WO1997015682A1

WO1997015682A1 - Procede de production de composes amines actifs sur le plan optique

Info

Publication number: WO1997015682A1
Application number: PCT/JP1996/003054
Authority: WO
Inventors: Yukio Yamada; Akira Iwasaki; Noriyuki Kizaki; Yasuhiro Ikenaka; Masahiro Ogura; Junzo Hasegawa
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 1995-10-23
Filing date: 1996-10-21
Publication date: 1997-05-01
Also published as: DE69635082T2; US6344351B2; US20010031487A1; EP0857790A4; EP0857790A1; EP0857790B1; US6221638B1; DE69635082D1

Description

明細書光学活性なァミノ化合物の製造方法技術分野

本発明は、医薬品や農薬等の中間体として用いられる 1 位に了リ

—ル基等を有する光学活性なァミノ化合物に関する。本発明の目的化合物の 1 つである 1 一（ 3 , 4 —ジメトキシフエ二ル）一 2—ァミノプロパンは、開発中の抗糖尿病薬、抗肥満薬として有望な C L 3 1 6. 2 4 3 ( J. D. Bloom ら、 J. Med. Chem. , 35, 3081-3084 (1992))やその類縁化合物の中間体として重要な化合物である。また、別の目的化合物である（ S ) — 2—アミノー 1 ーメトキシプロバンは除草剤中間体として用いることができる有用化合物であ

背景技術

酵素を用いて 1位にァリール基等を有する光学活性なァミノ化合物を製造する方法としては、中道らの報告（Appl. Microbiol. Bio techno 1· , 33. 634-640 (1990)) 及び特公平 4 一 1 1 1 9 4号公報が挙げられる。これらは 1 一（置換フヱニル）一 2 —プロパノン類にアミノ基を酵素的に転移させることによって（ S ) 体を効率的に合成できることを開示している。さらに、特公平 4 — 1 1 1 9 4号公報には（R) 体の合成についても記載があるが、（R) 体については、本発明者らが特公平 4 一 1 1 1 9 4号公報に記載のある微生物および基質について追試を行ったところ、非常に再現性に乏しく、実用化は困難であると考えられる。更に、有機合成的に生産したラセミ体ァミノ化合物に ω—アミノ酸トランスアミナーゼを作用させて（ S ) 体のみを分解し、残った（R) 体を取得する方法がス夕一リングら（特開平 3— 1 0 3 1 9 2号公報）によって開示されているが、この方法では、（R) 体を取得するために（ S ) 体を分解してしまう為、基質に対する収率が 5 0 %以下に低下し、コスト的には有利な方法とは言えない。また、同じくスターリングらは ω— アミノ酸トランスアミナーゼを用いて、ケトン体からァミノドナ一の存在下に（ S ) -ァミノ化合物のみを合成する方法をも開示しているが、この方法では光学活性な（R) -ァミノ化合物を合成することはできない。発明の開示

従って、本発明の目的は、微生物酵素による光学活性な（R) — ァミノ化合物の効率的かつ安価な製造方法を提供することにある。本発明者らは 1 位にァリール基等を有するケトン化合物に（R) 体特異的に効率良くアミノ基を転移させることによって、収率良く光学活性な（R) -ァミノ化合物を合成できる微生物を土壌より発見し、これを用いる反応を検討することによって本発明を完成させるに至つ 7こ。

即ち、本発明の要旨は、

〔 1 〕下記一般式（ I )

X— ( C Η₂)„ 一 C一（ C Η ₂)„ — C H ( I )

II

0

(式中、 nは 0〜 5、 mは 0又は 1 、 Xは炭素数 6〜 1 4の無置換のァリール基：炭素数 4〜 1 5のアルキル基、水酸基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、沃素原子、ニトロ基、およびカルボキシル基からなる群より選択される 1種以上の置換基を有する炭素数 6〜 1 4のァリール基；又はメトキシ基を示す。）

で示されるケトン化合物（ァミノ受容体）と、一般式（II)

H

(式中、 X , 、 Χ₂ はそれぞれ ϊ虫立して、水素原子；炭素数 1〜 1 0の直鎖アルキル基；炭素数 5〜 1 2の分岐アルキル基；炭素数 6 〜 1 4の無置換のァリール基：又は炭素数 1〜4のアルキル基、水酸基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、沃素原子、ニトロ基、およびカルボキシル基からなる群より選択される 1種以上の置換基を有する炭素数 6〜 1 4のァリール基を示す。）

で示される非キラールもしくはラセミ体又は（R) 体のアミノ化合物（ァミノ供与体）の共存下、（R) 体特異的なトランスアミナーゼを作用させることにより、立体選択的にアミノ基転移を行い、一般式 (IV)

(R) - X - (CH₂)„ 一 C H— (CH₂)_n - C H₃ (IV)

NH₂

(式中、 n、 m、および Xは、それぞれ一般式（ I ) における n、 m、および Xと同意義を表す。）

で示される光学活性な（R) —ァミノ化合物を得ることを特徴とする、光学活性な（R) —ァミノ化合物の製造方法、

〔 2〕一般式（II) の X , が炭素数 2〜 1 0のアルキル基、っェニル基、ナフチル基であり、 X₂ が炭素数 1 又は 2のアルキル基であることを特徴とする前記〔 1 〕記載の光学活性な（R) —ァミノ化合物の製造方法、

