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WO1997033624A1 - Mikropartikel, verfahren zu deren herstellung, sowie deren verwendung in der ultraschalldiagnostik - Google Patents

Mikropartikel, verfahren zu deren herstellung, sowie deren verwendung in der ultraschalldiagnostik Download PDF

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WO1997033624A1
WO1997033624A1 PCT/EP1997/001185 EP9701185W WO9733624A1 WO 1997033624 A1 WO1997033624 A1 WO 1997033624A1 EP 9701185 W EP9701185 W EP 9701185W WO 9733624 A1 WO9733624 A1 WO 9733624A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
microparticles
microparticles according
ultrasound
gas
hyaluronic acid
Prior art date
Application number
PCT/EP1997/001185
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Georg Rössling
Celál Albayrak
Johannes Tack
Original Assignee
Schering Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to EP97914205A priority Critical patent/EP0889738A1/de
Priority to AU21542/97A priority patent/AU2154297A/en
Priority to JP9532269A priority patent/JP2000507228A/ja
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Priority to NO984184A priority patent/NO984184L/no

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/22—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations
    • A61K49/222—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, liposomes
    • A61K49/223—Microbubbles, hollow microspheres, free gas bubbles, gas microspheres

Definitions

  • Microparticles processes for their preparation and their use in the
  • the invention relates to the subject characterized in the claims, that is, gas-containing micro- and nanoparticles made of biodegradable, synthetic polymers based on hydrophobized polysaccharides, agents containing these particles for ultrasound diagnostics, and methods for producing the particles and agents.
  • Ultrasonic waves are reflected at the interfaces of media with different acoustic densities.
  • the resulting echo signals are electronically amplified and made visible.
  • the visualization of blood vessels and internal organs using ultrasound generally does not allow the visualization of blood flow.
  • Liquids, especially blood only provide ultrasound contrast if there are differences in density and compressibility to the environment.
  • Gas-containing or gas-producing substances are generally used as contrast agents in medical ultrasound diagnostics. Gases are particularly suitable insofar as the difference in impedance between gas and surrounding blood is much greater than that observed for liquids or solids [Levine R. A., J. Am. Coll. Cardiol. 3 (1988) 28 or Machi I.J., CU 11 (1983) 3].
  • cardiac echo contrasts can be achieved by injecting solutions containing fine gas bubbles [Roelandt J., Ultrasound Med. Biol. 8 (1982) 471-492]. These gas bubbles are obtained in physiologically compatible solutions, for example by shaking, other agitation or by adding carbon dioxide. However, they are not standardized in number and size and can only be reproduced inadequately. They are also usually not stabilized, so that their lifespan is short. Their mean diameters are usually above the erythrocyte size, so that a lung capillary passage with subsequent contrasting of organs such as the left heart, liver, kidney or spleen is not possible.
  • EP 0 131 540 describes the stabilization of gas bubbles by sugar. This improves the reproducibility and homogeneity of the contrast effect, but these bubbles do not survive passage through the lungs.
  • EP 0 122 624 and 0 123 235 describe that the gas bubble stabilizing effects of sugars, sugar alcohols and salts are improved by adding surface-active substances. Lung capillary mobility and the possibility of displaying the arterial vascular space and various organs such as the liver or spleen are given with these ultrasound contact glasses.
  • the contrast effect is limited to the vascular volume since the vesicles are not absorbed by the tissue cells.
  • the wall material used here consists of protein, in particular human serum albumin with the known allergenic properties, to which cytotoxic effects can be added by denaturing.
  • European patent application EP 0 398 935 describes gas-containing microparticles for ultrasound diagnostics based on biodegradable, synthetic materials. These agents have a sufficient in vivo lifespan and, after intravenous administration, are accumulated intracellularly in the reticuloendothelial system and thus in the liver or spleen.
  • the European patent application EP 0 454 044 describes ultrasound contrast media based on hydrophobized polysaccharides. Be used here exclusively high molecular, mixed polyelectrolyte complexes. However, such complexes have a higher osmotic pressure in solution than is measured for uncharged compounds; moreover, charged complexes generally have poorer in vivo compatibility than uncharged compounds.
  • the object is achieved by the present invention.
  • microparticles consisting of hydrophobized polysaccharides and a gas are outstandingly suitable for producing a preparation for ultrasound diagnosis.
  • the gas-filled, echogenic polymemano or microparticles consist of biodegradable, synthetic polymers based on hydrophobized polysaccharides and have the advantage that they are easily degraded in vivo and without toxicologically harmful degradation products.
  • their lipophilic properties can be varied slightly over a wide range via the degree of esterification or etherification, as a result of which the residence time in the blood circulation and also the distribution behavior can be controlled.
  • the wall thickness of the microparticles according to the invention can be influenced by the production process, it is possible to produce particles whose oscillation modes can be excited by the sound field, which means that they can also be used in non-linear imaging modes.
  • the microparticles according to the invention are made up of hydrophobized polysaccharides.
  • Derivatives of hyaluronic acid, dextran, pullan, amylopectin, amylose, mannan and / or chitosan may be mentioned by way of example, functional groups by propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, pentyl, isopentyl, hexyl -, Octyl, decyl, dodecyl, Pa nitoyl, stearinoyl, lauryl and / or benzyl groups are completely or partially hydrophobized, ie are esterified or etherified.
