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WO1998056351A1 - Compositions pulverulentes de liposomes unilamellaires - Google Patents

Compositions pulverulentes de liposomes unilamellaires Download PDF

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WO1998056351A1
WO1998056351A1 PCT/FR1998/001203 FR9801203W WO9856351A1 WO 1998056351 A1 WO1998056351 A1 WO 1998056351A1 FR 9801203 W FR9801203 W FR 9801203W WO 9856351 A1 WO9856351 A1 WO 9856351A1
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WO
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liposomes
aqueous
lgs
lipids
gelling agents
Prior art date
Application number
PCT/FR1998/001203
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English (en)
Inventor
Jean-Pierre Salles
Original Assignee
Lipogel
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Publication date
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Priority to AU81122/98A priority patent/AU738238C/en
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Priority to EP98930819A priority patent/EP0998268A1/fr
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Priority to BR9810104-8A priority patent/BR9810104A/pt
Priority to HU0002066A priority patent/HUP0002066A3/hu
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Definitions

  • the present invention relates to pulverulent compositions of stabilized unilamellar liposomes, comprising at least one external lipid phase and an internal aqueous polar nucleus gelled at room temperature, to their preparation process and to their applications as nutritional supplements and in pharmaceutical compositions (action on lipemia).
  • Liposomes internal core gelled, suspended in an aqueous medium containing low concentrations of gelling agents have been described by JC Hauton, which referred to as the lipogelosomes ®. He has, in particular, developed a process making it possible to manufacture such liposomes or lipogelosomes 1 ′ (European patent 0 393 049), which differs from conventional liposomes in that the encapsulated aqueous phase is in the semi-solid form of gel and not in liquid form, which prevents liposome fusions during collisions. Such lipogelosomes ® are produced only from natural substances, which minimizes the risks of intolerance.
  • these lipogelosomes ® consist of a bilayer interfacial phase in the case of unilamellar lipogelosomes ® or a plurality of interfacial phases bilayer superimposed concentrically, in the case of lipogelosomes ® multilamellar and by a gelled encapsulated internal aqueous polar phase, in which the gelled substance, polymerizable or not, is selected from polysaccharides, polypeptides or polyacrylamides; for example, the non-polymerizable gelable substance is selected from gelatin, agarose, or carrageenans and the polymerizable gelable substance is selected from polyacrylamide gels.
  • These lipogelosomes ® have a significantly increased stability, compared to the liposomes of the prior art, in particular due to the absence of interparticle fusion during collisions.
  • Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality and morbidity in France, as in all industrialized countries, and represent a real financial burden (30 billion francs in 1992). The figures are alarming: 36.4% of all deaths are due to cardiovascular diseases, including 20% for heart disease and 12% for strokes. For comparison, then come the deaths due to different cancers and violent deaths (accidental or voluntary), in the respective proportions of 24.2% and 9.4%.
  • cardiovascular diseases including 20% for heart disease and 12% for strokes.
  • cancers and violent deaths accidental or voluntary
  • lipid-lowering agents which act in the interior environment are used, such as HMG CoA reductase inhibitors which decrease the synthesis of endogenous cholesterol and increase the hepatic receptors of atherogenic lipoproteins, thus reducing their plasma concentration (MS Brown et al., Athero - sclerosis rev / ews, 1987, 18, 85-93).
  • a long-term prophylaxis of atherosclerosis applicable on a population scale implies that there is a need for effective long-term products which are easy to handle and which have a minimum of undesirable side effects.
  • Reasonable dietary measures must therefore be supplemented by actions at the intestinal level in order to reduce the lipolysis of triglycerides into free fatty acids and monoglycerides and reduce the production of the micellar phase, from which their absorption and that of cholesterol are made.
  • Food triglycerides the hydrolysis of which begins in the stomach (sublingual and gastric lipases) and continues in the duodenum (pancreatic lipase) are organized in the proximal intestinal medium in the form of an emulsion, the interfacial phase of which in a monolayer, formed mainly by food and bile phospholipids (G Nalbone et al, Lipids, 1974, 9, 765-770) incorporates lipolysis products (monoglycerides, free fatty acids) as well as a fraction of bile salts .
  • the intestinal interfacial phase cannot dissociate into micelles as long as the concentration of detergent molecules in this phase (bile salts, ionized fatty acids, lysophospholipids) does not reach a certain threshold (critical micellar concentration).
  • micellar phase diverting a sufficient quantity of bile salts onto said competitive interfacial phase to lower their concentration below a certain threshold in order to prevent the production of the micellar phase.
  • the problem to be solved therefore consists in sending into the proximal intestine during the digestion phase a non-toxic competitive interfacial phase having a maximum of surface area in the smallest possible volume.
  • the most suitable current structure is that of small unilamellar liposomes.
  • the pulverulent compositions of stabilized liposomes according to the invention effectively make it possible to solve this problem, on the one hand because of the presence of the gelled internal aqueous nucleus and on the other hand because they are in the form of a powder, which can either be administered directly by the oral route or can be easily dissolved in an aqueous phase at the time of use. Consequently, the Applicant has set itself the goal of providing a stable pulverulent composition, based on liposomes, which better meets the needs of the practice than the compositions of the prior art in that, in addition to significantly improved stability, it is effective both in the prevention and in the treatment of hyperlipemia.
  • the subject of the present invention is a pulverulent composition intended for oral administration, characterized:
  • aqueous core consists essentially of a mixture M of at least two non-polymerizable gelling agents and Gl G2, different, and whose gel-sol phase transition point is greater than or equal to 37 ° C, Gl being a gelling agent selected from gelatins and carrageenans, such as kappa-carrageenans and G2 being selected from carrageenans having properties different from the carrageenans selected for Gl, such as iota-carrageenans and celluloses, such as hydroxypropylcellulose, which liposome
  • a gangue selected from the group consisting of a gel dehydrated thermoreversible aqueous material identical to the aqueous gel of said internal nucleus, dextrins or a mixture of these, so that it comprises, on average, 10 16 to 10 18 liposomes / g of powder.
  • Such pulverulent compositions retain all the integrity of lipogelosomes ® they contain and which remain stable over time, both in powder form that when they are resuspended, due to the maintenance of the integrity constitutive lipids (no degradation product) and maintaining the integrity of the characteristics of the gelling agents, in particular of the Gl and G2 mixture (viscosity, gel and breaking strength, molecular weights). They thus contain stabilized pulverulent lipogelosomes ® .
  • the gelling agents G1 and G2 differ in particular with regard to viscosity, molecular mass and the gel-sol transition point (that is to say the melting temperature). For Gl gelling agents, this temperature is less than or equal to 45 ° C, while it is greater than or equal to 45 ° C for G2 gelling agents.
  • the mixture M of at least two gelling agents Gl and G2 as defined above has texturometric characteristics (gel strength and breaking strength) which are particularly advantageous from the point of view of the stability of the liposomes obtained.
  • the mixture M of at least two gelling agents Gl and G2 has, at 5 ° C, relaxation characteristics of between 70 and 100%, preferably 81-89%, and a breaking force included between 1000 and 1600 g, preferably 1109-1503 g.
  • said internal aqueous nucleus of the liposomes further comprises at least one stabilizing agent of osidic nature, and / or at least one agent for regulating the osmolarity of the medium and / or at least a surfactant.
  • said pulverulent composition comprises in% (m / m): 25 to 75% of class 4 lipids, 5 to 45% of gelling agents, 0 to 70% of stabilizing agent of an osidic nature, 0 to 15 % of medium osmolarity regulating agent, 0 to 20% of surface-active agents and 0 to 15% of dextrin (essentially maltodextrin or cyclodextrin), preferably 8 to 12%.
  • a fraction of gelling agent is included in the internal aqueous phase of said lipogelosomes ® , while another fraction of gelling agent forms a gangue around the external lipid layer of said lipogelosomes ® .
  • said pulverulent composition comprises 70 to 95% of G1 gelling agent and 5 to 30% of G2 gelling agent.
  • the stabilizing agent of an osidic nature is sucrose, trehalose or any other protective agent.
  • the lipids constituting the external lipid phase of said liposomes preferably comprise 20 to 25% phosphatidylcholine, 10 to 18% phosphatidylethanolamine and 9 to 15% phosphatidylinositol.
  • Said phospholipids are essentially obtained from soy lecithins with a high phospholipid content.
  • the phospholipids consist of purified phospholipids, alone or as a mixture, preferably in the same proportions as those defined above.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a pulverulent composition according to the invention, in which the external gangue of the particulate units comprises a fraction of thermoreversible aqueous gel, characterized in that it comprises the following stages:
  • preparing a dispersion of liposomes internal core gelled (lipogelosomes ®) in the aqueous phase by (a) preparing a solution of at least one suitable gelling agent, in particular a mixture M of gelling agents Gl and G2 , by dissolving said gelling agents, with slow stirring, at a temperature higher than the gel-sol phase transition temperature of said gelling agents, in an aqueous solution, (b) incorporation of the lipids in the solution obtained in (a), under slow stirring of the mixture for a period of less than 5 hours, preferably in vacuo and forming an emulsion, and (c) obtaining the dispersion of liposomes internal core gelled (lipogelosomes ®) in an aqueous phase containing said gelling agents, by rapid stirring of the emulsion obtained in (b), preferably under vacuum and
  • the drying is carried out by atomization, coacervation, thin layer or granulation.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a pulverulent composition according to the invention, in which the external gangue of the particulate units comprises a fraction of thermoreversible aqueous gel and / or a dextrin, characterized in that it comprises the following steps : (1) preparing a dispersion of liposomes internal core gelled (lipogelosomes ®) in the aqueous phase by (a) preparing a solution of at least one suitable gelling agent, in particular a mixture M of gelling agents Gl and G2 , by dissolving said gelling agents, with slow stirring, at a temperature higher than the gel-sol transition temperature of said gelling agents in an aqueous solution, (b) incorporation of the lipids in the solution obtained in (a), with slow stirring of the mixing for a period of less than 5 hours, preferably in vacuo and forming an emulsion, and (c) obtaining said liposome dispersion gelled core internal (lipogelosome
  • step (2) of removing at least part of the aqueous liquid phase containing said gelling agents is carried out by dilution and or by filtration.
  • the aqueous solution of step (a) further comprises an agent for regulating the osmolarity of the medium (0.9% NaCl, for example) and / or a stabilizing agent of osidic nature and / or a surfactant.
  • a powdery composition stable liposome internal phase gelled lipogelosomes ®
  • a maturation phase as defined in ripening
  • a dispersion phase formation of lipogelosomes ®
  • said dispersion of gelled internal core liposomes has, in fact, the following morphology:
  • vesicular structure with a diameter between 20 nm and 1 mm, preferably between 70 and 200 nm,.
  • microscopic observations in negative staining, cryofracture, cryotransmission and atomic force microscopy vesicles or assemblies of vesicles of appearance characteristic of phospholipid bilayers; negative staining makes it possible to observe the more or less marked presence of mixture M of gelling agents coating the external phospholipid layer, and. polydispersity of liposomes with a gelled internal nucleus, between
  • step (b) is carried out, preferably, at a shear speed of less than 200 s ⁇ 1 ; generally, the shear speed is given by the following ratio : speed of the stirring module / distance between the internal wall of the reactor and the distal end of the stirring blade (also called "air gap").
  • the present invention also relates to a nutritional supplement capable of regulating cholesterolemia and triglyceridemia, characterized in that it comprises a pulverulent composition as defined above, optionally combined with an appropriate excipient.
  • the present invention also relates to pharmaceutical compositions intended for oral administration comprising a pulverulent composition according to the invention and at least one suitable vehicle; such compositions are particularly suitable for regulating cholesterolemia and the triglyceridemia or to serve as an adjuvant in treatments using one or more active ingredients causing the increase in transaminases or any other toxic marker; in fact, unexpectedly, the pulverulent compositions of stabilized liposomes according to the invention preclude increasing, significantly, the rate of GOT and GPT liver.
  • Both the nutritional supplement and the pharmaceutical compositions can be presented either in a solid form (capsule, tablet, powder to be dissolved in water), or in a liquid form (pulverulent composition according to the invention redissolved in an aqueous solution). Such forms are suitable for oral administration.
  • both the nutritional supplement that pharmaceutical compositions according to the invention are to be administered at a unit dose corresponding to a unit dose of constituent phospholipids lipogelosomes ® according to the invention between 0.01 and 0.07 g / kg, i.e. a daily dose of between 0.03 and 0.2 g of phospholipids constituting lipogelosomes, per kg of body, administered in 2 or 3 doses.
  • FIG. 1 illustrates the distribution, in percentage, of the lipid classes (AG: fatty acids; MG: monoglycerides; DG: diglycerides; TG: triglycerides) radiolabelled present in the stomach contents of the rats sacrificed after 2 hours of digestion;
  • - Figure 2 illustrates the percentages of radiolabelled lipids found in the intestinal lumen relative to the quantity (in dpm) of lipid which was emptied by the stomach of the rats sacrificed after 2 hours of digestion (int. segment: intestinal segment );
  • FIG. 3 illustrates the distribution, in percentage, of the lipid classes (AG: fatty acids; MG: monoglycerides; DG: diglycerides; TG: triglycerides wrinkles) radiolabelled present in the intestinal lumen of rats sacrificed after 2 hours of digestion (int. segment: intestinal segment);
  • AG fatty acids
  • MG monoglycerides
  • DG diglycerides
  • TG triglycerides wrinkles
  • FIG. 4 illustrates the percentages of radiolabelled lipids found in the intestinal mucosa compared to the amount (in dpm) of lipid which was drained by the stomach of the rats sacrificed after 2 hours of digestion (seg. muq .: segment of the mucosa);
  • FIG. 5 illustrates the percentages of radiolabelled lipids found in the plasma compared to the amount (in dpm) of lipid which was drained by the stomach of the rats sacrificed after 2 hours of digestion
  • - Figure 6 illustrates the percentages of radiolabelled lipids found in the liver compared to the amount (in dpm) of lipid emptied by the stomach of the rats sacrificed after 2 hours of digestion;
  • FIG. 7 illustrates the amount of radiolabelled lipids (in dpm) found in the cecum and faeces of rats sacrificed after 24 hours of digestion. It should be understood, however, that these examples are given only by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation.
  • the measurements are carried out on a TA-XT2i device from the company Rhéo.
  • the study concerns the behavior of gels made up of a mixture of gelatin, iota and carrageenan kappa during rupture and relaxation tests. .
  • the sodium chloride is dissolved in a mixer fitted with a turbine and a sun gear and containing the purified water (15 minutes at 10 revolutions / minute), the mixer is raised to temperature up to 75 ° C. (stirring at 10 rpm for 45 minutes), the gelling agents (gelatin, iota carrageenans, kappa carrageenans) are added to the mixer at 75 ° C., the stirring turbine is started at 1500 revolutions / minute; the duration of the dissolution step is approximately 30 minutes; dissolution is complete when the solution is clear and does not contain suspended particles.
