WO1997030159A2 - Proteine recombinante contenant un fragment c-terminal de msp-1 tde plasmodium - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to new active principles of vaccines.
- MSP-1 10 derivatives of the major surface protein of merozoite forms of an infectious plasmodium for mammals, in particular humans, more generally known by the designation MSP-1
- This protein has already been the subject of numerous studies. It is synthesized in the schizont stage of parasites of the Plasmodium type,
- Plasmodium falciparum in particular Plasmodium falciparum, and is expressed in the form of one of the major constituents of the surface of the merozoites both during the hepatic stage and during the erythrocytic stage of malaria (1, 2, 3, 4). Due to the predominance and conservation in all known Plasmodium species of this protein, it has been suggested
- the C-terminal fragment having a molecular weight of 42 kDa (7.8) is noted, which is in turn cleaved again into an N-terminal fragment having a conventional apparent molecular weight of 33 kDa and a C-terminal fragment having a conventional apparent molecular weight of 19 kDa (9)
- references to proteins p42 and p19 derived from a certain type of Plasmodium are understood to relate to the corresponding C-termmal cleavage products of the MSP-1 protein of this Plasmodium, or, by extension, to products containing substantially the same amino acid sequences, obtained by genetic recombination or by chemical synthesis according to conventional techniques, for example by synthesizer of the “Applied System” type or by synthesis on solid phase of the “Mer ⁇ field” type.
- references to "recombinant p42" and “recombinant p19” refer to "p42" and "p19” obtained by techniques comprising at least one step of genetic engineering
- composition containing the fusion protein p19 with a glutathione-S-transferase produced in E coli in association with alum or liposomes did not have any protective effect on any of the six Aotus nancymai monkeys vaccinated (40)
- P vivax and the Aotus model for P falciparum, are artificial systems, requiring the adaptation of parasite strains and often the spienectomy of animals to obtain significant parasitaemias. Consequently, the vaccination results from these models can only have limited predictive value for humans
- the p42s originating from various infectious Plasmodiums for humans comprise hyperva ⁇ able regions mainly concentrating in their regions III, and even more in their respective regions II see the publication by Longacre, S (13) in which the p42 sequences of P cynomolgy, P vivax (Belem) and P vivax (Sal-I) were aligned.
- a first object of the invention is therefore to provide active ingredients of vaccines derived from the p42 better able to protect the host against the immune escape he was above question II is evident that the fragmentation of the p42 which has just been considered can also be extended to P falciparum, the parasite mainly responsible for acute forms of malaria in humans, and this all the more so as the locations of the zones separating regions I, II, III and IV of the constitutive sequences of P.cynomolgi and of the two varieties of P vivax were determined by analogy with corresponding sites, previously identified in P.falciparum, as described by (34) (35)
- the invention relates more particularly to vaccine compositions against a parasite of the Plasmodium type infectious for humans, containing as active ingredient a recombinant protein glycosylated or not, whose essential constitutive polypeptide sequence is that
- the invention therefore relates more particularly to a recombinant protein, glycosylated or not derived from p42 and containing both the essential parts of region I and region IV defined above for the constitution of immunogenic compositions, in particular vaccines
- recombinant proteins derived from the recombinant p42 produced by S Longacre et al (14) can be used in such compositions
- S Longacre et al succeeded in producing a recombinant p1 9 from MSP-1 of P vivax in a baculovirus vector system containing a nucleotide sequence coding for the p19 of Plasmodium vivax, in particular by transfection of cultures of insect cells [line of Spodoptera frugiperda (Sf9)] with baculovirus vectors containing, under the control of the polyhed ⁇ ne promoter, a sequence coding for the peptide fragments defined below, the sequences of which were placed in the following order in the baculovirus vector used 5'-term fragment of 35 base pairs of the polyhednne signal sequence, from which the methionine codon for initiating the expression of this protein had been mutated (in ATT),
- nucleotide sequence coding for p19 or a sequence coding for p42 of the MSP-1 protein of Plasmodium vivax, these sequences being also, as the case may be, either provided (“anchored” forms) or lacking (soluble forms) ) 3 ′ end regions of these nucleotide sequences whose extreme C-terminal expression products are pondered to play an essential role in the anchoring of the final protein p19 on the membrane of the parasite,
- MSP-1 therefore extended from amino acid Asp 1325 to amino acid Leu 1726 (anchored form) or amino acid Ser 1705 (soluble form) and for p19, the sequences extended from l amino acid Ile 1602 to amino acid Leu 1726 (anchored form) or to amino acid Ser 1705 (soluble form), it being understood that the complete amino acid sequences of p42 and p19 whose initial and terminal amino acids have shown in the above stem from the Belem P vivax isolate gene which has been sequenced (20)
- P cynomolgi has a double interest it is a parasitic species very close to P vivax, which is very infectious for the macaque very close to P vivax II can also infect humans
- P cynomolgi rhesus monkeys and toques monkeys
- the rhesus monkey is considered to be one of the most representative species of immune reactions in humans.
- the recombinant baculovirus proteins derived from a C-terminal part of MSP-1 (p42), and more particularly the partially deleted p42s, have a very significant antimalarial protective effect in a natural system, which constitutes the evaluation model for the most representative protective effect of MSP-1 for humans
- the protective effect obtained could be all the better if the partially deleted p42 is devoid of the hyperva ⁇ able region of the N-terminal part of p42, the effect of which can be deleterious in natural situations in which the vaccinated subject is confronted with significant polymorphism
- region II and of all or part of region III normally leads to better results. It is clear that a person skilled in the art would have no difficulty in producing fusion proteins between regions I and IV of p42. corresponding, or even between a region I and a region IV originating respectively from two p42 originating from two different varieties of Plasmodium II naturally goes without saying that these fusion proteins may also contain linking elements still corresponding to parts of region II , preferably from region III, preferably chosen from among the best conserved.
- the C-terminal polypeptide sequence of p33 when it is present, comprises less than 50 amino acid residues, or even even less than 35, or even less than 10 amino acid residues
- the polypeptide sequence of the partially deleted p42 protein may not contain the entire sequence coding for p19 (or of the region IV), naturally provided that the latter retains the capacity to induce protective antibodies against parasite
- the aforesaid “part of fragment has a molecular weight of 10 to 25 kDa, in particular of 10 to 15 kDa
- this part of polypeptide fragment contains at least one of the two regions EGF (abbreviation of the English expression "Epidermal Growth Factor")
- region I of the recombinant protein according to the invention is able to differentiate between the active fragments and those which would cease to be so, in particular of experimentally by producing modified vectors containing, for example, inserts comprising parts of p42 and in particular of deleted p42, of different lengths, respectively produced from the coding sequence for p42, if appropriate, partially deleted, by reaction with appropriate restriction enzymes, or alternatively exonucleolytic enzymes which would have been kept in contact with the fragment coding for the initial p42, if necessary, partially deleted for variable times; the capacity of the expression products of these inserts in corresponding eukaryotic cells, in particular insect cells, transformed by the corresponding modified vectors, to exert a protective effect, which can then be tested, in particular under the experimental conditions which will be described more away, about the examples.
- the expression products of these inserts must be capable of inhibiting a parasitaemia induced in vivo by the entire corresponding parasit
- the invention includes all immunogenic or even vaccinating compositions in which the essential constitutive polypeptide sequence of the active principle would consist of a peptide capable of inducing an immunological response of cell and / or humoral type equivalent to that produced by the protein. partially deleted as defined above, since the addition, deletion or substitution in its sequence of certain amino acids by others would not result in a significant modification of the capacity of the peptide thus modified hereinafter called "immunologically equivalent peptide" - also to inhibit the above parasitaemia
- Partially deleted p42 can naturally also be associated, whether on the N-terminal side or on the C-Terminal side or via a peptide bond, with another fragment of plasmodial protein having a vaccinating potential such as for example a protein (“Duffy Bmding Protein” by P vivax (29) or EBA-175 by P. falciparum (30) and (31) whose region is specifically rich in cysteine), provided that is not altered, on the contrary amplified, its capacity to inhibit a parasitaemia normally introduced in vivo by the corresponding parasite
- Duffy Bmding Protein by P vivax (29) or EBA-175 by P. falciparum (30) and (31) whose region is specifically rich in cysteine
- the fragment coding for the partially deleted p42 or a part thereof may also contain, upstream from its N-terminal end, an even different peptide sequence, for example a C-terminal fragment of the signal peptide of the protein MSP- 1.
- This sequence preferably comprises less than 50 amino acids, for example from 10 to 35 amino acids
- the invention also provides a method which largely remedies this difficulty. It also becomes possible to obtain much higher yields of p42 of P.falciparum - and other plasmodiums when similar difficulties are encountered - by putting in place implements a synthetic nucleotide sequence of substitution for the natural nucleotide sequence coding for the p42 of Plasmodium falciparum in an expression vector of a baculovirus system, this synthetic nucleotide sequence coding for the same p42, but being characterized by a proportion of nucleotides G and C higher than in the natural nucleotide sequence
- the invention stems from the discovery that the expression in a baculovirus system of a nucleotide sequence coding for a p42, partially deleted or not, was apparently linked to improved compatibility of the successive codons of the nucleotide sequence to express with the "cellular machinery" host cells transformable by baculoviruses, like what is observed for the natural nucleotide sequences normally contained in these baculoviruses and expressed in infected host cells, hence the bad expression, if not sometimes the complete absence of expression of a nucleotide sequence native to P falciparum; hence also a possible explanation for the more efficient expression observed of p42 of P.
- the invention therefore also relates, more generally, to a modified vector of the recombinant baculovirus type containing, under the control of a promoter contained in this vector and capable of being recognized by cells transfectable by this vector, a first nucleotide sequence coding for a signal peptide exploitable by a baculovirus system, characterized by a second nucleotide sequence downstream of the first, also under the control of this promoter and coding for a peptide sequence nevertheless comprising in its own constituent sequence, that:
- This sequence can be obtained by construction of a synthetic gene in which the natural codons have been changed by codons rich in G / C without their translation being modified (maintenance of the peptide sequence)
- said nucleotide sequence provided by synthetic DNA, can have at least 10% of codons modified with respect to the sequence of the natural gene or cDNA while retaining the characteristics of the translated natural sequence, that is to say -to say the maintenance of the sequence in ammo-acids
- sequence coding for the signal used may be that normally associated with the native sequence of the Plasmodium concerned. It may also be from another Plasmodium, for example P vivax or P cynomolgi or from another organism.
- the sequence coding for p42 or a part thereof within the vector considered is, if appropriate, devoid of the anchoring sequence of the protein native to the parasite from which it originates, in which case the expressed protein is generally excreted in the culture medium (soluble form)
- the invention also relates to the vectors in which the coding sequence contains the 3 'terminal end sequence coding for the hydrophobic C'-terminus sequence of p19 and which is normally involved in induction of the anchoring of the native protein to the cell membrane of the host in which it is expressed
- This 3'-terminal end region may moreover be heterologous with respect to the sequence coding for the rest of the corresponding p42, for example correspond to the 3'-terminal sequence originating from P vivax or from another organism since it codes for an anchoring sequence for all of the recombinant protein produced at the membrane of the cell host of the baculovirus system used as an example of such anchor sequences, the G
- the invention naturally also relates to recombinant proteins, these proteins comprising conformational epitopes recognized by human sera formed against the corresponding Plasmodium
- the invention also relates to any recombinant protein of the type indicated above, as soon as it comprises conformational epitopes such as produced in the baculovirus system, in particular those which are found to be unstable in a reducing medium.
- the invention naturally relates to said recombinant proteins, whether in the so-called soluble form or in the form provided with an anchoring region, in particular to the cellular hosts used in the baculovirus system.
- the invention also relates to any conjugation product between a partially deleted p42 or p42 as defined above, on the one hand, and a carrier molecule - for example a polylysine - alanine - usable for the production of vaccines, on the other hand, by intermediary of covalent bonds or not
- the vaccinating compositions using them also form part of the invention
- the invention also relates to the vaccine compositions using these recombinant or conjugated proteins, including, moreover, the proteins derived from Plasmodium vivax.
- compositions in which the aforementioned recombinant proteins are associated with an adjuvant for example an alum.