  • degree of esterification or degree of etherification (hereinafter also generally referred to as degree of substitution) is given in percent in the present specification, whereby 100% esterification (etherification) is used when all functional groups (ie carboxyl or hydroxyl groups) of the polysaccharide esterify ( etherified). A degree of substitution of 30-100% is preferred according to the invention.
  • the degree of substitution can be used to control the hydrophilicity of the particles and thus influence the residence time in the blood. In general, the more hydrophilic the particles, the longer the dwell time in the bloodstream.
  • the more lipophilic particles also preferentially accumulate in organs such as e.g. to the liver, whereas particles with lower lipophiles preferentially remain in the vascular space.
  • Polymers with a molecular weight of 10-250 kDalton are also preferred according to the invention.
  • Amylopectin, amylose, mannan, chitosan or chitin can (can) be prepared and characterized by the following methods known from the literature:
  • perfluorinated compounds can also be used as the gases contained in the particles.
  • Another object of the invention is a method for producing the microparticles according to the invention from hydrophobized polysaccharides.
  • Microparticles are prepared by dissolving the respective polymer and, if appropriate, a surface-active substance in an organic solvent or solvent mixture. A perfluoro compound or water is dispersed in this solution. The dispersion is added to water, which if desired contains a surface-active substance, and dispersed with the aid of a stirrer. The solvent is removed by introducing gas (eg nitrogen) and, if necessary, applying a vacuum. Particles form which initially still contain water or the liquid perfluoro compound. The suspension containing the particles is then mixed with a suitable pharmaceutically acceptable cyroprotector and freeze-dried, the liquid in the particles largely escaping and being replaced by the desired gas (usually air) after the lyophilizer has been aerated.
  • gas eg nitrogen
  • Perfluoropentane, perfuorohexane, perfluoro-1, 3-dimethylcyclohexane, perfluorocyclohexane, perfluorodecalin and / or perfluoroether are used as perfluorinated liquid compounds.
  • organic solvents or solvent mixtures preference is given to using dichloromethane, acetone, ethyl acetate, methyl acetate, triacetin, triethyl citrate, ethyl lactate, methyl lactate, propyl acetate, isopropyl acetate, propyl formate, butyl formate and / or dimethyl sulfoxide.
  • Suitable surface-active substance is preferably a substance from the group of poloxamers ®, poloxamines ®, polyethylene glycol alkyl ethers, polysorbates, Saccharoseester (Sisterna ®; The Netherlands), Saccharoseester (Ryoto Sugarester ®; Tokyo) and gelatin, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, Fettalkohlpolyglycosid, Chaps (Serva ), Chap (Calbiochem), Chapso (Calbiochem), decyl- ⁇ -D-glycopyranoside, decyl- ⁇ -D-maltopyranoside, sodium oleate, polyethylene glycol or mixtures thereof.
  • Suitable suspension media are, for example, water pi, aqueous solutions of one or more inorganic salts, such as, for example, physiological electrolyte or buffer solutions, such as, for example, Tyrode, aqueous solutions of mono- or disaccharides, such as glucose or lactose, sugar alcohols, such as mannitol, which may also additionally comprise a surface-active substance the group of polysorbates, polysaccharides, Poloxamere ® or Poloxamine ® as well as polyvinyl pyrolidone, sucrose mono- or diesters and / or a physiologically compatible polyhydric alcohol, such as glycerol.
  • water suitable for injection purposes is preferred.
  • the suspension can be filtered immediately before the injection.
  • the agents according to the invention contain 10 6 -10 10 particles per milliliter of suspension medium.
  • the dose injected depends on the intended use; in ultrasound diagnostic examinations of the vessels it is in the range 1 to 500 ⁇ g, preferably between 10 and 100 ⁇ g particles / kg body weight, by means of the examination of the liver and spleen Color Doppler sonography in the range from 50 to 1000, preferably between 200 and 600 ⁇ g / kg body weight.
  • the particles also show an excellent backscattering coefficient.
  • the determination of the backscatter coefficients - which can be regarded as a measure of the effectiveness of the contrast agent - was carried out in an in vitro experimental setup in which the "backscatter" caused by a contrast agent in a cuvette is measured (see “Standardization of the measurement of acoustical Parameters of ultrasound contrast agents "First European Symposium on Ultrasound Contrast Imaging, January 25-26, 1996, Rotterdam).
  • the number of particles was determined using the Coulter Counter method.
  • the (O / O / W) emulsion is transferred to a three-necked flask equipped with a stirrer (300 rpm) and the solvent is removed for 3 hours at 20 ° C. by introduction of N and by vacuum.
  • the suspension is then freed from the surfactant and the residual solvent by ultrafiltration, the volume of the suspension is reduced to a minimum (50 ml), the suspension is mixed with a pharmaceutically acceptable cyroprotector and freeze-dried.
  • Example 2 The procedure is as in Example 1, with perfluoropentane being replaced by perfluorohexane.
  • the lyophilisate resuspended in water contains ultrasound-active microparticles with a diameter of 0.1 to 8 ⁇ m.
  • Example (1) The procedure is as in Example (1), the polymeric hyaluronic acid benzyl ester used having a degree of esterification of 75% and 40 ml of methylene chloride / ethyl acetate (2: 1 by volume) being used as the solvent.
  • the lyophilisate taken up in water contains ultrasound-active microparticles with a diameter of 0.1 to 8 ⁇ m.
