WO1998046739A1

WO1998046739A1 - Molecules immunomodulatrices et leur procede de production

Info

Publication number: WO1998046739A1
Application number: PCT/JP1997/002540
Authority: WO
Inventors: Kazuhisa Sugimura
Original assignee: Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1997-07-23
Publication date: 1998-10-22
Also published as: US6429286B1; CA2285571C; CA2285571A1

Description

明細書

免疫制御分子およびその製造方法技術分野

本発明は、 T細胞活性化に関与した第一シグナルに続く補助刺激シグナルに関与した分子間の相互作用を制御する免疫制御分子及びその製造方法に関するものであり、当該分子を利用して免疫系を制御することができる。さらに詳細には、本発明は、補助刺激シグナルの伝達に関与した分子間の結合を阻止し、かつ当該分子の立体構造を認識するモノクロナール抗体を用いて、ファージランダムペプチドライブラリーより得られる、目的タンパク分子の三次構造を模倣したぺプチド配列をもつ免疫制御分子及びその製造方法に関する。

背景技術

免疫反応は T細胞の活性化から始まる。生体内に入り込んだ抗原はマク口ファージゃ B細胞のような抗原提示細胞（以下、 A P Cと称することもある）に取り込まれる。次に、抗原断片を取り込んだ抗原提示細胞は細胞膜面上に主要組織適合性抗原（MH C ) のクラス I もしくはクラス Πと抗原（A g ) との複合体を提示する。そしてこの MH C /A g複合体は、 T 細胞上の T細胞抗原レセプ夕一（T C R) / C D 3複合体により認識され第一シグナルを T細胞内に送る。第二シグナルは補助刺激シグナル

(costimulatory signal) とも呼ばれ、 T細胞、 A P C双方の細胞膜上に発現する接着分子間の相互作用により T細胞内に送られる。 T細胞の活性化には第一と第二の両方のシグナルが必要であり、第二シグナルである補助刺激シグナルを阻害すると Tリンパ球が不活性化され、免疫学的不応答

(ァナジ一）に陥ることが分かっている。この補助刺激シグナルは、 A P C上に発現する CD 80 (別名 B 7— 1、 B7/BB 1) 及び CD 86 (別名 B7— 2、 B 70) 、そのカウンターレセプターである T細胞上に発現する CD 28及び細胞障害性 Tリンパ球関連抗原（CTLA— 4) の相互作用により主に伝達されると考えられている（Lenschow, D. J .， et al. , Annu. Rev. I mmunol.14, 233— 258、 1996) 。

CD28分子は T細胞上に発現される糖タンパク分子であり、 TCRからの刺激による T細胞の増殖及びさまざまなサイトカイン産生を増強する補助刺激レセプタ一として機能していることが明らかにされている。 CT L A— 4分子は CD 28と構造的、機能的に非常に類似している分子として知られている。 CTLA— 4ノックァゥ卜マウスでは、脾臓ゃリンパ節の T細胞が増え、心筋、甲状腺、膝臓などの多くの臓器に T細胞浸潤が起こり、自己免疫病により死亡することより、 CTLA— 4が T細胞応答のネガティブレギュレーターであることが示唆されている。 CD 28、 CT LA— 4のリガンドとして、 1990年に Linsleyら（P roc. Natl. Acad. Sci. US A, 87， 5031— 5035) により CD80分子が、続いて 1993年に Azmnaら（Nature, 366， 76— 79 ) により CD 86分子が同定された。 CD80は膜貫通型糖タンパク質で細胞内領域は短く、シグナル伝達部を有しており、 Igスーパーファミリーに分類されている。 CD86は CD80同様、 I gスーパーファミリ一に分類される膜貫通型タンパク質であるカ^ C D 80と異なり細胞内領域に 3つの潜在的なプロティンキナーゼ C依存性のリン酸化領域を持つことからシグナル伝達機能を有することが示唆されている。 CD80、 CD86とも T細胞の増殖、細胞障害活性、胸腺内における T細胞分化に関与している。 CD 28分子あるいは CTLA— 4分子は CD 80分子あるいは CD 86分子にそれぞれ結合できる能力を有しており、これらの分子の発現時期や相互作用によって、 T細胞の活性化または抑制、ひいては免疫系全体が影響を受けると考えられている。

このように CD28分子、 CTLA— 4分子、 CD80分子及び CD8 6分子は Τ細胞の抗原応答や Β細胞の相互作用など様々な免疫機能発現に極めて重要な役割を果たしており、 MH C / A g複合体と TCR/CD3複合体による第一のシグナルに続く補助刺激シグナルの主たる部分を担つている。従って、この補助刺激シグナルを制御することによって免疫系全体を制御することができると思われる。このような試みとして CD 28分子や CTL A— 4分子に対する抗体を用いる試みがあり、抗 CD 3抗体で予め刺激している T細胞に抗 CD 28抗体の存在下で抗 CTL A— 4抗体あるいは抗 B 7抗体を作用させることにより抗 C D 28抗体の T細胞活性化効果をさらに 3倍弱増強している（Matthew F.,et al. , J . Exp. Med. 18.2, 459— 465, 1995) 。

生体内の情報伝達は、補助刺激シグナルの例で述べたように、細.胞表面上に発現しているレセプター分子と、これに対応するリガンド分子との結合により送られるシグナルによって行われる。レセプターとリガンドはお互いに相補的な関係にあり、 2つの分子の結合はお互い形の合う者同士でおこる。しかし、リガンド分子において結合に最も重要な部位は限られており、その相互作用部位の構造を明らかにすることでレセプターとリガンドの結合をブロックしたり促進したりすることができる。従来、あるレセプタ一一リガンド系でどちらか一方の相互作用部位を明らかにしょうとする場合、そのタンパク質の全ァミノ酸配列にわたって適当な長さのぺプチドを合成し、その結合活性もしくは結合阻害活性により相互作用部位を明らかにするペプチドスキャニング方法がとられていた。あるいは、部位特異的突然変異誘発法（site- directed mutagenesis) による結合部位への関与を 1つ 1つのァミノ酸置換により調べる方法か、フォトァフィニティ一法により夕ンパク質同士の結合ァミノ酸を特定化する方法が使われてきた。最近では、ファージランダムペプチドライブラリーを用いたスクリーニング方が行われるようになつてきた。これは S cottら（S cience, 2 4 9， 3 8 6— 3 9 0 , 1 9 9 0 ) によって開発された方法で、ファージの構成タンパク質である ρΠΐ分子の遺伝子（genem ) にランダムなペプチド分子をコードする遺伝子を挿入することにより、ランダムなぺプチド分子を含んだ形の ρΙΠ分子を fd- tetファージ（繊維状一本鎖 DNAのファージ）上に発現させ、ファージランダムペプチドライブラリ一を作り、パンニングなどで結合ファージをスクリ一二ングし、その pm遺伝子のシークェンスを行って、相互作用部位を決定する方法である。この方法を用いると、数億種類にも及ぶぺプチドの集合体を化学反応で合成するよりも容易に得られ、さらに必要に応じてその増幅が可能である。