- the recombinant proteins comprising the extreme C-terminal region permitting their anchoring to the membrane of the cells in which they are produced are advantageously used in combination with lipids capable of forming liposomes and suitable for the production of vaccines Without having to be limited thereto, recourse may be had to the lipids described for this purpose by example in the work entitled “Liposomes technological, biological and pharmacological aspects” by J Delattre et al, INSERM edition, 1993
- PfMSP1 p ⁇ 9 S contains DNA corresponding to the 8 base pairs of the leader sequence and the first 32 amino acids of MSP1 of Plasmodium vivax from MeU to Asp 32 (isolate Belem, Del Portillo et al 1991 PNAS 88 , 4030) FOLLOWED by a GluPhe, due to the EcoRI site linking the two fragments. The whole is followed by the synthetic gene, described in FIG. 1, coding for Plasmodium. IX
- falciparum MSP1 p ⁇ 9 from Asn ⁇ 6 i 3 to Ser ⁇ 705 (isolate Kenya-Palo Alto, Chang et al 1988 Exp Parasitol. 67, 1). Construction is completed by two TAA stop codons. This construction gives rise to a recombinant protein which is secreted in the culture supernatant of infected cells.
- the construction PfMSP1 p19 A has characteristics of the previous except that the synthetic sequence ( Figure 1 B) codes for the MSP1 p ⁇ 9 of Plasmodium falciparum (Uganda-Palo alto isolate) from Asn ! 613 to ll ⁇ 726 followed by two stop codons of TAA.
- This construction gives rise to a recombinant protein which is anchored in the plasma membrane of infected cells by a structure of the glycosyl phosphatidyl inositol (GPI) type.
- GPI glycosyl phosphatidyl inositol
- Figure 1C is representative of the sequence of the recombinant protein PfMSP1 p ⁇ 9 S before cutting the signal sequence
- Figure 1 D is representative of the sequence of the recombinant protein PfMSP1 p ⁇ 9 S after cutting the signal sequence
- amino acids underlined in FIGS. 1 C and 1 D come from the EcoRI site used to join the nucleotide sequences derived from the N-terminal part of MSP1 of P vivax (with signal sequence) and of MSP1 p19 of P.falciparum
- FIG. 2 The recombinant antigen PfMSP1 p ⁇ 9 purified by immunoaffinity was analyzed by immunoblotting after SDS-PAGE in the presence (reduced) or absence (not reduced) of B-mercaptoethanol. The samples are loaded on gel after heating to 95 ° C. in the presence of 2% SDS. Under these conditions only bonds of the covalent type
- FIG. 3 The soluble PvMSP1 P42 recombinant antigen (Longacre et al. 1994, op. Cit.) was incubated for 5 hours at 37 ° in the presence of protein fractions derived from P. falciparum merozoites and separated by isoelectric focusing. the samples were then analyzed by immunoblotting in the presence (reduced) or absence (not reduced) of B-mercaptoethanol Fractions 5 to 12 of isoelectric focusing, as well as two total extracts of merozoites made in the presence (Tex) or absence (T) of detergent were analyzed The immunoblot was revealed with monoclonal antibodies specific for MSP1 p42 and pl9 of P.
- the DNA used for the above-mentioned construction was obtained from a clone of the Plasmodium cynomolgi ceylonesis strain (22-23) This strain was maintained by successive passages in its natural host (Macaca smica) and cyclic transmissions through mosquitoes (27) Blood parasites were obtained from infected monkeys at the mature schizont stage when the parasitaemias reached a level of 5% They were then purified according to the methods described in (25) The DNA was then extracted as described in (26 ) A 1200 base pair fragment was then produced using the PCR reaction using the oligonucleotides underlined in FIG.
- the 5 'oligonucleotide included an EcoRI restriction site and the oligonucleotide 3 'two synthetic TAA stop codons FOLLOWED by a Bglll restriction site This fragment was introduced by ligation and via these EcoRI and Bglll sites into the plasmid pVLSV 20 o already containing the signal sequence of the protein MSP-1 of P vivax (19)
- the new plasmid (pVLSV 20 oC 42 ) was used for the analysis of DNA sequences
- the PcMSP1 p ⁇ 9 S recombinant construct contains DNA corresponding to the 8 base pairs of the “leader” sequence and the first 32 amino acids of MSP1 from Met Plasmodium vivax! a Asp 32 (Belem isolate, Del Portillo et al 1991 PNAS 88, 4030) FOLLOWED by a GluPhe, due to the EcoRI site making the connection of the two fragments
- the whole is followed by the sequence coding for the MSP1 p ⁇ 9 of Plasmodium cynomolgi ( Ceylon strain) from Lys 276 to Ser 38 o Construction is terminated by two TAA stop codons This construction gives rise to a protein • >?
- the chromatography resin was prepared by binding 70 mg of a monoclonal antibody (obtained from a G17 12 hyb ⁇ dome deposited at the CNCM (Paris, France) on February 14, 1997 under the n ° l-1846, this G17 hyb ⁇ dome 12 was constructed from myeloma X63 Ag8 653 producing
- Plasmodium vivax recombinant MSP1 vaccination trial (p42 and p19) in the squirrel monkey Saimiri sciureus.
- GST glutathione-S-transferase
- Fifteen captured monkeys were used as follows: (1) 3 animals injected with 100 mcg PcMSP1 p42 soluble, 3 animals injected with 35 micrograms (1 st injection) or 50 ug (2 nd and 3 rd injections) PcMSP1 soluble p19; (3) 3 5 animals injected with a mixture of PcMSP1 p42 and p , 9 ; (4) 3 animals injected with the adjuvant plus PBS, (5) 3 animals not injected. The complete and incomplete Freund's adjuvant was used according to the protocol described above. The injections were made intramuscularly 4 weeks apart.
- the challenge infection was made by injecting 2.10 5 red blood cells infected with Plasmodium cynomolgi 4 weeks after the last injection Protection was assessed by determining daily parasitaemias in all animals by examining parasitaemias with giemsa Parasitaemias were classified as negative only after counting 400 smear fields Parasitaemias are expressed as a percentage of parasitized red blood cells
- Figures 6A-6G are illustrative of the results obtained In each of them appear the parasitaemias (expressed as percentages of parasitized red cells on the ordinate axis on the logarithmic scale) observed in the test animals as a function of the times after infection (in days on the x-axis)
- FIG. 6B relates to animals which had received a saline solution additionally containing the Freund's adjuvant
- FIG. 6C is a superposition of FIGS. 6A and 6B, with the aim of showing the relative results resulting from the administration of Freund's adjuvant to animals (the variations are obviously not significant)
- FIG. 6D provides the results obtained after vaccination with p42
- FIG. 6E relates to animals vaccinated with only p19
- FIG. 6F relates to the animals vaccinated with a mixture of p19 and p42
- FCA Freund's complete
- FIA incomplete adjuvant
- Monkeys bred in captivity were injected with 1 ml of moculum by the intramuscular route 2 times at 4 weeks apart as follows (1) 4 animals injected with 50 ⁇ g of soluble PfMSP1 p19 in the presence of Freund's adjuvant as follows l® re injection January 1 FCA / FIA, 2nd ignition 1 4 FCA / FIA, and mixed by the sequence 1 1 with the antigen in PBS, (2) 4 animals injected with 50 micrograms of PfMSP1 ⁇ 19 soluble in the presence of 10 mg of alum, (3) 4 animals injected with approximately 50 ⁇ g of PfMSP1 p19 anchored GPI reconstituted in liposomes compounds 1 1 in cholesterol molar and phosphatidyl cholme The animals were bled 17 days after the second injection
- FIG. 7 also illustrates these results. It relates to immunoblots produced on gel.
- the first three columns of the gel illustrate the m vivo response of monkeys to injections of p19 [(1) with Freund's adjuvant, (2) with l alum, (3) in the form of a liposome) and in particular the existence of high molecular weight complexes confirming the hypothesis of m vivo aggregation of p19 in the form of an oligomer, specific to the stage of maturation (when p42 is cut in p19 and p33)
- This vaccination trial also includes a third injection identical to the previous ones.
- the injection with Freund's adjuvant only includes FIA
- FIG. 7B The data for this figure are derived from the P falciparum I squirrel monkey vaccination trial (Figure 10 below) The figures correspond to the individual monkeys noted in Figure 10 The techniques and methods for this figure are the same as for Figure 7 except that the individual antiserum of each monkey noted was tested after three injections on the day of the challenge infection and the SHI antiserum was diluted 1,250 The results show that the antiserum of the 4 monkeys vaccinated with p19 and alum react significantly and specifically with very high molecular weight complexes while monkeys from other groups vaccinated with p19 and Freund's adjuvant or liposomes show only a low reactivity with these complexes Since the monkeys vaccinated with p19 and alum were also the best protected, this reactivity with high molecular weight complexes seems to indicate a protective effect, and this a despite that one monkey in the alum group was not protected from controls and another was only partially protected
- the invention naturally relates to other applications, for example
- the recombinant molecules according to the invention can be used to produce specific antibodies which can be used by passive transfer for the purpose of therapy adapted to severe malaria due to P falciparum with risk of mortality.
- the recombinant molecules PvMSP 1 p42 and PvMSP1 p19 and according to the invention, derived from baculovirus can and have been used to produce specific monoclonal antibodies mu ⁇ ns
- These antibodies, in combination with polyclonal anti p42 antisera from another species such as rabbit or goat, may be the basis of a semi-quantitative diagnostic test for malaria and capable of distinguishing between malaria due to P falciparum, which can be fatal, and malaria due to P vivax, which does not is generally not lethal
- the principle of this test would be to trap and quantify any MSP1 molecule containing the p42 part in the blood
- recombinant p42 and in particular partially deleted recombinant p42, are as follows (i) they are both well conserved within the same species and sufficiently divergent between different species to allow production easily species-specific reagents, under conditions whereby antibodies derived from different Plasmodiums can be produced, in particular against P falciparum and P vivax which do not give rise to cross-reactions, (n) since the recombinant p42 molecules derived from baculovirus seem to reproduce more the native structure of the corresponding native proteins, the antibodies produced against these proteins would be well suited for diagnostic use
- the microorganisms identified below were deposited according to rule 6 1 of Treaty of Budapest on 01 February 1996, under the following numbers
- the invention also relates to the use of these antibodies, then preferably fixed beforehand on a solid support (for example for affinity chromatography), for the purification of peptides of the p19 type initially contained in a mixture.
- the purification then involves a bringing this mixture into contact with the antibody, dissociation of the antigen-antibody complex and recovery of the purified p19 peptide
- p42 is deleted from a part or parts which are the least well conserved of region III, these are preferably regions having at least 10 amino acids and the degree of which storage in P vivax, P cynomolgi and P falciparum is less than 70% (less than seven of 10 identical amino acids, when aligned
- polyclonal and monoclonal antibodies of the present invention presented as recognizing p42 are preferably those which recognize more specifically regions other than region IV, to exclusion of region IV itself Preferably they recognize region I of p42
- the invention also relates to the hyb ⁇ domes secreting specific antibodies selectively recognizing the p42 of an MSP-1 protein of the merozoite form of a parasite of the Plasmodium type infectious for humans other than Plasmodium vivax and does not recognize
- these hyb ⁇ domes secrete antibodies which do not recognize the p42 of Plasmodium vivax or which specifically recognize the p42 of Plasmodium falciparum
- the invention also relates to a hyb ⁇ dome characterized in that it produces a monoclonal antibody which specifically recognizes the p42 of P vivax and of P cynomolgi
- a hyb ⁇ dome F10-3 was constructed from the myeloma X63 Ag8 653 producing IgG 2b / k recognizing the p42 of P vivax
- the invention also relates to vaccine compositions, also comprising mixtures of proteins or fragments, in particular mixtures of the type - p42 of P falciparum and p42 of P vivax,
- p42 is, where appropriate, devoid of its most hyperva ⁇ able regions.
- Sim B KL (1995) "EBA-175 An erythrocyte-bindmg ligand of Plasmodium falciparum”. Parasitology Today, vol. Il, n ° 6 213-217. (31) Sim BKL (1994) “Receptor and ligand domains for invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum” Science, 264 1941-1944 (32) Davies, A et al (1993), Biochem J 295 (Pt3) 889-896 "Expression of the glycosylphosphatidyhnositol-lmked complement-inhibitmg protein CD59 antigen m insect cells using a baculovirus vector"
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Abstract
L'invention concerne une protéine recombinante, fabriquée dans un système à baculovirus, dont la séquence polypeptidique constitutive essentielle est celle d'un fragment C-terminal de 42 kilodaltons (p42) de la protéine 1 de surface (protéine MSP-1) de la forme mérozoïte d'un parasite du type Plasmodium, en particulier Plasmodium falciparum, infectieux pour l'Homme, ce fragment p42 étant particulièrement délété de sa région II et, le cas échéant, aussi de sa région III. Cette protéine recombinante est applicable à la production de vaccins contre la malaria.
