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WO1997035995A1 - Compositions cellulaires antitumorales exprimant au moins trois transgenes - Google Patents

Compositions cellulaires antitumorales exprimant au moins trois transgenes Download PDF

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WO1997035995A1
WO1997035995A1 PCT/FR1997/000521 FR9700521W WO9735995A1 WO 1997035995 A1 WO1997035995 A1 WO 1997035995A1 FR 9700521 W FR9700521 W FR 9700521W WO 9735995 A1 WO9735995 A1 WO 9735995A1
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expression
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gene
virus
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PCT/FR1997/000521
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Majid Mehtali
Horst Homann
Yves Poitevin
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Transgene S.A.
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    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • the subject of the present invention is a cell composition for the treatment or prevention of tumors in humans or animals. More particularly, it comprises a population of cells capable of expressing a combination of at least three therapeutic genes having an effect. The invention also relates to the therapeutic use of such a composition in the field of oncology 20
  • Immunotherapy is based on the transfer of genes coding for cytokines and co-stimulatory molecules with the aim of making tumor cells more immunogenic and strengthening the host's anti-tumor immune response.
  • the cytokines thus evaluated in mu ⁇ ns models and, for which have shown an anti-tumor property, are interleukin (IL) 2, 1TL-4, IL-6, IL-7, IL-12, tumor necrosis factor (TNF) of alpha type, GM-CSF (for Granulocyte Macrophage Colony Sttmulating Factor) and interferons (IFN) Xenogenic cells producing IL-2 have thus demonstrated an anti-tumor effect (see European application EP 0 579 791)
  • the cytotoxic approach consists in specifically increasing the sensitivity of tumor cells to chemotherapy by transfer of a so-called suicide gene, the product of which is capable of transforming an inactive precursor into a highly cytotoxic product.
  • suicide gene the product of which is capable of transforming an inactive precursor into a highly cytotoxic product.
  • the most widely used to date is the tk gene of the virus.
  • Herpes Simplex type 1 (HSV-1) coding for the enzyme thymidine kinase (TK) which has the property of converting acyclovir and ganciclovir into phosphorylated analogs of nucleosides
  • TK thymidine kinase
  • the anti-oncogene strategy is based on the introduction into tumor cells of a functional copy of a tumor suppressor gene (for example the gene associated with retinoblastoma or p53) or the inhibition of the expression of oncogenes by the transfer of genes coding for antisense polynucleotides or ⁇ bozymes capable of degrading the messenger RNAs of oncogenes with the aim of reducing or abolishing the proliferation of cancer cells
  • an anti-tumor composition based on cells genetically modified to secrete IL-2 and produce retroviral particles expressing the tk genes of the HSV-1 virus and LFN ⁇ .
  • Such a composition makes it possible to inhibit or delay the Cell proliferation by inducing specific death of tumor cells, better presentation of antigens and stimulation of host immune cells
  • the present invention offers an effective alternative to the techniques of the prior art for treating cancer in humans or 'animal This is why the subject of the present invention is an anti-tumor composition comprising a population of cells allowing the expression of at least three therapeutic anti-tumor genes.
  • therapeutic antitumor genes genes whose expression products have an antitumor effect, in particular for increasing immunity directed specifically against the tumor and / or at least partially inhibiting cell division.
  • genes coding for immunostimulatory polypeptides of the immune response and / or cytotoxic are meant any polypepude capable of amplifying the production of antibodies directed against tumor cells and antigens or of stimulating an immune response mediated by cells, activating T cells to trigger a significant delayed hypersensitivity or cytotoxic response against tumor cells.
  • cytotoxic is meant any polypepude capable of inducing cell death either directly or indirectly via a drug capable of being administered independently
  • immunostimulatory genes which can be used in the context of the present invention, it is possible to envisage genes coding for cytokines and in particular mterleukins (IL), colony stimulating factors (G-CSF, M-CSF and GM-CSF), interferons (LFN), rumor necrosis factors (TNF), co-stimulation factors such as polypeptides B7 1 and B7 2 and factors activating the expression of class II histocompatibthte antigens
  • IL mterleukins
  • G-CSF colony stimulating factors
  • M-CSF and GM-CSF interferons
  • TNF rumor necrosis factors
  • co-stimulation factors such as polypeptides B7 1 and B7 2 and factors activating the expression of class II histocompatibthte antigens
  • IL-2 is particularly preferred It is responsible for the proliferation of activated T lymphocytes, and, in association with IFN ⁇ , stimulates macrophages, natural killer cells NK (for Natural Killer in English) and T cells. In addition, certain studies tend to show that it has a chemotactic role for lymphocytes when it is produced at the level of a rumor.
  • Interferons have antiviral and immunomodulatory properties. They can activate phagocytic cells and increase the expression of class I and II surface antigens of the major histocompatibility complex (MHC) and also stimulate the cytotoxicity of NK cells and those activated by lymphokines (LAK for Lymphokine Activated Killer in English) meet tumor cells.
  • MHC major histocompatibility complex
  • LAK lymphokine Activated Killer in English
  • Colon stimulating factors are involved in the maturation of hematopoietic stem cells and their differentiation into mature cells in the bloodstream.
  • GM-CSF, G-CSF and M-CSF for Granulocyte-Macrophage, Granuiocyte and Macrophage respectively.
  • TNF ⁇ produced by macrophages are responsible for the anti-tumor cytotoxic activity of macrophages and lymphocytes and for local tissue damage. observed in the inflammatory reaction.
  • cytotoxic genes include those encoding a thymidine kinase and, in particular the thymidine kinase (TK) of the Herpes Simplex virus type 1 (HS V- 1), cytosine deaminase, cytochrome P450 2B 1, pu ⁇ ne nucleoside phosphorylase encoded by the DeoD ⁇ 'E.coli gene, nitroreductase and ⁇ -glucoronidase
  • TK thymidine kinase
  • H V-1 Herpes Simplex virus type 1
  • these toxic genes are described in the literature ( see for example Moolten, 1994, Cancer Gène Therapy /, 279-287)
  • the three therapeutic genes used in the context of the present invention code for the TK-HSV1, IL-2 and IFN ⁇ polypeptides.
  • the origin of the immunostimulatory genes is chosen so that they are functional in the host for which the anti-tumor composition according to the invention is intended.
  • the coding sequences for human IL-2 and human LFN ⁇ are preferably retained.
  • the therapeutic genes can be obtained by cloning, by PCR or by chemical synthesis according to the conventional techniques commonly used. They may be native genes or derivatives thereof by mutation, deletion, substitution and / or addition of one or more nucleotides. Of course, they can include the appropriate elements for regulating transcription as well as translation initiation and termination signals allowing their expression.
  • a promoter region which is functional in the cells of the host which we want to treat will be used, preferably in human cells. It may be the promoter region naturally governing the expression of said gene or a promoter region of different origin, for example from eukaryotic or viral genes. On the other hand, the promoter region can be modified so as to contain regulatory sequences, for example a transcription activating element (enhancer).
  • the promoter region chosen may be constitutive or regulable, and in the latter case, in response to certain cellular signals. It will be advantageous to use a tissue-specific promoter region, when the tumor to be treated originates from a particular cell type. Alternatively, the use of a promoter responding to tumor specific signals (e.g. having overexpressed factors by tumor cells) may prove advantageous because the expression is restricted to tumor cells.
  • promoters are generally known to those skilled in the art. Mention may in particular be made of the promoters SV40 (Virus Simian 40), PGK (Adra et al., 1987, Gene 60, 65-74), HMG (Hydroxy-Methyl-Glutaryl-coenzyme A), TK (Thymidine Kinase), LTRs (Long Terminal Repeat) of RSV (Rous Sarcoma Virus), Mo-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) and promoters of genes coding for class 1 MHC antigens which are activated by IFN ⁇ . These examples are not limitative.
  • the therapeutic genes can be placed under the control of elements allowing their expression independently or in common. In other words, they can be expressed in a monocistronic or polycistronic manner. In the latter case, an element allowing the reinitiation of translation will be implemented at the level of the second cistron, for example an internal ribosome entry site (IRES) well known to those skilled in the art.
  • IRES internal ribosome entry site
  • a certain number of IRES have been identified in the 5 ′ region of viral mRNAs and, in particular, picornaviruses such as the poliomyelitis virus (Pelletier et al., 1988, Mol. Cell. Biol.
  • the immunosumulatory polypeptides may be secreted outside the cells making up the antitumor composition according to the invention.
  • the corresponding genes can also include a signal sequence. It can be the natural signal sequence or a heterologous sequence as long as it is functional in the cell host
  • said cell population can derive from a primary or tumor cell, from a cell line, from an organ or can comprise a mixture of cells allowing the expression of the various therapeutic genes.
  • a mixture of cells for example derived from the Véro line (available at ATCC), a part expressing IL2 and another part expressing IFN ⁇ , possibly combined with a retroviral packaging line allowing production of virions or a population of viruses expressing the TK cytotoxic gene.
  • Véro line available at ATCC
  • a part expressing IL2 and another part expressing IFN ⁇ possibly combined with a retroviral packaging line allowing production of virions or a population of viruses expressing the TK cytotoxic gene.
  • a retroviral packaging line allowing the production infectious particles comprising a retroviral vector according to the invention as defined below
  • the cell population composing the antitumor composition according to the invention comprises or consists of retroviral packaging cells allowing the production of infectious particles comprising a retroviral vector
  • the retroviral vector is defective by deletion or mutation of the gag, pol and env viral genes and cannot, therefore, replicate autonomously Its propagation requires the supply of viral polypeptides for which it is deficient
  • An packaging cell is capable of providing in trans all the polypeptides which the retroviral vector cannot synthesize and which are necessary for the constitution of the infectious particles
  • the packaging cells in use in the present invention are derived from a line of human origin and, in particular, of line 293 This can be generated by transfusion ction of vectors allowing expression of the gag / pol genes of the FMuLV virus (F ⁇ end Mu ⁇ ne Leukemia Virus) of the strain FB29 and the env gene of the amphotropic virus 4070A
  • a preferred antitumor composition according to the invention comprises a population of cells comprising a vector allowing the expression of a gene coding for PIL-2 and allowing the production of infectious particles having incorporated a retroviral vector expressing a gene coding for thymidine kinase of the HSV-1 virus and a gene coding for lTFN ⁇
  • the population of cells in use in the context of the present invention is sensitive to a drug allowing its elimination.