  • Example (1) The procedure is as in Example (1), the benzyl ester of hyaluronic acid being dissolved in 40 ml of methylene chloride / dimethyl sulfoxide (DMSO) (2: 1 by volume).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the lyophilisate resuspended in water contains ultrasound-active microparticles with a diameter of 0.3 -8 ⁇ m.
  • the (O / O / W) emulsion is transferred to a three-necked flask equipped with a stirrer (300 rpm) and the solvent is removed for 3 hours at 20.degree. C. by introducing it under vacuum. Then the suspension is freed of the surfactant and residual solvent used by ultrafiltration, the volume of the suspension concentrated to a minimum (50 ml) and the suspension was mixed with a pharmaceutically acceptable cyroprotector and freeze-dried.
  • Example 9 The procedure is as in Example (8), the polymer being 3.0 g of succinic acid mono-
  • the lyophilisate resuspended in water contains ultrasound-active microparticles with a diameter of 0.1 to 6 ⁇ m.
  • the lyophilisate resuspended in water contains ultrasound-active microparticles with a diameter of 0.1 to 7 ⁇ m.
  • the lyophilisate resuspended in water contains ultrasound-active microparticles with a diameter of 0.1 to 7 ⁇ m.
  • the lyophilisate resuspended in a 0.9% NaCl solution contains ultrasound-active microparticles with a diameter of 0.1 to 7 ⁇ m.

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Abstract

Die Erfindung betrifft gasenthaltende Mikro- und Nanopartikel aus bioabbaubaren, synthetischen Polymeren auf Basis hydrophobisierter Polysaccharide, diese Partikel enthaltende Mittel für die Ultraschalldiagnostik, sowie Verfahren zur Herstellung der Partikel und Mittel.

Description

Mikropartikel, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung in der
Ultraschall Diagnostik
Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand, daß heißt gasenthaltende Mikro- und Nanopartikel aus bioabbaubaren, synthetischen Polymeren auf Basis hydrophobisierter Polysaccharide, diese Partikel enthaltende Mittel für die Ultraschalldiagnostik, sowie Verfahren zur Herstellung der Partikel und Mittel.
Die Ultraschalldiagnostik hat in der Medizin wegen der komplikationslosen und einfachen Handhabung sehr breite Anwendung gefunden. Ultraschallwellen werden an Grenzflächen von Medien unterschiedlicher akustischer Dichte reflektiert. Die dabei entstehenden Echosignale werden elektronisch verstärkt und sichtbar gemacht.
Die Darstellung von Blutgefäßen und inneren Organen mittels Ultraschall erlaubt im allgemeinen nicht die Darstellung des Blutflusses. Flüssigkeiten, insbesondere Blut, liefern nur dann Ultraschallkontrast, wenn Dichte- und Kompressibilitätsunterschiede zur Umgebung bestehen. Als Kontrastmittel werden in der medizinischen Ultraschalldiagnostik in der Regel gasenthaltende oder gasproduziemde Substanzen verwendet. Gase sind insofern besonders geeignet, da hier der Impedanzunterschied zwischen Gas und umgebendem Blut wesentlich größer ist, als er für Flüssigkeiten oder Festkörper beobachtet wird [Levine R. A., J. Am. Coll. Cardiol. 3 (1988) 28 oder Machi I. J., CU 11 (1983) 3].
Es ist bekannt, daß durch Injektionen von Lösungen, die feine Gasblasen enthalten kardiale Echokontraste erzielt werden können [Roelandt J., Ultrasound Med. Biol. 8 (1982) 471-492]. Diese Gasblasen werden in physiologisch verträglichen Lösungen z.B. durch Schütteln, anderer Agitation oder durch Zusatz von Kohlendioxid erhalten. Sie sind jedoch hinsichtlich Anzahl und Größe nicht standardisiert und können nur unzulänglich reproduziert werden. Auch sind sie in der Regel nicht stabilisiert, so daß ihre Lebensdauer gering ist. Ihre mittleren Durchmesser liegen meist über Erythrozytengröße, so daß eine Lungenkapillarpassage mit nachfolgender Kontrastierung von Organen wie linkes Herz, Leber, Niere oder Milz nicht möglich ist. Darüber hinaus eignen sie sich nicht für Quantifizierung, da sich das von ihnen erzeugte Ultraschallecho aus mehreren, nicht voneinander zu trennenden Prozessen wie Blasenentstehung, Koaleszenz und Auflösung zusammensetzt. So ist es z. B. nicht möglich mit Hilfe dieser Ultraschallkontrastmittel über die Messung des Kontrastverlaufs im Myokard Aussagen über Transitzeiten zu gewinnen.
Hierzu sind Kontrastmittel notwendig, deren Streukörper eine ausreichende Stabilität aufweisen.
In der EP 0 131 540 ist die Stabilisierung von Gasblasen durch Zucker beschrieben. Damit wird die Reproduzierbarkeit und Homogenität des Kontrasteffektes verbessert, eine Lungenpassage überstehen diese Blasen jedoch nicht.
In EP 0 122 624 und 0 123 235 wird beschrieben, daß der gasblasenstabilisierende Effekte von Zuckern , Zuckeralkoholen und Salzen durch Zusatz von grenzflächenaktiven Substanzen verbessert wird. Eine Lungenkapillargängigkeit und die Möglichkeit zur Darstellung des arteriellen Gefäßraums und verschiedener Organe wie Leber oder Milz ist bei diesen Ultrascliallkonttastrmtteln gegeben. Der
Kontrasteffekt ist hierbei jedoch auf das Gefäßvolumen beschränkt, da die Bläschen nicht von den Gewebezellen aufgenommen werden.
