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WO1997017843A1 - Procede pour realiser des animaux transgeniques - Google Patents

Procede pour realiser des animaux transgeniques Download PDF

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WO1997017843A1
WO1997017843A1 PCT/JP1996/003359 JP9603359W WO9717843A1 WO 1997017843 A1 WO1997017843 A1 WO 1997017843A1 JP 9603359 W JP9603359 W JP 9603359W WO 9717843 A1 WO9717843 A1 WO 9717843A1
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WO
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gene
hvj
gene transfer
vector
present
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Application number
PCT/JP1996/003359
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ryuichi Morishita
Yasushi Kaneda
Toshio Ogiwara
Tsuneaki Sakata
Mamoru Hasegawa
Original Assignee
Dnavec Research Inc.
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Filing date
Publication date
Application filed by Dnavec Research Inc. filed Critical Dnavec Research Inc.
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
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    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription

Definitions

  • the present invention relates to a technique for producing transgenic animals.
  • transgenic animals In developmental biology and molecular biology, techniques for creating transgenic animals include: (1) analysis of the expression of genetic information that accompanies temporal changes such as gene development, differentiation, growth, and aging in vivo; Analysis of the gene structure involved in the expression of tissue-specific genetic information, 3 Analysis of the physiological and pathological roles of gene products at the individual level, ⁇ Creation of disease model animals, 5 Occurred by the introduction of foreign genes It has been applied to the analysis of unknown genes using insertion mutations, etc., and ⁇ ⁇ the direct function evaluation of unknown genes.
  • a knockout animal in which a specific gene is inactivated by using a technology obtained by applying and developing this technology, it is also possible to identify the role of the gene at the developmental stage or the function in vivo. it can.
  • transgenic technology has greatly contributed to the development of biotechnology.
  • this technology to livestock, it can be used to produce useful bioactive substances and improve varieties.
  • the most commonly used method for producing transgenic animals by a conventional method is to inject the isolated gene into the pronucleus of a fertilized egg through a glass capillary attached to the tip of a micromanipulator. I have. After injection, survived recipients The sperm is transplanted into the oviduct of the foster mother mouse. In other words, basically, three operations are performed: collection of a fertilized egg, injection of a gene, and transplantation of a fertilized egg into a fallopian tube. These operations require a high level of skill. Further, the number of transgenic mice finally obtained by the conventional method is about 1 to 3 on average when starting from 100 fertilized eggs, and the efficiency is very low. Furthermore, since the conventional method uses a fertilized egg, there is a disadvantage that it is impossible to knock out essential genes involved in the early stage of development.
  • An object of the present invention is to overcome the technical difficulties of the conventional technology and to easily produce a transgenic mammal. It is another object of the present invention to introduce a gene in a stage-specific and site-specific manner at various stages of development, which was impossible with the prior art.
  • the present inventors have found that a composition containing a compound having an affinity for both DNA and cells and a vector for gene transfer can be efficiently contacted with the epidermis of a mammal including living epidermis cells directly.
  • the present inventors have found that gene transfer can be performed and completed the present invention. More specifically, the present inventors have found that, when a gene transfer vector is introduced into fetal amniotic fluid, the gene is transferred in a body surface-specific manner over the entire body surface, thus completing the present invention. did.
  • the present invention provides a method for producing a transgenic mammal other than a human, Regarding the composition for gene transfer used in the method, specifically,
  • a method for producing a transgenic mammal other than a human which comprises injecting a gene transfer composition comprising a compound having affinity and a gene transfer vector.
  • composition for gene transfer contains an inactivated Sendai virus (HV J);
  • composition for gene transfer which is used in the method according to any one of (1) to (3),
  • Examples of the “compound having an affinity for both DNA and the body surface of a mammalian embryo or fetus” in the “gene transfer composition” of the present invention include cationic ribosomes (PLFelgner et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987), CM Corma et al., Ol. Cell. Biol., 2, 1044 (1982), N. Haga, K. Yagi, J. Clin. Biochem. Nutr.
  • the “gene transfer vector” in the “gene transfer composition” of the present invention basically all gene transfer vectors are used.
  • retrovirus vectors for gene transfer such as adeno-associated virus vectors.
