WO1998053064A1

WO1998053064A1 - Transporteur d'anions organiques et gene codant pour ce dernier

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Publication number: WO1998053064A1
Application number: PCT/JP1998/002171
Authority: WO
Inventors: Hitoshi Endou; Yoshikatsu Kanai; Takashi Sekine; Makoto Hosoyamada
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co., Ltd.
Priority date: 1997-05-23
Filing date: 1998-05-18
Publication date: 1998-11-26
Also published as: US6986997B1; AU7238498A; US20060057677A1

Description

明細書有機陰イオントランスポー夕一およびその遺伝子技術分野

本発明は腎臓における有機陰イオンの輸送に関与する遺伝子と、その遺伝子がコ一ドするポリべプチドに関する。

背景技術

腎臓は、生体異物や薬物の体外への排出に関して、重要な役割を果たしている。ァニオン性の薬物は、担体を介した経路で腎臓近位尿細管から尿中へ排出されている。このような有機陰イオンの排出は、尿細管細胞がその側底膜を介して、有機陰ィォンを尿細管周囲の血液から取り込むことから始まる。

側底膜における有機陰ィオンの取り込みについては、例えば基質の有機陰イオンとしてパラアミノ馬尿酸を使い、摘出臓器かん流法や単離細胞膜小胞系などを用いた実験により研究されてきた。この研究の中で、有機陰イオンの取り込みには、有機陰イオントランスポ一夕一が関与していること、また、側底膜における有機陰イオンの取り込みは、有機ァ二オンとジカルボン酸の交換輸送体によって介されると考えられてきた。しかし、従来の手法では、尿細管における輸送機構の詳細、例えばトランスポー夕一間での輸送のネットワークゃ腎排泄過程における薬物間の相互作用などを解析することは困難であり、有機陰イオントランスポ —夕一の遺伝子を単離して詳細な機能解析を可能とすることが望まれていた。

肝臓で発現している有機陰イオントランスポ一夕一遺伝子については、種々の分子種がクロ一ニングされている（Hagenbuchら、 Proc. Natl .

Acad. Sci . USAヽ第 88卷、 10629頁、 1991年； Jacqueminら、 Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 第 91巻、 133頁、 1994年）。また、腎臓および肝臓に発現する有機陽イオントランスポー夕一の一つである O C T 1の遺伝子クローニングが報告されてい（Grundemannら、 Nature、第 372卷、 549頁、

1994年）。

また、ジカルボン酸のトランスポ一夕一として、腎臓のナトリウム依存性ジカルボン酸トランスポ一夕一（N a D C— 1 )の遺伝子クロ一ニングが報告されている（Pajorら、 J. Biol . Chem.、第 270巻、 5779頁、 1995 年)。

また、最近、ナトリウム非依存性ラット肝有機陰イオントランスポー夕一 (oatp)の類縁遺伝子として、ラットの腎尿細管に局在する有機陰イオントランスポーター O A T— K 1の遺伝子のクロ一ニングが報告された ( Saitoら、 J. Biol . Chem.ヽ第 270卷、 20719頁、 1996年）。しかしながら、この O A T— K 1については、その輸送機構が、有機ァニオンとジカルボン酸の交換輸送によるものであるとは確認されていない。

発明の開示

本発明の目的は、腎臓における有機陰イオン輸送に関与する新規な有機陰ィオントランスポ一夕一遺伝子およびその遺伝子がコ一ドするポリぺプチドである有機陰イオントランスポ一夕一を提供することにある。その他の目的については、以下の記載より明らかである。

本発明者らは、ラット腎臓細胞から、有機陰イオンを輸送する能力を有する新規タンパク質の遺伝子をクローニングし、さらにヒトの相同遺伝子（ホモログ）をクローニングした。さらに、これら遺伝子の産物をァフリカツメガエルの卵母細胞中で発現させて有機陰イオンの輸送能を確認することに成功し、本発明を完成するにいたった。

すなわち、本発明は、以下の（A)、（B)、（C)および（D)から選択されるタンパク質である。

(A)配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。

( B )配列番号 1で示されるアミノ酸配列において 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ有機陰イオンを輸送する能力を有するタンパク質。

( C )配列番号 2で示されるァミノ酸配列からなるタンパク質。

(D)配列番号 2で示されるアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ有機陰イオンを輸送する能力を有するタンパク質。

また、本発明は、以下の（a)、（b)、（ c)および（d)から選択される D N Aからなる遺伝子である。

(a)配列番号 1で示される塩基配列からなる DNA。

(b)配列番号 1で示される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ有機陰イオンを輸送する能力を有するタンパク質をコ一ドする DNA。

( c )配列番号 2で示される塩基配列からなる D N A。

(d)配列番号 2で示される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ有機陰イオンを輸送する能力を有するタンパク質をコードする DNA。

本発明の有機陰イオンを輸送する能力を有する新規タンパク質、すなわち有機陰イオントランスポーター（0 AT 1 ： Organic Anion

Transporter 1)は、生体内においては腎臓の尿細管で主に発現している ( また、有機陰イオントランスポー夕一 OAT 1は、その有機陰イオン輸送能 (発現細胞への有機陰イオン取り込み)が細胞内ジカルボン酸の存在によって活性化される。このことから、有機ァニオンとジカルボン酸の交換輸送を行うトランスポー夕一であると考えられる。また、交換輸送に際しては、 OAT 1によって有機陰イオンと交換に細胞外にだされるジカルボン酸は、ナトリウム依存性ジカルボン酸トランスポ一夕一（N aDC- 1 )によって細胞に取り込まれ、リサイクルされると考えられる, また、本発明の有機陰イオントランスポ一夕一 OAT 1は、環状塩基、プロスタグランジン、尿酸のほか、抗生物質、非ステロイド系抗炎症薬、利尿薬、抗腫瘍薬等種々の異なる構造を持った薬物に対してこれらを輸送する（取り込む)能力を有する、非常に広い範囲の基質選択性を有するものである。

また、本発明の有機陰イオントランスポー夕一 0 AT 1は、既に報告されているラヅト腎の有機陰イオントランスポ一夕一 OA T— K 1とは、相同性がなく、全く別の分子種であると考えられる。

図面の簡単な説明

図 1はラヅトのナトリゥム依存性ジカルボン酸塩トランスポー夕一（ r NaDC- 1 )遺伝子の cRN Aを注入した卵母細胞によるグルタル酸の取り込み実験の結果を示す図である。

図 2はラット腎組織由来 mRNAおよび/またはラット NaDC— 1 遺伝子の cRN Aを注入した卵母細胞によるパラアミノ馬尿酸 (以下、

"PAH" と略す）の取り込み実験の結果を示す図である。

図 3はラヅト有機陰イオントランスポ一夕一◦ AT 1の疎水性プロヅトを示す図である。

図 4はラッ卜の各臓器組織における OAT 1遺伝子 mRNAの発現をノーザンプロッティングにより解析した結果を示した電気泳動の写真であ。

図 5はラヅト OAT 1遺伝子 cRN Aを注入した卵母細胞による PAH の取り込み実験においてグルタル酸とのプレインキュベーシヨンの影響および rNaDC— 1との共発現の効果を調べた結果を示す図である。図 6はラット OAT 1遺伝子 cRN Aを注入した卵母細胞による PAH の取り込み実験において添加するナトリゥム塩の影響を調べた結果を示す図である。