Keines der beschriebenen Ultraschallkontrastmittel verbleibt längere Zeit unverändert im Körper. Eine Organdarstellung mit ausreichender Signalintensität durch selektive Anreicherung nach i.v. Gabe oder Quantifizierung sind mit diesen Mitteln nicht möglich.
Eine Verkapselung von Gasen wie beispielsweise Luft in Partikeln und deren Verwendung als Ultraschallkontrastmittel wird in der EP 0 224 934 beschrieben. Das hierbei verwendete Wandmaterial besteht aus Protein, insbesondere menschliches Serumalbumin mit den bekannten allergenen Eigenschaften, zu denen durch eine Denaturierung zytoxische Effekte hinzukommen können.
In der europäischen Patentanmeldung EP 0 398 935 werden gasenthaltende Mikropartikeln für die Ultraschall-Diagnostik auf der Basis von biologisch abbbaubaren, synthetischen Materialien beschrieben. Diese Mittel weisen eine ausreichende in vivo Lebensdauer auf und werden nach intravenöser Applikation intrazellulär im retikuloendothelialem System und damit auch in der Leber oder Milz angereichert.
In der europäischen Patentanmeldung EP 0 454 044 werden Ultraschall-kontrastmittel auf der Basis hydrophobisierter Polysaccharide beschrieben. Verwendet werden dabei auschließlich hochmolekulare, gemischte Polyelektrolytkomplexe. Derartige Komplexe weisen in Lösung jedoch einen höheren osmotischen Druck auf als er für ungeladene Verbindungen gemessen wird, darüber hinaus zeigen geladene Komplexe in der Regel eine schlechtere in vivo Verträglichkeit als ungeladene Verbindungen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher Ultraschallkontrastmittel zu finden, die die Nachteile des Standes der Technik überwinden, d.h. Kontrastmittel zu finden, die
• einen deutlichen Kontrast zum umgebendem Gewebe liefern,
• die so klein und stabil sind, daß sie ohne wesentlichen Gasverlust und im wesentlichen quantitativ die linke Herzhälfte nach intravenöser Applikation erreichen,
• gegebenenfalls lange im Blutkreislauf zirkulieren, • gute Verträglichkeit aufweisen ohne allergenes Potential zu besitzen,
• nicht im Wasser oder Blut miteinander aggregieren und
• sich schnell und einfach herstellen lassen.
Die Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.
Es wurde gefunden, daß Mikropartikel bestehend aus hydrophobisierten Polysacchariden und einem Gas hervorragend zur Herstellung eines Präparates für die Ultraschalldiagnostik geeignet sind.
Die erfindungsgemäßen gasgefüllten, echogene Polymemano- oder Mikropartikel (nachfolgend auch als Partikel oder Mikropartikel bezeichnet) bestehen aus bioabbaubaren, synthetischen Polymeren auf der Basis hydrophobisierter Polysaccharide und haben den Vorteil, daß sie in vivo leicht und ohne toxikologisch bedenkliche Abbauprodukte abgebaut werden. Darüber hinaus können ihre lipophilen Eigenschaften in weiten Bereichen über den Veresterungs bzw. Veretherungsgrad leicht variiert werden, wodurch die Verweilzeit im Blutkreislauf, aber auch das Verteilungs verhalten gesteuert werden kann.
Da die Wandstärke der erfindungsgemäßen Mikropartikel durch den Herstellungsprozess beinflußbar ist, kann man Partikel herstellen, deren Schwingungsmoden sich durch das Schallfeld anregen lassen, wodurch eine Anwendung auch in nichtlinearen Abbildungsmodi möglich ist. Die erfindungsgemäßen Mikropartikel sind aufgebaut aus hydrophobisierten Polysacchariden. Beispielhaft genannt seien Derivate der Hyaluronsäure, des Dextrans, des Pullans, des Amylopektins, der Amylose, des Mannans und/oder des Chitosans, wobei funktionelle Gruppen durch Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, Pentyl-, Isopentyl-, Hexyl-, Octyl-, Decyl-, Dodecyl-, Pa nitoyl-, Stearinoyl-, Lauryl- und/oder Benzylgruppen ganz oder teilweise hydrophobisiert, d.h. verestert oder verethert sind.
Der Veresterungsgrad bzw. Veretherungsgrad (nachfolgend auch allgemein als Substitutionsgrad bezeichnet) wird in der vorliegenden Schrift in Prozent angegeben, wobei von einer 100% igen Veresterung (Veretherung) gesprochen wird, wenn alle funktioneilen Gruppen (d.h. Carboxyl- oder Hydroxylgruppen) des Polysaccharids verestert (verethert) sind. Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Substitutionsgrad von 30 - 100 %.
Über den Substitutionsgrad läßt sich die Hydrophilie der Partikel steuern und damit die Verweilzeit im Blut beeinflussen. Allgemein gilt: Je hydrophiler die Partikel desto länger ist die Verweilzeit im Blutkreislauf.
Auch reichem sich die lipophileren Partikel vorzugsweise in Organen wie z.B. der Leber an, wohingegen Partikel mit geringerer Lipophile vorzugsweise im Gefäßraum verbleiben.
Erfmdungsgemäß bevorzugt sind weiterhin Polymere mit einem Molekulargewicht von 10-250 kDalton.