  • the gelling agents gelatin, iota carrageenans, kappa carrageenans
  • the mobile used is an aluminum cylinder 25 mm in diameter with a pre-speed of 1.0 mm / s, a speed of 0.5 mm / s and a post-speed of 10.0 mm / s.
  • the movement of the mobile is 1.0 mm for 30 seconds.
  • the mobile used is a 10 mm diameter ebonite cylinder with a pre-speed, a speed and a post-speed of 1.0 mm / s.
  • the movement of the mobile is 12 mm.
  • b results of a study at 5 ° C, with a NaCl level of 0.9% Relaxation (%) minimum value: 81 ⁇ 2.2 maximum value: 89 ⁇ 0.8
  • Breaking force (g) minimum value: 1109 ⁇ 25 maximum value: 1503 ⁇ 35 c) results as a function of temperature and different NaCl levels
  • the operating conditions are identical to those described in a), except for the displacement of the mobile used in the relaxation test (displacement of 20% of the total thickness of the gel). Relaxation (%) at 5 ° C
  • soy lecithins are added to the mixer, in which the planetary spins at the speed of 10 revolutions / minute and the turbine at the speed of 1500 revolutions / minute, for 5 hours, under vacuum (- »formation of an emulsion) .
  • a dispersion of lipogelosomes ® in the aqueous phase is obtained.
  • the study of the samples taken at the end of the dispersion shows vesicular structures with a diameter of 120 ⁇ 30 nm.
  • the dispersion of the lipogelosomes ® in aqueous phase obtained is transferred to a vacuum dryer (50-100 mbar) for approximately 4 hours.
  • a fairly homogeneous, straw yellow, very clear powder is obtained, containing grains with a diameter between 0.1 mm and 1 mm.
  • Other drying methods can be implemented.
  • the drying is performed as follows: the dispersion of lipogelosomes ® in aqueous phase is distributed directly onto a rotating dryer cylinders (cylinder temperature: 120-150 ° C, rotation speed of 3-6 revolutions / min.). The “shavings” obtained are then ground and calibrated on an appropriate grid. This gives a powder lipogelosomes ® (also referred to hereinafter LGS), having the characteristics defined above.
  • soy lecithins are added to the mixer, in which the planetary spins at the speed of 10 revolutions / minute and the turbine at the speed of 1500 revolutions / minute, for 5 hours, under vacuum (-> formation of an emulsion) .
  • a dispersion of lipogelosomes ® in the aqueous phase is obtained.
  • the study of the samples taken at the end of the dispersion shows vesicular structures with a diameter of 120 ⁇ 30 nm.
  • Microscopic observations in negative staining, cryofracture, cryotransmission and atomic force microscopy vesicles or assemblies of vesicles with aspects characteristic of phospholipid bilayers; negative staining makes it possible to observe the more or less marked presence of external gelling agent according to the manufacturing and / or separation process chosen. 2)
  • the dispersion of LGS in an external gelling medium is diluted to 1/10 with a 0.9% NaCl solution, then filtered on a 300 kDa or 500 kDa filter (tangential filtration system "Open Channel", PAL FILTRON), at 37 °. vs.
  • a dispersion is obtained, the dry matter content of which varies between 37 and 50% (m / v).
  • An amount equivalent to 4-6% (m / m) of maltodextrin is added.
  • atomization is carried out (for example, with a pilot NIRO atomizer).
  • Particulate units are then obtained, in which the external gangue comprises maltodextrins and the composition of which is substantially as follows: LGS concentrated to 44.6% dry matter 1500 g maltodextrin 80 g
  • the animals are male Wistar rats (Iffa-Crédo, l'Arbresle,
  • the stomachs of the rats are free of all material before the intubation of the test meals.
  • Six groups of rats are randomly formed: two control groups (T), two "lipogelosome ® “ groups (LGS) and two "ingredient” groups (I) which are sacrificed either 2 hours after digestion or 24 hours after the digestion.
  • the number of rats is variable, according to the groups, due to experimental constraints.
  • Test meals Each test meal consists of a lipid emulsion to which the lipogelosomes ® (LGS group), the ingredients of lipogelosomes ® (group I) or sodium chloride (group T) have been added immediately.
  • triolein- 14 C and cholesterol- 3 H were, respectively, 68.45 kBq / mmol and 4.27 kBq / mmol in each test meal.
  • a pulverulent composition, according to Example 2 is redissolved in water, in order to obtain a concentration of phospholipids of
  • the diameter of the lipogelosomes ® in suspension, controlled by particle size and by electron microscopy is stable and around 164.9 nm (average value).
  • lipogelosomes ® The ingredients of lipogelosomes ® : The constituent raw materials of lipogelosomes ® as specified in Example 2 were used. The phospholipids and the gelling mixture were prepared separately.
  • the dietary triglyceride / phospholipid ratio of the total ingested is 40 for all groups and corresponds to the ratio observed in human food. However, to take this value into account, the test meals of animals treated with LGS or I have a dietary fat intake correspondingly reduced.
  • the rats were intubated by gastric tube with polyethylene catheters. Before intubation of the emulsion, two aliquots were taken to accurately quantify the radioactivity ingested by the rats.
  • Bovine serum albumin (poor in fatty acids): Calbiochem, San Diego, CA. Triolein (99% pure): Serva, Heidelberg, FRG. Triolein- ' 4 C (98.3% pure), 4.1 Gbq / mmol: NEN research products, Dupont de Nemours, Paris, France. Cholesterol (99% pure): Sigma, St Louis, MO. Cholesterol- H (99% pure), 814 Gbq / mmol: NEN Research products, Dupont de Nemours. Soy lecithin (90% pure): Frangis, St-Maur, France.
  • the rats were anesthetized with a ketamine / xylamine mixture (60 mg / kg / 7.5 mg / kg) and then sacrificed by exsanguination. Blood was taken by puncture from the abdominal aorta and approximately 10 ml was collected in tubes containing EDTA to prevent clotting.
  • a ketamine / xylamine mixture 60 mg / kg / 7.5 mg / kg
  • Table II below presents the conditions of the different samples taken.
  • the results of the direct radioactivity measurements were expressed as a percentage of the radioactivity found beyond the stomach pylorus, in order to reduce the influence of gastric emptying which is variable within the same group.
  • the results are expressed as a percentage of intubated radioactivity (in dpm).
  • the first line concerns lipids - 14 C, the second line concerns cholesterol - 3 H. No significant difference was observed between the groups by the Fisher test (P ⁇ 0.05).
  • Figure 1 shows the percentages of triglycerides (TG), diglycerides (DG), monoglycerides (MG) and fatty acids (FA) found in the stomach contents, two hours after intubation of the test meal containing triglycerides.
  • the proportion of triglycerides remained significantly higher in the presence of the ingredients (+ 21.6% compared to group T) and lipogelosomes ® (+ 31.3%) in the test meal, unlike those of diglycerides and acids which are significantly lower.
  • the proportion of monoglycerides is not significantly different between the three groups, however it underwent a clear decrease in the stomach contents of the rats of the LGS group (-48.5% compared to the T group).
  • the proportions of the lipid classes in the stomach contents of the rats of the Ingredients group are always intermediate with those of the Control and LGS groups.
  • each histogram is the mean ⁇ SEM of the individual values of each group (T: controls; I: ingredients; L: Lipogelosomes ® ). Different letters indicate significant differences (p ⁇ 0.05) between groups by the Fisher test. A * indicates a significant difference (p ⁇ 0.05) with the control group by the Scheffé test. 2) Effects of lipogelosomes ® in the intestinal compartment
  • each histogram is the mean ⁇ SEM of the individual values of each group (T: Controls; I: Ingredients; L: Lipogelosomes ® ). Different letters indicate significant differences (p ⁇ 0.05) between groups by the Fisher test. A * indicates a significant difference (p ⁇ 0.05) with the control group by the Scheffé test.
  • the distribution of cholesterol along the intestine was changed by the ingredients and lipogelosomes ® .
  • the ingredients significantly lowered cholesterol in the intestinal contents of the upper segment (-57.3% compared to group T); lipogelosomes ® significantly increased cholesterol in the intestinal contents of the lower segment, as well as in the whole of the intestinal contents (respectively, 104.5% and + 34.4% compared to group T).
  • the contents of the intestinal mucosa were only removed and analyzed for 2 hours of digestion; such analysis for 24 hour time would have been of no interest, the transit time of the lipids in the enterocytes being short.
  • the triglyceride content of the cells of the intestinal mucosa did not show any significant differences between the T, I and LGS groups ( Figure 4).
  • the absorption of dietary cholesterol is largely affected by the presence of lipogelosomes ® in the test meal and to a lesser extent by that of their ingredients ( Figure 4).
  • the absorption of cholesterol is significantly reduced by the ingredients in the upper segment of the intestinal mucosa.
  • Lipogelosomes ® resulted in a significant decrease in the absorption of cholesterol to the upper and lower segments of the mucosa, as well as to the entire intestinal mucosa (-32.9%, -47% and -16.8 respectively) % o compared to group T).
  • each histogram is the mean ⁇ SEM of the individual values of each group (T: Controls; I: Ingredients; L: lipogelosomes ®).
  • T Controls
  • I Ingredients
  • L lipogelosomes ®
  • Different letters indicate significant differences (p ⁇ 0.05) between groups by the Fisher test.
  • a * indicates a significant difference (p ⁇ 0.05) with the control group by the Scheffé test.
  • Plasma cholesterol is significantly lowered by lipogelosomes ® (- 42.6%> compared to group T).
  • the ingredients have a similar but insignificant effect on the plasma cholesterol of the control group rats.
  • each histogram is the mean ⁇ SEM of the individual values of each group (T: Controls; I: Ingredients; L: lipogelosomes ®).
  • T Controls
  • I Ingredients
  • L lipogelosomes ®
  • Different letters indicate significant differences (P ⁇ 0.05) between groups by the Fisher test.
  • a * indicates a significant difference (p ⁇ 0.05) with the control group by the Scheffé test. For the 24 hour time, no difference between the three groups is observed.
  • each histogram is the mean ⁇ SEM of the individual values of each group (T: Controls; I: Ingredients; L: lipogelosomes ®). No significant difference was observed by the Fisher test (p ⁇ 0.05). At the time of 24 hours of digestion, the quantities of radiolabelled lipids present in the livers showed no difference between the three groups.
  • each histogram is the mean ⁇ SEM of the individual values of each group (T: Witnesses; I: Ingredients; L: Lipogelo- somes ® ). Different letters indicate significant differences (p ⁇ 0.01) between the groups by the Fisher test and by the Scheffé test.
  • lipogelosomes ® The action of lipogelosomes ® on the decrease in the absorption of cholesterol by the intestinal mucosa is more important than that on monoglycerides and fatty acids. This can be attributed to the fact that the absorption rate of cholesterol is much lower than that of triglycerides (respectively 80 to 100% and 40 to 60%).
  • lipogelosomes ® trap part of the bile salts. This action would result in a decrease in the solubilization of cholesterol in the micellar phase leading to a decrease in its absorption.
  • Wistar rats 8 groups of 10 Wistar rats (IFFA CREDO, L'Arbresle, France), aged 14 weeks, were randomly formed.
  • the animals are caged in an air-conditioned room (temperature of 21 ° C, 50% humidity), with a light-dark cycle of 12h-12h. Food and water were provided ad libitum.
  • I 2 - diet rich in lipids including 2.5% of PL (LGS ingredients)
  • STUDY PROCEDURE The weight of the rats is measured at the beginning and at the end of the study. The intake is measured (over 3 days) after 2 weeks and at the end of the study. Blood samples are taken at the start of the study and after 3 weeks of diet on the RL and LGS 3 groups.
  • the faeces were harvested (over 4 days) during the penultimate week, they were weighed and frozen at -20 ° C.
  • the measurement of the absorption coefficient of cholesterol is carried out on the faeces collected at the beginning of the last week.
  • the animals are sacrificed after a young day, under anesthesia: the liver (weight gain then freezing at -20 ° C) and about 10 ml of blood (puncture in the abdominal aorta) were taken .
  • the serum is obtained by centrifugation of whole blood. All serum analyzes are performed on fresh serum.
  • the triglycerides, phospholipids, total cholesterol and free cholesterol in the serum of each rat were measured after 6 weeks of diet using the same methods.
  • VLDL ery low density lipoproteins
  • LDL low density lipoproteins
  • HDL high density lipoproteins
  • LGS 1 0.51 g / d
  • LGS 2 1.04 g / d
  • LGS 3 1.67 g / d, which corresponds to the following quantities of phospholipids: LGS 1: 0.28 g / d; LGS 2: 0.57 g / day; LGS 3: 0.92 g / d.
  • Table V presents the values of the serum parameters of the rats after 6 weeks of diet.
  • the values represent the mean ⁇ SEM of 10 rats. For a parameter, different letters indicate significant differences.
  • Table VI shows that the increase in triglyceridemia with the PL diet was mainly due to a significant increase in triglycerides of VLDL, and secondarily to a significant increase in triglycerides of LDL and HDL.
  • the increase obtained with the I 2 diet is mainly due to an increase in the VLDL triglycerides.
  • the LGS 3 diet induced a significant increase in LDL triglycerides; LGS 2, I 2 and I 3 diets caused a significant increase in HDL triglycerides.
  • the increase in intake of LGS or I only induced slight variations in triglycerides in the different classes of lipoproteins: there is therefore no dose effect for this parameter.
  • VLDL LDL HDL VLDL LDL HDL
  • LGS 2 0.36 a "0.50 ab " 0.96 “” 0.03 ac "0.03 a " 0.16 ab
  • VLDL LDL HDL VLDL LDL HDL
  • VLDL LDL HDL VLDL LDL HDL
  • LGS 1 0.36 "0.64 to 0.80" 0.26 bce 0.05 "0.17""0.23 bee 0.7 e 0.75"
  • VLDL Very Low Density Lipoproteins
  • LDL Low Density Lipoproteins
  • HDL High Density Lipoproteins
  • PL diet low in lipids (3 Vo);
  • RL diet rich in lipids (25%);
  • LGS 1 diet containing 25% lipids including 1.25% phospholipids in the form of lipogelosomes®;
  • LGS 2 diet containing 25% lipids including 2.5% phospholipids in the form of lipogelosomes®;
  • LGS 3 diet containing 25% lipids including 3.75% phospholipids in the form of lipogelosomes®;
  • 1 1 diet containing 25% lipids including 1.25% phospholipids;
  • I 2 diet containing 25% lipids of which 2.5% phospholipids;
  • I 3 diet containing 25% lipids including 3.75% phospholipids.
