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WO1998043995A1 - Nouveaux complexes anti-vih et compositions medicamenteuses - Google Patents

Nouveaux complexes anti-vih et compositions medicamenteuses Download PDF

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WO1998043995A1
WO1998043995A1 PCT/JP1998/001366 JP9801366W WO9843995A1 WO 1998043995 A1 WO1998043995 A1 WO 1998043995A1 JP 9801366 W JP9801366 W JP 9801366W WO 9843995 A1 WO9843995 A1 WO 9843995A1
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WO
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hiv
residue
amino acid
arg
group
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/001366
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English (en)
French (fr)
Inventor
Nobutaka Fujii
Original Assignee
Seikagaku Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seikagaku Corporation filed Critical Seikagaku Corporation
Priority to AU65186/98A priority Critical patent/AU6518698A/en
Publication of WO1998043995A1 publication Critical patent/WO1998043995A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43509—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from crustaceans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel substance having anti-HIV activity and a pharmaceutical composition containing the substance as an active ingredient. More specifically, a complex in which a reverse transcriptase inhibitor and a Z or HIV protease inhibitor are bound to a polypeptide having an anti-HIV activity by a chemical bond, an anti-HIV agent containing the substance as an active ingredient, and the like. And a pharmaceutical composition.
  • HIV Human immunodeficiency virus
  • AIDS acquired immunodeficiency syndrome
  • AIDS-related syndrome AIDS-related syndrome
  • Drugs that inhibit each stage of HIV growth are known as anti-HIV drugs, but drugs that are actually licensed or undergoing clinical trials include reverse transcriptase inhibitors (for example, nucleoside 3′-azido-3, -deoxythymidine (hereinafter also referred to as AZT), 2,, 3,1-dexoxyinosine (hereinafter also referred to as ddl), 2 ′, 3′-deoxycytidine (hereinafter ddC) Etc.) and HIV protease inhibitors (N, 1 [1 (S) 1 benzyl-3--3- [4 a (S), 8 a (S), 3 (S)-(tert-butyl carbamoyl) ) Decahydroisoquinoline 1-2-yl] 1-2 (R) -hydroxypropyl] 1N "-quinoline-2-ylcarbamoyl) 1-L-asparagineamide (hereinafter also referred to as Ro 31-8959) )
  • these anti-HIV drugs require large doses and long-term administration, so that side effects (such as bone marrow damage) and the development of drug-resistant viruses due to reverse transcriptase or amino acid mutations in HIV protease are required. There were problems such as appearance.
  • a novel polypeptide having an antiviral activity and an anti-HIV agent containing this polypeptide as an active ingredient are known (International Publication WO92 / 043734, JP-A-5-1633).
  • the polypeptide is known to exhibit the same level of anti-HIV activity as AZT, such as reverse transcriptase inhibitors and HIV proteases. It is also known that when administered in combination with a monose inhibitor, it exhibits excellent anti-HIV activity (Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-252440).
  • Toxic side effects such as reverse transcriptase inhibitors and HIV protease inhibitors can also be caused by administration of a combination of a polypeptide having anti-HIV activity and a reverse transcriptase inhibitor or HIV protease inhibitor, etc. It cannot be reduced and remains a problem to be solved, and anti-HIV drugs with lower toxicity are expected. Disclosure of the invention
  • the present inventors have developed a polypeptide based on a polypeptide having anti-HIV activity and having high affinity for HIV surface protein.
  • a complex in which an anti-HIV active substance such as a reverse transcriptase inhibitor or an HIV protease inhibitor has been chemically bonded to the amino (N) terminus of the polypeptide has been used as an anti-HIV agent.
  • the present inventors have found that it is possible to exhibit IV activity and reduce side effects, and thus completed the present invention.
  • the present invention relates to a polypeptide having an affinity for an HIV surface protein, preferably a polypeptide of the following formula (1), and one or more anti-HIV active substances (a reverse transcriptase inhibitor and a Z or HIV protein). And a pharmaceutical composition containing the complex as an active ingredient.
  • a polypeptide having an affinity for an HIV surface protein preferably a polypeptide of the following formula (1)
  • one or more anti-HIV active substances a reverse transcriptase inhibitor and a Z or HIV protein.
  • a pharmaceutical composition containing the complex as an active ingredient I 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3
  • 81 is ⁇ 1— (derived from the amino group of A2), or one basic amino acid selected from lysine, arginine and ordinine, or the same or selected from these amino acid residues.
  • a peptide residue having at least two different amino acid residues, or a hydrogen atom at the N- ⁇ position of the amino terminal amino acid residue of the basic amino acid residue or the peptide residue is an acyl group or substitution
  • a 2 independently represents a tyrosine, phenylalanine or tributophan residue
  • a 3 independently represents a lysine or arginine residue
  • a 4 represents an amino acid residue or a peptide residue having at least one amino acid selected from lysine and arginine;
  • Y represents a peptide residue represented by the following formula (a):
  • a 6 independently represents an alanine, nocrine, leucine, isoleucine, serine, cysteine or methionine residue
  • A7 represents a tyrosine, phenylalanine, tryptophan, alanine, palin, oral isin, isoleucine, serine, cysteine or methionine residue;
  • G 1 y represents a glycine residue.
  • D-Ordityl-proline Prolyl-D-Orditin, Prolyl-D-lysine, Prolyl-D-arginine, D-Rigid-loop phosphorus, D-Arginyl-proli And glycyl-lysine, glycyl-arginine, ornithyl-glycine, glycylornithine, lysyl-glycine, and arginyl-glycine.
  • a hydrogen atom of a side chain ⁇ -amino group of a certain D-lysine, lysine, D-orudin or ordinin indicates a peptide residue which may be substituted with an acyl group;
  • Cys indicates a cysteine residue, and the cysteine residues at positions 3 and 11 may be linked by a disulfide bond.
  • the conjugate of the present invention is characterized in that at least the above-mentioned polypeptide and an anti-HIV active substance such as AZT are bound by a chemical bond, whereby CD4 positive cells, which are targets for HIV infection in vivo, are tested. It transports an HIV active substance and releases an anti-HIV active substance in the cells to exhibit excellent anti-HIV activity.
  • a composition containing this novel complex as an active ingredient is safe. It is effective as a pharmaceutical composition such as an anti-HIV drug which is high and has few side effects.
  • the novel complex of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the substance of the present invention) is a polypeptide which has affinity for HIV surface proteins gp120 and Z or HIV host target cell surface protein CD4, 1 or A complex in which two or more reverse transcriptase inhibitors and / or HIV protease inhibitors are bound by a chemical bond.
  • the polypeptide constituting the present invention is not particularly limited as long as it is a polypeptide having an affinity for the HIV surface proteins gp120 and Z or the HIV host target cell surface protein CD4.
  • suitable polypeptides include antibodies and polypeptides represented by the following formula (1).
  • the protein also has affinity for the cell surface protein CD4 of CD4 positive cells (host target cells), which are host targets of HIV. (Biochem. Biophys. Res. Commun., 219, 555-559 (1996), Biochem. Biophys. Acta., 1298.37-44 (1996)), which is itself represented by the following formula (1) having anti-HIV activity. Polypeptides are preferred.
  • a UiH— (derived from the amino group of A2) or one basic amino acid selected from lysine, arginine and orditin, or the same or different amino acids selected from these amino acid residues
  • a peptide residue having at least two residues, or a hydrogen atom at the N-la position of the amino terminal amino acid residue of the basic amino acid residue or the peptide residue is an acyl group or a substituted thiocarno ⁇ moyl group
  • a 2 independently represents a tyrosine, phenylalanine or tribubutane residue
  • a 3 independently represents a lysine or arginine residue
  • a 4 represents an amino acid residue or a peptide residue having one or at least two amino acids selected from lysine and arginine;
  • Y is a peptide residue represented by the following formula (a)
  • a 6 independently represents an alanine, nocrine, leucine, isoleucine, serine, cysteine or methionine residue
  • a 7 represents a tyrosine, phenylalanine, tryptophan, alanine, palin, oral isin, isoleucine, serine, cysteine or methionine residue;
  • G 1 y represents a glycine residue.
  • Cys represents a cysteine residue, and the cysteine residues at positions 3 and 11 may be linked by a disulfide bond.
  • the number indicating the position of the amino acid roughly indicates the amino acid sequence, but does not necessarily correspond to the amino acid residue in a one-to-one correspondence. are those attached to, H from the N-terminus, one OH and from the C-terminus - are NH 2 and one digit when the amino acid residue inside the other amino acid sequences present one is used, If the amino acid residue is a peptide residue according to the definition, the number of its constituent amino acid residues is used.
  • polypeptide represented by the formula 8 (1) is a polypeptide synthesized based on a horseshoe crab-derived tachyplesin family polypeptide, a horseshoe crab-derived tachyplesin I, a tachyplesin II, a tachyplesin III, a polyhumsine I or Polyphencin II (metabolism, 26, p429-439 (1989)) can be used as an alternative to the above polypeptides.
  • Having an anti-HIV activity in the present specification means having the ability to exert effects such as suppressing HIV infection, suppressing HIV proliferation, and reducing HIV.
  • the polypeptide represented by the above formula (1) (hereinafter referred to as a polypeptide chain for convenience) is a polypeptide synthesis method known per se, in particular, a liquid phase synthesis method or a solid phase synthesis method (New Protein Chemistry Laboratory Course 1 Protein VI). , Tokyo Chemical Dojin, p3-29 (1992)).
  • DNAs encoding the amino acid sequences of these polypeptides can be synthesized by introducing them into host cells by gene recombination techniques and expressing them.
  • the carboxyl group of the N-protected amino acid corresponding to the carboxyl terminal amino acid residue of the polypeptide chain for example, directly or optionally via an intervening substance such as an amino group or a hydroxyl group Has a functional group
  • the protected amino acids from position 11 to position 1 of the amino acid sequence represented by the above formula (1) are sequentially bonded in accordance with the solid phase synthesis method to obtain a protecting group-protected peptide resin.
  • the insoluble resin is not particularly limited as long as it can be covalently bonded directly to the carboxyl group of the N-protected amino acid at the carboxyl (C) terminal, or optionally through an intervening substance, and can be subsequently removed. Is not done.
  • examples of such an insoluble resin include a resin that releases an amino acid or a eptidic acid after elimination of the insoluble resin, an alkoxy resin (A1 ko-resin or the like), an amino acid amide after elimination, An amide-type resin (Rinkami de resin or the like) that releases a peptide amide may be used.
  • resins that release amino acids or eptidic acids include chloromethyl resin, oxymethyl resin, PAM (4- (hydroxymethyl) phenylacetamidomethyl) resin and Alko-resin.
  • the amide resin include p-alkoxybenzyl alcohol (Wang) resin, hydroxymethyl phenoxy acetic acid (HMPA) resin, dialkoxy benzyl alcohol type resin, and trialkoxy diphenyl methyl alcohol type resin.
  • BHA benzhydrylamine
  • MBHA p_methylbenzhydrylamine
  • PAL pepti de ami de 1 i nker resin and R i n k ami de resin
  • a protected amino acid is an amino acid in which a functional group is protected with a protecting group by a known method, and various protected amino acids are commercially available.
  • the protecting group is preferably selected from those known per se according to the peptide synthesis conditions.
  • the coupling of the protected amino acids can be carried out according to a conventional condensation method.
  • the DCC (dicyclohexylcarbodiimide) method the DCC-HOBt (1-hydroxybenzotriazole) method
  • the DIPCI N, N-diisopropyl carpoimide
  • BOP benzotriazolyl-N-hydroxytrisdimethylaminophosphonium hexafluorophosphoride
  • HBTU 2,3,3-tetramethylperoniumhexafluoro
  • symmetric anhydride method etc.
  • These condensation reactions are usually performed in an organic solvent such as dichloromethane, dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP) or a mixture thereof.
  • the desired protecting group-protected peptide resin or the peptide released from the protecting group-protected polypeptide resin and the substituted isothiocyanate compound are slightly diluted.
  • a ⁇ terminal ⁇ -monosubstituted thiocarbamoylated polypeptide of the substance of the present invention can be obtained.
  • the carboxyl terminus of the amino acid residue at position 13 can be free (A 5 in formula (1) corresponds to - ⁇ ), or the acid amide (formula (In (1), A 5 is equivalent to —NH 2 ).
  • the polypeptide having the protecting group and bonded to the insoluble resin is hereinafter also referred to as a protecting group-protected polypeptide resin.
  • each symbol represents an amino acid residue or a substituted amino acid residue in internationally recognized three-letter display, and each symbol represents the following amino acid residue or substituted amino acid residue.
  • each symbol represents the following amino acid residue or substituted amino acid residue.
  • D- before an amino acid label, it means that all are "L”.
  • amino acid used as a protecting group for the side chain functional group of the amino acid examples include the following.
  • B u ' tertiary butyl
  • B oc tertiary butyloxy
  • Examples of a method for obtaining only a polypeptide chain from the protective group-protected polypeptide resin include a known method and a method for removing a protective group and an insoluble resin and forming a disulfide bond in one step described below.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • dichloromethane HC 1Z dioxane
  • piperidine / DMF or piperidine Zin ZNMP is used, and is appropriately selected depending on the type of the protecting group.
  • Protected group-protected polypeptide resins include hydrogen fluoride, TFMSA (trifluoromethanesulfonic acid), TMSOTf (trimethylsilino retriflate), TMSB r (trimethylsilyl bromide), TMSC1 (trimethylsilino chloride) ) Or by treating with TFA, etc., the resin and the protecting group can be simultaneously eliminated.
  • the above elimination reagent is appropriately selected depending on the synthesis strategy (Boc method or Fmoc method), the insoluble resin to be used, and the type of protecting group.
  • the obtained polypeptide chain forms a disulfide bond (1-S—S—) via a mercapto group between the cysteines at positions 3 and 11 or, optionally, at positions ⁇ and 6 ,.
  • These disulfide bonds can be formed by a method known per se, for example, mild air oxidation or the like.
  • an oxidizing agent such as oxygen perfluorophosphate in the atmosphere (for example, potassium perfluoride) is used.
  • the protecting group and the resin are eliminated, and the polypeptide formed by forming a disulfide bond can be further isolated and purified by a known method. Most effective.
  • a reverse transcriptase inhibitor and a NO or HIV protease inhibitor which are anti-HIV active substances, are chemically bound to the protecting group-protected polypeptide resin.
  • Reverse transcriptase inhibitors are substances that inhibit the activity of HIV reverse transcriptase, and are classified into nucleoside-based inhibitors and non-nucleoside-based inhibitors.