Description
PROTEINE RECOMBINANTE CONTENANT UN FRAGMENT C-TERMINAL DE MSP-1 TDE PLASMODIUM
L'invention concerne de nouveaux principes actifs de vaccins
10 dérivés de la protéine majeure de surface de formes merozoïtes d'un plasmodium infectieux pour des mammifères, notamment l'homme, plus généralement connue sous la désignation MSP-1
Cette protéine a déjà fait l'objet d'études nombreuses. Elle est synthétisée dans le stade schizonte des parasites du type Plasmodium,
15 notamment Plasmodium falciparum, et est exprimée sous forme de l'un des constituants majeurs de la surface des merozoïtes aussi bien pendant le stade hépatique que pendant le stade érythrocytique du paludisme (1 , 2, 3, 4). En raison du caractère prédominant et de la conservation dans toutes les espèces de Plasmodium connues de cette protéine, il a été suggéré
20 qu'elle pourrait représenter un candidat pour la constitution de vaccins anti-paludiques (5, 6)
Il en a encore été de même pour des fragments de cette protéine, particulièrement des produits naturels de clivage dont l'on observe la formation, par exemple au cours de l'invasion par le parasite des
25 érythrocytes de l'hôte infecté Parmi, ces produits de clivage, on relèvera le fragment C-terminal ayant un poids moléculaire de 42 kDa (7,8) qui est à son tour clivé une nouvelle fois en un fragment N-terminal ayant un poids moléculaire apparent conventionnel de 33 kDa et en un fragment C- terminal ayant un poids moléculaire apparent conventionnel de 19 kDa (9)
™ qui reste normalement fixé à la membrane du parasite au terme des
modifications dont il est lui-même l'objet, par l'intermédiaire de groupes du type glycosylphosphatidylinositol (GPI) (10, 1 1 )
On le retrouve encore au stade anneau précoce du cycle de développement intraérythrocytique (15, 16), d'où les observations qui ont été faites que ce fragment de 19 kDa pourrait jouer un rôle non encore connu, mais sans doute essentiel dans les processus reinvasifs. De là découlent les hypothèses déjà formulées dans le passé que cette protéine pourrait constituer une cible particulièrement efficace pour d'éventuels vaccins II sera entendu que les références souvent faites dans ce qui suit à des protéines p42 et p19 issues d'un certain type de Plasmodium s'entendent comme se rapportant aux produits de clivage C-termmaux correspondants de la protéine MSP-1 de ce Plasmodium, ou, par extension, à des produits contenant sensiblement les mêmes séquences en acides aminés, obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse chimique selon les techniques classiques, par exemple par synthétiseur de type « Applied System » ou par synthèse sur phase solide de type « Merπfield ». Pour la commodité du langage, les références à des « p42 recombinantes » et des « p19 recombinantes » se rapportent à des « p42 » et « p19 » obtenues par des techniques comportant au moins une étape de génie génétique
Devant la difficulté d'obtenir des quantités importantes de parasites pour P.falciparum et l'impossibilité de cultiver P vivax in vitro, il est devenu évident que le seul moyen de produire un vaccin antipaludique nécessite un recours aux techniques permettant l'utilisation des peptides ou protéines recombinantes Mais, le MSP-1 est très difficile à produire en entier à cause de sa grande taille d'environ 200 kDa, un fait qui a conduit les chercheurs à s'intéresser à la partie C-terminale dont la fonction, encore inconnue, est vraisemblablement la plus importante
Au titre, des protéines recombinantes concernant la partie C- terminale de MSP-1 de P.falciparum, qui ont été produites et testées chez le singe (12, 40, 41 ), on mentionnera
. une p19 fusionnée avec une glutathione-S-transférase produite dans E coh (40),
• une p42 fusionnée avec une glutathione-S-transférase produite dans
. une p19 fusionnée avec un polypeptide issu d'une anatoxine tétanique et porteur d'épitopes de cellules T auxiliaires produites dans S cerevisiae (12),
. une p42 produite dans un système baculovirus (41 )
Une composition contenant la protéine de fusion p19 avec une glutathione-S-transférase produite dans E coli en association avec alun ou liposomes n'a pas exercé d'effet protecteur sur aucun des six singes Aotus nancymai vaccinés (40)
Une composition contenant la protéine de fusion p42 avec une glutathione-S-transférase produite dans E coli en association avec un adjuvant complet de Freund n ont pas exercé d'effet protecteur dans les deux types de singes Aotus (A nancymai et A vociferans) auxquels elles avaient été administrées La protéine p19 produite dans S cerevisiae a exercé un effet protecteur dans deux singes Aotus de type A nancymai (12) Par contre elle n'a pas exercé d'effet protecteur dans deux singes Aotus de type A vociferans Certains chercheurs (Chang et al ) ont également rapporté des essais d'immunisation réalisés chez le lapin avec une protéine recombinante p42 produite dans un système baculovirus et contenant une séquence d'acides aminés en commun avec P falciparum (18) Ainsi ces derniers auteurs indiquent-ils que cette p42 recombinante se comporte chez le lapin sensiblement de la même façon que la protéine MSP-1 recombinante entière (gp195) Cette protéine p42 en association avec un
adjuvant complet de Freund a fait l'objet d'un essai de vaccination dans un primate non-humain susceptible à l'infection par P falciparum., Aotus, lemunnus grisemembra (40) Les résultats montrent que 2 sur 3 animaux ont été complètement protégés et le troisième, bien que montrant une parasitémie semblable aux contrôles, avait une période latente plus longue II est néanmoins hasardeux de conclure au caractère protecteur chez l'homme des anticorps ainsi induits à rencontre des parasites eux- mêmes Rappelons en effet qu'il n'existe pas actuellement de modèles expérimentaux très satisfaisants chez le primate pour P vivax et P falciparum Le modèle Saimin, qui a été développé pour P falciparum et
P vivax, et le modèle Aotus pour P falciparum, sont des systèmes artificiels, nécessitant l'adaptation de souches de parasite et souvent la spiénectomie des animaux pour obtenir des parasitémies significatives En conséquence, les résultats de vaccination provenant de ces modèles ne peuvent avoir qu'une valeur prédictive limitée pour l'Homme
Outre que l'on peut donc s'interroger sur ce que serait un taux réel de vaccination susceptible d'être éventuellement obtenu avec de telles protéines recombinantes, la présence dans les p42 issues des Plasmodiums de la même espèce, et plus particulièrement dans les p33 correspondantes, de régions hypervaπables pourraient rendre aléatoires en de nombreux cas l'efficacité immuπoprotectπce des anticorps induits chez des personnes vaccinées par une p42 issue d'une souche de Plasmodium à rencontre d'une infection par d'autres souches de la même espèce (13) Le polymorphisme important des régions centrales de la p42 pourrait même jouer un rôle significatif dans l'échappement immunitaire, souvent observe pour ce type de parasites
Mais il s'avère que les p42 issues de divers Plasmodiums infectieux pour l'homme comportent des régions hypervaπables se concentrant principalement dans leurs régions III, et plus encore dans leurs régions II respectives voir la publication de Longacre, S (13) dans laquelle les
séquences des p42 de P cynomolgy, P vivax (Belem) et P vivax (Sal-I) ont été mises en alignement. La séquence « consensus » de la figure 4 jointe ajoutée aux séquences des p42 de ces trois parasites en témoigne.
On se rapportera à l'article de Longacre, S. (13) dans lequel sont exposées les conditions dans lesquelles lesdites régions ont été déterminées. Il est remarqué que la figure 4 jointe n'est autre qu'une reproduction de la figure 1 de l'article de Longacre Le lecteur est donc invité à se reporter à la légende de cette figure Celle-ci fait également apparaître les tailles relatives des quatre régions de la p42 (la région IV correspondant à la séquence de la p19) exprimées en pourcentages vis-à-vis de la taille de la séquence codante de la p42 en son entier.
Comme cela découle également de la figure 4 de la présente demande, les pourcentages d'homologie sont élevés entre les séquences des régions I des P.cynomolgi et P vivax : 84% dans la région I, 86% dans la région IV En revanche, ce pourcentage d'homologie décroît fortement dans la région III (69%) et plus encore dans la région II (47%).
Un premier objectif de l'invention est par conséquent de fournir des principes actifs de vaccins issus de la p42 davantage capables de protéger l'hôte contre l'échappement immunitaire dont il était question ci-dessus II va de soi que la fragmentation de la p42 qui vient d'être envisagée peut également être étendue à P falciparum, le parasite principalement responsable de formes aiguës du paludisme chez l'homme, et cela d'autant plus que les localisations des zones séparant les régions I, II, III et IV des séquences constitutives de P.cynomolgi et des deux variétés de P vivax ont été déterminées par analogie avec des sites correspondants, identifiés au préalable dans P.falciparum, comme cela a été décrit par (34) (35)
L'invention concerne plus particulièrement des compositions vaccinantes contre un parasite du type Plasmodium infectieux pour l'homme, contenant à titre de principe actif une protéine recombinante
glycosylee ou non, dont la séquence polypeptidique constitutive essentielle est celle
• soit de la p42 dont ont été délétées la région II et, le cas échéant, tout ou partie de la région III , • soit d'une partie de ce fragment dès lors qu'elle est apte aussi à induire une réponse immune capable d'inhiber une parasitémie in vivo par le parasite correspondant ,
• soit d'un peptide immunologiquement équivalent à ce fragment p42 ou à la susdite partie de ce fragment, et cette protéine recombinante comportant en outre des epitopes conformationnels instables en milieu réducteur et constituant, de préférence, la majorité des epitopes reconnus par des antisérums humains formés contre le Plasmodium correspondant
L'invention concerne donc plus particulièrement une protéine recombinante, glycosilée ou non issue de la p42 et contenant à la fois les parties essentielles de la région I et la région IV définie ci-dessus pour la constitution de compositions immunogènes, notamment de vaccins
La susdite protéine recombinante, glycosylee ou non, contient le cas échéant aussi la partie conservée de la région III qui se situe du côté C- terminal de la p33, proche de la p19, en particulier celle qui s'étend entre les acides aminés 255 à 273, ou plus particulièrement encore entre les acides aminés 255 à 270 (voir numérotation de la séquence consensus de la figure 4)
En d'autres termes tout ou partie peu conservée de la région III peut être délatée de la partie N-terminale de la région III
Pour la commodité du langage, il sera souvent fait référence dans ce qui suite a une « p42 partiellement délétee » pour désigner la p42 modifiée, selon ce qui a été défini ci-dessus
La présence dans ce principe actif des susdits epitopes conformationnels pourrait jouer un rôle important dans l'efficacité protectrice qu'il est susceptible de conférer à l'hôte vacciné On les
retrouve tout particulièrement dans les principes actifs présentant par ailleurs les autres caractéristiques définies ci-dessus, lorsqu'ils ont été produits dans un système vecteur baculovirus S'il en est besoin, il est mentionné ci-après que par l'expression « système de vecteur baculovirus » on entend l'ensemble que constitue le vecteur type baculovirus lui-même et les lignées cellulaires, notamment cellules d'insectes transfectables par un baculovirus modifié par une séquence à transférer dans ces lignées cellulaires avec pour résultat l'expression de cette séquence transférée Des exemples préférés de ces deux partenaires du système baculovirus, ont été décrits dans l'article de Longacre et al
(19) C'est le même système qui a été utilisé dans les exemples qui suivent II va naturellement de soi que des variants, tant du baculovirus que des cellules infectables par ce baculovirus peuvent être utilisés en lieu et place de celui qui a été choisi Le caractère instable en milieu réducteur de ces epitopes conformationnels peut être mis en évidence, notamment par le test décrit plus loin dans les exemples, notamment en présence de β-mercaptoéthanol
De ce point de vue, des protéines recombinantes dérivées de la p42 recombinante produite par S Longacre et al (14) peuvent être mises en oeuvre dans de tels compositions II est rappelé que S Longacre et al réussirent à produire une p1 9 recombinante issue de la MSP-1 de P vivax dans un système vecteur à baculovirus contenant une séquence nucléotidique codant pour la p19 de Plasmodium vivax, en particulier par transfection de cultures de cellules d'insectes [lignée de Spodoptera frugiperda (Sf9)] avec des baculovirus vecteurs contenant, sous le contrôle du promoteur de la polyhédπne, une séquence codant pour les fragments peptidiques définis ci-dessous, dont les séquences étaient placées dans l'ordre suivant dans le vecteur baculovirus utilisé
• fragment 5'-termιnal de 35 paires de bases de la séquence signal de la polyhédnne, dont avait été muté (en ATT) le codon méthionine d'initiation de l'expression de cette protéine,
• un fragment 5'-termιnal nucléotidique codant pour un peptide de 32 acides aminés correspondant à la partie N-terminale de MSP-1 , y compris le peptide signal de MSP-1 ,
• soit une séquence nucléotidique codant pour la p19, soit une séquence codant pour la p42 de la protéine MSP-1 de Plasmodium vivax, ces séquences étant aussi, selon le cas, soit pourvues (formes « ancrées »), soit dépourvues (formes solubles) des régions d'extrémité 3' de ces séquences de nucleotides dont les produits d'expression C-terminaux extrêmes sont réputés jouer un rôle essentiel dans l'ancrage de la protéine finale p19 sur la membrane du parasite ,
• 2 codons stop TAA Pour la p42, les séquences dérivées de la région C-termmale de
MSP-1 s'étendaient par conséquent de l'acide aminé Asp 1325 à l'acide aminé Leu 1726 (forme ancrée) ou a l'acide aminé Ser 1705 (forme soluble) et pour la p19, les séquences s'étendaient de l'acide aminé Ile 1602 à l'acide aminé Leu 1726 (forme ancrée) ou a l'acide aminé Ser 1705 (forme soluble), étant entendu que les séquences en acides aminés complètes de p42 et p19 dont les acides aminés initiaux et terminaux ont été indiqués dans ce qui précède découlent du gène de l'isolât Belem de P vivax qui a été séquence (20)
Des résultats semblables ont été obtenus en mettant en oeuvre dans les mêmes systèmes de vecteurs des séquences nucléotidiques codant pour la p19 et la p42 de Plasmodium cynomolgi P cynomolgi présente un double intérêt c'est une espèce parasitaire très proche de P vivax, qui est très infectieuse pour le macaque très proche de P vivax II peut aussi infecter l'Homme On a également accès à des hôtes naturels de P cynomolgi, les singes rhésus et les singes toques, pour tester
l'efficacité de protection du MSP-1 de P.cynomolgl dans des systèmes naturels. Le singe rhésus est considéré comme une des espèces les plus représentatives des réactions immunitaires chez l'Homme.