ファージランダムペプチドライブラリ一を利用して、ターゲット分子上の相互作用部位を同定することが試みられている。一般的には、レセプタ一あるいはリガンドを直接プレート上に固相化してパンニング法によりファージランダムべプチドライブラリ一をスクリ一二ングする方法がとられている。しかし、相当数の目的分子に結合するファージクローンが得られ、その大多数は機能のない単なる結合ファージクローンであり、その中からレセプタ一一リガンドの相互作用を制御するようなべプチド配列を持ったファージを得ることは非常に効率が悪く、難しかった。また、抗原指向性がはっきりしている抗体を用いてファージライブラリ一をスクリ一二ングする場合には、比較的効率よく結合ペプチドが得られている。例えば、抗 p 5 3モノクローナル抗体を用いて p 5 3分子上のェピトープの決定を行つている例では、種々の長さのランダムべプチドライブラリ一を用いているが、抗 p 53モノクローナル抗体によって得られたものは、全て p 53上のァミノ酸配列にホモロジ一の高いものであり、その結果からェピトープを同定している（Stephen, C.W. ,et al. , J . Mol. Biol. , 248, 58 - 78, 1995) 。また、抗 b FGF抗体を用いて 6個のァミノ酸配列をもったファージランダムぺプチドライブラリ一をスクリ一二ングしたところ bFGFのアミノ酸配列に類似のぺプチド配列が得られ、そのァミノ酸配列を 8個に拡張して合成したぺプチドが b FGFとそのレセプター F GFR- 1との結合を阻害したとの報告がある（Yayon, A.，et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. US A, 90， 10643— 10647, 1993) 。また、ァセチルコリンレセプタ一に対してコンフオメーショナルなェピトープを認識する抗体に結合するモチーフを 6個のァミノ酸をもつファージランダムべプチドライブラリ一を用いてスクリ一二ングしたところ、ァセチルコリンレセプターとはホモロジ一がないが、この抗体と結合するぺプチド配列が得られている。 .しかしながら、アセチルコリンと結合するか否かは何ら言及されていない（Balass, M.， et al.， Proc. Natl. Acad.

Sci. US A, 90, 10638 - 10642, 1993) 。

前述の補助刺激シグナルに関係している分子をターゲッ卜にして免疫反応を制御しょうとする試みとして、 B 7分子や CTL A— 4分子に対する抗体が用いられているが、その抗体の効果は T細胞活性化を 3倍弱増強するにとどまつており、十分に高いとはいいがたい。また、彼らの実験では、具体的な抗原を用いておらず、 in vivoの免疫反応において効果があるとの確証は得られていない。抗体以外のものとして、特に、医薬品として望ましいと考えられる小分子を、このような補助刺激シグナルに関与した分子をターゲッ卜にしてデザィンする試みはまだ報告されていない。

—方、小分子をデザインするための情報として、ターゲット分子の相互作用部位解析を行い、その相互作用部位のァミノ酸配列を元にべプチドを合成し、小分子をデザインするという方法がとられてきた。し力、し、従来の蛋白分子同士の相互作用部位の解析法により相互作用部位のァミノ酸配列を明らかにし、そのァミノ酸一次配列をもとにオリゴぺプチドを作製しても、ターゲット分子の機能を代替するような小分子の設計は困難であつた。すなわち、重要な機能を有する蛋白分子の相互作用部位は三次構造によつて規定されており、たとえ三次構造上相互作用に関与する部位が集積されていたとしても、一次配列上では相互作用部位が散在しているため、相互作用部位のァミノ酸一次配列をもとにオリゴぺプチドを作製しても、相互作用部位の三次構造を再構成することは技術的に困難であり、機能小分子の設計は困難であった。

ファージランダムぺプチドライブラリ一を用いた検索でも、レセプターあるいはリガンドを直接固相化してパンニング法によりスクリーニングすると、レセプタ: "一リガンドの相互作用を制御するような特別のぺプチド配列を持ったファージを得ることは非常に効率が悪く、困難であった。さらに、抗体のような比較的、抗原指向性がはっきりしているタンパク分子を使ったスクリーニングでも、抗体が結合するターゲット分子のァミノ酸の一次配列あるいは、それとホモロジ一の高いモチーフを同定することに使われてきており、ホモロジ一がない場合は単に抗体と結合するだけのぺプチド配列を示す場合がほとんどであった。すなわち、抗体の結合するターゲット分子の三次構造をアミノ酸の一次配列に依存せずに模倣する分子が得られたとの報告は未だされていない。ましてや A P C上に発現する C D 8 0及び C D 8 6と、そのカウンタ一レセプターである T細胞上に発現する C D 2 8及び C T L A— 4をターゲットにして、免疫系を制御するような小分子を得たとの報告もない。さらに、ターゲット分子のアミノ酸の一次配列に依存せずにそのような小分子を作製する試みがなされたという報告もない。

発明の開示

本発明は、 T細胞活性化に関与した MH C /A g複合体と T C R/ C D 3 複合体による第一シグナルに続く補助刺激シグナルに関与した分子間の相互作用を制御する免疫制御分子及びその作製方法を提供するものであり、当該分子を利用して免疫系を制御することができる。さらに詳細には、本発明は、補助刺激シグナルに関与した分子間の結合を阻止し、かつ当該分子の立体構造を認識するモノクロナ一ル抗体を用いて、ファージランダムぺプチドライブラリーより得られる、目的タンパク分子の三次構造を模倣したべプチド配列をもつ免疫制御分子及びその作製方法を提供する。

図面の簡単な説明

図 1は、ファージランダムべプチドライブラリーのスクリ一ニングに用いた抗マウス C T L A— 4モノクローナル抗体の特異性を示したものである。

図 2は、抗 C T L A— 4抗体と結合するファージクローンのパンニングの結果得られた 5 8個のファージクローンの抗マウス C T L A— 4モノクローナル抗体との反応性を示したものである。

図 3は、 6種類のファージクローンの抗マウス C T L A— 4モノクローナル抗体との結合性を示したものである。

図 4は、 6種類のファージクローンのマウス T細胞增殖に及ぼす影響を示したものである。

図 5は、 3種類のファージクローンのマウス C D 8 0一 I gへの結合能を示したものである。

図 6は、 F 2配列を発現するファージクローンのマウス C D 8 0— I g、マウス CTLA— 4— I g、ヒト I gGへの結合活性を示したものである。図 7は、 F 2配列を発現するファージクローンのヒ卜 CD80— I gへの結合活性を示したものである。

図 8は、鶏卵リゾチーム免疫マウスに対する F 2、 F 6配列を発現するファージクローンの T細胞増殖刺激活性を示したものである。

図 9は、 F 2配列を発現するファージクロ一ンの T細胞増殖刺激活性に対する CD80— I g、 CD86— I gの影響を示したものである。

図 10は、 F 6配列を発現するファージクローンの T細胞増殖刺激活性に対する CD80— I g、 CD 86 - I gの影響を示したものである。図 11は、 F2、 F6配列を発現するファージの抗 HB s Ag抗体産生増強活性を示したものである。