図 7はラット OAT 1遺伝子 cRN Aを注入した卵母細胞による PAH の取り込み実験において基質 P A Hの濃度の影響を調べた結果を示す図である。

図 8はラヅト OAT 1遺伝子 cRN Aを注入した卵母細胞による PAH の取り込み実験において、系への各種薬物添加の影響を調べた結果を示す図である。

図 9は基質として各種薬物を用いた場合の、ラット OAT 1遺伝子の c R N Aを注入した卵母細胞による放射能標識化合物の取り込み実験の結果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

後記配列表の配列番号 1は、ラットの腎臓由来の有機陰イオントランスポ一夕一（ラット OAT 1)の遺伝子の全長 cDN A塩基配列 (約 2.2 k bp), およびその翻訳領域にコードされたタンパク質のアミノ酸配列

(551アミノ酸）を表す。

配列番号 2は、ヒトの腎臓由来の有機陰イオントランスポーター (ヒト OAT 1)の遺伝子の全長00 八塩基配列（約2.2¾13 ）、およびその翻訳領域にコードされたタンパク質のアミノ酸配列（563アミノ酸）を表す。前記配列番号 1および 2に示される塩基配列もしくはァミノ酸配列について、既知 DNAデータベース（G e nB ankおよび EMB L)およびプロティンデ一夕ベース（NBRFおよび SWI S S— PROT)に含まれる全ての配列に対してホモロジ一検索を行った結果、一致するものはなく、これら配列は、新規なものであると考えられる。

本発明のタンパク質としては、配列番号 1または 2で示されたァミノ酸配列を有するもののほか、例えば配列番号 1または 2で示されたアミノ酸配列において 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、有機陰イオン輸送活性が失われない程度であればよく、通常 1〜約 110個、好ましくは 1〜約 55個である。このようなタンパク質は、配列番号 1または 2で示されたアミノ酸配列と通常、 80% 以上、好ましくは 90%以上のアミノ酸配列のホモロジ一を有する。また、本発明の遺伝子としては、配列番号 1または 2で示された塩基配列を有する DNAを含むもののほか、配列番号 1または 2で示された塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし得る DNAを含むものが挙げられる。このようにハイプリダイズし得る DNAは、その DNAにコ一ドされるタンパク質が有機陰イオンを輸送する能力を有するものであればよい。このような DNAは、配列番号 1または 2で示された塩基配列と、通常、 70%以上、好ましくは 8

0 %以上の塩基配列のホモロジ一を有する。このような DNAとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。

本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイプリダイゼーシヨンは、通常のストリンジェントな条件（口一ストリンジェントな条件）では、ハイプリダイゼーシヨンを、 5xSSCまたはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼ一ション溶液中、 37— 42 °Cの温度条件下、約 1 2時間行い、 5x S S Cまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、 1 X S S Cまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。また、より高いストリンジェンシ一を有する条件（ハイストリンジェントな条件）では、前記において、洗浄を 0.1 X S S Cまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で行うことにより実施できる。

本発明の有機陰イオントランスポー夕一遺伝子は、適当な哺乳動物の腎臓の組織や細胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。哺乳動物としては、ィヌ、ゥシ、ゥマ、ャギ、ヒッジ、サル、ブ夕、ゥサギ、ラットおよびマウスなどの非ヒト動物のほか、ヒ卜が挙げられる。

遺伝子のスクリーニングおよび単離は、発現クローニング (Expression Cloning)などにより好適に実施できる。

例えば、ラット腎臓組織を遺伝子源として用い、これから mRNA (ポリ（A)^TRNA)を調製する。これを、分画し、各画分について、ラットナトリウム依存性ジカルボン酸塩トランスポ一夕一（rNaD C— 1 )の。

RNAとともに、ァフリカヅメガエルの卵母細胞に導入する。

NaD C— 1遺伝子の cDNAはすでに報告されている（Pajorら、 J.

Biol. Chem.、第 270卷、 5779頁、 1995年）ので、この配列情報から、 PC

R法などを用いて、容易に NaDC— 1遺伝子の cDNAを得ることが可能である。得られた NaDC— lcDNAから、 T 3または T 7 RNAポリメラ一ゼ等を用いて、これに相補的な RNA(cRNA) (キャップ化されたもの）を合成できる。 mRNAと、 NaDC— lcRNAを導入した卵母細胞について、例えば P A Hなどを基質 (有機陰ィオン）として、細胞内への基質の輸送 (取込み）を測定し、高い取り込みを示した mRNAの画分を選択することにより、 OAT 1の mRNAを濃縮できる。この濃縮された mRNAをもとに、 cDNAライブラリ一を作製する。ライブラリ一の cDNAから、 cRNA

(キャップ化されたもの）を調製し、各々のクローンについて、前記と同様にして、 NaDC— lcRNAとともに卵母細胞に導入し、基質の取り込み活性を指標として、陽性クローンを選択することにより、 OAT 1 遺伝子の cDN Aを含むクローンを得ることができる。

得られた cDN Aについては、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質、すなわち、 0 AT Iのァミノ酸配列を決定することができる。

得られた cDNAが、有機陰イオントランスポー夕一遺伝子の cDN A であること、すなわちは c D N Aにコードされた遺伝子産物が有機陰ィォントランスポー夕一であることは、例えば次のようにして検証することができる。すなわち、得られた OAT 1遺伝子の cDNAから調製した c R N Aを卵母細胞内に導入して発現させ、有機陰ィォンを細胞内へ輸送する（取り込む)能力を、前記と同様、適当な有機陰イオンを基質とする通常の取込み試験 (Kanai and Hediger, Nature, 第 360卷、 467- 471頁、 1992年）により、細胞内への基質の取り込みを測定することにより確認でぎる。

また、発現細胞について、同様の取り込み実験を応用して、 OAT 1 の特性、例えば、 OAT 1がジカルボン酸との交換輸送を行っているという特性や、 OAT 1の基質特異性などを調べることができる。

得られた OAT 1遺伝子の cDNAを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当な cDN Aライブラリーまたはゲノミック DNAライブラリ一をスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。

また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列 (配列番号 1および 2に示された塩基配列、もしくはその一部）の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常の P CR(Polymerase Chain Reaction)法により c DNAライブラリーまたはゲノミック DNAライブラリ一から遺伝子を単離することができる。

cDNAライブラリ一およびゲノミヅク DNAライブラリー等の DNA ライブラリ一は、例えば、「モレキュラークロ一ニング（Molecular C loning)j (Sambrook, J.， Fritsch, E. F.および Maniatis, T. 著、 Cold Spring Harbor Laboratory Pressより 1989年に発刊）に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリ一がある場合はこれを用いてもよい。

本発明の有機陰イオントランスポ一夕一（OAT 1 )は、例えば、有機陰イオントランスポ一夕一をコードする cDNAを用い、遺伝子組換え技術により生産することができる。例えば、有機陰イオントランスポ一夕 —をコ一ドする DNA(cDNA等）を適当な発現ベクターに組み込み、得られた組換え DN Aを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリべプチドを生産するための発現系（宿主一べク夕一系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、昆虫細胞および哺乳動物細胞を用いることが好ましい。

