WO1997016205A1

WO1997016205A1 - Agent antitumoral

Info

Publication number: WO1997016205A1
Application number: PCT/JP1996/003105
Authority: WO
Inventors: Toshikazu Nakamura
Original assignee: Toshikazu Nakamura
Priority date: 1995-10-24
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 1997-05-09
Also published as: JPH09110716A; CA2235805C; DE69634138D1; JP3832674B2; EP0890361B1; EP0890361A1; ATE285785T1; CA2235805A1; ES2235200T3; EP0890361A4; DE69634138T2

Description

糸田抗癌剤技術分野

本発明は抗癌剤に関する。より詳細には、 H G F (Hepatocyte Growth Factor)の α鎖を有効成分とし、その c一 M e t ZH G Fレセプターアンタゴニスト活性に基づき、制痉、特に癌浸潤 ·転移抑制を可能とする新しい抗癌剤に関する。背景技術

癌の制圧は、今日の医療における最大の課題であり、また新規癌治療法あるいは新抗癌剤は医療 ·医薬研究者の最大の関心事である。現在、日本における死因の第 1位は癌であり、毎年多くの新しい患者が発生している。

化学療法に用いられる抗癌剤として、従来のアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質のほかに、ピシバニール（商品名、中外製薬社製）やクレスチン（商品名、三共製薬社製）を初めとする微生物由来の生体反応修飾物質が全盛を極めた。従来のァルキル化剤を初めとする化合物は本来、細胞毒性を利用するものであり、少なからぬ副作用のために使用がかなり限定されたのに比べ、その後のピシバニールなどの生体反応修飾物質は生体の免疫機能を高め、癌細胞を駆逐するという作用を有する。しかし、その限界が明らかになると共に、インターフェロンやインターロイキン一

2や T N F (腫瘍壊死因子）など、高等動物由来の生理活性蛋白に重点が置かれるようになった。しかしながら、これらも作用スペクトルが発見当初予想されたものよリはるかに広範囲であったため、副作用を示さないという認識も覆されてしまつた。

このような状況のなかで。癌治療が単なる癌病巣の撃退をもって評価するだけではなく、生体のトータルな機能の改善の中での治療を考える「クオリティ *ォブ- ライフ」に焦点が移りつつあることは間違いなく、本発明者が発見した H G Fが抗癌剤の有効成分であることはすでに報告済みである（日本特開平 6- 25010号公報）。上述のごとく、既成の抗癌剤がその副作用や、あるいは抗癌作用そのものへの疑問から、決定的な治療薬とはいいがたく、さらに次世代を担う生理活性蛋白質もこれまで開発されたものは主に免疫系にかかわる因子であり、必ずしも究極の抗瘙剤として広く利用されることを期待できない状況にある。そこで、同じく生体が本来持っている生理活性蛋白質の中でもその生理作用が明解で、しかも活性のスぺク卜ルがよく研究されているものの中から、真の抗癌剤を見いだすことが重要になってくる。特に、従来開発されてきた生理活性蛋白質、インターフェロンあるいはインターロイキン等はほとんど免疫系にかかわる因子であることから、全く異なる作用を有する生体因子がこれからの抗癌剤として重要であると考えらえれる。

ところで、日本においては癌が死因のトップを占めていることは前述の通りであるが、その危険性は癌細胞の浸潤 ·転移能に依存しているといっても過言ではない。いくつかの増殖因子が癌細胞の浸潤 ·転移能に関与することが報告されているが、最近 HGFが種々の癌細胞に対し、その浸潤、転移能を強力に誘導する因子であることが明らかにされた（H. Shimura et al. J. Jap. Cancer Res. 86, 662-669， 199 5)。実際に極めて悪性度が高いとされてレ、る肺癌や胆嚢癌の浸潤能は H G Fに依存して誘導され、また肺癌原発組織中の HGFレベルは肺癌の悪性度、致死率とよく相関するリスクファクターであることが確認されている。