発明を実施するための最良の形態

例えば、分子 Aと Bの結合を阻害し分子 Aの立体構造を認識する抗 Aモノクローナル抗体を用いて、ファージランダムべプチドライブラリ一からこの抗体に結合するファージクローンを単離する場合、用いた抗 A抗体は分子 A上の結合部位の三次構造の「铸型」すなわち分子 B上の結合部位の役割を果たすため、分子 Aの結合部位の三次構造と類似している構造をファージ表面に提示したクローンに結合する。従来の分子 Bをそのままスクリ一二ングに使用する方法では、分子 B上に数多くのファージ結合可能部位があり、 A— B分子間の相互作用に関係ない部分に結合するファージクロ —ンも同時に得られることになつてしまい、スクリーニング効率を非常に悪くしていた。一方、 A— B分子間の相互作用に関係している部分の立体構造を認識する抗 Aモノクローナル抗体を使うことにより、相互作用に関係している分子 B上の部分の立体構造のみを抽出することになり、ターゲット領域を単一化することができ、その点でファージスクリ一二ングの効率を飛躍的に上げることができる。この立体構造を保持するためにべプチド単独の状態にせずに、ファージ上に表現されたままで、分子 Bとの結合活性によりスクリ一ニングすれば、最終的に分子 Aと非常に構造の良く似た立体構造を持つぺプチド配列を有するファージを選択することができる。このべプチド配列は分子 Aと非常に構造がよく似ていることから、さらに、バイオアッセィ等により選択すれば、その分子 Aのァゴニストゃアンタゴ二ストとしての活性を明らかにすることができる。また、このようにして選択されたぺプチド配列をもつファージクローンの中には、その立体構造が非常に分子 Aと似ている構造をしていることから、分子 Aのァゴニスト · アンタゴニスト的な活性ではなく、分子 Aとは異なるが分子 Aファミリーに属し同様の立体構造を持った分子 Cのァゴニスト · アンタゴニストとしても働くものが得られる。

このような方法を用いることにより、補助刺激シグナルに関与した C D 8 0及びじ0 8 6と〇0 2 8及び〇丁1^ 一4、さらにこれらの分子と立体構造が非常に類似しているが未だ明らかになつていない分子をターゲットにした免疫系を制御するような小分子をァミノ酸一次配列に依存せずに作製することが可能になり、本発明の一つである T細胞を活性化を促進するべプチド配列を得るに至った。

本発明の免疫制御分子とは、第一シグナルに続く補助刺激シグナルに関与した分子をターゲットにした小分子である。ここでいう補助刺激シグナルに関与した分子とは、 A P C上に発現する C D 8 0及び C D 8 6と、そのカウンターレセプターである T細胞上に発現する C D 2 8及び C T L A — 4、あるいは未だ知られていないがこれらの分子と非常に立体構造がよく似ている分子である。本発明の免疫制御分子は、第一シグナルに続く補助刺激シグナルに関与した分子間の結合を阻止し、かつその分子の立体構造を認識するモノクロナ一ル抗体を用いて、 1 0 ⁸種類以上の少なくとも 8個以上の長さを持ったランダムなぺプチド配列を提示するファージランダムべプチドライブラリ一を、そのべプチド配列がファージに表現された状態でスクリーニングすることによって得ることができる。

本発明の免疫制御分子は、補助刺激シグナルに関与し、かつ T細胞上に発現する C T L A— 4に対する抗体と結合するものであり、さらに、そのァミノ酸配列としての特徴は、 2つの C y s残基を持ち、該 C y s残基を介して分子内 S— S結合をしており、これら 2つの C y s残基間に少なくとも 6個のァミノ酸からなる配列を含む、全体では少なくとも 8個のぺプチド配列からなる分子である。また、当該分子は C T L A— 4分子のアミノ酸配列とはホモロジ一がほとんど無いという特徴がある。

本発明の免疫制御分子の代表例としては、配列表の配列番号 4に記載した F 2または配列番号 8に記載した F 6が挙げられる。

本発明の免疫制御分子は、ファージクローンより得た F 2及び F 6のべプチド配列情報に基づきその立体構造を保持した状態であれば、何らかのキヤリヤー上か、あるいは蛋白質に組み込まれた形態であるか、またはべプチド合成によりペプチド単独の形態でも使用可能である。さらに、 F 2 または F 6をリード化合物として、 F 2または F 6の立体構造が保持された範囲で当該ペプチド配列を欠失、置換、付加または修飾させてもよい。本発明で用いるモノクローナル抗体は、補助刺激シグナルに関与した分子間の結合を阻害する能力のある抗体であればどのような動物種の抗体でもよく、抗体のサブクラスやアイソタイプには限定されないが、コンフォメーショナルェピトープを認識する抗体が望ましい。本発明では T細胞上に発現する C T L A— 4に対する抗 C T L A— 4抗体として、 U C 1 0— 4 F 1 0— 1 1モノクローナル抗体（ファーミンジェン社製）を使用しているが、これに限定されるものではない。例えば、抗 C D 2 8抗体など、 C T L A— 4及び C D 8 0または C D 8 6との結合、あるいは C D 2 8及び C D 8 0または C D 8 6との結合を阻害することができ、かつコンフォメーンョナルェピトープを認識するモノクローナル抗体であれば使用することができる。コンフオメーショナルェピトープを認識する抗体とは、ェピトープの立体構造を認識する抗体、すなわち、その抗体の抗原結合領域がカウンターパー卜の立体構造を再現しているような抗体をいう。具体的には免疫沈降反応など抗原がネィティブな状態であれば結合できるが、抗原が変性状態ある場合に結合できない抗体のことであり、還元下の状態でウェスタンプロッティング法により抗原と結合できない抗体、またはェピトープの構成ァミノ酸配列をもとに合成されたリニアなぺプチドに結合できないような抗体のことを指す。

本発明で用いるファージランダムべプチドライブラリ一は、ファージ表面にランダム配列を持つぺプチドが提示されているものならば、いかなる種類のファージベクターも使用可能である。挿入されるランダムなぺプチド配列の長さは、 8個以上のァミノ酸のランダム配列が挿入されたものを用いるのが好ましく、 1 5個以上のァミノ酸のランダム配列が挿入されたものがさらに好ましい。さらに、ランダムなペプチド配列はファージの表面に提示されていれば、いかなるファージの構成夕ンパク質に挿入されていてもよいが、 p m分子に揷入されたものが好ましい。 p m分子の N末端から 4番目の A 1 aと 5番目の G 1 yとの間（配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列において、それぞれ 2 2番目と 2 3番目に相当する）に 1 5個以上のァミノ酸のランダム配列が挿入されているものならばぺプチドモチーフの両端に延びるアミノ酸配列がモチーフの三次構造に及ぼす影響を最小限に抑えることができる。本発明は、前述の抗 C T L A— 4抗体を用いて、ファージランダムぺプチドライブラリ一をスクリ一ニングすることから開始する。スクリーニング法としては抗体をプレート上に固定化して使用する一般的なパンニング方法や、抗体を固定化したァフィ二ティーカラム法などを使用することができる。また、パンニング→ファージ回収—ファージ增殖→パンニングの工程を 3回以上繰り返すことによって、目的のファージクローンを濃縮することができる。このようなスクリーニング法によって、抗 C T L A— 4 抗体に結合するべプチド配列を持ったファージクローンを得ることができる。通常このようにして得られたファージクローンは、抗体との結合力の差や保持されているぺプチド配列の種類によっていくつかのクローン集団に分類することができる。ファージクローンのシークェンスはジデォキン法などの常法により簡単に行うことができる。