  • the nucleoside-based inhibitor includes a nucleoside comprising a pyrimidine base, a purine base, an imidazole base or a triazole base, and a furanose having at least one hydroxyl group or an acyclo-form thereof.
  • AZT CAS REGISTRY NUMBERS: 30516-87-1: zidovudine
  • dd I CAS REGISTRY NUMBERS: 69655-05-6: didanosine
  • d dC CAS REGISTRY NUMBERS: 7481-89- 2: zalci tabin e
  • 2 ', 3'—didehydro 1', 3, 1-dideoxythymidine CAS REGISTRY NUMBERS: 3056-17 -5: d 4 T: stavudine
  • 3'-thia-2 ', 3' didoxycytidine CAS REGISTRY NUMBERS: 134678-17-4: 3 TC: l 5 Lamivudine
  • 2 '-3-Fluoro dd C 3' Fluorotymidine
  • non-nucleoside inhibitors examples include, for example, tetrahydroimidazo-benzodiazepine one-one or one-thione (T IBO) derivative (specifically,
  • nucleoside reverse transcriptase inhibitors are preferred, among the nucleoside-based HIV transcriptase inhibitors, it is preferably AZT, ddl, ddC, 14 or 3 fingers already administered to humans in the clinic, more preferably the polypeptide chain and AZT whose antiviral activity is particularly synergistically enhanced when chemically combined with the substance of the present invention.
  • nucleoside reverse transcriptase inhibitors are incorporated into DNA when HIV synthesizes DNA from RNA by reverse transcription.As a result, unnatural nucleosides or nucleoside analogs are inhibited to inhibit DNA synthesis. Nigs are preferred.
  • the nucleoside analog refers to a non-nucleoside compound having a steric structure similar to that of a nucleoside.
  • these reverse transcriptase inhibitors can be commercially available or those prepared according to known synthesis methods.
  • an inhibitor which is a substance which inhibits the activity of HIV protease and which is a mimic compound of the substrate transition state of the protease is preferable.
  • the substrate transition state mimic refers to a substance that can bind to the substrate binding site of the enzyme and has a similar tertiary structure to the substrate in the enzyme-substrate complex.
  • Ro 3 1—8 9 5 9 (CAS REGISTRY NUMBERS: 127779-20-8: sa quinavir), A—7703 (CAS REGISTRY NUMBERS: 134878-17-4), A—8 0 9 8 7 (CAS REGISTRY NUMBERS: 144141-97-9), KN I—93 (CAS REGISTR Y NUMBERS: 138258-64-7), KN I—102 (CAS REGISTRY NUMBERS: 139694-6 5- 8), KN I- 1 7 4, KN I-2 2 7 (CAS REGISTRY NUMBERS: 147384-69-8) .KN I-2 7 2 (CAS REGISTRY NUMBERS: 147318-81-8), L- 7 3 5 5 2 7 (CAS REGISTRY NUMBERS: 150378-17-9: indinavir), SC-5 2 1 5 1 (CAS REGISTRY NUMBERS: 143224-34-4: Tel inavir).
  • Ro31-8959, L1-735527 and KN-272 having high antiviral activity are preferred, but there is no particular limitation.
  • these HIV protease inhibitors commercially available ones or those prepared according to known synthetic methods can be used.
  • Ro 31 -8959 for example, the preparation method described in J. Med. Chem. 36, P2300-2310 (1993) can be mentioned.
  • the substance of the present invention is not particularly limited as long as the force at which the polypeptide chain and the anti-HIV active substance are chemically bonded is not particularly limited as long as the bond is a chemically formed bond.
  • the ester bond is formed by transporting the bound anti-HIV active substance into a target cell in a living body, followed by intracellular esterase or the like.
  • the anti-HIV active substance can be released near the action point of the anti-HIV active substance.
  • the ester bond is a bond having such a stability that the ester bond is not easily cleaved during transportation, and is not limited to a preferable force.
  • the position of the polypeptide chain that binds to the anti-HIV active substance is not particularly limited, but the polypeptide chain itself, HIV surface protein gp120, and CD4 positive which is a host target cell
  • An amino terminal site capable of maintaining affinity with cell surface protein CD4 of the cell is preferred.
  • the ⁇ -amino group or ⁇ -amino group of the amino acid at the amino terminal, or Tam was used to prepare the antibody.
  • MAP system multiple antigen peptide peptide system
  • JP Tam 'Peptides synthesi s, structures, and applications "(B.
  • Dendrimer using radially branched lysine Is formed at the amino terminus of the polypeptide chain by the method of Tam described above, and a plurality of anti-HIV active substances are bound to a plurality of amino groups present at the terminus and side chains to obtain one molecule of the polypeptide chain.
  • the substance used for forming the dendritic structure is most preferably the above-described lysine, but may be prepared by a basic amino acid such as ornithine or by synthesis in addition to lysine. Even amino acids and the like can be used as long as they are substances containing two or more amino groups. .
  • the binding site of the anti-HIV active substance that binds to the amino group of the polypeptide chain should be appropriately selected depending on the type of the active substance to be bound, but when a carboxyl group or a hydroxyl group is present in the substance. Is preferably a chemical bond formed through these functional groups, particularly preferably a hydroxyl group. Further, even if the position of the functional group is a site having a central role in anti-HIV activity, a chemical bond is cleaved in the target cell, so that the functional group in the molecule serving as the binding site is The position is not particularly limited.
  • the substance of the present invention when the substance of the present invention is obtained by binding an anti-HIV active substance to a polypeptide chain via a carboxyl group in the substance, the amino group at the amino terminal of the protecting group-protected polypeptide resin is reacted with the amino group. It is possible to form an amide bond between the carboxyl groups of the HIV active substance and to make the bond directly, and to form a chemical bond that is easily cleaved in vivo through an appropriate spacer substance. It is also possible to form.
  • the substance of the present invention is obtained by binding an anti-HIV active substance to a polypeptide chain via a hydroxyl group in the substance, the functional group at the amino terminal of the protecting group-protected polypeptide resin and the anti-HIV activity It can be attached through a multifunctional spacer having a functional group that can be chemically attached to both hydroxyl groups of the substance.
  • a multifunctional supplier has one carboxyl group capable of binding to an amino group at the amino terminal of the polypeptide chain to be used, and further contains water in the anti-HIV active substance. It is preferable to have a carboxyl group different from the above which can form an ester bond with an acid group, and specific examples include an aromatic compound having two or more carboxyl groups or an aliphatic compound. Aliphatic compounds are preferred because they form a chain structure.
  • an amide bond is formed between one of the carboxyl groups and the amino group at the amino end of the polypeptide chain, and the other carboxyl group is formed.
  • an ester bond is formed with the hydroxyl group in the anti-HIV active substance, a polypeptide chain and the anti-HIV active substance can be bound.
  • an aliphatic dicarboxylic acid having 4 to 12 carbon atoms is a multifunctional spacer.
  • an aliphatic dicarboxylic acid having 4 to 8 carbon atoms is more preferable.
  • Succinic acid or glutaric acid is particularly preferred from the viewpoint of stability and ease of handling.
  • the dicarboxylic acid may have another functional group as long as it does not prevent the binding between the polypeptide chain and the anti-HIV active substance.
  • a method of bonding the protecting group-protected polypeptide resin and AZT to a dicarboxylic acid for example, succinic acid or glutaric acid
  • AZT and a polyfunctional spacer are combined.
  • AZT is reacted with succinic anhydride or glucuric anhydride in the presence of dimethylaminopyridine, and after a conventional treatment, the binding of AZT, in which succinic acid or glutaric acid is ester-bonded to AZT, to a multifunctional spacer. Get the body.
  • the AZT-polyfunctional spacer conjugate is added to the ⁇ -amino group or ⁇ -amino group of the amino acid at the N-terminal of the protecting group-protected polypeptide resin, or dendrimer-like to the amino acid.
  • Peptide resin is also referred to as AZT complex).
  • the protecting group-protected polypeptide resin spacer-AZT complex obtained as described above can be prepared in a single step, for example, by the following method to remove the insoluble resin and the protecting group and form a disulfide bond.
  • the substance of the present invention can be obtained. That is, for example, 10% or less, preferably less than 5%, and more preferably 0.5 to 1.5% (v / v) of aniso is added to the protecting group-protected polypeptide resin-spacer AZT complex.
  • TMSC1 trimethylsilyl chloride
  • TFA trimethylsilyl chloride
  • the reaction is carried out for 0 minutes at 0 to 80 ° C, preferably at 10 to 40 ° C, more preferably at 15 to 30 ° C, followed by preferably 10 ° C or less, more preferably ice.
  • 100 equivalents or more, preferably 200 to 400 equivalents of DMSO is added under cooling, and 20 minutes or more, preferably 30 to 120 minutes, more preferably 60 to 100 minutes.
  • TMSC1-1DMSO / TFA system The system for removing the protecting group and the resin and forming a disulfide bond is hereinafter referred to as TMSC1-1DMSO / TFA system.
  • the thus-obtained substance of the present invention can be isolated and purified by a known method, but the method by reversed-phase high-performance liquid chromatography is most effective.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is the above-mentioned substance of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • Pharmaceutically acceptable salts include, for example, inorganic acids (hydrochloric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid, nitric acid, sulfuric acid, etc.), organic carboxylic acids (acetic acid, propionic acid, maleic acid, succinic acid, malic acid, Salts with citric acid, tartaric acid, salicylic acid, etc., acidic sugars (eg, glucuronic acid, galacturonic acid, dalconic acid, ascorbic acid, etc.), or organic sulfonic acids (eg, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids hydroochloric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid, nitric acid, sulfuric acid, etc.
  • organic carboxylic acids acetic acid, propionic acid, maleic acid, succinic acid, malic acid, Salts with citric acid, tartaric acid, salicylic acid, etc.
  • acidic sugars
  • the substance of the present invention can be administered as it is, it may be a pharmaceutical composition further containing a pharmacologically acceptable carrier selected according to the administration method and administration form of the drug.
  • This pharmaceutical composition is administered orally or parenterally according to the treatment method and the like, and is injected, injectable, externally applied, suppository (for example, powder) using an appropriate drug carrier according to the administration method.
  • suppository for example, powder
  • Granules, liquid for injection or oral use, tablets, pessaries, ointments, creams, aerosols, etc. It can be a formulation.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is directly administered to a living body, for example, as an injection, 10 mg to 5 g per 1 kg of human body weight per day can be administered as a drug component.
  • the anti-HIV activity of the pharmaceutical composition of the present invention is determined by transporting an anti-HIV active substance into a target cell by a polypeptide chain having affinity for at least an HIV surface protein, and a polypeptide chain on the target cell.
  • the anti-HIV agent By breaking the chemical bond with the anti-HIV active substance, the anti-HIV agent with a different mechanism of action, the polypeptide chain and the anti-HIV active substance, ie, the steps of adsorption, fusion and entry of HIV to CD4-positive cells It is thought to be caused by the combination of a polypeptide that is thought to suppress the activity and an anti-HIV agent that inhibits the enzyme activity of HIV reverse transcriptase or HIV protease.
  • FIG. 1 is a BIAcore analysis diagram showing the affinity of the substances 12 (AZT-Suc-T22) and 22 (AZT-Glu-T22) of the present invention for gp120 and CD4.
  • Fmo c As p (But) — OH, Fmo c — G lu (B u ') — OH, Fm oc — H is (Bo c) _0H, Fmo c — Ser (Bu l ) — 0H, Fmo c- Th r (B u ') -OH, Fmo c— Lys (Bo c) one 0H, Fmo c— A rg (Pmc) — To each 6 mg of OH, add TMSC 1 (42 ⁇ 1), DMSO (762 ⁇ 1), and TFA (5.2 ml), and treat at 4 ° C to 5, 1 0, 3 0, 6 0, 9 and sampled by 1 0 0 beta 1 after 0 minutes ⁇ 2 0- Me CN (1: 1) with diluted lml, by injection a part of the solution to the H PLC Fmoc amino acids, side chain protected Fmoc amino acids were quantified.
  • H—Leu—A1 koresin (0.60 mmo1 / g, 2 ⁇ mo1) in which Leu is bound to an alkoxyl-type resin that releases amino acids or eptidic acid by cleavage, or amino acids by cleavage H-Arg (Pmc) with Arg (Pmc) bound to an amide-type resin that releases amide or peptide amide
  • An internal standard for Rink am ideresin (0.32 mmo1 / g, 2 no1) Boc—Gly—OH (3 no 1), TMS C 1 (7 ⁇ 1, 750 eq) and TFA (870 (1) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • Preparation of the protecting group-protected polypeptide resin having the polypeptide chain of the formula (A) was performed manually using the Fmoc-type solid phase synthesis method.
  • Fmoc-Arg (Pmc) -A1 koresin 0.52 mmo1 / g in terms of Arg
  • the cells were treated with 20% piperidine ZDMF for 15 minutes to remove the Fmoc group.
  • DIPCI-HOBt / DMF was used for the condensation of Fmoc amino acids.
  • Fmoc amino acids, condensing reagents, and the like were each used in 2.5 equivalents to the resin.
  • the substance synthesized in this manner is referred to as a protecting group-protected polypeptide resin 1 for convenience.
  • a protecting group-protected polypeptide resin that generates an amide form of a polypeptide chain in which the 13-position of the above formula (A) is NH 2 is used as a resin for peptide synthesis, as Fmoc-Arg (Pmc).
  • Fmoc-Arg Pmc
  • a protecting group-protected polypeptide resin having a polypeptide chain represented by the following formula (B) is used as a resin for synthesizing a peptide, which releases an amino acid amide or a peptide amide by a cleavage treatment.
  • Fmoc-PAL (peptideamid) The compound was synthesized by the Fmoc-type solid phase synthesis method as described above using delinker) resin (0.38 mmo 1 / g in terms of amino group). The substance synthesized in this manner is described as a protecting group-protected polypeptide resin 2 for convenience. 1 1 2 3 4 5 6 7 7 7 7 7 8
  • AZT (534.8 mg, 2 mmo 1) was reacted with glutaric anhydride (228.2 mg, 2 mmo 1) under the same reaction conditions and the same reaction procedure as in the preparation of AZT succinate in Preparation Example 2. After the same treatment, the desired crystals of AZT glutaric acid ester were obtained (yield: 80.0%).
