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WO1997035974A9 - Sequences en amont du gene sm22, vecteurs les contenant et leurs utilisations therapeutiques, notamment dans le traitement des maladies vasculaires - Google Patents

Sequences en amont du gene sm22, vecteurs les contenant et leurs utilisations therapeutiques, notamment dans le traitement des maladies vasculaires

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WO1997035974A9
WO1997035974A9 PCT/FR1997/000543 FR9700543W WO9735974A9 WO 1997035974 A9 WO1997035974 A9 WO 1997035974A9 FR 9700543 W FR9700543 W FR 9700543W WO 9735974 A9 WO9735974 A9 WO 9735974A9
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vector
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Definitions

  • the present invention relates to sequences upstream of a gene expressed in smooth muscle cells, such as SM 22, as well as vectors containing them.
  • vectors and sequenced in therapy for example for the production of active polypeptides locally or systemically, including polypeptides i mmuno misleadings, endogenous regulatory polypeptides such as cytok i nes, or for the production of RNA of therapeutic interest , for example an antisense RNA
  • the subject of the invention is the use of vectors and nucleotide sequences in the treatment of vascular diseases.
  • Atherosclerosis is a degenerative disease of the arteries assoc i ant lesions of arteriosclerosis and atherosclerosis, and combining a i nsi hardening of the arteries and fatty degeneration of their internal tun that i.
  • This is generally remedied coronary heart disease by percutaneous coronary angioplasty of i ntroduire in the coronary arterial system a catheter provided at its extrem i ty of a balloon, advancing the catheter j ntil the stenosis and inflating the balloon to crush the lesion against the wall and thereby restore a coronal caliber allowing sufficient myocardial perfusion
  • This myocardial revasculansation technique is widely used (50 000 procedures per year in France and 500,000 ntervent i i ons per year in the US) but is limited by the réappar i tion, in the months following the operation, d a new lesion s i te dilated, or restenosis, in about 30% of cases.
  • intimal hyperplasia is due to the proliferation of smooth muscle cells in the intima, which results in the synthesis of a voluminous extracellular matrix This activity would be induced by the local release of growth factors and cytokines. as well as by suppressing the synthesis of certain antiproliferative endothelial peptides.
  • the second mechanism, arterial remodeling consists of a reduction in the size of the artery without modifying the thickness of the wall, and therefore without proliferation of cells.
  • the application WO 96/05351 also describes defective recombinant adenoviruses comprising a suicide gene for the treatment of restenosis.
  • the suicide gene can be placed under the control of an active promoter in vascular smooth muscle cells. Only the promoter of acti ⁇ e ⁇ smooth muscle is cited in the context of this embodiment. No example of use of such a construction illustrates this request.
  • the proteins constituting the smooth muscles were the subject of piecemeal studies.
  • the SM 22 protein which constitutes one of the first markers to appear during the differentiation of smooth muscle cells, was studied and the coding part of its gene was sequenced in mice (SOLWAY and AL, 1995, J Biol Chem, 270,22, 13460-13469) and in rats (KEMP and AL, 1995, BIOCHEM J 310, 1037-1043).
  • Chicken gene and gene sequences human also been determ i nes (Nishida et al, 1991, Biochem Int, 23, 663-668 for chicken gene, Thweatt et al 1992 Biochem Biophyse Res Comm, 187 1-7 to the human gene)
  • the g ene encoding the SM protein 22 alpha in the mouse is composed of five exons and includes 6.2 kb II is present in a single copy in the genome SOLWAY et al showed that the 441 base pairs upstream of the coding region of the gene were necessary and sufficient to induce a high level of transcription of a reporter gene, in primary cell cultures of rat aortae and in the kjr lines. They also showed that the messenger RNAs of this gene were expressed at significant levels in the aorta, uterus, lungs and intestine
  • nucleotides -2735 and -445 do not contain any essential muscular regulatory elements.
  • the applicant endeavored to identify in vivo, on adult individuals, the activity of the various regions constituting the region upstream of the expressed coding sequence of the gene of the SM 22 II protein has also sought to determine whether modifications in this sequence induced changes in the expression of the gene in the different tissues.
  • sequences identified by Ll et al (1996, previously cited) as containing no essential regulatory sequences contained sequences indispensable for a specific expression of the SM 22 gene in the adult.
  • the invention also relates to any nucleotide sequence or ohgonucleotide of natural origin or obtained by chemical synthesis having a homology with SEQ ID No. 1 sequence of at least 70%
  • nucleotide sequence is meant naturally occurring, a complementary DNA fragment obtained by reverse transcription of cellular mRNA or a genomic DNA fragment obtained after cleavage of cellular DNA using enzymes restriction
  • Nucleotide sequence obtained by chemical synthesis is understood to mean a fragment of DNA of known sequence generated by automatic synthesis of polynucleotides, for example using a suitable automatic apparatus.
  • protein or RNA of therapeutic interest is meant a molecule capable of inhibiting the growth of smooth muscle cells, of stimulating the growth of endothelial cells, of consolidating the arteries and / or capable of inducing a cellular or humoral immune response.
  • the term "strongly st ⁇ nge ⁇ tes conditions" is used in the sense given by Maniatis et al, 1982 (Molecular cloning A Laboratory Manual, CSH Cold Sp ⁇ ng Harbor Lab, NY USA or one of his recent reissues. preferred, the hybridization conditions are as described by Maniatis (1982 edition). Three washes to remove non-hybrid fragments are required and are carried out at 65 ° C in the presence of 0.2 SSC and 0.1% SDS, in the absence of formamide
  • said sequence comprises a fragment of the sequence between the nucleotides -2126 and +4135, whose sequence SEQ ID No. 1 is given in the appendix, of the sequence comprised between the nucleotides
  • sequence SEQ ID No. 4 may also comprise a fragment of the sequence SEQ ID No. 4
  • Such a fragment may in particular comprise at least part of the sequence SEQ ID No. 5 which corresponds to the portion upstream of the 5 'end of the coding portion between the nucleotides -2126 and -1 340
  • sequence SEQ ID No. 5 the sequence of which is given in the appendix constitutes an object of the present invention.
  • sequences SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 1 are included respectively in the plasmids p2126nlz and p2126INTnlz carried by the strains deposited on March 25, 1996 with the National Collection of Culture of Microorganisms of the Pasteur Institute (CNCM) respectively under No. 1-1685 and 1-1686
  • the invention also relates to hyb ⁇ dant sequences under conditions of high stringency with the sequences SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 5
  • sequences including the sequence of the first intron of the SM 22 gene, and in particular the sequence SEQ ID No. 1, constitute particularly advantageous embodiments of the present invention, because they allow an expression of proteins or RNAs of therapeutic interest. , in adults, specific to the arteries
  • the present invention is nevertheless not restricted to sequences containing fragments of the mouse gene, but relates to any other sequence of any other species having the same properties namely to specifically induce an expression of a gene in the cells of the arteries.
  • those skilled in the art can advantageously refer to the article by KEMP and AL (1995, cited above) which dec ⁇ t the sequence upstream of the rat gene of the SM 22 protein.
  • the present invention also covers any sequence comprising fragments. upstream sequences of SM 22 protein genes, modified for example by deletion of certain structures which retain functions identical or similar to those of the complete sequence
  • the protein of therapeutic interest may be a protein inducing the formation of a cytotoxic compound, such as the thymidine ki ⁇ ase of the herpes virus.
  • This protein has the particularity of transforming ganciclovir (Merck Index, reference 4262), an analogue of the guanosine, in a drift which blocks the synthesis of the DNA in the cells in rephcation
  • transforming ganciclovir Merck Index, reference 4262
  • an analogue of the guanosine in a drift which blocks the synthesis of the DNA in the cells in rephcation
  • the introduction of a gene coding for this protein in the sequences according to the present invention thus makes it possible to block the proliferation of the cells in the case of the intimal hyperplasia
  • a sequence coding for thymidine kinase is described by Caruso and Klatzmann (1992, Proc Natl Acad Sci, USA, 89, 182-186).
  • Said protein of therapeutic interest may also be a protein exhibiting a cytostatic effect, such as the protein encoded by the Rb gene (Chang et al. 1995 Science, 267, 518-522), or by the eNOS gene (Hamon et al., 1994 , Circulation, 90, 1357-1362)
  • a protein exhibiting lipolytic activity such as lipoprotein lipase.
  • lipoprotein lipase Such proteins are encoded by the sequences described by Reyner (1995, Nature Genetics, 10, 28) and Ming Sun Liu (1994, J Biol Chem, 269). -1 1417) It may also be an endothelial cell growth factor Such a protein may be in particular an interleukin
  • muscle protein such as myosin, or actin
  • protein of tissue structure such as collagen or elastin
  • protein may be a protein inducing an immune response as described in WO 90 1 1092, and in particular a viral antigen such as glycoprotein gp120 or HIV Nef protein (human immunodeficiency virus).
  • protein may be one or more proteins of therapeutic or vaccinal interest, such as proteins of immunotherapeutic interest, for example interleukins, growth factors, for example fibroblast growth factors (FGF) or NGF (Nerve Growth). Factor), proteins that can induce an immune response, be it a humoral, cytotoxic or cellular immunity, or proteins that make it possible to complement the activity of a gene normally expressed in the individual to be treated but which is no longer , either by mutation or deletion of its sequence This sequence may also encode an RNA of therapeutic interest.
  • FGF fibroblast growth factors
  • NGF Nef protein
  • RNA may be the antisense RNA of the p53 protein or an RNA as described in the application WO 90 1 1092 filed by the company VICAL.
  • the present invention furthermore for object vectors characterized in that they contain a sequence according to the invention as described above
  • Such a vector may contain any other DNA sequence necessary for the expression of the protein, or RNA, of therapeutic interest in the target tissues, and in particular may contain an effective origin of rephcation in the cells of the arteries, particularly in smooth muscle cells
  • Such a vector may comprise sequences allowing homologous recombination in the treated organism, specific for the gene to be replaced, said sequences being placed upstream and downstream of the sequence according to the invention. Due to the presence of such sequences, the gene undesired, present in the treated organism will be replaced by the gene carried by the vector or the sequence and that one wishes to be expressed in the organism
  • Such a homologous recombination method may be of the type described by Le Mouellic et al (1990, Proc Nat Acad Sa USA 87, 4712-4716) or in PCT application WO 91/06 667.
  • the introduction of the sequences according to the present invention into the vectors described above is not essential, and that the cells of the arteries can be directly traced by DNA comprising these sequences.
  • nucleic acid sequences according to the present invention. invention can be introduced after covalent coupling of the nucleic acid with compounds promoting their penetration into the cells or their transport to the nucleus, the resulting conjugates being optionally encapsulated in polymeric microparticles, as in international application WO 94/27238 of Meidsorb International Technologies
  • the nucleic sequences can be included in a transfection system comprising polypeptides promoting their penetration into cells, as in international application WO 95/10534 of Seikagaku Corporation.
  • vectors or sequences can be administered in situ by any means known to those skilled in the art.
  • they can be delivered in situ using a channel-covered balloon catheter, as described by Feldmann and STEG (1996). , previously cited)
  • Another mode of administration consists of introducing a mesh of low mesh impregnated with DNA including these sequences, along the aorta, as described. by Feldman et al (1995 J Clin Invest 95 2662-2671)
  • sequences or vectors may advantageously be administered in the form of a composition containing them, for example in a gel facilitating their transfection into the cells of the arteries.
  • a gel may be a poly-L-lysine and lactose complex, as described. by MIDOUX (1993, Nucleic Acid Research, 21, No. 4, 871-878) or poloxamer 407 as described by PASTORE (1994, Circulation, 90 I-517) can also be dissolved in a buffered solution or be associated with liposomes
  • the present invention further relates to medicaments containing such sequences, vectors or compositions, as well as to pharmaceutical compositions containing them in quantities pharmaceutically effective as well as pharmaceutically compatible excipients
  • Such sequences, vectors or compositions can be advantageously used for the manufacture of medicaments for delivery to the arteries of a DNA (cDNA or genomic DNA) which can express in particular a gene coding for a protein of interest, for the treatment of However, they can also be used for the manufacture of a medicament for the treatment of mutations weakening the vessels.
  • a medicament could, for example, comprise a sequence or a vector according to US Pat. invention capable of expressing a gene coding for a normal desmin protein or a CAM-type muscle adhesion protein
  • the subject of the present invention is also RNAs expressed from the sequences and vectors that are the subject of the present invention, and in particular messenger RNAs.
  • the present invention also relates to a method for screening molecules in vitro, in order to test their activity on the regulatory sequences of the gene encoding the SM 22 protein.
  • a method for screening molecules in vitro will comprise, for example, a first step according to which transfections of cells with a sequence or a vector according to the invention comprising a reporter gene placed under the control of all or part of the promoter sequence of the gene encoding the SM 22 protein.
  • the cells thus transfected are incubated in the presence of the molecule to be tested, then the expression of the reporter gene is quantified
  • the cells used for transfection are advantageously smooth muscle cells, in particular cells of the aorta, either in the form of a primary culture or in the form of a stable cell line
  • the quantification of the beta-galactosidase produced will advantageously be carried out by optical reading, for example using the detection kit marketed by Boeh ⁇ nger under the reference 1 669 893 ( Boeh ⁇ ger- catalog Mannheim - "Biochemicals” 1996, page 236. beta-Gal Reporter Gene Assay, Chemilummescent)
  • the reporter gene is the gene coding for luciferase
  • the quantification of the expression of luciferase is advantageously carried out by chemiluminescence, for example by means of of the diagnostic kit marketed by Boeh ⁇ nger under the reference 1,758,241 (Boeh ⁇ nger-Mannheim catalog "Biochemicals", 1,996, Luciferase Reporter Gene Assay)
  • the present invention also relates to transgenic animals and in particular to mice carrying a sequence or a vector as defined above in which the gene coding for the protein of therapeutic interest is replaced by a reporter gene
  • the present invention finally relates to a method for detecting mutations of the sequence upstream of the coding part of the SM22 protein gene.
  • Such mutations are in fact capable of modifying the expression of the gene coding for the SM22 protein, in particular reduce or even abolish the expression of this gene in the smooth muscle
  • Such mutations would be likely to cause a change in smooth muscle function, the SM22 protein being related to a family of proteins involved in the regulation of calcium binding, of the calponme type (Ayme-Southgate et al. 1989, J Cell Biol)
  • Such a method for detecting mutations can advantageously be the process that is the subject of the French patent application FR-93 10821
  • sequences according to the invention modified so that they allow an increase in the expression of the SM22 gene are also part of the invention.
  • transgenic mice can be used to screen molecules for their activity on the gene-encoding sequences encoding the SM 22 protein. Molecules can be administered to mice, and after sacrifice, histological sections are performed to highlight the tissues. colored by the reporter gene
  • SAMBROK et al Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spong Harbor
  • Figure 1 shows the restriction map and the exon / intron structure of the SM 22 site, including the region -2474 to +6030 (relative to the transcription initiation site).
  • the exons are represented by white squares while the arrows indicate the position of the repeated sequences of type B1
  • FIG. 2 represents the alignment of three B1 type repeat sequences, in which the basic exchanges are indicated.
  • FIG. 3 is an autoradiogram illustrating the identification of the transcription initiation site. The well P corresponds to the primer used.
  • FIG. 4A represents the sequence of the 5 'region upstream of the transcription initiation site, and the exon of the SM 22 gene.
  • the binding sites of the various factors are indicated, as well as the various sequences of the consensus.
  • the broken lines indicate the position of the repeated sequences of type B1.
  • Figure 4B is a schematic restriction map of the SM 22 gene.
  • Figure 4C is a detailed restriction map of the SM 22 gene.
  • Figure 5 illustrates the manufacture of plasmid p352nlz
  • Figure 6 illustrates the manufacture of plasmid p2126 nlz.
  • Figure 7 illustrates the manufacture of plasmid p2126INTn1z.
  • Figures 8A and 8B illustrate the expression of the lacZ gene in transgenic mouse embryos.
  • Figures 8A, 8B represent respectively embryos at stages 12.5 and 15.5 days.
  • Figures 9A-9D show histological sections of embryos stained with lacZ.
  • Figure 9A shows a sectional view of an embryo at the 12.5 day heart stage, showing intense staining exclusively in the right ventricular myocardium (RV) and in the artery walls (abbreviations AA elbow of the fourth aortic artery, CA carotid artery, esophagus, iv left ventricle PA proximal portion of aorta, PT pulmonary trunk, right atrium RV right ventricle, trachea T, right and left cardinal vein)
  • Figure 9B shows a sectional view of through the abdominal region of a 14.5-day stage embryo, showing umbilical artery (UA) staining and the absence of visceral staining (B bladder, D duodenum, H large intestine L liver, M small bowel, ST stomach)
  • Figure 9D is a section through the 12.5-day-old tail segments showing myotome (my) and tail (a)
  • Figure 9C is an enlargement of the portion of the photograph corresponding to the umbilical artery at the 12.5 day stage, showing exclusive labeling of the muscular layer (m) and absence of endothehum (e) labeling.
  • FIGS. 10A to 10C illustrate the expression of tra ⁇ sgene in adult mice
  • Figure 10A shows a top view of the entire heart showing intense staining of the aorta (a) and pulmonary artery (PA) and absence of vena cava (vc) labeling.
  • 10C are sections through the smooth muscle layer (sm) of the adult colon and an adjacent mesenteric artery (ma). LacZ labeling ( Figure 10B) shows that transgene expression is restricted to artery while immunofluorescence with antibodies SM 22 ( Figure 10C) demonstrates the expression of the endogenous SM 22 gene in the smooth muscle cells of both artery and colon
  • FIG. 11 represents a vector comprising the regulatory regions of the SM 22 gene and the gene encoding the thymidme kmase of the herpes virus.
  • Figures 12A to 12D illustrate the expression of the SM 445 nlz construct in 15.5 day old PC embryos ( Figures 12A to 12C) and in a 2 month old adult ( Figure 12D)
  • Figures 12A to 12D illustrate the expression of the SM 445 nlz construct in 15.5 day old PC embryos ( Figures 12A to 12C) and in a 2 month old adult ( Figure 12D)
  • SM 22 locus II one of the isolated clones was found to contain an entire SM 22 locus II was then mapped with restriction enzymes and subcloned.
  • hybridization analysis of the type Southern genomic DNA from Mice and genomic clones were performed and restriction patterns of the fragments were compared.
  • the sequence of the SM 22 gene was determined on both strands by the chain termination method (Sanger et al., 1977, Proc Natl Acad Sci 74 5463) using the Sequenase V2 kit (United States Biochemical, Clevela ⁇ d, Ohio)
  • RNA of cell lines and adult mouse tissue was isolated by the method of Chirgwi ⁇ et al., (1979, Biochemistry, 1794-5299) modified for the isolation of messenger RNAs, the Oligotex kit (Quiagen Inc., Chatsworth, CA) was used following the manufacturer's instructions
  • Northern hybridization analyzes were performed using agarose gels containing formaldehyde and by capillary hybridization on Hybo ⁇ d-N membranes (Amersham Life Science UK Little Chalfont) according to methods known to those skilled in the art.
  • primer extension assays a synthetic oligonucleotide of 30 nucleotides (P27N1) complementary to the +36 to +65 sequence of the complementary DNA of the SM 22 gene having the sequence SEQ ID No. 6 (5'-AAGGCTTGGTCGTTTGTGGACTGGAAGGAG-3 ), was labeled with T4 polyanucleotide kinase.