  • a drug derived from acyclovir and, in particular, ganciclovir
  • the population of cells can also express a positive selection marker, for example a gene for resistance to an antibiotic facilitating its selection Mention may be made of the genes ne ⁇ (neomycin) conferring resistance to antibiotic G4 I 8, dhjr (dihydrofolate reductase), pac (puroacetyl transferase) (Morgenstern and Land, 1990, Nucleic Acids Res 18, 3587-3596), hygromycin B and gpt (xanthine phospho ⁇ bosyl)
  • the present invention also relates to an packaging cell derived from line 293 and comprising - the gag / pol genes of the FMuLV virus (F ⁇ end Mu ⁇ ne Leukemia Virus) of the strain FB29 and the env gene of the amphotropic virus 4070A, and a vector allowing the of a gene encoding IL-2
  • a suitable vector can be constituted by the vector pTG5324 described below in which the expression of riL-2 is directed by the early promoter of the virus.
  • the present invention also relates to a retroviral vector characterized in that it comprises from 5 'to 3' - a 5 'LTR, an encapsidation region, a gene coding for gamma interferon, a constitutive internal promoter, a gene coding for thymidine kinase of the HS V-1 virus, - an internal ⁇ bosome entry site (IRES), a gene coding for a positive selection marker, and a 3 'LTR
  • a vector according to the invention can derive from any retrovirus.
  • retroviruses such as avian erythroblastosis virus (AEV), avian leukemia virus (AVL), avian sarcoma virus (ASV), necrosis virus of spleen (SNV) and Rous sarcoma virus (RSV), bovine retroviruses, feline retroviruses, mu ⁇ ns retroviruses such as mu ⁇ ne leukemia virus (MuLV), Friend virus (F-MLV) and murine sarcoma virus (MSV) and primate retroviruses.
  • MoMuLV Moloney mu ⁇ ne leukemia virus
  • the numerous retroviral vectors derived from the latter which are described in the literature, in particular the vector
  • the present invention also relates to the use of an anti-tumor composition of an packaging cell or of a retroviral vector according to
  • cancers which could be thus treated are, advantageously, solid tumors such as renal, breast, lung and colon cancers and melanomas.
  • the medicament resulting from the present invention can be administered according to any general route commonly in use, in particular by parenteral route such as the systemic route, subcutaneous intramuscular or intrapetoneal route.
  • parenteral route such as the systemic route, subcutaneous intramuscular or intrapetoneal route.
  • the intra-tumor route is indicated as being particularly advantageous.
  • administration can take place in a single or repeated dose, one or more times after a certain time interval.
  • the medicament will also comprise a support which is acceptable from a pharmaceutical point of view. It may also include a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or adjuvant.
  • the appropriate dosage varies according to different parameters, for example the route of administration, the individual to be treated, the nature and severity of the tumor condition, the type of therapeutic genes used.
  • the present invention also relates to a method of treatment of cancer in mammals, according to which an individual in need of such treatment is injected with a pharmaceutically effective amount of an antitumor composition, an encapsidation cell or a retroviral vector according to the invention
  • Figure 1 illustrates the vector pTG5324 allowing expression of human IL-2 from the CMV early promoter. It includes the pac selection gene directed by the SV40 promoter.
  • Figure 2 illustrates the retroviral vector pTG9344 comprising a 5 'LTR. an encapsidation region, a bicistronic expression cassette "tk gene of the HSV-1 virus followed by TIRES EMCVet of the selection gene neo" directed by the murine PGK promoter.
  • Figure 3 illustrates the retroviral vector pTG9326 deriving from the vector pTG9344 by insertion of the gene coding for canine IFN ⁇ .
  • the constructions described below are carried out according to general techniques of genetic engineering and molecular cloning, detailed in Maniatis et al, (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Sp ⁇ ng Harbor, NY) or according to the recommendations of the manufacturer when using a commercial kit
  • the cloning steps using bacterial plasmids are preferably carried out in the coitus XLl-BIue or DH5a strain (Gibco BRL)
  • the M13 vectors are amplified in the E.
  • the procedure is by filling the protruding 5 ′ ends with the large fragment of DNA polymerase I ⁇ E coli (Klenow) or by digestion with nuclease SI followed by a Klenow treatment PCR (Polymerase Chain Reaction) amplification techniques are known to those skilled in the art (see for example PCR Protocols - A guide to methods and applications, 1990, edited by Innis, Gelfand, Sninsky and White, Académie Press Inc)
  • the line E l 7 is a retroviral packaging line derived from the human line 293 (Graham et al, 1977, J Gen Virol 36, 59-72) by transfection of vectors expressing respectively the gag / pol genes of the FMuLV virus (Friend Mu ⁇ ne Leukemia Virus) of the strain FB29 and the env gene of the amphotropic virus 4070A
  • the cells are transfected according to standard techniques well known to those skilled in the art.
  • the DMEM medium Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco BRL
  • FCS fetal calf serum
  • EXAMPLE 1 Construction of a retroviral packaging line producing human interleukin-2 fhrL-2 (17-TG5324)
  • the sequences coding for I'hIL-2 are isolated from the vector pTG36 (described in French patent 85 09480) in the form of a PstI fragment, sub-cloned in the vector M 13TG130 (Kieny et al, 1983, Gene 26, 91 -99) and subjected to site-directed mutagenesis so as to introduce a Sa / l site 12 nucleotides downstream of the stop codon (Amersham mutagenesis kit, RPN 1523)
  • the hIL-2 cDNA is pu ⁇ fie of the mutated vector by digestion Sali and inserts into the ⁇ ' / iol site of pBCMGneo (Karasuyama and Melchers, 1988, Eur J Immunol 18, 97-104) located in 3' and 5 'respectively of splicing and polyadenylation signals of the rabbit ⁇ -globin gene
  • pTG5320 The sequences coding for I'hIL-2 are isolated from the vector
  • a BamHI-HindIII fragment carrying the early promoter of the CMV virus (Cytomegalovirus) purified from pLNCX is introduced into the vector p polyIII-I * (Lathe et al, 1987, Gene 57, 193-201) treated with the same enzymes.
  • the Saf [-BamHl purifies fragment of pTG5320 carrying the intron ⁇ -globin, the cDNA hIL -2 and the ⁇ -globin polyadenylation signal
  • the resulting vector pTG5321 is linearized by the enzyme BamHI and a BamHI-Bglll fragment containing the selection gene pac is inserted under the control of the early promoter and of the polyadenylation signal of the SV40 virus
  • the vector thus obtained is designated pTG5322
  • the vector pTG5324 (FIG. 1) is generated by insertion into the preceding vector linearized by BamHI of a BamHI fragment comprising the mitochond ⁇ ale 12 S mu ⁇ ne sequences (Luftalla et al, 1985, Som Cell Mol Genêt 11, 223-238)
  • plasmid pTG5324 20 ⁇ g of plasmid pTG5324 are used to transfect E 17 cells at a density of 40 to 50% according to the standard calcium phosphate technique. The next day, the transfected cells are placed in the presence of puromycin After two weeks in selective medium, the resistant clones are subcultured, propagated and frozen in liquid nitrogen while waiting to check their capacity to secrete hIL-2.
  • 6-well culture plates are used in which 4em] 0 5 cells to be tested are tested.
  • the day next, the medium is changed and harvested 24 h later The amount of hLL-2 present in cell supernatants is estimated by ELISA (R&D Systems Minneapolis, D2050) About a quarter of the clones tested secrete amounts of IL-2 exceeding 2 ⁇ g / ml / 10 6 cells / 24h.
  • the most clone producer designates E17-5324-clone 2 and secretes 3 ⁇ g / ml / 10 6 cells / 24h of hIL-2 is retained for subsequent studies
  • E l cells 7-5324 are intended for human therapeutic use, it is advantageous to test their capacity for resistance to inactivation by the human complement. To do this, 5 ⁇ 10 cells are cultured in an appropriate support. The next day the medium is eliminated and the cells are exposed to 0.5 ml of fresh or inactive human serum by heating (negative control) taken from two different individuals or from FCS (negative control). After 150 min, the culture is continued.
  • the retroviral vector pTG9344 allows the expression in a bicistronic manner of a cytotoxic gene, in this case the tk gene of HSV-1 and of the positive selection gene neo
  • the basic vector is pLXSP which derives from pLXSN (Miller and Rosman, 1989, supra)
  • the PGK promoter obtained from the plasmid PKJ-1 (Adra et ai, 1987 Gene 60, 65-74) is introduced downstream of the packaging region in the form of an EcoRI-Psll fragment (positions - 517 a -20 with respect to the transcriptional dimming site)
  • the tk gene is isolated from the vector pTK- 1 (Spandidos et al, 1982, Exp Cell Res 141, 149-15S, Wagner, 1981, Proc Natl Acad Sci USA 78, 1441-1445) and subclone in the BamHI site of ⁇ BR32S (Covarrubias and Bolivar, 1982 Gene /
  • the resistance to the selection agent G418 depends on the efficiency of reinitiation from TIRES EMCV Consequently, when the culture is carried out in a selective medium, only the cells producing large quantities of bicistronic mRNA are brought to survive thereby ensuring a level of expression high tk gene
  • the vector pTG9344 includes a unique EcoRl restriction site which allows the insertion of an additional gene under the dependence of the 5 'LTR retroviral promoter.
  • Canine LFN ⁇ is cloned from cellular RNA isolated from canine T lymphocytes stimulated by concanavalin
  • a cellular RNA is reverse transc ⁇ t by implementing the degenerate primer oTG4031 (SEQ LD NO 3)
  • the specific fragment is amplified in two stages First of all an internal fragment is produced using primers OTG4 I 69 and OTG4 I 70 (SEQ ID NO 4 and 5) Then, two specific ohgonucleotides oTG4321 and oTG43 19 (SEQ ID NO 6 and 7) are used in combination with two oligo d (T) and primer adapters to generate the 5 'and 3' fragments according to the RACE method (Frohmann et al, 1988, Proc Natl Acad Sa USA 85, 8998-9002) The two PCR fragments are cleaved with Sphl and A ⁇ ll before being inserted into the Sphl site of M13TG131 ( Kieny et al,
  • the murine IFN ⁇ is isolated by PCR on the basis of the sequence data (Gray and Goeddel, 1983, Proc Natl Acad Sci USA 80, 5842-5846) using the primers 0TG7295 and oTG7296 (SEQ ID NO 10 and 1 1 )
  • the retroviral vector pTG9337 resulting from the insertion of the amplification fragment cleaved by EcoKl within the Ec ⁇ Rl site of pTG9344
  • Human LFN ⁇ is isolated by PCR from the vector M13TG2437 which results from subcloning into the vector M 13TG131 of the coding sequence IFN isolated from pTG23 (Tessier et al, 19S4 Nucleic Acids Res 12, 7663-7676)
  • the primers 0TG6 I47 and oTG4983 (SEQ ID NO 12 and 13) are used.