例えば、ポリペプチドを哺乳動物細胞で発現させる場合には、有機陰イオントランスポー夕一をコードする DNAを、適当な発現べクタ一 (例えば、レトロウイルス系ぺク夕一、パピ口一マウィルスベクタ一、ワクシニアウィルスベクタ一、 SV40系べクタ一等）中の適当なプロモー夕 —(例えば、 SV40プロモー夕一、 LTRプロモ一夕一、ェロンゲーシヨン 1ひプロモー夕一等）の下流に挿入して発現べクタ一を構築する。次に、得られた発現ベクターで適当な動物細胞を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とするポリべプチドが生産される。宿主とする哺乳動物細胞としては、サル COS— 7細胞、チヤィニ一ズハムス夕一 CHO細胞、ヒト HeLa細胞または、腎臓組織由来の初代培養細胞やプ夕腎由来 LLC— PK 1細胞、フクロネズミ腎由来 OK細胞等の細胞株等が挙げられる。

有機陰イオントランスポー夕一 0 AT 1をコ一ドする DNAとしては、例えば、配列番号 1および 2に示される塩基配列を有する cDN Aを用いることができるほか、前記の cDN A配列に限定されることなく、ァミノ酸配列に対応する D N Aを設計し、ポリペプチドをコードする D N Aとして用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々 1〜6種類知られており、用いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つ D N Aは、 DNAの化学合成、前記 cDNAの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコ一ドする合成ォリゴヌクレオチドからなるプライマ一を利用して部位特異的変異導入法（site specific mutagenesis) (Mark, D. F. et al.、 Proceedings of National Academy of Sciences、第 81卷、第 5662〜5666頁（1984年））等によって実施できる。

本発明の有機陰イオントランスポー夕一遺伝子にストリンジェントな条件下でハイプリダイズするヌクレオチド（ォリゴヌクレオチドもしくポリヌクレオチド）は、有機陰ィオントランスポ一夕一遺伝子を検出するためのプローブとして使用できるほか、有機陰イオントランスポ一夕一遺伝子の発現を変調させるために、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドゃ、リボザィム、デコイとして使用することもできる。このようなヌクレオチドとしては、例えば、配列番号 1または 2で示される塩基配列の中の通常、連続する 1 4塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドを用いることができ、ハイプリダイズをより特異的とするためには部分配列としてより長い配列、例えば 2 0塩基以上あるいは 3 0塩基以上の配列を用いてもよい。

また、本発明の有機陰イオントランスポ一夕一またはこれと免疫学的同等性を有するポリべプチドを用いて、その抗体を取得することができ、抗体は、有機陰イオントランスポ一夕一の検出や精製などに利用できる。抗体は、本発明の有機陰イオントランスポ一夕一、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチド等を抗原として用いて製造できる。ポリクローナル抗体は、宿主動物 (例えば、ラットやゥサギ等）に抗原を接種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造することができる。また、モノクローナル抗体は、通常のハイプリドーマ法などの技術により製造できる。

以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。

なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「モレキユラ一クロ一ニング ( Molecular C loning)」 (Sambrook, J. , Fritsch, E.F.および Maniatis, T. 著、 Cold Spring Harbor Laboratory Pressより 1989年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬ゃキヅトを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。

実施例

実施例 1 ラヅト有機陰イオントランスポ一夕一のクロ一ニング

( 1 )ラットジカルボン酸塩トランスポー夕一 cDNAの単離と cRNAの

cDNAライブラリ一は、ラットポリ（A)+RNAから、 cDNA合成用キット（商品名： Superscript Choice System^ ギブコ社製）を使用して作成し、ファ一ジベクターえ Z i p 1 ox(ギブコ社製）の制限酵素 EcoR

I切断部位に組み込んだ。 PCR法にて、ゥサギのナトリウム依存性ジカルボン酸トランスポーター NaD C— 1遺伝子（Pajorら、 J. Biol.

Chem.、第 270卷、 5779頁、 1995年）の第 1323— 1763番目の塩基に相当するセグメントを³" P— dCTPでラベルし、これをプロ一プとして用いて、ラットの cDNAライブラリ一をスクリーニングした。ハイブリダイゼ一ションは、 37 °Cのハイブリダイゼ一ション用溶液中でー晚行い、フィル夕一膜は、 37°Cで 0.1 XSSC/O, 1%SDSで洗浄した。ハイブリダィゼ一シヨン用溶液としては、 5xSSC、 3xデンハード液（Denhard's液）、 0.2% SDS、 10%硫酸デキストラン、 50

%ホルムアミド、 0.01% Ant i f 0 rm B (商品名、シグマ社製）（消泡剤）、 0.2mg/ml サーモン精子変性 DNA、 2.5mM ピロリン酸ナトリウム、 25mM ME Sを含む pH6.5の緩衝液を用いた。入

Ziploxファージに組込まれた cDNA部分を、塩基配列決定のために、プラスミド pZL lに組み込み、さらにプラスミド pBluescriptl I SK

— ( Stratagene社製）へサブクローン化した。

上記により得られたラットジカルボン酸塩トランスポーターの cDN A を含むプラスミドから、 T 7RNAポリメラ一ゼを用いて、 cRNA(cD N Aに相補的な RN A)を調製した。

得られた cRNAを、金井らの方法（Kanai and Hediger, Nature^ 第 360卷、第 467-471頁、 1992年）に準じて、アフリカヅメガエルの卵母細胞に注入し、この卵母細胞について、基質としてグルタル酸を用いる取り込み実験を行った。実験には、放射能ラベルした基質い ⁴ C-グルタル酸）を用い、また取り込み溶液として、ナトリウムイオンの影響を調べるためのナトリウムの取り込み溶液（ 96mM塩化ナトリウム、 2mM塩化力リウム、 1.8mM塩化カルシウム、 ImM塩化マグネシウム、 5mM H EPES、 pH7.4)、塩化コリンイオンの影響を調べるための塩化コリン取り込み溶液（96mM塩化コリン、 2mM塩化カリウム、 1.8mM 塩化カルシウム、 ImM塩化マグネシウム、 5mM HEPES、 pH7.4) を用い、これらに¹⁴ C—グルタル酸を 1 mM濃度で添加して試験液とした < コントロールには RNAを注入しない卵母細胞を用いた。

その結果を図 1に示す。図 1から明らかなように、塩化コリン取り込み溶液では rNaDC— 1の cRN Aを注入した卵母細胞とコントロールのレ、ずれにおいてもグル夕ル酸の取り込みが認められなかった。これに対し、ナトリゥム取り込み溶液では r NaDC— 1の cRNAを注入した卵母細胞において著しいグルタル酸の取り込みが認められた。すなわちグル夕ミン酸の取り込みがナトリゥム依存性であることが示され、クロ —ニングした cDN Aがラヅトジカルボン酸塩トランスポ一夕一遺伝子のものであることが確認できた。

(2)ラヅト腎臓有機陰イオントランスポ一夕一 0 AT 1のクロ一ニング金井らの方法 (Kanai and Hediger、 Nature, 第 360巻、第 467-471頁、 1992年）に準じて、発現クローニング法により以下のようにして行った。ゲル電気泳動によりラヅト腎臓ポリ（A)^TRN A 400〃gを分画した。分画により得られた各画分を、上記（1)で得られたラットジカルボン酸塩トランスポーターの cRN Aと共に卵母細胞に注入した。卵母細胞は、基質として ImM グルタル酸を含むナトリウム取り込み溶液（96 mM 塩ィ匕ナトリウム、 2mM塩化カリウム、 1.8mM塩化カルシウム、 ImM 塩化マグネシウム、 5mM HEPE S、 pH7.4)中にて予め 2時間前培養したものを用いた。