  • the 5'RACE method was carried out using two 18 bp antisense synthetic oligonucleotides corresponding to bases +1 12 to +129 (primer 2) and +162 to +179 (primer 1) of the complementary DNA SM 22, as described in substance by FROHMAN et al., (1988, Proc Natl Acad Sci, 85, 8998-9002)
  • RNA polymerase for RNase protection assays, a 417 bp PCR fragment comprising the region -352 to +65 of the SM 22 gene was made and cloned by the sticky tip method into the HinC II site of the pBluesc ⁇ pt vector. SK + The sequence of the fragment obtained by PCR was verified In order to generate a radioactively labeled antisense RNA probe, the construct was linearized with Sph I at position -203 of the SM 22 gene and transcribed with T7 RNA polymerase in the presence of 32p_Qjp [ ⁇ ] SO 3 (c10) was hybridized with 5 ⁇ g mouse uterine messenger RNA at 42 ° C. overnight. After hybridization, the samples were incubated with RNases A and T (1 hr). at 37 ° C), precipitates, and assays as described for primer extension analysis
  • the NIH 3T3, 10T1 / 2 and 8/47 cell lines were cultured in DMEM (Life Technologies, Inc., Vienna, Austria) supplemented with 10% fetal calf serum (Hyclone Inc., USA) at 37 ° C. C, in a Co2 atmosphere at 7%
  • DMEM Life Technologies, Inc., Vienna, Austria
  • 10% fetal calf serum Hyclone Inc., USA
  • confluent cells were plated, subcultured in 6 cm Petri dishes, and allowed to grow to approximately 75% confluence prior to addition of the transfection mixture.
  • the cells were taken from petri dishes with a cell scraper, centrifuged, resuspended in 150 ⁇ l of buffer Z (100 mM sodium phosphate, pH 7.5, 1 mM MgCl 2, 10 nM KCl, 50 nM ⁇ -mercaptoethanol ) and lysed by three cycles of freezing / thawing.
  • the debris was eliminated by low speed centrifugation and the ⁇ -galactosidase activity was determined from 2 to 20 ⁇ l of supernatant according to the methods known to those skilled in the art.
  • the CAT activity according to GORMAN et al (1982 Mol Cell Biol, 2, 1044-1051), from 10 to 100 ⁇ l of lysate were used. To account for variations in transfection efficiency. CAT activity was normalized with ⁇ gal activity.
  • mice carrying the transgene were identified by PCR and Southern hybridization using a DNA probe The pnlz2126 construct yielded three positive animals on 17 mice, two of them transmitting and expressing this construct.
  • mice were backcrossed with c57 / bl mice and the histochemical stains were performed with hemizygous mice for Transgene 6. Histochemical stains Whole embryos or tissues of adults were fixed for 15-30 minutes at 4 ° C in 1% formaldehyde in buffer A (100 mM sodium phosphate pH 7.3). 2 mM MgCl 2, 0.1% sodium deoxycholate, and 0 2% NP-40). After rinsing, the specimens were stained overnight at 30 ° C in buffer A containing 1 mg / ml X-gal (Sigma, St.
  • the mouse tissues were fixed in 3% paraformaldehyde in PBS buffer at 4 ° C. for 3 hours, then coated in Tissue-Tek medium (Reichert-Jung, Vienna) and sectioned on a cryo-microtome. thicknesses of 5 to 10 ⁇ m
  • the selected sections were mounted and stained using a monoclonal antibody directed against SM 22 (Duband et al., 1993, Differentiations 55, 1 -11) at a 1/30 dilution as well as using a Cy3 labeled secondary antibody (Biological Detection Systems USA)
  • the sections were examined using a fluorescence microscope
  • the sequence was determined between positions -2474 and +110 downstream of the polyadenylation site and compared in the EMBL database.
  • the gene covers 5923 bp from the transcription start site to the polyadenylation site. and the coding sequence is shared in 5 exons (FIG. 1). All the exon-mtron boundaries correspond to consensus sequences.
  • the first exon contains only a 5 'ieader sequence and the start codon of the transcription is therefore located in the second exon separated from the transcription start site by more than 4kbp of intron sequence
  • Two potential polyadenylation signals have been located at positions 5905 and 5913 and several TGT regions downstream of the polyadenylation site are likely to be involved in the termination of transcription.
  • the starting site of the transcription was mapped by primer extension analysis (FIG. 3).
  • An antisense oligonucleotide complementary to the 3 'end of exo ⁇ 1 leads to obtaining four extension products which differ only in size. by a pair of bases (bp) in length, the longest of them being 65 bp.
  • the transcription product therefore starts with a G, 77bp upstream of the transcription initiation codon.
  • the shortest extension products were likely caused by premature termination of primer extension due to 5'-end modifications (cappmg) of the messenger RNA
  • RNAse which leads to a 65bp protected fragment and by cloning and sequencing the extension product derived from an independent reaction with an antisense primer located in the second exon of the gene
  • the TTTAAA sequence at position -28bp (FIG. 4) is closely related to the TATAAA sequence and is likely to have the function of a TATA box.
  • Computer analysis of the 5 'sequence reveals the presence of several potential binding sites for factors as well as for elements that are known to contribute to the regulation of muscle gene transcription (Figure 4).
  • a total of 1 1 E-type (CANNTG) plates, four Mef-2 / rSRF (YTAWAAATAR) units, four potential SRF linkers (CC (A / T) 6GG), five AP-2 binding sites (CCCMNSSS ) and five SP1 motifs (GGGCGG) were located.
  • Plasmid pGEM7 (i.e., plasmid pGEM-72F (+/-), marketed by Promega Corp., Madison, Wi, USA.) Sequences available in Gen Bank, under the following numbers: • X65310 and X 6531 1) comprises an ampiciliin resistance gene, a lac Z gene and a replication origin II comprises 3000 base pairs II was digested with Nae 1 / Bsp 1201 The outgoing end Bsp 1201 of the vector was made " blunt ends with the Klenow enzyme, and the plasmid was closed in the presence of a hnker Sal I of 10 bp. The lacZ fragment of pGEM 7 was therefore deleted, a Sal I site introduced, and a Bsp 1201 site restored.
  • a Pme I site was introduced by inserting a Pme I hnker with Nsi I outgoing single-stranded ends in the Nsi I construction site.
  • lacZ gene coupled to the nuclear localization signal was isolated from pDes2.2 ⁇ lz (Ll et al, 1993, previously cited) with Hind III and Sac I giving two fragments of the reporter gene.
  • the two fragments were inserted between the Hind III and Sac I sites of the modified pGEM7 vector and verified for their orientation. This procedure gives the promoterless pnlz vector.
  • Figure 5 illustrates the manufacture of this plasmid
  • FIG. 7 The manufacture of this plasmid is illustrated in FIG. 7.
  • a 5.8 kb Bsp 1201 / Hind III fragment covering the -2126 to +3651 region of the SM 22 locus was inserted into the corresponding sites of pnlz giving pINt-nlz.
  • 496 bp PCR fragment of base +3648 to +4143 of locus SM 22 was generated using an upstream primer and a downstream primer designed to introduce a Hind III site at position 41.
  • the first construct, p2126nlz contains 2126 bp of the upstream region and the first exon (65 bp) the second.
  • construction p2126INTnlz is identical to the first except for the addition of the first intron and the first 12bp of the second exon
  • each of the constructs gave rise to at least one transgenic mouse expressing the reporter gene
  • the sections show that the expression of the transgene is restricted to the myotomal region of the segments (FIG. 9 D).
  • lacZ is present in the major vessels, including those of the limbs and the tail, and the staining of the pulmonary trunk becomes visible.
  • FIG. 10B shows that the expression of the transgene is absent in the muscles of the colon, whereas the mesenteric vessel is very strongly stained by lacZ.
  • staining by immunofluorescence of the section of a similar intestinal tract shows that the endogenous SM 22 protein is present in both tissues (FIG.
  • the HIV-LTR fragment (-167, +80) is deleted from the plasmid pLTR-TK by Hind III digestion whose ends are made blunt with the Klenow enzyme, followed by Xho I digestion.
  • the plasmid closed by inserting a hnker containing the 5 'XhoI sites, the Hind III and Bsp 1201 sites in the 5' -> 3 'order and a 3' end to give the p-TK vector
  • a Bsp 1201 / Hind III fragment of 5.8 kb covering the region -2126 to +3648 of the SM 22 locus is inserted into p-TK to obtain SM 22 INT-TK This fragment is included in the sequence of nucleotides of SEQ ID No. 1
  • Plasmid p2126nlz was cut by Xba I which has a unique site in the 5 '' polyhnker 'upstream of the SM 22 sequence.
  • the 5' protuding ends of the fragment were filled with Klenow polymerase, dNTP
  • the fragment was cut with Pst I which has a unique site at position -445 relative to the transcription start nucleotide +1
  • the protruding 3 'ends of the Pst I cleavage were hydrolysed to Klenow polymerase without dNTP
  • the fragment comprising the plasmid sequences plus the sequence SM 22 from - 445 to +65 fused to the lacZ gene was purified from an agarose gel and closed by the T4 ligase
  • the fragment injected into the mouse eggs was purified from a double digestion Pst 1 / Ns ⁇ I plasmid p2126nlz
  • transcreptional regulatory properties of the sequence of the SM 22 gene between nucleotides -445 and +65 were analyzed in vivo in transgenic mice by two methods.
  • the first method called transient analysis consists in analyzing the expression pattern of the lacZ gene directly. in FO founding embryos at a given stage
  • the second method is to establish stable lineages from adult FO founders 1.
  • the transient analysis yielded four embryos that integrated the p445 ⁇ lz transgene into their genome out of a total of 1 3 embryos. Of the four positive embryos analyzed at 12.5 days of development, one embryo did not express the transgene. expression identical to that of the line p2126 INT nlz at the same stage, that is to say specific arterial smooth muscle cells and finally a third embryo presented the same arterial expression territories added with various sites of ectopic expression essentially diffuse in the embryonic mesenchyme
  • the expression of the transgene was analyzed in the embryo at the stage
  • the two p445nlz lines express lacZ very strongly in the walls of the esophagus and respiratory trachea which are composed of smooth muscle at this stage.
  • FIGS. 12A to 12D represent 15.5-day-old (12A, 12B, 12C) and 2-month-old (12D) SM 445 nlz embryos stained for ⁇ -galactosidase activity.
  • GCAGGATCTA AGAGGAGGGG GGGTTTTTTTTTTT TGTTTGGGGGGGGTGTTTTTTGGTTTTTTTT
  • TCTTTTCCTC TAGTGGCTAG TGATGTTTGG TTTTTTGTTT TGAGACAGGG TTTCTCTGTA
  • CTAGTTCCCA CCAACTCGAT TTTAAAGCCT TGCAAGAAGG TGGCTTGTTT GTCCCTTGCA
  • TGTTAGGCCC AAAGAGGTGA CAAATGAGGC CAAGGGAACA ACTCCATCTT TGGATCTCCA
  • CTCTCTTTCA CTCTCTCTTT CT.AATTTCTT TTTCTTTTTT TCTTTCTTTT CTTTAGACAG
  • CAAAATTCTT CAGATACCTC AACAGATGGC ATCCCACTCA GGCTATCCCT GCTGACTAGG
  • GCATACAGGC CAGGCTTCCC ATGCTCTGGC TAGCAGATTC TCTGCCCTGG AGGACTTTGA
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • SEQ ID NO: 2 GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCATGTTTTT ATAGCTCTTG GGCTGGGAGA AGAGGCGGGT CTGGGTCTTTTTTTTTGAGC TTTGTTCTAT GTTCCTCCATGCTACGGTTGT 1 CAATTGTTTT CTATGAACGA GTACATTCAA TAAAGACAAC CAGACCTGGGATTTGGGGTC 1
  • GATTCTGTAA ACATGTGACC CTTGCTCCAA
  • GCATTGCTTA CAGGAGCAGG ATACTGAAAG 3;
  • TTCTATGCAC CAATAGCTTA AACCAGCCAG GCTGGCTGTA GTGGATTGAG CGTCTGAGGC 96
  • CTGCAGTCAA GACTAGTTCC CACCAACTCG ATTTTAAAGC CTTGCAAGAA GGTGGCTTGT 174 TTGTCCCTTG CAGGTTCCTT TGCTCGGGCC AAACTCTAGA ATGCCTCCCC CTTTCTTTCT 18 ⁇
  • GATTCTGTAA ACATGTGACC CTTGCTCCAA
  • GCATTGCTTA CAGGAGCAGG ATACTGAAAG 3
  • TTCTATGCAC CAATAGCTTA AACCAGCCAG GCTGGCTGTA GTGGATTGAG CGTCTGAGGC 9 '
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • GAGTCCCAGT GCCTGTCGTG GAAAGGGAGG AACATGCCAG GTCCCTGTGT GTCCTTGGCC
  • CTGTGTTAGT CACGTAGGCC TAAGAGCCTT GGCGTTTACA GAGTCACCCA GCTCTGGCCC
  • GCAGGATCTA AGAGGAGGGG GGGTTTTTTTTTTT TGTTTGGGGGGGGTGTTTTTTGGTTTTTTTT
  • CTAGTTCCCA CCAACTCGAT TTTAAAGCCT TGCAAGAAGG TGGCTTGTTT GTCCCTTGCA
  • TGTTAGGCCC AAAGAGGTGA CAAATGAGGC CAAGGGAACA ACTCCATCTT TGGATCTCCA
  • CTCTCTTTCA CTCTCTCTTT CTAATTTCTT TTTCTTTTTT TCTTTCTTTTTT CTTTAGACAG GGTTTCTCTG TGTAGCCCTG GCTGTTCTGG AACTCACTCT TTAGACCAGG CTGGCCTCGA
  • TCTTTTCCTC TAGTGGCTAG TGATGTTTGG TTTTTTGTTT TGAGACAGGG
  • CTGTCATCTG CTCCATGCTC ACACAATTTT TCTCTCAACC AATGACCTCT CAGAAGCAGG GGTTGGTTTG
  • CAAAATTCTT CAGATACCTC AACAGATGGC ATCCCACTCA GGCTATCCCT GCTGACTAGG
  • GCATACAGGC CAGGCTTCCC ATGCTCTGGC TAGCAGATTC TCTGCCCTGG AGGACTTTGA
  • MOLECULE TYPE DNA (oenomic)
  • GATTCTGTAA ACATGTGACC CTTGCTCCAA
  • GCATTGCTTA CAGGAGCAGG ATACTGAAAG 36
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Abstract

Séquences d'ADN comprenant: un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM22, ou d'une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence à ladite séquence en amont, ledit fragment étant susceptible d'induire une expression spécifique d'un gène dans des cellules eucaryotes; et une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d'intérêt thérapeutique. Cette séquence, ou un vecteur la contenant, peut être utilisée pour le traitement des maladies coronariennes, en particulier de la resténose.

Description

SEQUENCES EN AMONT DU GENE SM 22, VECTEURS LES CONTENANT ET LEURS UTILISATIONS THERAPEUTIQUES,
NOTAMMENT DANS LE TRAITEMENT DES MALADIES VASCULAIRES
La présente invention est relative à des séquences en amont d'un gène exprimé dans les cellules du muscle lisse, tel que SM 22, ainsi qu'à des vecteurs les contenant.
Elle a en outre pour objet l'utilisation de ces vecteurs et séquences en thérapeutique, par exemple pour la production de polypeptides actifs localement ou de manière systémique, notamment des polypeptides immunogènes, des polypeptides régulateurs endogènes tels que les cytokines, ou encore pour la production d'ARN d'intérêt thérapeutique, par exemple un ARN anti-sens De manière particulière, l'invention a pour objet l'utilisation des vecteurs et séquences nucléotidiques dans le traitement des maladies vasculaires.
L'athérosclérose est une maladie dégénérative des artères associant les lésions de l'artériosclérose et de l'athérome, et combinant ainsi un durcissement des artères et une dégénérescence graisseuse de leur tunique interne. Cette insuffisance coronarienne est généralement remédiée par une angioplastie coronaire percutanée consistant à introduire dans le réseau artériel coronaire un cathéter muni à son extrémité d'un ballonnet, d'avancer le cathéter jusqu'au niveau de la sténose et de gonfler le ballonnet afin d'écraser la lésion contre la paroi et de rétablir ainsi un calibre coronaire permettant une perfusion myocardique suffisante
Cette technique de revasculansation myocardique est très largement utilisée (50 000 interventions par an en France et 500 000 interventions par an aux Etats-Unis) mais est cependant limitée par la réapparition, dans les mois suivants l'opération, d'une nouvelle lésion au site dilaté, ou resténose, dans environ 30 % des cas.
Les divers traitements proposés pour traiter ce type de lésions sont résumés dans l'article de FELDMAN et STEG "Perspective de la thérapie génique de la resténose" (Médecine/Sciences, synthèse 1996 12, 47-55) Deux mécanismes sont responsables des resténoses l'hyperplasie mtimale et le remodelage artériel Le premier de ces mécanismes, l'hyperplasie intimale est due à la prolifération des cellules musculaires lisses dans l'intima, qui aboutit à la synthèse d'une volumineuse matrice extra cellulaire Cette activatioπ serait induite par la libération locale de facteurs de croissance, et de cytokines. ainsi que par la suppression de la synthèse de certains peptides endothéliaux antiproliférants. Le second mécanisme, le remodelage artériel, consiste en une réduction du calibre de l'artère sans modification de l'épaisseur de la paroi, et donc sans prolifération de cellules.
Ces auteurs décrivent diverses tentatives destinées à inhiber l'hyperplasie iπtimale, par thérapie génique, mais dont les résultats se sont révélés peu satisfaisants, pour diverses raisons L'inefficacité du transfert est une des raisons généralement invoquée pour expliquer ces résultats Ce problème a été partiellement résolu par l'utilisation de vecteurs adénoviraux, mais d'autres problèmes sont apparus, liés à l'immunogénicité de ces virus, au risque de recombiπaison avec des adénovirus sauvages ou au risque de dissémination de ces vecteurs dans la circulation systémique. Ces auteurs citent en outre l'utilisation de séquences promotrices spécifiques des cellules vasculaires, comme la préproendothéline, ou des complexes adénovirus-ligand, comme constituant des voies de recherche très intéressantes, sans pour autant développer ces aspects.
La demande WO 96/05.321 (Rhône Poulenc Rorer S A.) décrit aussi des adénovirus recombinants défectifs comportant un gène suicide pour le traitement de la resténose. Le gène suicide peut être placé sous le contrôle d'un promoteur actif dans les cellules musculaires lisses vasculaires. Seul le promoteur de l'actiπe α du muscle lisse est cité dans le cadre de ce mode de mise en oeuvre. Aucun exemple d'utilisation d'une telle construction ne vient illustrer cette demande.