  • the amplified fragment is treated with SI nuclease and then with Klenow before being cloned in an intermediate vector from which it can be isolated to be inserted into the LcoRl site of pTG9344
  • the E17 cells are transfected with 10 ⁇ g of each of the plasmids pTG9326 and pTG5324 by the calcium phosphate method and cultured in a selective medium (1 ⁇ g / ml of puromycin and 1 mg / ml of G418) 24 h after transfection
  • a selective medium (1 ⁇ g / ml of puromycin and 1 mg / ml of G418)
  • the resistant cells are subcloned by limiting dilution (cultured in a 96-well plate of 200 ⁇ l / well of a dilution at a density of 1.5 cells per ml)
  • the cell clones are recovered after two weeks culture and amplified in a conventional manner
  • the clones are cultured at the rate of 4.
  • ⁇ 10 cells After a change of medium, the 24 ha culture supernatant is collected from which the amounts of hIL-2 and of IFN ⁇ secreted
  • the ELISA method (R&D Systems Minneapolis, D2050) previously applied LTFN ⁇ is applied by the method of inhibiting the cytopathic effect of the VSV virus (Vesicular Stomatitis Virus strain lndiana, ATCC VR 158) on the dog kidney epithelial cell line MDCK (Steward II, in The Interferon System, pp 17-19, Sp ⁇ nger-Verlag, NY, Familletti et al, 1981, Methods Enzymology 78, 387) Briefly, 3x l 0 4 MDCK cells / well are cultured in a 96-well microtiter plate and then serial dilutions of the supernatants obtained from the clones resistant to puromycin and to G418 are added.
  • retroviral particles by these clones is evaluated by infection of 1 to 2x 10 permissive 3T3 cells After 24 h of culture, they are exposed for 90 min to 200 ⁇ l of 10 in 10 dilutions of cell supernatant to be tested and 200 ⁇ l of medium containing 16 ⁇ g / ml of polybrene (Sigma) The culture is continued in a medium which is first of all conventional and then selective (5 mg / ml of G418) 24 h after infection The resistant colonies after two weeks are stained with crystal violet (0.05% in an ethanol mixture 10% water 90%) The number of retroviral particles present in the supernatant of the producing clones can be calculated from the number of 3T3 colonies resistant to G41 8 The clone designated below is selected after E 17-TG5324 & TG9326 # 28 which produces 1 ⁇ g / ml / 10 6 cells / 24h of hIL-2, 32 U / ml of TFN ⁇ and 4.5 ⁇ 10 6
  • EXAMPLE 7 Construction of an packaging line secreting hIL-2 and producing the retoviral vector pTG9337
  • the El 7-5324 cells are transfected with 20 ⁇ g of plasmid pTG9337 and the resistant clones are selected in G418 medium (1 mg / ml) After subcloning, the most producing clones are evaluated in terms of hIL-2 secretion , murine IFN ⁇ and of titre in viral particles The methods used are described in the previous example with the exception of the assay technique of murine IFN ⁇ which is quantified by ELISA test (PerSeptive Diagnostics, Cambridge, MA , N ° S-6716) The clone retained E17-TG5324 & TG9337 # 33 produces 1 ⁇ g / ml / 10 6 cells / 24h of hIL-2, 60 ng / ml / 10 6 cells / 24h of IFN ⁇ and has a viral titer of I, 3 ⁇ I 0 "cfu / ml
  • EXAMPLE S Transduction of target cells It is verified that the viral particles produced from the producing lines E 17-TG5324 & TG9326 and E 17-TG5324 & TG9337 are capable of transducing target cells and that the expression of the therapeutic genes is not altered in the cellular context
  • This study is carried out on an established mu ⁇ ne line (3T3 cells) and on two primary lines (P3D6M and P3D4M cells) The latter are derived from dog melanomas and subjected to passage in immunodeficient SCID mice in order to generate homogeneous primary lines 2 ⁇ 10 7 cells at stage 5 , are injected subcutaneously into animals Tumors are removed 3 weeks later and the melanoma cells are kept in culture under standard conditions
  • the target cells are cultured at a rate of 1 to 2 ⁇ 10 4 cells per well and, the following day, infected with 0.5 ml of culture cell culture supernatant previously filtered through a 0.45 ⁇ m membrane. infection continue for 1 to 2 hours then the cells are returned to fresh medium Usually, two transduction cycles are carried out on the same day and the transduced cells are cultured in the presence of G418 (5 mg / ml) The medium is changed every three days until the appearance of resistant colonies whose sensitivity to ganciclovir is evaluated The tests use 5 ⁇ 10 ° cells which are placed the day following their cultivation, in the presence of ganciclovir at concentrations of between 0 and 1000 uM The viability of the cells is determined after one week by the trypane blue test The number of cells counted in the wells in which the culture was carried out in abse ganciclovir represents 100% The results indicate that the three types of target cells transduced by particles from the retoviral vectors pTG9326 and p
  • the capacity of the viral particles of vector pTG9344 is verified to induce a neighboring cytotoxic effect in the transduced cells.
  • the primary cells P3D6M are transduced by the viral particles pTG9344 and the infected cells are selected in the presence of G418 (1 mg. / ml)
  • a co-culture is carried out containing non-transduced P3D6M cells and a certain percentage of the transduced culture (respectively 0, 10, 30, 50, 80 and 100%)
  • the co-culture is maintained for 7 days in the presence of Ganciclovir (1 ⁇ M) and the viability of the cells is estimated by staining with trypane blue.
  • this concentration is chosen so as to be toxic for the transduced cells which express thymidine kinase (3% of surviving cells for the test 100%) while it has little or no effect on the viability of cells not expressing the suicide gene (86% of surviving cells for the 0% test) know of co-culture, ganciclovir exerts a notable toxic effect even on a small percentage of transduced cells A drastic reduction in viability is already observed when the cell mixture contains only 10% of transduced cells (18% of surviving cells for the test 10% and 5% for test 30%) These results indicate that the vector pTG9344 expresses a sufficient quantity of TK to induce cytotoxicity of the infected cell and to propagate this effect to the neighboring non-transduced cells.
  • PS 15 (murine mastocvtome) and B 16 (murine melanoma) cells are transduced by the vector pTG9344 (tk-neo) as a negative control or pTG9337 (IFN ⁇ mu ⁇ n-tk-neo) and the presence of antigens is determined.
  • class 1 and II on the surface of cells infected by conventional immunofluorescence and flow cytometry (FACS) techniques The MHC class II antigens present on the surface of P815 and B 16 cells are demonstrated by an anti- sou ⁇ s coupled to FITC (for Fluorescein isothiocyanate) (Pharmingene, San Diego, CA).
  • FITC for Fluorescein isothiocyanate
  • the cells After infection and maintenance in a selective medium (G418 5 mg / ml) for approximately two weeks, the cells are detached by the action of 10 mM EDTA in a phosphate buffered saline (PBS) and washed twice in the following buffer (PBS, 1% bovine serum albumin, 0.1% human gamma globulin, 10 mM EDTA and 0.02% sodium azide). 1x10 6 cells are incubated for 45 min, at 4 ° C.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the cells are fixed (2% formaldehyde in PBS buffer) and analyzed by FACS (Becton Dickinson cytometer, San Jose, CA)
  • the B 16 mu ⁇ nes cells are transduced by the vectors pTG9344 and pTG9337 or as a negative control by a retroviral vector expressing the marker gene.
  • LacZ encoding ⁇ -galactosidase (pTG5391)
  • the infected cells are selected in the presence of G41 S for 14 days trypsinized and resuspended at a density of 2x 10 cells / ml in PBS buffer 100 ⁇ l of this suspension are injected subcutaneously into immunocompetent B6 / D2 generation FI mice Two days later and this during the 6 days which follow, the animals receive an intraperitoneal injection of ganciclovir (100 mg / kg / day) and the number of tumors and their size are examined up to 44 days after implantation.
  • ganciclovir 100 mg / kg / day
  • mice in which were implanted the cells transduced by a vector expressing therapeutic genes do not develop tumors before the 25th day (groups 3 and 4) whereas the animals having received no vector (group 1) or a non-therapeutic vector ( group 2) are decimated well before the 21st day
  • group 1 or a non-therapeutic vector group 2
  • group 3 and 4 the mice having received no vector
  • group 2 a non-therapeutic vector
  • group 3 and 4 the expression of the tk gene alone slows tumor development (group 3) while the vast majority (9 / 10) animals having received B cells 16-9337 (concomitant expression of the tk and LFN ⁇ genes) show no tumor more than 44 days post-implantation
  • NAME Transgene S.A.

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Abstract

La présente invention concerne une nouvelle composition antitumorale comprenant une population de cellules capables d'exprimer au moins trois gènes thérapeutiques et notamment des gènes immuno-stimulateurs et/ou cytotoxiques. Elle a également pour objet une cellule d'encapsidation exprimant l'interleukine-2 et un vecteur rétroviral exprimant les gènes interféron gamma et thymidine kinase du virus de l'herpès HSV-1 ainsi que leur utilisation thérapeutique pour la prévention et le traitement des cancers.

