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WO1997016459A1 - Application de la proteine gax au traitement de cancers - Google Patents

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WO1997016459A1
WO1997016459A1 PCT/FR1996/001690 FR9601690W WO9716459A1 WO 1997016459 A1 WO1997016459 A1 WO 1997016459A1 FR 9601690 W FR9601690 W FR 9601690W WO 9716459 A1 WO9716459 A1 WO 9716459A1
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WO
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gax
use according
adenovirus
nucleic
sequence
Prior art date
Application number
PCT/FR1996/001690
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Inventor
Aude Leroux
Didier Branellec
Patrice Denefle
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S.A.
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Publication date
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Priority to AU74982/96A priority patent/AU730324B2/en
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Definitions

  • the present invention relates to a new method for the treatment of cancers. More particularly, it relates to a method of treating cancers by blocking cell proliferation which can be deregulated in tumor cells expressing an oncogen such as ras mutated or deficient for a tumor suppressor gene such as p53. It also relates to the use of gene therapy vectors making it possible to regulate it, as well as the pharmaceutical compositions containing them.
  • p21 proteins The products of the ras genes, generally designated p21 proteins, play a key role in the control of cell division in all the eukaryotic organisms where they have been sought. Certain specific modifications of these proteins cause them to lose their normal control and lead them to become oncogenic. Thus, a large number of human tumors have been associated with the presence of modified ras genes. Likewise, overexpression of these p21 proteins can lead to disruption of cell proliferation.
  • tumor suppressor genes like p53 and Rb.
  • the protein p53 at least in its wild form, is a transcription factor which negatively regulates growth and cell division and which, in certain situations, is capable of inducing Tapoptosis (Yonish-Rouach et al., Nature, 352, 345-347, 1991).
  • Tapoptosis Yamamoto-Rouach et al., Nature, 352, 345-347, 1991.
  • p53 has been suggested to be a "guardian of the genome".
  • certain phenomena can disrupt this mechanism of cellular self-regulation and thus favor the development of a neoplastic state.
  • the present invention results precisely in part from the demonstration that the GAX protein constitutes a potential inhibitor of cell proliferation induced by ras proteins. It results in particular from the demonstration that a cell proliferation, deregulated in tumor cells, can be retao ⁇ ed by expressing the GAX protein there.
  • the GAX protein is a protein of 303 amino acids. Its sequence has been characterized and its cDNA cloned (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733).
  • the gax (growth arrest specifies homeobox) gene belongs to the family of homeotic genes. These genes code for transcriptional factors which contain consensus (or homeodomain) sequences recognizing specific regions of DNA (or homeoboxes) (review: Gehring et al. Cell, 78: 211-223, 1994).
  • the rat gax protein iomeodomain is between amino acids 185 and 245. This gene has certain properties similar to the gas and Gadd genes since it also seems to control the G0 / G1 transition of the cell cycle.
  • gax mRNA levels are reduced in rat CMLVs by a factor of 10 after two hours of exposure to PDGF (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733).
  • the expression of the gax gene is therefore repressed during the mitogenic response of CMLV.
  • the expression of the gax gene has been demonstrated in the cardiovascular system, in particular the heart and the aorta and so far the use in gene therapy of this gene has therefore been limited to the level of these cells, expressing it naturally.
  • the Applicant has discovered that it is possible to advantageously enhance an inhibitory activity of the GAX protein with regard to cell proliferation in tumor cells, ie cells which do not express the gax gene endogenously.
  • the present invention thus offers a new particularly effective approach for the treatment of tumors associated with a disruption of cell proliferation such as non-small cell lung tumors, pancreatic and colonic carcinomas, osteosarcomas, etc.
  • the present invention also describes particularly effective systems enabling the delivery in vivo, directly into tumors, of such compounds and thus of combating the development of cancers.
  • a first object of the invention therefore resides in the use of the GAX protein or a variant thereof for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of cancers.
  • variant designates any mutant, fragment or peptide having at least one biological property of GAX, as well as any GAX homolog obtained from other species.
  • fragments and variants can be obtained by any technique known to those skilled in the art, and in particular by genetic and / or chemical and / or enzymatic modifications, or even by hybridization or by cloning by expression, allowing the selection of variants according to their biological activity. Genetic modifications include deletions, deletions, mutations, etc.
  • the nucleic acid sequence used can code all or part of the rat GAX protein or one of its variants.
  • the gene used within the meaning of the invention is preferably the gene coding for the GAX protein of rats or of its human counterpart. It is more preferably a cDNA or a gDNA.
  • the claimed nucleic acid sequence can be injected as it is at the site to be treated, or incubated directly with the cells to be destroyed or treated. It has in fact been described that naked nucleic acids can penetrate cells without particular vector. Nevertheless, it is preferred in the context of the present invention to use an administration vector, making it possible to improve (i) the efficiency of cell penetration, (ii) targeting (iii) extra- and intracellular stability.
  • D can be viral or non-viral vectors.
  • the vector according to the invention can thus be a non-viral agent capable of promoting the transfer and expression of the nucleic sequence in prokaryotic or eukaryotic cells.
  • Chemical or biochemical vectors represent an interesting alternative to natural viruses, in particular for reasons of convenience, safety and also by the absence of theoretical limit as regards the size of the DNA to be transfected.
  • These synthetic vectors have two main functions, to compact the nucleic acid to be transfected and to promote its cellular fixation as well as its passage through the plasma membrane and, where appropriate, the two nuclear membranes. To compensate for the polyanionic nature of nucleic acids, the non-viral vectors all have polycationic charges.
  • cationic polymers of polylysine type, (LKLK) n, (LKKL) n, polyethylene i ⁇ unine and DEAE dextran or else cationic lipids or lipofectants are the most advantageous. They have the property of condensing DNA and promoting its association with the cell membrane.
  • the nucleic sequence used in the present invention can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
  • it is used in an injectable form.
  • It can therefore be mixed with any pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for a direct injection at the site to be treated.
  • They may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • a direct injection of the nucleic sequence into the patient's tumor is advantageous because it allows the therapeutic effect to be concentrated in the affected tissues.
  • the doses in nucleic sequence used can be adapted as a function of various parameters, and in particular as a function of the vector, the mode of administration used, the pathology concerned or even the duration of the treatment sought.