Les protéines constituant les muscles lisses ont fait l'objet d'études parcellaires Ainsi, la protéine SM 22, qui constitue un des premiers marqueurs à apparaître lors de la différenciation des cellules de muscles lisses, a été étudiée et la partie codante de son gène a été séquencée chez la souris (SOLWAY et AL, 1995, J Biol Chem, 270,22, 13460- 13469) et chez le rat (KEMP et AL, 1995, BIOCHEM J 310, 1037-1043) Les séquences du gène de poulet et du gène humain ont aussi ete détermines (Nishida et al, 1991 , Biochem Int , 23 663-668 pour le gène de poulet , Thweatt et al 1992, Biochem Biophyse Res Comm , 187 1 - 7 pour le gène humain)
Le gène codant pour la protéine SM 22 alpha chez la souris est compose de cinq exons et comprend 6,2 kb II est présent en une seule copie dans le génome SOLWAY et al ont montré que les 441 paires de base en amont de la région codante du gène étaient nécessaires et suffisantes pour induire un taux important de transcription d'un gène reporteur, dans des cultures cellulaires primaires d'aortes de rats et dans les lignées kjr Ils ont d'autre part mis en évidence que les ARN messagers de ce gène étaient exprimés a des taux importants dans l'aorte, dans l'utérus, dans les poumons et dans l'intestin
KEMP et al (1995, BIOCHEM J 310, 1037-1043 ) ont clone et séquence le fragment de 1 ,9 kb en amont de la séquence codante du gène SM 22 de rat Des délétions effectuées dans le fragment ont montré que la région du promoteur comprise entre les nucléotides +65 et -303 étaient plus actives qu'un fragment de 1 ,5 kb comprenant une partie importante de la région du gène non traduite, ce qui suggérerait la présence de séquences régulatrices à l'extrémité 5' du promoteur
OSBOURN et AL (1995, Gène, 154, 249-253) ont aussi étudié la région 5' en amont du gène SM 22 du rat Ils ont mis en évidence la présence de deux introns dans cette région
On notera que ces études ont été faites m vitro en utilisant des cultures de cellules primaires de l'aorte, et non in vivo Or, ces conditions d'expérimentation ne sont pas représentatives de l'activité des gènes dans les cellules de l'organisme
De plus, elles ne concernent qu'une région très limitée de la partie non codante du gène située à l'extrémité 5' c'est-à-dire la partie en aval du nucléotide -441
Plus récemment Li et al (1996, J Cell Biol, 132, 849-859) ont étudié la régulation du gène SM22 à l'aide de souris transgéniques Néanmoins, cet article ne mentionne aucune application de vecteurs portant des fragments de ce gène et en tout état de cause aucune application thérapeutique
En outre un nombre limite de constructions ont été fabriquées, et de manière générale seul I effet sur des embryons, et non sur des adultes, a été teste
Les auteurs déduisent de leur étude que les séquences comprises entre les nucléotides -2735 et -445 ne contiennent pas d'éléments régulateurs musculaires essentiels Le demandeur s'est attaché à identifier in vivo, sur des individus adultes l'activité des diverses régions constituant la région en amont de la séquence codante exprimée du gène de la protéine SM 22 II s'est d'autre part attaché a déterminer si des modifications dans cette séquence induisait les changements dans l'expression du gène dans les différents tissus
Il a mis en évidence de manière surprenante qu'il était possible , en modifiant la région en 5' du gène de la protéine SM 22 de souris, d'obtenir, chez des individus adultes, une expression spécifique d'un gène reporteur dans les muscles lisses des artères et en particulier de l'aorte
Il a en outre montré que les séquences identifiées par Ll et al (1996, précédemment cités) comme ne contenant pas de séquences régulatrices essentielles, contenaient au contraire des séquences indispensables à une expression spécifique du gène SM 22 chez l'adulte
II a enfin montre de manière surprenante que des séquences introniques étaient nécessaires pour l'induction d'une expression spécifique dans les artères
La présente invention a donc pour objet une séquence d'ADN caractérisée en ce qu'elle comprend
- un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM 22, ou d'une séquence hybπdant dans des conditions fortement stπngentes à ladite séquence en amont, ledit fragment étant susceptible d'induire une expression spécifique m vivo de ce gène dans des cellules des artères, et - une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d'intérêt thérapeutique
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique ou ohgonucléotide d origine naturelle ou obtenue par synthèse chimique présentant une homologie avec la séquence SEQID n°1 d'au moins 70 %
On entend par séquence nucléotidique d'origine naturelle, un fragment d'ADN complémentaire obtenu par transcription inverse de l'ARN messager cellulaire ou encore un fragment d'ADN génomique obtenu après clivage de l'ADN cellulaire à l'aide d'enzymes de restriction
On entend par séquence nucléotidique obtenue par synthèse chimique un fragment d'ADN de séquence connue généré par synthèse automatique de polynucléotides, par exemple à l'aide d'un appareil automatique adapte
On entend par protéine ou ARN d'intérêt thérapeutique une molécule susceptible d'inhiber la croissance des cellules du muscle lisse, d'activer la croissance des cellules endothéhales, de consolider les artères et/ou capable d'induire une réponse immunitaire cellulaire ou humorale
Pour la présente invention, le terme "conditions fortement stπngeπtes" est utilisé dans le sens donné par Maniatis et al , 1982 (Molecular cloning A Laboratory Manual, Cold Spπng Harbor Lab CSH, N Y USA ou l'une de ses récentes rééditions. A titre préféré, les conditions d'hybridation sont telles que décrites par Maniatis (édition de 1982) Trois lavages destinés à éliminer les fragments non hybrides sont nécessaires et sont effectués à 65°C en présence de 0,2 SSC et 0, 1 % SDS, en l'absence de formamide
De manière avantageuse, ladite séquence comprend un fragment de la séquence comprise entre les nucléotides -2126 et +4135, dont la séquence SEQ ID n°1 est donnée en annexe, de la séquence comprise entre les nucléotides
-2126 et +65 dont la séquence SEQ ID n° 2 est donnée en annexe ou encore de la séquence comprise entre les nucléotides -2126 et -445 dont la séquence SEQ ID N°3 est donnée en annexe Elle peut aussi comprendre un fragment de la séquence SEQ ID N° 4
Un tel fragment peut en particulier comprendre au moins une partie de la séquence SEQ ID N°5 qui correspond à la partie en amont de l'extrémité 5' de la partie codante comprise entre les nucléotides -2126 et -1 340 Une telle séquence SEQ ID N°5 dont la séquence est donnée en annexe constitue un objet de la présente invention
Les séquences SEQ ID n° 2 et SEQ ID n° 1 sont comprises respectivement dans les plasmides p2126nlz et p2126INTnlz portées par les souches déposées le 25 mars 1996 auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) respectivement sous les n° 1-1685 et 1-1686
L'invention a également pour objet les séquences hybπdant dans des conditions de forte stringence avec les séquences SEQ ID n° 1 SEQ ID n° 2, SEQ ID n° 3 et SEQ ID N° 5
Les séquences incluant la séquence du premier intron du gène SM 22, et en particulier la séquence SEQ ID N° 1 constituent des modes de mise en oeuvre particulièrement avantageux de la présente invention, car elles permettent une expression de protéines ou ARN d'intérêt thérapeutique, chez l'adulte, spécifique des artères
La présente invention n'est néanmoins pas restreinte à des séquences contenant des fragments du gène de souris, mais concerne toute autre séquence de toute autre espèce ayant les mêmes propriétés à savoir d'induire spécifiquement une expression d'un gène dans les cellules des artères Ainsi, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'article de KEMP et AL (1995, précédement cité) qui décπt la séquence en amont du gène de rat de la protéine SM 22 La présente invention couvre aussi toute séquence comprenant des fragments des séquences en amont de gènes de la protéine SM 22, modifiées par exemple par délétioπ de certaines structures qui conservent des fonctions identiques ou similaires à celles de la séquence complète
La protéine d'intérêt thérapeutique peut être une protéine induisant la formation d'un composé cytotoxique, telle que la thymidine kiπase du virus de l'herpès Cette protéine présente la particularité de transformer le ganciclovir (Merck Index, référence 4262), un analogue de la guanosine, en un dérive qui bloque la synthèse de l'ADN dans les cellules en réphcation L'introduction d'un gène codant pour cette protéine dans les séquences selon la présente invention permet donc de bloquer la prolifération des cellules dans le cas de l'hyperplasie intimale Une séquence codant la thymidine kinase est notamment décrite par Caruso et Klatzmann (1992, Proc Natl Acad Sci , USA, 89, 182-186)
Ladite protéine d'intérêt thérapeutique peut aussi être une protéine présentant un effet cytostatique, telle que la protéine codée par le gène Rb (Chang et al 1995 Science, 267, 518-522), ou par le gène eNOS (Hamon et al , 1994, Circulation, 90, 1357-1362)
Elle peut aussi être une protéine présentant une activité lipolytique, telle qu'une lipoprotéine lipase De telles protéines sont codées par les séquences décrites par Reyner (1995, Nature Genetics, 10, 28) et Ming Sun Liu (1 994 J Biol Chem, 269-1 1417) Elle peut aussi être un facteur de croissance des cellules endothéliales Une telle protéine peut être en particulier une interleukme
Elle peut être une protéine musculaire, telle que la myosine, ou l'actine, ou encore une protéine de structure tissulaire telle que le collagèπe ou l'élastine
Elle peut être une protéine induisant une réponse immunitaire telle que décrite dans la demande WO 90 1 1092, et en particulier un antigène viral tel que la glycoprotéine gp120 ou la protéine Nef du VIH (virus de l'immunodéficience humaine) De manière générale, ladite protéine peut être une ou plusieurs protéines présentant un intérêt thérapeutique ou vaccinal, telles que des protéines d'intérêt immunothérapeutique, par exemple des interleukmes, les facteurs de croissance, par exemple les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF) ou le NGF (Nerve Growth Factor), des protéines pouvant induire une réponse immunitaire, que ce soit une immunité humorale, cytotoxique ou cellulaire, ou des protéines permettant de complémenter l'activité d'un gène normalement exprimé chez l'individu à traiter mais qui ne l'est plus, soit par mutation ou délation de sa séquence Cette séquence peut aussi coder pour un ARN d'intérêt thérapeutique Un tel ARN peut être l'ARN antisens de la protéine p 53 ou un ARN tel que décrit dans la demande WO 90 1 1092 déposée par la société VICAL La présente invention a en outre pour objet des vecteurs caractérises en ce qu'ils contiennent une séquence selon l'invention telle que décrite ci-dessus Un tel vecteur peut contenir tout autre séquence d'ADN nécessaire à l'expression de la protéine, ou de l'ARN, d'intérêt thérapeutique dans les tissus cibles, et en particulier peut contenir une origine de réphcation efficace dans les celluies des artères, en particulier dans les cellules du muscle lisse
Un tel vecteur peut comprendre des séquences permettant la recombinaison homologue chez l'organisme traité, spécifique du gène a remplacer, lesdites séquences étant placées en amont et en aval de la séquence selon l'invention Du fait de la présence de telles séquences, le gène non désiré, présent dans l'organisme traité sera remplacé par le gène porté par le vecteur ou la séquence et que l'on désire voir s'exprimer dans l'organisme
Une telle méthode de recombiπaison homologue peut être du type de celle décrite par Le Mouellic et al , (1990, Proc. Nat Acad Sa USA , 87, 4712-4716) ou dans la demande PCT WO 91/06 667
Un tel vecteur peut être un vecteur dérivé d'un adénovirus Des adénovirus adaptes a la mise en oeuvre de la présente invention sont en particulier ceux décrits par FELDMAN et STEG (1996, précédemment cité) ou OHNO et al (1994, Sciences, 265, 781 -784) ou encore dans la demande FR 94 03 151 (Institut Pasteur, Inserm) Ces virus sont généralement rejetés par l'individu, du fait de leur trop forte immunogenicité Néanmoins, des souches de ces virus ont ete sélectionnées afin de diminuer leur caractère immunogène En tout état de cause, ces vecteurs, même présentant une forte immunogenicité, peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention, car les artères sont traitées durant des périodes de temps relativement courtes, de l'ordre de quelques semaines, compatibles avec les temps de rejet des adénovirus par le système immunitaire de l'hôte On notera néanmoins que l'introduction des séquences selon la présente invention dans les vecteurs décrits ci-dessus n'est pas indispensable, et que les cellules des artères peuvent être directement traπsfectees par de l'ADN comprenant ces séquences Les séquences nucléiques selon la présente invention peuvent être introduites après couplage covalent de l'acide nucléique avec des composés favorisant leur pénétration dans les cellules ou leur transport vers le noyau, les conjugués résultants étant éventuellement encapsulés dans des microparticules polymères, comme dans la demande internationale WO 94/27238 de Meidsorb Technologies International
Selon un autre mode de réalisation, les séquences nucléiques peuvent être incluses dans un système de transfection comprenant des polypeptides favorisant leur pénétration dans les cellules, comme dans la demande internationale WO 95/10534 de Seikagaku Corporation
Ces vecteurs ou séquences peuvent être administrés in situ par tout moyen connu de l'homme du métier Ainsi, ils peuvent être délivrés in situ à l'aide d'un cathéter à ballonnet recouvert de canaux, tel que décrit par FELDMAN et STEG (1996, précédemment cité)
Ils peuvent aussi être administrés au cours d'une opération, ou en dénudant l'aorte Un autre mode d'administration consiste à introduire un grillage de faible maillage imprégné d'ADN comprenant ces séquences, le long de l'aorte , tel que décrit par Feldman et al (1995 J Clin Invest 95 2662-2671 )
Ces séquences ou vecteurs peuvent avantageusement être administrés sous la forme d'une composition les contenant, par exemple dans un gel facilitant leur transfection dans les cellules des artères Un tel gel peut être un complexe de poly-L lysine et de lactose, tel que décrit par MIDOUX (1993, Nucleic Acid Research, 21 , n°4, 871 -878) ou du poloxamer 407 tel que décrit par PASTORE (1994, Circulation, 90 I- 517) lis peuvent aussi être mis en solution dans une solution tamponnée ou être associés à des liposomes
La présente invention est en outre relative à des médicaments contenant de telles séquences, vecteurs ou compositions, ainsi qu'à des compositions pharmaceutiques les contenant en quantités pharmaceutiquement efficaces ainsi que des excipients pharmaceutiquement compatibles
De tels séquences, vecteurs ou compositions peuvent être avantageusement utilises pour la fabrication de médicaments pour la délivrance au niveau des artères d'un ADN (ADNc ou ADN géπomique) pouvant exprimer notamment un gène codant pour une protéine d'intérêt, pour le traitement des maladies coronariennes, et en particulier pour le traitement de la resténose Elles peuvent néanmoins être aussi utilisées pour la fabrication d'un médicament pour le traitement de mutations fragilisant les vaisseaux Un tel médicament pourrait, par exemple, comprendre une séquence ou un vecteur selon l'invention capable d exprimer un gène codant pour une protéine normale de la desmine ou une protéine d'adhésion du muscle du type CAM
La présente invention a aussi pour objet des ARN exprimés à partir des séquences et vecteurs objets de la présente invention, et en particulier des ARN messager
La présente invention a aussi pour objet un procédé de criblage de molécules m vitro, en vue de tester leur activité sur les séquences régulatrices du gène codant pour la protéine SM 22 Un tel procédé comprendra, par exemple, une première étape suivant laquelle on transfecte des cellules avec une séquence ou un vecteur selon l'invention comprenant un gène reporteur placé sous le contrôle de tout ou partie de la séquence du promoteur du gène codant pour la protéine SM 22 Dans une seconde étape, les cellules ainsi transfectées sont incubées en présence de la molécule à tester, puis l'expression du gène reporteur est quantifiée
Les cellules utilisées pour la transfection sont avantageusement des cellules de muscle lisse, en particulier des cellules de l'aorte, soit sous la forme d'une culture primaire, soit sous la forme d'une lignée cellulaire stable
Dans le cas ou les cellules sont transfectées par des constructions telles que p2126nlz ou p2126INTnlz, la quantification de la bêta-galactosidase produite sera avantageusement effectuée par lecture optique, par exemple en utilisant la trousse de détection commercialisée par Boehπnger sous la référence 1 669 893 (catalogue Boehππger- Mannheim - « Biochemicals » 1996, page 236. béta-Gal Reporter Gène Assay, Chemilummescent)
Dans un autre mode de réalisation du procédé de criblage in vitro selon l'invention, le gène reporteur est le gène codant pour la luciférase Dans ce cas, la quantification de l'expression de la luciférase est avantageusement effectuée par chimioluminescence, par exemple au moyen de la trousse de diagnostic commercialisée par Boehπnger sous la référence 1 758 241 (catalogue Boehπnger-Mannheim « Biochemicals », 1 996, Luciférase Reporter Gène Assay) La présente invention est aussi relative à des animaux transgéniques et en particulier des souris portant une séquence ou un vecteur tel que défini ci-dessus dans lequel le gène codant pour la protéine d'intérêt thérapeutique est remplacée par un gène reporteur
La présente invention est enfin relative à un procédé de détection de mutations de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM22 De telles mutations sont en effet susceptibles de modifier l'expression du gène codant pour la protéine SM22, en particulier diminuer ou même abolir l'expression de ce gène dans les muscles lisses De telles mutations seraient de nature à entraîner une modification du fonctionnement du muscle lisse, la protéine SM22 étant apparentée à une famille de protéines impliquées dans la régulation de la fixation du calcium, du type calponme (Ayme-Southgate et al 1989, J Cell Biol ) Un tel procédé de détection de mutations peut être avantageusement le procédé objet de la demande de brevet français FR-93 10821
De manière complémentaire, des séquences selon l'invention modifiées de telle sorte qu'elles permettent une augmentation de l'expression du gène SM22 font également partie de l'invention
De telles souris transgéniques peuvent être utilisées pour cribler des molécules pour leur activité sur les séquences régulatrices gène codant pour la protéine SM 22 Des molécules peuvent être administrées à des souris, puis après sacrifice, des coupes histologiques sont effectuées afin de mettre en évidence les tissus colores par le gène reporteur Pour la mise en oeuvre de la présente invention, l'homme du métier pourra avantageusement se référer au manuel suivant "SAMBROK et al (Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spπng Harbor
Laboratory Press, New York, 1989), ou à l'une de ses récentes rééditions
La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent
La figure 1 représente la carte de restriction et la structure exon/intron du site SM 22, comprenant la région -2474 à +6030 (par rapport au site d'initiation de la transcription). Les exons sont représentés par des carrés blancs tandis que les flèches indiquent la position des séquences répétées de type B1
La figure 2 représente l'alignement de trois séquences répétées de type B1 , dans lesquelles les échanges de base sont indiquées La figure 3 est un autoradiogramme illustrant l'identification du site d'initiation de la transcription Le puits P correspond à l'amorce utilisée
La figure 4A représente la séquence de la région 5' en amont du site d'initiation de la transcription, et de l'exon du gène SM 22. Les sites de fixation des différents facteurs sont indiqués, ainsi que les différentes séquences concensus. Les lignes discontinues indiquent la position des séquences répétées de type B1 .
La figure 4B est une carte de restriction schématique du gène SM 22.
La figure 4C est une carte de restriction détaillée du gène SM 22.
La figure 5 illustre la fabrication du plasmide p352nlz
La figure 6 illustre la fabrication du plasmide p2126 nlz.
La figure 7 illustre la fabrication du plasmide p2126INTnlz.
Les figures 8A et 8B illustrent l'expression du gène lacZ dans des embryons de souris transgéniques. Les figures 8A, 8B, représentent respectivement des embryons aux stades 12,5 et 15,5 jours.