Description

COMPOSITIONS CELLUUIRES ANTITUMORALES EXPRIMANT AU MOINS TROIS TRANSGENES
La présente invention a pour objet une composition cellulaire pour le traitement ou 15 la prévention de tumeurs chez l'homme ou l'animal Plus particulièrement, elle comprend une population de cellules capables d'exprimer une combinaison d'au moins trois gènes thérapeutiques à effet antitumoral L'invention concerne également l'utilisation thérapeutique d'une telle composition dans le domaine de la cancérologie 20
Depuis une dizaine d'années, de nombreuses publications font état de la possibilité d'éliminer les tumeurs ou, à défaut retarder leur progression, par la technique du transfert de gène Les nombreux essais cliniques mis en place confirment l'intérêt grandissant de la thérapie génique du cancer La majorité des protocoles emploie 25 des vecteurs rétroviraux du fait de leur capacité d'intégration dans les cellules en division, pour transférer un gène a visée antitumorale Ces derniers ainsi que les lignées d'encapsidation permettant de les produire sont décrits dans de nombreux documents de l'état de la technique
30 Plusieurs approches ont été considérées, notamment le transfert de gènes immunosiimulateurs (immunothérapie) susceptibles d'induire ou activer une réponse cellulaire immune a l'égard de la tumeur, de gènes cytotoxiques conférant une toxicité aux cellules les exprimant et d'anti-oncogenes (gènes suppresseurs de tumeurs ou capables d'inhiber l'activité d'un oncogene) Ces différentes approcheb sont résumées dans l'état de la technique (voir par exemple Moolten, 1994, Cancer Gene Therapy /, 279-2S7 , Anderson, 1994, Humaπ Gène Therapy 5, 1 -2, Vile et Russel, 1994, Gène Therapy /, 88-89 , Culver et Blaese, 1994, Trends in Genetics 10, 174-178 , Zier et al , 1996, Immunology Today, 17, 39-45)
L'immunothérapie est fondée sur le transfert de gènes codant pour les cytokines et molécules co-stimulatπces dans le but de rendre les cellules tumorales plus immunogenes et renforcer la réponse immunitaire antitumorale de l'hôte Les cytokines ainsi évaluées dans des modèles muπns et, pour lesquelles une propriété antitumorale a ete mise en évidence, sont l'interleukine (IL) 2, 1TL-4, l'IL-6, l'IL-7, l'LL-12, le facteur nécrosant des tumeurs (TNF) de type alpha, le GM-CSF (pour Granulocyte Macrophage Colony Sttmulating Factor) et les interferons (IFN) Des cellules xenogeniques produisant l'LL-2 ont ainsi démontre un effet antitumoral (voir la demande européenne EP 0 579 791 )
L'approche cytotoxique consiste a accroître spécifiquement la sensibilité des cellules tumorales a une chimiothérapie par transfert d'un gène dit suicide dont le produit est capable de transformer un précurseur inactif en produit hautement cytotoxique Le plus employé a ce jour est le gène tk du virus Herpès Simplex de type 1 (HSV-l) codant pour l'enzyme thymidine kinase (TK) qui a la propriété de convertir l'acyclovir et le ganciclovir en analogues phosphoryles de nucleosides Ces nucleotides aberrants sont alors incorpores durant la division cellulaire dans les chaînes d'ADN chromosomiques neoformees, ce qui a pour conséquence une inhibition de la replication génétique et une mort des cellules tumorales en division
(Moolten 1986, Cancer Res 46, 5276-5281) Un avantage supplémentaire de cette approche est confère par l'effet de voisinage ( by stander en anglais) qui resuite d'une propagation des propriétés cytotoxiques aux cellules avoisinantes causant leur destruction (Freeman et al , 1993 Cancer Res 53 5274-52S3 ) Ainsi des retrovirus portant le gène tk ont ete utilises dans le cadre du traitement de tumeurs cérébrales malignes dans le but de déclencher le suicide cellulaire après administration de ganciclovir (Izquierdo et al , 1996, Gène Therapy 3, 491 -495) Dans la même optique, ia demande WO 95/06486 propose l'injection de fibroblastes muπns produisant un vecteur retroviral exprimant le gène cytotoxique
Enfin, la stratégie anti-oncogene repose sur l'introduction dans les celluies tumorales d'une copie fonctionnelle d'un gène suppresseur de tumeur (par exemple le gène associe au retinoblastome ou p53) ou l'inhibition de l'expression des oncogenes par le transfert de gènes codant pour des polynucleotides antisens ou des πbozymes capables de dégrader les ARN messagers des oncogenes dans le but de réduire ou abolir la prolifération des cellules cancéreuses
Certains protocoles expérimentaux anticancéreux récents proposent de combiner plusieurs gènes thérapeutiques pour obtenir un effet antitumorai synergique (voir par exemple la demande PCT/FR94/00192 , Rosenthal et al , 1994, Blood 83, 12S9- 129S , O'Malley et al , 1996, Cancer Res 56, 1737-1741 , Lollini et al , 1995, Human Gène Therapy 6, 743-752) Cependant, vu leur grand nombre et leur diversité, l'ensemble de ces études ne permet pas aujourd'hui de clairement identifier la molécule ou la combinaison de molécules la mieux adaptée au traitement d'une tumeur donnée
On a maintenant mis en évidence une composition antitumorale basée sur des cellules génétiquement modifiées pour sécréter de l'IL-2 et produire des particules retroviraies expnmant les gènes tk du virus HSV- 1 et LFN γ Une telle composition permet d'inhiber ou retarder la prolifération cellulaire en induisant la mort spécifique des cellules tumorales, une meilleure présentation des antigènes et une stimulation des cellules immunes de l'hôte La présente invention offre une alternative efficace aux techniques de l'art antérieur pour traiter le cancer chez l'homme ou l'animal C'est pourquoi la présente invention a pour objet une composition antitumorale comprenant une population de cellules permettant l'expression d'au moins trois gènes thérapeutiques antitumoraux
Par "gènes thérapeutiques antitumoraux", on entend des gènes dont les produits d'expression ont un effet antitumoral, notamment pour accroître l'immunité dirigée spécifiquement contre la tumeur et/ou inhiber au moins partiellement la division cellulaire De préférence, il s'agit de gènes codant pour des polypeptides immunostimulateurs de la réponse immunitaire et/ou cytotoxiques Par "immunostimulateur", on entend tout polypepude capable d'amplifier la production d'anticorps dirigés contre les cellules et antigènes tumoraux ou de stimuler une réponse immunitaire à médiation cellulaire, en activant les lymphocytes T, afin de déclencher une réponse cytotoxique ou de type hypersensitivité retardée significative à rencontre des cellules tumorales. Par "cytotoxique", on entend tout polypepude capable d'induire une mort cellulaire soit directement soit indirectement par l'intermédiaire d'une drogue susceptible d'être administrée de manière indépendante
Parmi les gènes immunostimulateurs utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut envisager les gènes codant pour les cytokines et notamment les mterleukines (IL), les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, M-CSF et GM- CSF), les interferons (LFN), les facteurs de nécrose des rumeurs (TNF), les facteurs de co-stimulation tels que les polypeptides B7 1 et B7 2 et les facteurs activant l'expression des antigènes d'histocompatibthte de classe II
A l'heure actuelle, 16 mterleukines ont ete identifiées II est particulièrement difficile de leur attπbuer une fonction spécifique car elles exercent des effets pleiotropes Dans le cadre de la présente invention, toutes les mterleukines présentent un intérêt, mais on cite plus particulièrement l'IL-2, l'IL-4 l'IL-6, l'IL- 10, I'IL- 12 Dans ce contexte, l'IL-2 est particulièrement préférée Elle est responsable de la prolifération des lymphocytes T activés, et, en association avec l'IFNy, stimule ies macrophages, les cellules tueuses naturelles NK (pour Natural Killer en anglais) et les cellules T. De plus, certaines études tendent à montrer qu'elle a un rôle chimiotactique pour les lymphocytes lorsqu'elle est produite au niveau d'une rumeur.
Les interferons possèdent des propriétés antivirales et immunomodulatπces Ils peuvent activer les cellules phagocytaires et accroître l'expression des antigènes de surface de classe I et II du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) et stimuler également la cytotoxicite des cellules NK et celles activées par les lymphokines (LAK pour Lymphokine Activated Killer en anglais) à rencontre des cellules tumorales. Bien que les trois classes principales d'IFNs, respectivement α, β et γ , présentent un intérêt dans le cadre de la présente invention, on préférera tout particulièrement l'IFNγ .
Les facteurs stimulant les colonies interviennent au niveau de la maturation des cellules souches hématopoïétiques et leur différentiation en cellules matures de la circulation sanguine. On distingue les GM-CSF, G-CSF et M-CSF (pour Granulocyte-Macrophage, Granuiocyte et Macrophage respectivement) selon le stade de maturation et le type cellulaire sur lequel ces facteurs exercent leur influence.
Pour ce qui est des facteurs nécrosant des tumeurs, on distingue le TNFα produit par les macrophages et le TNFβ produit par les lymphocytes T. Tous deux sont responsables de l'activité cytotoxique anti-tumorale des macrophages et lymphocytes et de l'altération tissulaire locale observée dans la réaction inflammatoire.
Parmi les gènes cytotoxiques, on peut citer ceux codant pour une thymidine kinase et , notamment la thymidine kinase (TK) du virus Herpès Simplex de type 1 (HS V- 1 ), la cytosine déaminase, le cytochrome P450 2B 1 , la puπne nucléoside phosphorylase codée par le gène DeoD ά'E.coli, la nitroreductase et la β- glucoronidase D'une manière générale, ces gènes toxiques sont décrits dans la literature (voir par exemple Moolten, 1994, Cancer Gène Therapy /, 279-287)
Selon un mode de réalisation préféré, les trois gènes thérapeutiques mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention codent pour les polypeptides TK-HSV1 , IL- 2 et IFNγ L'origine des gènes immunostimulateurs est choisie de manière a ce qu'ils soient fonctionnels dans l'hôte à qui la composition antitumorale selon l'invention est destinée S'agissant d'un hôte humain, on retiendra de préférence les séquences codante pour l'LL-2 et l'LFNγ humains.
Les gènes thérapeutiques peuvent être obtenus par clonage, par PCR ou par synthèse chimique selon les techniques conventionnelles communément en usage. Il peut s'agir de gènes natifs ou dérivés de ces derniers par mutation, délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides. Bien entendu, ils peuvent comprendre les éléments appropriés de régulation de la transcription ainsi que des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction permettant leur expression. D'une façon générale, on aura recours à une région promotrice fonctionnelle dans les cellules de l'hôte que l'on veut traiter, de préférence dans les cellules humaines. Il peut s'agir de la région promotrice gouvernant naturellement l'expression dudit gène ou d'une région promotrice d'origine différente, par exemple issue de gènes eucaryotes ou viraux. D'autre part, la région promotrice peut être modifiée de manière à contenir des séquences régulatrices, par exemple un élément activateur de la transcription (enhancer).
La région promotrice retenue pourra être constitutive ou régulable, et dans ce dernier cas, en réponse à certains signaux cellulaires. Il sera avantageux d'utiliser une région promotrice tissu-spécifique, lorsque ia tumeur à traiter est issue d'un type cellulaire particulier. D'une manière alternative, l' utilisation d'un promoteur répondant à des signaux spécifiquement tumoraux (par exemple répondant à des facteurs surexprimés par les cellules tumorales) peut s'avérer avantageuse puisque l'expression sera limitée aux cellules tumorales.
De tels promoteurs sont généralement connus de l 'homme de l 'art. On peut citer notamment les promoteurs SV40 (Virus Simian 40), PGK (Adra et al. , 1987, Gène 60, 65-74), HMG (Hydroxy-Methyl-Glutaryl-coenzyme A), TK (Thymidine Kinase), les LTRs (Long Terminal Repeat) du RSV (Rous Sarcoma Virus), du Mo-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) et les promoteurs des gènes codant pour les antigènes MHC de classe 1 qui sont activés par l 'IFNγ . Ces exemples ne sont pas limitatifs.