上記の HGFは肝実質細胞を in vitro で増殖させる因子として見出された蛋白質である（Biochem Biophys Res Co難 un， 12,2, 1450, 1984、 Proc. Natl. Acad. Sc i. USA, 83, 6489, 1986, FEBS Letter, 22. 311， 1987、 Nature, 342, 440, 1989、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3200, 1990) 。肝実質細胞を特異的に増殖させる因子として発見された HGFは、本発明者らをはじめとする多くの研究者による最近の研究成果によって、生体内で組織傷害治癒などの種々の活性を示している事が明らかとなり、研究対象としてのみならずヒ卜や動物の治療薬などへの応用に期待が集まっている。このような HGFの受容体（レセプター）に関して、最近の研究から、 c— Me t原腫瘍遺伝子が HGF受容体をコ一ドしていることが確定的になった（Bouaro et al., Science 251. 802-804, 1991; Naldini et al., Oncogene

6, 501-504， 1991)。

上述のように、 HGFが種々の癌細胞に対し、その浸潤、転移能を強力に誘導する因子であることが明らかになつてきており、 HGFによる癌細胞の浸潤 ·転移能を特異的にブロックするアンタゴニスト（antagonist) ならびにインヒビターの開発は制癌という観点で極めて重要な研究課題であると考えられる。発明の開示

本発明者はかかる観点から鋭意検討を行った結果、 HGFの有する瘙細胞の浸潤転移能を抑制する活性、すなわち、細胞の c一 Me tZHGFリセプタ一に対するアンタゴニス卜活性を有する物質を見出し、当該物質が癌細胞の浸潤、転移能を抑制し、抗瘙剤として極めて有用であるという知見を得て本発明を完成するに至った。従って、本発明の目的は、細胞の c— Me tZHGFリセプターのアンタゴニスト活性に基づく抗癌剤として極めて有用な医薬品を提供することにある。

即ち、本発明は、下記の理化学的性質及び生理活性を有する蛋白質（以下、便宜上、一フラグメントと称する）を有効成分として含有する抗癌剤である。

a) HGFの α鎖からなる；

b)分子量が約 55— 69 kDaである；

c) c一 Me tZHGFレセプターのアンタゴニス卜活性を有する。

また、本発明の他の発明は、有効量の α—フラグメントをヒト又は哺乳動物に投与することからなる癌疾患の治療法であり；また抗癌剤を製造するためのひーフラグメン卜の使用である。図面の簡単な説明

図 1は、 HGF—酵素消化物を逆層 H PLCで精製したときのクロマトグラムである。

図 2は、逆層 HPLCで精製した HGF—酵素消化物を電気泳動（SDS— PA GE、還元条件下）に付した結果を示す電気泳動写真である。

図 3は、 MDCK細胞に対する ct一フラグメントのスキヤタリング効果を示す写真である。

図 4は、 HGFの共存下における MDCK細胞に対するな一フラグメントのスキャタリング効果を示す写真である。

図 5は、ラッ卜肝細胞の DNA合成に対する HGF、 EGF、な一フラグメントの効果を示す図である。図中、（a) は HGFを添加した系、（b) はな一フラグメントを添加した系、（c) は 5 n gZm 1の HGF共存下に α—フラグメントを添加した系、（d) は 1 On gZmlの EGF共存下に α—フラグメントを添加し O 97/16205

4

た系である。

図 6は、 GB— d 1細胞の浸潤に対する α—フラグメントの効果を示す写真である。

図 7は、 HGFの共存下における GB— d 1細胞の浸潤に対する α—フラグメン卜の効果を示す写真である。

図 8は、図 6及び図 7の結果を図表化したものである。発明を実施するための最良の形態

前述のように、本発明者は、年余にわたり肝実質細胞の増殖因子を研究し、その結果 HGFを単離精製することに成功した。 HGFは元来、肝実質細胞増殖を促進する因子として発見されたポリペプチドであるが、細胞増殖制御に加え、細胞運動 (cell motility) を促進するモトゲン（motogen)として働く（T. Nakamura, Prog. Growth Factor Res., 3, 67-85, 1991) ことは発明者によってもとより見いだされた事実である。 HGFによる細胞の運動性亢進には、 /9一力テニンのりん酸化によるカドヘリンを介した細胞間接着の滅少、 rho small Gタンパク質の活性化を介する情報伝達系が関与している。さらに最近、 rhoの下流に pl25FAK(focal adhesion kin ase)が位置し、 HGFによって一過的な pI25FAKのリん酸化が起こることが明らかになった (K. Matsumoto et al. J.Biol.Chem. 269, 31807-31813， 1994)。 HGFの刺激後、初期の焦点接着（focal adhesion)の形成、細胞骨格の再構成に pl25FAKのりん酸化が関与しており、 HGFによる細胞の運動性亢進において細胞一マトリックスとの相互作用は P125FAKを介して調節されていると考えられる。