  • Bondasphere 5 C18—100 people (3.9 x 50 mm, manufactured by Nippon Millipore) has a retention time of 14.8 minutes in analytical HPLC, and amino acid analysis of hydrolyzate with 6N HCl (in Nikko) Cy s not determined (theoretical values are theoretical) (1), Tyr
  • polypeptide amide of the above formula (B) (protecting group-protected polypeptide)
  • synthetic polypeptide the substance obtained by this method is referred to as a synthetic polypeptide
  • synthetic polypeptide (T13 31) having the polypeptide chain of the above formula (A) is referred to as synthetic polypeptide 1
  • synthetic polypeptide (T22) prepared by the same method as described above using the protecting group-protected polypeptide resin 2 having the above polypeptide chain will be referred to as synthetic polypeptide 2.
  • substance 1 of the present invention substance 1 of the present invention
  • substance 1 of the present invention (AZT-Suc-T131) having the polypeptide chain of the above formula (A) will be referred to as substance 11 of the present invention
  • substance 1 of the present invention (AZT-Sue-T22) having the polypeptide chain of (B) is referred to as the substance 12 of the present invention.
  • substance 2 of the present invention substance 2 of the present invention
  • substance 2 of the present invention (AZT-G1U-T131) having the polypeptide chain of the above formula (A) is referred to as substance 21 of the present invention
  • substance 22 of the present invention substance 22 of the present invention
  • the protecting amino acid is further protected on the ⁇ -amino group of the N-terminal amino acid of the protecting group-protected polypeptide resin 1 or 2 prepared in Preparation Example 1 using a similar amino acid condensation method (DIPCI-HOBt method, etc.).
  • Fmo c — Lys Fmo c was bound.
  • the removal of Fmoc group and the introduction of Fmoc-Lys (Fmoc) were repeated twice, and Lys having a dendritic structure in which seven Lys were introduced into the amino terminal of the polypeptide.
  • An introduced protecting group-protected polypeptide resin was prepared.
  • the resin prepared from the protecting group-protected polypeptide 1 obtained in Preparation Example 1 is referred to as Lys-introduced protecting group-protected polypeptide resin 1
  • the resin prepared from the protecting group-protected polypeptide 2 is referred to as Lys Described as introduced protection group-protected polypeptide resin 2.
  • the F moc group of the Lys-introduced protecting group-protected polypeptide resin 1 was removed, and the AZT succinate (2.5 eq) prepared in Preparation Example 2 was prepared in the same manner as in Preparation Example 5 by DI PC I- Condensed by the HOBt method.
  • the Lys-introduced protecting group-protected polypeptide resin-AZT succinate complex thus obtained was subjected to deprotection, deresinization and disulfide bond formation in the same manner as in the preparation of synthetic polypeptide 1 in Preparation Example 4.
  • a dendrimer-type substance of the present invention into which eight target AZTs were introduced was obtained.
  • the substance of the present invention according to the present preparation method will be referred to as “dendrimer type substance 1 of the present invention” for convenience.
  • the AZT glutaric acid ester prepared in Preparation method 3 is bonded to the Lys-introduced protecting group-protected polypeptide resin 1, and the same deprotection, deresinization, disulfide bond formation, isolation, Purification was performed to obtain the target substance of the present invention.
  • the substance of the present invention is referred to as “dendrimer type present substance 2”.
  • the AZT succinate prepared in Preparation Example 2 was bonded to the Lys-introduced protecting group-protected polypeptide resin 2.
  • the obtained Lys-introduced protecting group-protected polypeptide-AZT succinate complex resin (10 Omg) was added to m-cresol (3001), 1,2-ethanedithiol (300/1), Add thioanisole (30031), TFA (4.8 ml) and distilled water (300 ⁇ 1) and stir at room temperature for 2 hours to deprotect and deresin. After treating and air-drying according to the procedure for preparing synthetic polypeptide 1 or 2, the crude peptide derivative obtained was 1 N
  • dendrimer-type substance 3 of the present invention the substance of the present invention according to the present preparation method is referred to as dendrimer-type substance 3 of the present invention for convenience.
  • two disulfide isomers were obtained, they are represented as isomers 1 and 2, respectively.
  • Dendrimer-type substance 3 of the present invention 3 two kinds of disulfide isomers were obtained.
  • the AZT glutaric acid ester prepared in Preparation Example 3 was bonded to the Lys-introduced protecting group-protected polypeptide resin 2, and the same deprotection, resin removal, disulfide bond formation, isolation, Purification was performed to obtain the target substance of the present invention.
  • the substance of the present invention is referred to as “dendrimer type present substance 4”.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • the antiviral activity against HIV of Invention Substance 1 and AZT was tested and evaluated according to the following method. That is, HIV-infected MT-4 cells (2.5 ⁇ 10 4 cells, Zwell, multiplicity of infection (MOI): 0.001) are added to a 96-well microtiter plate immediately after infection, together with various concentrations of the test substance.
  • MOI multiplicity of infection
  • C0 2 incubator one, they were cultured for 5 days at 37 ° C, the number of viable cells the MTT method (Pauwel et. Al., J. Virol. M ethods 20, 309-321 (1988)) was measured in.
  • Antiviral activity is expressed as the concentration that inhibits cell death by 50% by HIV infection (E Cso: 50 : effective concentration).
  • E Cso 50 : effective concentration
  • virus-uninfected cells were cultured with the test substance at various concentrations in the same manner as described above. Cytotoxicity is expressed as 50% cytotoxic concentration (C Cso: 503 ⁇ 4 cytotoxic concentration) by the test substance. Also CC 5 . And EC 5 .
  • the approximate ratio (CC 5; ZEC 5 ) was expressed as the selection coefficient (SI).
  • Table 3 shows the results of the anti-HIV activity measurement.
  • the anti-HIV activity of the substance 11 of the present invention was twice as high as the anti-HIV activity of AZT (EC 5. Comparison of values), the selection coefficient was more than twice, and the anti-HIV activity was clearly enhanced. It also has higher anti-HIV activity than synthetic polypeptide 1, which is a known anti-HIV active polypeptide. Furthermore, the dendrimer type substance 1 of the present invention showed the highest anti-HIV activity.
  • Table 3 Measurement of anti-HIV activity by MTT method
  • HIV infection inhibitory activity of synthetic polypeptides 1 and 2 obtained in Preparation Example 4 above, substances 1 to 22 of the present invention obtained in Preparation Examples 4, 5, and 6, and dendrimer-type substance 1 of the present invention, and AZ-cho. was tested and evaluated according to the following methods. That is, PHA (Phaseolus vulgaris agglutinin) activated P BMC (perip heral blood mononuclear cells) using T cell line tropic HIV-1 (NL 4-3) and macrophage tropic HIV-1 (JR-CSF) ) was measured by a p24 antigen expression suppression test by an ELISA method using an antibody against the HIV-1 p24 antigen.