Erfmdungsgemäß einsetzbare Hyaluronsäureester mit dem gewünschten Molekulargewicht und Veresterungsgrad können nach den folgenden literaturbekannten Verfahren hergestellt und charakterisiert werden:
- Jeanloz et al., Biol. Chem. 186, (1950) 495-511
- Jeanloz et al., J. Biol. Chem. 194 (1952 ) 141-150
- Jeanloz et al., Hei. Chimi. Act. 35 (1952) 262-271
- Jager et al., J . Bacteriology. (1979) 1065-1067 - US 4,851,521
- Kawaguchi et al., Carbohyd. Polym. 18 (1992) 139-141
- Prestwich et al., Bioconjugate Chem. 5 (1994) 339-347
- Prestwich et al., Bioconjugate Chem. 5 (1994) 370-372 -5-
- Prestwich et al., Bioconjugate Chem. 2 (1991) 232-241
- Chabrecek et al., J. Appl. Polym. Symp. 48 (1993) 20-22
- Kobajashi et al., Biorheology 31 (1994) 235-244
Erfindungsgemäß einsetzbare(s), hydrophobisierte(s) Dextrane, Pullulan,
Amylopectin, Amylose, Mannan, Chitosan oder Chitin können (kann) nach den folgenden literaturbekannten Verfahren hergestellt und charakterisiert werden:
- Suzuki.M et al., Carbohydr. Res. 23 (223-229) 1977 - Hämmerling U. et al., Biochimica et Biophysica Acta 875 9 (1986) 265-270
- Kobojashi . K. et al., Makromolecules 19 (1986) 529-535
- Ringsdorf H. et al., Angew. Makromol. Chem. 166/167 (1989) 71-80
- Sunamato J. et al., CRC Critical Reviews in Therapeutic drug Carrier Systems 2
(1986) 117-136 - Ringsdorf H. et al., Angew. Chem. Int. ed. Engl. 27 (1988) 113
- Toshihiro S. et al., Makromol. Chem. 192 (1991) 2447-2461
Als in den Partikeln enthaltene Gase kommen neben den üblichen Gasen wie Luft, Stickstoff und Edelgasen auch perfluorierte Verbindung infrage.
Eine weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mikropartikel aus hydrophobisierten Polysacchariden.
Zur Herstellung von Mikropartikeln verfährt man in der Weise, daß man das jeweilige Polymer, sowie gegebenenfalls eine oberflächenaktive Substanz in einem organischen Lösungsmittel oder Lösunsmittelgemisch löst. In dieser Lösung wird eine Perfluoro- Verbindung oder Wasser dispergiert. Die Dispersion wird in Wasser, das gewünschtenfalls eine oberflächenaktive Substanz enthält, gegeben und mit Hilfe eines Rührers dispergiert. Das Lösungsmittel wird durch Gaseinleitung (z.B. Stickstoff) und gegebenenfalls Anlegen eines Vakuums entfernt. Dabei bilden sich Partikel aus, die zunächst noch Wasser bzw. die flüssige Perfluoro- Verbindung enthalten. Anschließend wird die Partikel enthaltende Suspension mit einem geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Kyroprotektor vermischt und gefriergetrocknet, wobei die in den Partikeln befindliche Flüssigkeit weitgehend entweicht und nach Belüften des Lyophilisators durch das gewünschte Gas (in der Regel Luft) ersetzt wird. Je nach Trocknungsdauer verbleibt gegebenenfalls eine geringe Menge der Flüssigkeit (Wasser bzw. Perfluoro- Verbindung) als Dampf in den Partikeln. Als perfluorierte flüssige Verbindungen kommen zur Anwendung Perfluoropentan, Perfuorohexan, Perfluoro-l,3-dimethylcyclohexan, Perfluorocyclohexan, Perfluorodecalin und/oder Perfluoroether.
Als organische Lösungmittel oder Lösungsmittelgemische werden bevorzugt Dichlormethan, Aceton, Ethylacetat, Methylacetat, Triacetin, Triethylcitrat, Ethylactat, Methyllactat, Propylacetat, Isopropylacetat, Propylformiat, Butylfoπniat und/oder Diemethylsulfoxid verwendet.
Als oberflächenaktive Substanz wird bevorzugt eine Substanz aus der Gruppe der Poloxamere®, Poloxamine®, Polyethylenglycolalkylether, Polysorbate, Saccharoseester (Sisterna®; The Netherlands), Saccharoseester (Ryoto Sugarester®; Tokyo) sowie Gelatine, Polyvinylalkohl, Polyvinylpyrolidon, Fettalkohlpolyglycosid, Chaps (Serva), Chap (Calbiochem), Chapso (Calbiochem), Decyl-ß-D-glycopyranosid, Decyl-ß-D-maltopyranosid, Natriumoleat, Polyethylenglykol oder deren Gemische eingesetzt.