Les figures 9A à 9D représentent des coupes histologiques d'embryons colorés à l'aide de lacZ. La figure 9A représente une coupe d'un embryon au stade 12,5 jours au niveau du coeur, montrant une coloration intense exclusivement dans le myocarde du ventricule droit (RV) et dans les parois des artères (abréviations AA coude de la quatrième artère aortique , CA artère carotidienne , E oesophage , Iv ventricule gauche PA partie proximale de l'aorte , PT tronc pulmonaire , RA atrium droit RV ventricule droit , T trachée , V veine cardinale droite et gauche) La figure 9B représente une coupe à travers la région abdominale d'un embryon au stade 14,5 jours, montrant une coloration des artères ombilicales (UA) et l'absence de marquage des viscères (B vessie , D duodénum , H gros intestin L foie , M intestin grêle , ST estomac) La figure 9D est une coupe à travers les segments de la queue au stade 12,5 jours montrant le marquage dans le myotome (my) et l'artère de la queue (a)
La figure 9C est un agrandissement de la partie de la photographie correspondant a I artère ombilicale au stade de 12,5 jours, montrant un marquage exclusif de la couche musculaire (m) et une absence de marquage de l'endothehum (e)
Les figures 10A a 10C illustrent l'expression du traπsgene dans des souris adultes
La figure 10A représente une vue de dessus de l'ensemble du coeur montrant un intense marquage de l'aorte (a) et de l'artère pulmonaire (pa) et une absence de marquage de la veine cave (vc) Les figures 10B et 10C sont des coupes à travers la couche de muscle lisse (sm) du colon de l'adulte et d'une artère mésentère adjacente (ma) Le marquage de lacZ (figure 10B) montre que l'expression du transgèπe est restreinte à l'artère tandis que l'immunofluorescence avec des anticorps SM 22 (figure 10C) met en évidence l'expression du gène SM 22 endogène dans les cellules du muscle lisse aussi bien de l'artère que du colon
La figure 1 1 représente un vecteur comportant les régions régulatrices du gène SM 22 et le gène codant la thymidme kmase du virus de l'herpès
Les figures 12A à 12D illustrent l'expression de la construction SM 445 nlz dans des embryons de 15,5 jours p c (figures 12A à 12C) et dans un adulte de 2 mois (figure 12D) EXEMPLES: Matériels et méthodes
1. Clonage et caractérisation du gène de la souris SM 22
Environ 106 phages recombinants d'une banque génomique de souris c57/bl construite dans le phage delta-EMBL 3 (fourni par Dr D Plachov Munster Allemagne) ont été criblées en utilisant le fragment BAL l/Eco RV de 890 bp de l'ADN complémentaire de la protéine de souris SM22 ( Almendral et al, 1989 , Exp Cell Res 181 , 518-530), comme sonde La sonde a ete marquée radioactivement par initiation aléatoire et l'ADN a ete hybπdee sur des filtres laisses durant une nuit a 65°C dans un tampon de Church Les filtres ont été ensuite lavés dans du 0,2 X SSC/0 1 % SDS a 65°c et des plaques positives ont ete purifiées et homogénéisées par trois recriblages successifs dans des conditions identiques L'un des clones isolés s'est révèle contenir un locus SM 22 entier II a été ensuite cartographie à l'aide d'enzymes de restriction et sous-clone Afin d'éviter des réarrangements durant les procédures de clonage, une analyse par hybridation de type Southern de l'ADN génomique de souris et des clones génomiques a été effectuée et les figures de restriction des fragments ont été comparées La séquence du gène SM 22 a été déterminée sur les deux brins par la méthode de terminaison de chaîne ( Sanger et al, 1977, Proc Natl Acad Sci 74, 5463) en utilisant le kit Sequenase V2 0 (United States Biochemical, Clevelaπd, Ohio)
2. Hybridation de type Northern, extension par amorce, 5'RACE, et analyse de protection par RNAse
De l'ARN total de lignées cellulaires et de tissu de souris adulte a été isolée par la méthode de Chirgwiπ et al, (1979, Biochemistry, 1 8 5294-5299) modifiés Pour l'isolement des ARN messager, le kit Oligotex (Quiagen Inc, Chatsworth, CA) a été utilise en suivant les instructions du fabricant
Les analyses par hybridation de type Northern ont été effectuées en utilisant des gels d'agarose contenant du formaidehyde et par hybridation capillaire sur des membranes Hyboπd-N (Amersham Life Science Little Chalfont Royaume Uni) selon les méthodes connus de l'homme du métier Pour les analyses par extension d'amorce un oligonucléotide synthétique de 30 nucléotides (P27N1 ) complémentaire de la séquence +36 a +65 de l'ADN complémentaire du gène SM 22 présentant la séquence SEQ ID N° 6 (5'-AAGGCTTGGTCGTTTGTGGACTGGAAGGAG-3), a ete marque par de la poiynucléotide kinase T4 5 μg d'ARN messager d'utérus de souris ont été hybrides a 55°C avec 1 -2 X 105 cpm de sonde purifiée et la reaction d'extension d'amorce a été effectuée en utilisant les procédures de laboratoire connues de l'homme du métier Les résultats sont analysés par électrophorèse sur des gels de polyacrylamide dénaturants à 6 % Une réaction utilisant la même amorce a été chargée dans un puits adjacent afin de permettre une détermination directe du site d'initiation de la transcription
La méthode 5'RACE a été effectuée en utilisant deux oligonucleotides synthétiques antisens de 18 bp correspondant aux bases +1 12 à +129 (amorce 2) et +162 à +179 (amorce 1 ) de l'ADN complémentaire SM 22, tel que décrit en substance par FROHMAN et al, (1988, Proc Natl Acad Sci, 85, 8998-9002)
En vue des analyses de protection par ia RNase, un fragment obtenu par PCR de 417 bp comprenant la région -352 à +65 du gène du SM 22 a été fabriqué et clone par la méthode des bouts collants dans le site HinC II du vecteur pBluescπpt SK+ La séquence du fragment obtenu par PCR a été vérifiée Afin de générer une sonde ARN antisens marquée radioactivement, la construction a été linéarisée avec Sph I a la position -203 du gène SM 22 et transcrite avec de la RNA polymerase T7 en présence de 32p_Qjp [_a SOnde (3 X 10^ cpm) a été hybπdée avec 5 μg d'ARN messager d'utérus de souris à 42°C durant une nuit Après hybridation les échantillons ont été incubés avec des RNases A et T (1 heure à 37°C), précipités, et analyses comme décrits pour l'analyse par extension d'amorce
3. Culture cellulaire et transfection
Les lignées cellulaires NIH 3T3, 10T1/2 et 8/47 ont été cultivées dans du DMEM (Life Technologies, Inc, Vienne, Autriche) complementées avec 10 % de sérum de foetus de veau (Hyclone Inc , Etats-Unis) a 37°C, dans une atmosphère de Co2 à 7% Pour les expériences de transfection, des cellules confluentes ont été étalées, repiquées dans des boîtes de Petri de 6 cm, et laissées croître jusqu'à obtenir approximativement une confluence de 75 % avant ajout du mélange de transfection.
Les transfections ont été effectuées en utilisant le réactif Lipofectamine commercialisé par Life Technologies Inc .
En résumé 24 μg de Lipofectamine ont été ajoutés à 6 μg de plasmide portant le gène reporteur supereπroulé et 2 μg de PCMVβ gai comme témoin interne Après ajout de 3 ml de DMEM, le cocktail de transfection a été ajouté aux cellules. Au bout de 6 heures, ce mélange a été remplacé avec du milieu de croissance contenant 10 % de sérum et à nouveau changé au bout de 12 heures. L'expression du produit du gène reporteur a été analysée après 24 heures. Pour les expériences de stimulation par le sérum, des cellules transfectées ont été placées dans du DMEM contenant 20 % de sérum, 24 heures avant d'être récoltées
4. Dosage de la CAT et de la β-galactosidase
Les cellules ont été prélevées sur des boîtes de pétri avec un racloir à cellules, centrifugées, resuspendues dans 150 μl de tampon Z (100 mM de phosphate de sodium, pH 7,5, 1 mM MgCI2, 10 nM KCI, 50 nMβ - mercaptoethanol) et lysées par trois cycles de congélation/décongélation. Les débris ont été éliminés par centrifugation à basse vitesse et l'activité de la β-galactosidase a été déterminée à partir de 2 à 20 μl de surnageant selon les procédés connus de l'homme du métier Pour la détermination de l'activité CAT selon GORMAN et al (1982 Mol. Cell. Biol , 2, 1044-1051 ), de 10 à 100 μl de lysat ont été utilisés. Afin de tenir compte des variations dans l'efficacité de transfection. l'activité CAT a été normalisée avec l'activité βgal.
5- Production des souris transgénigues Des mserts des plasmides pnlz2126 et p2126INTnlz. déposés auprès de la CNCM respectivement sous les n°l-1685 et n°l-1686, ont été isolés par digestion avec Sal l/Pme I, suivie d'une électrophorèse sur gel, puis d'une purification utilisant le kit Geneclean (Bio 101 . la Jolla, CA) puis resuspendus dans 10 mM de Tris Hcl pH 7,5, 0,25mM EDTA Les animaux transgéniques ont été produits comme décrits précédemment par Ll et al (1993, Development, 177/3, 947-959)
Des souris portant le transgene ont été identifiées par PCR et hybridation de type Southern en utilisant une sonde ADN La construction pnlz2126 a permis d'obtenir trois animaux positifs sur 17 souris, deux d'entre elles transmettant et exprimant cette construction
Pour la construction p2126INTnlz deux animaux positifs sur les 28 testés ont été obtenus et a nouveau un seul exprime et transmet cette construction Les souris transgéniques ont été rétro-croisées avec des souris c57/bl et les colorations histochimiques ont été effectuées avec des souris hemizygotes pour le transgène 6. Colorations histochimigues Des embryons entiers ou des tissus d'adultes ont été fixés durant 15 à 30 minutes a 4°C dans du formaldéhyde à 1 % dans du tampon A (100 mM de phosphate de sodium , pH 7,3,2 mM Mgcl2, 0,1 % de sodium de deoxycholate, et 0 2 % NP-40). Après rinçage, les spécimens ont été colorés durant une nuit à 30 °C dans du tampon A contenant 1 mg/ml de X - gai (Sigma, St Louis, Missouri), 5 mM de ferrocyanure de potassium, 5mM de ferπcyanure de potassium, et 20 mM de Tns-CI pH 7,3 Les échantillons colorés ont alors été rincés, déshydratés à l'aide de concentrations croissantes d'éthanol, clarifiés dans du xylène, et enrobés dans de la paraffine Les coupes histologiques ont été effectuées avec une épaisseur de 7 à 10 μm et à nouveau colorées avec de l'hématoxlme d'Ehrhch et de l'éosiπe Les embryons ont d'autre part pu être a nouveau clarifiés à l'aide d'un mélange d'alcool benzylique et de benzoate de beπzyle
Pour rimmunohistocoloration, les tissus de souris ont été fixes dans 3 % de paraformaldéhyde dans du tampon PBS à 4°C durant 3 heures, puis enrobés dans un milieu Tissue-Tek (Reichert-Jung, Vienne) et sectionnés sur un cryo-microtome a des épaisseurs de 5 à 10 μm Les coupes sélectionnées ont été montées et colorées en utilisant un anticorps monocloπal dirige à rencontre de la SM 22 (Duband et al, 1993, Differentiations 55, 1 -11 ), à une dilution 1/30 ainsi qu'en utilisant un anticorps secondaire marqué Cy3 (Biological Détection Systems USA) Les coupes ont été examinées à l'aide d'un microscope a fluorescence
EXEMPLE 1.
Caractérisation du locus SM 22 Le criblage par hybridation de la banque génomique de souris a conduit a l'isolement de trois clones se recouvrant, contenant le gène complet de la SM 22 Une carte de restriction, qui est partiellement reproduite sur la figure 1 a été établie et les exons ont été localisés par hybridation à l'aide de sondes ohgonucléotidiques synthétiques Les régions présentant un intérêt ont été sous clonées et séquencées
La séquence a été déterminée entre les positions -2474 et +1 10 en aval du site de polyadenylation et a été comparée dans la banque de données EMBL Le gène couvre 5923 bp à partir du site de début de la transcription jusqu'au site de polyadenylation et la séquence codante est partagée en 5 exons (figure 1 ) Toutes les frontières exon-mtron correspondent à des séquences consensus
Le premier exon contient seulement une séquence ieader en 5' et le codon de départ de la transcription est donc localisé dans le second exon séparé du site de départ de la transcription par plus de 4kbp de séquence d'intron
Deux signaux de polyadenylation potentiels ont été localisés au position 5905 et 5913 et plusieurs régions TGT placées en aval du site de polyadenylation, prennent vraisemblablement part dans la terminaison de la transcription
L'analyse de la séquence révèle de plus la présence de trois séquences répétées (figure 2) qui présentent des homologies importantes avec les éléments répétés de type B1 , dont certains sont transcrits par la RNA polymérase III et codent pour des ARN 5S On notera que toutes les séquences répétées sont dans une orientation inverse par rapport au locus SM 22
Le site de départ de la transcription a été cartographiée par analyse par extension d'amorce (figure 3) Un oligonucléotide antisens complémentaire de l'extrémité 3' de l'exoπ 1 conduit à l'obtention de quatre produits d'extension qui diffèrent seulement par une paire de bases (bp) en longueur, le plus long d'entre eux étant de 65 bp. Le produit de la transcription démarre donc avec un G, 77bp en amont du codon d'initiation de la transcription.
Les produits d'extension les plus courts ont été vraisemblablement causés par une terminaison prématurée de l'extension de l'amorce due à des modifications (cappmg) à extrémité 5' de l'ARN messager
Ces résultats ont été confirmés par l'analyse par protection par la
RNAse , qui conduit à un fragment protégé de 65bp et par le clonage et le séquençage du produit d'extension dérivé d'une réaction indépendante avec une amorce antisens située dans le second exon du gène
Ces résultats sont en accord avec ceux de Solway et al ( 1995 précédemment cité). Des différences de séquences mineures entre ces deux résultats sont vraisemblablement dues à des variations alleliques entre les différentes souches de souris.
La séquence TTTAAA en position -28bp (figure 4) est en relation étroite avec la séquence TATAAA et a vraisemblablement la fonction d'une boîte TATA L'analyse par ordinateur de la séquence en 5' révèle la présence de plusieurs sites potentiels de liaison pour des facteurs ainsi que pour des éléments qui sont connus comme contribuant à la régulation de la transcription de gène musculaires (figure 4). Au total 1 1 boîtes de type E (CANNTG), quatre motifs du type Mef-2/rSRF (YTAWAAATAR), quatre éléments de liaison SRF potentiels (CC(A/T)6GG), cinq sites de liaision AP-2 (CCCMNSSS) et cinq motifs SP1 (GGGCGG) ont été localisés. Enfin, un élément similaire au motif TGT3-3, récemment identifié comme site de liaison d'un facteur nucléaire du muscle lisse et comme contribuant à la régulation de la transcription de l'actine alpha du muscle lisse, a été localisé (figure 4) EXEMPLE 2 Clonage et construction de plasmides recombinants pour la création de souris transgénigues 1. Fabrication de pnlz
Le plasmide pGEM7 (c'est-à-dire le plasmide pGEM-72F (+/-), commercialisé par Promega Corp., Madison, Wi, USA. Séquences disponibles dans Gen Bank, sous les numéros suivants • X65310 et X 6531 1 ) comprend un gène de résistance à l'ampiciliine, un gène lac Z et une origine de réphcation II comprend 3000 paires de base II a été digéré avec Nae l/Bsp 1201 L'extrémité sortante Bsp 1201 du vecteur a été rendue « bouts francs » avec l'enzyme de Klenow, et le plasmide a été refermé en présence d'un hnker Sal I de 10 pb Le fragment lacZ de pGEM 7 a donc été délété, un site Sal I introduit, et un site Bsp 1201 restauré
Un site Pme I a été introduit par insertion d'un hnker Pme I avec des extrémités simple-brin sortantes Nsi I, dans le site Nsi I de la construction
Finalement, le gène lacZ couplé au signal de localisation nucléaire a été isolé à partir de pDes2.2πlz (Ll et al, 1993, précédemment cité) avec Hind III et Sac I donnant deux fragments du gène rapporteur
Les deux fragments ont été insérés entre les sites Hind III et Sac I du vecteur pGEM7 modifié et vérifiés pour leur orientation Cette procédure donne le vecteur pnlz sans promoteur
2. Fabrication de p352nlz
La figure 5 illustre la fabrication de ce plasmide
Un fragment PCR de 417 pb couvrant la région -352 à +65 du gène SM 22, dont la séquence se retrouve dans la séquence SEQ ID N° 1 qui comprend l'enchaînement des nucléotides - 2126 à + 4135, a été produit et inséré dans le site Hinc II rendu bout-franc du vecteur pBluescrιptSK+ La séquence du fragment PCR a été vérifiée Le fragment est récupéré par les sites Xba I et Xho I et inséré dans le plasmide pBLCAT 3 dans les sites correspondants, générant le recombinant p352CAT Pour créer p352nlz, le fragment Xba l/Xhol de p352CAT a été inséré dans les sites correspondants de pnlz
3. Fabrication de p2126nlz
Pour créer p2126nlz, un fragment Bsp 1201/Sph I de 1 ,9 kb recouvrant la région -2126 à -206 du locus SM 22, dont la séquence se retrouve dans la séquence SEQ ID N° 1 qui comprend l'enchaînement des nucléotides - 2126 a + 4135, a été inséré dans les sites respectifs de p352nlz Ce plasmide a été déposé le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le n° 1-1685 Sa fabrication est illustrée par la figure 6 4. Fabrication de p2126INTnlz
La fabrication de ce plasmide est illustrée par la figure 7 Un fragment Bsp 1201/Hιnd III de 5,8 kb recouvrant la région -2126 a +3651 du locus SM 22 a été inséré dans les sites correspondants de pnlz donnant pINt-nlz Ensuite un fragment PCR de 496 pb de la base +3648 a +4143 du locus SM 22 a été généré en utilisant une amorce en amont et une amorce en aval conçue pour introduire un site Hind III en position 41 35-4140 Ce produit de PCR a été digéré avec Hind III et hé dans le site Hind III de pINT-nlz pour donner p2126INT-nlz La construction p2126INTniz contient donc 2126 paires de bases de la région en 5' du début de transcription, le premier exon, le premier intron entier et 15 paires de bases du deuxième exon avec les quatre dernières paires de bases mutées de CATG en GCTT pour éliminer le codon d'initiation de traduction et introduire un site Hind III comme mentionné ci-dessus La partie de l'insert dérivé du promoteur de SM 22 contenu dans le plasmide p2126 INTnlz est constitué par la séquence SEQ ID N°1 Ce plasmide a été dépose le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le n°l-1686 Sa fabrication est illustrée par la figure 7 EXEMPLE 3 : Expression des constructions p2126 nlz et p2126 INTnlz dans les animaux transgénigues
Deux constructions utilisant le gène reporteur lacZ avec signal de localisation nucléaire du virus SV 40 ont été fabriquées, comme décrit dans l'exemple 2 La première construction, p2126nlz contient 2126 bp de la région en amont et le premier exon (65 bp) La seconde construction p2126INTnlz est identique à la première à l'exception de l'addition du premier intron et des premières 12bp du second exon
Comme indiqué dans la partie Matériel et Méthodes, chacune des constructions a donné naissance à au moins une souris transgénique exprimant le gène reporteur
Les embryons obtenus de 12,5 à 15,5 jours après le coït (dpc) ont été colores de manière a mettre en évidence l'activité βgai Les expressions des deux constructions sont identiques, à tous les stades observés bien que p2126INTnlz donne une coloration un petit peu plus intense
L'expression a ete détectée en premier lieu au jour 8 5 dans la région du coeur de l'embryon et dans les vaisseaux de l'enveloppe cardiaque Au jour 9 5 l'expression de lacZ dans le coeur augmente et est confinée au ventricule droit aux artères
Entre 12,5 et 15 5 jours une ségrégation du marquage en fonction des régions devient évident, le marquage étant confiné au ventricule droit (figures 8A et 8B) Les coupes montrent que l'expression a heu dans le myocarde du ventricule droit, avec des marquages mineurs dans le ventricule gauche et dans l'adrium droit (figure 9A)
Cette expression dans le coeur est seulement transitoire et n'apparaît pas chez l'adulte Elle est vraisemblablement inhibée dans les phases tardives du développement des foetus L'expression précoce est aussi observée dans les segments du rostre à partir de 9,5 jours qui s'étend aux segments caudaux à 10,5 jours, et atteint des niveaux importants à 11 ,5 jours
L'expression diminue à partir de 12,5 jours dans les segments du rostre (figure 8B) et finalement n'est plus détectable à 14,5 jours (figure 10E)
Les coupes montrent que l'expression du transgène est restreinte à la région myotomale des segments (figure 9 D)
La plus grande partie de l'expression a heu dans le système vasculaire de l'embyron en développement A partir de 9,5 jours, l'expression est détectée dans l'aorte dorsale A 10,5 jours, la coloration de l'aorte dorsale et des coudes aortiques augmente et à 11 ,5 jours l'expression lacZ est clairement visible dans l'aorte dorsale, les coudes aortiques, les artères iliaques, les artères ombilicales, les artères de la carotide et dans les vaisseaux majeurs de la tête L'expression du transgène dans les vaisseaux augmente à partir de
12,5 jours date a laquelle les vaisseaux intercostaux peuvent être facilement vus (Figure 8A)
A 15 5 jours (figure 8B) lacZ est présent dans les vaisseaux majeurs, incluant ceux des membres et de la queue, et la coloration du tronc pulmonaire devient visible L'expression dans le système vasculaire persiste chez l'adulte et est clairement visible dans l'aorte, dans le tronc pulmonaire et dans l'artère pulmonaire droite (figure 10A), ainsi que dans les vaisseaux des intestins (figure 10B), dans la vessie et dans l'utérus Des coupes histologiques révèlent mieux les différences dans l'expression du transgène dans les artères et dans les veines. La section de l'embryon à 12.5 jours (figure 9A) montre un niveau d'expression très élevée dans les couches musculaires des artères de la carotide, de ia quatrième artère du coude de l'aorte, du tronc pulmonaire proximal et de la partie proximale de l'aorte ascendante, tandis que les parties gauche et droite des veines cardinales antérieures restent non colorées L'absence d'expression du transgène dans les veines musculaires ressort à l'évidence des coupes du ductus venosus, ainsi que des veines portales et ombilicales La même situation est observée chez l'adulte, où l'expression ne peut jamais être détectée dans les veines caves (figure 10A) ni dans les veines pulmonaires.