  • PHA Phaseolus vulgaris agglutinin
  • P BMC peripheral blood mononuclear cells
  • T cell line tropic HIV-1 NL 4-3
  • macrophage tropic HIV-1 JR-CSF
  • dendrimer type substance of the present invention 1 88 7.3
  • a pharmaceutical composition having high anti-HIV activity can be provided by effectively inducing an anti-HIV active substance on target cells by affinity for CD4 positive cell surface protein and HIV surface protein.

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Description

明細書
新規抗 H I V複合体及び医薬組成物 技術分野
本発明は、 抗 H I V活性を有する新規物質及び当該物質を有効成分として含有 する医薬組成物に関する。 更に詳しくは抗 H I V活性を有するポリべプチドに、 逆転写酵素阻害剤及び Z又は H I Vプロテア一ゼ阻害剤が化学的結合により結合 した複合体、 及び当該物質を有効成分として含有する抗 H I V剤等の医薬組成物 に関する。 背景技術
ヒ ト免疫不全ウィルス （H I V) は、 後天性免疫不全症候群 （AI DS) や A I D S関連症候群等の様々な臨床症状を弓 Iき起こすことが知られている。
抗 H I V剤として、 H I Vの増殖の各段階を阻害する薬剤が知られているが、 実際に薬として認可されているか、 あるいは臨床試験が行なわれている薬剤とし ては、 逆転写酵素阻害剤 （例えば、 ヌクレオシド系の 3' —アジドー 3， —デォ キシチミジン （以下 AZTとも記載する） 、 2， ， 3， 一デォキシイノシン （以 下 dd lとも記載する） 、 2' ， 3' —デォキシシチジン （以下 ddCとも記載 する） 等） や H I Vプロテア一ゼ阻害剤 （N， 一 〔1 (S) 一ベンジル— 3— 〔 4 a (S) ， 8 a (S) ， 3 (S) ― (tert—プチルカルバモイル） デカヒドロ イソキノ リン一 2—ィル〕 一2 (R) ーヒ ドロキシプロピル〕 一N" —キノ リン ― 2—ィルカルバモイル） 一Lーァスパラギンアミ ド （以下 Ro 31 - 8959 とも記載する） 等） が知られている。
通常、 これらの抗 HI V剤は、 大量にしかも長期間投与することが必要である ため、 副作用 （例えば骨髄障害など） や、 逆転写酵素あるいは H I Vプロテア一 ゼのァミノ酸変異による薬剤耐性ウィルスの出現等の問題が生じていた。
これらの問題の解決および抗ウィルス効果の増強を目的として、 AZTと、 d d Iあるいは ddCとを組合せて使用すること （H I V感染症 · A I DS， 日本 臨床社， p316- 326(1993)) 、 Ro 31— 8959と、 八2丁ぁるぃは(3 。とを 組合せて使用すること (J. Infect. Dis,， 166(5)， pll43- 1146(1992)) および 3 T Cと A Z T、 d d Iあるいは R o 3 1 - 8 9 5 9とを組合せて使用すること （特 開平 6 _ 2 3 4 6 4 1 ) が知られている。
し力、しな力 ら、 これらの組合せによる使用においても、 抗ウィルス活性は不十分 であり、 しかも上記問題の解決も不十分である。
ところで、 抗ウィルス活性を有する新規なポリべプチド及びこのポリべプチド を有効成分とする抗 H I V剤が知られており （国際公開 W0 9 2 / 0 4 3 7 4、 特開平 5— 1 6 3 2 9 8、 国際公開 WO 9 5 / 1 0 5 3 4 ) . 当該ポリぺプチド は A Z Tと比して同程度の抗 H I V活性を示すことが知られており、 逆転写酵素 阻害剤や H I Vプロテア一ゼ阻害剤と組み合わせて投与することにより優れた抗 H I V活性を示すことも知られている （特開平 9— 2 5 2 4 0 ) 。
逆転写酵素阻害剤や H I Vプロテア一ゼ阻害剤などの毒性による副作用は、 上 記抗 H I V活性を有するポリべプチドと逆転写酵素阻害剤または H I Vプロテア ーゼ阻害剤等とを組み合わせた投与によっても低減することはできず、 解決すベ き問題点として未だに残されており、 より毒性の低い抗 H I V剤が期待されてい る。 発明の開示
本発明者は優れた抗 H I V活性を保持し、 且つより副作用の少ない抗 H I V剤 として有用な複合体を得るべく、 抗 H I V活性を有し H I V表面タンパク質に親 和性が高いポリペプチドを基に鋭意研究した結果、 当該ポリペプチドのァミノ （ N) 末端に逆転写酵素阻害剤または H I Vプロテア一ゼ阻害剤等の抗 H I V活性 物質を化学的に結合した複合体は、 抗 H I V剤として使用した場合に優れた抗 H
I V活性を示し、 副作用も低減する事が可能であることを見いだし本発明を完成 した。
即ち、 本発明は H I V表面タンパク質に親和性を持つポリペプチド、 好ましく は下記式 （ 1 ) のポリぺプチドに、 1又は 2種以上の抗 H I V活性物質 （逆転写 酵素阻害剤及び Z又は H I Vプロテア一ゼ阻害剤） が化学的結合により結合して なる複合体及び該複合体を有効成分とする医薬組成物からなる。 I 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3
A 1 -A 2 -C y s -A 2 -A 3 -A 3 -Y-A 2 -A 3 -A 3 -C y s -A 4 - A 5
( 1 )
[式中、 八 1は^1— (A 2のァミノ基由来） 或いはリジン、 アルギニンおよび オル二チンから選ばれる 1個の塩基性ァミノ酸又はこれらのァミノ酸残基から選 択された同一又は異なるァミノ酸残基を少なくとも 2個有するぺプチド残基、 或 いは該塩基性ァミノ酸残基若しくはべプチド残基のァミノ末端ァミノ酸残基の N ― α位の水素原子がァシル基若しくは置換チォカルバモイル基で置換されている Ν— αァシル置換アミノ酸残基、 Ν— ァシル置換ペプチド残基、 Ν— α置換チ 才力ルバモイル化ァミノ酸残基または Ν— 置換チォカルバモイル化ぺプチド残 基を示し；
A 2は独立してチロシン、 フヱニルァラニンまたはトリブトファン残基を示し； A 3は独立してリジンまたはアルギニン残基を示し；
A 4はリジンおよびアルギニンから選ばれるアミノ酸の少なくとも 1個を有する ァミノ酸残基またはべプチド残基を示し；
八 5は—011 (A 4のカルボキシル基由来） 又は一NH2 (A 4のカルボキシル 基の酸アミ ド由来） を示し； Yは下記式 （a) で示されるペプチド残基
1 · 2 * 3 , 4 ' 5 * 6 '
-A 6 -A 2-A 3 -G 1 y -A 7 -A 6 - (a)
(式中、 A 2及び A 3は上記 （1) 式におけると同義である。
A 6は独立してァラニン、 ノくリン、 ロイシン、 イソロイシン、 セリン、 システ ィンまたはメチォニン残基を示し、
A7はチロシン、 フエ二ルァラニン、 トリプトファン、 ァラニン、 パ'リン、 口 イシン、 イソロイシン、 セリン、 システィンまたはメチォニン残基を示し、
G 1 yはグリシン残基を示す。
但し、 Γ 位と 6， 位が共にシスティン残基である場合にはこれらはジスルフィ ド結合により連結していてもよい。 ） 、 または
D—オル二チル一プロリン、 プロリル一 D—オル二チン、 プロリル一 D—リジン 、 プロリル— D—アルギニン、 D—リジループ口リン、 D—アルギニル—プロリ ン、 グリシルーリジン、 グリシルーアルギニン、 オルニチルーグリシン、 グリシ ルーオルニチン、 リジル一グリシン及びアルギニル一グリシンで示されるァミノ 酸 2個から構成されたジぺプチドから選ばれるものであり、 その構成アミノ酸で ある D—リジン、 リジン、 D—オル二チン又はオル二チンの側鎖 ω—ァミノ基の 水素原子はァシル基で置換されていてもよいべプチド残基を示し；
Cy sはシスティン残基を示し、 3位と 1 1位のシスティン残基はジスルフィ ド 結合により連結していてもよい]
本発明の複合体は、 少なくとも上述のポリペプチドと、 AZT等の抗 H I V活 性物質とが化学的結合により結合されていることにより、 生体内において H I V 感染の標的となる CD 4陽性細胞へ抗 H I V活性物質を運搬し、 当該細胞内にお いて抗 H I V活性物質を遊離して優れた抗 H I V活性を示すものであり、 また、 この新規複合体を有効成分として含有する組成物は安全性が高く、 より副作用の 少ない抗 H I V剤などの医薬組成物として有効である。
(発明の実施の形態）
以下に本発明を更に詳細に説明する。
本発明の新規複合体 （以下本発明物質と記載することもある。 ） は H I V表面 タンパク質 gp 1 20及び Z又は H I V宿主標的細胞表面タンパク質 CD 4に親 和性を有するポリぺプチドに、 1又は 2種以上の逆転写酵素阻害剤及び/又は H I Vプロテア一ゼ阻害剤が化学的結合により結合している複合体である。
本発明を構成するポリペプチドは、 H I V表面タンパク質 gp 1 2 0及び Z又 は H I V宿主標的細胞表面夕ンパク質 CD 4に対し親和性を有するポリべプチド であれば特に限定はされず、 そのようなポリペプチドとして、 例えば抗体或いは 下記式 （1) で表されるポリペプチドなどが挙げられる力 H I Vの宿主標的で ある C D 4陽性細胞 （宿主標的細胞） の細胞表面タンパク質 C D 4とも親和性を 有し (Biochem. Biophys. Res. Commun. , 219, 555-559(1996), Biochem. Biophys. Acta., 1298.37-44(1996)) 、 それ自体抗 H I V活性を有する下記式 （ 1 ) で表 されるポリべプチドが好ましい。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3
A 1 -A 2 -C y s -A 2 -A 3 -A 3 -Y-A 2 -A 3 - A 3 -C y s -A 4 - A 5 ( 1 )
[式中、 A UiH— (A 2のァミノ基由来） 或いはリジン、 アルギニンおよび オル二チンから選ばれる 1個の塩基性ァミノ酸又はこれらのァミノ酸残基から選 択される同一又は異なるァミノ酸残基を少なくとも 2個有するぺプチド残基、 或 いは該塩基性ァミノ酸残基若しくはべプチド残基のァミノ末端アミノ酸残基の N 一 a位の水素原子がァシル基若しくは置換チォカルノ <モイル基で置換されている Ν— αァシル置換アミノ酸残基、 Ν— αァシル置換ペプチド残基、 Ν— 置換チ 才力ルバモイル化ァミノ酸残基または Ν— 置換チォカルバモイル化ぺプチド残 基を示し；
A 2は独立してチロシン、 フェニルァラニンまたはトリブトファン残基を示し； A 3は独立してリジンまたはアルギニン残基を示し；
A 4はリジンおよびアルギニンから選ばれるァミノ酸の 1個または少なくとも 2 個を有するァミノ酸残基またはべプチド残基を示し；
八5は—011 (A 4のカルボキシル基由来） 又は— NH2 (A 4のカルボキシル 基の酸アミ ド由来） を示し；
Yは下記式 （a) で示されるペプチド残基
1 , 2 * 3 * 4 ' 5 ' 6 '
-A 6 -A 2-A 3 -G 1 y-A 7 -A 6 - (a;
(式中、 A 2及び A 3は上記 （1 ) 式におけると同義である。
A 6は独立してァラニン、 ノくリン、 ロイシン、 イソロイシン、 セリン、 システ インまたはメチォニン残基を示し；
A 7はチロシン、 フエ二ルァラニン、 トリプトファン、 ァラニン、 パ'リン、 口 イシン、 イソロイシン、 セリン、 システィンまたはメチォニン残基を示し；
G 1 yはグリシン残基を示す。
但し、 Γ 位と 6， 位が共にシスティン残基である場合にはこれらはジスルフィ ド結合により連結していてもよい。 ） 、 または
D—オルニチループ口リン、 プロリル一 D—オル二チン、 プロリル—D_リジン 、 プロリル— D—アルギニン、 D—リジループ口リン、 D—アルギニル—プロリ ン、 グリシルーリジン、 グリシルーアルギニン、 オルニチルーグリシン、 グリシ ルーオル二チン、 リジル一グリシン及びアルギニルーグリシンで示されるァミノ 酸 2個から構成されるジぺプチドから選ばれるものであり、 且つその構成ァミノ 酸である D—リジン、 リジン、 D—オル二チン又はオル二チンの側鎖 ω—ァミノ 基の水素原子はァシル基で置換されていてもよいべプチド残基を示し；
C y sはシスティン残基を示し、 3位と 1 1位のシスティン残基はジスルフイ ド 結合により連結していてもよい] 。 尚、 式 （1 ) において、 アミノ酸の位置を示 す数字は、 ァミノ酸配列順序を大まかに示すが、 ァミノ酸残基と必ずしも一対一 に対応するものでなく、 便宜的に N末端から C末端へ付けたものであり、 N末端 由来の H、 C末端由来の一 O H及び— N H 2 及びそれ以外のアミノ酸配列内部の ァミノ酸残基が 1個存在する場合は 1個の数字が使用され、 該ァミノ酸残基が定 義に従って、 ペプチド残基である場合は、 その構成アミノ酸残基の数の数字が使 用される。
式 8 ( 1 ) で表されるポリペプチドは、 カブトガニ由来のタキプレシン族ポリ ぺプチドを基に合成されたポリべプチドであるため、 カブトガニ由来のタキプレ シン I、 タキプレシン I I、 タキプレシン I I I、 ポリフヱムシン I又はポリフエム シン I I (代謝， 26， p429-439(1989)) 等を上記ポリぺプチドの代替として使用する ことも可能である。
本明細書中における抗 H I V活性を有するとは、 H I Vの感染を抑制する、 H I Vの増殖を抑制する、 H I Vを減少させるなどの効果を発現する性能を有する ことを意味する。
上記式 （1 ) で表されるポリペプチド （以下便宜上ポリペプチド鎖と記載する ) は、 それ自体公知のポリペプチド合成法、 特に液相合成法あるいは固相合成法 (新生化学実験講座 1 タンパク質 VI， 東京化学同人， p3-29(1992))によって製 造することができる。 また、 これらのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする D N Aを遺伝子組み換え技術により宿主細胞に導入し、 発現させる方法によって も合成できる。
すなわち例えば固相合成法の場合、 例えばポリべプチド鎖のカルボキシル末端 アミノ酸残基に対応する、 N-保護アミノ酸のカルボキシル基を直接、 あるいは 場合により介在物を介して、 アミノ基あるいは水酸基等の適宜な官能基を有する 不溶性樹脂に結合させた後、 前記式 （1) で示されるアミノ酸配列の 1 1位から 1位までの各保護ァミノ酸を固相合成法に従って順次結合し保護基保護化べプチ ド樹脂とする。
不溶性樹脂としては、 カルボキシル （C) 末端の N—保護アミノ酸のカルボキ シル基と直接、 あるいは場合により介在物を介して共有結合が可能であり、 且つ 、 その後脱離可能なものであれば特に限定はされない。 このような不溶性樹脂と しては、 当該不溶性樹脂を脱離後にァミノ酸あるいはべプチド酸を遊離する樹脂 あるいはアルコキシ型樹脂 （A 1 k o— r e s i n等） 、 又は脱離後にァミノ酸 ァミ ドあるいはべプチドアミ ドを遊離するアミ ド型樹脂 （Ri nk ami de r e s i n等） が挙げられる。 具体的には、 ァミノ酸あるいはべプチド酸を遊 離する樹脂としてはクロロメチル樹脂、 ォキシメチル樹脂、 PAM (4- (ヒドロ キシメチル）フヱニルァセトアミ ドメチル） 樹脂及び A l ko— r e s i nとし ては、 p—アルコキシベンジルアルコール （Wang) 樹脂、 ヒドロキシメチル フヱノキシ酢酸 （HMPA)樹脂、 ジアルコキシベンジルアルコール型樹脂、 ト リアルコキシジフヱニルメチルアルコール型樹脂等が挙げられ、 アミ ド型樹脂と しては、 ベンズヒドリルァミン （BHA)樹脂、 p_メチルベンズヒドリルアミ ン （MBHA) 樹脂、 トリアルコキシベンズヒドリルアミン型樹脂、 PAL (p e p t i de ami de 1 i nke r 樹脂及び R i nk ami de r e s i n (4- (2，，4，-ジメ トキシフヱ二ルーアミノメチル） 一フヱノキシ樹脂等 ) 等が挙げられる。