Dans le cadre de la présente invention, les gènes thérapeutiques peuvent être placés sous le contrôle d'éléments permettant leur expression de façon indépendante ou commune. En d'autres termes, ils peuvent être exprimés d'une manière monocistronique ou polycistronique. Dans ce dernier cas, on mettra en oeuvre un élément permettant la réinitiation de la traduction au niveau du second cistron, par exemple un site interne d'entrée des ribosomes (IRES) bien connu de l'homme de l'art. A ce jour, un certain nombre d'IRES ont été identifiés dans la région 5' des ARNm viraux et, notamment, des picornavirus tels que le virus de la poliomyélite (Pelletier et al. , 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 1 103- 1 1 12) et I'EMCV (Encephalomyocarditis virus ; Jang et al. , 1988, J. Virol. 62, 2636- 2643). Il est également possible d'employer les IRES décrits dans la demande internationale WO 96/01324.
Par ailleurs, il peut être avantageux que les polypeptides immunosumulateurs soient sécrètes à l'extérieur des cellules composant la composition antitumorale selon l'invention. Dans ce contexte, les gènes correspondants peuvent également inclure une séquence signal. II peut s'agir de la séquence signal naturelle ou bien d'une séquence hetérologue du moment qu'elle soit fonctionnelle dans la cellule hôte
Bien entendu, ladite population de cellules peut dériver d'une cellule primaire ou tumorale, d'une lignée cellulaire, d'un organe ou peut comprendre un mélange de cellules permettant l 'expression des divers gènes thérapeutiques Pour illustrer ce mode de réalisation, on peut avoir recours à un mélange de cellules, par exemple dérivées de la lignée Véro (disponible à l'ATCC), une partie exprimant l'IL2 et une autre partie exprimant l'IFNγ , éventuellement combiné à une lignée d'encapsidation retrovirale permettant la production de virions ou à une population de virus exprimant le gène cytotoxique TK. Bien entendu, d'autres combinaisons peuvent également être envisagées Par exemple, il est également possible de mettre en oeuvre un mélange cellulaire comprenant une lignée (par exemple Véro) permettant l'expression du gène IL2 et une lignée d'encapsidation retrovirale permettant la production de particules infectieuses comprenant un vecteur retroviral selon l'invention tel que défini ci- après
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, la population cellulaire composant la composition antitumorale selon l'invention comprend ou est constituée de cellules d'encapsidation retrovirale permettant la production de particules infectieuses comprenant un vecteur retroviral Généralement et pour des raisons de sécurité, le vecteur retroviral est defectif par deletion ou mutation des gènes viraux gag, pol et env et ne peut, de ce fait, se répliquer de manière autonome Sa propagation nécessite l'apport des polypeptides viraux pour lesquels il est déficient Une cellule d'encapsidation est capable de fournir en trans l'ensemble des polypeptides que le vecteur retroviral ne peut synthétiser et qui sont nécessaires a la constitution des particules infectieuses De préférence, les cellules d'encapsidation en usage dans la présente invention sont dérivées d'une lignée d'origine humaine et, notamment, de la lignée 293 Celle-ci peut être générée par transfection de vecteurs parmettant l'expression des gènes gag/pol du virus FMuLV (Fπend Muπne Leukemia Virus) de la souche FB29 et le gène env du virus amphotropique 4070A A titre d'exemple, on peut citer la lignée E 17 décrite dans la demande internationale PCT/IB96/00439 dont le contenu est incorpore par référence
Une composition antitumorale préférée selon l'invention comprend une population de cellules comportant un vecteur permettant l'expression d'un gène codant pour PIL-2 et permettant ia production de particules infectieuses ayant incorpore un vecteur retroviral exprimant un gène codant pour la thymidine kinase du virus HSV- l et un gène codant pour lTFNγ
Selon un mode de réalisation avantageux, la population de cellules en usage dans le cadre de la présente invention est sensible a une drogue permettant son élimination Dans le cas où elle expπme ie gène tk du HSV-I , on peut envisager d'employer une drogue dérivée de l'acyclovir et, notamment, le ganciclovir La population de cellules peut en outre exprimer un marqueur de sélection positive, par exemple un gène de résistance a un antibiotique facilitant sa sélection On peut citer les gènes neυ (neomycine) conférant une résistance a l'antibiotique G4 I 8, dhjr (dihydrofolate reductase), pac (puroacetyl transferase) (Morgenstern et Land, 1990, Nucleic Acids Res 18, 3587-3596), hygromycine B et gpt (xanthine phosphoπbosyl)
La présente invention concerne également une cellule d'encapsidation dérivée de la lignée 293 et comprenant - les gènes gag/pol du virus FMuLV (Fπend Muπne Leukemia Virus) de la souche FB29 et le gène env du virus amphotropique 4070A, et un vecteur permettant l'expression d'un gène codant pour l'IL-2
Un vecteur approprie peut être constitue par le vecteur pTG5324 décrit ci-apres dans lequel l'expression de riL-2 est dirigée par le promoteur précoce du virus
CMV (Cytomegalovirus) Mais, bien entendu, d'autres vecteurs d'expression peuvent être employés
La présente invention a également pour objet un vecteur retroviral caractérise en ce qu'il comprend de 5' vers 3' - un LTR 5', une région d'encapsidation, un gène codant pour l'interferon gamma, un promoteur interne constitutif, un gène codant pour la thymidine kinase du virus HS V- 1 , - un site interne d'entrée des πbosomes (IRES), un gène codant pour un marqueur de sélection positive, et un LTR 3'
Un vecteur selon l'invention peut dériver d'un retrovirus quelconque. On peut citer a titre d'exemples, les retrovirus aviaires tels que le virus de l'érythroblastose aviaire (AEV), le virus de la leucémie aviaire (AVL), le virus du sarcome aviaire (ASV), le virus de la nécrose de la rate (SNV) et le virus du sarcome de Rous (RSV), les retrovirus bovins, les retrovirus félins, les retrovirus muπns tels que le virus de la leucémie muπne (MuLV), le virus de Friend (F-MLV) et le virus du sarcome murin (MSV) et les retrovirus de primate. Cependant, on préfère tout particulièrement avoir recours au virus de la leucémie muπne de Moloney (MoMuLV) Les nombreux vecteurs retroviraux dérivés de ce dernier qui sont décrits dans la littérature, notamment le vecteur
N2 ou un de ses dérivés peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention
La présente invention concerne également l'utilisation d'une composition antitumorale d'une cellule d'encapsidation ou d'une vecteur retroviral selon
1 invention , pour la fabrication d'un médicament destine au traitement ou a la prévention du cancer ou d'une affection cancéreuse chez un homme ou un animal Les cancers qui pourraient être ainsi traités sont, avantageusement, des tumeurs solides telles que les cancers rénaux, du sein, du poumon et du colon et les mélanomes.
Le médicament issu de la présente invention peut être administré selon n'importe quelle voie générale communément en usage, notamment par voie parentérale telle que la voie systémique, intramusculaire sous-cutanée ou intrapeπtonéale. D'une manière générale, la voie intratumoraie est indiquée comme étant particulièrement avantageuse. D'une manière générale, l'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée, une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de l ' invention, le médicament comprendra en outre un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Il peut également comprendre un véhicule, un diluant ou un adjuvant acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Le dosage approprié varie en fonction de différents paramètres, par exemple de la voie d'administration, de l'individu à traiter, de la nature et de la sévérité de l'état tumoral, du type de gènes thérapeutiques employés.
Enfin, la présente invention a également pour objet une méthode de traitement du cancer chez les mammifères, selon laquelle on injecte à un individu ayant besoin d'un tel traitement, une quantité efficace d'un point de vue pharmaceutique d'une composition antitumorale, d'une cellule d'encapsidation ou d'une vecteur retroviral selon l'invention
La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants dans lesquels :
La Figure 1 illustre le vecteur pTG5324 permettant l 'expression de I ' IL-2 humaine à partir du promoteur précoce CMV. Il comprend le gène de sélection pac dirigé par le promoteur SV40. La Figure 2 illustre le vecteur retroviral pTG9344 comprenant un LTR 5 ' . une région d'encapsidation, une cassette d'expression bicistronique "gène tk du virus HSV- l suivi de TIRES EMCVet du gène de sélection neo" dirigée par le promoteur PGK murin.
La Figure 3 illustre le vecteur retroviral pTG9326 dérivant du vecteur pTG9344 par insertion du gène codant pour l'IFNγ canin.