  • the RL diet induced a slight increase in total serum cholesterol compared to the PL diet (Table V). Compared to the RL diet, there was a significant decrease (-22.3%) in total serum cholesterol with the LGS 3 diet. The decrease obtained with the I 3 diet was less significant (- 10.9%).
  • Table VI shows that the decrease in total cholesterol obtained with the LGS 3 diet is due to a significant decrease in total cholesterol from VLDL and secondarily to a tendency to decrease in total LDL cholesterol. Compared to the RL diet, the decrease in total cholesterol of VLDL + LDL following ingestion of the LGS 3 diet was 36.4%. On the other hand, no variation in total HDL cholesterol was noted following the ingestion of this diet.
  • the decrease in serum free cholesterol following the LGS 3 diet compared to the RL diet is due to a significant decrease in the free cholesterol of VLDL and LDL. It should also be mentioned that, compared to the RL diet, diet 13 induced a significant increase in free HDL cholesterol.
  • the decrease compared to the RL diet is due to a significant decrease in the esterified cholesterol of the VLDLs and a tendency to decrease in the LDL and HDL levels (Table VI). Still compared to the RL diet, we did not observe any significant variation in the esterified LDL and HDL cholesterol with the diets containing LGS or I.
  • Table V presents the results of the toxicological parameters of the rat serum after 6 weeks of diet.
  • the addition of lipids in the diets did not induce an increase in alkaline phosphatase.
  • the I 1 regime induced a significant reduction in this parameter compared to the RL, LGS 1 and I 2 regimes.
  • the RL diet significantly increased the GOT activity compared to the PL diet.
  • the RL diet induced an increase in GPT activity. Diets containing LGS or I did not significantly modify the activity of this transaminase compared to PL and RL regimes. Here again, the lowest values were obtained following the ingestion of the LGS 3 and 1 3 regimes.
  • the addition of lipids in the diets induces a significant increase in the concentration (mg / g of liver) and of the total amount (mg / liver) in total cholesterol of the livers (Table VI).
  • the total cholesterol concentration was significantly increased with the LGS 3 diets, and the three I diets.
  • the total amount of cholesterol in the livers was no longer significant with the I 3 diet, so that with the other groups the significant differences are unchanged compared to the RL diet.
  • LGS from 1.25 to 3.75% in diets
  • Table VIII illustrates the effects of LGS on bile salts and sterols.
  • LGS 3 leads to a decrease in total VLDL cholesterol of around 44% and in total LDL cholesterol of around 36%.
  • the LGS induce a favorable distribution of the lipids of the different classes of lipoproteins (Table VI).
  • EXAMPLE 6 Qualitative and quantitative comparison of dispersion lipogelosomes ® in aqueous phase obtained in step 1 of the process according to Example 2, with respect to a reconstituted aqueous solution from a powdered composition obtained in step 2 according to example 2.

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Abstract

Compositions pulvérulentes de liposomes unilamellaires stabilisés, comportant au moins une phase lipidique externe et un noyau polaire aqueux interne gélifié à température ambiante, leur procédé de préparation ainsi que leurs applications comme compléments nutritionnels et dans des compositions pharmaceutiques destinées à être administrées par voie orale (action sur la lipémie). Lesdites compositions sont essentiellement constituées de liposomes unilamellaires comprenant une phase lipidique externe constituée essentiellement de lipides de classe 4 (phospholipides) et un noyau aqueux interne constitué essentiellement d'un mélange M d'au moins deux agents gélifiants non-polymérisables G1 et G2, différents et dont le point de transition de phase gel-sol est supérieur ou égal à 37 °C, G1 étant un agent gélifiant sélectionné parmi les gélatines et des carraghénanes et G2 étant sélectionné parmi les carraghénanes ayant des propriétés différentes des carraghénanes sélectionnés pour G1, et les celluloses, lesquels liposomes ont un diamètre compris entre 20 nm et 1 mm, de préférence compris entre 50 nm et 500 nm et se présentent sous la forme d'unités particulaires ayant un diamètre moyen compris entre 10 mm et 1 000 mm, formées d'un ou plusieurs desdits liposomes, entourés d'une gangue sélectionnée dans le groupe constitué par un gel aqueux thermoréversible déshydraté identique au gel aqueux dudit noyau interne, des dextrines ou un mélange de ceux-ci, de telle sorte qu'elles comprennent, en moyenne, 10?16 à 1018¿ liposomes/g de poudre.

Description

COMPOSITIONS PULVERULENTES DE LIPOSOMES UNILAMELLAIRES.
La présente invention est relative à des compositions pulvérulentes de lipo- somes unilamellaires stabilisés, comportant au moins une phase lipidique externe et un noyau polaire aqueux interne gélifié à température ambiante, à leur procédé de préparation ainsi qu'à leurs applications comme compléments nutritionnels et dans des compositions pharmaceutiques (action sur la lipémie).
Des liposomes à noyau interne gélifié, en suspension en milieu aqueux, contenant de faibles concentrations de substances gélifiantes, ont été décrits par J.C. Hauton, qui les a dénommés lipogélosomes®. Il a, en particulier, mis au point un procédé permettant de fabriquer de tels liposomes ou lipogélosomes1' (Brevet européen 0 393 049), se différenciant des liposomes classiques par le fait que la phase aqueuse encapsulée se présente sous forme semi-solide de gel et non sous forme liquide, ce qui empêche les fusions des liposomes lors des collisions. De tels lipogélosomes® sont produits uniquement à partir de substances naturelles, ce qui minimise les risques d'intolérances. En particulier, dans ce Brevet Européen 0 393 049, ces lipogélosomes® sont constitués par une phase interfaciale en bicouche dans le cas des lipogélosomes® unilamellaires ou d'une pluralité de phases interfaciales en bicouche superposées concentri- quement, dans le cas des lipogélosomes® multilamellaires et par une phase polaire aqueuse interne encapsulée gélifiée, dans laquelle la substance gélifiée polymérisable ou non est sélectionnée parmi les polysaccharides, les polypeptides ou les polyacrylamides ; par exemple la substance gélifiable non polymérisable est sélectionnée parmi la gélatine, l'agarose, ou les carraghénanes et la substance gélifiable polymérisable est sélectionnée parmi les gels de polyacrylamide. Ces lipogélosomes® ont une stabilité significativement augmentée, par rapport aux liposomes de l'art antérieur, notamment en raison de l'absence de fusion interparticulaire pendant les collisions.
Toutefois, ils ont l'inconvénient de se présenter sous une forme liquidé, non adaptée à la préparation de formulations solides, de stockage et d'administration aisés. La Demanderesse a maintenant notamment trouvé qu'en sélectionnant les lipides de la phase lipidique externe d'une part et les gélifiants d'autre part, il est possible de préparer des lipogélosomes® pulvérulents stabilisés présentant des propriétés particulièrement intéressantes en tant que complément nutritionnel et en tant que médicament destiné à être administré par voie orale, dans la prévention des hyperlipémies, (hypercholestérolémies ou hypertriglycéridémies) ; en effet, de tels lipogélosomes® pulvérulents stabilisés peuvent soit être administrés directement par voie orale, soit être aisément dissous dans une phase aqueuse, au moment de leur utilisation.
Les maladies cardio-vasculaires sont la première cause de mortalité et de morbidité en France, comme dans tous les pays industrialisés, et représentent un véritable fardeau financier (30 milliards de francs en 1992). Les chiffres sont alarmants : 36,4 % de tous les décès sont dus aux maladies cardio-vasculaires, dont 20 % pour la pathologie cardiaque et 12 % pour les accidents vasculaires cérébraux. A titre de comparaison, viennent ensuite les décès dus aux différents cancers et morts violentes (accidentelles ou volontaires), dans les proportions respectives de 24,2 % et 9,4 %. Une telle incidence des accidents cardio-cérébro-vasculaires, dans les civilisations occidentales, fait de l'athérosclérose le premier fléau socio-économique dans le domaine de la Santé.
Une prophylaxie à long terme est donc nécessaire. Une diminution de la cholestérolémie peut s'obtenir par un régime hypolipidique, associé ou non à des produits pharmacologiques. Un moyen largement utilisé chez des sujets à risque (ayant une trop forte cholestérolémie) est de séquestrer dans l'intestin les sels biliaires par la cholestyramine, et des études ont montré qu'un traitement chronique par cette résine synthétique diminue la fréquence des accidents cardiaques (BM Rifkind, Atherosclerosis reviews,\987, 18, 59-70). Toutefois, il semble difficile d'envisager une prophylaxie systématique à long terme avec un tel produit, en raison d'un maniement peu commode et d'effets secondaires mal acceptés par les patients.
Un régime hypolipidique strict semble le moyen le plus efficace pour traiter une athérosclérose constituée, mais l'expérience montre que cela est le plus souvent impossible, car sacrifier le plaisir gastronomique représente une atteinte à la qualité de la vie et est d'ailleurs difficile à appliquer dans le contexte des activités quotidiennes des sociétés modernes des pays développés.
D'autres hypolipémiants qui agissent dans le milieu intérieur sont employés, tels que les inhibiteurs de HMG CoA réductase qui diminuent la synthèse du cholestérol endogène et augmentent les récepteurs hépatiques des lipoprotéines athérogènes, réduisant ainsi leur concentration plasmatique (MS Brown et al., Athero- sclerosis rev/ews,1987, 18, 85-93).
Mais appliquer des mesures de prévention médicamenteuse chez des sujets apparemment sains ayant un lipidogramme sanguin se situant dans des limites dites « normales » est contestable en raison des effets secondaires.
Une prophylaxie à long terme de l'athérosclérose applicable à l'échelle d'une population implique qu'il faut disposer de produits efficaces à long terme, d'un maniement facile et présentant un minimum d'effets secondaires indésirables. Des mesures diététiques raisonnables doivent donc être complétées par des actions au niveau intestinal afin de diminuer la lipolyse des triglycérides en acides gras libres et monoglycérides et réduire la production de la phase micellaire, à partir de laquelle se fait leur absorption et celle du cholestérol.
Les triglycérides alimentaires, dont l'hydrolyse commence dans l'es- tomac (lipases sublinguale et gastrique) et se poursuit dans le duodénum (lipase pancréatique) s'organisent dans le milieu intestinal proximal sous forme d'une émulsion, dont la phase interfaciale en monocouche, formée majoritairement par les phospho- lipides alimentaires et biliaires (G Nalbone et al, Lipids, 1974, 9, 765-770) incorpore les produits de la lipolyse (monoglycérides, acides gras libres) ainsi qu'une fraction des sels biliaires. La phase interfaciale intestinale ne peut se dissocier en micelles tant que la concentration en molécules détergeantes dans cette phase (sels biliaires, acides gras ionisés, lysophospholipides) n'atteint pas un certain seuil (concentration micellaire critique).
Pour inhiber fortement la lipolyse intestinale des triglycérides et ré- duire ou même supprimer la formation de la phase micellaire à partir de laquelle se fait l'absorption des produits de la lipolyse, J.C. Hauton a trouvé (Cah. Nutr. Diét., 1990, 25, 2, 87-91) qu'il faut :
- détourner une partie des lipases digestives de la phase interfaciale des particules de l'émulsion lipidique en l'associant sur une phase interfaciale compéti- tive ; et
- détourner une quantité suffisante de sels biliaires sur ladite phase interfaciale compétitive pour abaisser leur concentration au-dessous d'un certain seuil afin d'empêcher la production de la phase micellaire.
Le problème à résoudre consiste donc à faire parvenir dans l'intestin proximal durant la phase de digestion une phase interfaciale compétitive atoxique présentant un maximum de surface sous le plus petit volume possible. La structure actuelle la mieux adaptée est celle des petits liposomes unilamellaires.
Dans une optique industrielle, et pour des raisons de maniement et de conservation, de tels liposomes doivent être stables. Les compositions pulvérulentes de liposomes stabilisés selon l'invention, permettent effectivement de résoudre ce problème, d'une part en raison de la présence du noyau aqueux interne gélifié et d'autre part du fait qu'ils se présentent sous la forme d'une poudre, qui peut soit être administrée directement par voie orale, soit être aisément dissoute dans une phase aqueuse, au moment de son utilisation. En conséquence, la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à une composition pulvérulente stable, à base de liposomes, qui réponde mieux aux besoins de la pratique que les compositions de l'art antérieur en ce qu'outre une stabilité significativement améliorée, elle est efficace aussi bien dans la prévention que dans le traitement des hyperlipémies. La présente invention a pour objet une composition pulvérulente destinée à l'administration par voie orale, caractérisée :
- en ce qu'elle est essentiellement constituée de liposomes unilamellaires comprenant une phase lipidique externe constituée essentiellement de lipides de classe 4 (phospholipides), à l'exclusion des substances de classe 3 (cholestérol, acides gras à longue chaîne non ionisés) et des substances de classe 5 (sels biliaires, dérivés de l'acide fusidique) et un noyau aqueux interne formant un gel aqueux thermoréversible irradiant jusqu'à la phase lipidique externe, lequel noyau aqueux interne est constitué essentiellement d'un mélange M d'au moins deux agents gélifiants non-polymérisables Gl et G2, différents, et dont le point de transition de phase gel-sol est supérieur ou égal à 37°C, Gl étant un agent gélifiant sélectionné parmi les gélatines et des carraghénanes, tels que les kappa-carraghénanes et G2 étant sélectionné parmi des carraghénanes ayant des propriétés différentes des carraghénanes sélectionnés pour Gl, tels que les iota-carraghénanes et les celluloses, telles que l'hydroxypropylcellulose, lesquels liposomes ont un diamètre compris entre 20 nm et 1 mm, de préférence compris entre 50 nm et 500 nm ; et
- en ce qu'elle se présente sous la forme d'unités particulaires ayant un diamètre moyen compris entre 10 mm et 1 000 mm, formées d'un ou plusieurs desdits liposomes, entourés d'une gangue sélectionnée dans le groupe constitué par un gel aqueux thermoréversible déshydraté identique au gel aqueux dudit noyau interne, des dextrines ou un mélange de ceux-ci, de telle sorte qu'elle comprend, en moyenne, 1016 à 1018 liposomes/g de poudre.
L'utilisation de telles compositions pulvérulentes de liposomes en matière de prévention et de thérapie de l'athérosclérose et de l'obésité peut s'avérer d'une grande utilité en permettant de rendre moins sévères et donc plus acceptables les régimes hypolipidiques prescrits aux patients traités pour ces affections.