保護アミノ酸とは、 官能基を公知の方法により保護基で保護したアミノ酸であ り、 各種の保護アミノ酸が市販されている。 保護基は、 ペプチドの合成条件に応 じ適当な物をそれ自体公知の中から選択することが好ましい。 保護アミノ酸の結 合は、 通常の縮合法に従って行うことができるが、 DCC (ジシクロへキシルカ ルボジイミ ド） 法、 DCC— HOB t (1—ヒ ドロキシベンゾトリァゾール） 法 、 D I PC I (N, N—ジイソプロピルカルポジイミ ド） 一HOB t法、 BOP (ベンゾトリアゾリル一 N—ヒドロキシトリスジメチルアミノホスホニゥムへキ サフルォロリン化物塩） —HOB t法、 HBTU (2 - (1 H) —ベンゾトリア ゾ一ル一 1—ィル） 一 1， 1， 3， 3—テトラメチルゥロニゥムへキサフルォロ ホスフヱート） 一 H O B t法、 対称無水物法等が好ましい。 これらの縮合反応は 、 通常、 ジクロロメタン、 ジメチルホルムアミ ド （DMF ) 、 N—メチルピロリ ドン （NM P ) 等の有機溶媒又はそれらの混合物中で行われる。
式 （1 ) 中 A 1においてァミノ末端アミノ酸残基の N _ 位の水素原子がァシ ル基で置換されている Ν—α—ァシルァミノ酸残基または Ν—ひーァシルぺプチ ド残基を選択する場合は、 目的とする上記保護基保護化べプチド樹脂又は該保護 基保護化ポリべプチド樹脂より遊離させたぺプチドと、 該当するァシル基の酸無 水物または該当するカルボン酸により、 縮合剤を用いてぺプチド樹脂又はべプチ ドの Ν末端アミノ基をァシル化し、 Ν—ァシル化ペプチド樹脂とする。 また、 前 記式 （1 ) 中 A 1においてァミノ末端 Ν—α位の水素原子が置換チォカルバモイ ル基で置換されている Ν—α—置換チォカルバモイル化ァミノ酸残基または Ν— 一置換チォカルバモイル化ぺプチド残基を選択する場合は、 目的とする保護基 保護化べプチド樹脂または該保護基保護化ポリぺプチド樹脂より遊離させたぺプ チドと置換イソチオシァネート化合物を微アル力リ条件下に反応することにより 本発明物質の Ν末端 Ν— 一置換チォカルバモイル化ポリぺプチドを得ることが できる。 この場合不溶性樹脂を適宜選択することにより 1 3位のアミノ酸残基の カルボキシル末端はフリー （式 （1 ) において A 5がー Ο Ηに相当） であること もできるし、 あるいは酸アミ ド （式 （1 ) において A 5が— N H 2に相当） に変 換することもできる。 当該保護基を有し、 不溶性樹脂に結合したポリペプチドは 以下保護基保護化ポリぺプチド樹脂とも記載する。
該保護基保護化ポリぺプチド樹脂を構成するポリぺプチド鎖 （保護基は記載せ ず） の具体例としては、 下記表 1に示すものを挙げることができる。
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1 1 2 3 4 5 6 7 7 7 7 7 7 8 9 10 1 1 12 12 13
(33 し y s -し ys - Trp- C y s■ T y r™し y s - L y s - C y s■ Tyr. し y s ' Gly T y r - C y s ' T y r - し y s - し y s - C y s - し y s -し y s - N H ( 34 Arg - Arg - Trp- C y s - T y r - L y s - Arg-C y s- Γ y r■ し y s - Gly T y r ~ C y s - T y r - し y s - A i' g - C y s - Arg - H ( 3δ Arg- Ar -Trp- C y s■ T y ϊ· - Λ r g - L y s - C y s - Ty r- し y s - Gly P h e - C y s■ l y r - Arg- Ly s-Cy s- Arg -NH ( 36 Arg-Af -Trp- C y s - T y f - A r g -し y s - C y s - T y r - Arg- Gly. T y r - C y s - Ty r- Arg- L y s - C y s - A rg -NH ( 37 A r g - T r p - C y s - T y r - A r g - L y s - C y s - Ty r■ Ar g- Gly. Γ y r C y s ' T y r - Arg- し y s - C y s - Arg -Nil ( 38 Arg~Arg-Tr - C y s - T y r - A r g - L y s - C y s - Phe- A rg- Gly P h e - C y s - Ty r- Arg- L y s - C y s - Arg -NH： ( 39 A r g - T r i) - C y s■ T y r Λ r g Ly s- ys . Phe- Arg- Gly Plie-Cy s- T y r - Arg- L y s - C y s■ Arg - N II . (40 Λ r g - Λ r g - T r p - C y s - T y r - L y s ■ Λ r g - C y s - T y I · Ar g- G ly P !i e - C y s - T y r -し y s - A r g - C y s - Ar - Nil： ( 41 Λ r g - T r p - C y s - T y r- ^r g し y s - C y s - T y r - Arg- Gly P h e - C y s - T y r- Arg- L y s - C y s - Arg -NH： ( 42 Λ r- g - Λ r- g - T r p - C y s - T y r - Λ r g L y s - C y s · P e- し y s - Gly- P Ii e - C y s - Ty r- Arg- L y s - C y s - Arg - N H . ( 43 Arg- T r p - C y s - T y r - Λ r g L y s - C y s - P e- し y s - G!y P e - C y s - T y r - Arg-し y s - C y s - Arg -NH： ( 44 Λ r g - A i- g - T r ] C y s - T y r - A r g - L y s - C y s - Phe- し y s - Gly P h e - C y s T y r - Arg- L y s - C y s■ Arg ■ A r g - N H； ( 45 Λ r g ~ Λ f g - T r p■ C y s - T y r - Ly s - A r- g - C y s - Phe- し y s - Gly- Phe-Cy s- T y r - し y s - Ar g-Cy s- Arg - N H : ( 46 Λ に Λ r' - T r p - C y - T y r --し y s - Λ r g - C y s■ T y r■ Λ r g - Gly Ί' y r - C y s - T y r - し y s - Λ r g - C y s A rg - Nlに (47 Λ r g - A r -T r - C y s - T y r - Λ r g ■ Λ r g - C y s - Tyr- し y s - Gly- T y r - C y s - T y r - Ar g- Λ r g -C y s■ Ar g - N H： (48 Λ r g - T r p - C y s■ Tyr- Λ r -し y s - C y s - T y r■ し y s - Gly T y r - C y s - T y Λ r g - L y s - C y s■ Arg -NH ( 49 T r p · C y s - ΐ y r - A r g -し y s - C y s - T y r - し y s - Gly T y r- - C y s - T y r - Arg- し y s - C y s - A i' g - N H ( 50 T r p■ C y s - T y r -Ar g - L y s - C y s■ Tyr Gly P h e - C y s - T y r - Ar g- し y s - C y s •Arg - N II
ο
ο 。 ο ο ο ο ο ο
99€I0/86dT/X3d 表 1 つづき
1 1 2 3 4 5 6 7 7 7 8 9 10 11 12 12 13 ( 69 ) A c - Arg - Arg - Trp - Cys - Tyr - Arg - Lys - Dし y s -Pro -Tyr - Arg -し ys- Cys Arg -NH
(70) Oct - Arg - Arg - Trp- Cys- Tyr Arg -し ys - Dし y s -Pro -Tyr - Arg -し ys - Cys - Arg -NH
(71)し aur - Arg - Arg -' Γι.ρ - Cys - Tyr - Arg - Lys - Dし y s -Pro - Tyr— Arg—し ys— Cys— Arg - NH
(72) My r - Arg - Arg - Trp Cys - Tyr Arg - Lys - Dし y s -Pro -Tyr - Arg -し ys - Cys - Arg -Nil:
(73) Parm - Arg- Arg - Trp Cys- Tyr - Arg -し ys - Dし y s -Pro -Tyr - Arg -し ys - Cys - Arg -NH:
(74) FTC - Arg - Arg - Trp- Cys - Tyr - Arg - Lys - Dし y s -Pro .ryr - Arg -し ys-Cys Arg -NH：
(75) PTC -八 rg - Arg - Trp- Cys- Tyr- Arg - Lys -DLy s -Pro -Tyr - Arg - Lys - Cys - Arg - H:
(76) Nicot Arg- Arg - Trp - Cys - Tyr- Arg -Lys - D L y s -Pro • ryr - Arg - Lys - Cys Arg -NH:
(77) Λ r g - Λ r g - Ί r i) - C y s T y r - A r g -し y :
Figure imgf000015_0001
s -Pro •Tyr - Arg - Lys - Cys - Arg -NH:
(78) Arg Arg - Trp - Cys - Tyr - Arg Lys - D L y s -Pro ryr- Arg -し ys - Cys - Arg -Nil：
N-But^,
(79) Parm - Arg Arg - Trp - Cys Tyr- Arg -し ys - Dし y s -Pro -Tyr- Arg - Lys - Cys - Arg -NH：
(80) Parm Or n - Arg -「rp Cys Tyr - Arg - Lys - Dし y s Pro - Tyr - Arg -し ys - Cys - Arg -NH：
同様に、 表 1においてカルボキシ末端にカルボキシル基をもつポリべプチド鎖 (式 （1) において A 5が一 OHに相当） も挙げることができる。
本明細書のポリべプチドの標記において、 各記号は国際的に認められた三文字 表示によるアミノ酸残基または置換アミノ酸残基を表し、 各記号は下記アミノ酸 残基または置換アミノ酸残基を示す。 尚、 アミノ酸表示の前に 「D—」 が無い場 合は、 全て 「L一」 体であることを意味する。
A r g：アルギニン、 Trp : トリプトファン、 Cy s :システィン、 Ty r ：チロシン、 L y s ： リジン、 G 1 y： グリシン、 P h e ： フエニルァラニン、 I 1 e ：ィソロイシン、 S e r ：セリン、 L e u： ロイシン、 Me t ： メチォニ ン、 V a 1 リン、 A 1 a ：ァラニン、 P r o：プロリン、 0 r n：オルニチ ン、 DO r n D—オル二チン、 D A r g D—アルギニン、 D L y s D—リ ジン、 A c— A r g N—ひ一ァセチルアルギニン、 Oc t— Arg : N— α— ォクタノィルアルギニン、 Lau r— Arg : N— α—ラウリルアルギニン、 Μ y r— Arg : N— α—ミ リスチノレアルギニン、 P a r m— A r g N- «一 ルミ トイルアルギニン、 FTC— A r g Ν— α—フルォレセィンチォカルバミ ン化アルギニン、 PTC— A r g Ν_α—フヱニルチオカルバミン化アルギニ ン、 Ni co t— Ar g : N— α—ニコチニルアルギニン、 ε— N— Ac— DL y s ε— N— ω—アミノアセチル一D—リジン、 ε— N— Bu t— DLy s ε— N— ω—ァミノブチリルー D—リジン、 P a rm— 0 r η Ν— α—パルミ トイルオル二チン
また、 ァミノ酸の側鎖官能基の保護基として用いられるものとして例えば、 次 のものが例示される。
B u '：第三プチル、 B o c ：第三プチルォキシ、 Fmo c 2 2, 5, 7 8—ペンタメチルクロマン一 6—スルホ
当該保護基保護化ポリぺプチド樹脂からポリぺプチド鎖のみを得る方法として は、 公知の方法及び後述の一工程による保護基及び不溶性樹脂の脱離とジスルフ ィ ド結合の形成方法が挙げられる。
すなわち、 α—ァミノ基の保護基の脱離試薬としては、 TFA (トリフルォロ 酢酸） /ジクロロメタン、 HC 1Zジォキサン、 ピぺリジン/ DMF又はピペリ ジン Z N M P等が用いられ、 該保護基の種類により適宜選択する。
保護基保護化ポリペプチド樹脂は、 フッ化水素、 TFMSA (トリフルォロメ タンスルホン酸） 、 TMSOT f (トリメチルシリノレトリフラ一ト） 、 TMSB r (トリメチルシリルブロミ ド） 、 TM S C 1 (トリメチルシリノレクロリ ド） 又 は T F Aなどで処理することにより、 樹脂及び保護基を同時に脱離させることが できる。 上記の脱離試薬は、 合成ストラテジー （Bo c法又は Fmo c法） 、 使 用する不溶性樹脂、 保護基の種類により適宜選択する。
さらに得られたポリペプチド鎖は、 その 3位と 1 1位、 又は場合により Γ 位 と 6， 位のシスティン間において、 メルカプト基を介してジスルフィ ド結合 （一 S— S—） を形成させることができる。 これらのジスルフイ ド結合は、 それ自体 公知の方法、 例えば、 温和な空気酸化等により形成することができる。 通常、 大 気中の酸素ゃフヱリシァン酸塩 （例えば、 フヱリシァン化カリウム） のような酸 化剤を用いる。
このようにして保護基、 樹脂を脱離し、 ジスルフィ ド結合を形成して生じたポ リぺプチドはさらに公知の方法により単離精製することができる力^ 逆相高速液 体クロマトグラフィ一による方法が最も効果的である。
本発明物質において、 上記保護基保護化ポリペプチド樹脂に、 抗 H I V活性物 質である逆転写酵素阻害剤及びノ又は H I Vプロテアーゼ阻害剤を化学的に結合 する。 逆転写酵素阻害剤は、 H I Vの逆転写酵素の活性を阻害する物質であつ て、 ヌクレオシド系の該阻害剤及び非ヌクレオシド系の該阻害剤に分けられる。 ヌクレオシド系の該阻害剤は、 ピリ ミジン塩基、 プリン塩基、 ィミダゾ一ル塩基 又はトリアゾ一ル塩基のいずれかの塩基と、 少なくとも一つの水酸基を有するフ ラノース又はそのァシクロ体とから構成されるヌクレオシド又はその類縁体が好 ましく、 例えば、 AZT (CAS REGISTRY NUMBERS: 30516-87-1： ジドブジン（zid ovudine)) 、 d d I (CAS REGISTRY NUMBERS： 69655-05-6： ジダノシン（didanos ine)) 、 d dC (CAS REGISTRY NUMBERS: 7481-89- 2：ザルシ夕ビン（zalci tabin e)) 、 2' ， 3' —ジデヒ ドロ一 2' ， 3， 一ジデォキシチミジン （CAS REGIST RY NUMBERS: 3056-17-5 : d 4 T： スタブジン（stavudine)) 、 3' —チア— 2' ， 3' ージデォキシシチジン （CAS REGISTRY NUMBERS: 134678-17-4 : 3 TC ： l 5 ラミブジン（lamivudine)) 、 2' — 3—フルォロ一 d d C、 3' 一フルォロチミ ジン （CAS REGISTRY NUMBERS: 25526-93-6 : FLT) . 9一 （2—ホスホニル— メ トキシェチル） 一アデニン （CAS REGISTRY NUMBERS: 106941-25-7 : PME A ) , 6— C I— d d l、 6— C 1— d d C等が挙げられる。
