGC 2280
TGACGTCCAG ACTCCGCTTC ATCCCCAAGC CTGACGGGCT GCGGCCGATT GTGAACATGG 2340
ACTACGTCGT GGGAGCCAGA ACGTTCCGCA GAGAAAAGAG GGTGGCTGTG CTTTGGTTTA 2400
ACTTCCTTTT TAAACAGAAG TGCGTTTGAG CCCCACATTT GGTATCAGCT TAGATGAAGG 2460
GCCCGGAGGA GGGGCCACGG GACACAGCCA GGGCCATGGC ACGGCGCCAA CCCATTTGTG 2520 CGCACGGTGA GGTGGCCGAG GTGCCGGTGC CTCCAGAAAA GCAGCGTGGG GGTGTAGGGG 2580
GAGCTCCTGG GGCAGGGACA GGCTCTGAGG ACCACAAGAA GCAGCTGGGC CAGGGCCTGG 2640
ATGCAGCACG GCCCGAGCGG GTGGGGGCCC ACCACGCCAT TCTGGTCAAA GGTGTTGTAG 2700
TCGTAATAGC CGGCCCAGGC GCTCTGAACC TTCAGAGTCT CAAAAGCTGG GACCCTCAGG 2760
GCCAAATGGG GCCACACCTT GTCCTGGAAG AAATCATGGT CCACTTCCAG GTTCGCCGGG 2820
TCCGGTTCTT CCTGCTCAGT GGGGCTACGA CCACCTAGGT AGTTGCTACC TAATCCTTCC 2880
CGGCGAAAAT AGGCTCCACT GGTGTCTGCA ACAAGCGGAG TCTCTAGGCC TGGTCCCTGG 2940
GGGCAGTGCC ACACATACAC ATACCTTTTC CTCGGCTCCA CAGGTAGCTT GGTGCCCTGC 3000
AGGGTGCCAG GCGGCCCCTC TCCAACACCA GCCAGTGCTG CGATTTGCGC AGACCAGGCT 3060
CCGGCTGCGT TGATCACAAT GGCGCATTCC ACAGGCTGGT ACTCCAGGCT GCGGTCCATC 3120
TTCACATGGA CTTCATGGAT CCTTTTCAAG ACCACCGCTT TGTCATCTGT GGTCAACATG 3180
CGTTGAGATG AAGAGACAAA ACGTGTCACC TCTCCCTGGC AGAAAAGGAC TCCCAAGGAC 3240
TGGACCTTTC GCCGAAGCCC CTGGAGCAGA CACCAGGGGT CAAACCAACC TTCGTCCTCC 3300
ATCCCATAAG ACGCCAAAGC CACTCCCTCT GTGTTTATCC AGGGAAACTT GTTCCGAAGC 3360
TGATCAGGAG ACATCAGAGA AACTTTGGCT CCCTCCTGCC TCTGCACTTT CACGTTGCTC 3420
TCCATGGCTG CAGCATCCTT TTCTGAAGCC AGCAAGAGGT AGCCCGAGGG GTTGAACCGG 3480
AGGTCCAGGG GAGGAGCATC GACTACGGCC AGGTACTCAT TGATGTTCCG TAGAAAGCTG 3540
GCTGAAAAGA GGGAGAGCTG GATGTTCTCA GGCAATGAGA ACTGCTGACA AATCCCACCT 3600
ACTGAGAGCC CAGTGGAGGC CTGTGAATAC GTGTGGTCCC GTTCCACCAC TAGCACTCGA 3660
ATAGCACCTC GTCTGCTCTC CAGCTTCTTC AGCCAATAGG CCACAGACAA GCCAAGCACC 3720
CCACCTCCCA CGATCACCAC ATCCGAGTGC TCGGGAGGCA GGTGGCTGGT GTCTTGCAGT 3780
AGATCACAGG ACCTTCCAGG CAGGATCGAC TTGATCTTCT TCTTAATCTC AGACACCTTT 3840
CCATCCCAGT CCAGAGAAAA GCCTCCTCTG CGCGTGCCTG GCCTCCGGGT CAAGAGGCCC 3900
CGGCCCATGC CGTGCGGCAG AACCCTCCGA ATCATAGCCC CTCTGAGCCC GGGTCGACGC 3960
GGCCGCGAAT TC 3972 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LDNGE: 2089 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKsLS: cDNA (v) ART DES FRAGMENTS: linear (vi) URSPRsNLICHE HERKUNFT:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: Human
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
CCGGAAGAGT GTCTGGAGCA AGTTGCAAAG CATTGGAATC AGACAGCACT TGAAGAGGGT 60
GCAGCTGCGG GAGCTGTCGG AAGCAGAGGT CAGGCAGCAT CGGGAAGCCA GGCCCGCCCT 120
GCTGACGTCC AGACTCCGCT TCATCCCCAA GCCTGACGGG CTGCGGCCGA TTGTGAACAT 180
GGACTACGTC GTGGGAGCCA GAACGTTCCG CAGAGAAAAG AGGGCCGAGC GTCTCACCTC 240
GAGGGTGAAG GCACTGTTCA GCGTGCTCAA CTACGAGCGG GCGCGGCGCC CCGGCCTCCT 300
GGGCGCCTCT GTGCTGGGCC TGGACGATAT CCACAGGGCC TGGCGCACCT TCGTGCTGCG 360
TGTGCGGGCC CAGGACCCGC CGCCTGAGCT GTACTTTGTC AAGGTGGATG TGACGGGCGC 420
GTACGACACC ATCCCCCAGG ACAGGCTCAC GGAGGTCATC GCCAGCATCA TCAAACCCCA 480
GAACACGTAC TGCGTGCGTC GGTATGCCGT GGTCCAGAAG GCCGCCCATG GGCACGTCCG 540
CAAGGCCTTC AAGAGCCACG TCTCTACCTT GACAGACCTC CAGCCGTACA TGCGACAGTT 600
CGTGGCTCAC CTGCAGGAGA CCAGCCCGCT GAGGGGTGCC GTCGTCATCG AGCAGAGCTC 660