En particulier, on a obtenu d'excellents résultats dans des essais de vaccination réalisés chez le singe toque avec deux polypeptides recombinants : la p42 et la p19 solubles, dérivées de P.cynomolgi, respectivement produites dans un système baculovirus et purifiées sur colonne d'affinité avec des anticorps monoclonaux reconnaissant les régions correspondantes de la protéine MSP-1 native Les observations suivantes ont été faites • les six singes immunisés avec le seul p19 (trois singes) et le 19 et p42 ensemble (3 singes) ont tous témoigné d'une immunité presque stérile après infection d'épreuve Les résultats obtenus chez les trois singes immunisés avec le p42 ont été moins significatifs Deux d'entre eux se sont comportés comme les précédents, mais si le troisième a manifesté une parasitémie moins importante que des témoins immunisés avec un tampon PBS en présence de l'adjuvant de Freund (3 singes) ou non immunisés (3 singes), elle n'en n'était pas moins patente
Les résultats des essais particulièrement efficaces réalisés chez le macaque avec des polypeptides recombinants produits dans un système baculovirus mettant en oeuvre une p42, en association avec une p19 recombinante de P.cynomolgi, établissent que des polypeptides recombinants contenant respectivement des p42 recombinantes issus d'autres Plasmodiums doivent se comporter de la même manière Ces essais sont « plus parlants » pour le paludisme chez l'Homme que les résultats d'essais réalisés avec P. vivax ou P.falciparum dans leurs « hôtes artificiels ».
Les protéines recombinantes de baculovirus, dérivées d'une partie C-terminale de MSP-1 (p42), et plus particulièrement les p42 partiellement délétées, ont un effet protecteur antipaludique très significatif dans un système naturel, qui constitue le modèle d'évaluation de l'effet protecteur de MSP-1 le plus représentatif pour l'homme
L'effet protecteur obtenu pourrait être d'autant meilleur que la p42 partiellement délétée est dépourvue de la région hypervaπable de la partie N-terminale du p42, dont l'effet peut être délétère dans des situations naturelles dans lesquelles le sujet vacciné est confronté à un polymorphisme important
Mais la délétion de la région II et de tout ou partie de la région III conduit normalement à des résultats meilleurs II est clair que l'homme du métier n'éprouverait aucune difficulté à réaliser des protéines de fusion entre des régions I et IV des p42 correspondantes, voire même entre une région I et une région IV provenant respectivement de deux p42 issues de deux variétés différentes de Plasmodium II va naturellement de soi que ces protéines de fusion peuvent aussi contenir des éléments de liaison correspondant encore a des parties de la région II, de préférence de la région III, choisies de préférence parmi les mieux conservées A titre d'exemple, on mentionnera la séquence polypeptidique C-terminale de la p33, lorsqu'elle est présente, comprend moins de 50 résidus d'acides aminés, voire même moins de 35, ou même moins de 10 résidus d'acides aminés
Cela étant, la séquence polypeptidique de la protéine p42 partiellement délétée peut ne pas comporter la totalité de la séquence codant pour la p19 (ou de la région IV), naturellement sous réserve que cette dernière conserve la capacité d'induire des anticorps protecteurs contre le parasite En particulier la susdite « partie de fragment a un poids moléculaire de 10 à 25 kDa, notamment de 10 à 15 kDa De préférence, cette partie de fragment polypeptidique contient au moins l'une des deux régions EGF (abréviation de l'expression anglaise « Epidermal Growth Factor »)
Naturellement les mêmes observations valent pour la région I de la protéine recombinante selon l'invention II est clair que l'homme du métier est à même de faire la différence entre les fragments actifs et ceux qui cesseraient de l'être, notamment de
façon expérimentale en produisant des vecteurs modifiés contenant, par exemple, des insérats comportant des parties de la p42 et notamment de la p42 délétée, de longueurs différentes, respectivement produits à partir de la séquence codante pour la p42, le cas échéant, partiellement délétée, par réaction avec des enzymes de restriction appropriés, ou encore des enzymes exonucléolytiques qui auraient été maintenus au contact du fragment codant pour la p42 initiale, le cas échéant, partiellement délétée pendant des temps variables ; la capacité des produits d'expression de ces insérats dans des cellules eucaryotes correspondantes, notamment des cellules d'insectes, transformées par les vecteurs modifiés correspondants, à exercer un effet protecteur, pouvant alors être testée, notamment dans les conditions expérimentales qui seront décrites plus loin, à propos des exemples. En particulier, les produits d'expression de ces insérats doivent être aptes à inhiber une parasitémie induite in vivo par le parasite correspondant entier.
De même, l'invention inclut toutes compositions immunogènes, voire vaccinantes dans lesquelles la séquence polypeptidique constitutive essentielle du principe actif serait constitué d'un peptide capable d'induire une réponse immunoiogique de type cellulaire et/ou humorale équivalente à celle produite par la protéine partiellement délétée telle que définie ci- dessus, dès lors que l'addition, la délétion ou la substitution dans sa séquence de certains acides aminés par d'autres n'entraîneraient pas une modification importante de la capacité du peptide ainsi modifié -ci-après appelé « peptide immunologiquement équivalent »- à aussi inhiber la susdite parasitémie
La p42 partiellement délétée peut naturellement aussi être associée que ce soit du côté N-terminal ou du côté C-Terminal ou par l'intermédiaire d'une liaison peptidique, à un autre fragment de protéine plasmodiale ayant un potentiel vaccinant comme par exemple une protéine (« Duffy Bmding Protein » de P vivax (29) ou EBA-175 de P. falciparum (30) et (31 ) dont une région est spécifiquement riche en cystéine), sous réserve que
ne soit pas altérée, au contraire amplifiée, sa capacité d'inhiber une parasitémie normalement introduite in vivo par le parasite correspondant
Le fragment codant pour la p42 partiellement délétée ou une partie de celle-ci, peut contenir également, en amont de son extrémité N- terminale, une séquence peptidique encore différente, par exemple un fragment C-terminal du peptide signal de la protéine MSP-1 . Cette séquence comprend de préférence moins de 50 acides aminés, par exemple de 10 à 35 acides aminés
Ces observations s'étendent de la même façon à des p42 partiellement délétées issues d'autres Plasmodium, en particulier
P.falciparum, l'espèce dominante des parasites, responsable d'une des formes les plus graves de paludisme
Mais les techniques rappelées ci-dessus pour la production dans un système de baculovirus d'une p42 recombinante issue de P. vivax ou P.cynomolgi sont difficilement transposables telles quelles â la production d'une p42 recombinante de P.falciparum avec un rendement satisfaisant, ne fût-ce que pour obtenir des quantités appréciables autorisant la réalisation d'essais d'immunoprotection.
L'invention fournit également un procédé remédiant en grande partie à cette difficulté II devient aussi possible d'obtenir des rendements beaucoup plus importants en p42 de P.falciparum -et d'autres plasmodiums lorsque l'on rencontre des difficultés semblables- en mettant en oeuvre une séquence nucléotidique synthétique de substitution à la séquence nucléotidique naturelle codant pour la p42 de Plasmodium falciparum dans un vecteur d'expression d'un système baculovirus, cette séquence nucléotidique synthétique codant pour la même p42, mais étant caractérisée par une proportion de nucleotides G et C plus élevée que dans la séquence nucléotidique naturelle
Il et clair pour l'homme du métier que ce résultat peut être obtenu en tirant profit à la fois de sa capacité de synthétiser des ADNs par synthèse nucléotidique et de choisir parmi les possibilités que lui offre le code
génétique, de substituer, chaque fois que le code génétique l'autorise, des codons synthétiques ayant des teneurs en C et/ou en G plus élevées que les codons naturels qui, au sein des séquences natives codant pour les p42 natives correspondantes, codent pour le même acide aminé. II va de soi que les mêmes observations étendent leurs effets à des p42 dont des séquences ont été partiellement délétées comme défini plus haut.