また非ヌクレオシド系の該阻害剤としては例えば、 テトラヒ ドローイミダゾ— ベンゾージァゼピン一オンもしくは一チオン （T I BO) 誘導体 （具体的には、
(+ ) -S-4, 5， 6， 7—テトラヒドロ一 5—メチル一 6— (3—メチル一 2—ブテニル） イミダゾ 〔4， 5， 1 - j k) 〔1， 4〕 ベンゾジァゼピン一 2
( 1 H) ーチオン） （CAS REGISTRY NUMBERS: 167206-29-3： R 829 1 3 ) 、 ヒドロキシエトキン一メチルフエ二ルチオチミン （HEPT) 誘導体、 ネビラピ ン (Nevirapine) (CAS REGISTRY NUMBERS: 129618-40-2) 、 ピリジノン誘導体 等が挙げられる。
これらのうち、 上記ポリペプチド鎖との結合の容易性と、 DN A中に取り込ま れることによつて効果的に D N A合成を阻害する機序を考慮すると、 ヌクレオシ ド系の逆転写酵素阻害剤が好ましく、 ヌクレオシド系の H I V転写酵素阻害剤の 中でも、 好ましくはすでに臨床においてヒトに投与されている AZT、 d d l、 d dC、 14丁又は3丁じでぁり、 より好ましくは、 該ポリペプチド鎖との化学 的に結合して本発明物質とした際に特に相乗的に抗ウィルス活性が増強される A ZTである。 これらのヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤等は H I Vが RNAから 逆転写によって DN Aを合成する際に DN A中に取り込まれ、 その結果 DN Aの 合成を阻害するために非天然型ヌクレオシド又はヌクレオシドアナロニグである ことが好ましい。 上記ヌクレオシドアナローグとは、 ヌクレオシドと類似の立体 構造をもつ非ヌクレオシド化合物を指す。 また、 これらの逆転写酵素阻害剤は、 市販のものあるいは既知の合成法に従つて調製したものを使用することが可能で あ
また、 H I Vプロテアーゼ阻害剤としては、 H I Vのプロテアーゼの活性を阻 害する物質であって、 該プロテア一ゼの基質遷移状態ミ ミック化合物である阻害 剤が好ましい。 基質遷移状態ミ ミックとは、 酵素の基質結合部位に結合可能な物 質で、 酵素基質複合体における基質と類似の立体構造を有する物質を指す。 例え ば、 Ro 3 1— 8 9 5 9 (CAS REGISTRY NUMBERS: 127779-20-8：サキナビル（sa quinavir)) 、 A— 7 7 0 0 3 (CAS REGISTRY NUMBERS: 134878-17-4) 、 A— 8 0 9 8 7 (CAS REGISTRY NUMBERS: 144141- 97 - 9) 、 KN I— 9 3 (CAS REGISTR Y NUMBERS: 138258-64-7) 、 KN I— 1 0 2 (CAS REGISTRY NUMBERS: 139694-6 5-8) 、 KN I— 1 7 4、 KN I - 2 2 7 (CAS REGISTRY NUMBERS: 147384-69-8 ) . KN I - 2 7 2 (CAS REGISTRY NUMBERS: 147318-81-8) 、 L- 7 3 5 5 2 7 (CAS REGISTRY NUMBERS: 150378- 17 - 9 ：インジナビル（indinavir)) 、 S C - 5 2 1 5 1 (CAS REGISTRY NUMBERS: 143224-34-4 ：テリナビル (Tel inavir) ) . VX- 4 7 8 , ABT- 5 3 8 (CAS REGISTRY NUMBERS: 155213-67-5： リ トナビル（ritonavir)) 、 DMP— 3 2 3 (CAS REGISTRY NUMBERS: 151867-81-1 ) 、 U- 9 6 9 8 8 (CAS REGISTRY NUMBERS： 149394-65-0) 等が挙げられる。 より好ましくは高い抗ウィルス活性を有する Ro 3 1— 8 9 5 9、 L一 7 3 5 5 2 7及び KN— 2 7 2が好ましいが特に限定はされない。 これら H I Vプロテア 一ゼ阻害剤としては、 市販のものあるいは既知の合成法に従つて調製したものを 使用することができる。 Ro 3 1— 8 9 5 9については例えば、 J. Med. Chem.36， P2300-2310 (1993)に記載の調製法が挙げられる。
本発明物質では、 上記ポリべプチド鎖と上記抗 H I V活性物質とが化学的に結 合している力 その結合が化学的に形成された結合であれば特に限定はされず、 具体的には、 エステル結合、 アミ ド結合、 エーテル結合、 ジスルフィ ド結合等が 挙げられるが、 これらのうちエステル結合は、 結合した抗 H I V活性物質が生体 内の標的細胞内に運搬された後、 細胞内エステラーゼ等で切断が可能な結合であ り抗 H I V活性物質の作用点近傍で該抗 H I V活性物質を遊離しうる。 エステル 結合は、 運搬途中に容易に切断されることがない程度の安定性を有する結合であ るので好ましい力 \ これに限定はされない。
本発明物質において、 該抗 H I V活性物質との結合する該ポリべプチド鎖の部 位は特に限定されないが、 該ポリペプチド鎖自体と H I V表面タンパク質 gp 1 2 0及び宿主標的細胞である C D 4陽性細胞の細胞表面夕ンパク質 C D 4との親 和性を維持することが可能なァミノ末端部位が好ましい。 具体的には、 アミノ末 端部のァミノ酸の α—アミノ基又は ω—ァミノ基、 或いは T amが抗体作成のた めに開発した MA Pシステム （mul t iple ant igeni c peptide system) (J. P. Tam^P roc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、85， 5409-5413(1988) ; J. P. Tam 'Pept ides : synthesi s, structures, and appl i cations" (B. Gut tered. )Npp. 456-500^ Academic Press, Inc. .New York(1995)) の放射状に分枝したリジンを用いた樹枝状の構造 （dendrimer ) を、 上記 T a mの方法によって上記ポリペプチド鎖のアミノ末端部に作成し、 その末端及び側鎖に存在する複数のァミノ基に複数の抗 H I V活性物質を結合し てポリぺプチド鎖一分子あたり複数の抗 H I V活性物質を結合させることも可能 である。 当該樹枝状構造の形成に使用する物質は、 上記リジンが最も好ましいが 、 リジン以外にもオルニチン等の塩基性ァミノ酸或いは合成により調製したァミ ノ酸等であつてもアミノ基を 2個以上含有する物質であれば使用可能であり好ま しい。
該ポリぺプチド鎖のァミノ基に結合する抗 H I V活性物質の結合部位は、 結合 する該活性物質の種類により適宜選択されるべきであるが、 当該物質中にカルボ キシル基または水酸基が存在する場合はこれらの官能基を介して形成される化学 的結合が好ましく、 特に水酸基を介した化学的結合が好ましい。 また、 当該官能 基の位置が抗 H I V活性の中心的役割を有する部位であったとしても、 標的細胞 中で化学的結合が切断される為、 結合する部位となる当該官能基の分子中での位 置は特に限定はされない。
例えば、 抗 H I V活性物質をその物質中のカルボキシル基を介してポリべプチ ド鎖に結合させて本発明物質を得る場合は、 前記保護基保護化ポリべプチド樹脂 のァミノ末端部ァミノ基と抗 H I V活性物質のカルボキシル基の間でァミ ド結合 を形成させ、 直接的に結合させることも可能であり、 また適切なスぺーサ一物質 を介して生体内で切断が容易な化学的結合を形成させることも可能である。
また、 抗 H I V活性物質をその物質中の水酸基を介してポリべプチド鎖に結合 させて本発明物質を得る場合は、 保護基保護化ポリぺプチド樹脂のァミノ末端部 の官能基と抗 H I V活性物質の水酸基の両方に対して化学的に結合可能な官能基 を有する多官能性スぺ一サ一を介して結合させることができる。 このような多官 能性スぺ一サ一としては、 使用するポリべプチド鎖のアミノ末端部のァミノ基と 結合が可能な一方のカルボキシル基を有し、 さらに上記抗 H I V活性物質中の水 酸基ともエステル結合を形成することができる上記とは異なるカルボキシル基を 有することが好ましく、 具体的にはカルボキシル基を 2個以上有する芳香族化合 物或 、は脂肪族化合物等が挙げられるが、 鎖状構造を形成していることから脂肪 族化合物が好ましい。
即ち、 多官能性スぺ一サ一としてジカルボン酸を用いた場合、 一方のカルボキ シル基と前記ポリべプチド鎖のァミノ末端部のァミノ基とでァミ ド結合を形成し 、 他方のカルボキシル基と前記抗 H I V活性物質中の水酸基とでエステル結合を 形成することによりポリべプチド鎖と前記抗 H I V活性物質を結合することがで きる。 多官能性スぺーサ一としては、 合成の簡便性、 生体内での酵素による切断 の容易性、 本発明物質の抗 H I V活性などを考慮すると、 炭素数 4〜1 2の脂肪 族ジカルボン酸が好ましく、 炭素数 4〜 8の脂肪族ジカルボン酸がより好ましい 。 ジ力ルポン酸でも安定性や取り扱いの簡便性からコハク酸あるいはグルタル酸 が特に好ましい。 なお、 ジカルボン酸はポリペプチド鎖及び抗 H I V活性物質の 結合を妨げない限り他の官能基を有していても良い。
前記保護基保護化ポリペプチド樹脂と A Z Tとを、 ジカルボン酸 （例えばコハ ク酸あるいはグルタル酸） を多官能性スぺーサ一として結合する方法としては、 まず A Z Tと多官能性スぺ一サ一の結合体を形成する。 すなわち、 例えばジメチ ルァミノピリジン存在下で A Z Tを無水コハク酸あるいは無水グル夕ル酸と反応 させ、 常法処理後、 A Z Tにコハク酸あるいはグルタル酸がエステル結合した A Z Tと多官能性スぺーサ一の結合体を得る。 次いで、 この A Z T—多官能性スぺ ーサ一結合体を、 前記保護基保護化ポリべプチド樹脂の N末端部のアミノ酸の α —ァミノ基若しくは ω—アミノ基、 あるいは該ァミノ酸に d e n d r i m e r状 に結合した樹枝状構造の末端及び側鎖に存在する複数のァミノ基に公知の方法、 例えば D I P C I - H O B t法などにより縮合させて結合することができる （こ の物質を保護基保護化ポリぺプチド樹脂一スぺ一サ一一 A Z T複合体とも記載す る） 。
上記の如く して得られた保護基保護化ポリぺプチド樹脂ースぺーサ一— A Z T 複合体は、 例えば以下の方法により不溶性樹脂及び保護基の脱離及びジスルフィ ド結合の形成を一工程で行うことにより、 本発明物質とすることができる。 すなわち、 例えば保護基保護化ポリべプチド樹脂—スぺーサ一一 A Z T複合体 に 1 0 %以下、 好ましくは 5 %未満、 さらに好ましくは 0 . 5〜 1 . 5 % ( v / v ) のァニソ一ル、 1当量以上、 好ましくは 5〜1 5当量、 より好ましくは 8〜1 2当量の TM S C 1 (トリメチルシリルク口リ ド） 、 T F Aを加えて 5分以上、 好ましくは 3 0〜 1 2 0分間、 0〜 8 0 ° 好ましくは 1 0〜 4 0 °C、 より好ま しくは 1 5〜3 0 °C条件下で反応させ、 続いて好ましくは 1 0 °C以下、 より好ま しくは氷冷下で 1 0 0当量以上、 好ましくは 2 0 0〜 4 0 0当量の D M S Oを添 加し 2 0分以上、 好ましくは 3 0〜 1 2 0分、 より好ましくは 6 0〜 1 0 0分間 反応させることにより脱保護基、 脱樹脂及びジスルフィ ド結合の形成が一工程で なされる。 当該保護基、 樹脂の脱離を行い、 ジスルフィ ド結合の形成を行う系を 以下 TM S C 1 一 D M S O/T F A系と記載する。 抗 H I V活性物質を複数結合 した本発明物質を調製する際は、 本発明物質の分子の大きさを考慮すると、 一つ のポリぺプチド鎖あたり 3 2個以下の抗 H I V活性物質を結合することが好まし く、 より好ましくは 1 6個以下である。
このようにして得られた本発明物質は、 公知の方法により単離精製することが できるが、 逆相高速液体クロマトグラフィーによる方法が最も効果的である。 本発明の医薬組成物の有効成分は上記本発明物質又はその薬理学的に許容され うる塩である。 薬理学的に許容されうる塩とは、 例えば無機酸 （塩酸、 臭化水素 酸、 リン酸、 硝酸、 硫酸など） 、 有機カルボン酸 （酢酸、 プロピオン酸、 マレイ ン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 クェン酸、 酒石酸、 サリチル酸など） 、 酸性糖 （グ ルクロン酸、 ガラクッロン酸、 ダルコン酸、 ァスコルビン酸など） 、 または有機 スルホン酸 （メタンスルホン酸、 p—トルエンスルホン酸など） 等との塩が挙げ られ、 また、 ナトリウム塩、 カリウム塩、 カルシウム塩、 マグネシウム塩等も挙 げられるが、 特に限定はされない。 本発明物質をそのままとして投与することも 可能であるが、 さらに薬剤の投与方法及び投与形態に応じて選択された薬理学上 許容されうる担体を加えた医薬組成物としてもよい。 この医薬組成物としては、 治療法などに応じて経口的或いは非経口的に投与され、 その投与方法に応じて適 宜な薬物担体により、 注射薬、 内用薬、 外用薬、 坐薬 （例えば粉末、 顆粒、 注射 用若しくは内服用液剤、 錠剤、 ペッサリー、 軟膏、 クリーム、 エアゾール等） の 製剤とすることができる。
本発明の医薬組成物を例えば注射剤として直接、 生体に投与する場合には、 薬 剤成分として 1日あたりヒト体重 1 k gに対して 1 0mg〜5 gを投与すること ができる。
本発明の医薬組成物の示す抗 H I V活性は、 少なくとも H I V表面タンパク質 に親和性を示すポリべプチド鎖による抗 H I V活性物質の標的細胞内への運搬と 、 標的細胞上でのポリべプチド鎖と抗 H I V活性物質との化学的結合の切断によ つて、 ポリべプチド鎖と抗 H I V活性物質という作用機序の異なる抗 H I V剤、 即ち、 H I Vの CD 4陽性細胞への吸着、 融合及び侵入段階を抑制すると考えら れるポリべプチドと、 H I V逆転写酵素あるいは H I Vプロテアーゼの酵素活性 を阻害する抗 H I V剤とが組み合わせられることで生じるものと考えられる。 す なわち、 本発明物質の単体により多剤併用療法と同等の治療効果が期待される。 また、 従来の抗 H I V剤と比して毒性が低下している理由は、 それ自体に細胞毒 性を持つ AZT等の抗 H I V活性物質を化学的に結合させ、 標的細胞に的確に送 り込むことによつて薬剤有効濃度を抑え、 正常細胞への毒性を抑えるためである と考えられる。 図面の簡単な説明
図 1は本発明物質 1 2 (AZT-Suc-T22) 及び 22 (AZT- Glu- T22) の gp 1 2 0及び C D 4への親和性を表す B I A c o r e分析図である。 発明を実施するための最良の形態
以下に、 本発明を実施例により更に詳細に説明するが、 本発明はその要旨を超 えない限りこれらに限定されるものではない。
試験例 1
TMS C 1— DMSO— TFA系の脱側鎖保護能力
Fmo c— As p (But) — OH、 Fmo c—G l u (B u ') — OH、 Fm o c— H i s (Bo c) _0H、 Fmo c— S e r (Bul) — 0H、 Fmo c -Th r (B u ') -OH, Fmo c— Ly s (Bo c) 一 0H、 Fmo c— A r g (Pmc) — OH各 6mgに TMSC 1 (4 2〃 1) 、 DMSO (7 6 2〃 1 ) 、 及び T FA (5. 2 m l) を加え、 4 °C下で処理して 5、 1 0、 3 0、 6 0、 9 0分後に 1 0 0 β 1ずつサンプリングして Η20— Me CN (1 ： 1) で l m lに希釈し、 その溶液の一部を H PLCにインジェクションして、 Fmo c アミノ酸、 側鎖保護 Fmo cアミノ酸を定量した。
以下において HPLC分析は、 C o smo s i 1 5 C 1 8 -AR (4. 6 x 1 5 0 mm) カラムを使用し、 流速 1 m 1 Zm i nで行った。 溶出は、 0. 1 %
(v/v) TFA— H20と 0. 1 % (v/v) TFA— Me CN (ァセトニト リル） の直線勾配により行った。 HP L Cでの分取には C o s mo s i 1 C I 8 -AR (2. 0 X 2 5 c m) を流速 7 m 1 Zm i nで使用した。
その結果、 何れの側鎖保護基も、 この切断試薬系で 6 0分以内に定量的に除去 できることが判明した。