De manière surprenante, de telles compositions pulvérulentes conservent toute l'intégrité des lipogélosomes® qu'elles contiennent et qui restent stables dans le temps, aussi bien sous forme pulvérulente que lorsqu'ils sont remis en suspension, du fait du maintien de l'intégrité des lipides constitutifs (pas de produit de dégradation) et du maintien de l'intégrité des caractéristiques des agents gélifiants, notamment du mélange Gl et G2 (viscosité, force en gel et à la rupture, masses moléculaires). Elles contiennent ainsi des lipogélosomes® pulvérulents stabilisés.
Les agents gélifiants Gl et G2 diffèrent notamment en ce qui concerne la viscosité, la masse moléculaire et le point de transition gel-sol (c'est-à-dire la température de fusion). Pour les agents gélifiants Gl, cette température est inférieure ou égale à 45°C, alors qu'elle est supérieure ou égale à 45°C pour les agents gélifiants G2.
Le mélange M d'au moins deux agents gélifiants Gl et G2 tels que définis ci-dessus présente des caractéristiques texturométriques (force en gel et à la rupture) particulièrement intéressantes du point de vue de la stabilité des liposomes obtenus. Ainsi, de manière préférée, le mélange M d'au moins deux agents gélifiants Gl et G2 présente, à 5°C, des caractéristiques de relaxation comprises entre 70 et 100 %, de préférence 81-89 %, et une force de rupture comprise entre 1000 et 1600 g, de préférence 1109-1503 g. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, ledit noyau aqueux interne des liposomes comprend, en outre, au moins un agent stabilisant de nature osidique, et/ou au moins un agent de régulation de l'osmolarité du milieu et/ou au moins un agent tensioactif.
De manière avantageuse, ladite composition pulvérulente comprend en % (m/m) : 25 à 75 % de lipides de classe 4, 5 à 45 % d'agents gélifiants, 0 à 70 % d'agent stabilisant de nature osidique, 0 à 15 % d'agent de régulation de l'osmolarité du milieu, 0 à 20 % d'agents tensio-actifs et 0 à 15 % de dextrine (maltodextrine ou cyclodextrine essentiellement), de préférence 8 à 12 %.
Conformément à l'invention, une fraction d'agent gélifiant est inclus dans la phase aqueuse interne desdits lipogélosomes®, alors qu'une autre fraction d'agent gélifiant forme une gangue autour de la couche lipidique externe desdits lipogélosomes®.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition pulvérulente, elle comprend 70 à 95 % d'agent gélifiant Gl et 5 à 30 % d'agent géli- fiant G2.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition pulvérulente selon l'invention, l'agent stabilisant de nature osidique est du saccharose, du tréhalose ou tout autre agent de protection.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition pulvérulente selon l'invention, les lipides constituant la phase lipidique externe desdits liposomes, comprennent de préférence, 20 à 25 % de phosphatidylcholine, 10 à 18 % de phosphatidyléthanolamine et 9 à 15 % de phosphatidylinositol.
Lesdits phospholipides sont essentiellement obtenus à partir de léci- thines de soja à teneur élevée en phospholipides. En variante, les phospholipides sont constitués par des phospholipides purifiés, seuls ou en mélange, de préférence dans les mêmes proportions que celles définies ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une composition pulvérulente selon l'invention, dans laquelle la gangue externe des unités particulaires comprend une fraction de gel aqueux thermoréversible, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(1) préparation d'une dispersion de liposomes à noyau interne gélifié (lipogélosomes®) en phase aqueuse par (a) préparation d'une solution d'au moins un agent gélifiant convenable, notamment un mélange M d'agents gélifiants Gl et G2, par dissolution desdits agents gélifiants, sous agitation lente, à une température supérieure à la température de transition de phase gel-sol desdits agents gélifiants, dans une solution aqueuse, (b) incorporation des lipides dans la solution obtenue en (a), sous agitation lente du mélange, pendant une période inférieure à 5 heures, de préférence sous vide et formation d'une émulsion et (c) obtention de la dispersion de liposomes à noyau interne gélifié (lipogélosomes®) dans une phase aqueuse contenant lesdits agents gélifiants, par agitation rapide de l'émulsion obtenue en (b), de préférence sous vide et
(2) obtention du produit pulvérulent par séchage direct convenable de la dispersion obtenue. Selon un mode de réalisation avantageux dudit procédé, le séchage est réalisé par atomisation, coacervation, couche mince ou granulation.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une composition pulvérulente selon l'invention, dans laquelle la gangue externe des unités particulaires comprend une fraction de gel aqueux thermoréversible et/ou une dextrine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (1) préparation d'une dispersion de liposomes à noyau interne gélifié (lipogélosomes®) en phase aqueuse par (a) préparation d'une solution d'au moins un agent gélifiant convenable, notamment un mélange M d'agents gélifiants Gl et G2, par dissolution desdits agents gélifiants, sous agitation lente, à une température supérieure à la température de transition gel-sol desdits agents gélifiants dans une solution aqueuse, (b) incorporation des lipides dans la solution obtenue en (a), sous agitation lente du mélange, pendant une période inférieure à 5 heures, de préférence sous vide et formation d'une émulsion et (c) obtention de ladite dispersion de liposomes à noyau interne gélifié (lipogélosomes®) en phase liquide aqueuse contenant lesdits agents gélifiants, par agitation rapide de l'émulsion obtenue en (b), de préférence sous vide,
(2) élimination, au moins en partie, de la phase liquide aqueuse contenant lesdits gélifiants, dans laquelle sont dispersés lesdits liposomes.
(3) ajout d'au moins une dextrine convenable et (4) obtention du produit pulvérulent par séchage par atomisation de produit obtenu en (3).
Selon un mode de mise en œuvre avantageux de ce procédé, l'étape (2) d'élimination d'au moins une partie de la phase liquide aqueuse contenant lesdits agents gélifiants est réalisée par dilution et ou par filtration. Conformément aux procédés de préparation selon l'invention, la solution aqueuse de l'étape (a) comprend en outre un agent de régulation de l'osmolarité du milieu (NaCl à 0,9 %, par exemple) et/ou un agent stabilisant de nature osidique et/ ou un agent tensioactif.
De manière surprenante, de tels procédés permettent d'obtenir une composition pulvérulente de liposomes stables à phase interne gélifiée (lipogélosomes®) au cours d'une seule étape comportant une phase de maturation (au sens de mûrissement) des constituants en phase aqueuse, à vitesse lente, puis une phase de dispersion (formation des lipogélosomes®) à vitesse rapide, comprennent une étape au cours de laquelle on obtient une dispersion stable de lipogélosomes® en phase liquide, de morphologie homogène, qui est apte à être soumise à l'étape de séchage ; ladite dispersion de liposomes à noyau interne gélifié présente, en effet, la morphologie la suivante :
. structure vésiculaire de diamètre compris entre 20 nm et 1 mm, de préférence entre 70 et 200 nm, . observations microscopiques en coloration négative, cryofracture, cryotransmission et microscopie de force atomique : vésicules ou assemblages de vésicules d'aspect caractéristiques de bicouches phospholipidiques ; la coloration négative permet d'observer la présence plus ou moins marquée de mélange M d'agents gélifiants enrobant la couche phospholipidique externe, et . polydispersité des liposomes à noyau interne gélifié, comprise entre
10 et 55 %, de préférence entre 30 et 50 %.
Un tel procédé a l'avantage d'être reproductible et parfaitement adaptable à l'échelle industrielle.
Il présente en outre l'avantage d'être moins lourd à mettre en oeuvre que les procédés de l'Art antérieur dans lesquels une étape de sonication, d'extrusion ou d'élimination de détergents est nécessaire, comme décrites dans le Brevet Européen 0 393 049.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux desdits procédés, l'étape (b) est effectuée, de préférence, à une vitesse de cisaillement inférieure à 200 s"1 ; de manière générale, la vitesse de cisaillement est donnée par le rapport suivant : vitesse du module d'agitation/écartement entre la paroi interne du réacteur et l'extrémité distale de la pale d'agitation (également appelé « entrefer »).
La présente invention a également pour objet un complément nutritionnel apte à réguler la cholestérolémie et la triglycéridémie, caractérisé en ce qu'il comprend une composition pulvérulente telle que définie ci-dessus, éventuellement associée à un excipient approprié.
La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques destinées à être administrées par voie orale comprenant une composition pulvérulente selon l'invention et au moins un véhicule approprié ; de telles compositions sont particulièrement aptes à réguler la cholestérolémie et la triglycéridémie ou à servir d'adjuvant dans des traitements utilisant un ou plusieurs principes actifs provoquant l'augmentation des transaminases ou de tout autre marqueur toxique ; en effet, de manière inattendue, les compositions pulvérulentes de liposomes stabilisés selon l'invention s'opposent à l'augmentation, de manière significative, des taux de GOT et de GPT hépatiques.
Aussi bien le complément nutritionnel que les compositions pharmaceutiques peuvent se présenter soit sous une forme solide (gélule, comprimé, poudre à dissoudre dans l'eau), soit sous une forme liquide (composition pulvérulente selon l'invention redissoute dans une solution aqueuse). De telles formes sont adaptées à l'administration par voie orale.
De manière avantageuse, aussi bien le complément nutritionnel que les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont destinées à être administrées à une dose unitaire correspondant à une dose unitaire de phospholipides constitutifs des lipogélosomes® selon l'invention comprise entre 0,01 et 0,07 g/kg, soit une dose journalière comprise entre 0,03 et 0,2 g de phospholipides constitutifs des lipogélosomes, par kg corporel, administrée en 2 ou 3 prises.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 illustre la distribution, en pourcentage, des classes lipidiques (AG : acides gras ; MG : monoglycérides ; DG : diglycérides ; TG : triglycérides) radiomarquées présentes dans le contenu stomacal des rats sacrifiés après 2 heures de digestion ; - la figure 2 illustre les pourcentages de lipides radiomarqués retrouvés dans la lumière intestinale par rapport à la quantité (en dpm) de lipides qui a été vidangée par l'estomac des rats sacrifiés après 2 heures de digestion (seg. int. : segment intestinal) ;
- la figure 3 illustre la distribution, en pourcentage, des classes lipi- diques (AG : acides gras ; MG : monoglycérides ; DG : diglycérides ; TG : triglycé- rides) radiomarquées présentes dans la lumière intestinale des rats sacrifiés après 2 heures de digestion (seg. int. : segment intestinal) ;
- la figure 4 illustre les pourcentages de lipides radiomarqués retrouvés dans la muqueuse intestinale par rapport à la quantité (en dpm) de lipides qui a été vidangée par l'estomac des rats sacrifiés après 2 heures de digestion (seg. muq. : segment de la muqueuse) ;
- la figure 5 illustre les pourcentages de lipides radiomarqués retrouvés dans le plasma par rapport à la quantité (en dpm) de lipides qui a été vidangée par l'estomac des rats sacrifiés après 2 heures de digestion ; - la figure 6 illustre les pourcentages de lipides radiomarqués retrouvés dans le foie par rapport à la quantité (en dpm) de lipides vidangée par l'estomac des rats sacrifiés après 2 heures de digestion ;
- la figure 7 illustre la quantité de lipides radiomarqués (en dpm) retrouvés dans le caecum et les fèces des rats sacrifiés après 24 heures de digestion. II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Mesures de texturométrie du mélange des agents gélifiants Gl et G2 a) Matériel et méthodes
Les mesures sont réalisées sur un appareil TA-XT2i de la société Rhéo. L'étude concerne le comportement de gels constitués d'un mélange de gélatine, de iota et de kappa carraghénanes lors d'essais de rupture et de relaxation. . Concentration des échantillons : Mélange gélatine/iota/kappa carraghénanes (80/17,5/2,5) à 7,5 % p/N, dans un milieu Νa2HPO4 5mM et NaCl 0,9 ou 2 %.
. Préparation d'une solution de gélifiants :
On dissout le chlorure de sodium dans un mélangeur muni d'une turbine et d'un planétaire et contenant l'eau purifiée (15 minutes à 10 tours/minute), on monte le mélangeur à température jusqu'à 75°C (agitation à 10 tours/minute pendant 45 minutes), on ajoute dans le mélangeur, à 75°C, les agents gélifiants (gélatine, iota carraghénanes, kappa carraghénanes), on met en marche la turbine d'agitation à 1500 tours/minutes ; la durée de l'étape de dissolution est d'environ 30 minutes ; la dissolution est achevée lorsque la solution est limpide et ne contient pas de particules en suspension.
. Préparation des échantillons :
Pour l'essai de relaxation, 45 ml de gel sont coulés à chaud dans une boîte de Pétri à fond plat de 92 ± 2 mm de diamètre externe. Pour l'essai de rupture, 30 ml de gel sont coulés à chaud dans un cristallisoir à fond plat de 50 ± 2 mm de diamètre externe. Le gel est obtenu par refroidissement à une température inférieure ou égale à 37°C. Le temps de maturation des gels, qui correspond à une hydratation maximale des gels, est de 2,5 jours à la température de l'étude et au repos. . Conditions opératoires :
Pour l'essai de relaxation, une force de compression est appliquée au gel pendant un temps déterminé. Le mobile utilisé est un cylindre en aluminium de 25 mm de diamètre avec une pré-vitesse de 1,0 mm/s, une vitesse de 0,5 mm/s et une post- vitesse de 10,0 mm/s. Le déplacement du mobile est de 1,0 mm pendant 30 secondes.
Pour l'esssai de rupture, le mobile utilisé est un cylindre en ébonite de 10 mm de diamètre avec une pré-vitesse, une vitesse et une post-vitesse de 1,0 mm/s. Le déplacement du mobile est de 12 mm. b résultats d'une étude à 5°C, avec un taux de NaCl de 0.9 % Relaxation (%) valeur minimale : 81 ± 2,2 valeur maximale : 89 ± 0,8
Force de rupture (g) valeur minimale : 1109 ± 25 valeur maximale : 1503 ± 35 c) résultats en fonction de la température et de différents taux en NaCl Les conditions opératoires sont identiques à celles décrites en a), sauf en ce qui concerne le déplacement du mobile utilisé dans l'essai de relaxation (déplacement de 20 % de l'épaisseur totale du gel). Relaxation (%) à5°C
NaCl 0,9 % : 89 ± 0,8 NaCl 2 % : 90 ± 0,2 à25°C
NaCl 0,9 % : 32 ± 3,9 NaCl 2 %: 38 ± 4,4 à37°C
NaCl 0,9% :36 ±3,7 NaCl 2 % : 40 ± 4,9 Force de rupture (g) à5°C
NaCl 0,9%: 1413 ±66 NaC12%: 1114 ±143 à25°C
NaCl 0,9%: 211 ±2,7 NaC12%:173±l,5 à37°C
NaCl 0,9%: 25,7 ±2,4 NaCl 2 % : 45,7 ± 3,9 EXEMPLE 2 : Procédé de préparation d'une composition pulvérulente selon l'invention (LGS) (avec gangue externe constituée de gélifiants déshydratés).