Die Herstellung der gebrauchsfertigen, injizierbaren Zubereitungen der erfindungsgemäßen Partikeln erfolgt durch Resuspendieren des Lyophilisats in einem pharmazeutisch akzeptablen Suspensionmedium. Geeignete Suspensionsmedien sind z.B. Wasser p.i., wäßrigen Lösungen eines oder mehrerer anorganischener Salze wie z.B. physiologische Elektrolyt- oder Pufferlösungen, wie z.B. Tyrode, wäßrige Lösungen von Mono- oder Disacchariden wie Glucose oder Lactose, Zuckeralkoholen wie Mannit, die gegebenenfalls zusätzlich noch eine oberflächenaktive Substanz aus der Gruppe der Polysorbate, Polysaccharide, Poloxamere® oder Poloxamine® sowie Polyvinylpyrolidon, Saccharose Mono- oder Diester und/oder einen physiologisch verträglichen mehrwertigen Alkohl, wie z.B. Glycerin, enthalten. Bevorzugt ist jedoch für Injektionszwecke geeignetes Wasser.
Um die Sicherheit der Applikation zu erhöhen, kann unmittelbar vor der Injektion eine Filtration der Suspension durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäßen Mittel enthalten 106-1010 Partikel pro Milliliter Suspensionsmedium. Die injizierte Dosis ist abhängig vom jeweiligen Verwendungszweck; sie liegt bei ultraschalldiagnostischen Untersuchungen der Gefäße im Bereich 1 bis 500 μg, bevorzugt zwischen 10 und 100 μg Partikel/kg Körpergewicht, bei der Untersuchung von Leber und Milz mittels Farbdopplersonographie im Bereich von 50 bis 1000, bevorzugt zwischen 200 und 600 μg/kg Körpergewicht.
Die erfindungsgemäßen Mikropartikel und daraus hergestellte Ultraschallkontrasürüttel zeichen sich durch die folgenden Vorteile aus:
• Sie werden schnell in vivo abgebaut,
• Abbauprodukte sind toxikologisch unbedenklich,
• sie zirkulieren ausreichend lange im Blutkreislauf, wobei die Verweilzeit über den Substitutionsgrad gesteuert werden kann,
• sie sind in allen Modi der Ultraschalldiagnostik, insbesondere auch bei Modi bei denen nichtlineare Effekte ausgenutzt werden, anwendbar,
• sie sind gut verträglich,
• sie zeigen eine einheitliche, steuerbare Größenverteilung, • sie sind leicht herstellbar,
• sie sind ausreichend stabil um auch eine Lungenpassage zu überstehen und eignen sich damit auch für die Kontrastierung des linken Herzens und
• sie werden vom retikuloendothelialen System aufgenommen und eignen sich damit auch für die Kontrastierung der Leber und Milz.
Die Partikel zeigen darüber hinaus einen hervorragenden Rückstreukoeffizenten. Die Bestimmung der Rückstreukoeffizienten - die als ein Maß für die Effektivität des Kontrastmittels angesehen werden können - erfolgte in einem in vitro Versuchsaufbau, bei dem der von einem in einer Küvette befindlichen Kontrastmittel verursachte "backscatter" gemessen wird (siehe "Standardisation of the measurement of acoustical Parameters of ultrasound contrast agents" First European Symposium on Ultrasound Contrast Imaging, January 25-26, 1996, Rotterdam).
Die Bestimmung der Teilchenzahl erfolgter nach der Coulter-Counter-Methode.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung des Eifindungsgegenstandes, ohne ihn auf diese beschränken zu wollen. Beispiel 1
3,0 g Hyaluronsäurebenzylester, bei dem alle Carboxylgruppen sind verestert (MW = 160 kDal) wird in 40 ml Methylenchlorid gelöst. 10 ml Perfluoropentan wird mittels Ultraturrax [10 000 Umdrehungen pro Minute (UPM)] 2 Minuten lang in der Polymerlösung dispergiert. Die entstandene (O/O)- Emulsion wird in 400 ml einer 2 %igen Polyvinylalkohol-Lösung (PVA-Lösung), die auf 0 °C temperiert ist, mittels mechanischen Rührers (Dispermat FT, VMA-Getzmann GmbH) 30 Minuten lang bei 10 000 UPM dispergiert. Die (O/O/W) Emulsion wird in einem Dreihalskolben, versehen mit einem Rührer (300 UPM), überführt und es wird 3 h lang bei 20 °C durch N - Einleitung und duch Vakuum das Lösungsmittel entfernt. Anschließend wird die Suspension durch Ultrafiltration von dem eingesetzten Tensid und dem Restlösungsmittel befreit, daß Volumen der Suspension auf ein Minimum (50 ml) eingeengt, die Suspension mit einem pharmazeutisch akzeptabelen Kyroprotektor versetzt und gefriergetrocknet. Das in Wasser resuspendierte Lyophilisat enthält Mikropartikel (Durchmesser von 0,1- 8 μm) und zeigt einen hervorragenden in vitro Rückstreukoeffizienten αs = 2.5 x 10'1 (dB/cm), bei 5 MHz Senderfrequenz und einer Teilchenkonzentration c = 4.0 x 106 T/mj.
Beispiel 2
Es wird wie in Beispiel 1 verfahren, wobei Perfluoropentan durch Perfluorohexan ersetzt wird. Das in Wasser resuspendierte Lyophilisat enthält ultraschallaktive Mikropartikel mit einem Durchmesser von 0,1 bis 8 μm.
Beispiel 3
Es wird wie in Beispiel (1) verfahren, wobei der eingesetzte polymere Hyaluronsäurebenzylester einen Veresterungsgrad von 75 % besitzt und als Lösungsmittel 40 ml Methylencholorid / Essigsäureethylester (Volumenanteil 2:1) eingesetzt wird. Das in Wasser aufgenommene Lyophilisat enthält ultraschallaktive Mikropartikel mit einem Durchmesser von 0,1 bis 8 μm.