  • the “gene introduction composition” of the present invention As a method for injecting the “gene introduction composition” of the present invention into amniotic fluid, there is a method of injecting directly into amniotic fluid in the uterus using an injector or the like. Further, as the genes to be guided by the “gene transfer vector” of the present invention, all types of genes such as development stage-specific genes, organ-specific, particularly skin-specific shoalers, and other genes for treating various diseases are included. No.
  • the range of animals to which the method of the present invention can be applied or the range of animals to which the composition of the present invention can be administered includes all mammals such as mice, puppies, puppies, and monkeys except humans. It is possible.
  • the fertilized egg which is a pre-implantation embryo for embryo development, as well as the 2-cell stage embryo, the 4-cell stage embryo, and the 8-cell stage Genes can be introduced into embryos at any stage, including embryos, morulae, blastocysts, late blastocysts, early ovarian embryos, ovarian embryos, and late ovarian embryos.
  • the gene can also be introduced into the embryo after implantation.
  • Such "introduction of a stage-specific gene" according to the present invention is considered to give very important findings to embryology research.
  • the role of the gene at each stage of development can be inferred by suppressing genes that act stage-specifically, such as by introducing antisense.
  • the gene by introducing the gene into each site at each developmental time, the future fate of the development at that site and the fate of the cell can be observed.
  • introduction of the gene after a certain stage of development can avoid toxicity due to overexpression of the gene.
  • Fig. 1 (A)-Fig. 1 (B) are photomicrographs showing the distribution of FITC-labeled 0DN introduced into fetal rat amniotic fluid by IS-injector after 2 hours.
  • (A) is a micrograph observed at 40 ⁇ and
  • (B) is a micrograph observed at 100 ⁇ .
  • Figure 2 is a photomicrograph showing the distribution of FITC-labeled 0DN 5 days after introduction into fetal rat amniotic fluid by direct injection.
  • FIG. 3 shows the structure of plasmid pSV40Gal expressing ⁇ -galactosidase gene.
  • FIG. 4 (A) -FIG. 4 (C) are photographs of rat fetal skin on day 5 after transfusion.
  • (A) and (B) relate to rats transfected with the S-galactosidase vector and control vector, respectively, and (C) relates to untreated rats.
  • FIG. 5 (A) -FIG. 5 (C) are photographs showing histological analysis of rats on day 5 after transfusion.
  • (A) and (B) relate to a rat transfected with one galactosidase vector and a control vector, respectively, and (C) relates to an untreated rat.
  • FIG. 6 (A) -FIG. 6 (C) are photographs showing histological analysis of rats 10 days after transfection.
  • (A) and (B) relate to the rat transfected with the -galactosidase vector and the control vector, respectively, and (C) relates to the untreated rat.
  • Phosphatidylserine, phosphatidylcholine, and cholesterol were mixed at a weight ratio of 1: 4.8: 2.
  • the dried lipid was dissolved in 200 1 BSS solution (137 mM NaCl, 5.4 mM C1, 10 mM Tris-HCl, pH 7.6) containing plasmid DNA or FITC-labeled oligonucleotide (0DN).
  • the ribosome was prepared by shaking and ultrasound (see “Liposome Experiments in Life Sciences”, Springer 1. Pharaak Tokyo (1992), p. 282-287).
  • HVJ strain Z
  • UV irradiation 110 erg / nun 2 / sec
  • the ribosome solution described above (10 mg liposome / 0.5 ml solution) was mixed with 10,000 hemagglutination units of HVJ and diluted with BSS solution to a final volume of 4 ml. The mixed solution was kept at 4 for 5 minutes, and then gently shaken at 37 for 30 minutes. Unreacted HVJ and liposomes were removed from the HVJ-ribosome by a sucrose density gradient.
  • FITC-labeled oligonucleotide (0DN)
  • the oligonucleotide (0DN) was labeled with FITC at the 5 'end and 3' end (Antisense Res. Develop. Vol. 2, 27-39 (1992)).
  • the HVJ-ribosome containing the labeled ODN was prepared by the method of Example 1.
  • the final concentration of the FITC-labeled 0DN injected into the amniotic fluid was 3 M (concentration of 0DN relative to the total ribosome solution).
  • 101 ⁇ l of HVJ-ribosome containing labeled 0DN prepared by the method of Example 1 was injected through a 30-gauge injection needle. .