次に、これらの分類されたクローンの中から、 T細胞制御活性があるべプチド配列を選択するために、 in vitroあるいは in vivoのアツセィ系よつて更なるスクリーニングをする必要がある。例えば、抗 C T L A— 4抗体によって選ばれたファージクローンは、 C T L A— 4分子と同様の働きをすることが期待されているので、 C T L A— 4分子のカウンターレセプタ一である C D 8 0あるいは C D 8 6と結合するかどうか調べることができるアツセィ系により選別することができる。また、補助刺激シグナルが関与する分子が相互作用した結果を実際の免疫反応によって調べることが可能なバイオアツセィ系によりファージを選択することもできる。この場合のバイオアッセィ系とは、 T細胞の活性化の程度がわかる方法であれば、どのような方法でもよく、 T細胞活性化の結果、産生されるサイトカインの量を調べる方法なども適用可能である。抗原により一回感作された動物の T細胞や抗原提示細胞を in vitroでべプチド配列を持つファージクロ一ン単独であるいは、抗原及びべプチド配列を持つファージクローンと共に刺激し、 T細胞の活性化の程度を³ Hチミジンの取り込み度合いで調べる方法が好ましい。分類されたファージクローンを、このような実際の免疫反応を反映したアツセィ系に供することにより、結果として現在知られていないメ力ニズムにより、 T細胞を制御するようなべプチド配列を持ったファージクローンが得られる可能性がある。そのような望ましい例として、 F 6のアミノ酸からなるペプチド配列（配列表の配列番号 8 ) が示される。この F 6配列を持ったファージは、未だ知られていないが、おそらく C D 8 0あるいは C D 8 6とよく似た他の免疫関連因子と相互作用していると思われる。このようなペプチド配列をスクリーニングするためには、ぺプチドがファージ上に表現されたままでアツセィに供することが望ましい。立体構造が重要であるようなべプチド配列の場合、ファージ上から遊離のペプチド状態にすると、その立体構造が保持できない場合が多い。しかし、ファージクローンより得たぺプチド配列情報に基づきその立体構造を保持した状態でぺプチドを合成することができるならば、前述のスクリーニング系にぺプチド単独で供することも可能である。

このような方法により、 C D 8 0あるいは C D 8 6分子に結合し、さらに T細胞を活性化するべプチド配列を持つたファージクローンを得ることができる。その好ましい配列は F 2 (配列表の配列番号 4 ) である。また、 C D 8 0や C D 8 6分子とは結合しないが、 T細胞を活性化するべプチド配列を持ったファージクローンも得ることができる。その望ましい配列は F 6 (配列表の配列番号 8 ) である。

本発明の免疫制御分子は、補助刺激シグナルに関与した分子の発現状態により、 T細胞に対して正の制御または負の制御を行うことができる。例えば C D 2 8が主として作用している状態では、その免疫制御分子は免疫反応抑制因子として働くことができ、一方、 C T L A— 4が主として作用している状態では、免疫反応活性化因子として働くことができる。例えば、本発明の F 2または F 6に代表される免疫制御分子は、 T細胞の抗原特異的な活性化を著しく（5〜1 0倍）促進することが可能である。

また、その免疫制御分子による制御活性は、抗原の種類に依存するものではなく、当該分子と同時に免疫反応の場に存在するものであればいかなる抗原に対する免疫反応をも制御することができる抗原非特異的なものである。さらに、その制御活性を発揮するためには、抗原と同一分子上に存在してもよいが、抗原と個別に使用されてもよい。

本発明の補助刺激シグナルに関与した分子間の相互作用を制御する免疫制御分子は、結果として免疫反応を制御することができることから、免疫反応が係わる疾病には全て応用可能である。最も好ましい使用法としては、ワクチンあるいは、ガンの抗原特異的な免疫療法における免疫反応増強剤やアレルギー反応における免疫抑制剤としての使用などが挙げられる。また本発明は、補助刺激シグナルに関与した分子以外に、一般的なレセプター分子とそれに相互作用するリガンド分子あるいは、酵素分子と基質蛋白質等の生体高分子間の相互作用を制御する小分子を設計するための新しい方法をも提供する。生体高分子間の結合を制御する小分子を ·、ァミノ酸一次配列に依存せずに直接分子設計することができる本発明は、レセプターとリガンドのァゴニストゃアンタゴニストを分子デザィンする上で有用な方法となる。この方法はすべての生体高分子に適用できるので、この新技術で明らかにされるであろう数々のぺプチドモチーフは、今後の新規医薬品の開発に絶大な波及効果をもっと考えられる。しかも、波及効果は単に医薬品開発に留まらず、選択的接着技術を必要とする医療材料、ドラッグデリバリーシステム（D D S ) 等の機能性材料分野の開拓、さらに分子間の特異的結合を利用する応用技術一般にも及ぶものと考えられる。実施例

つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではない。

実施例 1 ：ファージランダムべプチドライブラリ一

Smithら（G. P. Smith, Science, Vol.249, p 386一 390(1 990)) により報告されたファージランダムべプチドライブラリ一は、

1 5

産生されるファージの先端にある pmタンパク分子をコ一ドする遺伝子

(genen) 内に目的に応じた長さのぺプチド配列に相当するランダムな遺伝子を挿入したものであり、 ρΠタンパクは感染能力を保持したままでそのべプチド分子を含んだ形で発現するように設計されたものである。配列表の配列番号 1に ρΠΙタンパクのァミノ酸の一次配列を示した。この一次配列の 22番目の A 1 aと 23番目の G 1 yの間にランダムなァミノ酸配列に対応する遺伝子を挿入することで、このべプチドは pmタンパクと融合した形で発現する。この方法を用いると、数億種類にも及ぶペプチドの集合体を化学反応で合成するよりも容易に得られ、さらに必要に応じてその增幅が可能である。今回のスクリ一二ングに用いたファージランダムべプチドライブラリーは Nishi、 Sayaら（T. Nishi 実験医学、 Vol. 11、 p 95— 100(1993)) が作製したもので、これは Smithらによって報告された方法により作製されたものである。このファージランダムぺプチドライブラリ一は、その先端にある ρΠΙタンパク分子をコ一ドする遺伝子（genem) 内の、配列表の配列番号 1の 22番目の A 1 aと 23番目の G 1 yの間に 15残基のランダムなアミノ酸配列に対応する遺伝子が挿入されて、 ρΠタンパクとこの 15残基のァミノ酸が融合した形で発現するように設計されたものである。この 15残基のランダムなぺプチド分子をファージの ρΠΙタンパク内に発現するファージ（fd- tet) を今回のスクリ一二ングに用いた。

実施例 2 ：スクリ一二ングに用いる抗体の活性

本発明の目的は、 CD 80と CTL A— 4あるいはこれらの分子と関連する分子と相互作用して免疫調節作用を示すぺプチド配列をもつファージクローンを得ることである。そこで実施例 1に示したファージランダムべプチドライブラリーのスクリーニングを、抗マウス CTLA— 4モノクローナル抗体（ファーミンジェンより購入： UC10— 4F10— 11) を用いて、この抗体に特異的に結合するファージクローンの単離を行った。この抗体に特異的に結合するファージの pmに含まれる 15残基のモチーフは、 CTL A— 4分子の抗体に認識される部分と同様な構造を持っていると考えられる。この部分はリガンドへの相互作用部位であるのでファージより得られたモチーフも CD 80分子または CD 86分子を認識し、 C TLA— 4分子と CD80分子または CD86分子との相互作用に影響を与えるか、あるいは CD 80分子または CD 86分子に何らかのシグナル ' を伝える可能性がある。

まず、スクリーニングに用いたこの抗体の特異性を調べるために、以下の操作を行った。この操作で用いた CTLA— 4— I g及び CD80— I gキメラ分子は、 Linsleyら（ J. Exp. Med. Vol.174, p561— 5 69(1991)) の方法に従って作製した CTL A— 4— I g及び CD 8 0— I gのキメラ遺伝子断片を pC DM 8に組み込んだ発現プラスミド（上掲（北大免疫研）より恵与）を、それぞれ DEAE—デキストラン法を用いて COS 7細胞に遺伝子導入後、培養 72時間後の上清よりプロティン Aセファロース（フアルマシア社）を用いて精製したものを使用した。