EXEMPLES
Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire, détaillées dans Maniatis et al , ( 1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spπng Harbor, NY) ou selon les recommandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial Les étapes de clonage mettant en oeuvre des plasmides bactériens sont de préférence réalisées dans la souche £ coït XLl-BIue ou DH5a (Gibco BRL) Les vecteurs M13 sont amplifies dans la souche E. coli JM1 10 ou NM522 S'agissant de la réparation des sites de restriction, on procède par remplissage des extrémités 5' protubérantes à l'aide du grand fragment de l'ADN polymerase I άE coli (Klenow) ou par digestion par la nucléase SI suivi d'un traitement par la Klenow Les techniques d'amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) sont connues de l'homme de l'art (voir par exemple PCR Protocols - A guide to methods and applications, 1990, édite par Innis, Gelfand, Sninsky et White, Académie Press Inc)
Dans les exemples qui suivent, on a recours à la lignée cellulaire murme NIH 3T3
(ATCC CRL 1685), la lignée canine MDCK (ATCC CCL 34), la lignée B 16 dérivée d'un melanome murin (ATCC CRL 6322), la lignée PS 15 issue d'un mastocvtome muπn (ECACC Nc870 42 301), la lignée El 7 (décrite en détail dans la demande internationale PCT/IB96/00439) et la lignée PAS 17 (Miller et Buttimore, 1986, Mol Cell Biol (5, 2895-2902) A titre indicatif, la lignée E l 7 est une lignée d'encapsidation retrovirale dérivant de la lignée humaine 293 (Graham et al , 1977, J Gen Virol 36, 59-72) par transfection de vecteurs exprimant respectivement les gènes gag/pol du virus FMuLV (Friend Muπne Leukemia Virus) de la souche FB29 et le gène env du virus amphotropique 4070A Les cellules sont transfectees selon les techniques standards bien connues de l'homme du métier On peut citer la technique au phosphate de calcium, mais tout autre protocole peut également être employé, tel que la technique au DEAE dextran, l'electroporation, les méthodes basées sur les chocs osmotiques, la microinjection ou les méthodes basées sur l'emploi de liposomes
Quant aux conditions de culture, on utilise en gênerai le milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium, Gibco BRL) contenant 10 % (vol/vol) de sérum de veau foetal (FCS), 3 g/ml de glucose, 2 mM de glutamine, 1 % d'acides aminés non essentiels et 40 μg/ml de gentamycine a l'exception des cellules MDCK et P815 pour lesquelles on emploie le milieu RPMI-1640 contenant 10 % de FCS, 2 mM de glutamine, 1 % d'acides aminés non essentiels et 40 μg/ml de gentamvcine Les cellules transduites par les vecteurs retroviraux exprimant le gène neo sont cultivées en présence de G418 a une concentration finale de ! mg/ml ou 5 mg/ml Les cellules d'encapsidation El 7 sont cultivées en présence de l'agent de sélection puromycine ( 1 μg/ml)
EXEMPLE 1 Construction d'une lignée d'encapsidation retrovirale produisant l'ιnterleukιne-2 humaine fhrL-2 ι Œ 17-TG5324)
Les séquences codant pour I'hIL-2 sont isolées du vecteur pTG36 (décrit dans le brevet français 85 09480) sous forme d'un fragment Pstl, sous-cionees dans le vecteur M 13TG130 (Kieny et al , 1983, Gène 26, 91-99) et soumises a une mutagenese dirigée de manière a introduire un site Sa/l 12 nucleotides en aval du codon stop (trousse de mutagenese Amersham, RPN 1523) L'ADNc hIL-2 est puπfie du vecteur mute par digestion Sali et insère dans le site λ'/iol de pBCMGneo (Karasuyama et Melchers, 1988, Eur J Immunol 18, 97- 104) situe en 3' et 5' respectivement des signaux d'épissage et de polyadenylation du gène β- globine de lapin On obtient pTG5320
En parallèle, un fragment BamHl-Hindlll portant le promoteur précoce du virus CMV (Cytomegalovirus) purifié de pLNCX (Miller et Rosman, 19S9, BioTechniques 7, 980-988) est introduit dans le vecteur p polyIII-I* (Lathe et al , 1987, Gène 57, 193-201) traite par les mêmes enzymes On introduit entre les sues Sali et BgHl situes en aval de ce promoteur, le fragment Saf[-BamHl purifie de pTG5320 portant l'intron β-globine, l'ADNc hIL-2 et le signal de polyadenylation β-globine Le vecteur résultant pTG5321 est linéarise par l'enzyme BamHl et on insère un fragment BamHl-Bglll contenant le gène de sélection pac place sous le contrôle du promoteur précoce et du signal de polyadenylation du virus SV40 Le vecteur ainsi obtenu est désigné pTG5322
Enfin, le vecteur pTG5324 (Figure 1) est généré par insertion dans le vecteur précédent linéarisé par BamHl d'un fragment BamHl comprenant les séquences mitochondπale 12 S muπne (Luftalla et al , 1985, Som Cell Mol Genêt 11, 223- 238)
20 μg de plasmide pTG5324 sont utilises pour transfecter les cellules E 17 a une densité de 40 à 50 % selon la technique classique du phosphate de calcium Le jour suivant, les cellules transfectées sont placées en présence de puromycine Apres deux semaines en milieu sélectif, les clones résistants sont repiques, propages et congelés en azote liquide en attendant de vérifier leur capacité a sécréter l'hIL-2 Pour ce faire, on utilise des plaques de culture a 6 puits dans lesquels on ensemence 4χ ] 05 cellules a tester Le jour suivant, le milieu est change et récolte 24 h plus tard La quantité d'hLL-2 présente dans les surnageants cellulaires est estimée par ELISA (R&D Systems Minneapolis, D2050) Environ un quart des clones testes sécrètent des quantités d'LL-2 dépassant 2 μg/ml/ 106 cellules/24h Le clone le plus producteur désigne E17-5324-clone 2 et sécrétant 3 μg/ml/106 cellules/24h d'hIL-2 est retenu pour les études ultérieures
Dans la mesure ou les cellules E l 7-5324 sont destinées a un usage thérapeutique humain, il est intéressant de tester leur capacité de résistance a l'inactivation par le complément humain Pour ce faire, 5x10 cellules sont mises en culture dans un support appropπe Le jour suivant le milieu est élimine et les cellules sont exposées a 0,5 ml de sérum humain frais ou inactive par chauffage (contrôle négatif) prélevé de deux individus différents ou encore du FCS (contrôle négatif) Apres 150 min, la culture est poursuivie dans un milieu classique pour 24 h Les cellules viables sont dénombrées après traitement a la trypsine et coloration au bleu de trypane L'expérience est également réalisée en parallèle sur les cellules 293 (lignée dont dérive les cellules El 7), la lignée d'encapsidation PA3 17 et les cellules muπnes 3T3 Comme attendu, la viabilité de l'ensemble des lignées testées n'est pas affectée par l'exposition au FCS ou au sérum inactivé Par contre, le traitement par du sérum frais induit la mort des cellules 3T3 et PA317 (viabilité < 0,015 %) Ce phénomène n'est pas observe avec les cellules 293 (viabilité de 80 et 100 % selon le sérum) ni avec les cellules E 17-5324 (viabilité de 75 et 70 %)
EXEMPLE 2 Construction du vecteur retroviral pTG9344
Le vecteur retroviral pTG9344 permet l'expression d'une manière bicistronique d'un gène cytotoxique, en l'occurence le gène tk de HSV- l et du gène de sélection positive neo Le vecteur de base est pLXSP qui dérive de pLXSN (Miller et Rosman, 1989, supra) On introduit en aval de la région d'encapsidation le promoteur PGK obtenu du plasmide PKJ- 1 (Adra et ai , 1987 Gène 60, 65-74) sous forme d'un fragment EcoRl-Psll (positions -517 a -20 par rapport au site dimtiation de la transcription) Le gène tk est isole du vecteur pTK- 1 (Spandidos ét al , 1982, Exp Cell Res 141, 149- 15S , Wagner , 1981 , Proc Natl Acad Sci USA 78, 1441- 1445) et sous-clone dans le site BamHl de ρBR32S (Covarrubias et Bolivar, 1982 Gène / ", 79-82) La région 3' non codante est éliminée par digestion Smal-Xbal et on introduit un adaptateur Smal-Xba\ résultant de la réassociation des oligonucléotides oTG4322 et oTG4323 (SEQ ID NO 1 et 2), ce qui permet de reconstituer les 7 derniers codons situés en 3' du site Sma\ et de créer un site Xbal 4 paires de bases (pb) après le codon stop Le gène tk ainsi modifié est alors isolé sous forme d'un fragment Bglll-Xbal de 1 191 pb et insère en aval du promoteur PGK
Puis on introduit en aval du gène tk le site IRES du virus EMCV pour permettre la réinitiation de la traduction du second cistron de l'ARNm bicistronique II est isolé du vecteur LRES-βgeo (décrit dans la demande internationale WO 94/24301 ) par digestion Xbal-Ncol Enfin le gène neo est clone en aval de la séquence IRES sous forme d'un fragment BglU-Smal produit à partir de pAG60 (Colbère-Garapin ét al , 1981 , J Mol. Biol 150, 1-14) clivé par ces mêmes enzymes Le vecteur final pTG9344 est présenté à la Figure 2
Il est connu que la réinitiation de la traduction à partir de site IRES est moins efficace que l'initiation à partir d'ARNm coiffés Pour ce qui est des cellules transduites par les particules issues du vecteur pTG9344, la résistance à l'agent de sélection G418 dépend de l'efficacité de la réinitiation à partir le TIRES EMCV En conséquence, lorsque la culture est effectuée en milieu sélectif, seules les cellules produisant de grandes quantités d'ARNm bicistroniques sont amenées à survivre assurant de ce fait un niveau d'expression élevé du gène tk
EXEMPLE 3 Construction du vecteur retroviral pTG9326 contenant l'IFNv canin
Le vecteur pTG9344 comprend un site de restriction unique EcoRl qui permet l'insertion d'un gène supplémentaire sous la dépendance du promoteur retroviral LTR 5'
L'LFNγ canin est clone à partir de l'ARN cellulaire isolé de lymphocytes T canins stimules par la concanavaline A L'ARN cellulaire est reverse-transcπt en mettant en oeuvre l'amorce dégénérée oTG4031 (SEQ LD NO 3) Le fragment spécifique est amplifie en deux étapes Tout d'abord un fragment interne est produit a l'aide des amorces OTG4 I 69 et OTG4 I 70 (SEQ ID NO 4 et 5) Puis, on utilise deux ohgonucleotides spécifiques oTG4321 et oTG43 19 (SEQ ID NO 6 et 7) en combinaison avec deux adaptateurs oligo d(T) et amorce pour générer les fragments 5' et 3' selon la méthode RACE (Frohmann et al , 1988, Proc Natl Acad Sa USA 85, 8998-9002) Les deux fragments PCR sont clives par Sphl et Aβll avant d'être insères dans le site Sphl de M13TG131 (Kieny et al , 1983, supra) et soumis a une analyse de séquence par les techniques classiques Les données confirment une séquence identique a celle publiée par Zucker et al ( 1992, J Interféron Res 12, 191-194) Le vecteur précèdent Ml 3TG8173 est utilise comme matπce pour isoler par PCR les séquences IFNγ a l'aide de deux amorces mutagenes oTG6727 et oTG6788 (SEQ LD NO 8 et 9) qui permettent d'introduire un site EcόRl en amont et en aval des codons initiateur et stop respectivement Le produit PCR après coupure par £coRI est clone dans le vecteur pTG9344 pour donner pTG9326 (Figure 3)
EXEMPLE 4 Construction du vecteur retroviral pTG9337 contenant l'IfNv murin
L'IFNγ murin est isole par PCR sur la base des données de séquence (Gray et Goeddel, 1983, Proc Natl Acad Sci USA 80, 5842-5846) a l'aide des amorces 0TG7295 et oTG7296 (SEQ ID NO 10 et 1 1 ) Le vecteur retroviral pTG9337 resuite de l'insertion du fragment d'amplification clive par EcoKl au sein du site EcυRl de pTG9344
EXEMPLE 5 Construction d'un vecteur retroviral contenant l'IFNv humain
L'LFNγ humain est isole par PCR a partir du vecteur M13TG2437 qui resuite du sous-clonage dans le vecteur M 13TG131 de la séquence codante IFN isolée de pTG23 (Tessier et al , 19S4 Nucleic Acids Res 12, 7663-7676) On utilise les amorces 0TG6 I47 et oTG4983 (SEQ ID NO 12 et 13) Le fragment amplifie est traite par la nuclease S I puis par la Klenow avant d'être clone dans un vecteur intermédiaire dont il peut être isole pour être insère dans le site LcoRl de pTG9344