  • HVJ ribosomes containing no FITC-labeled 0DN prepared by the method of Example 1 were injected. All rats were sacrificed 2 hours or 5 days later, and the extracted tissues were fixed in a 4% paraformaldehyde solution according to a conventional method, and the sections were stained with erythrochrome black and observed with a fluorescence microscope.
  • pSV40Gal a plasmid that expresses the ⁇ -peroxidase gene, was constructed as follows. Plasmid DNA pAct-c-myb containing the 370 base pair 5 'promoter overnight region and the 900 base pair primary 1-xon region of the nitrile / S-actin promoter to remove the cmb region Cleavage with restriction enzymes Ncol and Xbal was followed by ligation with Sail linker. 3. One kilobase pair of E. coli; the 3-galactosidase gene was excised from the plasmid DN ApMC1871 using the restriction enzyme Sail and bound to the Sail site on the plasmid thigh (Fig. 3).
  • a plasmid DNA pAct-CV containing no E. coli yS-galactosidase gene was simultaneously prepared.
  • HVJ-ribosomes containing the 9-galactosidase gene plasmid pSV40Gal or control plasmid DNA pAct-CV were prepared.
  • HMG-1 protein was simultaneously encapsulated in HVJ-ribosomes.
  • a syringe was injected directly into the amniotic fluid from the uterine wall, and 10 ⁇ 1 of HVJ-ribosome prepared by the method of Example 2 was injected.
  • transgenic animals can be created more easily than in the past.
  • Transgenic animals in which genes have been specifically introduced into the entire body are particularly useful for studies of skin cells, including fibroblasts. Specifically, (1) the expression of genetic information associated with temporal changes such as the development, differentiation, growth, and aging of skin-specific genes; (2) the analysis of the gene structure involved in the expression of skin-specific genetic information; and (3) the skin. It can be applied to research such as creation of disease model animals.
  • the present invention can be applied to the production of useful livestock with altered skin characteristics.