RN A注入した卵母細胞について、基質として PAHを用い、基質の取り込み実験を金井らの方法 (Kanai and Hediger. Nature, 第 360卷、第 467- 471頁、 1992年）に準じて、以下のようにして行った。基質として¹⁴ C-P AH( 50 /M)を含みグルタル酸を含まないナトリゥム取り込み溶液中にて 1時間卵母細胞を培養して、細胞内に取り込まれた放射能のカウントで基質の取り込み率を測定した。その結果、図 2に示すように、この系において、ラット腎臓のポリ（A)^TRNA(mRNA)だけを注入した卵母細胞、および、ラヅトジカルボン酸塩トランスポ一夕一の cRNA のみを注入した卵母細胞では、 PAHの取り込みは見られなかったのに対して、ラット腎臓のポリ（A)⁺RNAとラヅトジカルボン酸塩トランスポー夕—の c _R N Aの両者を注入した卵母細胞では P A Hの取り込みが認められることを確認した。コントロールには RNAを注入しない卵母細胞を用いた。

分画により得られた各 RN A画分のうち RN Aを注入した卵母細胞が、最も高い P A Hの取り込み率を示した画分を選択した。この画分のポリ

(A)^TRNA( 1.8〜2,4kb)について、 cD N A合成およびプラスミドクローニング用キット（商品名： Superscript Plasmid System、ギブコ社製）を使用して、 cDNAのライブラリ一を作成した。これら DNAはプラスミド pSPORT 1(ギブコ社製）の制限酵素 Sailおよび Not I認識部位に組み込み、得られた組換えプラスミド DNAを大腸菌 DH 10 B株のコンビテントセル（商品名： Electro Max DH10B Competent cell、ギブコ BRL社製）に導入した。得られた形質転換体をニトロセルロース膜上で培養し、 1プレート当たり約 500個のコロニーが得られた。これらコロニーから、プラスミド DNAを調製し、これらを制限酵素 Not

Iで切断した。得られた DNAを用いて、 in vitro転写により、キヤヅプ化された cRN Aを合成した。

得られた cRN A (約 1 Ong)を、上記（1)で得たラヅトジカルボン酸塩トランスポ一夕一の cRNA( 2ng)と共に卵母細胞へ注入した。これら卵母細胞について、前記と同様にして、 PAHの取り込み実験を行うことにより陽性クローンのスクリ一ニングを行った。スクリ一ニングに際しては、複数のクローンから抽出した DN Aをプールしたグループについて調べ、あるグループで PAHの取り込みが確認された場合、さらにそれを複数のグル一プに分割し、さらにスクリ一ニングを行った。

スクリーニングの結果、 8000個のクローンから 1つの陽性クロ一ン（cRN Aを注入した卵母細胞で基質の取り込みが認められるクローン）が単離された。

得られたクローン、すなわち、ラットジカルボン酸塩トランスポ一夕 — OAT 1の cDN Aを含むクローンについて、塩基配列決定のための欠失クローン作製用キット（商品名： Kilo-Sequense Deletion Kit、宝酒造社製)、合成プライマ一、塩基配列決定用キット（商品名： Sequenase ver.2.0、アマシャム社製）を用いてダイデォキシ法により、 cDNAの塩基配列を決定した。

これにより、ラットジカルボン酸塩トランスポー夕一 0 AT 1遺伝子の cDN Aの塩基配列が得られた。また、 cDNAの塩基配列を常法により解析して、 cDNA上の翻訳領域とそこにコードされる OAT 1のアミノ酸配列を決定した。これら配列を、後記配列表の配列番号 1に示した。疎水性プロヅト（Kyte- Doolittle hydropathy analysis)により、 OA T 1のアミノ酸配列を解析した結果、図 3に示したように、 12個の膜貫通領域 (membrane- spanning domains)が予測された。また、 5つの糖鎖付加部位が最初の親水性ループに予測された。 6番目と 7番目の膜貫通領域（transmembrane domains)の親水基のル一プにプロティンキナーゼ C 依存性のリン酸化部位と考えられる部位が 4つあった。

( 3 )種々の組織における 0 A T 1遺伝子の発現（ノ一ザンブロティングによる解析）

ラット OAT 1遺伝子の全長 cDNAを³² P— dCTPでラベルし、これをプロ一ブとして用いて、ラッ卜の種々の組織から抽出した RNAに対してノーザンブロッティングを以下のように行なった。 3 zgのポリ

(A)^TRNAを 1 %ァガロ一スホルムアルデヒドゲルで電気泳動したのち、ニトロセルロースフィル夕一にトランスファ一した。このフィル夕一を 42°Cで、 ³²P- dCTPでラベルした全長の OAT lcDNAを含んだハイブリダイゼーション液で 1晚ハイブリダイゼ一シヨンを行った。フィルターを、 65°Cにて、 0.1%SDSを含む 0. lxSSCで洗浄した。

ノーザンプロティングの結果、図 4に示すように、腎臓において、 2.

4 kb付近と 3.9 kbと 4.2 kbに相当する 2つのバンドが検出され、発現が認められた。腎臓の皮質と髄質外層では OAT 1 mRNAの発現量が多く、髄質内層では少なかった。

さらに長時間の感光で、脳において 2.4kb付近にかすかなバンドが検出されたが、その他の組織ではバンドは検出されず、発現は認められなかった。

(4)腎組織における OAT 1遺伝子の発現（In situハイブリダィゼーシヨンによる解析）

In situハイブリダィゼ一シヨンを以下のように行った。すなわち、ラヅトの腎臓を 4% パラホルムアルデヒドで灌流することにより固定した後、これを細切り、 4% パラホルムアルデヒドでさらに固定した。得られたラット腎臓を 5 mの厚さに薄切し、得られた切片を、 in situハィブリダイゼ一シヨンに用いた。

全長の OA T lcDNAから、 T7もしくは T3RNAポリメラ一ゼを用いて、 ³⁵ Sでラベルしたセンス cRNAとアンチセンス cRNAを合成し、プローブとして用いた。切片をハイブリダィゼ一シヨン液でー晚プローブでハイブリダィゼーシヨンを行ない、 0.1 XSSCで 30分、 3

7 °Cにて洗浄した。

In situハイブリダィゼーシヨンの結果、ラヅト腎臓では、 OAT 1 mRN Aは腎臓の皮質と髄質外層、特に皮質の髄放線の部分で発現することが示された。髄質内層では発現は検出されなかった。この結果は、有機陰イオントランスポ一夕一 OA T 1が近位尿細管の中間部分で最も多く発現されることを示している。

実施例 2 有機陰イオントランスポー夕一 OAT 1の特徴づけ

( 1 )OAT 1の輸送活性におけるグルタル酸の影響

ラット OAT 1遺伝子 cRN Aを注入した卵母細胞による PAHの取り込み実験においてグルタル酸とのプレインキュベ一シヨンの影響を調べた。

PAHの取り込み実験は、前記実施例 1(2)記載方法に準じ、以下のように行った。すなわち、ラヅト OAT 1遺伝子 cRNAもしくは、ラット OAT 1遺伝子 cRNAとラヅト NaDC— lcRNAを注入した卵母細胞を、 ImM グルタル酸添加もしくは無添加のナトリウム取り込み溶液中で 2時間前培養したあと、 ¹⁴C- PAHを添加して室温で 1時間培養し放射能でラベルされた基質の取り込みを測定した。