  • adenoviruses it is thus possible to use adenoviruses, herpes viruses, retroviruses and more recently associated adeno viruses. These vectors are particularly effective in terms of transfection.
  • a second object of the present invention therefore therefore is the use of a defective recombinant virus containing at least one inserted gene coding for all or part of the GAX protein or a variant thereof.
  • the invention also resides in the use of such a virus for the treatment of cancers.
  • the inserted and / or present gene may be a fragment of complementary DNA (AD Ne), of genomic DNA (gDNA), or a hybrid construct consisting for example of a cDNA into which would be inserted one or more introns. They can also be synthetic or semi-synthetic sequences.
  • the inserted gene also includes sequences allowing its expression in the infected cell. These may be sequences which are naturally responsible for the expression of said gene when these sequences are capable of functioning in the infected cell. It can also be sequences of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic). In particular, they may be sequences of eukaryotic or viral genes or derived sequences, stimulating or repressing the transcription of a gene in a specific way or not and in an inducible way or not.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect, or from the genome of a virus, and in particular the promoters of the ElA genes, adenovirus MLP, the CMV promoter, LTR-RSV, etc.
  • eukaryotic promoters include ubiquitous promoters (HPRT, vimentin, -actin, tubulin, etc.), promoters of intermediate filaments (desmin, neurofilaments, keratin, GFAP, etc.) promoters of therapeutic genes (MDR type, CFTR, factor VIII, etc.) tissue-specific promoters (smooth muscle cell actin promoter), promoters preferentially activated in dividing cells, or promoters responding to a stimulus (steroid hormone receptor, receptor retinoic acid, etc.).
  • these expression sequences can be modified by adding activation, regulation sequences, etc.
  • the inserted gene does not contain expression sequences, it can be inserted into the genome of the defective virus downstream of such a sequence.
  • the inserted gene generally comprises, upstream of the coding sequence, a signal sequence directing the polypeptide synthesized in the secretory pathways of the target cell.
  • This signal sequence may be the natural signal sequence of GAX, but it may also be any other functional signal sequence (that of the thymidine kinase gene for example), or an artificial signal sequence.
  • the viruses according to the present invention are defective, that is to say incapable of replicating autonomously in the target cell.
  • the genome of the defective viruses used in the context of the present invention is therefore devoid of at least the sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell. These regions can be either eliminated (in whole or in part), or made non-functional, or substituted by other sequences and in particular by the inserted gene.
  • the defective virus nevertheless retains the sequences of its genome which are necessary for the packaging of the viral particles.
  • serotypes of adenoviruses there are different serotypes of adenoviruses, the structure and properties of which vary somewhat. Among these serotypes, it is preferred to use, within the framework of the present invention, human adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or adenoviruses of animal origin (see application WO94 / 26914).
  • adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention, mention may be made of adenoviruses of canine, bovine, murine origin (example: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine , avian or even simian (example: after-sales service).
  • the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [manhattan or A26 / 61 strain (ATCC VR- 800) for example].
  • adenoviruses of human or canine or mixed origin are used.
  • the defective adenoviruses of the invention comprise the
  • the El region in the air is nor. foûct-ori-iclic.
  • the viral gene writes can be rendered noncr.ctior.r.e! by any technique known to a person skilled in the art, and in particular by total suppression, substitution, partial deletion, or addition of one or more bases in the gene or genes considered. Such modifications can be obtained in vitro (on isolated DNA) or in situ, for example, by means of genetic engineering techniques, or by treatment with mutagenic agents.
  • the adenovirus according to the invention comprises a deletion in the regions E1 and E4.
  • it comprises a deletion in region E1 at which are inserted the region E4 and the sequence coding for -GAX (Cf FR94 13355).
  • the deletion in the E1 region preferentially extends from nucleotides 455 to 3329 on the sequence of the adenovirus Ad5.
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). In particular, they can be prepared by homologous recombination between an adenovirus and a ponid plasmid, inter alia, the DNA sequence of interest. Homologous recombination occurs after co-transfection of said adenovirus and plasmid in an appropriate cell line.
  • the cell line used must preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain the sequences capable of complementing the part of the genome of the defective adenovirus, preferably in integrated form to avoid the risks of recombination.
  • a line mention may be made of the human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) which contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome an Ad5 adenovirus (12%) or lines capable of complementing the El and E4 as described in particular in applications No. WO 94/26914 and WO95 / 02697.
  • the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional techniques of molecular biology.
  • AAV adeno-associated viruses
  • D comprises approximately 4700 bases, and contains at each end an inverted repeat region (ITR) of approximately 145 bases, serving as the replication origin for the virus.
  • ITR inverted repeat region
  • the rest of the genome is divided into 2 essential regions carrying the packaging functions: the left part of the genome, which contains the rep gene involved in viral replication and the expression of viral genes; the right part of the genome, which contains the cap gene coding for the capsid proteins of the virus.
  • the defective recombinant AAVs according to the invention can be prepared by co-transfection, in a cell line infected with a human helper virus (for example an adenovirus), of a plasmid containing the nucleic sequence of interest bordered by two inverted repeat regions (ITR) from AAV, and a plasmid carrying the packaging genes (rep and cap genes) from AAV.
  • a human helper virus for example an adenovirus
  • ITR inverted repeat regions
  • rep and cap genes packaging genes
  • the invention also relates to a plasmid comprising a sequence coding for GAX bordered by two ITRs of an AAV.
  • a plasmid can be used as it is for transferring the GAX sequence, optionally incorporated into a liposomal vector (pseudovirus).
  • pseudovirus a liposomal vector
  • retroviruses the construction of recombinant vectors has been widely described in the literature: see in particular EP 453242, EPI 78220, Bemstein et al. Broom. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc.
  • retroviruses are integrative viruses, infecting dividing cells.
  • the genome of retroviruses essentially comprises two LTRs, an encapsidation sequence and three coding regions (gag, pol and env).
  • the gag, pol and env genes are generally deleted, in whole or in part, and replaced by a heterologous nucleic acid sequence of interest.
  • These vectors can be produced from different types of retroviruses such as in particular MoMuLV ("murine moloney leukemia virus”; also designated MoMLV), MSV ("murine moloney sarcoma virus”), HaSV ("harvey sarcoma virus”) ; SNV ("spleen necrosis virus”); RSV ("rous sarcoma virus”) or the Friend virus.