まず 96ゥエルの E I Aプレート（住友べ一クライト、東京）に 0.0 2%NaN₃を含む 5 OmMトリス一 HC 1、 pH7.5、 15 OmM N a C 1 (TBS) で希釈した C TLA— 4— I g (200 n g/m 1 ) を 1ゥエルあたり 50 μ 1分注し、 37でで1時間反応後、 0.5%Tween 20を含む 5 OmMトリスー HC 1、 pH7.5、 15 OmM N a C 1 (T BST) で洗浄した。各ゥエルに 1%牛血清アルブミン（BSA) を 25 0^ 1分注し、 37°Cで 1時間反応させてマスキングを行った。各ゥエルを TB STで洗浄後、 TB Sで種々の濃度に希釈した抗マウス CTL A— 4モノクロ一ナル抗体を 1ゥエルあたり 100 / 1分注し、 37°Cで 1時間反応後、 TBSTで洗浄した。その後 TB Sで 200 n g/m 1に希釈したピオチン標識したマウス CD 80— I gを 1ゥエルあたり 50 1分注し、 37°〇で1時間反応後、 TBSTで洗浄した。最後に TBSで 10 0倍に希釈したアル力リフォスタファ一ゼ標識ストレプトアビジン

(Leinco Technologies Ltd. , ミズーリ）を室温で 1時間反応、 TBS Τで洗浄後、基質である ρ—ニトロフエニルリン酸ナトリウム六水和物（和光純薬、大阪）を加え吸光度 405 nmを測定した。陰性対照として抗マウス CTLA— 4モノクローナル抗体の代わりにこの抗体と同じアイソタイブであるハムスター抗体（ハムスター血清の硫酸アンモニゥム（33〜 55%) 飽和画分を PB Sに対して透析したもの）を用いた。その結果、図 1に示すように、ここで用いた抗マウス CTLA— 4モノクローナル抗体は CTLA— 4— I gと CD80— I gの結合を完全に阻害することを確認した。

実施例 3 ：抗 CTLA— 4抗体と結合するファージクローンのパンニング実施例 2に示した CTLA— 4— I gと CD 80— I gの結合を阻害する抗 CTLA— 4抗体を用いて、以下に示す方法に従って実施例 1に述べたファージランダムペプチドライブラリ一のパンニングを行った。直径 3 5mmのプラスチックプレート（岩城ガラス、東京）に抗マウス CTLA —4モノクロ一ナル抗体を 1枚あたり 10 g /mlを lmlコートし、ファージランダムべプチドライブラリー（1.2 X 10¹²TU) と 4°Cで 16時間反応させた。このプレー卜を TB STで洗浄後、結合しなかったファージを取り除き、 0. IN HC 1—グリシン、 pH2.2 (lmg/m 1 BSA、 0. lmg/m 1 フエノールレッド（ギブコ、ニューヨーク））を加え、抗マウス CTLA— 4モノクローナル抗体に特異的に結合したファ一ジを溶出し、回収後、 pH9.1のトリス一 HC 1で中和した。得られたファージを大腸菌 K 91 k a nに感染させ増殖させた後、パンニングに用いる抗マウス CTLA— 4モノクロ一ナル抗体の量を 5 fig, 1〃gと減らしながら同じ操作を計 3回行い、より強く特異的に抗マウス CTLA — 4モノクローナル抗体と結合するファージの選別を行った。

得られたファージ 58個のクローンについて EL I S A法を用いた一次スクリーニングを行った。 Smithらの方法（G. P. Smith Method in Enzymology Vol.217 p228— 257(1993)、アカデミックプレス）に従い精製した各ファージ（4x 10⁹ビリオン/ゥエル/ 40 u l ) を 96ゥエル EL I SAプレート（住友べ一クライト、東京）に 4。Cで 1 晩でコートし、 TBSTで洗浄し、 0.02%NaN₃、 1%BSAを含む 50mMトリス一 HC 1、 pH7.5、 150mM NaC lを 1ゥエルあたり 100 1加え、室温で 2時間プロックした。このプレートを TB S Tで洗浄後、抗マウス CTLA— 4モノクロ一ナル抗体（200 n g/m 1 /ゥエル/ 100 1 ) を加え室温で 1時間反応させた。 TBSTで洗浄後、 TB Sで 250倍に希釈したアル力リフォスタファーゼ標識の抗ハムスター I gG抗体（ザィメット、カリフォルニァ）を室温で 1時間反応、洗浄後、基質である p—二トロフエ二ルリン酸ナトリウム六水和物（和光純薬、大阪）を加え、 405 nmにおける吸光度を測定した。その結果、抗マウス CTLA— 4モノクロ一ナル抗体と反応するファージクローンが 21個確認できた（図 2) 。

実施例 4 ：パンニングされたファージクローンの挿入べプチドのァミノ酸配列の決定

実施例 3で得られた 21個のファージクローンの挿入べプチドに対応する核酸塩基配列について、それぞれのファージから DNAを Smithらの方法（G. P. Smith, Method in Enzymology, Vol.217、 p 228 - 2 57(1993)、ァカデミックプレス）に従って回収し、配列表の配列番号 2に示す合成 DNAをプライマーとして、 Applied B iosystems社の 3 73 A-36 S DNAシークェンサ一を用いて核酸塩基配列の解析を行つた。このプライマ一は配列表の配列番号 1に示したァミノ酸配列の 37番の P r oから 41番の As nの領域に対応するものである。核酸塩基配列の解析の結果、これらのファージクローンの、配列表の配列番号 1に示す ρΙΠタンパクの 22番目の A l aと 23番目の G l yの間に含まれるアミノ酸配列モチーフは、配列番号 3から 8に示す 6種類のァミノ酸配列に分類されることが確認された。これらのアミノ酸配列を CTL A— 4のアミノ酸配列と比較したが、ホモロジ一は認められなかった。これらのァミノ酸配列のモチーフを表 1に示す。これらのアミノ酸配列モチーフを、それぞれ F1 (配列番号 3) 、 F 2 (配列番号 4) 、 F 3 (配列番号 5) 、 F 4 (配列番号 6) 、 F 5 (配列番号 7) 及び F6 (配列番号 8) とし、以下の解析を行った。表 1

F 1 ： Gly Leu His Ser Arg Cys His lie Gly Arg Asp Cys Ser Ser Ala F 2 ： Gly Phe Val Cys Ser Gly lie Phe Ala Val Gly Val Gly Arg Cys F 3 ： Ser Cys Val Phe His His Ser Gly Arg Tyr Trp Gly Arg Cys Val F 4 ： His Tyr Gly Asp Cys Arg Tyr Asp Leu Gly Ser Cys Arg Gly Ala F 5 ： Ala Cys Val Met Tyr Asp Phe Val Leu Arg Gly Met Cys Ala Arg F 6 ： Ala Pro Gly Val Arg Leu Gly Cys Ala Val Leu Gly Arg Tyr Cys 実施例 5 ：各モチーフと抗マウス C TLA— 4モノクロ一ナル抗体との結合特異性