Beispiel 4
Es wird wie in Beispiel (1) verfahren, wobei der Polymere Hyaluronsäurebenzylester in 40 ml Methylencholorid / Dimethylsulfoxid (DMSO) ( Volumenanteil 2:1) gelöst wird. Die in einer 0,9 % NaCl-Lösung resuspendierten Partikel zeigen einen in vitro Rückstreukoeffizienten αs = 2.3 x 10"1 (dB/cm), bei 5 MHz Senderfrequenz und einer Teilchenkonzentration c = 3.6 x 106 T/ml und haben einen Durchmesser von 0,5 bis 8 μm.
Beispiel 5
Es wird wie in Beispiel (1) verfahren, wobei als Polymer Hyaluronsäurepentylester (Veresterungsgrad 100 %, MW = 250 kDal), gelöst in 40 ml Methylenchlorid / Ethyllactat (Volumenanteil 2:1), eingesetzt wird. Das in einer 5,5 % igen Mannitol- Lösung aufgenommene Lyophilisat enthält ultraschallaktive Mikropartikel mit einem Durchmesser von 0,1-6 μm.
Beispiel 6 Es wird wie in Beispiel (1) verfahren, wobei als Polymer Hyaluronsäurepalmitoylester (Veresterungsrad 50 % , MW = 150 kDal) eingesetzt wird. Das in Wasser resuspendierte Lyophilisat enthält ultaschallaktive Mikropartikel mit einem Durchmesser von 0,3 -8 μm.
Beispiel 7
Es wird wie in Beispiel (1) verfahren, wobei das Polymer Hyaluronsäurebenzylester durch Hyaluronsäuredodecylester (Veresterungsgrad 75 % , MW = 50 kDal) ersetzt wird. Das in einer 0,9 %igen NaCl-Lösung resuspendierte Lyophilisat enthält ultraschallaktive Mikropartikel mit einem Durchmesser von 0,3 - 7 μm.
Beispiel 8
3,0 g Pal itoyldextan (Substitutionsgrad 35 %, MW = 10-12 kDal) wird in 40 ml Methylenchlorid/ Isopropylacetat (Volumenanteil 2:1) gelöst. 10 ml Perfluoropentan wird mittels Ultraturrax (10 000 UPM) 2 Minuten lang in der Polymerlösung dispergiert. Die entstandene (O/O)-Emulsion wird in 400 ml 2 % PVA-Lösung, die auf 0°C temperiert ist, mittels mechanischen Rührers (Dispermat FT, VMA - Getzmann GmbH) 30 Minuten lang bei 10 000 UPM dispergiert. Die (O/O/W) Emulsion wird in einen Dreihalskolben, versehen mit einem Rührer (300 UPM ), überführt und 3 h lang bei 20 °C durch ^-Einleitung und duch Vakuum vom Lösungsmittel befreit. Anschließend wird die Suspension durch Ultrafiltration von dem eingesetzten Tensid und Restlösungsmittel befreit, das Volumen der Suspension auf ein Minimum (50 ml) eingeengt und die Suspension mit einem pharmazeutisch akzeptabelen Kyroprotektor versetzt und gefriergetrocknet. Das in Wasser resuspendierte Lyophilisat enthält Mikropartikel mit einem Durchmesser von 0,1 bis 8 μm und zeigt einen hervorragenden in vitro Rückstreukoeffizienten αs = 2,0 x 10"1 (dB/cm), bei 5 MHz Senderfrequenz und einer Teilchenkonzentration c = 4,0 x 106 T/ml.
Beispiel 9 Es wird wie in Beispiel (8) verfahren, wobei als Polymer 3,0 g Bernsteinsäuremono-
N,N-bis(octadecyl)amindextran (Substitutionsgrad 20 %; MW = 8 kDal) und als
Lösungsmittel 40 ml Methylencholorid eingesetzt wird.
Das in Wasser resuspendierte Lyophilisat enthält ultraschallaktive Mikropartikel mit einem Durchmesser von 0,1 bis 6 μm.
Beispiel 10
Es wird wie in Beispiel (8) verfahren, wobei als Polymer 3,0 g Palmitoylpullan (Substitutionsgrad 30 %; MW = 51 kDal) eingesetzt wird. Das in einer 0,9 %igen NaCl-Lösung resuspendierte Lyophilisat enthält ultraschallaktive Mikropartikel mit einem Durchmesser von 0,1 bis 8 μm.
Beispiel 11 Es wird wie in Beispiel (8) verfahren, wobei als Polymer 3,0 g Palmitoylamylopectin (Substitionsgrad 30 % , MW = 112 kDal) und als Lösungsmittel 40 ml Methylenchlorid eingesetzt wird. Das in einer 5,5 %igen Mannitol-Lösung resuspendierte Lyophilisat enthält ultraschallaktive Mikropartikel mit einem Durchmesser von 0,3 bis 7 μm.
Beispiel 12
Es wird wie in Beispiel (11) verfahren, wobei als Polymer Palmitoylamylose (Substitutionsgrad 30 %, MW = 100 kDal) und als Lösungsmittel 40 ml Methylenchlorid/Propylformiat (Volumenanteil 2:1) eingesetzt wird.