試験例 2
TMS C 1一 DMSO— TFA系の樹脂からのァミノ酸遊離能力
切断処理によりアミノ酸或いはべプチド酸を遊離するアルコキシル型樹脂に L e uを結合した H— L e u— A 1 k o r e s i n (0. 6 0 mmo 1 /g, 2 〃mo 1 ) 、 或いは切断処理によりアミノ酸アミ ド或いはペプチドアミ ドを遊離 するアミ ド型樹脂に A r g (Pmc) を結合した H— A r g (Pmc) 一 R i n k am i d e r e s i n (0. 3 2 mmo 1 / g, 2 n o 1 ) に内部標準 として B o c— G l y— OH (3 n o 1 ) を加え、 TMS C 1 (7 ^ 1 , 7 5 0 e q) と TFA ( 8 7 0〃 1) を加えて、 室温下で 1時間攪拌後、 DMSO ( 1 2 7 / l, 7 5 0 e q) を加え、 更に 1時間攪拌した。 3 0、 6 0、 9 0、 1 2 0分後にそれぞれ 1 0 0 1ずつサンプリングして蒸留水で l m lに希釈した 。 アミノ酸分析機により再生アミノ酸を定量した。 その結果、 2時間処理した後 のァミノ酸の再生率は、 L e u : 1 0 0%、 A r g : 8 7 %であった。 このこと より、 この切断試薬系で、 A 1 k o r e s i n及び R i nk am i d e r e s i nに結合したアミノ酸が定量的に切断、 遊離できることが判明した。
調製例 1
下記式 （A) のポリペプチド鎖を持つ保護基保護化ポリペプチド樹脂の調製 1 1 2 3 4 5 6 7 7 8 9 10 11 12 13
Arg-Arg-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Lys-DLys-Pro-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-OH
• · · · (A)
(式中、 Arg、 Tyr、 Cys、 Lys、 DLysおよび Proは前記したアミノ酸残基を示し、 3位と 1 1位の Cy s間の実線はジスルフィ ド結合をしめす。 ）
式 （A) のポリペプチド鎖を持つ保護基保護化ポリペプチド樹脂の調製は、 F mo c型固相合成法を用いて手動で行った。 ペプチド合成用樹脂として、 Fmo c - A r g (Pmc) - A 1 k o r e s i n (A r g換算で 0. 52 mmo 1 /g) を使用した。 20%ピぺリジン ZDMFで 15分間処理し、 Fmo c基の 除去を行った。 Fmo cアミノ酸の縮合には、 D I P C I— HOB t/DMFを 使用した。 Fmo cアミノ酸及び縮合試薬等はそれぞれ樹脂に対して 2. 5当量 使用した。 以下、 このように合成された物質を便宜上保護基保護化ポリぺプチド 樹脂 1と記載する。
また、 上記式 （A) の 13位が NH2となったポリペプチド鎖のアミ ド体を生 成する保護基保護化ポリぺプチド樹脂を、 ぺプチド合成用樹脂として Fm o c— Arg (Pmc) — Ri nk ami de r e s i n (A r g換算で 0. 34 mmo 1 /g) を用いて上記同様の Fmo c型固相合成法により合成した。 さらに、 下記式 （B) のポリペプチド鎖を持つ保護基保護化ポリペプチド樹脂 はべプチド合成用樹脂として切断処理によりアミノ酸アミ ド或いはべプチドアミ ドを遊離する Fmo c— PAL (p ep t i de ami de l i nk e r) r e s i n (ァミノ基換算で 0. 38mmo 1/g) を用いて上記同様の Fmo c型固相合成法により合成した。 このようにして合成された当該物質を便宜上保 護基保護化ポリぺプチド樹脂 2と記載する。 1 1 2 3 4 5 6 7 7 7 7 7 7 8
Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Tyr-Cys-Tyr
9 10 11 12 13
Figure imgf000026_0001
(B)
(式中、 Arg、 Trp、 Tyr、 Cys、 Gly及び Lysは前記のアミノ酸残基を示し、 3位 と 1 1位間、 両 7位間の C y sを結ぶ実線はジスルフィ ド結合を示す。 ） なお、 固相合成における各ァミノ酸縮合反応は表 2に示す操作条件に従って行 つた o
表 2
Figure imgf000027_0001
調製例 2
3， 一アジドー 3， ーデォキシチミジン一 5， 一モノスクシネート （AZTコ ハク酸エステル） の調製
3， 一アジド一 3， ーデォキシチミジン （AZT) ( 534. 8 mg、 2 mm o 1) を THF (1 0m l) に溶解し、 4。Cで無水コハク酸 （ 20 0. lmg、 2 mmo 1) 、 ついでジメチルァミノピリジン （48. 8 mg, 0. 4 mmo 1 ) を加え、 4 8時間撹拌した。 更に、 無水コハク酸 （400. 2 mg、 4 mmo 1 ) を追加し 2 4時間攪拌した。 反応液を A cOE t (酢酸ェチル： 50ml) で抽出し、 有機層を飽和食塩水で洗浄した後、 飽和 NaHC03水溶液を加え分 液した。 水層にクェン酸を加えて PH 4に調整し、 AcOE t (5 0 m l x 3) で抽出し、 有機層を飽和食塩水で洗浄した後、 無水 MgS04で乾燥、 MgSO4 を濾過し、 濾液を減圧留去し、 目的の AZTコハク酸エステルの結晶を得た （5 6 7. 8 mg、 収率 77. 3 %) 。
Ή-NMR (27 0 MHz、 CDC 13) (51. 86 (d， 3H) 、 2.6 -2. 9 (m、 6H) 、 4. 1 1 - 4. 1 3 (m， 1 H) 、 4.23 - 4.29 (dd， 1 H) 、 4.34 - 4. 3 9 (m， 1 H) , 4.8 2 - 4.8 8 (dd， 1 H) 、 5. 8 8— 5.9 3 (q, l H) 、 7.45 (d， 1 H) 、 1 0. 6 8 (s， 1 H)
調製例 3
3， 一アジドー 3' —デォキシチミジン一 5' —モノグルタレート （AZTグ ルタル酸エステル） の調製
調製例 2の AZTコハク酸エステルの調製と同様の反応条件及び同様反応操作 により、 AZT ( 534. 8 mg、 2 mmo 1 ) と無水グルタル酸 （ 228. 2 mg、 2 mmo 1) を反応させ、 同様の処理後、 目的の A Z Tグルタル酸エステ ルの結晶を得た （収率 8 0. 0%) 。
Ή-NMR (2 7 0 MHz、 CD C 13) 51.9 1 (s， 3H) 、 1.96— 2.0 5 (m、 2H) 、 2. 3 6 - 2. 57 (m， 6H) 、 3.9 8— 4.08 (m ， 1 H) 、 4.24 - 4. 3 3 (m, 2 H) 、 4.5 1—4. 5 5 (d t, 1 H) 、 6. 0 5 - 6. 0 9 (t， l H) 、 7. 3 9 (s， 1 H) 、 1 0.27 (s， 1 H) 調製例 4
保護基保護化ポリぺプチド樹脂からのポリぺプチドの調製
上記調製例 1で調製した保護基保護化ポリペプチド樹脂 1 (50mg、 9. 6 mmo 1 ) に、 ァニソ一ル （0. 1 5 m 1 ) 、 TMS C 1 (0. 1 0 5 m K 1 0 e q) 及び TFA (1 3ml) を加えて室温下で 1時間攪拌した。 次いで、 4 °Cで DMSO (1. 9m 1、 3 0 0 e Q) を加えて 1時間 30分攪拌した。 反応 後、 冷エーテル （50m l ) を加えてポリペプチドを析出させ、 遠心分離操作に より該ポリぺプチドを得た。 この粗ポリぺプチドをェ一テル （ 50 m 1 X 3 ) で 洗浄した後、 風乾させた。 HPLCを用いて精製し、 凍結乾燥の後、 目的の上記 式 （A) のポリべプチドを得た （6. 2 8,収率33%) 。 以下のイオンスプ レ一マススぺク トル （I S— MS) の測定はトリプルステージ四重極型質量分析 装置 ΑΡΙΠΕ型 （P e r k i n— E 1 me r S c i e x社製） で行った。 I S -MS (reconstructed) m/z: Found 1974.0(1973.2 Calc. for C86H, 4 oN32Pi a S2) 、 [ ]26 D=-24.5° (c=0.2， H20)、 1 0〜 40 %の 3 0分間のァセトニトリ ル濃度勾配、 流速 lml/minでの Wa t e r s Bo n d a s p h e r e 5 n C 1 8 - 1 00 A (3. 9 x 150mm. 日本ミリポア製） による分析的 HPしじでの 保持時間は 14.2分、 6 N HC 1による加水分解物のァミノ酸分析 （力ッコ内の 数値は理論値） では C y s未決定 （l) 、 Ty r 3. 0 0 (3) 、 Ly s及び D -L y s 2. 8 6 (3) 、 A r g 5. 1 1 (5) 、 P r o O. 9 5 (1) 。
上記と同様な反応操作により、 上記式 （A) のポリペプチドアミ ド体 （保護基 保護化ポリべプチド樹脂 （R i nk am i d e 樹脂を使用） からの収率 56 % (8. 4mg) ) を得た。 I S— MS (reconstructed) m/z: Found 1972.5(19 72.1 Calc. for C86H, 4 ,N33P.7S2) 、 [a] 26 D=-18.8° (c=0.2, H20)、 1 0〜4
0 %の 30分間のァセトニトリル濃度勾配、 流速 lml/minでの W a t e r s
Bo nd a s p h e r e 5 C 1 8— 1 00人 （3. 9xl50mm、 日本ミ リポア 製） による分析的 HPLCでの保持時間は 14.8分、 6 N HC 1による加水分解 物のァミノ酸分析 （力ッコ内の数値は理論値） では Cy s未決定 （ 1 ) 、 Ty r
3. 0 0 (3) 、 L y s及び D— Ly s 2. 80 (3) . A r g 5. 1 3 (5) 、 P r o O. 88 (1) 。
同様にして上記式 （B) のポリペプチドアミ ド体 （保護基保護化ポリペプチド
2からの収率 4 3 %) を得た。
以下便宜上本方法により得た物質を合成ポリペプチドと記載し、 上記式 （A) のポリぺプチド鎖を持つ合成ポリぺプチド （T 1 3 1 ) を合成ポリぺプチド 1、 上記式 （B) のポリペプチド鎖を持つ保護基保護化ポリペプチド樹脂 2を用いて 上記と同様の方法により調製した合成ポリペプチド （T22) を合成ポリべプチ ド 2と言己載する。
調製例 5
本発明物質 （ポリペプチド一 AZTコハク酸エステル複合体） の調製 上記調製例 1で調製した保護基保護化ポリぺプチド樹脂 1あるいは 2の N末端 のァミノ酸の α—ァミノ基に、 上記調製例 2で調製した ΑΖΤコハク酸エステル (2. 5 e q) のカルボキシル基を D I PC I— HOB t法により縮合した。 こ のようにして得た保護基保護化ポリぺプチドー A Z Tコハク酸エステル複合体樹 脂 （5 Omg) を調製例 4の合成ポリペプチドの調製法と同様の脱保護、 脱樹脂 、 ジスルフィ ド結合形成を行い、 同様の単離、 精製法により、 目的のポリべプチ ドー AZTコハク酸エステル複合体の本発明物質を得た。 以下便宜上本調製方法 による本発明物質を本発明物質 1と記載し、 上記式 （A) のポリペプチド鎖を持 つ本発明物質 1 (AZT-Suc- T131) を本発明物質 1 1、 上記式 （B) のポリべプチ ド鎖を持つ本発明物質 1 (AZT- Sue- T22) を本発明物質 1 2と記載する。
本発明物質 1 1 ：収率 29. 99 % (5. 5mg) 、 I S -M S (reconstruct ed)m/z: Found 2323.23(2322.1 Calc. for C, 0 oH, 55N37024S2, [«] ' 8 D=— 16.7° (c=0.1， IN AcOH)、 1 0〜 50 %の 3 0分間のァセトニトリル濃度勾配、 流速 lml /minでの W a t e r s /Bon d a s p h e r e 5 /C 1 8 - 1 00A (3. 9X150腿、 日本ミリポア製） による分析的 HP LCでの保持時間は 1 7. 5分、 6 N HC 1による加水分解物のァミノ酸分析 （力ッコ内の数値は理論値） では 、 C y s未決定 （l) 、 Ty r 3. 0 0 (3) 、 Ly s及び D— L y s 3. 00
(3) 、 A r g 5. 37 (5) 、 P r o l. 24 (1) 。
本発明物質 1 2 ：収率 2. 76%、 I S-MS(reconstructed)m/z: Found 28 34.47(2836.3 Calc. for Ci 23Hi 79N43028S4, [a]2%=47.8° (c=0.01, IN AcOH) 調製例 6
本発明物質 （ポリペプチド一 AZTグルタル酸エステル複合体） の調製 上記調製例 1で調製した保護基保護化ポリぺプチド樹脂 1あるいは 2の N末端 アミノ酸の α—アミノ基に、 上記調製例 3で調製した ΑΖΤグルタル酸エステル (2. 5 e q) のカルボキシル基を D I P C I—HOB t法により縮合した。 こ のようにして得た保護基保護化ポリぺプチド樹脂一 A Z Tグルタル酸エステル複 合体を調製例 4の合成ポリぺプチドの調製と同様の調製法により、 目的のポリべ プチドー A Z Tグルタル酸エステル複合体の本発明物質を得た。
以下便宜上本調製方法による本発明物質を本発明物質 2と記載し、 上記式 （A ) のポリペプチド鎖を持つ本発明物質 2 (AZT-G1U-T131) を本発明物質 2 1、 上 記式 （B) のポリペプチド鎖を持つ本発明物質 2 (AZT-G1U-T22) を本発明物質 22と記載する。
本発明物質 2 1 :収率 6. 27 % (2. 3mg) 、 I S— M S (reconstructed )m/z: Found 2337.73(2336.2 Calc. for C, 0.H, 5 τΝ37O24S2, [«] 20 D=-38.2° (c =0.3, IN AcOH)、 1 0〜 5 0 %の 3 0分間のァセトニトリル濃度勾配、 流速 lml/m inでの W a t e r s B o n d a s p h e r e 5 C 1 8— 1 0 0人 （3.9 X 150mm 日本ミ リポア製） による分析的 H P L Cでの保持時間は 1 7. 4分、 6 N HC 1による加水分解物のァミノ酸分析 （力ッコ内の数値は理論値） では 、 C y s未決定 （l) 、 Ty r 2. 9 2 (3) 、 Ly s及び D -Ly s 3. 0 0 (3) 、 A r g 5. 0 8 (5) 、 P r o 1. 2 2 (1 ) であった。
本発明物質 2 2 ：収率 8. 8 1 %、 I S-MS(reconstructed)m/z: Found 28 49.97(2850.3 Calc. for C, 2 ,H, 8 ,N4.028S4, [α]2%=21.4° (c=0.1, IN AcOH) 調製例 7
D e n d r i me r型本発明物質の調製
上記調製例 1で作製した保護基保護化ポリぺプチド樹脂 1あるいは 2の N末端 アミノ酸の α—アミノ基にさらに同様のァミノ酸縮合法 （D I P C I— HOB t 法等） を用いて保護アミノ酸である Fmo c— Ly s (Fmo c) を結合した。 更に、 脱 Fmo c基操作及び Fmo c— L y s (Fmo c) の導入を 2回繰り 返し、 該ポリべプチドのァミノ末端部に Ly sが 7個導入された樹枝状の構造を もつ Ly s導入保護基保護化ポリペプチド樹脂を調製した。 以下、 調製例 1で得 た保護基保護化ポリべプチド 1から調製した該樹脂を Ly s導入保護基保護化ポ リペプチド樹脂 1とし、 保護基保護化ポリペプチド 2から調製した該樹脂を Ly s導入保護基保護化ポリぺプチド樹脂 2と記載する。
上記 L y s導入保護基保護化ポリぺプチド樹脂 1の F m o c基を除去し、 調製 例 5と同様にして調製例 2で調製した A ZTコハク酸エステル （2. 5 e q) を D I PC I—HOB t法により縮合した。 このようにして得た Ly s導入保護基 保護化ポリぺプチド樹脂一 A Z Tコハク酸エステル複合体を、 調製例 4の合成ポ リペプチド 1の調製法と同様の脱保護、 脱樹脂、 ジスルフィ ド結合形成を行い、 同様の単離、 精製法により目的の AZTが 8個導入された d e n d r i me r型 の本発明物質を得た。 以下便宜上本調製方法による本発明物質を d e n d r i m e r型本発明物質 1と記載する。