癌細胞の増殖能や浸潤 ·転移能は、癌細胞をとりまく間質細胞との相互作用を介して大きく影響されることが古くから知られている（tumor-host relationship) 。発明者は宿主間質に由来する HGF、ならびに癌細胞に由来する HGF誘導因子（インジュリン）が癌の悪性化（増殖能や浸潤 ·転移能）に関与することを明らかにした (K. Matsumoto et al. uann Monograph No.42： Growth Factors: Cell growth, Morphogenesis and Transformation, CRC press 92-112, 1994; K. Rygaard et al. Intern. J. Oncology, 2, 991-996, 1993; W.G. Jiang et al. Clin, k Exp. Meta stasis, Π, 235-242, 1993; S.P. Seslar et al. Cancer res., 58, 1233-1238, 1 993; N. Rahimi et al. DNA and Cell Biol., 13， 1189-1197, 1994; S. Bellusci et al. Oncogene, 9, 1091-1099， 1994) 。

胆瘙は一般に高転移性で致死率の高い悪性癌である。ヒ卜胆嚢癌細胞は宿主間質組織内では高い浸潤能を有するが、 in vitroのコラーゲンゲル上での培養下では自らゲル内に浸潤することはない。ところが、正常間質線維芽細胞とコラーゲンゲルをはさんで共培養すると胆囊癌細胞はゲル内に活発に浸潤し、液性因子を介した間質細胞との相互作用により胆嚢癌細胞の浸潤能が誘導される。しかも、共培養下での癌細胞の浸潤は抗 HGF抗体の添加によリ完全に阻害され、間質由来の浸潤因子（invasion factor)が HGFであることが明らかになった。この胆嚢癌細胞のゲル内浸潤は代表的な増殖因子である EG F、 TGF—^、 PDGF、 bFGFなどでは誘導されず、 HGFに特異的である。一方、胆嚢癌細胞は間質線維芽細胞の HG F産生を誘導する因子を産生分泌し、この HGFインデューサ一の実体が IL-1/9であることが明らかになった。ヒ卜胆囊癌細胞に限らず多くのカルシノマ（carcinoma), 例えば口腔粘膜上皮癌細胞などの間質由来浸潤因子（stromal-derived invasion fac tor)の実体が HGFであることも明らかになった（K. Rygaard et al. Intra. J. 0 neology, 2, 991-996， 1993; W.G. Jiang et al. Clin. & Exp. Metastasis, 11， 2

35-242， 1993; S.P.Seslar et al. Cancer Res., 58. 1233-1238, 1993; N. Rahimi et al. DNA and Cell Biol., 13, 1189-1197, 1994) 。

癌細胞の浸潤 ·転移を防ぐことができれば癌による死亡率は著しく滅少するといわれている。しかも癌の 80%以上がカルシノマであり、これらのほとんどは c一 Me t /HGFレセプターを発現する HGF標的細胞である。このことから、 HGF による癌細胞の浸潤 ·転移能をブロックするアンタゴニス卜の開発は重要である。しかるに本発明者らは HGFの引き続く研究において以下の点を明らかにした。