  • MoMuLV murine moloney leukemia virus
  • MSV murine moloney sarcoma virus
  • HaSV human moloney sarcoma virus
  • SNV spleen necrosis virus
  • RSV rous sarcoma virus
  • Friend virus Friend virus
  • a plasmid comprising in particular the LTRs, the encapsidation sequence and said coding sequence is generally constructed, then used to transfect a cell line called encapsidation, capable of '' bring in trans retroviral functions deficient in the plasmid.
  • the packaging lines are therefore capable of expressing the gag, pol and env genes.
  • Such packaging lines have been described in the prior art, and in particular the line PA317 (US4,861,719); the PsiCRTP line (WO90 / 02806) and the GP + envAm-12 line (WO89 / 07150).
  • the recombinant retroviruses may include modifications at the level of the LTRs to suppress transcriptional activity, as well as extended packaging sequences, comprising a part of the gag gene (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639).
  • the recombinant retroviruses produced are then purified by conventional techniques.
  • a defective recombinant adenovirus For the treatment of cancers, it is particularly advantageous to use a defective recombinant adenovirus. It is possible to use relatively small amounts of active principle (recombinant adenovirus), and also allows an effective and very rapid action on the sites to be treated.
  • the adenoviruses of the invention are also capable of expressing the introduced gax gene at high levels, which gives them a very effective therapeutic action.
  • the adenoviruses of the invention have a limited persistence in proliferative cells and therefore a transient effect perfectly suited to the desired therapeutic effect.
  • the doses of virus used for the injection can be adapted according to various parameters, and in particular according to the mode of administration used and the duration of the treatment sought.
  • the recombinant viruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 ⁇ and 10 14 pfu / ml.
  • doses of 10 6 to 10 * 0 pfu / ml can also be used.
  • pfu plaque forming unit
  • the term pfu corresponds to the infectious power of a suspension of virions, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 48 hours, the number of plaques of infected cells. The techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.
  • the present invention is advantageously used in vivo for the destruction of cells in hyperproliferation (i.e. in abnormal proliferation).
  • cancers in which an activated oncogen is involved.
  • colon adenocarcinomas thyroid cancer
  • lung carcinoma myeloid leukemia
  • colorectal cancer breast cancer
  • lung cancer gastric cancer
  • cancer esophagus B lymphomas
  • ovarian cancers bladder cancers
  • glioblastomas etc.
  • this treatment can concern both humans and any animal such as sheep, cattle, domestic animals (dogs, cats, etc.), chevaax, fish, etc.
  • Figure 1 Representation of the plasmid pCOl.
  • Figure 2 Representation of the plasmid pXL-CMV-Gax HA
  • Figure 3 Representation of the effect of the expression of AdCMV gax on cell proliferation in human tumor cells H460.
  • Figure 4 H460 tumor cells treated with 1 "AdCMV gax adenovirus at MOI 1000 ( Figure 4A), MOI 100 ( Figure 4B) and MOI 1000 ( Figure 4C).
  • Figure 5 Representation of the effect of AdCMV gax on cell proliferation in human Saos tumor cells.
  • Figure 6 Representation of the effect of the expression of AdCMV gax on cell proliferation in human tumor cells H358.
  • the plasmids of the pBR322, pUC type and the phages of the Ml 3 series are of commercial origin (Bethesda Research Laboratories).
  • the DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in agarose or acrylamide gels, extracted with phenol or with a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol and then incubated in the presence of the DNA ligase from phage T4 (Biolabs) according to the supplier's recommendations.
  • the filling of the protruding 5 ′ ends can be carried out by the Klenow fragment of DNA Polymerase I of E. coli ( Biolabs) according to the supplier's specifications.
  • the destruction of the protruding 3 ′ ends is carried out in the presence of the DNA polymerase of phage T4 (Biolabs) used according to the manufacturer's recommendations.
  • the destruction of the protruding 5 ′ ends is carried out by gentle treatment with nuclease SI.
  • Mutagenesis directed in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides can be carried out according to the method developed by Taylor et al. [Nucleic Acids Res. Jj (1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham.
  • Enzymatic amplification of DNA fragments by the so-called PCR technique can be performed using a "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) according to the specifications of the manufacturer- Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5477] using the kit distributed by Amersham.
  • EXAMPLE 1 Constellation of the vector pXL-CMV-Gax iiA carrying the gene coding for the rat gax protein under the control of the CMY promoter.
  • This example describes the construction of a vector containing the cDNA coding for the protein gax (species: rat) and adenoviral sequences allowing a recombination.
  • the influenza virus hemagglutinin epitope (HAI epitope), comprising 18 amino acids, is added to the N-terminus of the gax protein (Field et al., Mol.CelLBiol. 8: 2159-2165, 1988 ).
  • This epitope addition process makes it possible to follow, in particular by immunofluorescence techniques, the expression of gax using antibodies directed against the HAI epitope. In addition to its sensitivity, this method eliminates the background noise corresponding to the expression of endogenous gax proteins both in vitro and in vivo.
  • the EcoRI-Xbal fragment corresponding to the left end of the genome of the Ad5 adenovirus was first cloned between the EcoRI and Xbal sites of the vector pIC19H. This generates the plasmid pCA.
  • the plasmid pCA was then cut by Hinfl, its prominent 5 'ends were filled with the klenow fragment of DNA polymerase I from E. coli, then it was cut by EcoRI.
  • the fragment thus generated of the plasmid pCA which contains the left end of the genome of the adenovirus Ad5 was then cloned between the EcoRI and Smal sites of the vector pIC20H (Marsh et al., Gene 22 (1984) 481).
  • the plasmid pCB was then cut with EcoRI, its prominent 5 'ends were filled in with the klenow fragment of DNA polymerase I from E. coli, then it was cut with BamHI.
  • the fragment thus generated of the plasmid pCB which contains the left end of the genome of the adenovirus Ad5 was then cloned between the NruI and Bgi ⁇ sites of the vector pIC20H. This generates the plasmid pCE, an interesting characteristic of which is that it has the first 382 base pairs of the adenovirus Ad5 followed by a cloning multisite.
  • the Sall-Taql fragment of the plasmid pPY53 prepared from a dam- context, containing the part of the Ad5 radenovirus genome between the Sau3A (3346) and Taql (5207) sites was then cloned between the SalI and Clal sites of the vector pIC20H, which generates the plasmid pCA '.