d e n d r i me r型本発明物質 1 ：収率 1 3. 1 8% (7. 3mg) 、 I S— MS (reconstructed)m/z: Found 5665.47(5664.5 Calc. for C24。H346 N86073S2 、 [ ]18 D二 22.6° (c=0.1，1N AcOH)ヽ 1 0〜 50 %の 30分間のァセトニトリル 濃度勾酉己、 流速 lml/minでの Wa t e r s Bo n d a s p h e r e 5〃C 1 8— 1 00人 （3.9xl50mm、 日本ミリポア製） による分析的 H P L Cでの保持 時間は 2 6. 5分、 6N HC 1による加水分解物のアミノ酸分析 （カツコ内の 数値は理論値） では、 C y s未決定 （ 1 ) 、 T y r 2. 87 ( 3 ) 、 L y s及び D-L y s 1 0. 0 0 ( 1 0) . A r g 5. 42 (5) 、 P r o l. 2 6 (1) o
上記と同様にして、 L y s導入保護基保護化ポリぺプチド樹脂 1に調製法 3で 調製した AZTグルタル酸エステルを結合し、 同様な脱保護、 脱樹脂、 ジスルフ ィ ド結合形成、 単離、 精製を行い目的の本発明物質を得た。 以下、 本発明物質を d e n d r i me r型本発明物質 2と記載する。
d e n d r i me r型本発明物質 2 ：収率 0. 7 2%、 I S-MS (reconstruc ted)m/z: Found 5775.22(5780.3 Calc. for C 248 H362 N86073S2， [α]2%=-12.3 ° (c=0.05, IN AcOH)
上記と同様にして、 L y s導入保護基保護化ポリぺプチド樹脂 2に調製例 2で 調製した AZTコハク酸エステルを結合した。 得られた Ly s導入保護基保護化 ポリペプチド— A ZTコハク酸エステル複合体樹脂 （1 0 Omg) に m—クレゾ —ル （3 00 1) 、 1， 2—エタンジチオール （300 / 1 ) 、 チオアニソ一 ノレ （3 0 0〃 1) 、 TFA (4. 8m l ) 、 蒸留水 （ 3 0 0〃 1 ) を加えて室温 下で 2時間攪拌して脱保護、 脱樹脂後、 調製例 4の合成ポリぺプチド 1または 2 の調製操作法に準じて処理操作、 風乾を行い、 得られた粗ペプチド誘導体を 1 N
AcOH (3m l) に溶解し、 超純水で 40m lに希釈した。 この溶液に 4 °C で DMSO (1 0ml) を加え、 室温下で 24時間放置し、 ジスルフィ ド結合を 形成させた。 さらに H PLCを用いて単離、 精製を行い、 凍結乾燥後、 目的の A ZTが 8個導入された d e n d r i me r型の本発明物質を得た。 以下、 便宜上 本調製方法による本発明物質を d e n d r ime r型本発明物質 3と記載する。 但し、 ジスルフィ ド異性体 2種が得られたので、 それぞれ異性体 1および 2と表 る。 d e n d r i me r型本発明物質 3 ： ジスルフィ ド異性体の 2種の化合物が得ら れた。
異性体 1 ：収率 2. 6 2% I S— MS (reconstructed)m/z: Found 6178.22(6 180.7 Calc. for C2s3H37。N92077 S4， [ ] 2。！ >=3.Γ (c=0.1, IN AcOH)
異性体 2 ：収率 4. 3 1 %、 [α]2%=-15.4 。 (c=0.1, IN AcOH)
上記と同様にして、 L y s導入保護基保護化ポリぺプチド樹脂 2に調製例 3で 調製した AZTグルタル酸エステルを結合し、 同様な脱保護、 脱樹脂、 ジスルフ ィ ド結合形成、 単離、 精製を行い目的の本発明物質を得た。 以下、 本発明物質を d e n d r i me r型本発明物質 4と記載する。
d e n d r i me r型本発明物質 4 ：収率 6. 2 0%、 I S-MS (reconstruc ted)m/z: Found 6292.97(6292.9 Calc. for C271H386 N920"S4， [ひ]2。 D二 10.3 ° (c=0.2， IN AcOH)
実施例 1
本発明物質の g p 1 2 0及び C D 4への親和性の測定
調製例 5及び 6で得た本発明物質 1 2 (AZT- Sue- T22) 及び 2 2 (AZT- Glu- T22 ) の gp 1 20及び CD 4への親和性を表面プラズモン共鳴を利用して測定する ノくィ才センサー、 B I A c 0 r™ biosensor (Pharmacia BiosensorAB^) 用 、 て Biochem. Biophys. Res. Commun.， 219， 555 - 559(1996)、 Biochem. Biopys. Act a.， 1298， 37-44(1996)の方法に準じて測定、 解析した （図 1 ) 。 その結果、 本発 明物質 1 2の gp l 2 0及び CD4に対する親和定数 （K a f f ) は、 それぞれ 2. 20 X 1 07Mと 3. 44 X 1 06Mであった。 同様に本発明物質 22の gp 1 20及び CD 4に対する Ka f f は、 それぞれ 6. 0 5ズ 1 06 及び1. 0 7 X 1 07Mであった。 これらの親和定数は、 調製例 4で得た合成ポリペプチド 2の g p 1 20及び CD 4に対する K a f f (それぞれ 5. 9 9 x 1 06Mと 9 . 9 0 x 1 06M : Biochem. Biophys. Res. Commun.， 219， 555- 559(1996)、 Bioch em. Biopys. Acta.， 1298， 37- 44(1996)) に匹敵し、 本発明物質 1 2及び 22が g p 1 2 0及び CD 4に高い親和性を示すことが明らかになった。
実施例 2
ヒト免疫不全ウィルス （H I V) に対する抗ウィルス活性 上記調製例 4で得た合成ポリペプチド 1 (T131) 及び 2 (T22) 、 上記調製例 5で得た本発明物質 1 1 (AZT- Sue- T131) 、 上記調製例 7で得た d e n d r i m e r型本発明物質 1及び AZTの H I Vに対する抗ウィルス活性を以下の方法に 従い試験し評価した。 すなわち 96穴マイクロタイタープレートに、 種々の濃度 の試験物質と共に H I V感染 MT— 4細胞 （2. 5 X 104個 Zwell、 感染多重 度 （MOI) : 0. 001) を感染直後に加える。 C02インキュベータ一中、 37°Cで 5日間培養した後、 生存細胞数を MTT法 （Pauwel et. al. , J. Virol. M ethods 20， 309-321(1988)) で測定した。 抗ウィルス活性は、 H I V感染による 細胞死を 50%抑制する濃度 (E Cso： 50¾ effective concentration) で表す 。 一方、 試験物質の MT— 4細胞に対する細胞毒性を知るために、 ウィルス非感 染細胞を上記と同様に種々の濃度の試験物質と共に培養を行った。 細胞毒性は試 験物質による 50%細胞障害濃度 (C Cso： 50¾ cytotoxic concentration) で 表す。 また、 CC5。と EC5。の概略比 （CC5。ZEC5。） を選択係数 （S. I. ) として表した。 抗 H I V活性測定の結果を表 3に示す。 本発明物質 1 1の抗 H I V活性は AZTの抗 H I V活性と比較して 2倍であり （EC5。値比較） 、 選択 係数も 2倍以上であり抗 H I V活性の明らかな増強を認めた。 また既知の抗 H I V活性ポリべプチドである合成ポリべプチド 1よりも抗 H I V活性は高い。 更に 、 d e n d r i me r型本発明物質 1が最も高い抗 H I V活性を示した。 表 3 M T T法による抗 H I V活性測定
CC50(^M) ECso(nM) S.I. 合成ポリペプチド 1 >80 17 >4615 合成ポリペプチド 2 27 8.4 3208 本発明物質 11 6.8 1.1 5713 dendrimer型本発明物質 1 1.7 0.18 9694
AZT 5.6 2.5 2299 実施例 3
H I V感染阻害活性
上記調製例 4で得た合成ポリペプチド 1及び 2、 上記調製例 4、 5、 6で得た 本発明物質 1 し 22及び d e n d r i me r型本発明物質 1、 及び A Z丁の、 H I V感染阻害活性を以下の方法に従い試験し評価した。 すなわち、 T細胞株指 向性 HI V— 1 (NL 4 - 3)及びマクロファージ指向性 H I V— 1 (JR-CS F) を用い、 PHA (Phaseolus vulgaris agglutinin)活性化 P BMC (perip heral blood mononuclear cells) への H I V— 1感染阻害活性能を、 H I V— 1の p 24抗原への抗体を用いる EL I S A法による p 24抗原発現抑制試験に より測定した。 すなわち種々の濃度の試験物質を H I V— 1感染直後の MT— 4 細胞に加え、 C02インキュベータ一中、 37 °Cで 3日間 （場合により 4日間或 いは 7日間） 培養した後、 培養上澄液中の H I V由来の p 24抗原量を EL I S Aキット （Ce l l u l a r P roduc t s製） で測定した。 その結果を表 4に示す。 上記調製例 4で得た合成ポリぺプチド 1及び 2が本来抗 H I V活性を 全く示さないマクロファージ指向性 H I V— 1である JR— CSFに対し、 本発 明物質はいずれも AZTと同様に抗 H I V活性を示し、 マクロファージ指向性の H I V- 1に対しても有効であることが判明した。
表 4 p 24抗原発現抑制試験による H I V感染阻害活性測定
ECso(nM)
NL4-3 JF-CSF
(T細胞指向性） （？ク Dファ-、ァ指向性）
合成ポリペプチド 1 1790 >4000
合成ポリペプチド 2 63 >3000
本発明物質 11 168 7.4
本発明物質 22 11.4 4.2
dendrimer型本発明物質 1 88 7.3
AZT 65 4.¾ 産業上の利用可能性
本発明物質により、 C D 4陽性細胞表面タンパク質及び H I V表面タンパク質 への親和性により抗 H I V活性物質を効果的に標的細胞上へ誘導し、 高い抗 H I V活性を有する医薬組成物を提供することができる。

Claims

請求の範囲
1. H I V表面タンパク質 gp 120及び/又は H I V宿主標的細胞表面タン パク質 C D 4に親和性を有するポリぺプチドに、 1又は 2種以上の逆転写酵素阻 害剤及び/又は H I Vプロテア一ゼ阻害剤が化学的結合により結合していること を特徴とする複合体。
2. H I V表面タンパク質 gp 120及び/又は H I V宿主標的細胞表面タン パク質 CD 4に親和性を有するポリペプチドが下記式 （1) で表されるポリぺプ チドであることを特徴とする請求項 1記載の複合体。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3
A 1 -A 2 -C y s - A 2 - A 3 - A 3 - Y -A 2 - A 3 - A 3 - C y s -A 4 - A 5
( 1 )
[式中、 1は11— (A 2のァミノ基由来） 或いはリジン、 アルギニンおよび オル二チンから選ばれる 1個の塩基性ァミノ酸残基又はこれらのァミノ酸残基か ら選択された同一又は異なるアミノ酸残基少なくとも 2個を有するぺプチド残基 、 或いは該塩基性ァミノ酸残基若しくはべプチド残基のァミノ末端ァミノ酸残基 の N— α位の水素原子が了シル基若しくは置換チォカルバモイル基で置換されて いる Ν— αァシル置換アミノ酸残基、 Ν— αァシル置換ペプチド残基、 Ν— 置 換チォ力ルバモイル化ァミノ酸残基または Ν— 置換チォカルバモイル化ぺプチ ド残基を示し；
A 2は独立してチロシン、 フヱ二ルァラニンまたはトリプトファン残基を示し； A 3は独立してリジンまたはアルギニン残基を示し；
A 4はリジンおよびアルギニンから選ばれるァミノ酸の少なくとも 1個を有する ァミノ酸残基またはべプチド残基を示し；
八5はー0?1 (A 4のカルボキシル基由来） 又は一 NH2 (A 4のカルボキシル 基の酸アミ ド由来） を示し； Yは下記式 （a) で示されるペプチド残基
1 , 2, 3, 4, 5, 6 ,
-A 6-A 2-A 3-G 1 y-A 7-A 6 - ( a)
(式中、 A2及び A3は上記 （1) 式におけると同義であり、 A 6は独立してァラニン、 バリン、 ロイシン、 イソロイシン、 セリン、 システ ィンまたはメチォニン残基を示し；
A 7はチロシン、 フエ二ルァラニン、 トリプトファン、 ァラニン、 ノ《リン、 口 イシン、 イソロイシン、 セリン、 システィンまたはメチォニン残基を示し；
G 1 yはグリシン残基を示す。
但し、 Γ 位と 6， 位力く共にシスティン残基である場合にはこれらはジスルフィ ド結合により連結していてもよい。 ） 、 または
D—オルニチループ口リン、 プロリル一 D—オル二チン、 プロリル一 D—リジン 、 プロリル一 D—アルギニン、 D—リジループ口リン、 D—アルギニル一プロリ ン、 グリシルーリジン、 グリシル一アルギニン、 オルニチルーグリシン、 グリシ ルーオル二チン、 リジル—ダリシン及びアルギニル—ダリシンで示される 2個の ァミノ酸から構成されたジぺプチドから選ばれるものであり、 且つその構成ァミ ノ酸である D—リジン、 リジン、 D—オル二チン又はオル二チンの側鎖 ω—アミ ノ基の水素原子はァシル基で置換されていてもよいべプチド残基を示し； C y sはシスティン残基を示し、 3位と 1 1位のシスティン残基はジスルフィ ド 結合により連結していてもよい] 。
3 . 化学的結合が、 上記式 （1 ) で表されるポリペプチドのァミノ末端アミノ 酸のび及び ωァミノ基の少なくとも一方と、 逆転写酵素阻害剤及び Ζ又は H I V プロテア一ゼ阻害剤との、 多官能性スぺーサーを介した結合であることを特徴と する請求項 2記載の複合体。
4 . 多官能性スぺ一サ一がァミノ基及び水酸基の双方に結合することが可能な 物質であることを特徴とする請求項 3記載の複合体。
5 . 多官能性スぺ一サ一が少なくとも 2個のカルボキシル基を有する化合物で あることを特徴とする請求項 3又は 4記載の複合体。
6 . 多官能性スぺーサ一が脂肪族ジカルボン酸であることを特徴とする請求項 3〜 5のいずれか一項記載の複合体。
7 . 逆転写酵素阻害剤が、 ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤であることを特徴 とする請求項 1 〜 6いずれか一項記載の複合体。
8 . ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤が非天然型ヌクレオシド又はヌクレオシ ドアナローグであることを特徴とする請求項 7記載の複合体。
9. ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤がピリ ミジン塩基、 プリン塩基、 ィミダ ゾ一ル塩基及びトリアゾール塩基からなる群から選ばれた塩基と、 少なくとも 1 個の水酸基を有するフラノ一ス又はそのァシクロ体からなるヌクレオシドもしく はその類縁体であることを特徴とする請求項 7記載の複合体。
1 0. ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤が、 3， —アジドー 3' —デォキンチ ミジンである請求項 7記載の複合体。
1 1. H I Vプロテア一ゼ阻害剤が、 H I Vプロテア一ゼの基質遷移状態ミ ミ ック化合物であることを特徴とする請求項 1又は 2記載の複合体。
1 2. H I Vプロテアーゼ阻害剤が、 Ro 3 1— 8 9 5 9、 A— 77 003、 KN I - 9 3、 KN I - 1 0 2、 KN I - 1 74、 KN I— 2 27、 KN I - 2 7 2、 L一 7 3 5 527、 SC— 5 2 1 5 1、 VX - 47 8、 ABT - 53 8、 DMP— 32 3及び U— 9 69 8 8から成る物質群より選択される 1又は 2以上 の物質である請求項 1〜 6いずれか一項記載の複合体。
1 3. 請求項 1〜1 2のいずれか一項記載の複合体またはその薬理学的に許容 されうる塩を有効成分として含有する医薬組成物。
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