実施例 4に示したそれぞれのモチーフが、特異的に抗マウス C T L A— 4モノクローナル抗体に結合するかどうかについての検討を行った。特異性の検討は実施例 3に示した EL I S A法により行った。陰性コントロールとして抗マウス CTL A— 4モノクローナル抗体と同じアイソタイプである抗マウス CD 28抗体（ファーミンジヱン、サンジエゴ）およびハムスター I gGを用いた。検出抗体には抗ハムスタ-■· I gG抗体を用いた。その結果、 F 2配列を発現するファージと F 6配列を発現するファージがより強く抗マウス CTLA— 4モノクローナル抗体と反応し、 F 1配列、 F 4配列及び F 5配列を発現する各ファージは弱く反応することがわかつた。また、 F3配列を発現するファージはさらに弱く反応した（図 3) 。なお、この F 2配列を発現するファージを産生する大腸菌が Escherichia coli F 2 [FERM BP— 6009] として、また、 F 6配列を発現するファージを産生する大腸菌が Escherichia coli F 6 [FERM BP -6010] として、 1997年 4月 14日（原寄託日； 1997年 7月 4日にそれぞれ微ェ研菌寄第 P— 16192号および第 P— 16193号よりブダぺスト条約に基づく寄託へ移管）に通商産業省工業技術院生命ェ学工業技術研究所（茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305) ) に出願人により寄託されている。

実施例 6 ：各々のファージの T細胞増殖刺激活性

実施例 5に示したように、今回得られた 6種類の配列を発現するファ一ジは、抗マウス CTLA— 4モノクローナル抗体と結合活性を有することから、これらの配列を発現するファージは、アミノ酸配列は類似していないが、 CTLA— 4分子のホモローグとして、 CTLA— 4分子と同様の働きをすることが期待される。そこで、まず T細胞増殖に及ぼすこれらのファージの影響をマウスを用いて検討した。

実験には Balb/cマウス（6週令）を用い（1群 4匹）、ファージは Smithらの方法（G. P. Smith, Method in Enzymology, Vol.217、 p228— 257(1993)、アカデミックプレス）に従って精製した。ファージの量は、プロテインアツセィキット（バイオラド）を用いて牛血清アルブミンをスタンダードとして測定し、タンパク濃度で表した。

まず、 Balb/cマウスに対する抗原刺激として、 ρΙΠタンパクを発現していないファージ本体（W. T.)を 10 g(200 1/PBS)腹腔内投与した。投与 4週間後に各マウスより常法に従って脾臓細胞を摘出し、この脾臓細胞を 96ゥエルカルチャープレー卜に 1ゥエルあたり 1.5 X 10⁵ 細胞分注し、精製した W. T.のファージおよび F 1〜F 6の配列を発現するファージを最終濃度 0.015から 5 zg/mlになるように加え、計 2 00 1 (10%F C Sを含む RPM I 1640培地）とし、各サンプルについて 3検体ずつ用意した。これらの試料を 30分間氷上でィンキュペート後、 3日間 37° (：、 5%C〇₂の条件で培養を行った。培養終了 18 時間前に [³H]チミジン（0.5〃CiZwell) でパルスラベルを行い、セルハ —ベスターで細胞を回収し、「³H] チミジンの取り込み量を液体シンチレーシヨンカウンターで測定した。その結果、図 4に示すように T細胞の増殖は、 Fl、 F3、 F4、 F 5配列を発現するファージを加えた群は、 W. T.ファージを加えた群と同程度の活性しか認められなかったが、 F 2 および F 6配列を発現するファージを加えた群は、 W. T.ファージを加えた群と比べて 5倍から 10倍の T細胞の著明な増殖が認められた。以上のことから F 2及び F 6配列を発現するファージには T細胞の抗原特異的な増殖刺激活性があることが示された。

実施例 7 ： F 2及び F 6配列を有するファージのマウス CD 80への結合活性

実施例 5で T細胞増殖刺激活性を示した、 F 2及び F 6配列を発現するファージの CTLA— 4のレセプターであるマウス CD 80に対する結合活性を調べた。

結合活性の評価は EL I S A法を用いた。 F 2および F 6配列を発現するファージ（4x 10⁹ビリオン/ゥエル/ 40〃 1 ) を 96ゥエル E L I S Aプレート（住友べ一クライト、東京）に 4°Cで 1晚でコ一トし、 1% B S Aを含む 5 OmMトリスー HC 1、 pH7.5、 15 OmM N a C 1 (TBS) で室温で 2時間ブロックした。このプレートを TB S Tで洗浄後、 P B Sで希釈したマウス CD 8 O— I gを 200ngから 1000η g/35〃 l加え、室温で 1時間反応させた。 TBSTで洗浄後、 TBS で 100倍に希釈したアル力リフォスタファーゼ標識の抗ヒ卜 I gG抗体 (ザィメット、カリフォルニア）を室温で 1時間反応、洗浄後、基質である p—二トロフエ二ルリン酸ナトリゥム六水和物を加え吸光度 40 δ nm を測定した。その結果、 F 2配列を発現するファージのみがマウス C D 8 0— 1 gに濃度依存的に結合することが確認された（図 5) 。

次にこの F 2ファージの CD 80一 I gへの結合の特異性をみるために、 F 2配列を発現するファージをコ一トしたプレー卜に対してマウス CD 8 0— I g、マウス CTLA—4— I g、ヒト I gGとの反応を、本実施例に述べた方法に従って EL I S A法により検討を行った。その結果、 F2 配列を発現するファージはマウス CD 80— I gのみ特異的に反応することが確認できた（図 6) 。

実施例 8 ： F 2配列を発現するファージのヒト CD 80— I gとの結合性実施例 7では F 2ファージがマウス CD 80— I gと特異的に結合することを示したが、次に、この F 2配列を発現するファージがヒト CD80 — I gと特異的に結合するかどうかを、実施例 7、図 5に示した方法に従つて検討した。ヒ卜 CD 80— I gの調製にあたっては、 Linsleyらの方法 ( J . Exp. Med. Vol.173、 p 721— 730(1991)) に従って、ヒト CD80の細胞外ドメインとヒト Ig Cァ 1領域との融合遺伝子を構築した。この融合遺伝子断片が pCDM8に組み込まれた発現プラスミドを、 DEAE—デキストラン法を用いて COS 7細胞に遺伝子導入後、培養 72時間後の上清よりプロテイン Aセファロース（フアルマシア社）を用いてヒト CD80— I gを精製した。このようにして調製したヒト CD 80- 1 gを用い、 F 2配列を発現するファージのヒト CD80— I gへの結合活性を、マウス CTLA—4— I g及びヒト I gGを陰性対照として調べたところ、図 7に示すように、 F 2配列を発現するファージはマウス CD 80- I gと同様にヒ卜 CD80_ I gと特異的に結合することが確認された。この結果は、 F 2配列を発現するファージは、ヒ卜の免疫系にも作用しうることを示している。

実施例 9 ：鶏卵リゾチーム免疫マウスに対する F 2及び F 6配列を発現するファージの T細胞増殖刺激活性

実施例 6で F 2及び F 6配列を発現する各ファージが T細胞増殖刺激活性を有することを示した。実施例 6では、最初の抗原刺激としてファージタンパクを用い、 in vitroの二次刺激ではこのファージタンパクに F 2あるいは F 6配列が発現したものを用いた。つまり実施例 6では、抗原としてファージタンパク質を用い、二次刺激の際に、この抗原と F 2あるいは F 6配列が同じ粒子上に存在する状態で行われた。そこで、今回認められた F 2あるいは F 6配列を発現するファージの T細胞増殖刺激活性を、最初の抗原刺激として、ファージとは全く異なる抗原（鶏卵リゾチーム）を用い、二次刺激として、鶏卵リゾチームと F 2あるいは F 6配列を発現するファージ粒子を個別に加える系で実施例 6と同様の検討を行った。