  • knockout of essential genes and introduction of lethal genes have become possible, and the range of transgenic animals that can be produced has been expanded.
  • “stage-specific gene transfer” has become possible using the present invention.

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Description

明細書 トランスジエニック動物の作出方法
技術分野
本発明は、 トランスジエニック動物作出技術に関する。 技術背景
外来遺伝子を導入し生体内で安定に発現させるという トランスジ ニック動物 の作成法については、 1980年マウスの受精卵にマイクロマニュピュレーターを用 い外来遺伝子を導入する方法が米国のゴードン （Gordon) により最初に開発され た。 発生生物学および分子生物学において、 トランスジエニック動物の作成技術 は、 ① 生体内での遺伝子の発生、 分化、 成長、 老化などの時間的変化に伴う遺 伝情報の発現の解析、 ② 細胞あるいは組織特異的な遺伝情報の発現に関与する 遣伝子構造の解析、 ③ 遺伝子産物の個体レベルでの生理的，病理的役割の解析 、 ④ 疾患モデル動物の作成、 ⑤ 外来遺伝子導入に伴って生じた挿入突然変異 などを利用した未知の遺伝子の解析、 ⑥ 未知の遺伝子の直接的な機能の評価、 などに応用されている。 また、 この技術を応用発展させた技術を用いて、 特定の 遺伝子を不活化したノックァゥ卜動物を作成することにより、 同様にその遺伝子 の発生段階における役割または生体内での機能を同定することができる。 このよ うにトランスジヱニック技術は生命工学の発展に大いに貢献している。 また、 家 畜などへこの技術を応用することによって、 有用な生理活性物質の生産や品種の 改良などに利用することが可能である。
ところで、 従来法によってトランスジヱニック動物を作成する際には、 単離し た遺伝子をマイクロマ二ュピュレーターの先につけたガラス毛細管を通して、 受 精卵の前核中に注入する方法が最もよく用いられている。 注入後、 生き残った受 精卵を仮親マウスの卵管へ移植する。 即ち、 基本的には、 受精卵の採取、 遺伝子 の注入、 および受精卵の卵管への移植という 3つの操作を経ているが、 これらの 操作には高度の習熟を必要とする。 また、 従来の方法により最終的に得られる遗 伝子導入マウスの数は、 100個の受精卵から出発した場合平均して 1〜3匹程度と、 効率も非常に低い。 更に、 従来法では受精卵を用いるため、 発生初期に関与する 必須遺伝子のノックァゥ卜は不可能であるという欠点がある。
なお、 最近、 モロニ一マウスレトロウイルスベクターのエンベロープ蛋白質と 、 造血因子の一^ ^でぁるェリスロポイエチンを融合蛋白質にしてウィルス表面に 出現させ、 赤芽球特異的に遺伝子を導入するべクタ一も開発されているが （N. Ka shihara et al. , Science 266, 1373 1376 (1994)) 、 成功例が少なく、 技術的に未 熟であるといわざるを得ない。 特に、 従来のトランスジヱニック技術では組織特 異的な遺伝子導入は不可能であり、 「体表全体」 への特異的な遺伝子導入につい ては、 概念的に述べた文献すら存在しない。 発明の開示
本発明は、 従来の技術が抱える技術的困難さを克服し、 簡便にトランスジェニ ック哺乳動物を作出することを目的とする。 また、 従来技術では不可能であった 、 発生の諸段階に対してステージ特異的に、 また部位特異的に遺伝子を導入する ことを目的とする。
本発明者らは、 D N A及び細胞の両者に親和性を有する化合物と遺伝子導入用 ベクターとを含む組成物を、 生存している表皮細胞を含む哺乳動物の表皮に直接 接触させることによって、 効率良く遺伝子導入を行うことができることを見い出 し、 本発明を完成した。 より具体的には、 本発明者らは、 胎児羊水中に遺伝子導 入用ベクターを導入したところ、 体表全体にわたって体表特異的に、 遺伝子が導 入されることを見い出し、 本発明を完成した。
即ち、 本発明は、 ヒ卜以外のトランスジエニック哺乳動物の作出方法または該 方法に用いられる遺伝子導入用組成物に関し、 具体的には、
( 1 ) 哺乳動物の胚または胎児の体表全体にわたつて特異的に外来遺伝子を導 入するための、 哺乳動物の羊水中に、 DN A及び哺乳動物の胚または胎児の体表 の両者に親和性を有する化合物と遺伝子導入用べクタ一とを含む遺伝子導入用組 成物を注入することを特徴とする、 ヒ卜以外のトランスジ ニック哺乳動物の作 出方法、
(2) D N A及び哺乳動物の胚または胎児の体表の両者に親和性を有する化合 物がリボソームを形成している、 （1 ) 記載の方法、