その結果、図 5に示すように、 PAHの取り込みは、 ImMグルタル酸で卵母細胞を前処置することによって増加した。また、ラットジカルボン酸塩トランスポ一夕一と 0 AT 1が発現している卵母細胞をグルタル酸で前処置すると，さらに¹⁴ C-PAHの取り込みの増加が見られた。この結果に示されるグルタル酸の効果は、 P A H取り込みの細胞内ジカルボン酸濃度依存性を示しており、 0 AT 1が有機ァニオンとジカルボン酸の交換輸送体であると考えられた。コントロールには RN Aを注入しない卵母細胞を用いた。

( 2 ) 0 A T 1の輸送活性の塩依存性

ラット OAT 1遺伝子 cRNAを注入した卵母細胞による P AHの取り込み実験において培養液に添加する塩の影響を調べた。

P A Hの取り込み実験は、ラット OAT 1遺伝子 cRNAを注入した卵母細胞を用い、前記（ 1)記載方法に準じて実施した。但し、取り込み溶液は、塩として塩化コリンイオンを添加した場合の影響をみる場合には、ナトリウム取り込み溶液にかえて、前記実施例 1の（ 1 )で用いたものと同じ塩化コリン取り込み溶液を用いた。

その結果、図 6に示すように、細胞外のナトリウムをコリンと置換しても、 PAH取り込みに何ら影響を与えなかった。このことから、 OA T 1はナトリゥムイオン非依存性に働くトランスポ一夕一であることが示された。コントロールには RN Aを注入しない卵母細胞を用いた。 (3)OAT 1のミカエリス—メンテンの動力学試験基質 PAHの濃度の違いによる PAHの取り込み率の変化を調べることにより、有機陰イオントランスポ一夕一のミカエリス一メンテンの動力学試験を行った。

PAHの取り込み実験は、ラット OAT 1遺伝子 cRNAを注入した卵母細胞を用い、前記（ 1)記載の方法に準じて実施した。但し、 ¹⁴C-PA H取り込みは 3分間測定した。その結果、図 7に示すように、 Km値は約 14.3±2.9 /Mであった。この Km値は、既に in vivo系で報告されている基底側の有機ァニオントランスポート系の Km値（80〃M)(Ulrich ら、 Am. J. Physiol. 第 254卷、 F453-462頁、 1988年）とほぼ同様であつた。

(4)0 AT 1の基質選択性 (薬物添加による阻害試験）

ラヅト OAT 1遺伝子 cRN Aを注入した卵母細胞による PAHの取り込み実験において、系への各種薬物添加の影響を調べた。

PAHの取り込み実験は、ラット OAT 1遺伝子 cRNAを注入した卵母細胞を用い、前記（ 1 )記載方法に準じて実施した。但し、ナトリウム取り込み溶液を用い、 2mMの各種化合物 (非標識)の存在下および非存在下（コントロール）で、 PAHの取り込みを測定した。

その結果、図 8に示すように、構造的に無関係の薬物の添加で、 cis— 阻害効果が観察された。セファロリジン（ ?ーラクタム系抗生物質)、ナリジクス酸（オールドキノロン）、フロセミドとエタクリン酸 (利尿薬)、インドメ夕シン（非ステロイド系抗抗炎症剤)、プロべネシド（尿酸排泄薬)、ノレプロ酸 (抗てんかん薬）は OAT— 1を介した ΡΑΗの取り込みを強く阻害した（85%>)。抗腫瘍薬であるメトトレキセ一トは ΡΑΗ の取り込みを中等度に阻害した。プロスタグランジン Ε 2、 c— ΑΜΡ、 c一 GMP、尿酸といった内因性化合物も PAHの取り込みを阻害した。 ( 5 ) 0 A T 1の基質選択性 (各種陰ィォン性物質を基質とする取り込み試験）

各種陰イオン性物質を基質として、 0 AT 1による取り込みを調べた。取り込み実験は、ラット OAT 1遺伝子 cRN Aを注入した卵母細胞を用い、前記（ 1 )に記載の方法に準じて実施した。但し、基質としては、 ¹⁴C— PAHにかえて、放射能でラベルされた各種の化合物を用いた。コントロールには、 RN Aを注入しない卵母細胞を用いた。

その結果、図 9に示すように、メトトレキセ一ト（³H標識物)、 c-A MP(³H標識物）、 c—GMP(³H標識物）、プロスタグランジン E₂(³H 標識物)、尿酸（¹⁴c標識物)、ひーケトグルタル酸（¹⁴c標識物）を基質とした場合に、卵母細胞への取り込みが認められた。一方、 TEA(¹⁴C標識物）とタウロコール酸では取り込みを示さなかった。

実施例 3 ヒト有機陰イオントランスポー夕一のクロ一ニング

実施例 1の（2)にて得たラット OAT 1遺伝子の cDNA断片を標識し、これをプローブとして用いて、ヒト cDNAライブラリ一をスクリ一ニングした。ヒト cDNAライブラリ一は、遺伝子源としてヒト腎ポリ（Α)^τ RN A (クロンテク社製）を用いて作製したヒト cDN Aライブラリーを用いた。

また、得られた陽性クローン、すなわち、ヒト有機陰イオントランスポ一夕一（ヒト OAT 1 )cDNAを含むクロ一ンについて、実施例 1と同様にして、塩基配列を決定し、得られた cDN Aの塩基配列を常法により解析して、 cDN A上の翻訳領域とそこにコードされるヒト OAT 1のァミノ酸配列を決定した。これらヒト OAT 1の配列を、後記配列表の配列番号 2に示した。

ラット OAT 1とヒト OAT 1とのホモロジ一は、アミノ酸レベルで約 85%であった。また、 cDN Aレベルでのホモロジ一は、約 79%でめった。

産業上の利用の可能性

本発明の有機陰イオントランスポ一夕一 OAT 1およびその遺伝子は、薬物排出や薬物と薬物の相互作用のインビト口での分析など、薬物動態や毒物動態の分子レベルでの解明に有用と考えられる。また、ラク夕ム系抗生物質、利尿薬、非ステロイド系抗炎症薬のような腎不全の原因となる多くの薬物が、 OAT 1によって輸送され、薬物が腎毒性を引き起こす原因は OAT 1に起因する蓄積性による可能性が示唆されることから、 OAT 1を用いて腎毒性を防止するのための薬物をスクリ一ニングする方法を開発し得ると考えられる。

配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 2294

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cD N A to mR N A

起源

生物名：ラット

配列

GCTCCAGCAG ACCCTGAAAG CTGAGCTGTC CAGACCCCCG AAGTGAAGAA AAGAGGCGAG 60 GGCAAGGGAG GGCCAGAACC GAGGGAGAGA GAAAGGAGGG GCAGCCCACC AGCCCGCTGT 120 CCTGCCACAG AACCGGCTCA GCTCCAGCTC CAGGAGTCAC TCAGCTGCAG AGGCAGTGGC 180 AGCCCCACTC CTCAGGCAAA GGGCAGCAGA CAGACAGACA GAGGTCCTAG GACTGGAGGT 240 CCTCAGTCAT TGACCACTCA GCCTGGCCCA GCCCC 275 ATG GCC TTC AAT GAC CTC CTG AAA CAG GTG GGG GGC GTC GGA CGC 320 Met Ala Phe Asn Asp Leu Leu Lys Gin Val Gly Gly Val Gly Arg