まず B alb/cマウスに対して鶏卵リゾチームを 1 ( 1 0 0 z l /フ口イント不完全アジュバント（F I A )) 皮下注射した。投与 4週間後に各マウスより常法に従って脾臓細胞と所属リンパ節を摘出した。本実施例ではこの脾臓細胞を調製後 9 6ゥエルカルチヤ一プレー卜に 1ゥエルあたり 1 . 5 x 1 0 ⁵細胞に分注し、各サンプルに鶏卵リゾチームを 3 g /m 1 で添加し、 F 2及び F 6配列を発現するファージを添加する時期を（各ファ —ジの添加量は 1 g /m 1 ) 、鶏卵リゾチーム添加と同時、 1日後、 2 日後の 3通りに設定した。陰性対照として、 W. T.ファージを添加した。培養以降の測定は実施例 6に従った。その結果、図 8に示すように、最初の抗原刺激はファージ由来の抗原でなくても（この場合は鶏卵リゾチーム）、 F 2及び F 6配列を発現するファージは、 T細胞の抗原特異的な増殖刺激活性を示した。しかもこの活性は、抗原と同一分子上になくても作用し、抗原と同時に添加する方が効果が高いことが示された。

実施例 1 0 ： T細胞増殖刺激活性における F 2及び F 6配列を発現する各ファージのレセプタ一特異性

F 2及び F 6配列を発現する各ファージは、実施例 5に示すように、抗マウス CTLA— 4モノクローナル抗体と反応し、そのうち F 2配列を発現するファージは、実施例 7に示すようにマウス CD 80— I gと特異的に結合する。そこで実施例 9に示された F 2及び F 6配列を発現する各ファ —ジの T細胞増殖刺激活性が、これらのレセプタ一—リガンドを介した反応の結果かどうかを調べるために、実施例 9で述べた F 2及び F 6配列を発現する各ファージの T細胞増殖刺激活性に対する、 CD80— I g， C D86— I gの影響を測定した。

Balb/cマウスに対して鶏卵リゾチームを 50 g(l 00/11 /PB S)腹腔内投与し、投与 4週間後各マウスより常法に従つて脾臓細胞を摘出した。本実施例では、この脾臓細胞を 96ゥエルカルチャープレー卜に 1.5 X 10⁵細胞に分注し、各サンプルに鶏卵リゾチーム 3〃 g/m 1と F 2あるいは F 6配列を発現しているファージ（1 8/111 1 )と〇080— 1 gまたは CD 86— I gまたは陰性対照としてヒトー 18を0から1 /：11 1 で添加し、実施例 6で述べた方法に従って T細胞増殖刺激活性を調べた。その結果、図 9に示すように F2配列を発現するファージは、 CD80 一 Ig存在下では著しく T細胞増殖刺激活性が阻害され、 CD86— Ig存在下では、 CD 80— I gの場合の 40%程度の阻害が認められた。 Mak らの報告によると、 CTLA— 4遺伝子をノックァゥトしたマウスでは T 細胞の過剰な活性化がおこり、生後 3〜 4週間で死亡することから

(Science Vol.270 , p 985 ( 1995 )). CTLA— 4分子が T細胞の活性化を抑制する機能を有していることが示唆されている。 Makらの報告に従えば、今回得られた結果は、 F 2配列を発現するファージが CD 80或いは CD 86と CTL A— 4の相互作用に影響した結果、 T細胞増殖を誘導したことを示唆している。このように、 F2配列を発現するファ一ジが、 C T L A— 4分子の T細胞の活性化に対する負の作用を阻害した可能性や、 CD 80或いは CD 86と結合することで A PCを介して T細胞の活性化に対して正のシグナルを与えた、などの可能性が考えられる。

—方、同様の実験を F 6配列を発現するファージで行ったところ、図 1 0に示すように CD 80— I gあるいは CD86— I gを添加しても全く T細胞増殖刺激活性が阻害されず、 F 6配列を発現するファージはこれらのレセプター一リガンドとは別の分子を介して T細胞増殖刺激活性を示しているものと思われる。これは、今回のように抗リガンド抗体を用いてファージランダムぺプチドライブラリ一のスクリ一二ングを行うことで、目的のリガンドと似た未知のリガンド或いはレセプター様の分子と相互作用するファージが得られることを示しており、未知のリガンド或いはレセプタ一のスクリ一二ングに有効であることを示している。

実施例 11 ： B型肝炎表面抗原（HB s Ag) 免疫マウスに対する F2または F 6配列を発現するファージの抗 HB s A g抗体産生増強活性

実施例 9において、 F 2または F 6配列を発現するファージが、鶏卵リゾチーム免疫マウスに対して T細胞増強刺激活性を有することが示され、 F 2または F 6配列を発現するファージが外来抗原に対しても免疫系の細胞を活性化することが明らかになった。そこで、次に，この免疫系の細胞の活性化がヮクチン抗原を免疫した際にも認められるかどうかを B型肝炎表面抗原（HB sAg) を用いて検討を行った。

まず、 Balb/cマウス（4匹 Z1群）に対して、酵母産生組換え HB s Ag (yHB s Ag； (財)化学及血清療法研究所）を 10 g (100 1/PBS) のみ、または yHB s Agとともに F2または F6配列を発現するファージ（10 g/100 ζ 1 ) を腹腔内投与した。さらに初回免疫より 15日後に、同じ組み合わせのサンプルを腹腔内投与した。初回免疫より 3週間後各マウスより採血を行い、血清を PB Sで 50倍、 20 0倍、 800倍希釈した後、抗 HB s Ag抗体価をォーサブ E I Aキット

(アポット社）を用いて測定した。

抗体価の定量は、キッ卜に添付された陽性コントロールをスタンダードとして用いて行った。その結果、図 11に示すように、 HB s A gのみを免疫した群が示した抗 H B s A g抗体価を 1とした場合、 F 2または F 6 配列を発現するファージと共に yHB s A gを免疫した群は、 3週間後の血中の抗 HB s A g抗体価はそれぞれ 17.9および 11.9であり、有意に高かった。この結果より、 F2または F6配列を発現するファージがァジュバント活性を有することが明らかとなった。

配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 4 3 2

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

起源

生物名バクテリオファージ（fd-tet)

配列

Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala lie Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser

5 10 15

His Ser Ala Asp Gly Ala Gly Ala . Ala Gly Ala Glu Thr Val Glu Ser

20 25 30

Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu Asn Ser Phe Thr Asn Val Trp Lys

35 40 45

Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn Tyr Glu Gly Cys Leu Trp 50 55 60

Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr Gly Asp Glu Thr Gin Cys Tyr 65 70 75 80 Gly Thr Trp Val Pro lie Gly Leu Ala lie Pro Glu Asn Glu Gly Gly 85 90 95

Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly

100 105 110

Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr Pro lie Pro Gly Tyr Thr Tyr

115 120 125 lie Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Pro Pro Gly Thr Glu Gin Asn Pro 130 135 140

Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu Ser Gin Pro Leu Asn Thr Phe 145 150 155 160

Met Phe Gin Asn Asn Arg Phe Arg Asn Arg Gin Gly Ala Leu Thr Val

165 170 175

Tyr Thr Gly Thr Val Thr Gin Gly Thr Asp Pro Val Lys Thr Tyr Tyr

180 185 190

Gin Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala Met Tyr Asp Ala Tyr Trp Asn