En d'autres termes, l'invention découle de la découverte que l'expression dans un système baculovirus d'une séquence nucléotidique codant pour une p42, partiellement délétée ou non, était apparemment liée à une compatibilité améliorée des codons successifs de la séquence nucléotidique à exprimer avec la « machinerie cellulaire » des cellules hôtes transformables par des baculovirus, à l'instar de ce qui est observé pour les séquences nucléotidiques naturelles normalement contenues dans ces baculovirus et exprimées dans les cellules hôtes infectées , d'où la mauvaise expression, sinon parfois l'absence totale d'expression d'une séquence nucléotidique native de P falciparum ; d'où également une explication possible à l'expression plus efficace observée de la p42 de P. vivax dans un système baculovirus par Longacre et al. (19) et, comme les inventeurs l'ont aussi constaté, de la séquence de P.cynomolgi à partir des séquences nucléotidiques p42 natives correspondantes, en raison de leurs teneurs relatives en nucleotides G et C beaucoup plus élevées que celles des séquences nucléotidiques natives codant pour les p42 de P.falciparum. L'invention concerne donc aussi, plus généralement, un vecteur modifié du type baculovirus recombinant contenant sous le contrôle d'un promoteur contenu dans ce vecteur et susceptible d'être reconnu par des cellules transfectables par ce vecteur, une première séquence nucléotidique codant pour un peptide signal exploitable par un système baculovirus, caractérisé par une deuxième séquence nucléotidique en aval de la première, également sous le contrôle de ce promoteur et codant pour
une séquence peptidique comportant néanmoins dans sa propre séquence constitutive, celle :
• soit d'un fragment peptidique codant de la p42 ou une p42 dont ont été délétées la région II et, le cas échéant, tout ou partie de la région III ; • soit d'une partie de ce fragment peptidique dès lors que le produit d'expression de la deuxième séquence dans un système baculovirus est apte aussi à inhiber une parasitémie normalement induite in vivo par le parasite correspondant ;
• soit d'un peptide immunoiogiquement équivalent dérivé du susdit fragment peptidique C-terminal (p19) ou de la susdite partie de fragment peptidique par addition, délétion ou substitution d'acides aminés n'entraînant pas une modification importante de la capacité de ce peptide immunoiogiquement équivalent à induire une réponse immunologique de type cellulaire et/ou humorale semblable à celle produite par ce fragment peptidique p19 ou à la susdite partie de ce fragment, et ladite séquence nucléotidique ayant le cas échéant une teneur en nucleotides G et C comprise entre 40 et 60%, de préférence d'au moins
50% de la totalité des nucleotides dont elle est constituée. Cette séquence peut être obtenue par construction d'un gène synthétique dans lequel les codons naturels ont été changés par des codons riches en G/C sans que leur traduction soit modifiée (maintien de la séquence peptidique)
En l'occurrence ladite séquence nucléotidique, fournie par un ADN synthétique, peut présenter au moins 10% de codons modifiés par rapport à la séquence du gène ou du cDNA naturel tout en conservant les caractéristiques de la séquence naturelle traduite, c'est-à-dire le maintien de la séquence en ammo-acides
Cela étant, on n'exclut pas que cette teneur en nucleotides G et C pourrait être davantage accrue, dès lors que les modifications qui en résulteraient quant à la séquence en acides aminés du peptide recombinant -ou peptide immunoiogiquement équivalent-produit
n'entraîneraient pas une perte des propriétés immunologiques, voire protectrices, des protéines recombinantes formées, notamment dans les essais qui seront illustrés plus loin
Ces observations s'appliquent naturellement à d'autres Plasmodium infectieux pour l'homme, en particulier dès lors que des séquences nucléotidiques natives codant pour les p42 correspondantes, le cas échéant partiellement délétées, auraient des teneurs en nucleotides T et A difficilement compatibles avec une expression efficace dans un système baculovirus La séquence codant pour le signal utilise peut être celle normalement associée à la séquence native du Plasmodium concerné Mais elle peut également être issue d'un autre Plasmodium, par exemple P vivax ou P cynomolgi ou d'un autre organisme s'il est susceptible d'être reconnu en tant que signal dans un système baculovirus La séquence codant pour la p42 ou une partie de celle-ci au sein du vecteur considéré est, le cas échéant, dépourvue de la séquence d'ancrage de la protéine native au parasite dont elle est issue, cas dans lequel la protéine exprimée est en général excrétée dans le milieu de culture (forme soluble) L'invention concerne tout autant les vecteurs dans lesquels la séquence codante contient la séquence d'extrémité 3' terminale codant pour la séquence d'extrémité C'-terminaie hydrophobe de la p19 et qui est normalement impliquée dans l'induction de l'ancrage de la protéine native à la membrane cellulaire de l'hôte dans lequel elle est exprimée Cette région d'extrémité 3'-termιnale peut d'ailleurs être hétérologue vis-à-vis de la séquence codant pour le reste de la p42 correspondante, par exemple correspondre à la séquence 3'-termιnale issue de P vivax ou d'un autre organisme dès lors qu'elle code pour une séquence d'ancrage de l'ensemble de la protéine recombinante produite à la membrane de l'hôte cellulaire du système baculovirus mis en oeuvre A titre d'exemple de telles séquences d'ancrage on cite la GPI de l'antigène CD59 exprimable dans
des cellules d'insectes du type spodoptera frugiperda (32) ou la GPI d'une protéine humaine CD14 (33)
L'invention concerne naturellement aussi les protéines recombinantes, ces protéines comportant des epitopes conformationnels reconnus par des sérums humains formés contre le Plasmodium correspondant
D'une façon générale, l'invention concerne également toute protéine recombinante du type indiqué ci-dessus, dès lors qu'elle comporte des epitopes conformationnels tels que produits dans le système baculovirus notamment ceux qui se trouvent être instables en milieu réducteur
L'invention concerne naturellement lesdites protéines recombinantes, qu'elles soient sous la forme dite soluble ou sous la forme pourvue d'une région d'ancrage, en particulier aux hôtes cellulaires mis en oeuvre dans le système baculovirus L'invention porte également sur tout produit de conjugaison entre une p42 ou une p42 partiellement délétée telle que définie ci-dessus, d'une part, et une molécule porteuse -par exemple une polylysine- alanine- utilisable pour la production des vaccins, d'autre part, par l'intermédiaire de liaisons covalentes ou non Les compositions vaccinantes les mettant en oeuvre font également partie de l'invention
L'invention concerne également les compositions de vaccins mettant en oeuvre ces protéines recombinantes ou conjuguées, y inclus d'ailleurs les protéines issues de Plasmodium vivax
Font également partie de l'invention les compositions dans lesquelles les protéines recombinantes susmentionnées sont associées à un adjuvant, par exemple un alun Les protéines recombinantes comportant l'extrême région C-terminale permettant leur ancrage à la membrane des cellules dans lesquelles elles sont produites sont avantageusement utilisées en combinaison avec des lipides aptes à former des liposomes et appropriés a la production de vaccins Sans qu'il y ait eu lieu de s'y limiter, on peut avoir recours aux lipides décrits à cet effet par
exemple dans l'ouvrage intitulé « Les liposomes aspects technologique, biologique et pharmacologique » de J Delattre et al , édition INSERM, 1993
La présence de la région d'ancrage dans la protéine recombinante, qu'il s'agisse d'une région d'ancrage homologue ou hétérologue vis-à-vis de la partie vaccinante proprement dite, est de nature à favoriser la production d'anticorps cytophiles, notamment du type lgG2a et lgG2b chez la souris qui pourraient avoir une activité protectrice particulièrement élevée, au point que l'on pourrait se dispenser d'associer les principes actifs de vaccins ainsi constitués avec des adjuvants autres que les lipides utilisés pour la constitution des formes liposomiques II s'agirait là d'un avantage important, puisque les liposomes peuvent être lyophilisés dans des conditions permettant leur stockage et leur transport, sans que des chaînes de froid ne soient alors indispensables D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit d'exemples, de protéines recombinantes mettant en jeu des protéines recombinantes dont les séquences actives, soit contiennent celles de la p42, soit sont limitées a celle des protéines p19 correspondantes Sans que ces exemples soient à proprement parler toujours directement couverts par les revendications qui suivent, ils n'en contribuent pas moins a l'établissement du caractère opérationnel de l'invention qui fait l'objet de la présente demande
Description de la construction PfMSP1 pι9S (soluble) (p19 soluble issue de P.falciparum)
La construction recombinante PfMSP1 pι9S contient de l'ADN correspondant aux 8 paires de base de la séquence leader et les 32 premiers acides aminés de MSP1 de Plasmodium vivax de MeU à Asp32 (isolât Belem , Del Portillo et al 1991 P N A S 88, 4030 ) SUIVIS par un GluPhe, dû au site EcoRI faisant la liaison des deux fragments Le tout est suivi par le gène synthétique, décrit dans Figure 1 , codant le Plasmodium
I X
falciparum MSP1 pι9 de Asnι6i3 à Serι705 (isolât Uganda-Palo Alto , Chang et al 1988 Exp Parasitol. 67, 1 ). La construction est terminée par deux codons stop de TAA Cette construction donne lieu à une protéine recombinante qui est sécrétée dans le surnageant de culture des cellules infectées
De la même façon et à des fins de comparaisons, on a produit une construction recombinante dans des conditions semblables à celles utilisées pour la production de la p19 ci-dessus, mais en travaillant avec une séquence codante consistant en une copie directe de l'ADN correspondant de la souche P falciparum (FUP) décrite par Chang et al ,
Exp Parasit 67, 1 , 1989 La copie de ce gène naturel (s'étendant de l'asparagine 1613 à la séπne 1705) a été formée par PCR à partir du gène natif
On a représenté dans la Figure 1A les séquences à la fois du gène synthétique (Bac19) et du « gène natif » (PF19)
On remarque que 57 codons sur les 93 codons de la séquence codante native pour la p1 9 issue de P falciparum ont été modifiés (pour ce qui est du troisième nucleotide dans 55 d'entre eux et du premier et troisième nucleotides dans les deux codons restant) Des codons nouveaux ont été ajoutés à l'extrémité 5' pour introduire le peptide signal dans les conditions qui ont été indiquées ci-dessus et pour introduire un site EcoRI pour le clonage, d'une part, et de même ont été ajoutés deux codons stop non présents dans la p19 de P falciparum aux fins d'obtenir des signaux de terminaison de l'expression Les lettres individualisées placées respectivement au dessus des codons successifs correspondent aux acides aminés respectifs successifs Les astérisques (*) se rapportent aux codons stop Les lignes verticales soulignent les nucleotides qui sont les mêmes dans les deux séquences
Description de la construction PfMSP1 pι9A (ancré GPI) (p19 ancrée de P.falciparum)
La construction PfMSP1 p19A a des caractéristiques de la précédente sauf que la séquence synthétique (Figure 1 B) code pour le MSP1 pι9 de Plasmodium falciparum (isolât Uganda-Palo alto) de Asn! 613 à llβι726 suivie par deux codons stop de TAA. Cette construction donne lieu à une protéine recombinante qui est ancrée dans la membrane plasmique des cellules infectées par une structure du type glycosyl phosphatidyl inositol (GPI)
La figure 1 C est représentative de la séquence de la protéine recombinante PfMSP1 pι9S avant coupure de la séquence signal
La figure 1 D est représentative de la séquence de la protéine recombinante PfMSP1 pι9S après coupure de la séquence signal
Les acides aminés soulignés dans les figures 1 C et 1 D proviennent du site EcoRI utilisé pour joindre les séquences nucléotidiques dérivées de la partie N-terminale de MSP1 de P vivax (avec séquence signal) et de MSP1 p19 de P.falciparum
Figure 2 - L'antigène recombinant PfMSP1 pι9 soluble purifié par immunoaffinité a été analysé par immunoblot après SDS-PAGE en présence (réduit) ou absence (non réduit) de B-mercaptoéthanol. Les échantillons sont chargées sur gel après chauffage à 95°C en présence de 2% SDS. Dans ces conditions seulement des liaisons du type covalent
(ponts disulfure) peuvent résister à la désagrégation Le blot de gauche a été révélé avec un anticorps monoclonal qui réagit avec un épitope linéaire de la p19 naturelle Le blot de droite a été révélé avec un mélange de 13 antisera humains provenant des sujets avec une immunité acquise au paludisme dû à Plasmodium falciparum Ces résultats montrent que la molécule recombinante de baculovirus reproduit bien les epitopes
conformationnels en forme de polymère qui sont reconnus en majorité par l'antiserum humain
Figure 3 - L'antigène recombinant PvMSP1P42 soluble (Longacre et al. 1994, op. cit.) a été incubé pendant 5 heures à 37° en présence des fractions de protéines dérivées des merozoïtes de P.falciparum et séparées par isoélectrofocalisation Par la suite les échantillons ont été analysés par immunoblot en présence (réduit) ou absence (non réduit) de B-mercaptoéthanol Les fractions 5 à 12 d'isoélectrofocalisation, ainsi que deux extraits totaux de merozoïtes faits en présence (Tex) ou absence (T) de détergent ont été analysés L'immunoblot a été révélé avec des anticorps monoclonaux spécifiques pour le MSP1p42 et pl9 de P. vivax Les résultats suggèrent qu'il y a une activité protéolytique dans les merozoïtes de P.falciparum qui peut être extraite en détergent. La digestion du p42 dans certaines fractions semble provoquer une polymérisation des produits de digestion (p19) , cette polymérisation est probablement liée à la formation de ponts disulfure puisqu'en présence de B-mercaptoéthanol, les formes de haut poids moléculaire disparaissent en faveur d'une molécule d'environ 19 kDa (Tex-R) La polymérisation du p19 observée dans ces expériences pourrait donc être une propriété intrinsèque de cette molécule in vivo
Description de la construction PcMSP1pι9S (soluble) (p19 soluble de P.cynomolgi)
L'ADN utilisé pour la construction susdite a été obtenu à partir d'un clone de la souche de Plasmodium cynomolgi ceylonesis (22-23) Cette souche a été maintenue par des passages successifs dans son hôte naturel (Macaca smica) et des transmissions cycliques par l'intermédiaire de moustiques (27)
Des parasites sanguins ont été obtenus à partir des singes infectes au stade schizonte mature quand les parasitémies ont atteint un niveau de 5% Ils ont alors été purifiés selon la méthodes décrites dans (25) L'ADN a ensuite été extrait comme décrit dans (26) Un fragment de 1200 paires de base a ensuite été produit en ayant recours à la réaction PCR mettant en oeuvre les oligonucléotides soulignés dans la Figure 4 et issus de P vivax L'oligonucléotide 5' comprenait un site de restriction EcoRI et l'oligonucléotide 3' deux codons synthétiques stop TAA SUIVIS d'un site de restriction Bglll Ce fragment a été introduit par ligation et par l'intermédiaire de ces sites EcoRI et Bglll dans le plasmide pVLSV20o contenant déjà la séquence signal de la protéine MSP-1 de P vivax (19) Le nouveau plasmide (pVLSV20oC42) a ete utilise pour l'analyse de séquences d'ADN
Les séquences de P cynomolgi et des séquences correspondantes de P vivax ont été mises en alignement Les flèches noires désignent les sites de clivage primaire et secondaire présumés Ils ont été déterminés par analogie avec les sites connus dans P falciparum (27, 28) Des lignes verticales et des flèches horizontales localisent les limites des quatre régions qui ont été étudiées La région 4 correspond à la séquence codant pour la p19 de P cynomolgi Des sites de glycosylation sont encadres et les cysteines conservées sont soulignées Dans la partie inférieure de la Figure 4 sont indiqués les pourcentages identité entre les deux isolats de P vivax et P cynomolgi
La construction recombinante PcMSP1 pι9S contient de l'ADN correspondant aux 8 paires de bases de la séquence « leader » et les 32 premiers acides aminés de MSP1 de Plasmodium vivax de Met! a Asp32 (isolât Belem , Del Portillo et al 1991 P N A S 88, 4030 ) SUIVIS par un GluPhe, dû au site EcoRI faisant la liaison des deux fragments Le tout est suivi par la séquence codant pour le MSP1 pι9 de Plasmodium cynomolgi (souche Ceylon) de Lys276 à Ser38o La construction est terminée par deux codons stop de TAA Cette construction donne lieu a une protéine
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recombinante qui est sécrétée dans le surnageant de culture des cellules infectées
Purification de la protéine recombinante PfMSP1 p19 par chromatographie d'immunoaffinité avec un anticorps monoclonal reconnaissant spécifiquement la p19 de Plasmodium falciparum.