Ces observations mettent en évidence des différences qui n'avaient jusqu'alors pas été mises en évidence entre les couches de muscles lisses des artères et des veines. D'autres vues des artères montrent que l'expression est restreinte à la couche de muscles et est absente de l'endothelium (figure 9C).
Il est de plus évident, au vu de l'ensemble des observations (figures 8A, 8B), que l'expression du transgène est absente des muscles lisses des viscères Ceci est inattendu, car le gène SM 22 endogène est supposé être exprimé dans les tissus musculaires lisses vasculaires et des viscères. Dans les coupes histologiques de la région abdominale d'embryon à 14 5 jours, les couches de muscles de l'estomac, de l'intestin et de la vessie en développement sont facilement reconnaissables (figure 9C). L'expression du transgène dans cette région est clairement détectée dans les artères ombilicales, mais pas dans les couches de muscles des viscères de l'estomac, du duodénum, de l'intestin grêle et du gros intestin, et de la vessie, où aucune expression lacZ n'est observée. En outre, aucune expression n'est observée dans l'oesophage et dans la trachée (figure 9A), ainsi que dans les bronches du poumon La coloration du tissu musculaire de l'adulte donne essentiellement les mêmes résultats La figure 10B montre que l'expression du transgene est absente dans les muscles du colon, alors que le vaisseau mésentère est très fortement coloré par lacZ Par contre, la coloration par immunofluorescence de la coupe d'une région intestinale similaire montre que la protéine SM 22 endogène est présente dans les deux tissus (figure 10C) L'absence d'expression du transgène dans les muscles lisses des viscères de l'adulte est de plus confirmée par des colorations de l'oesophage, de la trachée, de la vessie du canal déférent et de l'utérus pour l'activité βgal En aucun cas, il ne peut être détectée une expression βgal dans les couches musculaires de ces tissus
Curieusement, une coloration importante est observée dans le cytoplasme des cellules epithéhales du lumen du canal déférent et dans l'épithéhum des conduits rénaux Ceci est vraisemblablement dû à une activité galactosidase endogène, la coloration étant aussi visible dans les animaux non transgéniques témoins
EXEMPLE 4 :
Fabrication d'une construction comportant des régions régulatrices du gène SM 22 et le gène codant la thymidine kinase du virus de l'herpès (SM 22 INT-TKl.
Le fragment HIV-LTR (-167, + 80) est délété du plasmide pLTR- TK par digestion Hind III dont les extrémités sont rendues bout franc avec l'enzyme de Klenow, suivie d'une digestion Xho I Le plasmide refermé en insérant un hnker contenant les sites Xhol en 5', les sites Hind III et Bsp 1201 dans l'ordre 5'->3' et une extrémité 3' bout-franc pour donner le vecteur p-TK Un fragment Bsp 1201/Hind III de 5.8 kb recouvrant la région -2126 à + 3648 du locus SM 22 est inséré dans p- TK pour obtenir SM 22 INT-TK Ce fragment est compris dans l'enchaînement de nucléotides de la SEQ ID N°1
Cette construction est schematiquement représentée sur la figure 1 1
EXEMPLE 5:
Fabrication du plasmide p445 nlz portant le fragment -445 à + 65 du gène SM22 fusionné au gène lacZ, et obtention de transgènes Matériels et méthodes Construction de p445nlz
Le plasmide p2126nlz a été coupe par Xba I qui a un site unique dans le « polyhnker » en 5' en amont de la séquence SM 22 Les extrémités 5' protudaπtes du fragment ont été remplies à l'aide de la polymérase Klenow, par du dNTP
Après précipitation le fragment a été coupé par Pst I qui a un site unique en position -445 relativement au nucléotide +1 de début de la transcription Les extrémités 3' protudantes de la coupure Pst I ont été hydrolysées à la polymérase Klenow sans dNTP Le fragment comprenant les séquences plasmidiques plus la séquence SM 22 de - 445 à + 65 fusionnée au gène lacZ a été purifié à partir d'un gel d'agarose et refermé par la ligase T4 Pour les expériences de transgénèse le fragment injecté dans les oeufs de souris a été purifié à partir d'une double digestion Pst 1/Nsι I du plasmide p2126nlz
Les résultats obtenus avec cette construction et ceux obtenus avec p2126 INTIacZ et p2126lacZ pour comparaison, figurent dans le tableau ci-après
Les propriétés de régulation transcπptionnelle de la séquence du gène SM 22 entre les nucléotides -445 et +65 ont été analysées in vivo dans des souris transgéniques par deux méthodes La première méthode appelée analyse transitoire consiste à analyser le patron d'expression du gène lacZ directement dans les embryons fondateurs FO à un stade donné La deuxième méthode consiste à établir des lignées stables à partir de fondateurs FO adultes 1. Analyse transitoire
L'analyse transitoire a permis d'obtenir quatre embryons ayant intégré le transgène p445πlz dans leur génome sur un total de 1 3 embryons Parmi les quatre embryons positifs analysés à 12.5 jours de développement un embryon n'exprimait pas le transgène Deux embryons présentaient un patron d expression identique à celui de la lignée p2126 INT nlz au même stade, c est-à-dire spécifique des cellules musculaires lisses artérielles et enfin un troisième embryon présentait les mêmes territoires d'expression artérielle additionnés de divers sites d'expression ectopique essentiellement diffus dans le mésenchyme embryonnaire
2. Lignées stables Deux lignées stables indépendantes ont été établies à partir d'un mâle (lignée n°1 ) et d'une femelle (lignée n°9)
L'expression du transgene a été analysée dans l'embryon au stade
15,5 jours pour la lignée 1 et 17,5 jours de développement dans la lignée 9 Les deux lignées présentent le même type d'expression dans les artères au niveau du coeur, le transgène est exprimé dans l'aorte dorsale et le tronc pulmonaire artériel
A la différence des lignées obtenues avec les transgènes p2126nlz et p2126 INTnlz, les deux lignées p445nlz expriment lacZ très fortement dans les parois de l'oesophage et de la trachée respiratoire qui sont composées de muscle lisse à ce stade
Les deux lignées présentent des différences entre elles dans certaines régions de l'embryon Pour la lignée nD1 , le transgene s'exprime fortement dans les bronchioles en continuité de la trachée à 15,5 jours ce qui n'est pas observé dans la lignée n°9 à 17,5 jours où lacZ n'est trouvé que dans la trachée Cette différence peut être due soit à une modification de la régulation due à des sites d'intégration différents dans les deux lignées, soit à la différence de stade qui fait que l'expression de lacZ peut être réprimée entre le jour 15,5 et 17,5
Dans les deux lignées on trouve donc une expression du transgène dans des organes qui contiennent une forte composante de cellules musculaires lisses II est intéressant de noter qu'il s'agit d'une partie au moins des cellules musculaires lisses de type respiratoire, la trachée, et une partie des cellules musculaires lisses de type viscérai, l'oesophage
Enfin des sites d'expression ectopiques différents, c'est-à-dire où la présence de la protéine ou de l'ARN SM 22 endogène n'a pas été reportée, ont été trouves dans les deux lignées La lignée 1 présente entre autre une expression forte très localisée dans les deux doigts postérieurs de chaque membre La lignée 9 exprime fortement lacZ dans les régions antérieures du cerveau L expression de cette construction à deux stades de l'évolution est illustrée par les figures 12A à 12D qui représentent des embryons de 15.5 jours p c (12A, 12B, 12C) et un adulte de 2 mois (12 D) SM 445 nlz colorés pour l'activité β-galactosidase. On note l'expression dans le tissu musculaire lisse des artères, de l'oesophage et des bronches sur les figures 12A, B, C ainsi que dans des sites ectopiques comme la moelle épinière (12B) ou les deux doigts postérieurs de chaque membre (12A) On note aussi l'absence d'expression dans l'aorte thoracique ou le tronc pulmonaire artériel chez l'adulte (12D). Seule une expression dans la trachée est maintenue.
Les résultats obtenus montrent qu'une séquence de 450 paires de bases est suffisante pour garder la même expression dans l'embryon et le foetus mais pas chez l'adulte.
TABLEAU
Figure imgf000030_0001
LISTE DE SEQUENCES
1) INFORMATIONS GENERALES i) DEPOSANT
(A) NOM INSTITUT PASTEUR
(B) RUE 28 RUE DU DOCTEUR ROUX (C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75015
(A) NOM: UNIVERSITE PARIS 7
(B) RUE: 1 PLACE JUSSIEU
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75005
(ii) TITRE DE L' INVENTION: SEQUENCES EN AI-.ONT DU GENE S.-J22 ;iii) NOMBRE DE SEQUENCES: S
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
INFORMATIONSPOURLASEQIDNO; 1 :
(i)CARACTERISTIQUESDELASEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6261 paires de bases
(B) TYPE : nuclcoride
(C) NOMBRE DE BRINS : double
(D) CONFIGURATION : linéaire
(ϋ) TYPE DE MOLECULE : ADN (sénomique)
(iii) HYPOTHETIQUE : NON
(vi) ORIGINE :
(A) ORGANISME : SOURIS GG GCCCCAGGAA
TGTGTTTCCT TCTCTCCACC ATGTTTTTAT AGCTCTTGGG CTGGGAGAAG AGGCGGGTCT
GGGTCTTTGT TTCTGAGCTT TGTTCTATGT TCCTCCATGC TACGGTTGCA ATTGTTTTCT
ATGAACGAGT ACATTCAATA .AAGACAACCA GACCTGGGAT TTGGGGTCTT ACTGATGTGT
TGGGAGGTGC AGGAGCCTCC GTGTCCCATT TATTTTGGCC TTCCCGTCTC GTTTCTGTGC
GTGGCTACAT TGGGAATGAC CTTCCTTGAT CCCACCAAGC CACCCATTGA TTCTGTAAAC
A AJGTGACCCT TGCTCCAAGC ATTGCTTACA GGAGCAGGAT ACTGAAAGTG TGTCTGTGCC
CTCTCCTGAT AACCCCTCCC TTCAGCAGGC ACACAGCACC TGACTACCCA CCACGTATGT
AAACGTCAGT ATCCTTTCCA GCCAGCTCTG CAGATGGGTG TCCAGGCTGT GCATGATGCA
CCTCAAGTGG GCAGAGCTTG CAGGCCAAGG TTTTAAAGGC TGTTCAGGAA TGGATGGCAA
GCAGGATCTA AGAGGAGGGG GGGTTGTTGT TGTTTGGGGG GGGGGTGGTT TTGGTTTGTT
TTTTTTGAGA CAGGGTTTCT CTGTGTGGCC CTGGCCCTCC TGGAACCCAC TCTGTAGACC
AGGCTGGCCT TGAACTCAGA AATCTGCCTG CCTCTGCCTC CCGAGTGCTG GGATTAAAGG
Λ Λ (:^C!TGCCCA TCGAGGAGGG AGATTTTATT TAGATTATAA AAAGGACGGG ATTTGGGGAA
^c à cJGτcτAQ TGAATTCAGG ACGTAATCAG TGGCTGGGAA GCAAGAGCTC TAGAGGAGCT
CCAGCTTATT ATGACCCTTC CTTCAGATGC CACAAGGAGG TGCTGGAGTT CTATGCACCA
AIAGCTTAAA CCAGCCAGGC TGGCTGTAGT GGATTGAGCG TCTGAGGCTG CACCTCTCTG
^ JÏCTGCAGCC AGTTCTGGGT GAGACTGACC CTGCCTGAGG GTTCTCTCCT TCCCTCTCTC n Λ^SS£??CC TCCCTCTCCC TCTCCCTCTC TCTGTTTCCT GAGGTTTCCA
VJAAΓTGGGGA
^-ΓÎSS?™ CAG AGACACCACT AAAGCCTTAC CTTTTAAGAA GTTGCATTCA GTGAGTGTGT
Ti^S^SiP ACAGATAGGG GCAGAGGAGA GCTGGTTCTG TCTCCACTGT GTTTGGTCTT τ^??J^GAA CTCAGACCAT CAGGTGTGAT AGCAGTTGTC TTTAACCCTA ACCCTGAGCC n Λ^lCJRA^Cτ GTCCCTTCCC AAGACCACTG AAGCTAGGTG CAAGATAAGT GGGGACCCTT
A JS?" Λ^SPTGG TAGGATCTTT CACGATAAGG ACTATTTTGA AGGGAGGGAG GGTGACACTG
^T^CT^GTCCT CTTACCCTAG TGTCTCCAGC CTTGCCAGGC CTTAAACATC CGCCCATTGT
A A ^S^10™ GAAGGGGCCA CCCTTGACTT GCTGCTAAAC AAGGCACTCC CTAGAGAAGA GTCCACTGTA GGCAGATAGG TGACAGGTGG CAGATAGGTG ACAGATAGGT GACAGGTGGA
GGAGCTTTGG AACTGGGACT GGACAGCCCT GGGACCCTGT TCCTCCCAAA GGGTCTTGGT
GGTTCCCCTT GGGGCTCTCT AAAGGATGTC AGTGGGCTGT TGCCACATCT ATATAAGAGG
ACTAGTCTTC TGGAATTTAG GTGTGATCTC TCAGGGATGC AGAAATGCTC ACCCTTACTG
TCATTTTATG GGCTGAGGTA CCACAGGCAG ATATACCCTG GTCTGCTTGT TGTCCAGGGT
CTCTGCTACA TGGAGGCCCC TTTCCACAGC CTAACCTCTC TACCTGCTGA CAGGAGGGCT
GGATGGCCAC AGGCATCCAA CGTGCGCATC ATGCAGGTGT TTTGCGTTGG AGCTTTTGTC
TAGAAATACC CTGGTGGGCT GCCAAACCAC CACCCATATC CCTCTCTCCT CTCTGCTGCC
TCTAAGATGA CAGCTTGATT TTTCTTATAG TGATTTTTTT TTTTGGTTTT GTTTTTTTGT
TTGTTTTAAG TTAGCATACA AAGTAATACA TTTCATCATG GCATTTGGAC ATACATATAT
ATTTTATTTG CTCTCCTGGC CTCTTCTCAA AGAGACTTCT CTGGACTTTC TTGTATTTTT
GGTTGTGAGC CTAGCCTTTA ACGGCTGAGC CATCTCTCCA GCCCTTCTTT GGACTTTCTA
CTTCATACTT CCCACCAGTC TGGGAAGAAG GGCACATGGA ATCTTGAGAG CATGACCTGA
CCCAGACCTG ACAGATGTCA AGGCTGCAGT GTATGCTCTT GTTCGTACGG CTTGTTCTTA
GTCCTGCAGT TCAGAACTTT CTGGAGACTG AGAAGTGCAT GTGAGGACAC TCTCCTCCCA
TCTTTTCCTC TAGTGGCTAG TGATGTTTGG TTTTTTGTTT TGAGACAGGG TTTCTCTGTA
_IAGCCCTAGC TATCCTGGAA CTCACTTTGT AGATCAGGCT GGCCTCCAAC TCAGAAATCT
GCCTGCCTCT GCCTCCCGAG TGCTGGGACT AAAGGCGTGC GCCACCACTG TCCAGTCAGG