EXEMPLE 6 Construction d'une lignée d'encapsidation sécrétant l'hIL-2 et produisant le vecteur retoviral pTG9326
Les cellules E17 sont transfectees par lOμg de chacun des plasmides pTG9326 et pTG5324 par la méthode au phosphate de calcium et cultivées en milieu sélectif ( 1 μg/ml de puromycine et 1 mg/ml de G418) 24 h après la transfection Dix a 14 jours plus tard, les cellules résistantes sont sous clonees par dilution limite (mise en culture dans une plaque à 96 puits de 200 μl/ puit d'une dilution a une densité de 1 ,5 cellules par ml) Les clones cellulaires sont récupères après deux semaines de culture et amplifies de manière classique Les clones sont mis en culture a raison de 4.x 10 cellules Apres un changement de milieu, on récolte le surnageant de culture de 24 h a partir duquel on estime les quantités d'hIL-2 et d'IFNγ sécrétées
Pour ce qui est de l'hIL-2, on applique la méthode ELISA (R&D Systems Minneapolis, D2050) decπte précédemment LTFNγ est dose par la méthode d'inhibition de l'effet cytopathique du virus VSV (Vesicular Stomatitis Virus souche lndiana, ATCC VR 158) sur la lignée de cellules epitheliales de reins de chien MDCK (Steward II, in The Interféron System, pp 17- 19, Spπnger-Verlag, NY , Familletti et al , 1981 , Methods Enzymology 78, 387) Brièvement, 3x l 04 cellules MDCK/puit sont mises en culture dans une plaque de microtitration a 96 puits puis on ajoute des dilutions en série des surnageants obtenus des clones résistants a la puromycine et au G418 Par la suite, les cellules sont exposées a 10J cfu (pour colony forming unit en anglais) de viais VSV et on détermine la cytopathie 24 h plus tard L'IFNγ rend les cellules résistantes a l'infection VSV Les résultats sont données en unîtes arbitraires qui correspondent a l'inverse de la dilution pour laquelle on obtient 50 % de protection Les cellules contrôles montrent une cytopathie supérieure à 90 %
Enfin, la production de particules retrovirales par ces clones est évaluée par infection de 1 à 2x 10 cellules 3T3 permissives Après 24 h de culture, elles sont exposées pendant 90 min à 200 μl de dilutions de 10 en 10 de surnageant cellulaire à tester et 200 μl de milieu contenant 16 μg/ml de polybréne (Sigma) La culture est poursuivie dans un milieu tout d'abord classique puis sélectif (5 mg/ml de G418) 24 h après l'infection Les colonies résistantes après deux semaines sont colorées au crystal violet (0,05 % dans un mélange éthanol 10 % eau 90 %) Le nombre de particules retrovirales présentes dans le surnageant des clones producteurs peut être calculé à partir du nombre de colonies 3T3 résistantes au G41 8 On sélectionne le clone désigné ci-après E 17-TG5324&TG9326 #28 qui produit 1 μg/ml/106 cellules/24h d'hIL-2, 32 U/ml d'TFNγ et 4,5x 106 cfu/ml de particules virales
EXEMPLE 7 Construction d'une lignée d'encapsidation sécrétant l'hIL-2 et produisant le vecteur rétoviral pTG9337
Les cellules El 7-5324 sont transfectees par 20 μg de plasmide pTG9337 et on sélectionne les clones résistants en milieu G418 ( 1 mg/ml) Apres sous-clonage, on évalue les clones les plus producteurs en terme de sécrétion d'hIL-2, d"IFNγ murin et de titre en particules virales Les méthodes mises en oeuvre sont décrites a l'exemple précédent à l'exception de la technique de dosage de l'IFNγ murin qui est quantifié par test ELISA (PerSeptive Diagnostics, Cambridge, MA, N° S-6716) Le clone retenu E17-TG5324&TG9337 #33 produit 1 μg/ml/106 cellules/24h d'hIL-2, 60 ng/ml/ 106 celiules/24h d'IFNγ et présente un titre viral de I ,3\ I 0" cfu/ml
EXEMPLE S Transduction de cellules cibles On vérifie que les particules virales produites a partir des lignées productrices E 17- TG5324&TG9326 et E 17-TG5324&TG9337 sont capables de transduire des cellules cibles et que l'expression des gènes thérapeutiques n'est pas altérée dans le contexte cellulaire Cette étude est menée sur une lignée muπne établie (cellules 3T3) et sur deux lignées primaires (cellules P3D6M et P3D4M) Ces dernières sont dérivées de melanomes de chien et soumises a un passage en souris SCID immunodéficientes afin de générer des lignées primaires homogènes 2xl07 cellules au stade passage 5, sont injectées par voie sous-cutanée dans les animaux Les tumeurs sont prélevées 3 semaines plus tard et les cellules de melanome sont maintenues en culture dans les conditions classiques
Les cellules cibles sont mises en culture a raison de 1 a 2x10^ cellules par puit et, le jour suivant, infectées par 0,5 ml de surnageant de culture des cellules productrices préalablement filtre a travers une membrane de 0,45 μm On laisse l'infection se poursuivre pendant 1 à 2 h puis les cellules sont remises dans du miiieu frais Habituellement, on effectue deux cycles de transduction dans la même journée et les cellules transduites sont cultivées en présence de G418 (5 mg/ml) Le milieu est change tous les trois jours jusqu'à l'apparition de colonies résistantes dont on évalue leur sensibilité au ganciclovir Les essais mettent en oeuvre 5x 10° cellules qui sont placées le jour suivant leur mise en culture, en présence de ganciclovir a des concentrations comprises entre 0 et 1000 uM La viabilité des cellules est déterminée après une semaine par le test au bleu de trypane Le nombre de cellules dénombre dans les puits dans lesquels la culture a ete effectuée en absence de ganciclovir représente le 100 % Les résultats indiquent que les trois types de cellules cibles transduites par les particules issues des vecteurs retoviraux pTG9326 et pTG9337 ainsi que les lignées productrices correspondantes sont sensibles au ganciclovir En d'autres termes, leur viabilité est affectée en présence de doses faibles de ganciclovir (LD50 c'est a dire la concentration de ganciclovir pour laquelle on obtient 50 % de viabilité, inférieure a 0, 1 uM) alors que les cellules non transduites résistent a des concentrations beaucoup plus élevées (LD50 au delà de 10 μM) Ces résultats montrent que le niveau d'expression du gène tk dans les cellules tumorales transduites est suffisamment eleve pour les rendre sensibles a des doses de gancoclovir non toxiques pour les cellules normales
EXEMPLE 9 Effet de voisinage
On vérifie la capacité des particules virales de vecteur pTG9344 a induire un effet cytotoxique de voisinage dans les cellules transduites Dans un premier temps, les cellules primaires P3D6M sont transduites par les particules virales pTG9344 et les cellules infectées sont sélectionnées en présence de G418 (1 mg/ml) Puis, on réalise une co-culture contenant des cellules P3D6M non transduites et un certain pourcentage de la culture transduite (respectivement 0, 10, 30, 50, 80 et 100 %) La co-culture est maintenue 7 jours en présence de Ganciclovir (1 μM) et la viabilité des cellules est estimée par coloration au bleu de trypane On indique que cette concentration est choisie de manière à être toxique pour les cellules transduites qui expriment la thymidine kinase (3 % de cellules survivantes pour l'essai 100 %) alors qu'elle n'affecte pas ou peu la viabilité des cellules n'exprimant pas le gène suicide (86 % de cellules survivantes pour l'essai 0 %) Pour ce qui est des essais de co-culture, le ganciclovir exerce un effet toxique notable même a un faible pourcentage de cellules transduites Une réduction drastique de la viabilité est deja observée lorsque le mélange cellulaire ne contient que 10 % de cellules transduites (18 % de cellules survivantes pour l'essai 10 % et 5 % pour l'essai 30%) Ces résultats indiquent que le vecteur pTG9344 exprime une quantité suffisante de TK pour induire la cytotoxicite de la cellule infectée et propager cet effet aux cellules non transduites avoisinantes
EXEMPLE 10 Induction de l'expression des antigènes MHC de classe 1 et H dans les cellules transduites
Cette étude est destinée a vérifier la fonctionnalité des gènes IFNγ portes par les vecteurs pTG9326 et pTG9337 Un des effets biologiques de l'IFNγ est d'induire l'expression des antigènes MHC de classe I et II . T)
Les cellules PS 15 (mastocvtome murin) et B 16 (mélanome murin) sont transduites par le vecteur pTG9344 (tk-neo) à titre de témoin négatif ou pTG9337 (IFNγ muήn-tk-neo) et on détermine la présence d'antigènes de classe 1 et II à la surface des cellules infectées par les techniques classiques d'immunofluorescence et de cytometπe de flux (FACS) Les antigènes MHC de classe II présents a la surface des cellules P815 et B 16 sont mis en évidence par un anticorps anti-souπs couplé au FITC (pour Fluorescein isothiocyanate) (Pharmingène, San Diego, CA). Pour la détection des antigènes de classe I, on utilise un anticorps antι-H2kb (Pharmingen) pour les cellules B16 et anti-H2kd (Pharmiπgen) pour les cellules P815
Apres l'infection et maintien en milieu sélectif ( G418 5 mg/ml) pendant environ deux semaines, les cellules sont détachées par action de 10 mM d'EDTA dans un tampon phosphate salin (PBS) et lavées à deux reprises dans la tampon suivant (PBS, 1 % de sérum albumine bovine, 0, 1 % de gammaglobuline humaine, 10 mM d'EDTA et 0,02 % d'azide de sodium). lxlO6 cellules sont incubées pendant 45 min, a 4°C et à l'obscurité en présence de 200 μl d'une dilution au 1 50 de chacun des anticorps cites ci-dessus ou à titre de témoin négatif en absence d'anticorps ou en présence d'un anticorps non spécifique (antι-CD8 de souris) Apres lavage, les cellules sont fixées (formaldéhyde 2 % dans du tampon PBS) et analysées par FACS (cytometre Becton Dickinson, San José, CA)
Les résultats indiquent que l'expression des antigènes MHC de classe I à la surface des cellules murines cancéreuses B 16 et P815 (80 % pour les cellules PS 1 5 et 95 % pour les cellules B 16) est fortement induite par le transfert du vecteur pTG9337 montrant que ce dernier exprime un IFNγ fonctionnel En revanche, les cellules PSI 5 et B 16 transduites par le vecteur pTG9344 ne présentent aucune fluorescence (0 %) De plus, l'intensité de fluorescence des cellules transduites exprimant l'IFNγ est environ 30 à 40 fois supérieure à celle obtenue avec les cellules non traitées Ainsi, le grand nombre de cellules positives pour les antigènes de classe I et l'intensité de l'expression a la surface de ces cellules dus a l'expression de l'IFNγ devraient contribuer a une meilleure reconnaissance des cellules efrectπces immunes en vue d'éliminer les cellules cancéreuses L'expression des MHC de classe II est faiblement induite
Une expérience similaire est entreprise sur les cellules primaires canines P3D6M infectées par le vecteur pTG9326 (IFNγ canm-tk-neo) ou, a titre de témoins négatifs, pTG9344 (pas d'expression d'IFNγ) et pTG9337 (expression de l'IFNγ munn) Les antigènes MHC de classe I et II sont respectivement mis en évidence par les anticorps monoclonaux H58A reconnaissant les molécules ant ι-H2kk et TH 14B dirige contre l'équivalent allelique DR de plusieurs espèces dont le chien (VRMD Inc, Pullman, WA) (Davis et al , 1987, Vet Immunol Immunopathol 15, 337-376) L'immunocoloration est réalisée comme decπt ci-avant a la différence qu'après l'incubation avec la solution d'anticorps, les cellules sont mises en présence de 200 μl de tampon de lavage contenant une dilution au 1 256 d'un anticorps de lapin anti-immunoglobuhne G de souris conjugue au FITC Apres 45 min de contact a 4°C et dans l'obscurité, les cellules sont lavées, fixées et la présence des antigènes de classe I et II évaluée par FACS