  • the Taql (5207) - Narl (5519) fragment of the Ad5 adenovirus genome prepared from a dam context and the Sall-Taql fragment of the plasmid pCA ' were then ligated and cloned between the SalI and Narl sites of the vector pIC20H.
  • the Gax cDNA was cloned between the Xbal-BamHI sites of the pCGN vector (Tanaka and Herr, Cell 60: 375-386, 1990).
  • the resulting pGCN-Gax vector contains the early promoter and enhancer sequence of cytomegalovirus (CMV) (-522, +72; Boshart et al, Cell, 41: 521-530, 1985), the thymidine kinase leader sequence of Herpes simplex virus including the initiation codon AUG as well as the first three amino acids (+55, +104; Rusconi and Yamamoto, EMBO J., 6: 1309-1315, 1987), the sequence coding for the HAI epitope, the rat gax cDNA and finally the poly adenylation sequence of the rabbit ⁇ -globin gene (Pabo et al, cell. 35: 445-453, 1983).
  • CMV cytomegalovirus
  • the vector pCGN-Gax was then cut with Xmnl and Sfil and the fragment obtained, containing promoter, cDNA and polyadenylation sequence, previously treated with Klenow, was introduced into the EcoRV site of the shuttle vector pCOl containing the adenoviral sequences necessary for recombination.
  • the plasmid obtained was designated pXL-CMV-Gax HA ( ⁇ * Figure 2).
  • the vector pXL-CMV-Gax HA prepared in Example 1 is then linearized and cotransfected for recombination with a deficient adenoviral vector, in helper cells (line 293) providing in trans the functions coded by the El regions (ElA and EIB ) of adenovirus.
  • the Ad-CMVgax adenovirus was obtained by homologous recombination in vivo between the Ad.RSVJ3gal adenovirus (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626) and the vector pXL-CMV-Gax HA sei ⁇ e is following protocol: vector pXL- CMV-Gax HA linearized with the enzyme XmnI, and the adenovirus Ad.RSVBgal linearized with ClaI are cotransfected into line 293 in the presence of calcium phosphate to permit homologous recombination . The recombinant adenoviruses thus generated were selected by plaque purification.
  • the recombinant adenovirus is amplified in the cell line 293, which leads to a culture supernatant containing the unpurified recombinant defective adenovirus having a titer of approximately l ⁇ ! 0 pfu / ml.
  • the viral particles are purified by centrifugation on a cesium chloride gradient according to known techniques (see in particular Graham et al., Virology 52 (1973) 456).
  • the Ad-CMVgax adenovirus is stored at -80 ° C in 10% glycerol.
  • Example 3 Control of the expression of Ad-CMVgax in human tumor cells H460.
  • Human H460 tumor cells derived from non-small cell lung cancer were transduced by the recombinant adenovirus Ad-CMV gax and by a control virus expressing ⁇ -galactosidase (Ad-RSV- ⁇ gal) with multiplicities of infection (ME) increasing (Figure 3). After 1 hour 30 minutes incubation in the presence of the adenoviral solution, the culture medium comprising 10% fetal serum was renewed and the cells incubated for a period of 48 hours. The cell viability being checked by trypan blue exclusion test, the number of viable cells per culture well is then determined. Two batches of AdCMV gax adenovirus, Ad-gax and Ad-gax (2), were used and correspond to two productions independent in 293 cells. The activities of the two batches appear to be comparable and very distinct from the AdRSV ⁇ gal control adenovirus.
  • Ad-RSV - ⁇ gal has previously made it possible to demonstrate the capacity of a recombinant adenovirus to efficiently transduce H460 cells.
  • nuclear ⁇ gal activity has been detected in more than 75% of cells treated with Ad-RSV- ⁇ gal (M.O.I. 1000).
  • Ad-RSV- ⁇ gal M.O.I. 1000
  • the expression of the gax protein was demonstrated in the cells transduced by Ad-CMV gax by immunofluorescerce.
  • the transduction efficiencies of the Ad-CMV gax and Ad-RSV- ⁇ gal viruses were found to be comparable.
  • the treatment of H460 cells with Ad-CMV gax is associated with a reduction in cell proliferation but also with massive cytotoxicity detected 48 hours after transduction by the adenovirus (cf. FIGS.
  • H358 cells also derived from lung carcinoma non-small cell, is a deficiency model for the p53 protein.
  • This cell line indeed has a homozygous deletion for the p53 gene (Maxwell and Roth. Oncogen 8: 3421. 1993).
  • the Ad-gax adenovirus effectively blocks the growth of H358 cells and causes massive cytotoxicity 48 hours after adenoviral transduction (FIG. 5). This my cell is not detected in the presence of an adenovirus controlling Ad-RSV- ⁇ gal.
  • Gax can advantageously be associated with a therapeutic benefit in the cancer patient.

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Abstract

La présente invention se rapporte à l'utilisation thérapeutique, notamment pour le traitement du cancer, d'acide nucléique codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci.

Description

APPLICATION DE LA PROTEINE GAX AU TRAITEMENT DE CANCERS
La présente invention concerne une nouvelle méthode pour le traitement des cancers. Plus particulièrement, elle concerne une méthode de traitement des cancers par blocage de la prolifération cellulaire laquelle peut être dérégulée dans les cellules tumorales exprimant un oncogéne tel que ras muté ou déficientes pour un gène suppresseur de tumeur tel que p53. Elle concerne également l'utilisation des vecteurs de thérapie génique permettant de réguler celle-ci, ainsi que les compositions pnaπnaceutiques les contenant
Les produits des gènes ras, généralement désignés protéines p21, jouent un rôle clé dans le contrôle de la division cellulaire chez tous les organismes eucaryotes où ils ont été recherchés. Certaines modifications spécifiques de ces protéines leur font perdre leur contrôle normal et les conduisent à devenir oncogéniques. Ainsi, un grand nombre de tumeurs humaines a été associé à la présence de gènes ras modifiés. De même, une surexpression de ces protéines p21 peut conduire à un dérèglement de la prolifération cellulaire.