„ A5î.tGAAGGA ^CTCTAAGG TGCTTGAGAC AGGCTGAGTA GAGGCTAGGA GGAAGGGGCA r,Λ,ΞC2CAGTCAC CGGCTCCATG ACTCTGTGAC TTTTGTGGTT CCTTGTCGCA GCGGTTCCTG
Δrïï^ΞSS^ TGGTCGGGG<î TTGGGGGGAG GGGGCAGGCC ACACAGTGGG GTGTGGGAGG r Δ?^AGCyGITGACAACTTC CCAACAGAAA CCAGGCTTTT GAGTCCTCCA GGGTAGCTTG n A AGA 1 GGGIACT CAGAAAGCCG TGTCCATGTC CCCTTTCCTT CACCTCAGGG AAGTAAGTTG
-rr-^ïïiϋS?31 TGTCATTTCA ATGAGGTCTT CTGGTTATTC TGTTTTTCTC TCAATGTTGG τ J^Y^SS10 AGGGAATGCT TTGGAGAAGG TGGTGGGAAC TGGAGAAGGG .AAGATCAGTT TACCATACCT GTGGGCAGGA TGACCCATGT TCTGCCATGC ACTTGGTAGC CTTGGAAAGG
CCACTTTGAA CCTCAATTTT CTCAACTGTT AAATGGAGTG GTAACTGCTA TCTCATAATA
AAGGGGAACG TGAGGAAGGC GTTTGGATAG TGCCTGGTTG CGGCCAGGCT GCAGTCAAGA
CTAGTTCCCA CCAACTCGAT TTTAAAGCCT TGCAAGAAGG TGGCTTGTTT GTCCCTTGCA
GGTTCCTTTG CTCGGGCCAA ACTCTAGAAT GCCTCCCCCT TTCTTTCTCA TTGAAGAGCA
GACCCAAGTC CGGGTAACAA GGAAGGGTTT CAGGGTCCTG CCCATAAAAG GTTTTTCCCG
GCCGCCCTCA GCACCGCCCC GCCCCGACCC CCGCAGCATC TCCAAAGCAT GCAGAGAATG
TCTCCGGCTG CCCCCGACAG ACTGCTCCAA CTTGGTGTCT TTCCCCAAAT ATGGAGCCTG
TGTGGAGTGA GTGGGGCGGC CCGGGGTGGT GAGCCAAGCA GACTTCCATG GGCAGGGAGG
GGCGCCACGG GGCGGCAGAG GGGTGACATC ACTGCCTAGG CGGCCTTTAA ACCCCTCACC
CAGCCGGCGC CCCGGCCCGT CTGCCCCAGC CCAGACACCG AAGCTACTCT CCTTCCAGTC
CACAAACGAC CAAGCCTTGT AAGTGCAAGT CATGGGAGCA GAAGGGCTGT GGGCTCAATT
AGATCCCCTA GTCTCTTCTA GTTTGCTGGG TGGAATTGGG TCCCTAGAGA CCATTCTCTG
TGTTAGACAA AAAGTCTGGG TTAAAATGCC TAGGATGATT TGACTGGGGC AAAAGAATAA
ATGGGGTGAG AGGGAGGCTC AAATTCAGTC ACTGTCCCAC CCATAGGTGT ATGGGCTATG
TGTTAGGCCC AAAGAGGTGA CAAATGAGGC CAAGGGAACA ACTCCATCTT TGGATCTCCA
AGAAGGTGAG GGGCTAAGTT CTGGAAAGCA GTGACCCACT GATGGTCCCC AGGGCTAATG
CAACTCGGGG GAGCCAGGAG GTAGCCCCCT CAGGCAGTGG AGGACTAAAG ATCTTATTTT
TTGTAGCGCT AGGGATCAAA CCCCAGGGCG CTATGTGTGG CAGGCATGTG CTCCATCTAC
CACAGAAGTT TAATCCTTCA GACTAGCCTG GGATAGGGCC TGC1 1 1TTCT TTCCTTTTCT
CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTTT CTTTCCTTTT
CTCTCTTTCA CTCTCTCTTT CT.AATTTCTT TTTCTTTTTT TCTTTCTTTT CTTTAGACAG
GGTTTCTCTG TGTAGCCCTG GCTGTTCTGG AACTCACTCT TTAGACCAGG CTGGCCTCGA
ATCTCAGAAA TCTACCTGCC TCTGCCTCCC AAGTGCTGGG ATTAAAGGCG TGTGCCACCA
CTGCCCAGCT AAGGTTTGCT TTTTGATGGC AGCTTGGTCC AGTTTGAAAG TAGGAGGTCA TACTGTGTAA ACTCACTGGT TAAAGTACCC CCTCCCTTCC ACCCTGCAAT ACACACACAC
ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACCCCATCTC GAAGAGCTCT ATTAAGCTCC
AGGTGCACTG TAGTTCACAG ACTGCATCTT CCAGGTTTGC TCCCACTTCA CAAGCAGAGA
ACTCATAACT GAAGGGGGTG ACAGCACAGG GGAAGGGAAA GCAAGATGTT TAGAGTCTGA
CAGCTGGCCC GGGACCAGAG CCATGTGGTA ATGTTTGCTC CACTCCCATC CACCTCCACG
GCTGTGATGT GGAGAAGGTC CCCGCTTTCA TGGGAAGGAG GTGGGGGAGC CTGTCATCTG
CTCCATGCTC ACACAATTTT TCTCTCAACC AATGACCTCT CAGAAGCAGG GGTTGGTTTG
CAAAATTCTT CAGATACCTC AACAGATGGC ATCCCACTCA GGCTATCCCT GCTGACTAGG
TCTGGCTCCA GCCCTGACTG TATCTACCCA GGGACCTACC TGCCTGCTTT GCTCCTATAG
CCTTCCTCCG TGTCTGGGTC CCCAGAGAGC TGCCGGCATA GGCCTTTGAG GCAACAGCTG
GCATACAGGC CAGGCTTCCC ATGCTCTGGC TAGCAGATTC TCTGCCCTGG AGGACTTTGA
CTGCATGGTT TCTCTCACTG CTGCAACAGT CAGAGCTGGC CCACACGGGC ACAACAGCGC
ACTTCCATCT GGGTCTCCCT GAGAATGCCG CTGTTTTCTG AGAACCCTTG GACTCTGGTG
GCTTTATCAG GTCTTTTTGT CAGCTGCGCT TTGGGGGATG AACTTTGCTC TTCTGGCTTC
TGGGTCAGAG GGTAAAGATT TGGTGGCAAC CGGTAGCTAG AGAAAGATAG CTACTGGCTG
AATTTGGAGG ACATGGCTTC TGGAAAACCT CTCTAGTGCT TTTCTGGCTA GTCTTGGCAA
AGTAAAAATG CTCTGATAGC CAGCCCGGGT GATGCAGGGC TTCCTGTTCG AGGCCTTTCT
GTACAAAATT AGTGAGACAT TGCCTCAAAA CTATGAAACA AGCCAGACTC TGTTGAAGCA
CGCCTTTAAT CCCAGCACTC AGGAGGCTGA AGCAGGCAAG ATCTCTGTTA GTTGGAGGCC
AGTCTACAGG AAAGTTCTAC AACAGCAGAG GCCAGACAGT GCAACCCTTT CTGGGGGTGT
Λ ^(??Λ K32AGGAA AACGGAACA.A AAACACAAAC TATAAAACAA AGAGAAGGCC GAGGACAAAG
™ITAGCAATG CATACTTCCC TTTCTATGTG AAGCCCTGGG CTCCACCAGT ACTGCAGAAA
„ GAAGCAAGCA ATGAGGGACA GGAGGTTGGC TCTAGGCCCA GGGGTTGTCA AAATAGTCCA
^AGGCCAAAG OCAGCCTGAT GTCTGTTTTT ATAAACAAAA TTTTATTGGC ACACATTGGT
TATGTATCAG CTAGGCTATT TTCATTACAA TAGAGGCCAT ATGGTCTGTA AAGTCTAAAA TATTTACTCT GCTGTTTTAC ATAAAAAGTT GACAGACTCT TGCTCTAGAC TGACAAATAT
CTAAGACCTT GTTTTCTGAG GTTCAAGTTT CAGAGGGGTC TCTGCAGCAA GTGGGTAAAG
CTGGTCTAGG TCATGCTATG ATGTCTAGGG TCCCCTCAGA GTGGAAGGCC TGCTTAGCAC
AAATGAAGTA AAGTAACTTG CTGGCTCTTT GTTCTTTTCT CCACACTCTA TACTTTAGCT
CTGCCTC
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2190 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: SOURIS
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2 : GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCATGTTTTT ATAGCTCTTG GGCTGGGAGA AGAGGCGGGT CTGGGTCTTT GTTTCTGAGC TTTGTTCTAT GTTCCTCCAT GCTACGGTTG 1 CAATTGTTTT CTATGAACGA GTACATTCAA TAAAGACAAC CAGACCTGGG ATTTGGGGTC 1
TTACTGATGT GTTGGGAGGT GCAGGAGCCT CCGTGTCCCA TTTATTTTGG CCTTCCCGTC 2-
TCGTTTCTGT GCGTGGCTAC ATTGGGAATG ACCTTCCTTG ATCCCACCAA GCCACCCATT 3(
GATTCTGTAA ACATGTGACC CTTGCTCCAA GCATTGCTTA CAGGAGCAGG ATACTGAAAG 3;
TGTGTCTGTG CCCTCTCCTG ATAACCCCTC CCTTCAGCAG GCACACAGCA CCTGACTACC 4:
CACCACGTAT GTAAACGTCA GTATCCTTTC CAGCCAGCTC TGCAGATGGG TGTCCAGGCT 4Î
GTGCATGATG CACCTCAAGT GGGCAGAGCT TGCAGGCCAA GGTTTTAAAG GCTGTTCAGG 5-'
AATGGATGGC AAGCAGGATC TAAGAGGAGG GGGGGTTGTT GTTGTTTGGG GGGGGGGTGG 60
TTTTGGTTTG TTTTTTTTGA GACAGGGTTT CTCTGTGTGG CCCTGGCCCT CCTGGAACCC 6(
ACTCTGTAGA CCAGGCTGGC CTTGAACTCA GAAATCTGCC TGCCTCTGCC TCCCGAGTGC 7:
TGGGATTAAA GGCGTGTGCC CATCGAGGAG GGAGATTTTA TTTAGATTAT AAAAAGGACG 7E
GGATTTGGGG AATCCTGTCT AGTGAATTCA GGACGTAATC AGTGGCTGGG AAGCAAGAGC 8^
TCTAGAGGAG CTCCAGCTTA TTATGACCCT TCCTTCAGAT GCCACAAGGA GGTGCTGGAG 9C
TTCTATGCAC CAATAGCTTA AACCAGCCAG GCTGGCTGTA GTGGATTGAG CGTCTGAGGC 96
TGCACCTCTC TGGCCTGCAG CCAGTTCTGG GTGAGACTGA CCCTGCCTGA GGGTTCTCTC 102
CTTCCCTCTC TCTACTCCTT CCTCCCTCTC CCTCTCCCTC TCTCTGTTTC CTGAGGTTTC 10E
CAGAATTGGG GATGGGACTC AGAGACACCA CTAAAGCCTT ACCTTTTAAG AAGTTGCATT 114
CAGTGAGTGT GTGAGACATA GCACAGATAG GGGCAGAGGA GAGCTGGTTC TGTCTCCACT 12C
GTGTTTGGTC TTGGGTACTG AACTCAGACC ATCAGGTGTG ATAGCAGTTG TCTTTAACCC 12£
TAACCCTGAG CCTGTCTCAC CTGTCCCTTC CCAAGACCAC TGAAGCTAGG TGCAAGATAA 132
GTGGGGACCC TTTCTGAGGT GGTAGGATCT TTCACGATAA GGACTATTTT GAAGGGAGGG 13B
AGGGTGACAC TGTCCTAGTC CTCTTACCCT AGTGTCTCCA GCCTTGCCAG GCCTTAAACA 144
TCCGCCCATT GTCACCGCTC TAGAAGGGGC CACCCTTGAC TTGCTGCTAA ACAAGGCACT 15C
CCCTAGAGAA GATACCATAC CTGTGGGCAG GATGACCCAT GTTCTGCCAT GCACTTGGTA 156
GCCTTGGAAA GGCCACTTTG AACCTCAATT TTCTCAACTG TTAAATGGAG TGGTAACTGC 162
TATCTCATAA TAAAGGGGAA CGTGAGGAAG GCGTTTGGAT AGTGCCTGGT TGCGGCCAGG 168
CTGCAGTCAA GACTAGTTCC CACCAACTCG ATTTTAAAGC CTTGCAAGAA GGTGGCTTGT 174 TTGTCCCTTG CAGGTTCCTT TGCTCGGGCC AAACTCTAGA ATGCCTCCCC CTTTCTTTCT 18 ι
CATTGAAGAG CAGACCCAAG TCCGGGTAAC AAGGAAGGGT TTCAGGGTCC TGCCCATAAA 18 '
AGGTTTTTCC CGGCCGCCCT CAGCACCGCC CCGCCCCGAC CCCCGCAGCA TCTCCAAAGC 19 :
ATGCAGAGAA TGTCTCCGGC TGCCCCCGAC AGACTGCTCC AACTTGGTGT CTTTCCCCAA 19 ,
ATATGGAGCC TGTGTGGAGT GAGTGGGGCG GCCCGGGGTG GTGAGCCAAG CAGACTTCCA 2 0 -
TGGGCAGGGA GGGGCGCCAC GGGGCGGCAG AGGGGTGACA TCACTGCCTA GGCGGCCTTT 21 (
AAACCCCTCA CCCAGCCGGC GCCCCGGCCC GTCTGCCCCA GCCCAGACAC CGAAGCTACT 2 1 -
CTCCTTCCAG TCCACAAACG ACCAAGCCTT 2 1 :
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: -,
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: ιeβ1 .paires de bases
(B) TYPE: nuclέotidV
(C) NOMBRE DE BRINS: doubl >
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ii ) TYPE DE MOLECULE : ADN ( gé nomique )
( i ii ) HYPOTHETIQUE : NON
(Vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: SOURIS
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: -5 GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCATGTTTTT ATAGCTCTTG GGCTGGGAGA AGAGGCGGGT CTGGGTCTTT GTTTCTGAGC TTTGTTCTAT GTTCCTCCAT GCTACGGTTG CAATTGTTTT CTATGAACGA GTACATTCAA TAAAGACAAC CAGACCTGGG ATTTGGGGTC
TTACTGATGT GTTGGGAGGT GCAGGAGCCT CCGTGTCCCA TTTATTTTGG CCTTCCCGTC 2
TCGTTTCTGT GCGTGGCTAC ATTGGGAATG ACCTTCCTTG ATCCCACCAA GCCACCCATT 3
GATTCTGTAA ACATGTGACC CTTGCTCCAA GCATTGCTTA CAGGAGCAGG ATACTGAAAG 3
TGTGTCTGTG CCCTCTCCTG ATAACCCCTC CCTTCAGCAG GCACACAGCA CCTGACTACC 4
CACCACGTAT GTAAACGTCA GTATCCTTTC CAGCCAGCTC TGCAGATGGG TGTCCAGGCT 4
GTGCATGATG CACCTCAAGT GGGCAGAGCT TGCAGGCCAA GGTTTTAAAG GCTGTTCAGG 5
AATGGATGGC AAGCAGGATC TAAGAGGAGG GGGGGTTGTT GTTGTTTGGG GGGGGGGTGG 6
TTTTGGTTTG TTTTTTTTGA GACAGGGTTT CTCTGTGTGG CCCTGGCCCT CCTGGAACCC 6
ACTCTGTAGA CCAGGCTGGC CTTGAACTCA GAAATCTGCC TGCCTCTGCC TCCCGAGTGC 7
TGGGATTAAA GGCGTGTGCC CATCGAGGAG GGAGATTTTA TTTAGATTAT AAAAAGGACG 7
GGATTTGGGG AATCCTGTCT AGTGAATTCA GGACGTAATC AGTGGCTGGG AAGCAAGAGC 8
TCTAGAGGAG CTCCAGCTTA TTATGACCCT TCCTTCAGAT GCCACAAGGA GGTGCTGGAG 9
TTCTATGCAC CAATAGCTTA AACCAGCCAG GCTGGCTGTA GTGGATTGAG CGTCTGAGGC 9 '
TGCACCTCTC TGGCCTGCAG CCAGTTCTGG GTGAGACTGA CCCTGCCTGA GGGTTCTCTC 10
CTTCCCTCTC TCTACTCCTT CCTCCCTCTC CCTCTCCCTC TCTCTGTTTC CTGAGGTTTC 10
CAGAATTGGG GATGGGACTC AGAGACACCA CTAAAGCCTT ACCTTTTAAG AAGTTGCATT 11 -
CAGTGAGTGT GTGAGACATA GCACAGATAG GGGCAGAGGA GAGCTGGTTC TGTCTCCACT 12 '
GTGTTTGGTC TTGGGTACTG AACTCAGACC ATCAGGTGTG ATAGCAGTTG TCTTTAACCC 12
TAACCCTGAG CCTGTCTCAC CTGTCCCTTC CCAAGACCAC TGAAGCTAGG TGCAAGATAA 13
GTGGGGACCC TTTCTGAGGT GGTAGGATCT TTCACGATAA GGACTATTTT GAAGGGAGGG 13 '
AGGGTGACAC TGTCCTAGTC CTCTTACCCT AGTGTCTCCA GCCTTGCCAG GCCTTAAACA 14 *
TCCGCCCATT GTCACCGCTC TAGAAGGGGC CACCCTTGAC TTGCTGCTAA ACAAGGCACT 15 (
CCCTAGAGAA GATACCATAC CTGTGGGCAG GATGACCCAT GTTCTGCCAT GCACTTGGTA 15 {
GCCTTGGAAA GGCCACTTTG AACCTCAATT TTCTCAACTG TTAAATGGAG TGGTAACTGC 16 :
TATCTCATAA TAAAGGGGAA CGTGAGGAAG GCGTTTGGAT AGTGCCTGGT TGCGGCCAGG 16 i C 40
INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: . paires de bases
(B) TYPE : nuclcotide
(C) NOMBRE DE BRINS : double
(D) CONFIGURATION : linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE : NON
(vi) ORIGINE :
(A) ORGANISME : SOURIS
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP TCTAGAGGCC ACGGAACGGT GCCAAGCACA CAGTCCCTTT TGCCTCTTTC ACGGGAGCAG
GAGTCCCAGT GCCTGTCGTG GAAAGGGAGG AACATGCCAG GTCCCTGTGT GTCCTTGGCC
CTGTCTCACC AAAGGACTCA GGGCTGGTTT CTGAGTTTCC GTCCAGTATT TAGCCAAGTC
CTGTGTTAGT CACGTAGGCC TAAGAGCCTT GGCGTTTACA GAGTCACCCA GCTCTGGCCC
CTGGCATTCT GGTCCTTGGC GTTTACAGAG TCACCCAGCT CCAGGCCCCT GGCACTTTGG
TACTTGGTTG CCCTTCACTC CACCAGGTCC ATTCCAGATG CCAAGAGTGG GCCCCAGGAA
TGTGTTTCCT TCTCTCCACC ATGTTTTTAT AGCTCTTGGG CTGGGAGAAG AGGCGGGTCT
GGGTCTTTGT TTCTGAGCTT TGTTCTATGT TCCTCCATGC TACGGTTGCA ATTGTTTTCT
ATGAACGAGT ACATTCAATA AAGACAACCA GACCTGGGAT TTGGGGTCTT ACTGATGTGT
TGGGAGGTGC AGGAGCCTCC GTGTCCCATT TATTTTGGCC TTCCCGTCTC GTTTCTGTGC
GTGGCTACAT TGGGAATGAC CTTCCTTGAT CCCACCAAGC CACCCATTGA TTCTGTAAAC
ATGTGACCCT TGCTCCAAGC ATTGCTTACA GGAGCAGGAT ACTGAAAGTG TGTCTGTGCC
CTCTCCTGAT AACCCCTCCC TTCAGCAGGC ACACAGCACC TGACTACCCA CCACGTATGT
AAACGTCAGT ATCCTTTCCA GCCAGCTCTG CAGATGGGTG TCCAGGCTGT GCATGATGCA
CCTCAAGTGG GCAGAGCTTG CAGGCCAAGG TTTTAAAGGC TGTTCAGGAA TGGATGGCAA
GCAGGATCTA AGAGGAGGGG GGGTTGTTGT TGTTTGGGGG GGGGGTGGTT TTGGTTTGTT
TTTTTTGAGA CAGGGTTTCT CTGTGTGGCC CTGGCCCTCC TGGAACCCAC TCTGTAGACC
AGGCTGGCCT TGAACTCAGA AATCTGCCTG CCTCTGCCTC CCGAGTGCTG GGATTAAAGG
CGTGTGCCCA TCGAGGAGGG AGATTTTATT TAGATTATAA AAAGGACGGG ATTTGGGGAA
TCCTGTCTAG TGAATTCAGG ACGTAATCAG TGGCTGGGAA GCAAGAGCTC TAGAGGAGCT
CCAGCTTATT ATGACCCTTC CTTCAGATGC CACAAGGAGG TGCTGGAGTT CTATGCACCA
ATAGCTTAAA CCAGCCAGGC TGGCTGTAGT GGATTGAGCG TCTGAGGCTG CACCTCTCTG
GCCTGCAGCC AGTTCTGGGT GAGACTGACC CTGCCTGAGG GTTCTCTCCT TCCCTCTCTC
TACTCCTTCC TCCCTCTCCC TCTCCCTCTC TCTGTTTCCT GAGGTTTCCA GAATTGGGGA
TGGGACTCAG AGACACCACT AAAGCCTTAC CTTTTAAGAA GTTGCATTCA GTGAGTGTGT
GAGACATAGC ACAGATAGGG GCAGAGGAGA GCTGGTTCTG TCTCCACTGT GTTTGGTCTT
GGGTACTGAA CTCAGACCAT CAGGTGTGAT AGCAGTTGTC TTTAACCCTA ACCCTGAGCC
TGTCTCACCT GTCCCTTCCC AAGACCACTG AAGCTAGGTG CAAGATAAGT GGGGACCCTT
TCTGAGGTGG TAGGATCTTT CACGATAAGG ACTATTTTGA AGGGAGGGAG GGTGACACTG TCCTAGTCCT CTTACCCTAG TGTCTCCAGC CTTGCCAGGC CTTAAACATC CGCCCATTGT
CACCGCTCTA GAAGGGGCCA CCCTTGACTT GCTGCTAAAC AAGGCACTCC CTAGAGAAGA
TACCATACCT GTGGGCAGGA TGACCCATGT TCTGCCATGC ACTTGGTAGC CTTGGAAAGG
CCACTTTGAA CCTCAATTTT CTCAACTGTT AAATGGAGTG GTAACTGCTA TCTCATAATA
AAGGGGAACG TGAGGAAGGC GTTTGGATAG TGCCTGGTTG CGGCCAGGCT GCAGTCAAGA
CTAGTTCCCA CCAACTCGAT TTTAAAGCCT TGCAAGAAGG TGGCTTGTTT GTCCCTTGCA
GGTTCCTTTG CTCGGGCCAA ACTCTAGAAT GCCTCCCCCT TTCTTTCTCA TTGAAGAGCA