HGFは約 69 kDaの α鎖と約 34 k D aの /9鎖からなるヘテロダイマーである。

HGFのな鎖には N末端ヘアピンドメインと 4個のクリングルドメインが存在し、 /9鎖にはセリンプロテアーゼ様ドメインが存在しており、 HGFは非常にユニークなドメイン構造を有する増殖因子である。本発明者らは既に HGF分子内のドメィン構造を欠失した種々の変異 HGFを遺伝子工学的に作製し、 α鎖内の N末端ヘアピンならびに第一、第二クリングルドメインが c一 Me t/HGFレセプターに結合する最小ドメインであることを明らかにした。従って、この最小レセプター結合ドメイン内に遺伝子工学的に変異を導入することにより HGFレセプタ一一アンタゴニストの作製も可能になると考えられる。従来、癌細胞の浸潤 ·転移を抑制する因子の解明はそのほとんどが癌細胞に由来するマトリヅクスプロテアーゼを標的としたものであるが癌細胞の浸潤 ·転移をブロックする有効な物質は解明されていない。

それに対し、本発明は癌細胞の浸潤 '転移を誘導するシグナルをその上流で遮断することを目的としておリ、全く新しい戦略に基づいてレ、る点が大きな特色であリ、先駆的な発明である。

本発明の抗癌剤は、前述の理化学的性質及び生理活性を有する蛋白質（α—フラグメン卜）を有効成分とすることからなり、当該蛋白質は、例えば、 H G Fを酵素的に分解する方法、遺伝子工学的技術を用いて調製する方法、化学的に調製する方法などにより得ることができる。

上記の酵素的分解法に用いられる H G Fとしては、種々の方法で調製されたものを用いることができる。すなわち、 H G Fの調製方法としては、各種の方法が知られている。例えば、ラッ卜、ゥシ、ヒッジなどの哺乳動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤などの臓器、血小板、白血球等の血液細胞や血漿、血清などから抽出、精製して得ることができる（FEBS Letters, 224, 312, 1987 ; Proc. Acad. Sci. USA, 86, 5844, 1989など参照）。

また、 H G Fを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞等）から分離精製して H G Fを得ることもできる。あるいは遺伝子工学的手法により H G Fをコードする遺伝子を適切なベクタ一に組み込み、これを適当な宿主細胞に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換え H G Fを得ることができる（例えば、 Nature, 342， 440， 1989 ; 日本特開平 5-11138 3号公報；日本特開平 3- 255096号公報； Biochem. Biophys. Res. Comraun. , ^63, 967, 1989など参照) 。

上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いることができる。

より具体的には、 H G Fを生体組織から抽出精製する方法としては、例えば、ラッ卜に四塩化炭素を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラッ卜の肝臓を抽出して粉砕し、 S-セファロース、へパリンセファロースなどのゲルカラムクロマトグラフィー、 HPL cなどの通常の蛋白質精製法にて精製することができる。

また、 H G Fのアミノ酸配列をコードする遺伝子を通常の遣伝子工学的な手法により動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CH0) 細胞、マウス C127細胞、サル COS細胞、 Sf (Spodoptera frugiperda)細胞などに形質転換し、その培養上清より得ることができる。 H G Fはヒト由来のものでも、哺乳動物由来のものでも用いることができる力、好ましくはヒト由来のものがよく、更に好ましくは、ヒト由来の組換え H G F (日本特開平 5-111383号公報）がよい。

かくして得られた H G Fは H G Fと実質的に同効である限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のァミノ酸に置換されていたリ、他のァミノ酸配列が一部挿入されていたり、 N末端及び/又は C末端に 1又は 2以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されてもよい。

H G Fの酵素的分解は、例えば、エラスターゼ等の酵素を用いて H G Fを消化することにより行なうことができる。ついで、高速液体クロマトグラフィー等の慣用の蛋白精製法を用いて消化生成物を精製し、 α鎖が含まれるフラグメントが約 5 5 一 6 9 k D aからなる低分子 H G Fを単離することにより、前記の理化学的性質及び生理活性を有する蛋白質（α—フラグメント）を得ることができる。

本発明の α—フラグメントは、上記の方法によリ得られたものに限定されるものではなく、慣用のペプチド合成法に準じて化学的に調製したものでもよく、また α 一フラグメントのアミノ酸配列をコードする遺伝子を調製し、それを用いて前記の遺伝子工学的な手法により産生させたものであってもよい。