Dans un contexte cellulaire normal, cette prolifération des oncogènes est vraisemblablement contrée, au moins en partie, par la génération de gènes dits suppresseurs de tumeurs comme p53 et Rb. On sait ainsi que la protéine p53, au moins sous sa forme sauvage, est un facteur de transcription qui régule négativement la croissance et la division cellulaire et qui, dans certaines situations, est capable d'induire Tapoptose (Yonish-Rouach et al., Nature, 352, 345-347, 1991 ). Ces propriétés se manifestant en situation de stress où l'intégrité de l'ADN cellulaire est menacée, p53 a été suggérée être un « gardien du génome ». Toutefois, certains phénomènes peuvent venir perturber ce mécanisme d' autorégulation cellulaire et favoriser alors le développement d'un état néoplasique. Un de ces événements consiste en des mutations au niveau des gènes suppresseurs de tumeurs. C'est ainsi que des formes inactivées du gène Rb ont été mises en cause dans différentes tumeurs, et notamment dans les rétinoblastomes ou dans les cancers mésenchymateux comme les ostéosarcomes et qu'il a été noté la présence de p53 mutées dans environ 40 % des tumeurs humaines, tous types confondus (pour revues, voir Montenarh, Oncogéne, 7, 1673-1680, 1992 ; Oren, FASEB J., 6, 3169-3176, 1992 ; Zamberti and Levme, FASEB J.. 7, 855-865, 1993). En conséquence, la mise en évidence de composés biologiques susceptibles d'interférer à rencontre de ce type de dérèglement de la prolifération cellulaire et/ou de suppléer à ce type de déficience en gènes suppresseurs de tumeurs est par conséquent d'un intérêt majeur dans l'approche thérapeutique de la cancérogenèse.
La présente invention résulte précisément en partie de la mise en évidence que la protéine GAX constitue un inhibiteur potentiel de la prolifération cellulaire induite par les protéines ras. Elle résulte en particulier de la mise en évidence qu'une prolifération cellulaire, deregulee dans des cellules tumorales, peut être retaoϋe en y exprimant la protéine GAX.
La protéine GAX est une protéine de 303 acides aminés. Sa séquence a été caractérisée et son cDNA clone (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733). Le gène gax(growth arrest spécifie homeobox) appartient à la famille des gènes homéotiques. Ces gènes codent pour des facteurs transcriptionnels qui contiennent des séquences consensus (ou homéodomaines) reconnaissant des régions spécifiques de l'ADN (ou homéoboîtes) (revue : Gehring et al. Cell, 78 : 211-223, 1994). LTioméodomaine de la protéine gax de rat est compris entre les acides aminés 185 et 245. Ce gène possède certaines propriétés similaires aux gènes gas et Gadd puisqu'il semble également contrôler la transition G0/G1 du cycle cellulaire. Ainsi les niveaux d'ARNm de gax sont réduits dans les CMLV de rat d'un faαeur 10 après deux heures d'exposition au PDGF (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733). L'expression du gène gax est donc réprimée au cours de la réponse mitogénique des CMLV. Ces observations ont leur contrepartie in vivo puisque chez le rat, l'hyperplasie intimale provoquée par l'abrasion de la carotide est associée à une forte baisse de l'expression de gax (Weir et al. J. Biol. Chem. 1995, 270, 5457-5461 ).
L'expression du gène gax a été mise en évidence dans le système cardio- vasculaire, notamment le coeur et l'aorte et jusqu'ici l'utilisation en thérapie génique de ce gène était donc limitée au niveau de ces cellules, l'exprimant naturellement.
De manière inattendue, la demanderesse a découvert qu'il était possible de valoriser avantageusement une activité inhibitrice de la protéine GAX à l'égard de la prolifération cellulaire dans des cellules tumorales c'est à dire des cellules qui n'expriment pas le gène gax de manière endogène. La présente invention offre ainsi une nouvelle approche particulièrement efficace pour le traitement des tumeurs associées à un dérèglement de la prolifération cellulaire telles que les tumeurs du poumon non à petites cellules, les carcinomes pancréatiques et coliques, les ostéosarcomes etc.
La présente invention décrit également des systèmes particulièrement efficaces permettant la délivrance in vivo, directement dans les tumeurs, de tels composés et ainsi de lutter contre le développement des cancers.
Un premier objet de l'invention réside donc dans l'utilisation de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers.
Plus précisément, elle se rapporte à l'utilisation d'au moins une séquence nucléique codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers.
Comme indiqué ci-avant, il peut s'agir d'un gène codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci. Au sens de la présente invention, le terme variant désigne tout mutant, fragment ou peptide possédant au moins une propriété biologique de GAX, ainsi que tout homologue de GAX obtenu à partir d'autres espèces. Ces fragments et variants peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par modifications génétique et/ou chimique et/ou enzymatique, ou encore par hybridation ou par clonage par expression, permettant la sélection de variants en fonction de leur activité biologique. Les modifications génétiques incluent les suppressions, délétions, mutations, etc.
La séquence nucléique mise en oeuvre peut coder pour tout ou partie la protéine GAX de rat ou un de ses variants.
Le gène utilisé au sens de l'invention est préférentiellement le gène codant pour la protéine GAX de rat ou de son homologue humain. Il s'agit plus préféremiellement d'un ADNc ou d'un ADNg.
La séquence nucléique revendiquée peut être injectée telle quelle au niveau du site à traiter, ou incbée directement avec les cellules à détruire ou traiter. Il a en effet été décrit que les acides nucléiques nus pouvaient pénétrer dans les cellules sans vecteur particulier. Néanmoins, on préfère dans le cadre de la présente invention utiliser un vecteur d'administration, permettant d'améliorer (i) l'efficacité de la pénétration cellulaire, (ii) le ciblage (iii) la stabilité extra- et intracellulaires.
Différents types de vecteurs peuvent être utilisés. D peut s'agir de vecteurs viraux ou non viraux.
Le vecteur selon l'invention peut ainsi être un agent non viral capable de promouvoir le transfert et l'expression de la séquence nucléique dans des cellules procaryotes ou eucaryotes. Les vecteurs chimiques ou biochimiques représentent une alternative intéressante aux virus naturels en particulier pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN à transfecter.
Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux membranes nucléaires. Pour pallier à la nature polyanionique des acides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges polycationiques.
Parmi les vecteurs synthétiques développés, les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n, polyéthylène iπunine et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants sont les plus avantageux. Us possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, on peut citer les hpcipolyamines (Upofectarnine, transfectam, etc) et différents lipides cationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc) ou liposomes. Plus récemment, il a été développé le concept de la transfection ciblée, médiée par un récepteur, qui met à profit le principe de condenser l'ADN grâce au polymère cationique tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit.