1) Préparation d'une dispersion de liposomes à phase interne gélifiée (lipogélosomes®) :
- Constituants :
Lécithines de soja 11 ,915 kg (7,943 %) Gélatine B 150 7, 149 kg (4,766 %) Iota carraghénanes 1 ,565 kg ( 1 ,043 %)
Kappa carraghénanes 0,222 kg (0, 148 %)
Saccharose 8,936 kg (5,957 %)
Chlorure de sodium 1 ,073 kg (0,715 %) Eau purifiée 1 19, 15 kg (79,43 %)
TOTAL MATIERE 150,01 kg (100 %). a) Préparation d'une solution de gélifiants
On procède de la même manière que dans l'exemple 1. Les qualités de la solution sont vérifiées par prélèvements, puis on ajoute l'agent stabilisant osidique (saccharose). b) Incorporation des phospholipides dans la solution obtenue en a) :
On ajoute les lécithines de soja dans le mélangeur, dans lequel le planétaire tourne à la vitesse de 10 tours/minute et la turbine à la vitesse de 1500 tours/minute, pendant 5 heures, sous vide (-» formation d'une émulsion).
- dispersion finale par augmentation des vitesses d'agitation du planétaire (25 tours/minute) et de la turbine (2 500 tours/minute) un temps suffisant pour obtenir une polydispersité inférieure à 40 %.
On obtient une dispersion de lipogélosomes® en phase aqueuse. L'étude des échantillons prélevés en fin de dispersion montre des structures vésiculaires de diamètre 120 ± 30 nm.
Observations microscopiques en coloration négative, cryofracture, cryotransmission et microscopie de force atomique : vésicules ou assemblages de vésicules d'aspect caractéristiques de bicouches phospholipidiques ; la coloration négative permet d'observer la présence plus ou moins marquée de gélifiant extérieur selon le procédé de fabrication et/ou de séparation choisi.
2) Séchage de la dispersion obtenue :
La dispersion des lipogélosomes® en phase aqueuse obtenue est transvasée dans un sécheur sous vide (50-100 mbars) pendant environ 4 heures. On obtient une poudre assez homogène, de couleur jaune paille, très claire, contenant des grains de diamètre compris entre 0,1 mm et 1 mm. D'autres méthodes de séchage peuvent êtres mises en œuvre.
Au niveau des observations de microscopie électronique, on constate une rétraction des vésicules lipidiques sur elles-mêmes, en raison de la déshydratation. De plus, on remarque que, alors que, à l'état liquide, les LGS sont souvent agrégés à l'intérieur d'une gangue gélifiée homogène dans un environnement de nombreuses structures vésiculaires isolées, l'étape de séchage transforme cette gangue gélatineuse en filaments de gélifiant secs à la surface des agrégats, mais aussi à la surface des structures vésiculaires isolées : la Demanderesse pense que cette différence de morphologie est probablement à l'origine des différences de comportement des structures sèches, comparativement à la forme LGS humide, vis-à-vis du métabolisme des lipides.
En variante, le séchage est effectué comme suit : la dispersion de lipogélosomes® en phase aqueuse est répartie directement sur un sécheur à cylindres tournants (température des cylindres : 120-150°C, vitesse de rotation 3-6 tours/min.). Les « copeaux » obtenus sont ensuite broyés et calibrés sur une grille adéquate. On obtient alors une poudre de lipogélosomes® (également dénommés ci-après LGS), ayant les caractéristiques définies ci-dessus.
EXEMPLE 3 : Procédé de préparation d'une composition pulvérulente selon l'invention (LGS) (avec gangue externe comprenant des maltodextrines)
1) Préparation d'une dispersion de liposomes à phase interne gélifiée (lipogélosomes®) :
- Constituants :
Lécithines de soja 1 1 ,915 kg (7,943 %) Gélatine B150 7,149 kg (4,766 %)
Iota carraghénanes 1,565 kg (1,043 %)
Kappa carraghénanes 0,222 kg (0,148 %)
Saccharose 8,936 kg (5,957 %)
Chlorure de sodium 1 ,073 kg (0,715 %) Eau purifiée 1 19, 15 kg (79,43 %) TOTAL MATIERE 150,01 kg ( 100 %). a) Préparation d'une solution de gélifiants
On procède de la même manière que dans l'exemple 2. b) Incorporation des phospholipides dans la solution obtenue en a) :
On ajoute les lécithines de soja dans le mélangeur, dans lequel le planétaire tourne à la vitesse de 10 tours/minute et la turbine à la vitesse de 1500 tours/minute, pendant 5 heures, sous vide (— > formation d'une émulsion).
- dispersion finale par augmentation des vitesses d'agitation du planétaire (25 tours/minute) et de la turbine (2 500 tours/minute) un temps suffisant pour obtenir une polydispersité inférieure à 40 %.
On obtient une dispersion de lipogélosomes® en phase aqueuse. L'étude des échantillons prélevés en fin de dispersion montre des structures vésiculaires de diamètre 120 ± 30 nm. Observations microscopiques en coloration négative, cryofracture, cryotransmission et microscopie de force atomique : vésicules ou assemblages de vésicules d'aspects caractéristiques de bicouches phospholipidiques ; la coloration négative permet d'observer la présence plus ou moins marquée de gélifiant extérieur selon le procédé de fabrication et/ou de séparation choisi. 2)
La dispersion de LGS en milieu gélifiant externe est diluée au 1/10 par une solution de NaCl 0,9 %, puis filtrée sur filtre 300 kDa ou 500 kDa (système de filtration tangentielle « Open Channel », PAL FILTRON), à 37°C. Après concentration des LGS, on obtient une dispersion dont la teneur en matière sèche varie entre 37 et 50 % (m/v). On rajoute une quantité équivalent à 4-6 % (m/m) de maltodextrine. Après dissolution et homogénéisation du mélange, on réalise une atomisation (par exemple, avec un atomiseur pilote NIRO). On obtient alors des unités particulaires, dans lesquelles la gangue externe comprend des maltodextrines et dont la composition est sensiblement la suivante : LGS concentré à 44,6 % de matière sèche 1500 g maltodextrine 80 g
Total atomisât de LGS théorique 830 g quantité obtenue 760 g
(rendement 84 %). L'atomisation est réalisée dans les conditions suivantes: température d'entrée d'air : entre 180°C et 200°C température de sortie d'air : entre 80°C et 95°C pression en tête de turbine : 4 bars, environ température de sortie de la solution à atomiser : entre 20°C et 45°C. EXEMPLE 4 : Effets de l'ingestion d'une composition pulvérulente selon l'exemple 2 sur l'absorption intestinale des lipides alimentaires chez le rat en période post-prandiale.
Cette étude est réalisée chez le rat normolipidémique, en période post-prandiale. La normolipidémie permet d'étudier les effets réels des lipogélosomes® sans interaction avec les perturbations métaboliques engendrées par un état pathologique. La période post-prandiale permet l'étude des mécanismes, avec une « photographie » des effets des lipogélosomes® à un moment donné de la digestion.
MATERIELS ET METHODES Animaux et régimes
* Animaux
Les réglementations officielles françaises (n° 87-848 du 19 octobre 1987) et européennes (n° 86-609 du 24 novembre 1986) pour le soin et l'usage des animaux de laboratoire ont été respectées. Les animaux sont des rats mâles Wistar (Iffa-Crédo, l'Arbresle,
France) pesant 300 grammes. Pendant une période d'adaptation de 10 jours, ils ont été mis en cage dans une salle climatisée (température de 21°C, 50 % d'humidité), avec un cycle lumière-obscurité de 12 h-12 h ; l'eau et la nourriture ont été fournies ad libitum. 48 heures avant l'expérimentation, les rats sont placés en cage de contention avec un régime glucose à 50 g/1. 24 heures avant l'expérimentation, ils sont mis sous diète avec seulement de l'eau ad libitum, pour éviter la coprophagie.
Ainsi, les estomacs des rats sont libres de tout matériel avant l'intubation des repas tests. Six groupes de rats sont constitués de façon aléatoire : deux groupes témoins (T), deux groupes "lipogélosomes®" (LGS) et deux groupes "ingrédients" (I) qui sont sacrifiés, soit 2 heures après la digestion, soit 24 heures après la digestion. Le nombre de rats est variable, selon les groupes, en raison de contraintes expérimentales. * Repas tests Chaque repas test est constitué d'une émulsion lipidique à laquelle ont été rajoutés extemporanément les lipogélosomes® (groupe LGS), les ingrédients des lipogélosomes® (groupe I) ou du chlorure de sodium (groupe T).
- L'émulsion lipidique :
522,5 mg d'un mélange contenant de la trioléine, du cholestérol et des lécithines de soja (Tableau I), ont été ajoutés à une solution aqueuse de chlorure de sodium, saccharose et albumine. La préparation est émulsifiée par agitation magnétique et sonication. Elle est renouvelée chaque semaine. Le diamètre des particules de cette émulsion a été contrôlé tous les jours à l'aide d'un granulomètre (Capa 700, Horiba, Kyoto, Japon). Aucune différence n'a été observée d'un jour sur l'autre, avec un diamètre moyen de 2,97 μm.
Les radioactivités spécifiques de la trioléine- 14C et du cholestérol-3H ont été, respectivement, de 68,45 kBq/mmol et 4,27 kBq/mmol dans chaque repas test.
- Les lipogélosomes® :
Une composition pulvérulente, selon l'exemple 2, est remise en solution dans de l'eau, afin d'obtenir une concentration en phospholipides de
39,47 mg/ml ; le diamètre des lipogélosomes® en suspension, contrôlé par granulométrie et par microscopie électronique est stable et d'environ 164,9 nm (valeur moyenne).
- Les ingrédients des lipogélosomes® : Les matières premières constitutives des lipogélosomes® telles que précisées à l'exemple 2 sont utilisées. Les phospholipides et le mélange gélifiant ont été préparés séparément.
- Administration des repas tests : Extemporanément, dans une seringue, 2,2 ml de la préparation de lipogélosomes® ou des ingrédients ont été mélangés à 1,5 ml de l'émulsion lipidique pour les groupes LGS et I. Du chlorure de sodium, en quantité équivalente, a été ajouté à l'émulsion lipidique pour les groupes T.
Le rapport triglycérides/phospholipides alimentaires du total ingéré est de 40 pour tous les groupes et correspond au rapport observé dans l'alimentation humaine. Toutefois, pour tenir compte de cette valeur, les repas tests des animaux traités par LGS ou I ont un apport alimentaire en lipides diminué en conséquence.
Les rats ont été intubés par sonde gastrique avec des cathéters en polyéthylène. Avant l'intubation de l'émulsion, deux aliquotes ont été prélevées pour quantifier exactement la radioactivité ingérée par les rats.
TABLEAU I
Figure imgf000022_0001
* Albumine sérique bovine (pauvre en acides gras) : Calbiochem, San Diego, CA. Trioléine (pure à 99 %) : Serva, Heidelberg, FRG. Trioléine-'4C (pure à 98,3 %), 4,1 Gbq/mmol : NEN research products, Dupont de Nemours, Paris, France. Cholestérol (pur à 99 %) : Sigma, St Louis, MO. Cholestérol- H (pur à 99%), 814 Gbq/mmol : NEN Research products, Dupont de Nemours. Lécithine de soja (pure à 90 %) : Frangis, St-Maur, France.
Prélèvements
Sang
Après 2 ou 24 heures de digestion, les rats ont été anesthésiés par un mélange kétamine/xylamine (60 mg/kg/7, 5 mg/kg) puis sacrifiés par exsanguination. Le sang a été prélevé par ponction dans l'aorte abdominale et environ 10 ml ont été récoltés dans des tubes contenant de l'EDTA, afin d'empêcher leur coagulation.
Le Tableau II ci-après présente les conditions des différents prélèvements effectués.
Figure imgf000023_0001
lipides
** org. : organique.
Pour le temps de 2 heures de digestion, les résultats des mesures de la radioactivité directe ont été exprimés en pourcentage de la radioactivité retrouvée au-delà du pylore stomacal, afin de réduire l'influence de la vidange gastrique qui est variable au sein d'un même groupe.
Cela n'a pas été nécessaire pour les rats sacrifiés à 24 heures de digestion puisque la vidange est alors de 99,9 % pour l'ensemble des rats. Les résultats sont donc exprimés en dpm. RÉSULTATS
1) Effets des lipogélosomes® sur la lipolyse des lipides dans l'estomac
Comme précédemment observé chez les animaux ainsi que dans l'espèce humaine, les lipides alimentaires sont partiellement hydrolyses dans l'estomac des rats. Au bout de deux heures de digestion, les contenus stomacaux des trois groupes T, I et LGS ne sont pas significativement différents, bien que légèrement moins importants en ce qui concerne les rats du groupe LGS (Tableau III). Ces résultats correspondent à des taux de vidange gastrique proches de ceux trouvés précédemment chez des rats après la prise de repas tests (Gallaher D. et al., Am. J. Physiol., 1985, 249, 184-191).
TABLEAU III Contenus de l'estomac et vidanges gastriques après 2 heures de digestion*
Figure imgf000024_0001
* Les résultats sont exprimés en pourcentage de la radioactivité (en dpm) intubée. La première ligne concerne les lipides-14C, la deuxième ligne concerne le cholestérol-3H. Aucune différence significative n'a été observée entre les groupes par le test de Fisher (P<0,05).
Aucune différence n'a été observée en ce qui concerne la quantité de lipides-14C et de cholestérol-3H présents dans les estomacs des rats des trois groupes après deux heures de digestion. En revanche, il n'en a pas été de même en ce -qui concerne la qualité des lipides-14C qui ont subi, suivant les groupes, une hydrolyse plus ou moins poussée. La figure 1 montre les pourcentages de triglycérides (TG), diglycérides (DG), monoglycérides (MG) et acides gras (AG) trouvés dans le contenu stomacal, deux heures après l'intubation du repas test contenant des triglycérides. La proportion des triglycérides est restée significativement plus importante en présence des ingrédients (+21,6 % par rapport au groupe T) et des lipogélosomes® (+31,3 %) dans le repas-test, contrairement à celles des diglycérides et des acides gras qui sont significativement plus faibles. La proportion des monoglycérides n'est pas significativement différente entre les trois groupes, cependant elle a subi une nette diminution dans le contenu stomacal des rats du groupe LGS (-48,5 % par rapport au groupe T). Les proportions des classes lipidiques dans le contenu stomacal des rats du groupe Ingrédients sont toujours intermédiaires avec celles des groupes Témoins et LGS.