後記実施例に示されるように、 α—フラグメントは H G Fのマイ卜ゲン（mitogen) 及びモトゲン活性を阻害するなど c—M e t /H G Fリセプターのアンタゴニスト活性を有し、癌細胞の浸潤を抑制することが判明した。従って、 ct一フラグメントを有効成分とする本発明の薬剤は、ヒト及び哺乳動物（例えば、ゥシ、ゥマ、ブタヒッジ、サル、ィヌ、ネコ等）の抗癌剤、特に癌細胞の浸潤抑制剤、転移抑制剤として有用である。

本発明の他の発明は、上述の α—フラグメントの有効量をヒ卜及び哺乳動物（例えば、ゥシ、ゥマ、ブタヒッジ、サル、ィヌ、ネコ等）に投与することからなる癌疾患の治療法；抗癌剤を製造するための上述の α—フラグメン卜の使用である。本発明の抗癌剤は種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤など）をとリうるが、一般的には有効成分である α—フラグメントのみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤とされる力、、又は慣用の担体と共に経口剤とされる。当該注射剤は常法により調製することができ、例えば、 α—フラグメントを適切な溶媒（例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルタ一等で據過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。注射剤中の α— フラグメント含量としては、通常 0. 0002-0. 2 (w/v%)程度、好ましくは 0. 001-0. l (w/v ¾)程度に調整される。また、経口薬としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤などの剤形に製剤化され、これらの製剤は製剤化の常法に準じて調製することができる。製剤中の α—フラグメント含量は、剤形、適用疾患などに応じて適宜調整することができる。

製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等を含んでいてもよい。液状製剤とした場合は凍結保存、又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。

本発明の製剤は、該製剤の形態に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与することができる。その投与量は、患者の症状、年齢、体重などにより適宜調整されるが、通常 α—フラグメン卜として O. O hng-lOOingであり、これを 1日 1回ないし数回に分けて投与するのが適当である。産業上の利用可能性

本発明において、有効成分である α—フラグメントは、高転移性で致死率の高い胆囊癌や肺癌を初めとする癌細胞に対して特異的な癌浸潤 ·転移抑制効果を有する。従って、本発明の抗癌剤及び治療方法は、癌の治療、予防などに用いられ、臨床上極めて有用である。実施例以下に実施例及び試験例を示し、本発明をより具体的に述べるが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例 1

HGFのな一フラグメントの単離精製

遺伝子組換え HGF900mgをエラスターゼで 1時間消化し、これを逆相 HPLC(C4)で精製した。そのクロマ卜グラムを図 1に示す。図 1に示されるように、 4個のピ一クが得られ、第一のピークが α—フラグメント、第二のピークが未消化の HGF、第三と第四のピークが 1、 ^2であることが同定された。さらに、凍結乾燥システムで溶媒を除去し、それぞれの分画を集めて再蒸留水で再懸濁した。そうして得られた物質が α、 ^一フラグメントであることを SDS-PAGEでさらに確認した（図 2参照）。蛋白定量の結果、 α—フラグメントは 178mg取得された。実施例 2

DCK細胞を用いたモトゲンとしての作用の解析

MDCK細胞を 1 0%FBS加 DMEM培地で 2Χ1(Γ細胞/ mlに調製し、 48ゥエルプレートに

250ml/ゥエルでまきこんだ。 α—フラグメントを単独で 10ng/mlから 10 g/ml加えて 24時間培養し、位相差顕微鏡で観察した。その結果を図 3に示す。図 3に示されるように、 α:—フラグメン卜にはスキヤタリング（scattering)作用は認められなかつた。続いて、 HGF2ng/mlと同時に添加して HGFに対する阻害効果を調べた。その結果を図 4に示す（図中、 αの表示は、 HGFに対するひ一フラグメント濃度 (倍率）を示す。以下同様）。図 4に示すように、 1 000倍濃度をこえるとスキャタリングの抑制が濃度依存的に観察された。よって、 α—フラグメントは HGF のアンタゴニストであることが強く示唆された。実施例 3