La séquence nucléique utilisée dans la présente invention peut être formulée en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, elle est utilisée sous une forme injectable. Elle peut donc être mélangée à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du site à traiter. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Une injection directe de la séquence nucléique dans la tumeur du patient est intéressante car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Les doses en séquence nucléique utilisées peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un virus recombinant defectif.
Il est ainsi possible d'utiliser les adénovirus, les herpès virus, les rétrovirus et plus récemment les virus adéno associés. Ces vecteurs s'avèrent particulièrement performants sur le plan de la transfection.
La présente invention a donc pour second objet l'utilisation d'un virus recombinant defectif contenant au moins-un gène inséré codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci. L'invention réside également dans l'utilisation d'un tel virus pour le traitement des cancers. Dans les vecteurs de l'invention, le gène inséré et/ou présent peut être un fragment d'ADN complémentaire (AD Ne), d'ADN genomique (ADNg), ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semisynthétiques.
Généralement, le gène inséré comprend également des séquences permettant son expression dans la cellule infectée. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression dudit gène lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences de gènes eucaryotes ou viraux ou de séquences dérivées, stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non et de façon inductible ou non. A titre d'exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter, ou du génome d'un virus, et notamment, les promoteurs des gènes ElA, MLP d'adénovirus, le promoteur CMV, LTR-RSV, etc. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut citer également les promoteurs ubiquitaires (HPRT, vimentine, -actine, tubuline, etc), les promoteurs des filaments intermédiaires (desmine, neurofilaments, kératine, GFAP, etc) les promoteurs de gènes thérapeutiques (type MDR, CFTR, facteur VIII, etc) les promoteurs spécifiques de tissus (promoteur de .'actine des cellules du muscle lisse), les promoteurs préférentiellement activés dans les cellules en division, ou encore les promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, etc.). En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. Par ailleurs, lorsque le gène inséré ne comporte pas de séquences d'expression, il peut être inséré dans le génome du virus defectif en aval d'une telle séquence.
Par ailleurs, le gène inséré comprend généralement, en amont de la séquence codante, une séquence signal dirigeant le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle de GAX, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle (celle du gène de la thymidine kinase par exemple), ou d'une séquence signal artificielle.
Les virus selon la présente invention sont défectifs, c'est-à-dire incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non- fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène inséré. Préférentiellement, le virus defectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
D existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR- 800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les
ITR, une séquence permettant l'encapsidation et l'acide nucléique d'intérêt. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région El au aairà est nor. foûct-ori-iclic. Le gène viral ecr^idére pert être rendu non fcr.ctior.r.e! par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) et L5 (WO95/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions El et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans région El au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence codant pour -GAX (Cf FR94 13355). Dans les virus de l'invention, la délétion dans la région El s'étend préférentiellement des nucleotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus Ad5.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide ponant entre autre la séquence d'ADN d'intérêt. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complementer la partie du génome de l'adénovirus defectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complementer les fonctions El et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n° WO 94/26914 et WO95/02697.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été clone, séquence et caractérisé. D comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence nucléique d'intérêt bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. L'invention concerne donc également un virus recombinant dérivé des .AAV dont le génome comprend une séquence codant pour GAX bordée des ITR de l'AAV. L'invention concerne également un plasmide comprenant une séquence codant pour GAX bordée de deux ITR d'un AAV. Un tel plasmide peut être utilisé tel quel pour transférer la séquence de GAX, éventuellement incorporé dans un vecteur liposomal (pseudo- virus). Concernant les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment EP 453242, EPI 78220, Bemstein et al. Genêt. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant les cellules en division. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence codant pour GAX selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence codante est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4.861.719); la lignée PsiCRTP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Pour le traitement des cancers, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus recombinant defectif. Il est possible d'utiliser des quantités relativement faibles de principe actif (adénovirus recombinant), et permet également une action efficace et très rapide sur les sites à traiter. Les adénovirus de l'invention sont également capables d'exprimer à hauts niveaux le gène gax introduit, ce qui leur confère une action thérapeutique très efficace. De plus, en raison de leur caractère épisomal, les adénovirus de l'invention ont une persistance limitée dans les cellules prolifératives et donc un effet transitoire parfaitement adapté à l'effet thérapeutique recherché. Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé et de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 10^ et 1014 pfu/ml. Pour les AAV et les adénovirus, des doses de 106 à 10*0 pfu/ml peuvent également être utilisées. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une suspension de virions, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
La présente invention est avantageusement utilisée in vivo pour la destruction de cellules en hyperprolifération (i.e. en prolifération anormale).
Elle est ainsi applicable à la destruction des cellules tumorales. Elle est tout particulièrement appropriée au traitement des cancers dans lesquels un oncogéne activé est impliqué. A titre d'exemple, on peut citer les adénocarcinomes du colon, les cancers de la thyroïde, les carcinomes du poumon, les leucémies myéloïdes, les cancers colorectaux, les cancers du sein, les cancers du poumon, les cancers gastriques, les cancers de l'oesophage, les lymphômes B, les cancers ovariens, les cancers de la vessie, les glioblastomes, etc.
En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaax, les poissons, etc.
La présente invention est plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Représentation du plasmide pCOl . Figure 2 : Représentation du plasmide pXL-CMV-Gax HA
Figure 3 : Représentation de l'effet de l'expression de l'AdCMV gax sur la prolifération cellulaire chez des cellules humaines tumorales H460. Figure 4 : Cellules tumorales H460 traitées par 1" adénovirus AdCMV gax à M.O.I.. 1000 (Figure 4A), M.O.I. 100 (Figure 4B) et M.O.I. 1000 (Figure 4C). Figure 5 : Représentation de l'effet de l'AdCMV gax sur la prolifération cellulaire chez des cellules humaines tumorales Saos. Figure 6 : Représentation de l'effet de l'expression de l'AdCMV gax sur la prolifération cellulaire chez des cellules humaines tumorales H358.
TECHNIQUES GÉNÉRALES DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, .'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroéHition les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'ethanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondamment décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série Ml 3 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'ethanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase SI.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. Jj (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350- 1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 15_5_ (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fdtricant- La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463- 5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
EXEMPLE 1 : constπiction du vecteur pXL-CMV-Gax iiA portant le gène codant peur la protéine gax de rat sous le contrôle thi promoteur CMY.