1 5 10 15

TTC CAG TTG ATC CAG GTC ACC ATG GTG GTT GCT CCC CTA CTG CTG 365 Phe Gin Leu He Gin Val Thr Met Val Val Ala Pro Leu Leu Leu

20 25 30

ATG GCT TCC CAC AAC ACC TTG CAG AAC TTC ACT GCC GCT ATC CCC 410 Met Ala Ser His Asn Thr Leu Gin Asn Phe Thr Ala Ala l ie Pro

35 40 45 CCT CAT CAC TGC CGC CCA CCT GCC AAT GCC AAT CTC AGC AAA GAT 455 Pro His His Cys Arg Pro Pro Ala Asn Ala Asn Leu Ser Lys Asp

50 55 60

GGA GGT CTG GAG GCC TGG CTG CCC CTG GAC AAG CM GGA CM CCC 500 Gly Gly Leu Glu Ala Trp Leu Pro Leu Asp Lys Gin Gly Gin Pro

65 70 75

GAA TCG TGC CTC CGC TTT ACT TCC CCC CAG TGG GGA CCA CCC TTT 545 Glu Ser Cys Leu Arg Phe Thr Ser Pro Gin Trp Gly Pro Pro Phe

80 85 90

TAC AAT GGC ACA GAA GCC AAT GGC ACC AGA GTC ACA GAG CCC TGC 590 Tyr Asn Gly Thr Glu Ala Asn Gly Thr Arg Val Thr Glu Pro Cys

95 100 105

ATT GAT GGC TGG GTC TAT GAC AAC AGC ACC TTC CCT TCA ACC ATC 635 l ie Asp Gly Trp Val Tyr Asp Asn Ser Thr Phe Pro Ser Thr l ie

110 115 120

GTG ACT GAG TGG AAC CTT GTG TGC TCT CAT CGG GCT TTC CGC CAG 680 Val Thr Glu Trp Asn Leu Val Cys Ser His Arg Ala Phe Arg Gin

125 130 135

CTG GCC CAG TCC CTG TAC ATG GTG GGA GTG CTG CTG GGA GCC ATG 725 Leu Ala Gin Ser Leu Tyr Met Val Gly Val Leu Leu Gly Ala Met

140 145 150

GTG TTT GGC TAC CTG GCG GAC AGG CTG GGC CGC CGG AAG GTG CTG 770 Val Phe Gly Tyr Leu Ala Asp Arg Leu Gly Arg Arg Lys Val Leu

155 160 165 ATC TTG AAC TAC CTG CAG ACA GCT GTG TCG GGA ACC TGT GCA GCC 815 l ie Leu Asn Tyr Leu Gin Thr Ala Val Ser Gly Thr Cys Ala Ala

170 175 180

TAT GCA CCC AAC TAT ACT GTC TAC TGC GTT TTC CGG CTC CTC TCG 860 Tyr Ala Pro Asn Tyr Thr Val Tyr Cys Val Phe Arg Leu Leu Ser

185 190 195

GGC ATG TCT TTG GCT AGC ATT GCA ATC AAC TGC ATG ACA CTA AAT 905 Gly Met Ser Leu Ala Ser l ie Ala l ie Asn Cys Met Thr Leu Asn

200 205 210

GTG GAA TGG ATG CCT ATC CAC ACC CGT GCC TAT GTG GGC ACC TTG 950 Val Glu Trp Met Pro He His Thr Arg Ala Tyr Val Gly Thr Leu

215 220 225

ATT GGC TAT GTC TAC AGC CTG GGC CAG TTC CTC CTG GCT GGC ATC 995 l ie Gly Tyr Val Tyr Ser Leu Gly Gin Phe Leu Leu Ala Gly l ie

230 235 240

GCC TAT GCT GTG CCC CAC TGG CGC CAC CTG CAG CTT GTG GTC TCT 1040 Ala Tyr Ala Val Pro His Trp Arg His Leu Gin Leu Val Val Ser

245 250 255

GTG CCT TTT TTC ATT GCC TTC ATC TAC TCT TGG TTC TTC ATT GAG 1085 Val Pro Phe Phe He Ala Phe l ie Tyr Ser Trp Phe Phe l ie Glu

260 265 270

TCA GCC CGC TGG TAC TCC TCC TCA GGA AGG CTG GAC CTC ACC CTC 1130 Ser Ala Arg Trp Tyr Ser Ser Ser Gly Arg Leu Asp Leu Thr Leu

275 280 285 CGA GCC CTG CAG AGA GTG GCC CGG ATC AAT GGG AAA CAA GAA GAA 1175 Arg Ala Leu Gin Arg Val Ala Arg l ie Asn Gly Lys Gin Glu Glu

290 295 300

GGG GCT AAG CTA AGT ATA GAG GTG CTC CGG ACC AGC CTG CAG AAG 1220 Gly Ala Lys Leu Ser l ie Glu Val Leu Arg Thr Ser Leu Gin Lys

305 310 315

GAA CTG ACT CTA AGC AAA GGC CAA GCC TCA GCC ATG GAG CTG CTG 1265 Glu Leu Thr Leu Ser Lys Gl Gin Ala Ser Ala Met Glu Leu Leu

320 325 330

CGC TGC CCC ACC CTT CGA CAC CTC TTC CTC TGT CTC TCC ATG CTG 1310 Arg Cys Pro Thr Leu Arg His Leu Phe Leu Cys Leu Ser Met Leu

335 340 345

TGG TTT GCC ACT AGC TTT GCC TAC TAC GGG CTG GTC ATG GAC CTG 1355 Trp Phe Ala Thr Ser Phe Ala Tyr Tyr Gly Leu Val Met Asp Leu

350 355 360

CAG GGC TTT GGG GTC AGC ATG TAC CTT ATC CAG GTG ATT TTC GGT 1400 Gin Gly Phe Gly Val Ser Met Tyr Leu l ie Gin Val l ie Phe Gly

365 370 375

GCC GTG GAC CTG CCT GCC AAG TTT GTA TGC TTC CTA GTC ATC AAC 1445 Ala Val Asp Leu Pro Ala Lys Phe Val Cys Phe Leu Val l ie Asn

380 385 390

TCC ATG GGG CGC CGG CCT GCA CAG ATG GCC TCC CTG CTG CTG GCA 1490 Ser Met Gly Arg Arg Pro Ala Gin Met Ala Ser Leu Leu Leu Ala

395 400 405 GGC ATC TGC ATC CTG GTG AAT GGC ATA ATA CCG AAG AGC CAT ACG 1535 Gly l ie Cys l ie Leu Val Asn Gly l ie l ie Pro Lys Ser His Thr

410 415 420

ATC ATT CGC ACC TCC CTG GCT GTG CTA GGG AAG GGC TGC CTG GCT 1580 l ie l ie Arg Thr Ser Leu Ala Val Leu Gly Lys Gly Cys Leu Ala