GACCCAAGTC CGGGTAACAA GGAAGGGTTT CAGGGTCCTG CCCATAAAAG G l I H TCCCG
GCCGCCCTCA GCACCGCCCC GCCCCGACCC CCGCAGCATC TCCAAAGCAT GCAGAGAATG
TCTCCGGCTG CCCCCGACAG ACTGCTCCAA CTTGGTGTCT TTCCCCAAAT ATGGAGCCTG
TGTGGAGTGA GTGGGGCGGC CCGGGGTGGT GAGCCAAGCA GACTTCCATG GGCAGGGAGG
GGCGCCACGG GGCGGCAGAG GGGTGACATC ACTGCCTAGG CGGCCTTTAA ACCCCTCACC
CAGCCGGCGC CCCGGCCCGT CTGCCCCAGC CCAGACACCG AAGCTACTCT CCTTCCAGTC
CACAAACGAC CAAGCCTTGT AAGTGCAAGT CATGGGAGCA GAAGGGCTGT GGGCTCAATT
AGATCCCCTA GTCTCTTCTA GTTTGCTGGG TGGAATTGGG TCCCTAGAGA CCATTCTCTG
TGTTAGACAA AAAGTCTGGG TTAAAATGCC TAGGATGATT TGACTGGGGC AAAAGAATAA
ATGGGGTGAG AGGGAGGCTC AAATTCAGTC ACTGTCCCAC CCATAGGTGT ATGGGCTATG
TGTTAGGCCC AAAGAGGTGA CAAATGAGGC CAAGGGAACA ACTCCATCTT TGGATCTCCA
AGAAGGTGAG GGGCTAAGTT CTGGAAAGCA GTGACCCACT GATGGTCCCC AGGGCTAATG
CAACTCGGGG GAGCCAGGAG GTAGCCCCCT CAGGCAGTGG AGGACTAAAG ATCTTATTTT
TTGTAGCGCT AGGGATCAAA CCCCAGGGCG CTATGTGTGG CAGGCATGTG
CTCCATCTAC
CACAGAAGTT TAATCCTTCA GACTAGCCTG GGATAGGGCC TGCTTTTTCT TTCCTTTTCT
CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTTT CTTTCC I ι i I ^^
CTCTCTTTCA CTCTCTCTTT CTAATTTCTT TTTCTTTTTT TCTTTCTTTT CTTTAGACAG GGTTTCTCTG TGTAGCCCTG GCTGTTCTGG AACTCACTCT TTAGACCAGG CTGGCCTCGA
ATCTCAGAAA TCTACCTGCC TCTGCCTCCC AAGTGCTGGG ATTAAAGGCG TGTGCCACCA
CTGCCCAGCT AAGGTTTGCT TTTTGATGGC AGCTTGGTCC AGTTTGAAAG TAGGAGGTCA
GTCCACTGTA GGCAGATAGG TGACAGGTGG CAGATAGGTG ACAGATAGGT GACAGGTGGA
GGAGCTTTGG AACTGGGACT GGACAGCCCT GGGACCCTGT TCCTCCCAAA GGGTCTTGGT GGTTCCCCTT GGGGCTCTCT AAAGGATGTC AGTGGGCTGT TGCCACATCT
ATATAAGAGG
ACTAGTCTTC TGGAATTTAG GTGTGATCTC TCAGGGATGC AGAAATGCTC
ACCCTTACTG
TCATTTTATG GGCTGAGGTA CCACAGGCAG ATATACCCTG GTCTGCTTGT
TGTCCAGGGT
CTCTGCTACA TGGAGGCCCC TTTCCACAGC CTAACCTCTC TACCTGCTGA
CAGGAGGGCT
GGATGGCCAC AGGCATCCAA CGTGCGCATC ATGCAGGTGT TTTGCGTTGG
AGCTTTTGTC
TAGAAATACC CTGGTGGGCT GCCAAACCAC CACCCATATC CCTCTCTCCT CTCTGCTGCC
TCTAAGATGA CAGCTTGATT TTTCTTATAG TGATTTTTTT TTTTGGTTTT GTTTTTTTGT
TTGTTTTAAG TTAGCATACA AAGTAATACA TTTCATCATG GCATTTGGAC ATACATATAT
ATTTTATTTG CTCTCCTGGC CTCTTCTCAA AGAGACTTCT CTGGACTTTC
TTGTA i I i M
GGTTGTGAGC CTAGCCTTTA ACGGCTGAGC CATCTCTCCA GCCCTTCTTT
GGACTTTCTA
CTTCATACTT CCCACCAGTC TGGGAAGAAG GGCACATGGA ATCTTGAGAG
CATGACCTGA
CCCAGACCTG ACAGATGTCA AGGCTGCAGT GTATGCTCTT GTTCGTACGG
CTTGTTCTTA
GTCCTGCAGT TCAGAACTTT CTGGAGACTG AGAAGTGCAT GTGAGGACAC
TCTCCTCCCA
TCTTTTCCTC TAGTGGCTAG TGATGTTTGG TTTTTTGTTT TGAGACAGGG
TTTCTCTGTA
TAGCCCTAGC TATCCTGGAA CTCACTTTGT AGATCAGGCT GGCCTCCAAC
TCAGAAATCT
GCCTGCCTCT GCCTCCCGAG TGCTGGGACT AAAGGCGTGC GCCACCACTG
TCCAGTCAGG
AGTAGAAGGA AACTGTAAGG TGCTTGAGAC AGGCTGAGTA GAGGCTAGGA
GGAAGGGGCA
CCGCAGTCAC CGGCTCCATG ACTCTGTGAC TTTTGTGGTT CCTTGTCGCA
GCGGTTCCTG
GTGGTGGTGG TGGTCGGGGG TTGGGGGGAG GGGGCAGGCC ACACAGTGGG
GTGTGGGAGG
GAATAGCTGT TGACAACTTC CCAACAGAAA CCAGGCTTTT GAGTCCTCCA
GGGTAGCTTG
AGAGGGTACT CAGAAAGCCG TGTCCATGTC CCCTTTCCTT CACCTCAGGG
AAGTAAGTTG
CCTATAGGGT TGTCATTTCA ATGAGGTCTT CTGGTTATTC TGTTTTTCTC
TCAATGTTGG
TGTTGGGCTC AGGGAATGCT TTGGAGAAGG TGGTGGGAAC TGGAGAAGGG
AAGATCAGTT
TACTGTGTAA ACTCACTGGT TAAAGTACCC CCTCCCTTCC ACCCTGCAAT
ACACACACAC
ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACCCCATCTC GAAGAGCTCT
ATTAAGCTCC
AGGTGCACTG TAGTTCACAG ACTGCATCTT CCAGGTTTGC TCCCACTTCA
CAAGCAGAGA
ACTCATAACT GAAGGGGGTG ACAGCACAGG GGAAGGGAAA GCAAGATGTT
TAGAGTCTGA
CAGCTGGCCC GGGACCAGAG CCATGTGGTA ATGTTTGCTC CACTCCCATC
CACCTCCACG
GCTGTGATGT GGAGAAGGTC CCCGCTTTCA TGGGAAGGAG GTGGGGGAGC
CTGTCATCTG CTCCATGCTC ACACAATTTT TCTCTCAACC AATGACCTCT CAGAAGCAGG GGTTGGTTTG
CAAAATTCTT CAGATACCTC AACAGATGGC ATCCCACTCA GGCTATCCCT GCTGACTAGG
TCTGGCTCCA GCCCTGACTG TATCTACCCA GGGACCTACC TGCCTGCTTT GCTCCTATAG
CCTTCCTCCG TGTCTGGGTC CCCAGAGAGC TGCCGGCATA GGCCTTTGAG GCAACAGCTG
GCATACAGGC CAGGCTTCCC ATGCTCTGGC TAGCAGATTC TCTGCCCTGG AGGACTTTGA
CTGCATGGTT TCTCTCACTG CTGCAACAGT CAGAGCTGGC CCACACGGGC ACAACAGCGC
ACTTCCATCT GGGTCTCCCT GAGAATGCCG CTGTTTTCTG AGAACCCTTG GACTCTGGTG
GCTTTATCAG GTCTTTTTGT CAGCTGCGCT TTGGGGGATG AACTTTGCTC TTCTGGCTTC
TGGGTCAGAG GGTAAAGATT TGGTGGCAAC CGGTAGCTAG AGAAAGATAG CTACTGGCTG
AATTTGGAGG ACATGGCTTC TGGAAAACCT CTCTAGTGCT TTTCTGGCTA GTCTTGGCAA
AGTAAAAATG CTCTGATAGC CAGCCCGGGT GATGCAGGGC TTCCTGTTCG AGGCCTTTCT
GTACAAAATT AGTGAGACAT TGCCTCAAAA CTATGAAACA AGCCAGACTC TGTTGAAGCA
CGCCTTTAAT CCCAGCACTC AGGAGGCTGA AGCAGGCAAG ATCTCTGTTA GTTGGAGGCC
AGTCTACAGG AAAGTTCTAC AACAGCAGAG GCCAGACAGT GCAACCCTTT CTGGGGGTGT
GGGGGAGGAA AACCCAACAA AAACACAAAC TATAAAACAA AGAGAAGGCC GAGGACAAAG
CTTAGCAATG CATACTTCCC TTTCTATGTG AAGCCCTGGG CTCCACCAGT ACTGCAGAAA
GAAGCAAGCA ATGAGGGACA GGAGGTTGGC TCTAGGCCCA GGGGTTGTCA AAATAGTCCA
CAGGCCAAAG GCAGCCTGAT GTCTGTTTTT ATAAACAAAA TTTTATTGGC ACACATTGGT
TATGTATCAG CTAGGCTATT TTCATTACAA TAGAGGCCAT ATGGTCTGTA AAGTCTAAAA
TATTTACTCT GCTGTTTTAC ATAAAAAGTT GACAGACTCT TGCTCTAGAC TGACAAATAT
CTAAGACCTT GTTTTCTGAG GTTCAAGTTT CAGAGGGGTC TCTGCAGCAA GTGGGTAAAG
CTGGTCTAGG TCATGCTATG ATGTCTAGGG TCCCCTCAGA GTGGAAGGCC TGCTTAGCAC
AAATGAAGTA AAGTAACTTG CTGGCTCTTT GTTCTTTTCT CCACACTCTA TACTTTAGCT
CTGCCTCAAC ATG (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: Ξ
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 785 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (œnomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: SOURIS
(xi) DESCRIPTION- DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : ?
GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCATGTTTTT ATAoCTCTTG GGCTGGGAGA t.
AGAGGCGGGT CTGGGTCTTT GTTTCTGAGC TTTGTTCTAT GTTCCTCCAT GCTACGGTTG II
CAATTGTTTT CTATGAACGA GTACATTCAA TAAAGACAAC CAGACCTGGG ATTTGGGGTC 1E
TTACTGATGT GTTGGGAGGT GCAGGAGCCT CCGTGTCCCA TTTATTTTGG CCTTCCCGTC 24
TCGTTTCTGT GCGTGGCTAC ATTGGGAATG ACCTTCCTTG ATCCCACCAA GCCACCCATT 3C
GATTCTGTAA ACATGTGACC CTTGCTCCAA GCATTGCTTA CAGGAGCAGG ATACTGAAAG 36
TGTGTCTGTG CCCTCTCCTG ATAACCCCTC CCTTCAGCAG GCACACAGCA CCTGACTACC 4:
CACCACGTAT GTAAACGTCA GTATCCTTTC CAGCCAGCTC TGCAGATGGG TGTCCAGGCT 48
GTGCATGATG CACCTCAAGT GGGCAGAGCT TGCAGGCCAA GGTTTTAAAG GCTGTTCAGG 5'
AATGGATGGC AAGCAGGATC TAAGAGGAGG GGGGGTTGTT GTTGTTTGGG GGGGGGGTGG 6C
TTTTGGTTTG TTTTTTTTGA GACAGGGTTT CTCTGTGTGG CCCTGGCCCT CCTGGAACCC 6£
ACTCTGTAGA CCAGGCTGGC CTTGAACTCA GAAATCTGCC TGCCTCTGCC TCCCGAGTGC 7:
TGGGATTAAA GGCGTGTGCC CATCGAGGAG GGAGATTTTA TTTAGATTAT AAAAAGGACG 7E GGATT- 7E
Références
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LI LI, J.M. MIANO, B. MERCER and E. OLSON
J. OF CELL BIOLOGY 1996 - VOL 132 N° 5, p. 349-859

Claims
REVENDICATIONS
1 Séquence d'ADN caractérisée en ce qu'elle comprend
- un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gene de la protéine SM22, ou d'une séquence hybndaπt dans des conditions de forte stringence à ladite séquence en amont, ledit fragment étant susceptible d induire une expression spécifique d'un gène dans des cellules eucaryotes, et
- une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d'intérêt thérapeutique
2 Séquence d'ADN selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle comprend
- un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM 22, ou d'une séquence hybπdant dans des conditions de forte stringence à ladite séquence en amont, ledit fragment étant susceptible d'induire une expression spécifique m vivo d'un gène dans les cellules des artères, et
- une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d'intérêt thérapeutique. 3 Séquence selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite protéine , ou ledit ARN, est susceptible d'inhiber la croissance des cellules du muscle lisse, d'activer la croissance des cellules endothéliales de consolider les parois des artères et/ou d'induire une réponse immunitaire 4 Séquence selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit fragment est compris dans la séquence située entre les nucléotides -2126 et +4135 du gène de souris de la protéine SM22 (SEQ ID π° 1 )
5 Séquence selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit fragment est compris dans la séquence située entre les nucléotides - 2126 à +65 du gène de souris de la protéine SM 22 (SEQ ID N°2)
6 Séquence selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce qu'elle contient au moins une partie de la séquence située entre les nucléotides -2126 et -445 du gène de la souris de la protéine SM 22 (SEQ ID N° 3)
7 Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique est une protéine induisant la formation d'un composé cytotoxique
8 Séquence selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite protéine est la thymidine kmase du virus de l'herpès
9 Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique présente un effet cytostatique
10 Séquence selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique présente une activité lipolytique
1 1 Séquence selon la revendication 10, caractérisée en que ladite protéine est la lipoprotéine lipase
12 Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique est un facteur de croissance des cellules endothéhales
13 Séquence selon la revendication 11 , caractérisée en ce que ledit facteur est une interleukine
14 Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique est une protéine musculaire ou de structure tissulaire
15 Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'ARN d'intérêt thérapeutique est l'ARN aπtisens de la protéine p53
16 Séquence d'ADN située en amont de la partie codante du gène de souris de la protéine SM 22 caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une partie de la séquence SEQ ID Nc5 suivante, ou une séquence s'hybπdant avec celle-ci dans des conditions stπngentes
GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCATGTTTTT
ATAGCTCTTG GGCTGGGAGA AGAGGCGGGT CTGGGTCTTT
GTTTCTGAGC TTTGTTCTAT GTTCCTCCAT GCTACGGTTG CAATTGTTTT CTATGAACGA GTACATTCAA TAAAGACAAC CAGACCTGGG ATTTGGGGTC TTACTGATGT GTTGGGAGGT GCAGGAGCCT CCGTGTCCCA TTTATTTTGG CCTTCCCGTC TCGTTTCTGT GCGTGGCTAC ATTGGGAATG ACCTTCCTTG ATCCCACCAA GCCACCCATT GATTCTGTAA ACATGTGACC CTTGCTCCAA GCATTGCTTA CAGGAGCAGG ATACTGAAAG TGTGTCTGTG CCCTCTCCTG ATAACCCCTC CCTTCAGCAG GCACACAGCA CCTGACTACC CACCACGTAT GTAAACGTCA GTATCCTTTC CAGCCAGCTC TGCAGATGGG TGTCCAGGCT GTGCATGATG CACCTCAAGT GGGCAGAGCT TGCAGGCCAA GGTTTTAAAG GCTGTTCAGG AATGGATGGC AAGCAGGATC TAAGAGGAGG GGGGGTTGTT GTTGTTTGGG GGGGGGGTGG TTTTGGTTTG TTTTTTTTGA GACAGGGTTT CTCTGTGTGG CCCTGGCCCT CCTGGAACCC ACTCTGTAGA CCAGGCTGGC CTTGAACTCA GAAATCTGCC TGCCTCTGCC TCCCGAGTGC TGGGATTAAA GGCGTGTGCC CATCGAGGAG GGAGATTTTA
TTTAGATTAT AAAAAGGACG G GATT
17. Séquence d'ADN située en amont de la partie codante du gène de la souris de la protéine SM22, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une partie de la séquence SEQ ID n° 1 suivante, ou une séquence s'hybridant avec celle-ci dans des conditions stringentes
GG GCCCCAGGAA
TGTGTTTCCT TCTCTCCACC ATGTTTTTAT AGCTCTTGGG CTGGGAGAAG AGGCGGGTCT
GGGTCTTTGT TTCTGAGCTT TGTTCTATGT TCCTCCATGC TACGGTTGCA ATTGTTTTCT
ATGAACGAGT ACATTCAATA AAGACAACCA GACCTGGGAT TTGGGGTCTT ACTGATGTGT
TGGGAGGTGC AGGAGCCTCC GTGTCCCATT TATTTTGGCC TTCCCGTCTC GTTTCTGTGC
GTGGCTACAT TGGGAATGAC CTTCCTTGAT CCCACCAAGC CACCCATTGA TTCTGTAAAC
ATGTGACCCT TGCTCCAAGC ATTGCTTACA GGAGCAGGAT ACTGAAAGTG TGTCTGTGCC
CTCTCCTGAT AACCCCTCCC TTCAGCAGGC ACACAGCACC TGACTACCCA CCACGTATGT
AAACGTCAGT ATCCTTTCCA GCCAGCTCTG CAGATGGGTG TCCAGGCTGT GCATGATGCA
CCTCAAGTGG GCAGAGCTTG CAGGCCAAGG TTTTAAAGGC TGTTCAGGAA TGGATGGCAA
GCAGGATCTA AGAGGAGGGG GGGTTGTTGT TGTTTGGGGG GGGGGTGGTT TTGGTTTGTT
TTTTTTGAGA CAGGGTTTCT CTGTGTGGCC CTGGCCCTCC TGGAACCCAC TCTGTAGACC
AGGCTGGCCT TGAACTCAGA AATCTGCCTG CCTCTGCCTC CCGAGTGCTG GGATTAAAGG
CGTGTGCCCA TCGAGGAGGG AGATTTTATT TAGATTATAA AAAGGACGGG ATTTGGGGAA
TCCTGTCTAG TGAATTCAGG ACGTAATCAG TGGCTGGGAA GCAAGAGCTC TAGAGGAGCT
CCAGCTTATT ATGACCCTTC CTTCAGATGC CACAAGGAGG TGCTGGAGTT CTATGCACCA
ATAGCTTAAA CCAGCCAGGC TGGCTGTAGT GGATTGAGCG TCTGAGGCTG CACCTCTCTG
GCCTGCAGCC AGTTCTGGGT GAGACTGACC CTGCCTGAGG GTTCTCTCCT TCCCTCTCTC
TACTCCTTCC TCCCTCTCCC TCTCCCTCTC TCTGTTTCCT GAGGTTTCCA GAATTGGGGA