La résine de chromatographie a été préparée en liant 70 mg d'un anticorps monoclonal (obtenu à partir d'un hybπdome G17 12 déposé à la CNCM (Paris, France) le 14 février 1997 sous le n°l-1846 , cet hybπdome G17 12 a été construit a partir du myélome X63 Ag8 653 produisant des
IgG 2a/k reconnaissant la p19 de P falciparum) à 3g de CNBr-Sepharose 4B active (Pharmacia) par des méthodes standards détaillées dans le mode d'emploi fourni par Pharmacia Les surnageants de culture contenant le PfMSP1 p19 soluble ont été incubés en batch avec la résine de chromatographie pendant 16 heures à 4°C La colonne a été lavée une fois avec 20 volumes de 0 05% NP40, 0 5M NaCl, PBS , une fois avec 5 volumes de PBS et une fois avec 2 volumes de 10 mM phosphate de sodium, pH 6 8 L'élution a été effectuée avec 30 ml de 0 2 M glycine, pH 2 2 L'éluat a été neutralisé avec 1 M phosphate de sodium, pH 7 7 puis concentré par ultrafiltration et dialyse contre du PBS Pour la purification du PfMSP1 p19 ancré, toutes les solutions de lavage et élution contenaient en supplément 0 1 % 3-(Dιmethyl-dodecylammonιo)-propane sulfonate (Fluka)
Essai de vaccination de MSP1 recombinant de Plasmodium vivax (p42 et p19) chez le singe écureuil Saimiri sciureus.
Cet essai de vaccination a été fait chez des Saimin sciureus boliviensis mâles de 2 à 3 ans, non splénectomisés Trois singes ont été injectés 3 fois par voie intramusculaire à 3 semaines d'intervalle avec un mélange d'environ 50 à 100 μg chacun, de PvMSP1p42 et pιg soluble
recombinant (19), purifié par immunoaffinité. L'adjuvant de Freund complet et incomplet était utilisé comme suit - 1 ere injection : 1 : 1 FC A/FIA ; 2eme injection 1 :4 FCA/FIA ; 3ème injection : FIA. Ces compositions d'adjuvant étaient mélangées par la suite 1 : 1 avec l'antigène en PBS. Les cinq singes
5 contrôles recevaient l'antigène glutathione-S-transferase (GST) produit dans E.coli selon le même protocole. L'infection d'épreuve était effectuée en injectant 2.106 hématies infectées avec une souche adaptée de Plasmodium vivax (Belem) 2 5 semaines après la dernière injection La protection a été évaluée en déterminant les parasitémies journalières chez
I O tous les animaux par examen des frottis colorés avec giemsa.
Les courbes de la Figure 5 sont représentatives de la variation de la parasitémie mesurée en nombre d'hématies parasitées par microhtre de sang (sur l'axe des ordonnées à l'échelle logarithmique) en fonction du temps écoulé après l'infection (en jours) La courbe A correspond aux
15 valeurs moyennes observées chez les trois singes vaccinés, la courbe B , les valeurs moyennes chez cinq singes témoins
De l'examen de la figure découle une très forte réduction de la parasitémie sous l'effet de la vaccination
20 Essai de vaccination de MSP1 recombinant de Plasmodium cynomolgi (p42 et p19) chez le singe toque, Macaca sinica.
Quinze singes capturés ont été utilisés comme suit : (1 ) 3 animaux injectés avec 100 μg PcMSP1 p42 soluble , 3 animaux injectés avec 35 μg (1 ere injection) ou 50 μg (2ème et 3eme injections) PcMSP1 p19 soluble ; (3) 3 5 animaux injectés avec un mélange de PcMSP1 p42 et p,9 ; (4) 3 animaux injectés avec l'adjuvant plus PBS , (5) 3 animaux non injectés. L'adjuvant de Freund complet et incomplet a été utilisé selon le protocole décrit ci- dessus Les injections on été faites par voie intramusculaire à 4 semaines d'intervalle. L'infection d'épreuve était faite en injectant 2.105 hématies io infectées avec Plasmodium cynomolgi 4 semaines après la dernière
injection La protection a été évaluée en déterminant les parasitémies journalières chez tous les animaux en examinant les parasitémies avec giemsa Les parasitémies ont été classées comme négatives uniquement après comptage de 400 champs de frottis Les parasitémies sont exprimées en pourcentage d'hématies parasitées
Les Figures 6A-6G sont illustratives des résultats obtenus Dans chacune d'elles apparaissent les parasitémies (exprimées en pourcentages d'hématies parasitées sur l'axe des ordonnées à l'échelle logarithmique) observées chez les animaux d'épreuve en fonction des temps après l'infection (en jours sur les axes des abscisses)
Les résultats concernent
• dans la figure 6A , des animaux contrôles non vaccinés ,
• la figure 6B concerne des animaux qui avaient reçu une solution saline contenant en outre l'adjuvant de Freund , • la figure 6C est une superposition des figures 6A et 6B, dans le but de faire apparaître les résultats relatifs résultant de l'administration de l'adjuvant de Freund aux animaux (les variations ne sont évidemment pas significatives) ,
• la figure 6D fournit les résultats obtenus a l'issue d'une vaccination avec la p42 ,
• la figure 6E concerne des animaux vaccinés avec la seule p19 ,
• enfin, la figure 6F concerne les animaux vaccinés avec un mélange de p19 et p42
La p42 induit certes un certain niveau de protection Mais comme en témoignent les figures 6E et 6F, la protection conférée par la p19 recombinante selon l'invention est considérablement améliorée
On peut formuler l'hypothèse que l'amélioration de la protection résulte d'un clivage secondaire de la p42 qui s'accompagne du dévoilement de cystéine libre qui forme, par la suite, des ponts disulfure intermoléculaires donnant lieu a des multimères du p19 très
caractéristiques de cette forme dans les protéines recombinantes des trois espèces testées
Les chiffres utilisés pour élaborer les graphiques (6A-6F) sont précisés dans la Figure 6G
Essai de vaccination P.cynomolgilsïnge toque ; deuxième infection d'épreuve sur singes vaccinés avec p19 seule et contrôles (Figures 8)
Six mois plus tard sans autre immunisation, les 3 singes ayant reçu le MSP-1 p19 seule avec FCA/FIA (Figure 6E) et les 3 singes ayant reçu une solution saline contenant l'adjuvant de Freund (Figure 6B) ainsi que 2 nouveaux singes naïfs non vaccines ont subi une nouvelle infection c d'épreuve par injection de 1 1 0 hématies infectées avec Plasmodium cynomolgi La protection a été évaluée en déterminant les parasitémies journalières chez tous les animaux en examinant les frottis avec du giemsa Les parasitémies ont été classées comme négatives uniquement après comptage de 400 champs de frottis Les parasitémies sont exprimées en pourcentage d'hématies parasitées (les chiffres utilisés pour élaborer les graphiques 8A-C sont précisés dans la Figure 8D) Les six animaux immunisés qui avaient subi une infection d'épreuve six mois auparavant n'avaient pas de parasitémie détectable sauf pour 1 animal dans chaque groupe qui a présenté une parasitémie à 0 008% pendant 1 jour (Figures 8A et 8B) Les deux contrôles naïfs montrent une parasitémie classique avec un maximum de 0 8% et pendant 21 jours (Figure 8C) Donc, les 3 animaux vaccinés avec le MSP-1 p19 étaient aussi protégés six mois plus tard que les 3 contrôles qui présentaient une infection complète classique après le première infection d'épreuve, malgré une absence ou un très faible parasitémie après la première infection d'épreuve Ces résultats suggèrent que la durée de protection du p19 est au moins de six mois
Essai de vaccination avec p19 en association avec alun dans le système P.cynomolgils'inge toque (Figures 9)
Les résultats positifs de protection précédents ont été obtenus en utilisant l'adjuvant complet (FCA) ou incomplet (FIA) de Freund
Cependant, le seul adjuvant admis actuellement chez l'homme est l'alun Pour cette raison, nous avons fait un essai de vaccination avec le MSP-1 p1 9 de P cynomolgi chez le singe toque en présence d'alun comme adjuvant Six singes capturés ont été utilisés comme suit ( 1 ) 3 animaux injectés avec 4 doses de 50 mg MSP-1 p19 recombinant de P cynomolgi avec 20 mg d'alun (2) 3 animaux injectés 4 fois avec de l'eau physiologique et 10 mg de alun Les injections ont été faites par voie intramusculaire à 4 semaines d'intervalle L'infection d'épreuve était faite
5 en injectant 2 10 hématies infectées avec P cynomolgi 4 semaines après la dernière injection La protection a été évaluée en déterminant les parasitémies journalières chez tous les animaux en examinant les frottis avec le giemsa Les parasitémies ont été classées comme négatives uniquement après comptage de 400 champs de frottis Les parasitémies sont exprimées en pourcentage d'hématies parasitées Les résultats de cette expérience sont les suivants 2 des 3 singes immunisés avec le p19 recombinant en alun avaient environ 30 fois moins de parasitémie totale pendant la durée de l'infection (Figures 9A et 9B) que les 3 singes contrôles immunisés avec de l'eau physiologique et de l'alun (Figure 9D) après l'infection d'épreuve Le troisième singe immunisé avec p19 (Figure 9C) n'était pas très différent des contrôles Pour l'essai de vaccination de
Plasmodium cynomolgi p1 9 chez le singe toque, Macaca sinica, décrit dans la Figure 9, les chiffres utilisés pour élaborer les graphiques (9A-9D) sont précisés (Figure 9E) Bien que ces résultats soient un peu moins spectaculaires que les précédents (Figures 6, 8) , c'est la première fois
qu'une protection significative est observée pour MSP-1 recombinante en alun
Figure 10 Essai de vaccination avec une p19 recombinante de Plasmodium falciparum chez le singe écureuil
Vingt singes Saimm sciureus guyanensis (singe écureuil) d'environ 3 ans élevés en captivité ont été utilisés comme suit (1 ) 4 animaux injectés avec 50 mg de Pf MSP-1 p19 soluble en présence d'adjuvant de
Freund comme suit 1 ere injection 1 1 FCA/FIA, 2eme injection 1 4 FCA/FIA 3 injection FIA Ces compositions d'adjuvant ont ensuite été mélangées avec l'antigène en PBS 1 1 , (2) 2 animaux contrôles recevaient l'adjuvant de Freund comme décrit pour (1 ) avec uniquement PBS, (3) 4 animaux injectés avec 50 mg de Pf MSP-1 p19 soluble en présence de 10 mg d'alun (Alu-Gel-S, Serva), (4) 2 animaux contrôles recevaient 10 mg d'alun avec uniquement PBS, (5) 4 animaux injectés avec environ 50-100 mg Pf MSP-1 p19 ancré GPI reconstitués en liposomes comme suit 300 mmoles de cholestérol et 300 mmoles de phosphatidyl cholme étaient séchés sous vide et resuspendus en 330 mM N-octylglucoside en PBS avec 1 4 mg de Pf MSP-1 p19,GPI Cette solution avait été dialysée contre PBS avec des Bio-Beads SM-2 adsorbant (Bio-Rad) et les liposomes ainsi formés étaient concentrés par centrifugation et resuspendus en PBS La 1 injection était faite avec des liposomes frais maintenus à 4°C et les 2eme et 3eme injections étaient faites avec des liposomes ayant été congelés pour conservation, (6) 2 animaux injectés avec des liposomes contrôles faits de la même façon en absence de l'antigène p19, GPI, comme décrit pour (5), (7) 2 animaux injectés avec de l'eau physiologique Trois injections ont été faites par voie intramusculaire à 4 semaines d'intervalle L'infection d'épreuve était faite en injectant 1 10 hématies infectées avec Plasmodium falciparum
La protection a été évaluée en déterminant les parasitémies journalières chez tous les animaux en examinant les frottis avec giemsa Les parasitémies sont exprimées en pourcentage d'hématies parasitées Les résultats de cet essai de vaccination sont exposés dans les Figures 10, A- G
Les groupes immunisés avec le p19 en adjuvant de Freund ou en liposome ont démontré des parasitémies semblables aux groupes contrôles après une infection d'épreuve (un animal (numéro 29) vacciné avec p19 en adjuvant de Freund est mort quelques jours après l'infection d'épreuve pour des raisons indépendantes de la vaccination (crise cardiaque)) Des irrégularités dans l'administration de l'antigène dans ces 2 groupes (mauvaise émulsion de Freund, liposomes congelés) ne permettent pas d'évaluer de façon complète la signification de ces résultats Dans le groupe alun 2 animaux ont montré des parasitémies totales pendant la durée de l'infection environ 4 fois moins importantes que les contrôles, I animal environ 3 fois moins importante et 1 animal était semblable aux contrôles Cette expérience est un peu difficile à interpréter à cause de la variabilité dans les contrôles, probablement due à la souche de parasite utilisée pour l'infection d'épreuve qui n'aurait pas été assez adaptée au modèle Saimin non spénectomisé mis au point que récemment à Cayenne Néanmoins, l'effet réel, quoiqu'imparfait, avec l'alun est encourageant dans la mesure où nos antigènes semblent être les seules versions recombinantes MSP-1 de P falciparum qui, pour l'instant, ont démontré une certaine efficacité en association avec l'alun
Essai de vaccination avec une p19 recombinante de Plasmodium falciparum chez le singe écureuil (même essai que figure 10).