425 430 435

TCC TCT TTC AAC TGC ATC TTC CTG TAC ACC GGA GAG CTG TAC CCC 1625 Ser Ser Phe Asn Cys l ie Phe Leu Tyr Thr Gly Glu Leu Tyr Pro

440 445 450

ACA GTG ATT CGG CAG ACA GGC CTG GGC ATG GGC AGC ACC ATG GCC 1670 Thr Val l ie Arg Gin Thr Gly Leu Gly Met Gly Ser Thr Met Ala

455 460 465

CGG GTG GGC AGC ATT GTG AGC CCG CTG GTG AGC ATG ACT GCA GAG 1715 Arg Val Gly Ser l ie Val Ser Pro Leu Val Ser Met Thr Ala Glu

470 475 480

TTC TAC CCC TCC ATG CCT CTC TTC ATC TTC GGC GCT GTC CCT GTG 1760 Phe Tyr Pro Ser Met Pro Leu Phe l ie Phe Gly Ala Val Pro Val

485 490 495

GTC GCC AGT GCT GTC ACT GCC CTG CTG CCA GAG ACC TTG GGC CAG 1805 Val Ala Ser Ala Val Thr Ala Leu Leu Pro Glu Thr Leu Gly Gin

500 505 510

CCG CTG CCA GAT ACA GTG CAG GAC CTG AAG AGC AGG AGC AGA GGA 1850 Pro Leu Pro Asp Thr Val Gin Asp Leu Lys Ser Arg Ser Arg Gly

515 520 525 AAG CAG AAT CAA CAG CAG CAG GAA CAG CAG AAG CAG ATG ATG CCG 1895 Lys Gin Asn Gin Gin Gin Gin Glu Gin Gin Lys Gin Met Met Pro

530 535 540

CTC CAG GCC TCA ACA CAA GAG AAG AAT GGA CTT 1928 Leu Gin Ala Ser Thr Gin Glu Lys Asn Gly Leu

545 550 551

TGAGAACGGA AGGGCTTCAC ACAGCACTAA AGGGAGTGGG GTTCTACAGG TCCTGCCGTC 1988 TACATGAGGA GGGGGAGTGA GTAGAGGGAC TGGACCATCC AAATGTGGAG GCTGCCATTC 2048 AGAGAAATCC CTCCCCAAAG GTCATGTCAG TAGACCCACT AGGAACAAAA GCTCTGACTA 2108 TGTGCAGCTT CTTAAGCAGA ATGTTCTCGT CACCGGCCAT CTTCCTGCTC ATGGTCACTC 2168 CGCCACCTCC AGGACCTTGC AAAGAATCTC AGACAATTAA ATGAATCTCT TCTAAAAAAA 2228 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2288 AAAAAA 2294 配列番号： 2

配列の長さ： 2171

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cD N A to mR N A

起源

生物名：ヒト

配列

GAAAGCTGAG CTGCCCTGAC CCCCAAAGTG AGGAGAAGCT GCAAGGGAAA AGGGAGGGAC 60 AGATCAGGGA GACCGGGGAA GAAGGAGGAG CAGCCAAGGA GGCTGCTGTC CCCCCACAGA 120 GCAGCTCGGA CTCAGCTCCC GGAGCAACCC AGCTGCGGAG GCAACGGCAG TGCTGCTCCT 180 2Z

SOT ΟΟΪ 96

s ojj nig J¾ ¾iv ^ J usy ¾iv J¾ usy naq

Z8S 301 003 9V9 VOV 039 999 VOV 300 IW 030 W9 VOV 390 IW 313

06 S8 08

3¾d oJd τΐθΐ io dJi uio ojj J9S Jqx 9¾j Sjy s J9

L2 III 033 910 V99 091 9V3 003 031 OOV Oil 093 DID 391 001 9V9

L Oh 99

oad ui9 yiig ui9 SJV dsy SJV OJJ noq djj, Λ nig na A\Q

26 XOO 9V0 999 9V0 99V 3V9 990 030 913 991 319 9V9 913 999 999

09 9S 09

usy sXq J9s na usy ¾iv dsy ^iv ^0Jd OJJ s g STJJ SIH J¾

^ OW 9W 33V 010 3W 300 IV9 339 XOO 033 393 39X OVO OVO OOV

f C

oad 9U BIV BIV J¾ usy ui9 n9q J usy STH S ¾IV WW

ZO X33 3IV 009 XOO X3V Oil 3W 9V0 9X3 OOV OW OVO XOI 109 9XV

OS OZ

Π81 Π3Ί Π9Ί ojj ngq Ι¾Λ ΐ¾Λ naq J¾ ^Ιϋ ^Ϊ Ι uig aqj

910 010 913 003 DID 319 9X9 9X3 OOV 3X9 9V0 OXV 9V0 9V3 Oil 9Ϊ OT 9 I

SJV As o m ^uI «ΤΟ usy ¾iv

Z\Z 030 399 319 190 9D9 010 DVD OVO DXO 3X0 OVO IW III 039 DIV

VD0009I 0099910999 I0V039VDD3

339V0I3099 W99I3V909 X00X90V0V3 V9V3V9V03D V399V00V0V D9WD0DV33

IIO/86df/X3d t?90CS/86 OAV ACC GAT GGC TGG ATC TAT GAC AAC AGC ACC TTC CCA TCT ACC ATC 627 Thr Asp Gly Trp l ie Tyr Asp Asn Ser Thr Phe Pro Ser Thr l ie

110 115 120

GTG ACT GAG TGG GAC CTT GTG TGC TCT CAC AGG GCC CTA CGC CAG 672 Val Thr Glu Trp Asp Leu Val Cys Ser His Arg Ala Leu Arg Gin

125 130 135

CTG GCC CAG TCC TTG TAC ATG GTG GGG GTG CTG CTC GGA GCC ATG 717 Leu Ala Gin Ser Leu Tyr Met Val Gly Val Leu Leu Gly Ala Met

140 145 150

GTG TTC GGC TAC CTT GCA GAC AGG CTA GGC CGC CGG AAG GTA CTC 762 Val Phe Gly Tyr Leu Ala Asp Arg Leu Gly Arg Arg Lys Val Leu

155 160 165

ATC TTG AAC TAC CTG CAG ACA GCT GTG TCA GGG ACC TGC GCA GCC 807 l ie Leu Asn Tyr Leu Gin Thr Ala Val Ser Gly Thr Cys Ala Arg

170 175 180

TTC GCA CCC AAC TTC CCC ATC TAC TGC GCC TTC CGG CTC CTC TCG 852 Phe Ala Pro Asn Phe Pro l ie Tyr Cys Ala Phe Arg Leu Leu Ser

185 190 195

GGC ATG GCT CTG GCT GGC ATC TCC CTC AAC TGC ATG ACA CTG AAT 897 Gly Met Ala Leu Ala Gly l ie Ser Leu Asn Cys Met Thr Leu Asn

200 205 210

GTG GAG TGG ATG CCC ATT CAC ACA CGG GCC TGC GTG GGC ACC TTG 942 Val Glu Trp Met Pro l ie His Thr Arg Ala Cys Val Gly Thr Leu