TGGGACTCAG AGACACCACT AAAGCCTTAC CTTTTAAGAA GTTGCATTCA GTGAGTGTGT
GAGACATAGC ACAGATAGGG GCAGAGGAGA GCTGGTTCTG TCTCCACTGT GTTTGGTCTT
GGGTACTGAA CTCAGACCAT CAGGTGTGAT AGCAGTTGTC TTTAACCCTA ACCCTGAGCC
TGTCTCACCT GTCCCTTCCC AAGACCACTG AAGCTAGGTG CAAGATAAGT GGGGACCCTT
TCTGAGGTGG TAGGATCTTT CACGATAAGG ACTATTTTGA AGGGAGGGAG GGTGACACTG
TCCTAGTCCT CTTACCCTAG TGTCTCCAGC CTTGCCAGGC CTTAAACATC CGCCCATTGT
CACCGCTCTA GAAGGGGCCA CCCTTGACTT GCTGCTAAAC AAGGCACTCC CTAGAGAAGA GTCCACTGTA GGCAGATAGG TGACAGGTGG CAGATAGGTG ACAGATAGGT GACAGGTGGA
GGAGCTTTGG AACTGGGACT GGACAGCCCT GGGACCCTGT TCCTCCCAAA GGGTCTTGGT
GGTTCCCCTT GGGGCTCTCT AAAGGATGTC AGTGGGCTGT TGCCACATCT ATATAAGAGG
ACTAGTCTTC TGGAATTTAG GTGTGATCTC TCAGGGATGC AGAAATGCTC ACCCTTACTG
TCATTTTATG GGCTGAGGTA CCACAGGCAG ATATACCCTG GTCTGCTTGT TGTCCAGGGT
CTCTGCTACA TGGAGGCCCC TTTCCACAGC CTAACCTCTC TACCTGCTGA CAGGAGGGCT
GGATGGCCAC AGGCATCCAA CGTGCGCATC ATGCAGGTGT TTTGCGTTGG AGCTTTTGTC
TAGAAATACC CTGGTGGGCT GCCAAACCAC CACCCATATC CCTCTCTCCT CTCTGCTGCC
TCTAAGATGA CAGCTTGATT TTTCTTATAG TGATTTTTTT TTTTGGTTTT GTTTTTTTGT
TTGTTTTAAG TTAGCATACA AAGTAATACA TTTCATCATG GCATTTGGAC ATACATATAT
ATTTTATTTG CTCTCCTGGC CTCTTCTCAA AGAGACTTCT CTGGACTTTC TTGTATTTTT
GGTTGTGAGC CTAGCCTTTA ACGGCTGAGC CATCTCTCCA GCCCTTCTTT GGACTTTCTA
CTTCATACTT CCCACCAGTC TGGGAAGAAG GGCACATGGA ATCTTGAGAG CATGACCTGA
CCCAGACCTG ACAGATGTCA AGGCTGCAGT GTATGCTCTT GTTCGTACGG CTTGTTCTTA
GTCCTGCAGT TCAGAACTTT CTGGAGACTG AGAAGTGCAT GTGAGGACAC TCTCCTCCCA
TCTTTTCCTC TAGTGGCTAG TGATGTTTGG TTTTTTGTTT TGAGACAGGG TTTCTCTGTA
TAGCCCTAGC TATCCTGGAA CTCACTTTGT AGATCAGGCT GGCCTCCAAC TCAGAAATCT
GCCTGCCTCT GCCTCCCGAG TGCTGGGACT AAAGGCGTGC GCCACCACTG TCCAGTCAGG
AGTAGAAGGA AACTGTAAGG TGCTTGAGAC AGGCTGAGTA GAGGCTAGGA GGAAGGGGCA
CCGCAGTCAC CGGCTCCATG ACTCTGTGAC TTTTGTGGTT CCTTGTCGCA GCGGTTCCTG
GTGGTGGTGG TGGTCGGGGG TTGGGGGGAG GGGGCAGGCC ACACAGTGGG GTGTGGGAGG
GAATAGCTGT TGACAACTTC CCAACAGAAA CCAGGCTTTT GAGTCCTCCA GGGTAGCTTG
AGAGGGTACT CAGAAAGCCG TGTCCATGTC CCCTTTCCTT CACCTCAGGG AAGTAAGTTG
CCTATAGGGT TGTCATTTCA ATGAGGTCTT CTGGTTATTC TGTTTTTCTC TCAATGTTGG
TGTTGGGCTC AGGGAATGCT TTGGAGAAGG TGGTGGGAAC TGGAGAAGGG AAGATCAGTT TACCATACCT GTGGGCAGGA TGACCCATGT TCTGCCATGC ACTTGGTAGC CTTGGAAAGG
CCACTTTGAA CCTCAATTTT CTCAACTGTT AAATGGAGTG GTAACTGCTA TCTCATAATA
AAGGGGAACG TGAGGAAGGC GTTTGGATAG TGCCTGGTTG CGGCCAGGCT GCAGTCAAGA
CTAGTTCCCA CCAACTCGAT TTTAAAGCCT TGCAAGAAGG TGGCTTGTTT GTCCCTTGCA
GGTTCCTTTG CTCGGGCCAA ACTCTAGAAT GCCTCCCCCT TTCTTTCTCA TTGAAGAGCA
GACCCAAGTC CGGGTAACAA GGAAGGGTTT CAGGGTCCTG CCCATAAAAG GTTTTTCCCG
GCCGCCCTCA GCACCGCCCC GCCCCGACCC CCGCAGCATC TCCAAAGCAT GCAGAGAATG
TCTCCGGCTG CCCCCGACAG ACTGCTCCAA CTTGGTGTCT TTCCCCAAAT ATGGAGCCTG
TGTGGAGTGA GTGGGGCGGC CCGGGGTGGT GAGCCAAGCA GACTTCCATG GGCAGGGAGG
GGCGCCACGG GGCGGCAGAG GGGTGACATC ACTGCCTAGG CGGCCTTTAA ACCCCTCACC
CAGCCGGCGC CCCGGCCCGT CTGCCCCAGC CCAGACACCG AAGCTACTCT CCTTCCAGTC
CACAAACGAC CAAGCCTTGT AAGTGCAAGT CATGGGAGCA GAAGGGCTGT GGGCTCAATT
AGATCCCCTA GTCTCTTCTA GTTTGCTGGG TGGAATTGGG TCCCTAGAGA CCATTCTCTG
TGTTAGACAA AAAGTCTGGG TTAAAATGCC TAGGATGATT TGACTGGGGC AAAAGAATAA
ATGGGGTGAG AGGGAGGCTC AAATTCAGTC ACTGTCCCAC CCATAGGTGT ATGGGCTATG
TGTTAGGCCC AAAGAGGTGA CAAATGAGGC CAAGGGAACA ACTCCATCTT TGGATCTCCA
AGAAGGTGAG GGGCTAAGTT CTGGAAAGCA GTGACCCACT GATGGTCCCC AGGGCTAATG
CAACTCGGGG GAGCCAGGAG GTAGCCCCCT CAGGCAGTGG AGGACTAAAG ATCTTATTTT
TTGTAGCGCT AGGGATCAAA CCCCAGGGCG CTATGTGTGG CAGGCATGTG CTCCATCTAC
CACAGAAGTT TAATCCTTCA GACTAGCCTG GGATAGGGCC TGCTTTTTCT TTCCTTTTCT
CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTTT CTTTCCTTTT
CTCTCTTTCA CTCTCTCTTT CTAATTTCTT TTTCTTTTTT TCTTTCTTTT CTTTAGACAG
GGTTTCTCTG TGTAGCCCTG GCTGTTCTGG AACTCACTCT TTAGACCAGG CTGGCCTCGA
ATCTCAGAAA TCTACCTGCC TCTGCCTCCC AAGTGCTGGG ATTAAAGGCG TGTGCCACCA
CTGCCCAGCT AAGGTTTGCT TTTTGATGGC AGCTTGGTCC AGTTTGAAAG TAGGAGGTCA TACTGTGTAA ACTCACTGGT TAAAGTACCC CCTCCCTTCC ACCCTGCAAT ACACACACAC
ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACCCCATCTC GAAGAGCTCT ATTAAGCTCC
AGGTGCACTG TAGTTCACAG ACTGCATCTT CCAGGTTTGC TCCCACTTCA CAAGCAGAGA
ACTCATAACT GAAGGGGGTG ACAGCACAGG GGAAGGGAAA GCAAGATGTT TAGAGTCTGA
CAGCTGGCCC GGGACCAGAG CCATGTGGTA ATGTTTGCTC CACTCCCATC CACCTCCACG
GCTGTGATGT GGAGAAGGTC CCCGCTTTCA TGGGAAGGAG GTGGGGGAGC CTGTCATCTG
CTCCATGCTC ACACAATTTT TCTCTCAACC AATGACCTCT CAGAAGCAGG GGTTGGTTTG
CAAAATTCTT CAGATACCTC AACAGATGGC ATCCCACTCA GGCTATCCCT GCTGACTAGG
TCTGGCTCCA GCCCTGACTG TATCTACCCA GGGACCTACC TGCCTGCTTT GCTCCTATAG
CCTTCCTCCG TGTCTGGGTC CCCAGAGAGC TGCCGGCATA GGCCTTTGAG GCAACAGCTG
GCATACAGGC CAGGCTTCCC ATGCTCTGGC TAGCAGATTC TCTGCCCTGG AGGACTTTGA
CTGCATGGTT TCTCTCACTG CTGCAACAGT CAGAGCTGGC CCACACGGGC ACAACAGCGC
ACTTCCATCT GGGTCTCCCT GAGAATGCCG CTGTTTTCTG AGAACCCTTG GACTCTGGTG
GCTTTATCAG GTCTTTTTGT CAGCTGCGCT TTGGGGGATG AACTTTGCTC TTCTGGCTTC
TGGGTCAGAG GGTAAAGATT TGGTGGCAAC CGGTAGCTAG AGAAAGATAG CTACTGGCTG
AATTTGGAGG ACATGGCTTC TGGAAAACCT CTCTAGTGCT TTTCTGGCTA GTCTTGGCAA
AGTAAAAATG CTCTGATAGC CAGCCCGGGT GATGCAGGGC TTCCTGTTCG AGGCCTTTCT
GTACAAAATT AGTGAGACAT TGCCTCAAAA CTATGAAACA AGCCAGACTC TGTTGAAGCA
CGCCTTTAAT CCCAGCACTC AGGAGGCTGA AGCAGGCAAG ATCTCTGTTA GTTGGAGGCC
AGTCTACAGG AAAGTTCTAC AACAGCAGAG GCCAGACAGT GCAACCCTTT CTGGGGGTGT
GGGGGAGGAA AACCCAACAA AAACACAAAC TATAAAACAA AGAGAAGGCC GAGGACAAAG
CTTAGCAATG CATACTTCCC TTTCTATGTG AAGCCCTGGG CTCCACCAGT ACTGCAGAAA
GAAGCAAGCA ATGAGGGACA GGAGGTTGGC TCTAGGCCCA GGGGTTGTCA AAATAGTCCA
CAGGCCAAAG GCAGCCTGAT GTCTGTTTTT ATAAACAAAA TTTTATTGGC ACACATTGGT
TATGTATCAG CTAGGCTATT TTCATTACAA TAGAGGCCAT ATGGTCTGTA AAGTCTAAAΛ TATTTACTCT GCTGTTTTAC ATAAAAAGTT GACAGACTCT TGCTCTAGAC TGACAAATAT
CTAAGACCTT GTTTTCTGAG GTTCAAGTTT CAGAGGGGTC TCTGCAGCAA GTGGGTAAAG
CTGGTCTAGG TCATGCTATG ATGTCTAGGG TCCCCTCAGA GTGGAAGGCC TGCTTAGCAC
AAATGAAGTA AAGTAACTTG CTGGCTCTTT GTTCTTTTCT CCACACTCTA TACTTTAGCT
CTGCCTC
18 Séquence d'ADN située en amont de la partie codante du gene de la souris de la protéine SM22 caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une partie de la séquence SEQ ID n° 2 suivante ou une séquence s'hybπdant avec celle-ci dans des conditions stπngentes
SEQ I D NO : 2 : GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCATGTTTTT ATAGCTCTTG GGCTGGGAGA
AGAGGCGGGT CTGGCTCTTT GTTTCTGAGC TTTGTTCTAT GTTCCTCCAT GCTACGGTTG 1
CAATTGTTTT CTATGAACGA GTACATTCAA TAAAGACAAC CAGACCTGGG ATTTGGGGTC 1
TTACTGATGT GTTGGGAGGT GCAGGAGCCT CCGTGTCCCA TTTATTTTGG CCTTCCCGTC 2
TCGTTTCTGT GCGTGGCTAC ATTGGGAATG ACCTTCCTTG ATCCCACCAA GCCACCCATT 3
GATTCTGTAA ACATGTGACC CTTGCTCCAA GCATTGCTTA CAGGAGCAGG ATACTGAAAG 3
TGTGTCTGTG CCCTCTCCTG ATAACCCCTC CCTTCAGCAG GCACACAGCA CCTGACTACC 4
CACCACGTAT GTAAACGTCA GTATCCTTTC CAGCCAGCTC TGCAGATGGG TGTCCAGGCT 4
GTGCATGATG CACCTCAAGT GGGCAGAGCT TGCAGGCCAA GGTTTTAAAG GCTGTTCAGG 5
AATGGATGGC AAGCAGGATC TAAGAGGAGG GGGGGTTGTT GTTGTTTGGG GGGGGGGTGG 6
TTTTGGTTTG TTTTTTTTGA GACAGGGTTT CTCTGTGTGG CCCTGGCCCT CCTGGAACCC 6
ACTCTGTAGA CCAGGCTGGC CTTGAACTCA GAAATCTGCC TGCCTCTGCC TCCCGAGTGC 7
TGGGATTAAA GGCGTGTGCC CATCGAGGAG GGAGATTTTA TTTAGATTAT AAAAAGGACG 7
GGATTTGGGG AATCCTGTCT AGTGAATTCA GGACGTAATC AGTGGCTGGG AAGCAAGAGC 8
TCTAGAGGAG CTCCAGCTTA TTATGACCCT TCCTTCAGAT GCCACAAGGA GGTGCTGGAG 9
TTCTATGCAC CAATAGCTTA AACCAGCCAG GCTGGCTGTA GTGGATTGAG CGTCTGAGGC 9
TGCACCTCTC TGGCCTGCAG CCAGTTCTGG GTGAGACTGA CCCTGCCTGA GGGTTCTCTC 10 :
CTTCCCTCTC TCTACTCCTT CCTCCCTCTC CCTCTCCCTC TCTCTGTTTC CTGAGGTTTC 10 , CAGAATTGGG GATGGGACTC AGAGACACCA CTAAAGCCTT ACCTTTTAAG AAGTTGCATT 1 1 -'
CAGTGAGTGT GTGAGACATA GCACAGATAG GGGCAGAGGA GAGCTGGTTC TGTCTCCACT 12 C
GTGTTTGGTC TTGGGTACTG AACTCAGACC ATCAGGTGTG ATAGCAGTTG TCTTTAACCC 12 t
TAACCCTGAG C CTGTCTCAC CTGTCCCTTC CCAAGACCAC TGAAGCTAGG TGCAAGATAA 1 31
GTGGGGACCC TTTCTGAGGT GGTAGGATCT TTCACGATAA GGACTATTTT GAAGGGAGGG 13 c
AGGGTGACAC TGTCCTAGTC CTCTTACCCT AGTGTCTCCA GCCTTGCCAG GCCTTAAACA 14 -
TCCGCCCATT GTCACCGCTC TAGAAGGGGC CACCCTTGAC TTGCTGCTAA ACAAGGCACT 15 (
CCCTAGAGAA GATAC CATAC CTGTGGGCAG GATGACCCAT GTTCTGCCAT GCACTTGGTA 15 t
GCCTTGGAAA GGCC ACTTTG AACCTCAATT TTCTCAACTG TTAAATGGAG TGGTAACTGC 1 61
TATCTCATAA TAAAGGGGAA CGTGAGGAAG GCGTTTGGAT AGTGCCTGGT TGCGGCCAGG 16 E
CTGCAGTCAA GACTAGTTC C CACCAACTCG ATTTTAAAGC CTTGCAAGAA GGTGGCTTGT 17 -
TTGTCCCTTG CAGGTTCCTT TGCTCGGGCC AAACTCTAGA ATGCCTCCCC CTTTCTTTCT 18 C
CATTGAAGAG CAGACCCAAG TCCGGGTAAC AAGGAAGGGT TTCAGGGTCC TGCCCATAAA 18 £
AGGTTTTTCC CGGCCGCCCT CAGCACCGCC CCGCCCCGAC CCCCGCAGCA TCTCCAAAGC 192
ATGCAGAGAA TGTCTCCGGC TGCCCCCGAC AGACTGCTCC AACTTGGTGT CTTTCCCCAA 19 E
ATATGGAGCC TGTGTGGAGT GAGTGGGGCG GCCCGGGGTG GTGAGCCAAG CAGACTTCCA 204
TGGGCAGGGA GGGGCGCCAC GGGGCGGCAG AGGGGTGACA TCACTGCCTA GGCGGCCTTT 2 1 C
AAACCCCTCA CCCAGCCGGC GCCCCGGCCC GTCTGCCCCA GCCCAGACAC CGAAGCTACT 2 1 Ê
CTCCTTCCAG TCCACAAACG ACCAAGCCTT 2 1 S
19 Souche déposée le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le n°l-1685 portant le plasmide p2126πlz comprenant la séquence seion la revendication 18
20 Souche déposée le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le n° 1-1686 portant le plasmide p2126INTnlz comprenant la séquence selon la revendication 17
21 Vecteur caractérise en qu'il contient une séquence selon l'une des revendications 1 a 16
22 Vecteur selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il contient une origine de réphcation efficace dans les cellules des artères
23 Vecteur selon l'une des revendications 21 et 22 caractérisé en ce qu'il est un dérivé d'un adénovirus
24 ARN caractérisé en ce qu'il est capable d'être exprime par une séquence ou un vecteur seion l'une des revendications 1 à 23
25 Composition caractérisée en ce qu'elle contient une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 à 23
26 Composition selon la revendication 25, caractérisée en ce que la séquence ou le vecteur sont compris dans une composition facilitant leur transfection dans les cellules
27 Composition selon la revendication 25, caractérisée en ce qu'elle comprend un gel qui est un complexe de poly-L-lysiπe et de lactose
28 Médicament caractérisé en ce qu'il contient une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 à 23
29 Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'eue contient une quantité pharmaceutiquement efficace d'une séquence nucléique ou d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 a 23, et des excipients pharmaceutiquement compatibles
30 Utilisation d'un vecteur ou d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 à 23 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des maladies coronariennes
31 Utilisation d'un vecteur ou d'une séquence selon i'une des revendications 1 a 16 et 21 à 23 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement de la restenose 32 Utilisation d'un vecteur ou d'une séquence selon l'une des revendications 1 a 16 et 21 à 23 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des mutations fragilisant les vaisseaux
33 Animaux transgéniques caractérisés en ce qu'ils portent une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 à
23, dans lequel le gène codant pour la protéine d'intérêt thérapeutique est remplacé par un gène reporteur
34 Procédé de criblage de molécules in vitro pour leur activité sur les séquences régulatrices du gène codant pour la protéine SM22 comprenant les étapes suivantes'
- transfection de cellules avec une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 à 23, dans lequel le gène codant pour la protéine d'intérêt thérapeutique est remplacé par un gène reporteur, - incubation des cellules transfectées avec la molécule à tester, et
- quantification de l'expression du gène réporteur 35. Procédé de détection de mutations sur la région comportant la séquence selon l'une des revendications 1 à 16 ou le vecteur selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé par une altération de l'expression du gène placé en aval de ladite séquence.
36 Procédé d'expression de protéines d'intérêt thérapeutique caractérisé en ce qu'il met en oeuvre les produits selon l'une des revendications 1 à 24
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