Des singes élevés en captivité ont été injectés avec 1 ml d'moculum par voie intramusculaire 2 fois a 4 semaines d'intervalle comme suit (1 ) 4 animaux injectés avec 50 μg de PfMSP1 p19 soluble en présence
d'adjuvant de Freund comme suit l®re injection 1 1 FCA/FIA, 2eme injection 1 4 FCA/FIA, et mélangés par la suite 1 1 avec l'antigène en PBS, (2) 4 animaux injectés avec 50 μg de PfMSP1 ρ19 soluble en présence de 10 mg d'alun, (3) 4 animaux injectés avec environ 50 μg de PfMSP1 p19 ancré GPI reconstitués en liposomes composés 1 1 en molarité de cholestérol et phosphatidyl cholme Les animaux ont été saignés 17 jours après la deuxième injection
Les globules rouges provenants d'un singe écureuil avec 30% de parasitémie due à P falciparum (avec des formes mûres en majorité) ont ete lavés en PBS et le culot était dilué 8 fois en présence de 2% SDS et
2% dithiothreitol et chauffé à 95° avant d'être chargé sur un gel de polyacrylamide de 7 5% (gel de séparation) et 4% (gel de stacking) (haut du gel) Après transfère en nitrocellulose l'analyse par immunoblot (immunoempreinte) a été fait avec des antisera comme suit (1 ) pool d'antisera des 4 singes vaccinés avec PfMSP1 p19 soluble en adjuvant de
Freund dilué au vingtième , (2) pool d'antisera des 4 singes vaccinés avec PfMSP1 p19 soluble en adjuvant alun dilué au vingtième , (3) pool d'antisera des 4 singes vaccinés avec PfMSP1 p19 ancré en liposomes dilué au vingtième , (4) l'anticorps monoclonal, qui réagit avec un épitope linéaire de PfMSP1 p19, à 50 μg/ml , (5) pool d'antisera SHI90 provenant d'un vingtaine de singes infectés à répétition par P falciparum et devenus réfractaires à toute infection ultérieure de P falciparum, dilué au cinq centième , (6) pool d'antisera des singes naïfs (n'ayant jamais été exposés à P falciparum) dilué au vingtième Les résultats montrent que les 3 pools d'antisera des singes vaccines avec le PfMSP1 p19 reagissent de façon importante et spécifique avec des complexes de très haut poids moléculaire (se trouvant de façon diffuse dans le gel de stacking) et présents dans des extraits de parasite contenant davantage de formes mûres Ces résultats confortent l'hypothèse de la présence d'une agrégation spécifique du MSP1 p19 m
vivo comportant des epitopes qui sont reproduits dans les molécules recombinantes PfMSP1 p19 synthétisées dans le système baculovirus, en particulier celles en forme d'ohgomère
La figure 7 illustre également ces résultats Elle se rapporte aux immunoempreintes produites sur gel Les trois premières colonnes du gel illustrent la réponse m vivo de singes à des injections de p19 [(1 ) avec l'adjuvant de Freund, (2) avec de l'alun, (3) sous forme de liposome) et notamment l'existence de complexes de haut poids moléculaire confortant l'hypothèse de l'agrégation m vivo de p19 sous forme d'oligomère, spécifique du stade de maturation (quand p42 est coupé en p19 et p33)
Cet essai de vaccination comprend également une troisième injection identique aux précédentes L'injection avec l'adjuvant de Freund comprend uniquement du FIA
Figure 7B Les données pour cette figure sont dérivées de l'essai de vaccination de P falciparum I singe écureuil (Figure 10 ci-après) Les chiffres correspondent aux singes individuels notés dans la Figure 10 Les techniques et méthodes pour cette figure sont les mêmes que pour la Figure 7 sauf que I antiserum individuel de chaque singe noté a été teste après trois injections le jour de l'infection d'épreuve et l'antisérum SHI a été dilué 1 250 Les résultats montrent que l'antisérum des 4 singes vaccinés avec le p19 et alun réagissent de façon importante et spécifique avec des complexes de très haut poids moléculaire tandis que les singes des autres groupes vaccinés avec le p19 et l'adjuvant de Freund ou des liposomes ne montrent qu'une faible reactivité avec ces complexes Puisque les singes vaccines avec p19 et alun ont aussi été le mieux protégés, cette réactivité avec les complexes de haut poids moléculaire paraît indiquer un effet protecteur, et cela malgré qu'un singe dans le groupe alun n'était pas protégé par rapport aux contrôles et qu'un autre ne l'était que partiellement
L'invention concerne naturellement d'autres applications, par exemple celles exposées ci-après en rapport avec certains des exemples, lesquels ne présentent aucun caractère limitatif
Thérapeutique
Les molécules recombinantes selon l'invention peuvent être utilisées pour produire des anticorps spécifiques éventuellement utilisables par transfert passif dans un but de thérapeutique adaptée au paludisme sévère dû à P falciparum avec risque de mortalité
Diagnostic
Les molécules recombinantes PvMSP 1 p42 et PvMSP1 p19 et selon l'invention, dérivées de baculovirus peuvent et ont été utilisées pour produire des anticorps monoclonaux spécifiques muπns Ces anticorps, en combinaison avec des antisera polyclonaux anti p42 provenant d'une autre espèce telle que le lapin ou la chèvre, peuvent être à la base d'un test de diagnostic semi-quantitatif pour le paludisme et capable de distinguer entre un paludisme dû à P falciparum, qui peut être mortel, et un paludisme dû à P vivax, qui n'est généralement pas mortel Le principe de ce test serait de piéger et quantifier toute molécule de MSP1 contenant la partie p42 dans le sang
Dans ce cadre, les avantages des p42 recombinantes, et en particulier des p42 recombinantes partiellement délétées, sont les suivants (i) elles sont a la fois bien conservées au sein d'une même espèce et suffisamment divergente entre des espèces différentes pour permettre de produire facilement des réactifs spécifiques d'espèce, dans des conditions faisant en sorte que peuvent être produits des anticorps dérivés de Plasmodiums différents, notamment contre P falciparum et P vivax qui ne donnent pas heu a des réactions croisées ,
(n) puisque les molécules recombinantes p42 dérivées de baculovirus semblent reproduire davantage la structure native des protéines natives correspondantes, les anticorps produits contre ces protéines seraient bien adaptés à un usage diagnostique Les microorganismes identifiés ci-dessous ont été déposés suivant la règle 6 1 du Traité de Budapest à la date du 01 féyrier 1996, sous les numéros suivants
Références d'identification Numéros d'enregistrement PvMSP1 p19A -1659
PvMSP1 p19S -1660 PfMSP1 p19A -1661 PfMSP1 p19S -1662 PcMSP1 p19S -1663
L'invention concerne également l'utilisation de ces anticorps, alors de préférence préalablement fixés sur un support solide (par exemple pour chromatographie d'affinité), pour la purification de peptides du type p19 initialement contenus dans un mélange La purification fait alors intervenir une mise en contact de ce mélange avec l'anticorps, la dissociation du complexe antigène-anticorps et la récupération du peptide de type p19 purifié
Lorsqu'il est dit dans les revendications qui suivent que la p42 est délétée d'une partie ou de parties les moins bien conservées de la région III, il s'agit de préférence de régions ayant au moins 10 acides aminés et dont le degré de conservation dans P vivax, P cynomolgi et P falciparum est inférieur à 70% (moins de sept acides aminés identiques sur 10, lorsqu'ils sont mis en alignement
Les anticorps polyclonaux et monoclonaux de la présente invention présentés comme reconnaissant les p42, sont de préférence ceux qui reconnaissent plus spécifiquement des régions autres que la région IV, à
l'exclusion de la région IV elle-même De préférence ils reconnaissent la région I de la p42
L'invention concerne également les hybπdomes sécréteurs d'anticorps spécifiques reconnaissant sélectivement la p42 d'une protéine MSP-1 de la forme mérozoïte d'un parasite du type Plasmodium infectieux pour l'homme autre que Plasmodium vivax et ne reconnaît pas
Plasmodium vivax
En particulier, ces hybπdomes sécrètent des anticorps qui ne reconnaissent pas la p42 de Plasmodium vivax ou qui reconnaissent spécifiquement la p42 de Plasmodium falciparum
L'invention concerne également un hybπdome caractérisé en ce qu'il produit un anticorps monoclonal qui reconnaît spécifiquement la p42 de P vivax et de P cynomolgi Un hybπdome F10-3 a été construit à partir du myelome X63 Ag8 653 produisant des IgG 2b/k reconnaissant la p42 de P vivax
L'invention concerne également des compositions de vaccin, comprenant également des mélanges de protéines ou de fragments, notamment des mélanges du type - p42 de P falciparum et p42 de P vivax,
- p42 de P falciparum et p19 de P falciparum,
- p42 de P vivax et p19 de P vivax,
- p42 de P falciparum, p19 de P falciparum et p19 de P vivax, p42 de P vivax
Dans toutes les compositions qui précèdent la p42 est le cas échéant dépourvue de ses régions les plus hypervaπables
Par exemple sa région qui correspond a celle du fragment p19 normalement inclus dans la p42, est elle-même partiellement délétée, cette
région comprenant au moins l'une des deux régions EGF normalement contenues dans cette p19.