CTCCCTGAAT GAGGCCAGCA GTGGCCTCTT CGACGTCTTC CTACGCTTCA TGTGCCACCA 720
CGCCGTGCGC ATCAGGGGCA AGTCCTACGT CCAGTGCCAG GGGATCCCGC AGGGCTCCAT 780
CCTCTCCACG CTGCTCTGCA GCCTGTGCTA CGGCGACATG GAGAACAAGC TGTTTGCGGG 840
GATTCGGCGG GACGGGCTGC TCCTGCGTTT GGTGGATGAT TTCTTGTTGG TGACACCTCA 900
CCTCACCCAC GCGAAAACCT TCCTCAGGAC CCTGGTCCGA GGTGTCCCTG AGTATGGCTG 960
CGTGGTGAAC TTGCGGAAGA CAGTGGTGAA CTTCCCTGTA GAAGACGAGG CCCTGGGTGG 1020
CACGGCTTTT GTTCAGATGC CGGCCCACGG CCTATTCCCC TGGTGCGGCC TGCTGCTGGA 1080
TACCCGGACC CTGGAGGTGC AGAGCGACTA CTCCAGCTAT GCCCGGACCT CCATCAGAGC 1140
CAGTCTCACC TTCAACCGCG GCTTCAAGGC TGGGAGGAAC ATGCGTCGCA AACTCTTTGG 1200
GGTCTTGCGG CTGAAGTGTC ACAGCCTGTT TCTGGATTTG CAGGTGAACA GCCTCCAGAC 1260
GGTGTGCACC AACATCTACA AGATCCTCCT GCTGCAGGCG TACAGGTTTC ACGCATGCGT 1320
GCTGCAGCTC CCATTTCATC AGCAAGTTTG GAAGAACCCC ACATTTTTCC TGCGCGTCAT 1380
CTCTGACACG GCCTCCCTCT GCTACTCCAT CCTGAAAGCC AAGAACGCAG GTATGTGCAG 1440
GTGCCTGGCC TCAGTGGCAG CAGTGCCTGC CTGCTGGTGT TAGTGTGTCA GGAGACTGAG 1500
TGAATCTGGG CTTAGGAAGT TCTTACCCCT TTTCGCATCA GGAAGTGGTT TAACCCAACC 1560
ACTGTCAGGC TCGTCTGCCC GCCCTCTCGT GGGGTGAGCA GAGCACCTGA TGGAAGGGAC 1620 AGGAGCTGTC TGGGAGCTGC CATCCTTCCC ACCTTGCTCT GCCTGGGGAA GCGCTGGGGG 1680
GCCTGGTCTC TCCTGTTTGC CCCATGGTGG GATTTGGGGG GCCTGGCCTC TCCTGTTTGC 1740
CCTGTGGTGG GATTGGGCTG TCTCCCGTCC ATGGCACTTA GGGCCCTTGT GCAAACCCAG 1800
GCCAAGGGCT TAGGAGGAGG CCAGGCCCAG GCTACCCCAC CCCTCTCAGG AGCAGAGGCC 1860
GCGTATCACC ACGACAGAGC CCCGCGCCGT CCTCTGCTTC CCAGTCACCG TCCTCTGCCC 1920
CTGGACACTT TGTCCAGCAT CAGGGAGGTT TCTGATCCGT CTGAAATTCA AGCCATGTCG 1980
AACCTGCGGT CCTGAGCTTA ACAGCTTCTA CTTTCTGTTC TTTCTGTGTT GTGGAGACCC 2040
TGAGAAGGAC CCTGGGAGCT CTGGGAATTT GGAGTGACCA AAGGTGTGC 2089

Claims

Patentansprüche
1. Katalytisch aktive humane Telomerase-Untereinheit, ihre fünktionellen Äquivalente, ihre Varianten und ihre katalytisch aktiven Fragmente.
2. Telomerase gemäß Anspruch 1, enthaltend die Aminosäuresequenz gemäß Abb. 2 oder deren fünktionelle Äquivalente.
3. Nucleinsauresequenzen codierend für Verbindungen gemäß den Ansprüchen 1 und 2 und ihre fünktionellen Äquivalente.
4. Nucleinsauresequenzen gemäß Anspruch 3, enthaltend die DNA-Sequenz aus Abb. 1 oder ihre fünktionellen Äquivalente.
5. Antisense-Nucleinsäuresequenz bindend an die Nucleinsauresequenz gemäß
Anspruch 3 oder 4.
6. Antikörper gegen Telomerase gemäß den Ansprüchen 1 und 2, gegebenenfalls markiert mit einem oder mehreren Markern.
7. Verwendung von Nucleinsauresequenzen gemäß den Ansprüchen 3 und 4 zur Herstellung von Telomerase.
8. Verwendung von Antikörpern gemäß Anspruch 6 zur Diagnose.
9. Verwendung von Antikörpern gemäß Anspruch 6 zur Herstellung von Arzneimitteln.
10. Vektor enthaltend eine Nucleinsauresequenz, insbesondere DNA, gemäß Anspruch 3 und 4.
11. Mikroorganismen enthaltend den Vektor gemäß Anspruch 10.
12. Screening Assay zur Auffindung von Modulatoren der humanen Telomerase enthaltend die Telomerase gemäß den Ansprüchen 1 und 2.
13. Verfahren zur Herstellung der Telomerase gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus gemäß Anspruch 1 1 kultiviert und die Telomerase isoliert.
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