Les résultats indiquent que l'expression des antigènes MHC de classe 1 et II est fortement induite a la surface de plus de 95 % des cellules primaires cancéreuses P3D6M transduites par le vecteur pTG9326 L'intensité de fluorescence des cellules transduites expπmant i'LFNγ est environ 25 fois supérieure pour les MHC I et 300 fois supérieure pour les MHC II a celle obtenue avec les cellules non traitées Aucune induction ne se produit dans les cellules P3D6M transduites par les vecteurs pTG9344 et pTG9337
EXEMPLE 1 1 Evaluation /// vivo
Les cellules muπnes B 16 sont transduites par les vecteurs pTG9344 et pTG9337 ou a titre de contrôle négatif par un vecteur retroviral exprimant le gène marqueur
LacZ codant pour la β-galactosidase (pTG5391 ) Les cellules infectées sont sélectionnées en présence de G41 S pendant 14 jours trypsinees et resuspendues a une densité de 2x 10 cellules/ml dans du tampon PBS 100 μl de cette suspension sont injectes de manière sous-cutanee a des souris immunocompetentes B6/D2 génération FI Deux jours après et ceci pendant les 6 jours qui suivent, les animaux reçoivent une injection intraperitoneale de ganciclovir ( 100 mg/kg/jour) et on examine le nombre de tumeurs et leur taille jusqu'à 44 jours après l'implantation A titre de témoins, on utilise des souris traitées en parallèle par des cellules non transduites et des souris dans lesquelles ont ete implantées des cellules transduites mais qui ne sont pas traitées par le ganciclovir (GC) Comme résume dans le tableau suivant, au total 5 groupes de 10 animaux ont ete constitues
Figure imgf000026_0001
1 souris mortes ou sacrifiées en raison de la taille importante des tumeurs
La comparaison des groupes 4 et 5 tous deux résultant de l'implantation de cellules transduites par le vecteur pTG9337 mais traites ou non par le ganciclovir, montre clairement l'effet de ce dernier sur le developement des tumeurs Par ailleurs les souris dans lesquelles ont ete implantées les ceilules transduites par un vecteur exprimant des gènes thérapeutiques (pTG9344 et pTG9337) ne développent pas de tumeurs avant le 25ιemejour (groupes 3 et 4) alors que les animaux n'ayant reçu aucun vecteur (groupe 1) ou un vecteur non thérapeutique (groupe 2) sont décimes bien avant le 21ième jour De plus, l'avantage de combiner l'action de plusieurs gènes thérapeutiques ressort clairement de cette analyse En effet, l'expression du gène tk seul ralentit le développement tumoral (groupe 3) alors que la grande majorité (9/10) des animaux ayant reçu les cellules B 16-9337 (expression concomittante des gènes tk et LFNγ) ne présentent aucune tumeur plus de 44 jours post-implantation Ces données indiquent que la combinaison de l'effet immunostimulateur de l'LFNγ et des effets cytotoxiques de la thymidine kinase et du ganciclovir réduit d'une manière drastique la fréquence des tumeurs
LISTE DE SEQUENCES
) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: Transgene S.A.
(B) RUE: 11 rue de Molsheim
(C) VILLE: Strasbourg
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 67082
(G) TELEPHONE: (33) 88 27 91 00 (H) TELECOPIE: (33) 88 27 91 11
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Nouvelles compositions antitumorales
(m) NOMBRE DE SEQUENCES: 13
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: olgonucleotide de synthèse OTG4322
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1 GGAGATGGGG GAGGCTAACT GAAACT 26 ;2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(11) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse OTG4323
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: CTAGAGTTTC AGTTAGCCTC CCCCATCTCC 30
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO. 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: Simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE.
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse OTG4031
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: NGATGCTCTC CGGCCYTCGA AA 22
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(U) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) mi) HYPOTHETIQUE: NON (111) ANTI-SENS" NON (vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse OTG4169
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: AAGAATTCTT RGAHATTTKG ARGAAYTGG 29
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse OTG4170
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: AAGAATTCRT GCAYCACTYK GATGAGYTC 29
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse OTG4321
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: ACCTGCAGAT CGTTCACAGG AATTTG 26
,2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7: il) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 32 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse OTG4319
(:<ι) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: TGGAATTCTC TACTTGAAAC TGTTTGACAA CT 32
[ 2 ) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(in) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse OTG6727
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: CTTCGGCCGA ATTCTCTGAA AC 22
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (in) HYPOTHETIQUE: NON 111) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse OTG678S
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: TCAAATATTG AATTCAGGAT GACC 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: Simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse OTG7295
(κi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: CTGCGGCCGA ATTCTGAGAC AA 22
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(m! ANTI-SENS: OUI iv/i) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de syntnese OTG7296
!/.ι) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11. :?TATTGGGA GAATTCCTTC C (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse 0TG6147
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: TCGGAAACGA TGAAATATAC A 21
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(ni) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse OTG4983
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE-: SEQ ID NO: 13: TATTGCAGCT GGGACAA ' 7

Claims

- J ^
Revendications
1 Composition antitumorale comprenant une population de cellules permettant l'expression d'au moins trois gènes thérapeutiques antitumoraux
2 Composition antitumorale selon la revendication 1 , caractérisée en ce que les gènes thérapeutiques codent pour des polypeptides immunostimulateurs et/ou cytotoxiques
3 Composition antitumorale selon la revendication 2, caractérisée en ce que le polypeptide immunostimulateur est sélectionné parmi le groupe constitué par l'interleukine (JL)-2, ITL-4, ITL-6, 1TL-10, l'IL-12, les facteurs de stimulation des colonies (CSF) de type granulocyte (G-CSF), de type granulocyte macrophage (GM-CSF), l'interféron alpha, l'interféron gamma, les facteurs de costimulation et, notamment, les polypeptides B7 1 et B7 2 et les facteurs activant l'expression des antigènes d'histocompatibilité de classe II
4 Composition antitumorale selon la revendication 2, caractérisée en ce que le polypeptide cytotoxique est sélectionné parmi le groupe constitue par parmi une thymidine' kinase et , notamment la thymidine kinase (TK) du virus Herpès
Simplex de type 1 (HSV-l), la cytosine déaminase, le cytochrome P450 2B 1 , la puπne nucléoside phosphorylase àΕ.coli, la nitroréductase et la β- glucoronidase
5 Composition antitumorale selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que ladite population de cellules permet l'expression des gènes codant pour les polypeptides TK-HSV1 , IL-2 et LFN gamma
6 Composition antitumorale selon l'une des revendications 1 a 5, caractérisée en ce que ladite population de cellules comprend une lignée d'encapsidation retrovirale permettant la production de particules infectieuses comprenant un vecteur retroviral
Composition antitumorale selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite population de cellules est d'origine humaine
Composition antitumorale selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite population de cellules dérive de la lignée 293
Composition antitumorale selon l'une des revendications 6 a 8, caractérisée en ce que ladite population de cellules comprend les gènes gagφol du virus
FMuLV (Friend Muπne Leukemia Virus) de ia souche FB29 et le gène env du virus amphotropique 4070A
Composition antitumorale selon l'une des revendications 6 a 9, caractérisée en ce que ladite population de cellules comprend un vecteur permettant l'expression d'un gène codant pour lTL-2 et permet ia production de particules infectieuses comprenant un vecteur retroviral permettant l'expression d'un gène codant pour la thymidine kinase du virus HSV-l et d'un gène codant pour l'interféron gamma
Composition antitumorale selon l'une des revendications 1 a 10 caractérisée en ce que ladite population de cellules est sensible a une drogue permettant son élimination
Composition antitumorale selon la revendication 1 1, caractérisée en ce que ladite drogue est un dérive de l'acyclovir et, notamment, le ganciclovir
Composition antitumorale selon i'une des revendications 1 a 12, caractérisée en ce que ladite population de cellules comprend un mélange de cellules permettant 1 expression desdits gènes thérapeutiques antitumoraux
Composition antitumorale selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite population de cellules comprend un mélange de cellules dérivées de la lignée Vero, une partie permettant l'expression du gène IL-2 et l'autre partie permettant I expression du gène IFN-γ éventuellement combinée a une lignée d'encapsidation retrovirale permettant la production de particules infectieuses ou a des particules infectieuses comprenant un vecteur retroviral permettant l'expression du gène TK-HSV 1
Composition antitumorale selon l'une des revendications 1 a 14, caractérisée en ce que ladite population de cellules permet en outre l'expression d'un marqueur de sélection positive
Cellule d'encapsidation deπvee de la lignée 293 et comprenant les gènes gag/pol du virus FMuLV (Fπend Muπne Leukemia Virus) de la souche FB29 et le gène env du virus amphotropique 4070A, et un vecteur permettant l'expression d'un gène codant pour 1TL-2
Vecteur retroviral caractérise en ce qu'il comprend de 5' vers 3'
- un LTR 5',
- une région d'encapsidation, - un gène codant pour l'interféron gamma,
- un promoteur interne constitutif,
- un gène codant pour la thymidine kinase du virus HSV- l ,
- un site interne d'entrée des πbosomes (ERES),
- un gène codant pour un marqueur de sélection positive, et - un LTR 3'
Utilisation d'une composition antitumorale selon l'une des revendications 1 a 1 5 d'une cellule d'encapsidation selon la revendication 16 ou d'un vecteur retroviral selon la revendication 17, pour la fabrication d'un médicament destine au traitement ou a la prévention du cancer ou d'une affection cancéreuse chez un homme ou un animal Utilisation seion ia revendication 1 8, seion laquelle ladite composition antitumorale est destinée à être administrée par voie intratumorale
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