Ou encore elle est dépourvue de la région II, voire même aussi de la région N-terminale de la région III ou la totalité de la région III. L'invention n'est pas limitée à la production de vaccins humains
Elle s'applique tout autant à la production de compositions de vaccin vétérinaire mettant en oeuvre les protéines ou antigènes correspondants dérivés de parasites infectieux pour des mammifères et produits dans les mêmes conditions II est en effet connu que des infections du même type, la babésiose, apparaissent aussi chez les bovins, les canins et les équins un des antigènes des espèces Babésia présente une forte homologie conformationnelle (notamment les deux domaines « EFG-like » et richesse en cystéme) et fonctionnelle avec une partie protéique de MSP-1 [(36), (37) et (38)]. Des exemples de vaccins vétérinaires utilisant un antigène soluble contre de tels parasites on été décrits (39)
Il va sans dire que les p42 mises en oeuvre dans ces mélanges peuvent également donner lieu à toutes les modifications dont il a été question dans ce qui précède, lorsqu'elles étaient prises en considération de façon isolée
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Claims
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• soit d'un fragment C-terminal de 42 kilodaltons (p42) de la protéine 1 de surface (protéine MSP-1 ) de la forme mérozoïte d'un parasite du type Plasmodium et infectieux pour l'Homme, et dont ont été délétées la région II et, le cas échéant, une ou des parties de la région III, en particulier les parties les moins bien conservées ,
• soit d'une partie de ce fragment dès lors qu'elle est apte aussi à inhiber une parasitémie normalement induite in vivo par le parasite correspondant ;
• soit d'un peptide capable d'induire une réponse immunologique de type cellulaire et/ou humorale équivalente à celle produite par ce fragment p42 ou à la susdite partie de ce fragment, et cette protéine recombinante comportant le cas échéant des epitopes conformationnels instables en milieu réducteur et constituant la majorité des epitopes reconnus par des antisérums humains formés contre le Plasmodium correspondant
2. Protéine recombinante selon la revendication 1 , caractérisée en ce que sa région qui correspond à celle du fragment p19 normalement inclus dans la p42, est elle-même partiellement délétée, cette région comprenant au moins l'une des deux régions EGF normalement contenues dans cette p19
3. Protéine recombinante selon la revendication 2, caractérisée en ce que le poids moléculaire de cette partie de fragment p19 est comprise entre 10 et 25 kDa, notamment entre 10 et 15 kDa.
4. Protéine recombinante selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle contient à la fois les parties essentielles de la séquence polypeptidique de la région I et de la région IV de la p42 et qu'elle est dépourvue de la région II
5. Protéine recombinante selon la revendication 4, caractérisée en ce que sa séquence polypeptidique est celle de la p42 dont a été délétée la région II
6. Protéine recombinante selon la revendication 5 dont a également été délétée la région N-terminale de la région III ou la totalité de la région III
7. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle comporte également un groupe glycosylphosphatidylmosttol (GPI) du type de ceux qui permettent un ancrage du fragment p19 dont la séquence est normalement comprise dans celle de la p42 à l'hôte cellulaire, notamment une cellule eucaryote, préférentiellement une cellule d'insecte infectable par un baculovirus, dans lequel ladite protéine recombinante est exprimée
8. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle est dépourvue de la partie C-terminale extrême hydrophobe qui intervient dans l'induction de l'ancrage de cette protéine recombinante à la membrane cellulaire de l'hôte dans lequel elle est exprimée, notamment dans une cellule eucaryote, préférentiellement une cellule d'insecte infectable par un baculovirus
9. Protéine recombinante selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est hydrosoluble
10. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle contient la séquence partiellement délétée susdite de la p42 de la protéine MSP-1 de Plasmodium falciparum ou ladite partie du fragment correspondant
11. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle contient la séquence partiellement délétée susdite de la p42 de la protéine MSP-1 de Plasmodium cynomolgi ou ladite partie du fragment correspondant
12. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle contient la séquence partiellement délétée susdite de la p42 de la protéine MSP-1 de
Plasmodium vivax ou ladite partie du fragment correspondant
13. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 caractérisée en ce qu'elle est conjuguée à une molécule porteuse utilisable pour la production de vaccins 14. Composition vaccinante contre un parasite du type
Plasmodium infectieux pour l'homme, contenant à titre de principe actif la protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 13
15. Anticorps spécifique reconnaissant sélectivement la p42 d'une protéine MSP-1 de la forme mérozoïte d'un parasite du type Plasmodium infectieux pour l'homme autre que Plasmodium vivax et ne reconnaît pas Plasmodium vivax
16. Anticorps spécifique selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il ne reconnaît pas Plasmodium vivax
17. Anticorps spécifique selon la revendication 15, caractérisé en que qu'il reconnaît spécifiquement la p42 de P falciparum
18. Anticorps spécifique selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il reconnaît spécifiquement la p42 de P vivax
19. Procédé de diagnostic différentiel permettant de distinguer entre une infection parasitaire due à P wvax, d'une part, et une infection parasitaire due à un autre plasmodium, d'autre part, caractérisé par les mises en contact d'un prélèvement biologique infecté par un plasmodium avec un anticorps selon la revendication 18, d'une part, et avec un anticorps selon la revendication 16 ou 17, d'autre part, et la détection selon le cas, de la production ou non d'une réaction immunologique
20. Vecteur modifié du type baculovirus recombinant contenant sous le contrôle d'un promoteur contenu dans ce vecteur et susceptible d'être reconnu par des cellules transfectables par ce vecteur, une première séquence nucléotidique codant pour un peptide signal exploitable par un système baculovirus, caractérisé par une deuxième séquence en aval de la première, également sous le contrôle de ce promoteur et dont au moins une partie code pour la séquence peptidique •
• soit d'un fragment peptidique C-terminal de 42 kilodaltons (p42) de la protéine 1 de surface (protéine MSP-1 ) de la forme mérozoïte d'un parasite du type Plasmodium, infectieux pour l'homme, et dont, le cas échéant, ont été délétées la région II et, le cas échéant aussi, une ou des parties de la région III, en particulier les parties les moins bien conservées de celles-ci ,
• soit d'une partie de ce fragment peptidique dès lors que le produit d'expression de la deuxième séquence dans un système baculovirus est apte aussi à inhiber une parasitémie normalement induite m vivo par le parasite correspondant ,
• soit d'un peptide capable d'induire une réponse immunologique de type cellulaire et/ou humorale équivalente à celle produite par ce fragment peptidique p42 ou à la susdite partie de ce fragment, et ladite séquence nucléotidique ayant en outre une teneur en G et C comprise entre 40 et 60%, de préférence d'au moins 50% de la totalité des nucleotides dont elle est constituée
21. Vecteur modifié selon la revendication 20, caractérisé en ce que la susdite deuxième séquence polypeptidique est conforme à celle définie dans l'une quelconque des revendications 2 à 9
22. Vecteur modifié selon la revendication 20, caractérisé en ce que la deuxième séquence nucléotidique est une séquence synthétique
23. Vecteur modifié selon l'une quelconque des revendications 20 à 22, caractérisé en ce que la première séquence nucléotidique code pour un peptide signal issu de Plasmodium vivax et normalement associé à la protéine MSP-1 de ce Plasmodium
24. Vecteur modifié selon l'une quelconque des revendications 20 à 23, caractérisé en ce que la deuxième séquence nucléotidique est dépourvue à son extrémité 3' terminale de la séquence d'extrémité C- termmale hydrophobe qui est impliquée dans l'induction de l'ancrage de cette protéine recombinante à la membrane cellulaire de l'hôte dans lequel elle est exprimée, notamment dans une cellule d'insecte infectable par un baculovirus 25. Vecteur modifié selon l'une quelconque des revendications
20 à 24, caractérisé en ce qu'il consiste en un baculovirus modifié
26. Organisme, notamment cellule d'insecte du type Sf9, transfectable et transfecté par le vecteur modifié selon l'une quelconque des revendications 20 à 24
27. ADN synthétique contenant une première séquence nucléotidique dont au moins une partie code pour la séquence peptidique
• soit d'un fragment peptidique C-terminal de 42 kilodaltons (p42) de la protéine 1 de surface (protéine MSP-1 ) de la forme mérozoïte Plasmodium falciparum, infectieux pour l'homme et dont, le cas échéant, ont été délétées la région II et, le cas échéant aussi, une ou des parties de la région III, en particulier les parties les moins bien conservées de celles-ci ,
• soit d'une partie de ce fragment peptidique dès lors que le produit d'expression de cet ADN dans un système baculovirus est apte à inhiber une parasitémie normalement induite in vivo par le parasite correspondant
• soit d'un peptide capable d'induire une réponse immunologique de type cellulaire et/ou humorale équivalente à celle produite par ce fragment peptidique p42 ou à la susdite partie de ce fragment, et ladite séquence nucléotidique ayant en outre une teneur en nucleotides G et C comprise entre 40 et 60%, de préférence d'au moins 50% du total des nucleotides dont est constitué le susdit ADN synthétique.
28. ADN synthétique selon la revendication 27, caractérisé en ce que sa première séquence nucléotidique est dépourvue à son extrémité 3' terminale de la séquence codant pour la région d'extrémité C-terminale hydrophobe normalement impliquée dans l'induction de l'ancrage de la protéine p19 dont la séquence est incluse dans celle de la p42, à la membrane cellulaire de l'hôte dans lequel elle est exprimée, notamment dans une cellule d'insecte infectable par un baculovirus
29. ADN synthétique selon la revendication 27 ou la revendication 28, caractérisé en ce que la première séquence nucléotidique est précédée d'une séquence nucléotidique signal codant pour un peptide signal normalement associé à une protéine MSP-1 de Plasmodium, homologue ou hétérologue vis-à-vis de la séquence principale
30. ADN synthétique selon la revendication 29, caractérisé en ce que la séquence signal est issue de P vivax
31. ADN synthétique selon l'une quelconque des revendications 27 à 30, caractérisé en ce que la susdite première séquence nucléotidique inclut une séquence 3'-termιnale codant pour une région polypeptidique d'ancrage à la membrane cellulaire, ladite région d'ancrage se fixant sur la protéine recombinante exprimée à la surface de la membrane de l'hôte cellulaire transformé avec un vecteur contenant ledit ADN synthétique, ladite séquence 3' étant homologue à celle de la séquence nucléotidique principale, ou hétérologue, notamment celle issue de P vivax
32. ADN synthétique selon la revendication 31 , caractérisé en ce que la séquence 3'-termιnale est issue de P vivax.
33. ADN synthétique selon l'une quelconque des revendications 27 à 31 , caractérisé en qu'il est dépourvu de ladite séquence 3'-termιnale
34. Hybπdome sécréteur d'anticorps monoclonaux ayant les spécificités des anticorps selon l'une quelconque des revendications 15 à
18
35. Procédé de séparation d'un peptide p42 de spécificité donnée à partir d'un mélange de peptides caractérisé par la mise en contact de ce mélange de peptides avec un anticorps correspondant, conforme à l'une quelconque des revendications 15 à 18, de préférence préalablement fixé sur un support insoluble, par la dissociation ultérieure du composé antigène-anticorps formé et par la récupération du peptide p42 purifié
36. Utilisation de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 pour la préparation d'une composition immunogène susceptible d'induire une réponse immune contre une infection à Plasmodium
37. Composition de vaccin comprenant à titre de principes actifs un mélange d'une protéine conforme a l'une quelconque des revendications 1 a 13 et soit de la p19 correspondante, soit d'une autre protéine recombinante, de type p42 ou p19, provenant d'un parasite homologue de celui dont est issu la susdite protéine
38. Composition de vaccin selon la revendication 37 caractérisée en ce que son mélange de principes actifs est choisi parmi les mélanges suivant
- p42 de P falciparum et p42 de P vivax,
- p42 de P falciparum et p19 de P falciparum,
- p42 de P vivax et p19 de P vivax,
- p42 de P falciparum, p19 de P falciparum et p19 de P vivax, p42 de P vivax. la p42 étant le cas échéant dépourvue de ses régions les plus hypervaπables
39. Hybπdome selon la revendication 34, caractérisé en ce qu'il a été déposé à la CNCM sous le numéro 1-1846, le 14 février 1997.
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