Le cholestérol reste inchangé, ne subissant aucune transformation au niveau stomacal. Sur cette figure 1 , chaque histogramme est la moyenne ± SEM des valeurs individuelles de chaque groupe (T : Témoins ; I : Ingrédients ; L : Lipogélosomes®). Des lettres différentes indiquent des différences significatives (p<0,05) entre les groupes par le test de Fisher. Une * indique une différence significative (p<0,05) avec le groupe Témoins par le test de Scheffé. 2) Effets des lipogélosomes® dans le compartiment intestinal
Comme pour le contenu stomacal, le contenu intestinal des rats sacrifiés après 2 heures de digestion ne présente pas de différence significative entre les groupes Témoins, Ingrédients et LGS en terme de quantité de lipides-'4C. La figure 2 montre que la répartition des lipides- 14C dans les trois segments intestinaux est similaire pour les groupes Témoins et LGS, avec une décroissance de la quantité de lipides- 14C de la partie supérieure à celle inférieure de l'intestin. Une quantité nettement plus faible (mais non significative) de lipides- 14C est retrouvée dans le contenu intestinal du segment supérieur et de l'ensemble de l'intestin du groupe Ingrédients. A cette figure 2, chaque histogramme est la moyenne ± SEM des valeurs individuelles de chaque groupe (T : Témoins ; I : Ingrédients ; L: Lipogélosomes®). Des lettres différentes indiquent des différences significatives (p<0,05) entre les groupes par le test de Fisher. Une * indique une différence significative (p<0.05) avec le groupe Témoins par le test de Scheffé.
Les proportions des différentes classes lipidiques trouvées dans le contenu des segments intestinaux ont été modifiées suivant le repas test intubé (figure 3). Les diglycérides ont été significativement plus élevés dans le segment intestinal inférieur des rats des groupes Ingrédients et Lipogélosomes®. Dans ce même segment, les acides gras ont été significativement diminués par les ingrédients et les lipogélosomes®. En raison d'une variabilité assez forte intra-groupe, les ingrédients et les lipo- gélosomes® n'ont pas fait apparaître de différences significatives sur les contenus des segments intestinaux supérieur et moyen. A cette figure 3, chaque histogramme est la moyenne ± SEM des valeurs individuelles de chaque groupe (T : Témoins ; I : Ingrédients ; L : Lipogélosomes®). Des lettres différentes indiquent des différences significatives (p<0,05) entre les groupes par le test de Fisher. Une * indique une diffé- rence significative (p<0,05) avec le groupe Témoins par le test de Scheffé.
Comme le montre la figure 2, la répartition du cholestérol le long de l'intestin a été modifiée par les ingrédients et les lipogélosomes®. Les ingrédients ont diminué significativement le cholestérol dans le contenu intestinal du segment supérieur (-57,3 % par rapport au groupe T) ; les lipogélosomes® ont augmenté significativement le cholestérol dans le contenu intestinal du segment inférieur, ainsi que dans la totalité du contenu intestinal (respectivement, +104,5 % et +34,4 % par rapport au groupe T).
Les résultats pour les rats sacrifiés au bout de 24 heures de digestion ne présentent pas de différence entre les trois groupes. Les radioactivités mesurées ont été très faibles, l'intestin étant quasiment vide à ce temps de la digestion.
3) Effets des lipogélosomes® sur l'absorption des triglycérides et du cholestérol alimentaires
Le contenu de la muqueuse intestinale n'a été prélevé et analysé que pour le temps de 2 heures de digestion ; une telle analyse pour le temps de 24 heures n'aurait eu aucun intérêt, le temps de transit des lipides dans les entérocytes étant court.
Le contenu en triglycérides des cellules de la muqueuse intestinale n'a pas présenté de différences significatives entre les groupes T, I et LGS (figure 4). L'absorption du cholestérol alimentaire est largement affectée par la présence des lipogélosomes® dans le repas test et dans une moindre mesure par celle de leurs ingrédients (figure 4). L'absorption du cholestérol est diminuée significativement par les ingrédients au niveau du segment supérieur de la muqueuse intestinale. Les lipogélosomes® ont entraîné une diminution significative de l'absorption du cholestérol vers les segments supérieur et inférieur de la muqueuse, ainsi que vers la totalité de la muqueuse intestinale (respectivement, -32,9% , -47% et -16,8%o par rapport au groupe T). A cette figure 4, chaque histogramme est la moyenne ± SEM des valeurs individuelles de chaque groupe (T : Témoins ; I : Ingrédients ; L : Lipogélosomes®). Des lettres différentes indiquent des différences significatives (p<0,05) entre les groupes par le test de Fisher. Une * indique une différence significative (p<0,05) avec le groupe Témoins par le test de Scheffé.
4) Effets des lipogélosomes® sur les taux plasmatiques des lipides Les quantités de triglycérides- 14C et de cholestérol-3H, dans le plasma des rats sacrifiés après 2 heures de digestion, sont représentées sur la figure 5. Les ingrédients et les lipogélosomes® ont tendance à diminuer les triglycérides plasmatiques mais les différences observées ne sont pas significatives.
Le cholestérol plasmatique est significativement abaissé par les lipogélosomes® (- 42,6 %> par rapport au groupe T). Les ingrédients ont un effet similaire mais non significatif par rapport au cholestérol plasmatique des rats du groupe Témoins.
A cette figure 5, chaque histogramme est la moyenne ± SEM des valeurs individuelles de chaque groupe (T : Témoins ; I : Ingrédients ; L : Lipogélosomes®). Des lettres différentes indiquent des différences significatives (P<0,05) entre les groupes par le test de Fisher. Une * indique une différence significative (p<0,05) avec le groupe Témoins par le test de Scheffé. Pour le temps de 24 heures, aucune différence entre les trois groupes n'est observée.
5) Effets des lipogélosomes® sur le métabolisme lipidique hépatique Les ingrédients et les lipogélosomes® ne présentent pas d'effet marqué sur le stockage des lipides- l4C au niveau hépatique, au bout de deux heures de digestion (figure 6).
Ils induisent, en revanche, une baisse, non significative en raison d'une forte variabilité intra-groupe, de la quantité de cholestérol stocké par le foie, en la diminuant respectivement de 35 % et 33 % par rapport au groupe T.
A cette figure 6, chaque histogramme est la moyenne ± SEM des valeurs individuelles de chaque groupe (T: Témoins; I : Ingrédients ; L: Lipogélosomes®). Aucune différence significative n'a été observée par le test de Fisher (p<0,05). Au temps de 24 heures de digestion, les quantités de lipides radiomarqués présents dans les foies ne présentaient aucune différence entre les trois groupes.
6) Lipides et cholestérol alimentaires dans le caecum et les fèces Le caecum des animaux sacrifiés au bout de deux heures de digestion ne contenait pas ou à des doses infimes de radioactivité en l4C comme en 3H. De plus, il n'y avait pas de fèces.
Au temps de 24 heures de digestion (figure 7), les quantités de lipides-14C retrouvées dans le caecum et les fèces sont significativement augmentées chez les rats ayant reçu un repas test contenant des lipogélosomes® (+229,5 % par rapport au groupe T).
L'effet est encore plus marqué en ce qui concerne les quantités de cholestérol alimentaire qui sont augmentées significativement à la fois pour les groupes Ingrédients et LGS (respectivement, +133,3 %> et +229,4 % par rapport au groupe T). L'accroissement des quantités de cholestérol non absorbé par la muqueuse intestinale est plus faible pour le groupe I, comparativement au groupe LGS, et ceci de façon significative.
A cette figure 7, chaque histogramme est la moyenne ± SEM des valeurs individuelles de chaque groupe (T : Témoins ; I : Ingrédients ; L : Lipogélo- somes®). Des lettres différentes indiquent des différences significatives (p<0,01) entre les groupes par le test de Fisher et par le test de Scheffé.
Cette étude montre que l'ingestion de lipogélosomes® avec la ration alimentaire induit bien une diminution de l'absorption des lipides (triglycérides et cholestérol) alimentaires. L'hypothèse la plus vraisemblable, au vu des résultats, sur le mode d'action des lipogélosomes®, est celle d'une réduction de la lipolyse des triglycérides dans la lumière intestinale, conduisant à une production moins importante de monoglycérides et d'acides gras libres. Cette baisse de la lipolyse aurait principalement deux conséquences : une diminution de l'absorption des monoglycérides et des acides gras libres ; une diminution de la solubilisation du cholestérol dans la phase micellaire, entraînant ainsi une réduction de l'absorption du cholestérol.
L'action des lipogélosomes® sur la diminution de l'absorption du cholestérol par la muqueuse intestinale est plus importante que celle sur les monoglycérides et les acides gras. Ceci peut être attribué au fait que le taux d'absorption du cholestérol est beaucoup plus faible que celui des triglycérides (respectivement 80 à 100 % et 40 à 60 %).
Ainsi, même dans les conditions "normales" de digestion, l'absorption du cholestérol est limitée. La modification d'un paramètre (baisse de la concentration en monoglycérides et en acides gras libres) entraîne alors une perturbation importante de l'absorption du cholestérol.
De plus, il est possible que les lipogélosomes® trappent une partie des sels biliaires. Cette action aurait pour conséquence une diminution de la solubilisation du cholestérol dans la phase micellaire conduisant à une baisse de son absorption. Ces résultats sont renforcés par ceux obtenus lors d'une étude sur les effets de l'ingestion chronique de lipogélosomes® sur le métabolisme lipidique (exemple 5 ci-après).
EXEMPLE 5 : Effets de l'ingestion chronique de différentes quantités de LGS sur le métabolisme des lipides chez le rat.
ANIMAUX ET REGIMES :
8 groupes de 10 rats Wistar (IFFA CREDO, L'Arbresle, France), âgés de 14 semaines, ont été aléatoirement constitués.
Les animaux sont mis en cage dans une salle climatisée (température de 21°C, 50 % d'humidité), avec un cycle lumière-obscurité de 12h-12h. La nourriture et l'eau ont été fournies ad libitum.
8 régimes sont effectués manuellement. Les lipogélosomes® (LGS), ainsi que les matières premières constitutives des LGS (I = ingrédients) sont identiques à ceux de l'exemple 2. La composition détaillée de chaque régime est présentée dans le Tableau IV. Les proportions des divers nutriments des régimes ont été calculés en tenant compte des apports lipidiques des lipogélosomes® ou des ingrédients.
8 régimes ont été testés :
PL - régime pauvre en lipides (4 % de triglycérides) RL - régime riche en lipides (25 % de triglycérides + 1,2 % de cholestérol)
LGS 1 - régime riche en lipides dont 1,25 % de PL (LGS)
LGS 2 - régime riche en lipides dont 2,5 % de PL (LGS)
LGS 3 - régime riche en lipides dont 3,75 % de PL (LGS) I 1 - régime riche en lipides dont 1,25 % de PL (ingrédients LGS)
I 2 - régime riche en lipides dont 2,5 % de PL (ingrédients LGS)
I 3 - régime riche en lipides dont 3,75 % de PL (ingrédients LGS)
Afin de ne pas dégrader les LGS, les régimes LGS 1, 2 et 3 ont été préparés extemporanément. Les autres régimes ont été congelés à -20°C. TABLEAU IV
Figure imgf000031_0001
Composition des régimes (g/100). PL = régime pauvre en lipides (3 %) ; RL = régime riche en lipides (25 %) ; LGS 1 = régime contenan 25 % de lipides dont 1,25 % de phospholipides sous forme de lipogélosomes® ; LGS 2 = régime contenant 25 % de lipides dont 2,5 %> de phospholipides sous forme de lipogélosomes® ; LGS 3 = régime contenant 25 %> de lipides dont 3,75 %> de phospholipides sous forme de lipogélosomes® ; I 1 = régime contenant 25 % de lipides dont 1,25 %> de phospholipides ; I 2 = régime contenant 25 % de lipides dont 2,5 % de phospholipides ; I 3 = régime contenant 25 % de lipides dont 3,75 % de phospholipides.
DEROULEMENT DE L'ETUDE : Le poids des rats est mesuré au début et à la fin de l'étude. L'ingéré est mesuré (sur 3 jours) après 2 semaines et à la fin de l'étude. Des prises de sang sont effectuées au début de l'étude et après 3 semaines de régime sur les groupes RL et LGS 3.
Les fèces ont été récoltés (sur 4 jours) pendant l'avant dernière semaine, il ont été pesés et congelés à -20°C.
La mesure du coefficient d'absorption du cholestérol est effectuée sur les fèces collectés au début de la dernière semaine.
Après 6 semaines de régime, les animaux sont sacrifiés après un jour dé jeune, sous anesthésie : le foie (prise du poids puis congélation à -20°C) et environ 10 ml de sang (ponction à l'aorte abdominale) ont été prélevés. Le sérum est obtenu par centrifugation du sang total. Toutes les analyses sur sérums sont réalisées sur du sérum frais.
ANALYSES :
- Les triglycérides (G. BUCCOLO et al., Clin. Chem., 1973, 19, 476-482), les phospholipides (M. TAKAYAMA et al., Clin. Chem. Acta., 1977, 79, 93-98), le cholestérol total (J. SIEDEL et al, Clin. Chem., 1983, 29, 1075-1080) et le cholestérol libre (F. STAHLER et al., Med. Lag., 1973, 30, 29-37) de 20 rats (groupes RL et LGS 3) ont été dosés au temps initial et après 3 semaines de régime par méthodes enzymatique-colorimétrique.
- Les triglycérides, les phospholipides, le cholestérol total et le cholestérol libre du sérum de chaque rat ont été dosés après 6 semaines de régime à l'aide des mêmes méthodes.
- Les VLDL ( ery low density lipoproteins), LDL (low density lipo- proteins) et les HDL (high density lipoproteins) du sérum de chaque rat, ont été séparées (T. BROUSSEAU et al., Clin. Chem., 1993, 39, 960-964) en fin d'étude par ûltra- centrifugation séquentielle (VLDL : 436 000 g, 2,5h à 10°C ; LDL : 436 000 g, 2,5 h à 10°C ; HDL : 436 000 g, 5 h à 10°C) à l'aide d'une ultracentrifugeuse Beckman Optima TLX et du rotor TL- 100.2. Les triglycérides, les phospholipides, le cholestérol total et le cholestérol libre ont été dosés sur les différentes classes de lipoprotéines par les méthodes enzymatique-colorimétrique précitées.
- Les activités enzymatiques toxicologiques g-GT (JP. PRESIJN et al., J. Clin. Chem. Biochem., 1976, 14, 421-427), GOT (G. KESSLER et al., 9th Int.