215 220 225 οε

on see

Π9Ί J8S Τ191 9qd naq STH Say ojj s^3 Say ζοετ 9X3 9IV 001 013 ΟΰΧ 3X0 OXX tJoiO OVO 090 013 03V 333 091

ηΐΰ ^ID W J Π8Ί nig

910 910 9V9 9IV 339 931 V39 9V3 099 VW 099 OIV OOV 910 OVO STC οιε 90S

s^i uj9 niD s BIV ζ\ζ\ 9W OVO 0X3 X9V 030 993 013 VXO 0V9 9IV I0V 9IX VW 300 V90 οοε %Z OGZ

8{I Say BIV A na^ υιν SJV i W9 W9 990 9W 999 IW OIV 990 009 3X9 V9V OVO 9X0 309 90V

QSZ

Tia dsy n9i Say ^9 s STH dJX Say Ώΐν J9S

913 OOV αΐθ 0V9 913 99V 099 03X 331 031 OVO 991 093 309 901

09Z

纖 9V9 XIV oxx oxx m OVI OIV OXX 1XX XD3 909

Ζ

J9 A STH Sjy dJI STH ¾TV J^l BIV zeoT DID VIO 9V3 910 OVO 090 991 OVO 330 9ID I3D OVI 000

082

"13 J ΙΒΛ J ^19 3ΐ Ι

Α86 910 X9D 139 m OXD OXX OVO 009 913 OOV OVX 3X9 IVI DD9 IIV irO/86df/I3d ^90£5/86 O TGG TTT GCC ACT AGC TTT GCA TAC TAT GGG CTG GTC ATG GAC CTG 1347 Trp Phe Ala Thr Ser Phe Ala Tyr Tyr Gly Leu Val Met Asp Leu

350 355 360

CAG GGC TTT GGA GTC AGC ATC TAC CTA ATC CAG GTG ATC TTT GGT 1392 Gin Gly Phe Gly Val Ser l ie Tyr Leu l ie Gin Val l ie Phe Gly

365 370 375

GCT GTG GAC CTG CCT GCC AAG CTT GTG GGC TTC CTT GTC ATC AAC 1437 Ala Val Asp Leu Pro Ala Lys Leu Val Gly Phe Leu Val l ie Asn

380 385 390

TCC CTG GGT CGC CGG CCT GCC CAG ATG GCT GCA CTG CTG CTG GCA 1482 Ser Leu Gly Arg Arg Pro Ala Gin Met Ala Ala Leu Leu Leu Ala

395 400 405

GGC ATC TGC ATC CTG CTC AAT GGG GTG ATA CCC CAG GAC CAG TCC 1527 Gly l ie Cys l ie Leu Leu Asn Gly Val l ie Pro Gin Asp Gin Ser

410 415 420

ATT GTC CGA ACC TCT CTT GCT GTG CTG GGG AAG GGT TGT CTG GCT 1572 l ie Val Arg Thr Ser Leu Ala Val Leu Gly Lys Gly Cys Leu Ala

425 430 435

GCC TCC TTC AAC TGC ATC TTC CTG TAT ACT GGG GAA CTG TAT CCC 1617 Ala Ser Phe Asn Cys lie Phe Leu Tyr Thr Gly Glu Leu Tyr Pro

440 445 450

ACA ATG ATC CGG CAG ACA GGC ATG GGA ATG GGC AGC ACC ATG GCC 1662 Thr Met l ie Arg Gin Thr Gly Met Gly Met Gly Ser Thr Met Ala

455 460 465 CGA GTG GGC AGC ATC GTG AGC CCA CTG GTG AGC ATG ACT GCC GAG 1707 Arg Val Gly Ser lie Val Ser Pro Leu Val Ser Met Thr Ala Glu

470 475 480

CTC TAC CCC TCC ATG CCT CTC TTC ATC TAC GGT GCT GTT CCT GTG 1752 Leu Tyr Pro Ser Met Pro Leu Phe He Tyr Gly Ala Val Pro Val

485 490 495

GCC GCC AGC GCT GTC ACT GTC CTC CTG CCA GAG ACC CTG GGC CAG 1797 Ala Ala Ser Ala Val Thr Val Leu Leu Pro Glu Thr Leu Gly Gin

500 505 510

CCA CTG CCA GAC ACG GTG CAG GAC CTG GAG AGC AGG TGG GCC CCC 1842 Pro Leu Pro Asp Thr Val Gin Asp Leu Glu Ser Arg Trp Ala Pro

515 520 525

ACT CAG AAA GAA GCA GGG ATA TAT CCC AGG AAA GGG AAA CAG ACG 1887 Thr Gin Lys Glu Ala Gly l ie Tyr Pro Arg Lys Gly Lys Gin Thr

530 535 540

CGA CAG CAA CAA GAG CAC CAG AAG TAT ATG GTC CCA CTG CAG GCC 1932 Arg Gin Gin Gin Glu His Gin Lys Tyr Met Val Pro Leu Gin Ala

545 550 555

TCA GCA CAA GAG AAG AAT GGA CTC 1956 Ser Ala Gin Glu Lys Asn Gly Leu

560 563

TGAGGACTGA GAAGGGGCCT TACAGAACCC TAAAGGGAGG GAAGGTCCTA CAGGTCTCCG 2016 GCCACCCACA CAAGGAGGAG GAAGAGGAAA TGGTGACCCA AGTGTGGGGG TTGTGGTTCA 2076 GGAAAGCATC TTCCCAGGGG TCCACCTCCC TTTATAAACC CCACCAGAAC CACATCATTA 2136 AAAGGTTTGA CTGCGAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 2171

Claims

請求の範囲

1. 以下の（A)、（B)、（C)および（D)から選択されるタンパク質。 (A)配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。

( B )配列番号 1で示されるァミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ有機陰イオンを輸送する能力を有するタンパク質。

(C)配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。

2. ヒト由来である請求項 1記載のタンパク質。

3. ラット由来である請求項 1記載のタンパク質。

4. 腎臓組織由来である請求項 1記載の夕ンパク質。

5. 請求項 1記載のタンパク質をコードする遺伝子。

6. 以下の（a)、（b)、（c)および（d)から選択される DNAからなる遺伝子。

( a )配列番号 1で示される塩基配列からなる D N A。

( c )配列番号 2で示される塩基配列からなる DNA。

7 . ヒト由来である請求項 6記載の遺伝子。

8 . ラット由来である請求項 6記載の遺伝子。

9 . 腎臓組織由来である請求項 6記載の遺伝子。

1 0 . 請求項 5〜 9のいずれかの項に記載の遺伝子もしくは該遺伝子の中のタンパク質をコードする領域を含むプラスミド。

1 1 . 発現プラスミドである請求項 1 0記載のプラスミド。

1 2 . 請求項 1 0記載のプラスミドで形質転換された宿主細胞。

1 3 . 配列番号 1または 2で示される塩基配列の中の連続する 1 4塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチド。

1 4 . 有機陰イオンを輸送する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブとして使用するものである請求項 1 3 記載のヌクレオチド。

1 5 . 有機陰イオンを輸送する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させるために使用するものである請求項 1 3記載のヌクレオチド。

1 6 . 請求項 1〜4のいずれかの項に記載のタンパク質に対する抗体。

1 7 . 請求項 1〜4のいずれかの項に記載のタンパク質を用いて、該タンパク質の有する有機陰イオンを輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用を検定する方法。