ラット肝細胞を用いたマイトゲンとしての作用の解析

ラット肝細胞を 48ゥエルプレー卜で約 50%面積を占めるように培養し、 HGF、 EGF、ひ一フラグメントを添加して 22時間培養した。 '²⁵I-BrdU(0.15mCi/ゥェル）で 4時間ラベルし、活性をシンチレーシヨンカウンターで測定した。その結果を図 5に示す。 α—フラグメントには 10²ng/mlから liTng/mlの範囲で DNA合成促進作用は認められなかった。そして、 HGF5ng/mlと同時に加えると HGFのマイ卜ゲン活性を濃度依存的に抑制することが明らかとなった（図 5 c参照）。ゆえに、 α—フラグメン卜は HGFのマイ卜ゲン、モ卜ゲン活性に対してアンタゴニス卜であることが示された。実施例 4

α—フラグメントの HG F誘導癌細胞浸潤に対する作用

定量的であるマトリゲルインべイシヨンチャンバ一（Matrigel invasion chambe r, 24ゥエル）を用いた基底膜浸潤モデルで H G Fの癌細胞浸潤誘導作用に対するな一フラグメントの効果を検討した。 GB-dl細胞を 1.5X10'細胞/ 200ml/ゥエルに調整して、アッパーチャンバ一（upper chamber)にまきこんだ。ロワ一チャンバ一（lower chamber)の培地 500mlには H G F 2ng/mlと ct一フラグメントを加えて 24時間培養し、固定後 H&Eで染色した。顕微鏡下に任意の 10視野（8.4璧'）を観察し、フィルタ —下面に浸潤してきた細胞数で浸潤能を評価した。 HGFは濃度依存的に GB-dl細胞の浸潤を促進した（図 6参照）。 HGF3ng/mlに対する α—フラグメントの作用を検討したところ、 α—フラグメントは HGF3ng/mlの 1 30倍、 400倍、 400 0倍、 1 3000倍と濃度依存的に HGFの作用を阻害した（図 7参照）。なお、図 8に、図 6及び図 7の結果を図表化したものを示す。

上記の結果からして、な一フラグメントは、 HGFに誘導される癌細胞の浸潤を抑制する作用を有することが明らかになった。製剤例 1

生理食塩水 1 0 Om 1中に α—フラグメント 1 mg、マンニトール 1 g及びポリソルベート 80 1 Omgを含む溶液を無菌的に調製し、 1 m 1ずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。

製剤例 2

0. 02Mリン酸緩衝液（0. 1 5M NaC l及び0. 0 1 %ポリソルベー卜 8 0含有、 pH7. 4) 1 00m 1中に ct—フラグメント 1 mgとヒ卜血清アルブミン 1 0 Omgを含む水溶液を無菌的に調製し、 1 mlずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。製剤例 3

注射用蒸留水 1 00m 1中に α—フラグメント 1 mg、ソノレビトーソレ 2 g、グリシン 2 g及びポリゾリレベー卜 80 1 Omgを含む溶液を無菌的に調製し、 1 mlずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。

Claims

請求の範囲

1. 下記の理化学的性質及び生理活性を有する蛋白質を有効成分として含有する抗癌剤。

a) HGFの α鎖からなる；

b)分子量が約 55— 69 kDaである；

c) c一 Me tZHGFレセプターのアンタゴニスト活性を有する。

2. HGFが遺伝子組換えにより製造したものである請求の範囲第 1項記載の抗癌剤。

3. 遺伝子組換えの宿主細胞が、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物細胞又は動物細胞の何れかである請求の範囲第 2項記載の抗癌剤。

4. 下記の理化学的性質及び生理活性を有する蛋白質の有効量を投与することからなるヒト又は哺乳動物の癌疾患の治療法。

a) HGFの α鎖からなる；

b)分子量が約 55 - 69 kD aである；

c) c -Me tZHGFレセプターのアンタゴニスト活性を有する。

5. HGFが遺伝子組換えにより製造したものである請求の範囲第 4項記載の癌疾患の治療法。

6. 抗癌剤を製造するための下記の理化学的性質及び生理活性を有する蛋白質の使用。

a) HGFの α鎖からなる；

b)分子量が約 55 - 69 kDaである；

c) c一 Me tZHGFレセプターのアンタゴニス卜活性を有する。

7. H G Fが遛伝子組換えにより製造したものである請求の範囲第 6項記載の蛋白質の使用。