Das in Wasser resuspendierte Lyophilisat enthält ultraschallaktive Mikropartikel mit einem Durchmesser von 0, 1 bis 7 μm. Beispiel 13
Es wird wie in Beispiel (11) verfahren, wobei als Polymer 3,0 g Palmitoylmannan mit einem Substitutionsgrad von 35 % eingesetzt wird.
Das in Wasser resuspendierte Lyophilisat enthält ultaschallaktive Mikropartikel mit einem Durchmesser von 0,1 bis 7 μm.
Beispiel 14
Es wird wie in Beispiel (11) verfahren, wobei als Polymer 3,0 g Palmitoylchitosan mit einem Substitutionsgrad von 35 % eingesetzt wird.
Das in einer 0,9 %igen NaCl Lösung resuspendierte Lyophilisat enthält ultraschallaktive Mikropartikel mit einem Durchmesser von 0,1 bis 7 μm.

Claims

Patentansprüche
1. Mikropartikel zur Herstellung eines Präparates für die Ultraschalldiagnostik, bestehend aus hydrophobisierten Polysacchariden und einer bei Körpertemperatur gasförmigen Komponente.
2. Mikropartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als hydrophobisierte Polysaccharide Derivate der Hyaluronsäure, des Dextrans, des Pullans, des Amylopektins, der Amylose, des Mannans und/oder des Chitosans verwendet werden, wobei funktionelle Gruppen durch Propyl- ,
Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, Pentyl-, Isopentyl-, Hexyl-, Octyl-, Decyl-, Dodecyl-, Pahnitoyl-, Stearinoyl-, Lauryl- und/oderBenzylgruppen ganz oder teilweise verestert oder verethert sind.
3. Mikropartikel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß 30 bis 100 % der funktioneilen Gruppen des Polysaccharids verestert oder verethert sind.
4. Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophobisierten Polysaccharide ein Molekulargewicht von 10 - 250 kDalton haben.
5. Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel einen mittleren Partikeldurchmesser von 500 nm bis 10 μm aufweisen.
6. Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß als bei Körpertemperatur gasförmige Komponente Luft, Stickstoff und Edelgase enthalten sind.
7. Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß als gasförmige Komponente perfluorierte Verbindung enthalten sind.
8. Mikropartikel nach einem der Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als perfluorierte Verbindung Perfluoropentan, Perfuorohexan, Perfluoro-1,3- dirnethylcyclohexan, Perfluorocyclohexan, Perfluorodecalin und/oder Perfluoroether enthalten ist.
9. Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß hydrophobisiertes Polysaccharid Hyaluronsäurebenzylester, Hyaluronsäurepentylester, Hyaluronsäurepalmitoylester, Hyaluronsäuredodecylester, Palmitoyldextan, Bernsteinsäuremono-N,N- bis(octadecyl)amindextran, Palmitoylpullan, Palmitoylamylopectin,
Palmitoylamylose, Palmitoylmannan oder Palmitoylchitosan verwendet wird.
10. Ultraschallkontrastmittel enthaltend Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in einem physiologisch verträglichen flüssigen Suspensionsmedium gegebenenfalls mit den in der pharmazeutischen Technologie üblichen
Zusätzen.
11. Ultraschallkontrastmittel nach Anspruch 10 enthaltend als physiologisch verträgliches Suspensionsmedium Wasser, wäßrige Lösungen eines oder mehrerer anorganischener Salze oder wäßrige Lösungen von Mono- oder
Disacchariden, die gegebenenfalls zusätzlich eine oberflächenaktive Substanz aus der Gruppe der Polysorbate, Polysaccharide, Poloxamere® oder Poloxamine® sowie Polyvinylpyrolidon, Saccharosemono- oder diester und/oder einen physiologisch verträglichen mehrwertigen Alkohl enthalten.
12. Ein Kit für die Herstellung eines Mikropartikel und Gas enthaltenenden Ultra- schallkontrastmittels bestehend aus
a) einem ersten Behälter, versehen mit einem Verschluß, der die Entnahme des Inhalts unter sterilen Bedingungen ermöglicht und mit dem flüssigen
Suspensionsmedium gefüllt ist und
b) einem zweiten Behälter, versehen mit einem Verschluß, der die Zugabe des Suspensionsmediums unter sterilen Bedingungen ermöglicht, gefüllt mit Mikropartikeln nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und einem Gas oder Gasgemisch welches identisch mit dem in den Mikropartikeln enthaltenen Gas ist, wobei das Volumen des zweiten Behälters so bemessen ist, daß das Suspensionsmedium des ersten Behälters vollständig im zweiten Behälter Platz findet.
13. Verfahren zur Herstellung eines Mikropartikel und Gas enthaltenden Kontrastmittels für die Ultraschalldiagnostik, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit einer physiologisch verträglichen Trägerflüssigkeit vereinigt und bis zum Entstehen einer homogenen Suspension schüttelt.
14. Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das jeweilige Polymer, sowie gegebenenfalls eine oberflächenaktive Substanz in einem organischen Lösungsmittel oder Lösunsmittelgemisch löst, in dieser Lösung eine Perfluoro-
Verbindung oder Wasser dispergiert und anschließend diese Dispersion in Wasser, das gewünschtenfalls eine oberflächenaktive Substanz enthält, gibt und dispergiert, wobei das Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch durch Gaseinleitung und gegebenenfalls Anlegen eines Vakuums entfernt wird und abschließend die so erhaltene Suspension mit einem pharmazeutisch akzeptablen Kyroprotektor vermischt und gefriergetrocknet.
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