(3) 遺伝子導入用組成物が不活化されたセンダイウィルス （HV J ) を含む 、 （ 1 ) または （2) に記載の方法、
(4) ( 1 ) 〜 （3) のいずれかに記載の方法に用いられることを特徴とする 遺伝子導入用組成物、
に関する。
本発明の 「遺伝子導入用組成物」 中の 「DN A及び哺乳動物の胚または胎児の 体表の両者に親和性を有する化合物」 としては、 陽イオン性リボソーム （P.L.Fe lgner et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)、 C. M. Corma et al.， ol. Cell. Biol. , 2, 1044(1982)、 N. Haga, K. Yagi, J. Clin. Biochem. Nutr. , 7, 175(1989)、 J. R. Neuian et al.， Biotechniques, 12, 643(1987)) 、 HVJ-リボソームを含むリポ ソーム （ 「ライフサイエンスにおけるリボソーム /実験マニュアル」 シュプリン ガー ·フヱアラーク東京（1992)p.282〜287) 等が用いられる。 また、 本発明の 「 遺伝子導入用組成物」 中の 「遺伝子導入用ベクター」 としては、 基本的には全て の遺伝子導入用ベクターが用いられるが、 例えば、 レトロウイルスベクタ一、 ァ デノウィルスベクター、 アデノ随伴ウィルスベクターなどの遺伝子導入用ウィル スベクタ一力、'用いられる。
また、 本発明の 「遺伝子導入用組成物」 を羊水中に注入する方法としては、 注 射器等により子宮内の羊水中に直接注入する方法などがある。 更に、 本発明の 「遺伝子導入ベクター」 によって導人される遺伝子としては、 発生ステージ特異的遺伝子、 臓器特異的、 特に皮膚特異的逍伝子、 その他各種疾 患治療用遺伝子などあらゆる種類の遺伝子が挙げられる。
更に、 本発明の方法が適用可能な動物の範囲または本発明の組成物が投与可能 な動物の範囲としては、 ヒ卜を除く、 マウス、 ゥサギ、 ゥシ、 サルなど全ての哺 乳動物に適用可能である。
なお、 本発明によれば、 受精卵に遺伝子を導入するという先行技術に比べ、 胚 発生の着床前胚である受精卵はもちろんのこと、 2細胞期胚、 4細胞期胚、 8細胞期 胚、 桑実胚、 胚盤胞、 後期胚盤胞、 初期卵筒胚、 卵筒胚、 後期卵筒胚などあらゆ る時期特異的に胚に遺伝子を導入することが可能である。 また、 着床後胚にも遺 伝子導入が可能である。 このような本発明による 「発生ステージ特異的な遗伝子 導入」 は発生学の研究に非常に重要な知見を与えると考えられる。 特にアンチセ ンス導入などによりステージ特異的に働く遺伝子を抑えることにより発生各段階 における遗伝子の役割が推察できる。 また各発生時期の各部位にマ一力一遺伝子 を導入することにより、 その部位の発生における将来の運命が観察でき、 また細 胞の運命を観察できる。 更に、 全ての組織器官に働くと都合の悪い遗伝子でも、 発生のある時期以降に導入することにより遗伝子の過剰発現による毒性を回避で きる。 図面の簡単な説明
図 1 (A) -図 1 (B)は、 IS接注人により胎児ラッ 卜羊水へ導入された FITC標識 0DN の 2時問後における分布を示す顕微鏡写真である。 （A)は 40倍、 （B)は 100倍で観察 した顕微鏡写真である。
図 2は、 直接注入により胎児ラッ 卜羊水へ導入された FITC標識 0DNの 5日後にお ける分布を^す顕微鏡写真である。
図 3は、 ^一ガラクトシダ一ゼ遺伝子を発現するプラスミ ド pSV40Galの構造を 示す図である。
図 4 (A)-図 4 (C)は、 卜ランスフヱクシヨン後 5日目におけるラッ 卜の胎児皮膚 の写真である。 （A)、 （B)は、 各々 S—ガラク トシダーゼベクタ一、 対照ベクター で遺伝子導入されたラッ 卜に関し、 （C)は未処理ラッ 卜に関する。
図 5 (A)-図 5 (C)は、 トランスフヱクシヨン後 5日目におけるラッ 卜の組織学的 分析を示す写真である。 （A)、 （B)は、 各々 一ガラク トシダーゼベクタ—、 対照 ベクターで遺伝子導入されたラッ 卜に関し、 （C)は未処理ラッ 卜に関する。
図 6 (A)-図 6 (C)は、 トランスフヱクション後 10日目におけるラッ 卜の組織学的 分析を示す写真である。 （A)、 （B)は、 各々 ーガラク トシダーゼベクタ一、 対照 ベクタ一で遺伝子導入されたラッ 卜に関し、 （C)は未処理ラッ 卜に関する。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明は、 これらの実施例 に限定されるものではない。
[実施例 1 ] HVJ-リポソームの調製