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur contenant l'ADNc codant pour la protéine gax (espèce : rat) et des séquences adénovirales permettant un*» recombinaison. L'épitope de l'hémagglutinine du virus influenza (épitope HAÏ), comprenant 18 acides aminés, est ajouté à l'extrémité N- terminale de la protéine gax (Field et al., Mol.CelLBiol. 8 : 2159-2165, 1988). Ce procédé d'addition d'épitope permet de suivre, notamment par des techniques d'immunofluorescence, l'expression de gax à l'aide d'anticorps dirigés contre l'épitope HAÏ. Outre sa sensibilité, cette méthode permet de s'affranchir du bruit de fond corespondant à l'expression de protéines gax endogènes à la fois in vitro et in vivo.
1.1. Construction du plasmide pCOl (Figure 1)
A - Construction du plasmide pCE
Le fragment EcoRI-Xbal correspondant à l'extrémité gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a d'abord été clone entre les sites EcoRI et Xbal du vecteur pIC19H. Ceci génère le plasmide pCA. Le plasmide pCA a ensuite été coupé par Hinfl, ses extrémintés 5' proéminentes ont été remplies par le fragment de klenow de l'ADN polymérase I de E.coli, puis il a été coupé par EcoRI. Le fragment ainsi généré du plasmide pCA qui contient l'extrémité gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a ensuite été clone entre les sites EcoRI et Smal du vecteur pIC20H (Marsh et al., Gène 22 (1984) 481). Ceci génère le plasmide pCB. Le plasmide pCB a ensuite été coupé par EcoRI, ses extrémintés 5' proéminentes ont été remplies par le fragment de klenow de l'ADN polymérase I de E.coli, puis il a été coupé par BamHI. Le fragment ainsi généré du plasmide pCB qui contient l'extrémité gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a ensuite été clone entre les sites NruI et Bgiπ du vecteur pIC20H. Ceci génère le plasmide pCE dont une caractéristique intéressante est qu'il possède les 382 premières paires de bases de l'adénovirus Ad5 suivies d'un multisite de clonage.
B - Construction du plasmide pCD' Le fragment Sau3A (3346) - SstI (3645) et le fragment SstI (3645) - Narl (5519) du génome de l'adénovirus Ad5 ont tout d'abord été ligaturés et clones entre les sites Clal et BamHI du vecteur pIC20H, ce qui génère le plasmide pPY53. Le fragment Sall-Taql du plasmide pPY53 préparé à partir d'un contexte dam-, contenant la partie du génome de radénovirus Ad5 comprise entre les sites Sau3A (3346) et Taql (5207) a ensuite été clone entre les sites Sali et Clal du vecteur pIC20H, ce qui génère le plasmide pCA'. Le fragment Taql (5207) - Narl (5519) du génome de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un contexte dam- et le fragment Sall-Taql du plasmide pCA' ont ensuite été ligaturés et clones entre les sites Sali et Narl du vecteur pIC20H. Ceci génère le plasmide pCC Le fragment Narl (5519) - NruI (6316) du génome de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un contexte dam- et le fragment Sall-Narl du plasmide pCC ont ensuite été ligaturés et clones entre les sites Sali et NruI du vecteur pIC20R. Ceci génère le plasmide pCD'.
C - Construction ûu plasmide pCQl Une digestion partielle par Xhol puis une digestion complète par Sali du plasmide pCD' génère un fragment de restriction qui contient la séquence de l'adénovirus Ad5, du site Sau3A (3446) au site NruI (6316). Ce fragment a été clone dans le site Sali du plasmide pCE. Ceci génère le plasmide pCOl (figure 1), qui contient la partie gauche de l' adénovirus "Ad5 jusqu'au site Hinfl (382), un multisite de clonage et le fragment Sau3A (3446) - NruI (6316) de l'adénovirus Ad5.
1.2. Construction du vecteur pXL-CMV-Gax HA (cf figure 2)
L'ADNc de Gax a été clone entre les sites Xbal-BamHI du vecteur pCGN (Tanaka et Herr, Cell 60 : 375-386, 1990). Le vecteur pGCN-Gax résultant contient les promoteur précoce et séquence enhancer du cytomégalovirus (CMV) (-522, +72; Boshart et al, Cell, 41 : 521-530, 1985), la séquence leader de la thymidine kinase de l'Herpès simplex virus incluant le codon d'initiation AUG ainsi que les trois premiers acides aminés (+55, +104; Rusconi et Yamamoto, EMBO J., 6 : 1309-1315, 1987), la séquence codant pour l'épitope HAÏ, l'ADNc de gax de rat et enfin la séquence de poly adénylation du gène de β-globine de Lapin (Pàbo et al, cell. 35 : 445-453, 1983).
Le vecteur pCGN-Gax a ensuite été coupé par Xmnl et Sfil et le fragment obtenu, contenant promoteur, ADNc et séquence de polyadenylation, préalablement traité à la Klenow, a été introduit au site EcoRV du vecteur navette pCOl contenant les séquences adénovirales nécessaires à la recombinaison. Le plasmide obtenu a été désigné pXL-CMV-Gax HA (<* figure 2).
EXEMPLE 2 : Construction de l'adénovirus recombinant Ad-CMVgax
Le vecteur pXL-CMV-Gax HA préparé dans l'exemple 1 est ensuite linéarisé et cotransfecté pour la recombinaison avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (ElA et EIB) d adénovirus.
L'adénovirus Ad-CMVgax a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus Ad.RSVJ3gal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626) et le vecteur pXL-CMV-Gax HA seion ι e protocole suivant : le vecteur pXL- CMV-Gax HA linéarisé par l'enzyme Xmnl et l'adénovirus Ad.RSVBgal linéarisé par Clal ont été co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés ont été sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus defectif recombinant non purifié ayant un titre α environ lθ!0 pfu/ml.
Les particules virales sont purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-CMVgax est conservé à -80°C dans 10 % de glycérol.
EXEMPLE 3 : Contrôle de l'expression de l'Ad-CMVgax dans des cellules tumorales humaines H460.