Congr. Clin. Chem., Toronto, 1975), GPT (G. KESSLER et al., 9th Int. Congr. Clin. Chem., Toronto, 1975) et phosphatase alkaline (S. MORGENSTERN et al., Clin. Chem., 1965, 11, 876-881) ont été dosées sur le sérum des groupes RL et LGS 3 au temps initial et après 3 semaines de régime, et sur le sérum de chaque rat au bout de 6 semaines de régime.
- Environ 1 g du foie de chaque rat a été broyé dans de l'éthanol. Les triglycérides (G. BUCCOLO et al., Clin. Chem., 1973, 19, 476-482) et les phospholipides (J. AMIC et al., Clin. Chem. Acta., 1972, 40, 107-1 14) ont été dosés après extraction par la méthode de Folch (J. FOLCH et al., J. Biol. Chem., 1957, 226, 498- 509). Le cholestérol total (J. SIEDEL et al., Clin. Chem., 1983, 29, 1075-1080) a été dosé après saponification, extraction par de l'éther de pétrole, lavage par de l'éthanol/eau, évaporation et dissolution dans de l'isopropanol (L. CARA et al., Nutr. Res., 1991, 11, 907-916).
- Des aliquotes (préparations spécifiques) du foie de chaque rat ont été préparées afin de conserver des échantillons par congélation à -80°C pour des analyses éventuelles (HMGCoA red., ACAT, 7 a hydroxylase).
RESULTATS
EVOLUTION DU POIDS ET DE L'INGÉRÉ
Au début de l'étude, les moyennes des poids de chaque groupe de rats n'étaient pas significativement différentes (de 325 ± 2 g à 330 ± 2 g). Après 6 semaines de régime, le poids des rats des groupes II (419 ± 7 g) et 13 (414 ± 9 g) était significativement inférieur à celui du groupe LGS3 (444 ± 7 g).
Par contre, aucune différence significative n'apparaissait entre les groupes LGS, I et le régime témoin RL (425 ± 8 g). Les mêmes différences significa- tives apparaissaient au niveau du gain de poids (RL : 95 ± 9 g, LGS3 : 1 16 ± 9 g, Il : 92 ± 7 g, 13 :89 ± 9 g).
Les valeurs de l'ingéré du groupe PL après 2 semaines (41,2 ± 1,5 g) et 5 semaines (38,9 ± 0,9 g) étaient significativement supérieures aux valeurs de l'ingéré des autres groupes (de 25,3 ± 1,0 g à 31 ,7 ± 1,0 g). Le régime PL contenant moins de calories par gramme de régime, les rats de ce groupe ont augmenté leurs ingérés.
Les ingérés en LGS (en poudre) étaient les suivants : LGS 1 : 0,51 g/j ; LGS 2 : 1,04 g/j ; LGS 3 : 1,67 g/j, ce qui correspond aux quantités suivantes de phospholipides : LGS 1 : 0,28 g/j ; LGS 2 : 0,57 g/j ; LGS 3 : 0,92 g/j.
VARIATIONS DES PARAMÈTRES LIPIDIQUES SERIQUES Le Tableau V présente les valeurs des paramètres sériques des rats après 6 semaines de régime.
TABLEAU V
Figure imgf000035_0001
TABLEAU V (Suite)
Figure imgf000036_0001
Les valeurs représentent la moyenne ± SEM de 10 rats. Pour un paramètre, des lettres différentes indiquent des différences significatives.
Pour un paramètre, deux lignes de valeurs indiquent que les dosages ont été effectués dans deux laboratoires différents. PL = régime pauvre en lipides (3 %) ; RL — régime riche en lipides (25 %) ; LGS 1 — régime contenant 25 % de lipides dont 1,25 % de phospholipides sous forme de lipogélosomes® ; LGS 2 = régime contenant 25 % de lipides dont 2,5 % de phospholipides sous forme de lipogélosomes® ; LGS 3 = régime contenant 25 % de lipides dont 3,75 % de phospholipides sous forme de lipogélosomes® ; I 1 = régime contenant 25 % de lipides dont 1,25 % de phospholipides ; I 2 = régime contenant 25 % de lipides dont 2,5 % de phospholipides ; I 3 =* régime contenant 25 % de lipides dont 3,75 % de phospholipides.
L'ingestion des régimes riches en lipides ont induit une diminution significative des triglycérides du sérum des rats par rapport au régime pauvre en lipides alimentaires (Tableau VI). Ce résultat a été trouvé dans d'autres études (JL. VIGNE et al., Br. J. Nutr., 1987, 58, 405-413 ; F. CHANUSSOT et al., Am . Nutr. Metab., 1988, 32, 271-281 ; G. NALBONE et al., J. Nutr., 1988, 118, 809-817 ; G. NALBONE et al., Lipids., 1989, 24, 179-186), mais l'amplitude des variations dépend de la composition des régimes, de la souche de rats et de la durée des régimes. Le régime 12 a induit une augmentation significative des triglycérides du sérum par rapport aux régimes RL, LGS 1, 1 1 et I 3. L'analyse des lipides des différentes classes de lipoprotéines
(Tableau VI) montre que l'augmentation de la triglycéridémie avec le régime PL était due principalement à une augmentation significative des triglycérides des VLDL, et secondairement à une augmentation significative des triglycérides des LDL et des HDL. L'augmentation obtenue avec le régime I 2 est principalement due à une augmentation des triglycérides des VLDL. Par rapport au régime RL, le régime LGS 3 a induit une augmentation significative des triglycérides des LDL ; les régimes LGS 2, I 2 et I 3 ont provoqué une augmentation significative des triglycérides des HDL. L'augmentation de l'ingéré en LGS ou en I n'a induit que de faibles variations des triglycérides dans les différentes classes de lipoprotéines : il n'apparaît donc pas d'effet dose pour ce paramètre.
26
TABLEAU VI
Composition lipidique des lipoprotéines après 6 semaines de régime
CHOLESTEROL TOTAL (mM) CHOLESTEROL LIBRE (mM)
VLDL LDL HDL VLDL LDL HDL
PL 0,22a 0,54a " • l,15a 0,06a" 0,02a 0,19a
±0,03 ±0,05 ±0,04 ±0,02 ±0,07 ±0,07
RL 0,66b 0,55ab 0,8l""f 0,10" 0,07"" 0,1 1""
±0, 10 ±0,12 ±0,04 ±0,02 ±0,04 ±0,02
LGS 1 0,42" 0,7 lac 0,94""" 0,06ad 0,07"" 0,14""
±0,06 ±0,07 ±0,06 ±0,07 ±0,07 ±0,02
LGS 2 0,36a" 0,50ab" 0,96"" 0,03ac" 0,03a" 0,16ab
±0,04 ±0,08 ±0,05 ±0,07 ±0,02 ±0,01
LGS 3 0,37a" 0,40" 0,80"f 0,02" 0,0 r" 0,14""
±0,05 ±0,07 ±0,06 ±0,07 ±0, 07 ±0,01
I I 0,93" 0,65" 0,70f 0,07"" 0,10" 0,10"
±0, 11 ±0,09 ±0,02 ±0,07 ±0,01 ±0,07
1 2 0,47" 0,49ab 0,86""" 0,03acd 0,02a" 0,16a"
±0,03 ±0,06 ±0,03 ±0,07 ±0, 07 ±0,03
1 3 0,42" 0,36" l,02ae 0,03a" 0,03a" 0,2 r
±0,04 ±0,06 ±0,06 ±0, 07 ±0, 07 ±0,02
TABLEAU VI (suite')
CHOLESTEROL TRIGLYCERIDES PHOSPHOLIPIDES
ESTERIFIE ( mM) (mM) (mM)
VLDL LDL HDL VLDL LDL HDL VLDL LDL HDL
PL 0,16a 0,52ac 0,96a l,03a 0,13a 0,67a 0,3 lad" 0,5 la 0,99a
±0,02 ±0,05 ±0,04 ±0,16 ±0,02 ±0,06 ±0,04 ±0,03 ±0, 04
RL 0,56" 0,48ab"-ι 0,70""" 0,28bcde 0,07 cd 0,14" 0,26abee 0,38be 0,61be
±0,08 ±0,09 ±0,04 ±0,03 ±0,01 ±0,01 ±0, 02 ±0, 05 ±0,03
LGS 1 0,36" 0,64a 0,80" 0,26bce 0,05" 0,17"" 0,23bee 0,7 e 0,75"
±0,05 ±0,05 ±0,04 ±0,03 ±0,01 ±0,01 ±0,02 ±0,03 ±0,05
LGS 2 0,33" 0,47abc" 0,80e 0,35bcde 0,08ce 0,22"d 0,2 lbe 0,38"" 0,74"
±0,03 ±0,06 ±0,04 ±0,04 ±0,01 ±0,02 ±0, 02 ±0, 03 ±0,03
LGS 3 0,35" 0,39e" 0,66" 0,38bc" 0,10" 0,20bed 0,2 lbe 0,36be 0,69bd
±0,04 ±0,06 ±0,04 ±0,04 ±0,01 ±0,02 ±0,02 ±0,03 ±0,05
I I 0,86" 0,55a" 0,60b 0,24e" 0,08e" 0,13" 0,32" 0,50a 0,53"
±0,10 ±0,08 ±0,02 ±0,02 ±0,01 ±0,01 ±0,02 ±0,02 ±0,02
1 2 0,44"" 0,47abc" 0,70bc" 0,46" 0,09de 0,26d 0,28"" 0,42a" 0,72"
±0,02 ±0,05 ±0,03 ±0,05 ±0,01 ±0,03 ±0,07 ±0,03 ±0,03
1 3 0,39" 0,33" 0,81" 0,19" 0,06"" 0,22ed 0,20e 0,30b 0,78"
±0,03 ±0,05 ±0,06 ±0,02 ±0,01 ±0,01 ±0,02 ±0,03 ±0,04
Légende du Tableau VII : Les valeurs représentent la moyenne ± SEM (en italique) de 10 rats. Pour chaque colonne, des lettres différentes (en exposant) indiquent des différences significatives. VLDL = Very Low Density Lipoproteins ; LDL = Low Density Lipoproteins ; HDL = High Density Lipoproteins ; PL = régime pauvre en lipides (3 Vo) ; RL = régime riche en lipides (25 7o) ; LGS 1 = régime contenant 25 % de lipides dont 1,25 % de phospholipides sous forme de lipogélosomes® ; LGS 2 = régime contenant 25 % de lipides dont 2,5 % de phospholipides sous forme de lipogélosomes® ; LGS 3 = régime contenant 25 % de lipides dont 3, 75 % de phospholipides sous forme de lipogélosomes® ; 1 1 = régime contenant 25 % de lipides dont 1,25 % de phospholipides ; I 2 = régime contenant 25 % de lipides dont 2,5 % de phospholipides ; I 3 = régime contenant 25 % de lipides dont 3, 75 % de phospholipides.
Concernant les phospholipides du sérum (Tableau V), le régime pauvre en lipides a induit aussi une augmentation significative de ce paramètre par rapport aux régimes riches en lipides. Seul le régime 12 a provoqué une augmentation des phospholipides du sérum par rapport au régime RL.
Après séparation des différentes classes de lipoprotéines (Tableau VI), on a constaté que l'augmentation des phospholipides du groupe PL était essentiellement due à une augmentation quantitative des phospholipides des HDL. Cette classe de lipoprotéines contenant le plus de phospholipides, il est normal que l'augmentation soit retrouvée à ce niveau. Concernant les effets des LGS et des I, on a noté une augmentation significative des phospholipides des HDL avec les régimes LGS 1 , LGS 2, 1 2 et I 3 par rapport au groupe RL.
Le régime RL a induit une légère augmentation du cholestérol total du sérum par rapport au régime PL (Tableau V). Par rapport au régime RL, on a noté une diminution significative (-22,3 %) du cholestérol total du sérum avec le régime LGS 3. La diminution obtenue avec le régime I 3 a été moins importante (- 10,9 %).
Le Tableau VI montre que la diminution du cholestérol total obtenue avec le régime LGS 3 est due à une diminution significative du cholestérol total des VLDL et secondairement à une tendance à la diminution du cholestérol total des LDL. Par rapport au régime RL, la diminution du cholestérol total des VLDL+LDL à la suite de l'ingestion du régime LGS 3 était de 36,4 %. Par contre, aucune variation du cholestérol total des HDL n'a été notée à la suite de l'ingestion de ce régime.
Chez l'animal, les effets des phospholipides alimentaires dépendent aussi de la méthodologie utilisée. Si on compare les effets des régimes LGS 3 et I 3, il est important de noter que le régime LGS 3 a induit deux fois plus de diminution de la cholestérolémie. D'autre part, ces effets des LGS sur la cholestérolémie sont fonction de la dose ingérée. L'augmentation de l'ingéré en lipides alimentaires n'a pas induit de variation significative (sauf pour le régime LGS 3) du cholestérol libre du sérum (Tableau V).
Seul le régime LGS 3 a induit une diminution significative de 39 % du cholestérol libre du sérum par rapport au régime RL.
Par contre, les résultats des lipides des différentes classes de lipoprotéines (Tableau VI) montrent que suivant le régime ingéré, la répartition du cholestérol libre est différente.
La diminution du cholestérol libre du sérum à la suite du régime LGS 3 par rapport au régime RL est due à une diminution significative du cholestérol libre des VLDL et des LDL. Il faut aussi mentionner que, par rapport au régime RL, le régime 13 a induit une augmentation significative du cholestérol libre des HDL.
Concernant les variations du cholestérol estérifé du sérum (Tableau V), on a observé une diminution significative de 20 % à la suite de l'ingestion du régime LGS 3 par rapport au régime RL. Les régimes LGS 2, I 2 et I 3 tendent à induire une diminution de ce paramètre mais de manière non significative.
Avec le régime LGS 3, la diminution par rapport au régime RL est due à une diminution significative du cholestérol estérifié des VLDL et une tendance à la diminution au niveau des LDL et des HDL (Tableau VI). Toujours par rapport au régime RL, nous n'avons pas observé de variation significative du cholestérol estérifié des LDL et des HDL avec les régimes contenant des LGS ou des I.
Le Tableau V (suite) présente les résultats des paramètres toxico- logiques du sérum des rats au bout de 6 semaines de régime. Avec le régime PL, l'addition de lipides dans les régimes n'a pas induit d'augmentation de la phosphatase alcaline. Par contre, le régime I 1 a induit une diminution significative de ce paramètre par rapport aux régimes RL, LGS 1 et I 2.
Le régime RL a augmenté significativement l'activité GOT par rapport au régime PL.
Les autres régimes n'ont pas modifié significativement l'activité de cette transaminase par rapport au régime PL. Par contre, on a noté une forte diminu- tion significative (47 %) avec le régime LGS 3 par rapport au régime RL. Une diminution significative (30 %> ) a été aussi obtenue avec le régime I 3.