ホスファチディルセリン、 ホスファチディルコリン、 及びコレステロールを重 量比 1 :4. 8: 2で混合した。 乾燥させた脂質をプラスミ ド DNAもしくは FITC標識オリ ゴヌクレオチド（0DN)を含んだ 200 1の BSS溶液 （137mM NaCl, 5. 4mM C1, lOmM Tris-HCl, pH 7. 6) 中に溶解した。 リボソームは震 ¾と超音波により調製した （ 「ライフサイエンスにおけるリポソームノ実験マニュアル」 シュプリンガ一 . フ ヱアラーク東京（1992)p. 282〜287参照） 。
一方、 HVJ(Z株）を精製し、 使用直前に 3分間紫外線照射（110 erg/nun2/秒）を行い 不活化した。 前述のリボソーム溶液 （10 mgリポソ一厶 /0. 5 ml溶液） を 10, 000赤 血球凝集単位の HVJと混合し、 BSS溶液で希釈し最終容量を 4 mlとした。 混合溶液 を 4 で 5分間保持し、 その後 37 で 30分間穏やかに^盪した。 なお、 未反応の HV Jとリポソ一厶は蔗糖密度勾配で HVJ -リボソームから取り除いた。 [実施例 2 ] FITC標識ォリゴヌクレオチド（0DN)の in vivo導入
オリゴヌクレオチド（0DN)の 5'末端と 3'末端とを FITC標識した （Antisense Res . Develop. Vol. 2， 27- 39( 1992) ) 。 該標識 ODNを含む HVJ -リボソームを実施例 1の 方法で調製した。 羊水に注入する FITC標識 0DNは最終濃度 （全リボソーム溶液に対 する 0DNの濃度） 3 Mにした。 妊娠 15日のスプラーグーダウレ一 （Sprague- Dawle y) ラッ 卜の羊水に、 実施例 1の方法で調製した標識 0DNを含む HVJ-リボソーム 10 〃1を、 30ゲージの注射針を通して注入した。 この際、 直接子宮壁より羊水中に注 射器を打ち込んだ。 対照として、 実施例 1の方法で調製した FITC標識 0DNを含まな い HVJ リボソームを注入した。 全てのラットは 2時間もしくは 5日後に屠殺して常 法に基づき、 摘出した組織を 4%パラホルムアルデヒド溶液に投入して固 定した 後、 切片をエリクロームブラックで染色後蛍光顕微鏡で観察した。
その結果、 導入後 2時間後に全身に渡って、 表皮及び上皮の数層に蛍光が観察さ れた （図 1(A)及び図 1(B) ) 。 FITC標識 0DNを含まない の HVJ リボソームを注 入されたラッ卜もしくは未注入のラッ 卜には蛍光は観察されなかった （データは 示していない） 。 表皮細胞の蛍光は主に核内に観察され、 導入後少なくとも 5日間 は観察された （図 2) 。 蛍光は少ないながら肝臓にも 観察されたが、 腎臓、 心臓 、 肺、 脳には観察されなかった。
[卖施例 3 ] 新生児ラッ 卜への ;3 -ガラク トシダーゼの導入
β - ϋラウ卜シダ一ゼ遣伝子を発現するプラスミ ドである pSV40Galは、 以下のよ うに構築した。 ニヮ卜リ /S -ァクチンプロモーターの 370塩基対の 5' プロモ一夕一 領域及び 900塩基対の第一-ヱキソン領域を含むプラスミ ド DNApAct- c-mybを c myb領 域を除くために制限酵素 Ncolと Xbalで切断し、 その後に Sai lリンカ一をライゲー シヨンした。 3. 1キロ塩基対の大腸菌; 3 -ガラクトシダ一ゼ遺伝子はプラスミ ド DN ApMC1871より制限酵素 Sai lを用いて切り出し、 上記プラスミ ド腿の Sai l 部位に 結合した （図 3) 。 対照として、 大腸菌 yS -ガラクトシダ一ゼ遺伝子を含まないプ ラスミ ド DNApAct- CVを同時に作成した。 ;9 -ガラク トシダ一ゼ遺伝子プラスミ ド pSV40Galまたは対照プラスミ ド DNApAct - CVを含む HVJ -リボソームを調製した。 導入効率を上げるために、 HMG- 1蛋白質を 同時に HVJ -リボソームに封入して用いた。 直接子宮壁より羊水中に注射器を打ち 込み、 実施例 2の方法で作成した 10〃 1の HVJ-リボソームを注入した。 ラッ 卜は注 入後 5日後、 10日後に屠殺して、 常法に基づき、 摘出した組織を 1 %パラホルムァ ルデヒ ド溶液に投入して固定した後、 組織を取り出して、 常法に基づき、 ェオシ ン溶液で染色した。 その後、 X galクロマジヱンバッファ一溶液 （49mg/ml 5 ブロ モ- 4-クロル- 3-インドリル D-ガラク トシド： PBSに溶解した 1 mmol MgCl 2及び 3 匪 ol K3Fe(CN) 6 = l : 99) を加えた。 染色後顕微鏡で観察した。 対照とし て 、 ラ ッ 卜の心臓に大腸菌 -ガラク 卜シダ一ゼ遺伝子を含まないプラスミ ド DMを含ん だ HVJ リポソームを打ち込んだものにも同様の操作を行い観察した。