Les cellules tumorales humaines H460 dérivées d'un cancer du poumon non à petites cellules ont été transduites par l'adénovirus recombinant Ad-CMV gax et par un virus contrôle exprimant la β-galactosidase (Ad-RSV- βgal) à multiplicités d'infection (M.O.I.) croissantes (figure 3). Après 1 heure 30 d'incubation en présence de la solution adénovirale, le milieu de culture comprenant 10 % de sérum foetal est renouvelé et les cellules incubées pendant une période de 48 heures. La viabilité cellulaire étant contrôlée par test d'exclusion de bleu trypan, le nombre de cellules viables par puits de culture est alors déterminé. Deux lots d'adénovirus AdCMV gax, Ad-gax et Ad-gax(2), ont été utilisés et correspondent à deux productions indépendantes dans les cellules 293. Les activités des deux lots s'avèrent comparables et bien distinctes de l'adénovirus contrôle AdRSV βgal.
L'utilisation de Ad-RSV - βgal a préalablement permis de démontrer la capacité d'un adénovirus recombinant à transduire de manière efficace les cellules H460. Ainsi l'activité βgal nucléaire a été détectée dans plus de 75 % des cellules traitées par Ad-RSV- βgal (M.O.I. 1000). En parallèle, l'expression de la protéine gax a été mise en évidence dans les cellules transduites par Ad-CMV gax par immunofluorescerce. Les efficacités de transduction des virus Ad-CMV gax et Ad- RSV- βgal se sont avérés comparables. Le traitement des cellules H460 par Ad-CMV gax est associé à une réduction de la prolifération cellulaire mais également à une cytotoxicité massive détectée 48 heures après la transduction par l'adénovirus (cf. figures 4A, 4B et 4C). Un tel effet n'est pas observé avec l'adénovirus contrôle. Ces données démontrent donc que la surexpression de la protéine gax s'accompagne d'un arrêt de la croissance des cellules H460. De manière intéressante, les cellules H460 expriment une protéine ras mutée
(Ki-ras). Nos données démontrent de manière surprenante que l'expression de la protéine gax permet de rétablir le contrôle de la prolifération cellulaire initialement dérégulée par la protéine ras modifiée. Le caractère dominant du facteur gax vis-à-vis des mutations oncogéniques de ras n'est pas restreint aux carcinomes du poumon. Des résultats similaires, à savoir un arrêt de croissance par AdCMV gax, ont été obtenus sur les cellules HCT116 dérivés d'un carcinome du côlon. Une mutation de l'oncogène ras (G13C) et du gène DCC ont été décrites dans cène lignée cellulaire (Brattain et al.. Cancer Research, 41:1751-1756, 1981).
EXEMPLE 5 : Contrôle de l'expression de l'Ad-CMV-gax dans des cellules tumorales humaines à environnement p53 nul
Les cellules H358, également dérivées d'un carcinome du poumon non à petites cellules, constituent un modèle de déficience pour la protéine p53. Cette lignée cellulaire présente en effet une délétion homozygote pour le gène p53 (Maxwell and Roth. Oncogéne 8 : 3421. 1993). De manière avantageuse, l'adénovirus Ad-gax bloque de manière efficace la croissance des cellules H358 et provoque une cytotoxicité massive 48 heures après la transduction adénovirale (figure 5). Cette mon cellulaire n'est pas détectée en présence d'un adénovirus contrôle Ad-RSV-βgal. Ces données démontrent que la surexpression de gax bloque de manière spécifique et efficace la croissance des cellules tumorales déficientes pour p53. De manière intéressante, ces données ne se limitent pas aux cellules dérivées de carcinomes du poumon. En effet, la croissance des cellules humaines Saos, dérivées d'un ostéosarcome, est également bloquée après traitement par Ad-CMV gax. Les cellules Saos constituent un modèle cellulaire à environnement p53 et pRb nuls. De nouveau, cet arrêt de croissance est dépendant de la concentration de virus utilisée et n'est pas observée après transduction des cellules cancéreuses par le virus contrôle (Figure 6). Ainsi plus de 90 % des cellules Saos-2 sont positives pour l'activité βgal après induction par AdRSV βgal à une multiplicité d'infection de 250. Dans les mêmes conditions expérimentales (multiplicité d'infection 250), AdCMV gax entraîne une baisse de la viabilité cellulaire supérieure à 70%. Gax ayant été initialement décrit comme un gène d'arrêt de croissance, la demanderesse a observé de manière surprenante que l'arrêt de croissance est suivi par une mort cellulaire s apparentant à l'apoptose. La contrepartie in vivo de la mort cellulaire induite par la surexpression de
Gax peut de manière avantageuse être associée à un bénéfice thérapeutique chez le patient cancéreux.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers.
2. Utilisation d'au moins une séquence nucléique codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers.
3. Utilisation selon la revendication 2 caractérisée en ce que la séquence nucléique est utilisé sous forme complexée avec du DEAE-dextran, avec des protéines récepteurs, ou avec des lipides ou polymères cationiques, sous forme de liposomes ou encore tel quel.
4. Utilisation selon la revendication 2 caractérisée en ce que la séquence nucléique fait partie d'un vecteur viral recombinant.
5. Utilisation selon la revendication 4 caractérisée en ce que la séquence nucléique fait partie d'un vecteur viral, choisi parmi les adénovirus, les rétrovirus et les virus adéno-associés.
6. Utilisation selon la revendication 4 ou 5 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un adénovirus, de préférence de type Ad 5 ou Ad 2.
7. Utilisation selon la revendication 4, 5 ou 6 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un adénovirus d'origine animale, de préférence canine.
8. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 7 caractérisée en ce que la séquence nucléique mise en oeuvre code pour tout ou partie de la protéine GAX de rat ou d'un variant de celle-ci.
9. Utilisation selon la revendication 8 caractérisée en ce que la séquence nucléique mise en oeuvre code pour la protéine GAX de rat ou son homologue humain.
10. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 9 caractérisée en ce que la séquence nucléique mise en oeuvre est un ADNc.
11. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 9 caractérisée en ce que la séquence nucléique mise en oeuvre est un ADNg.
12 . Utilisation selon l'une des revendications 4 à 11 caractérisée en ce que la séquence nucléique mise en oeuvre comprend des séquences permettant son expression dans la cellule infectée.
13. Utilisation selon l'une des revendications 4 à 12 caractérisée en ce que la séquence nucléique mise en oeuvre comprend ime séquence sipnal rlmσ^nt i*» polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible.
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