Par rapport au régime PL, le régime RL a induit une augmentation de l'activité GPT. Les régimes contenant des LGS ou des I n'ont pas modifié significativement l'activité de cette transaminase par rapport aux régimes PL et RL. Là encore, les valeurs les plus faibles ont été obtenues à la suite de l'ingestion des régimes LGS 3 et 1 3.
Concernant l'activité g-GT, la sensibilité de la méthode de dosage n'a pas permis de mesurer cette activité enzymatique, étant donné les trop faibles valeurs. Aucune activité de cette enzyme n'a été détectée quel que soit le régime ingéré.
Les résultats des dosages toxicologiques montrent que chez le rat, l'ingestion de LGS à ces doses ne sont pas toxiques. Les LGS ont même tendance à présenter un effet hépato-protecteur. VARIATIONS DES PARAMÈTRES LIPIDIQUES DES FOIES.
L'addition de lipides alimentaires dans les régimes induit une augmentation significative du poids des foies, alors que l'augmentation de la quantité de LGS tend à diminuer le poids des foies. Cette variation est plus prononcée avec l'augmentation de la quantité d'ingrédients (groupe I). Il faut rappeler qu'avec les groupes I, le poids des rats était plus faible. Il est donc normal que le poids des foies soit plus faible avec ces groupes.
TABLEAU VII Poids et lipides des foies des rats au bout de 6 semaines de régime
Figure imgf000043_0001
Les valeurs représentent la moyenne ± SEM de 10 rats. Pour un paramètre, des lettres différentes indiquent des différences significatives. PL = régime pauvre en lipides (3 %) ; RL - régime riche en lipides (25 %) ; LGS 1 = régime contenant 25 % de lipides dont 1,25 %> de phospholipides sous forme de lipogélosomes® ; LGS 2 = régime contenant 25 % de lipides dont 2,5 % de phospholipides sous forme de lipogélosomes® ; LGS 3 = régime contenant 25 % de lipides dont 3,75 % de phospholipides sous forme de lipogélosomes® ; I 1 = régime contenant 25 % de lipides dont 1,25 % de phospholipides ; I 2 - régime contenant 25 % de lipides dont 2,5 % de phospholipides ; I 3 = régime contenant 25 % de lipides dont 3,75 % de phospholipides.
Concernant le cholestérol total des foies, l'addition de lipides dans les régimes alimentaires induit une augmentation significative de la concentration (mg/g de foie) et de la quantité totale (mg/foie) en cholestérol total des foies (Tableau VI). Par rapport au régime RL, la concentration en cholestérol total a été augmentée significativement avec les régimes LGS 3, et les trois régimes I. Par contre, la quantité totale de cholestérol dans les foies n'est plus significative avec le régime I 3, alors qu'avec les autres groupes les différences significatives sont inchangées par rapport au régime RL.
L'augmentation de la quantité de lipides alimentaires a induit une augmentation significative de la concentration et de la quantité totale des triglycérides des foies (Tableau VI). Par rapport au régime RL, l'addition de LGS ou d'I a augmenté la concentration (mg/g de foie) en triglycérides des foies. Par contre, étant donné que le poids des foies était différent suivant les groupes, nous n'avons plus noté de différence significative au niveau de la quantité (mg/foie) de triglycérides des foies avec les groupes I 1 et l 3.
Les effets de différentes quantités de LGS ou des I sur les paramètres lipidiques des foies ne sont pas corrélés à la quantité ingérée.
Dans cette étude, l'ingestion de LGS n'a pas induit de variation significative du poids des foies. Cependant, les résultats obtenus montrent que les lipogélosomes ont des effets différents de ceux des ingrédients. CONCLUSION Cette étude montre plusieurs résultats importants :
- Les quantités de LGS utilisées (de 1,25 à 3,75 % dans les régimes) ne sont pas toxiques.
- Des effets métaboliques chez le rat sont obtenus avec 3,75 %> de phospholipides sous forme de LGS dans les régimes (rapport triglycérides sur phospholipides alimentaires de : TG / PL = 5,7). La dose 2,5 %> présente des effets moins marqués (TG / PL ≈ 9). Étant donné que le rat dispose d'un métabolisme lipidique bien régulé, il est probable que chez l'homme des effets soient observés avec des doses de 2,5 %>. Si nous considérons que l'homme ingère environ 100 g de triglycérides par jour, il faudrait ingérer environ 11 g de phospholipides sous forme de LGS pour espérer observer des effets (soit 20 g de LGS si les LGS contiennent 55 % de phospholipides).
- Les principaux effets des LGS sont observés au niveau du cholestérol plasmatique et sont fonction de la dose ingérée (cholestérol total : coefficient de corrélation R=0,91 ; cholestérol libre : R=0,98 ; cholestérol estérifié : R=0,88). Les diminutions concernent principalement les VLDL et les LDL.
- Une partie des effets induits par les LGS sur le métabolisme des lipides peuvent être comparés à ceux de la cholestyramine.
Le Tableau VIII ci-après illustre les effets des LGS sur les sels biliaires et les stérols.
TABLEAU VIII
Figure imgf000045_0001
* moyenne ± SEM de 10 rats, a, b, c différent significativement de la rangée qui précède respectivement à p<0,05, p<0,008, p<0,001.
L'ensemble des résultats de cette étude montrent que les LGS pré- sentent, de manière surprenante, les propriétés suivantes :
- Effets sur le métabolisme des lipides :
Diminution du cholestérol total (Tableau V) entre le régime témoin (RL) et la plus forte dose de LGS (LGS 3). De manière plus précise, les LGS 3 entraînent une diminution significative du cholestérol plasmatique total de l'ordre de 22 % et du cholestérol estérifié, de l'ordre de 20 %. Ces diminutions sont doses-dépendantes. En outre, les
LGS 3 entraînent une diminution du cholestérol total de VLDL de l'ordre de 44 % et du cholestérol total des LDL de l'ordre de 36 %.
Les LGS induisent une répartition favorable des lipides des différentes classes de lipoprotéines (Tableau VI).
- Absence de toxicité, effet hypotoxique :
Diminution avec LGS 3 de GOT (Tableau V suite) par rapport au témoin (RL), tendance à la diminution avec GPT.
- Dose efficace par voie orale : entre 2,5 et 3,75 % de phospholipides dans le régime.
- Diminution des rapports sels biliaires primaires/secondaires et stérols neutres primaires/stérols neutres secondaires (Tableau VIII) ; ces résultats indiquent un changement de la quantité et/ou de la qualité des bactéries intestinales en présence de LGS.
- On observe une augmentation de l'excrétion fécale des stérols neutres avec LGS 3, de l'ordre de +36 %, alors qu'il y a une diminution des acides biliaires fécaux de l'ordre de -17 %.
EXEMPLE 6 : Comparaison qualitative et quantitative de la dispersion de lipogélosomes® en phase aqueuse obtenue à l'étape 1 du procédé selon l'exemple 2, par rapport à une solution aqueuse reconstituée à partir d'une composition pulvérulente obtenue à l'étape 2 selon l'exemple 2.
TABLEAU IX
Figure imgf000047_0001
[PL] = concentration en phospholipides (kit enzymatique Biomérieux) ; [gélifiant] = concentration en gélifiant total (méthode colorimétrique de Lowry) ; altération profil lipidique : d'après HPLC des PL ; 0 nombre et polydispersité : d'après granulométrie par SCP ; aspect microscopie électronique : observations photographiques (microscopie électronique par coloration négative) ; (NS) = non significatif.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS 1°) Composition pulvérulente destinée à l'administration par voie orale, caractérisée : - en ce qu'elle est essentiellement constituée de liposomes unilamel- laires comprenant une phase lipidique externe constituée essentiellement de lipides de classe 4 (phospholipides), à l'exclusion des substances de classe 3 (cholestérol, acides gras à longue chaîne non ionisés) et des substances de classe 5 (sels biliaires, dérivés de l'acide fusidique) et un noyau aqueux interne formant un gel aqueux thermoréversible irradiant jusqu'à la phase lipidique externe, lequel noyau aqueux interne est constitué essentiellement d'un mélange M d'au moins deux agents gélifiants non-polymérisables Gl et G2, différents et dont le point de transition de phase gel-sol est supérieur ou égal à 37°C, Gl étant un agent gélifiant sélectionné parmi les gélatines et les carraghénanes et G2 étant sélectionné parmi des carraghénanes ayant des propriétés différentes des carraghénanes sélectionnés pour Gl, et les celluloses, lesquels liposomes ont un diamètre compris entre 20 nm et 1 mm, de préférence compris entre 50 nm et 500 nm ; et - en ce qu'elle se présente sous la forme d'unités particulaires ayant un diamètre moyen compris entre 10 mm et 1 000 mm, formées d'un ou plusieurs desdits liposomes, entourés d'une gangue sélectionnée dans le groupe constitué par un gel aqueux thermoréversible déshydraté identique au gel aqueux dudit noyau interne, des dextrines ou un mélange de ceux-ci, de telle sorte qu'elle comprend, en moyenne, 1016 à 1018 liposomes/g de poudre. 2°) Composition pulvérulente selon la revendication 1 , caractérisée en ce que ledit noyau aqueux interne des liposomes comprend, en outre, au moins un agent stabilisant de nature osidique, et/ou au moins un agent de régulation de l'osmolarité du milieu et/ou au moins un agent tensioactif. 3°) Composition pulvérulente selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend en %> (m/m) : 25 à 75 % de lipides de classe 4, 5 à 45 %> d'agents gélifiants, 0 à 70 %> d'agent stabilisant de nature osidique, 0 à 15 %> d'agent de régulation de l'osmolarité du milieu, 0 à 20 % d'agents tensio- actifs et 0 à 15 %> de dextrines. 4°) Composition pulvérulente selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend 70 à 95 % d'agent gélifiant Gl et 5 à 30 % d'agent gélifiant G2. 5°) Composition pulvérulente selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'agent stabilisant de nature osidique est du saccharose, du tréhalose ou tout autre agent de protection. 6°) Composition pulvérulente selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 5, caractérisée en ce que les lipides constituant la phase lipidique externe desdits liposomes, comprennent de préférence, 20 à 25 % de phosphatidylcholine, 10 à 18 % de phosphatidyléthanolamine et 9 à 15 % de phosphatidylinositol. 7°) Composition pulvérulente selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les lipides constituant la phase lipidique externe desdits liposomes, comprennent des phospholipides purifiés, seuls ou en mélange, de préférence dans les mêmes proportions que celles définies à la revendication 6. 8°) Procédé de préparation d'une composition pulvérulente selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle la gangue externe des unités particulaires comprend une fraction de gel aqueux thermoréversible déshydraté, carac- térisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (1) préparation d'une dispersion de liposomes à noyau interne gélifié en phase aqueuse par (a) préparation d'une solution d'au moins un agent gélifiant convenable, notamment un mélange M d'agents gélifiants Gl et G2, par dissolution desdits agents gélifiants, sous agitation lente, à une température supérieure à la tempé- rature de transition de phase gel-sol desdits agents gélifiants dans une solution aqueuse, (b) incorporation des lipides dans la solution obtenue en (a), sous agitation lente du mélange, pendant une période inférieure à 5 heures, de préférence sous vide et formation d'une émulsion et (c) obtention de la dispersion de liposomes à noyau interne gélifié dans une phase aqueuse contenant lesdits agents gélifiants, par agitation rapide de l'émulsion obtenue en (b), de préférence sous vide et 4S (2) obtention du produit pulvérulent par séchage direct convenable de la dispersion obtenue. 9°) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'étape (2) de séchage est réalisée par atomisation, coacervation, couche mince ou granulation. 10°) Procédé de préparation d'une composition pulvérulente selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle la gangue externe des unités particulaires comprend une fraction de gel aqueux thermoréversible et/ou une dextrine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(1) préparation d'une dispersion de liposomes à noyau interne gélifié en phase aqueuse par (a) préparation d'une solution d'au moins un agent gélifiant convenable, notamment un mélange M d'agents gélifiants Gl et G2, par dissolution desdits agents gélifiants, sous agitation lente, à une température supérieure à la température de transition de phase gel-sol desdits agents gélifiants dans une solution aqueuse, (b) incorporation des lipides dans la solution obtenue en (a), sous agitation lente du mélange, pendant une période inférieure à 5 heures, de préférence sous vide et formation d'une émulsion et (c) obtention de ladite dispersion de liposomes à noyau interne gélifié en phase liquide aqueuse contenant lesdits agents gélifiants, par agitation rapide de l'émulsion obtenue en (b), de préférence sous vide,
(2) élimination, au moins en partie, de la phase liquide aqueuse contenant lesdits gélifiants et dans laquelle sont dispersés lesdits liposomes
(3) ajout d'au moins une dextrine convenable et
(4) obtention du produit pulvérulent par séchage par atomisation de produit obtenu en (3).
11°) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'étape (2) d'élimination d'au moins une partie de la phase liquide aqueuse contenant lesdits agents gélifiants est réalisée par dilution et/ou par filtration.
12°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que la solution aqueuse de l'étape (a) comprend un agent de régulation de l'osmolarité du milieu (NaCl à 0,9 %>, par exemple) et/ou un agent stabilisant de nature osidique. 13°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que l'étape (b) est effectuée, de préférence, à une vitesse de cisaillement inférieure à 200 s"1.
14°) Complément nutritionnel apte à réguler la cholestérolémie et la triglycéridémie, caractérisé en ce qu'il comprend une composition pulvérulente selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, éventuellement associée à un excipient approprié.
15°) Compositions pharmaceutiques destinées à être administrées par voie orale comprenant une composition pulvérulente selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et au moins un véhicule approprié.
16°) Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la préparation d'un médicament destiné à être administré par voie orale pour le traitement des hypercholestérolémies et/ou des hypertryglycéri démies . 17°) Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la préparation d'un adjuvant des traitements utilisant un ou plusieurs principes actifs provoquant l'augmentation des transaminases ou de tout autre marqueur toxique.
18°) Complément nutritionnel selon la revendication 14 ou composi- tions pharmaceutiques selon la revendication 15, caractérisés en ce qu'ils se présentent soit sous une forme solide (gélule, comprimé, poudre à dissoudre ans l'eau), soit sous une forme liquide, par redissolution des compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans une solution aqueuse.
19°) Dispersion de liposomes à noyaux internes gélifiés dans une solution aqueuse contenant le mélange d'agents gélifiants tels que définis à la revendication 1 , dans laquelle lesdits liposomes présentent la morphologie suivante :
. structure vésiculaire de diamètre compris entre 20 nm et 1 mm, de préférence entre 70 et 200 nm, et
. polydispersité des liposomes à phase interne gélifiée comprise entre 10 et 55 %, de préférence entre 30 et 50 %>.
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