その結果、 ；3 -ガラク トシダーゼ遺伝子プラスミ ド DNAベクタ一を含む HVJ -リポ ソー厶を直接羊水に注入することによって、 5日後の胎児皮膚には yS -ガラク トシ ダーゼの発現が見られた （図 4(A)) 。 一方、 >9 -ガラク トシダーゼ遺伝子プラスミ ド DNAベクタ一を含まない HVJ-リポソ一ムもしくは未処理の胎児皮膚には -ガラ ク トシダーゼの発現が見られなかった （図 4(B)、 図 4(C) ) 。 S -ガラク トシダーゼ の発現が見られた細胞は表皮と上皮数層にわたって存在した （図 5(A) ) 。 これら の細胞は主に線維芽細胞であつた。 S -ガラク トシダーゼの発現は発現量は弱くな るものの 10日にわたって観察された （図 6(A)) 。 一方、 /S -ガラク トシダーゼ遺伝 子プラスミ ド DNAベクタ一を含まない HVJ-リボソームで処理したマウス、 及び未処 理のマウスの組織には ガラク トシダーゼの発現が見られなかった （図 5(B)、 図 5(C)及び図 6(B)、 図 6(C) ) なお、 HVJ -リボソームを導入したラッ 卜、 導入しな い ラッ 卜の間に、 生存率の差はみられなかった。 産業上の利用の可能性
本発明によって、 「体表全体」 に特異的に遺伝子を導入することが可能となり 、 従来に比して簡便にトランスジヱニック動物が作成できるようになった。 「体 表全体」 に特異的に遺伝子が導入されたトランスジ ニック動物は、 特に線維芽 細胞を含む皮膚細胞の研究等に有益である。 具体的には、 ① 皮膚特異的遺伝子 の発生、 分化、 成長、 老化などの時間的変化に伴う遺伝情報の発現、 ② 皮膚特 異的な遺伝情報の発現に関与する遺伝子構造の解析、 ③ 皮膚疾患モデル動物の 作成、 などの研究に応用可能である。 また、 本発明は、 皮膚の形質を変化させた 有用な家畜の作出などにも応用可能である。 また、 本発明の方法を利用して、 必 須遺伝子のノックァゥトおよび致死遺伝子の導入が可能となり、 作出できるトラ ンスジエニック動物の幅が拡大した。 さらに、 本発明を用いて 「ステージ特異的 な遺伝子導入」 が可能となった。

Claims

請求の範囲
1 . 哺乳動物の胚または胎児の体表全体にわたって特異的に外来遺伝子を導入す るための、 哺乳動物の羊水中に、 D N A及び哺乳動物の胚または胎児の体表の両 者に親和性を有する化合物と遺伝子導入用べクターとを含む遺伝子導入用組成物 を注入する工程を含むことを特徴とする、 ヒ卜以外の卜ランスジ ニック哺乳動 物の作出方法。
2 . D N A及び哺乳動物の胚または胎児の体表の両者に親和性を有する化合物が リボソームを形成している、 請求の範囲 1記載の方法。
3 . 遺伝子導入用組成物が不活化されたセンダイウィルス （H V J ) を含む、 請 求の範囲 1または 2に記載の方法。
4 . 請求の範囲 1〜 3のいずれかに記載の方法に用いられることを特徴とする遺 伝子導入用組成物。
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Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLOOD, Vol. 78(4), 1991, WADE CLAPP et al., pages 1132-1139. *
GENE THERAPY, Vol. 2, July 1995, PITT et al., pages 344-350. *
GENE, Vol. 149, 1994, MORISHITA et al., pages 13-19. *
J. BIOL. CHEM., Vol. 264, 1989, KANEDA et al., pages 12126-12129. *
J. CLIN. INVEST., Vol. 95, June 1995, McCRAY et al., pages 2620-2632. *
NATURE SCIENCE, Vol. 1(11), 10 November 1995, HARMANJATINDER et al., pages 1201-1203. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7576080B2 (en) 2004-12-23 2009-08-18 Memory Pharmaceuticals Corporation Certain thienopyrimidine derivatives as phosphodiesterase 10 inhibitors

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