195 200 205 ε OSE ε

siV Π3ΐ io s ΙΒΛ dsy 9Π aqj χο dsy an ^TV ^IV ι m οτε gos dsy ュ八 ^j S dsy ngq sAq sA Etv dsy -i3S ui9 ng B"[y

OOS 96Z 062 usy η 9 dsy Βχν usy η ^ jq q.9¾ Β γ ^ sA usy εχν usy εχν

582 082

s q ηχο αλχ dsy aqj dsy Αχο I9S χ3 s Αχο Αχο Aio JQS TO

0Z2 592 092

^TO ηχ3 J9S λΐ3 χο jgs χο Λχο ηχο JQS

55^ 092 5^

"TO J9S 3 ^19 ^13 ^IO ^ s ^I ^ID ¾TV usy ΙΒ_Λ m ^zz o-id c d ojj ng dsy S UTO ^TO ^ ⁿI3 sAo Qqd

022 SIS 0Ϊ2

OJJ dsy nif) usy 9qj J3S STH 9qd eiv SAQ dsy SJV QMd sAq Λ13 Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gin Met

340 345 350

Ala Gin Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg

355 360 365

Gin Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gin Ser Val Glu Cys Arg Pro Tyr Val

370 375 380

Phe Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser lie Asp Cys Asp Lys lie

385 390 395 400

Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe

405 410 415

Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn lie Leu Arg Asn Lys Glu Ser

420 425 430

配列番号： 2

配列の長さ： 1 8

配列の型：核酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 DNA)

配列

TGAATTTTCT GTATGAGG 18 配列番号： 3

配列の長さ： 1 5

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他のぺプチド（人エペプチド）

配列

Gly Leu His Ser Arg Cys His lie Gly Arg Asp Cys Ser Ser Ala 1 5 10 15 配列番号： 4

配列の長さ： 1 5

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他のぺプチドド）配列

Gly Phe Val Cys Ser Gly lie Phe Ala Val Gly Val Gly Arg Cys 1 5 10 15 配列番号： 5

配列の長さ： 1 5

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他のぺプチド（人エペプチド）

配列

Ser Cys Val Phe His His Ser Gly Arg Tyr Trp Gly Arg Cys Val 1 5 10 15 配列番号： 6

配列の長さ： 1 5

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他のぺプチド（人エペプチド）

配列

His Tyr Gly Asp Cys Arg Tyr Asp Leu Gly Ser Cys Arg Gly Ala 1 5 10 15 配列番号： 7

配列の長さ： 1 5

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他のぺプチド（人エペプチド）

配列

Ala Cys Val Met Tyr Asp Phe Val Leu Arg Gly Met Cys Ala Arg 1 5 10 15 配列番号： 8

配列の長さ： 1 5

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他のぺプチド（人エペプチド）

配列

Ala Pro Gly Val Arg Leu Gly Cys Ala Val Leu Gly Arg Tyr Cys 1 5 10 15

Claims

請求の範囲

1. 抗原提示細胞による T細胞活性化において、抗原提示細胞上及び/ または τ細胞上の補助刺激シグナルの伝達に関与する分子に相互作用することにより補助刺激シグナルの伝達を制御する免疫制御分子。

2. 当該補助刺激シグナルの伝達に関与する分子に対するモノクローナル抗体により認識される、請求項 1記載の免疫制御分子。

3. 当該補助刺激シグナルに関与する分子が細胞障害性 Τリンパ球関連

3 δ

抗原 4 (CTL Α- 4) であり、当該モノクローナル抗体が抗 CTLA— 4モノクローナル抗体である、請求項 1または 2に記載の免疫制御分子。

4. 当該補助刺激シグナルの伝達に関与する分子が CD28であり、当該モノクローナル抗体が抗 CD 28モノクローナル抗体である、請求項 1 または 2に記載の免疫制御分子。

5. 当該補助刺激シグナルの伝達に関与する分子が CD80であり、当該モノクローナル抗体が抗 CD 80モノクロ一ナル抗体である、請求項 1 または 2に記載の免疫制御分子。

6. 当該補助刺激シグナルの伝達に関与する分子が CD 86であり、当該モノクローナル抗体が抗 CD 86モノクローナル抗体である、請求項 1 または 2に記載の免疫制御分子。

7. 2個のシスティン（Cy s) 残基を有し、当該システィン残基は C y s-Cy s結合を形成しており、かつ当該 Cy s -Cy s結合間に少なくとも 6個のァミノ酸からなる配列を有するぺプチドを含有する、請求項 1または 2に記載の免疫制御分子。

8. 当該べプチドが配列表の配列番号 4に記載のぺプチドであり、少なくともアミノ酸番号 4番目から 15番目の配列を有する、請求項 7に記載の免疫制御分子。

9. 当該ペプチドが配列表の配列番号 4に記載のペプチドを有する、請求項 7または 8に記載の免疫制御分子。

1 0. 当該べプチドが配列表の配列番号 8に記載のぺプチドであり、少なくともアミノ酸番号 8番目から 1 5番目の配列を有する、請求項 7に記載の免疫制御分子。

1 1 . 当該べプチドが配列表の配列番号 8に記載のぺプチドを有する、請求項 7または 1 0に記載の免疫制御分子。

1 2. 配列表の配列番号 8に記載のぺプチドを有する免疫制御分子により認識される免疫関連因子。

1 3 . 請求項 1から 1 1のいずれかに記載の免疫制御分子を含有することを特徴とする免疫制御剤。

1 4. 請求項 1から 1 1のいずれかに記載の免疫制御分子を組み込んだ、キヤリヤーまたは蛋白質を含有することを特徵とする免疫制御剤。

1 5 . 請求項 1 3または 1 4に記載の免疫制御剤を含有することを特徴とする免疫増強剤。

1 6. 請求項 1 3または 1 4に記載の免疫制御剤を含有することを特徴とする免疫抑制剤。

1 7. 特異的な相互作用をする 2分子のうちのいずれか一方の分子の相互作用部位と類似した立体構造を有するぺプチド配列の製造方法であって、該分子の相互作用部位の立体構造を認識する抗体を用いて 8個以上のァミノ酸配列を提示するファージランダムべプチドライブラリ一をスクリ一二ングすることによって、該分子の相互作用部位と類似した立体構造を有するべプチド配列を単離することを特徴とする方法。

1 8. 当該分子の一つが C T L A— 4である請求項 1 7に記載の方法。

1 9 . 当該立体構造を認識する抗体が、抗 C T L A— 4モノクロ一ナル抗体である請求項 1 7または 1 8に記載の方法。

2 0 . 当該ペプチドが、 2個のシスティン（C y s ) 残基を有し、当該システィン残基は C y s - C y s結合を形成しており、かつ当該 C y s - C y s結合間に少なくとも 6個のアミノ酸からなる配列を有するぺプチドである請求項 1 7から 1 9のいずれかに記載の方法。

2 1 . 当該ペプチドが配列表の配列番号 4に記載のペプチドであり、少なくともアミノ酸番号 4番目から 1 5番目の配列を有する、請求項 2 0に記載の方法。

2 2. 当該べプチドが配列表の配列番号 4に記載のぺプチドを有する、請求項 2 0または 2 1に記載の方法。

2 3 . 当該べプチドが配列表の配列番号 8に記載のぺプチドであり、少なくともアミノ酸番号 8番目から 1 5番目の配列を有する、請求項 2 0に記載の方法。

2 4. 当該べプチドが配列表の配列番号 8に記載のぺプチドを有する、請求項 2 0または 2 1に記載の方法。