〔 3〕一般式（ II) で示されるァミノ供与体が、 D—ァラニンの炭素数 1 8のアルキルエステルであることを特徴とする前記〔 1 〕記載の光学活性な（R) —ァミノ化合物の製造方法、

〔 4〕一股式（11) で示されるァミノ供与体が、（R) — 1 ーフェニルェチルァミン、（R) — 1 —ナフチルェチルァミン、（R) 一 1 —メチルプロピルァミン、（R) — 2—ァミノペンタン、（R ) 一 2 —アミノー 1 -プロパノール、（R) ― 1 一メチルプチルァミン、（R) — 1 — フエニルメチルァミン、（R) — 1 —アミノー

1 一フエニルエタノール、（R) — 2—アミノー 2— フエニルエタノール、（R) — 3 —ァミノヘプタン、（R) - l -ァミノ一 3 — フエニルブン、（R) — 2 —ァミノ一 4 —フエニルブタン、（ R) — 2 —アミノー 3 -フエニルプロバノール、（R) — 3 , 4 — ジメトキシアミノブ 'ン、（R) — 1 一メチルヘプチルァミン、ベンジルァミン、（ S) — 2—フエニルグリシノール、 3 —ァミノフエニルブタン、 L一フエ二ルァラ二ノール、（R) — 2 —ァミノ一 1 ーメトキシプ 'ン、 D—ァラニンメチルエステル、若しくは D—ァラニンェチルエステルである又はこれらの化合物のラセミ体である前記〔 1 〕記載の光学活性な（R) -ァミノ化合物の製造方法、

〔 5〕一般式（ I ) および一般式（IV) の n mが n = l m = 0であることを特徴とする、前記〔 1 〕（ 4〕いずれか記載の光学活性な（R) —ァミノ化合物の製造方法、

〔 6〕一般式（ I ) および一般式（IV) のが、フエニル、 2 - メトキシフエ二ル、 3— メトキシフエニル、 4— メトキシフエニル、 2, 4—ジメトキシフエ二ル、 3 , 4—ジメトキシフエ二ル、又はメトキシであることを特徴とする、前記〔 1〕〜〔 5〕いずれか記載の光学活性な（R) -ァミノ化合物の製造方法、

〔 7〕一般式（ I ) で示されるアミノ受容体と一般式（II) で示されるァミノ供与体を（R) 体特異的なトランスアミナーゼを生産する微生物の培養物、分離した菌体、菌体処理物、又は固定化菌体と接触せしめることを特徴とする前記〔 1〕〜〔 6〕いずれか記載の光学活性な（R) -ァミノ化合物の製造方法、

〔 8〕一般式（ I ) で示されるアミノ受容体と一般式（Π) で示されるァミノ供与体を（R) 体特異的なトランスアミナーゼを生産する微生物の無細胞抽出物、粗精製酵素、精製酵素、又は固定化酵素と接触せしめることを特徴とする前記〔 1〕〜〔 6〕いずれか記載の光学活性な（R) -ァミノ化合物の製造方法、

〔 9〕該トランスアミナーゼを生産する微生物がァルスロバクタ一（A r t h r o b a c t e r ) 厲に厲する微生物である前記〔 1 〕〜〔 8〕いずれか記載の光学活性な（R) -ァミノ化合物の製造方法、

〔 1 0〕該ァルスロパクター属に厲する微生物がァルスロバクタ — ' スピーシーズ（A r t h r o b a c t e r s p . ) K N K 1 6 8 (F ER B P - 5 2 2 8 ) である前記（ 9〕記載の光学活性な（R) —アミノ化合物の製造方法、

〔 1 1〕該トランスアミナーゼを生産する微生物を培養する際に、該酵素の誘導物質として（R S) — 1 一メチルプロピルァミン、

(R S) - 1 — フエニルェチルァミン、（R S) — 1 — メチルブチルァミン、（R S) — 3—アミノー 2, 2— ジメチルブタン、（R S) — 2—アミノー 1 ーブタノール、及び（R) 又は（R S) — 1 一（ 3, 4—ジメトキシフエ二ル）アミノブ口パンからなる群より選択される 1種以上を培地に添加することを特徴とする前記〔 1〕〜〔 1 0〕いずれか記載の光学活性な（R) -ァミノ化合物の製造方法、

〔 1 2〕アミノ基転移反応において、 5以上 1 2以下の p Hで反応を行うことを特徴とする前記〔 1〕記載の光学活性な（R) -ァミノ化合物の製造方法、

〔 1 3〕アミノ基転移反応において、反応時に反応促進物質として界面活性剤又は脂肪酸を添加して反応を行うことを特徴とする前記〔 1〕記載の光学活性な（R) -ァミノ化合物の製造方法、

〔 1 4〕一般式（III) で示されるケトン化合物（ァミノ受容体）の存在下、一般式（V) で示されるラセミ体のアミノ化合物に（R ) 体特異的なトランスアミナーゼを作用させることにより、立体選択的にアミノ基転移反応を行い、一般式（VI) で示される光学活性な（ S ) —ァミノ化合物を得ることを特徴とする、光学活性な（ S ) ーァミノ化合物の製造方法、

X

>= 0

X

H

(RS) - X - (CH₂)» - C - (C H₂)_m - C H₃ ( V)

NH₂ H

I

( S ) - X - ( C H₂)» 一 C一（ C H₂)_m - C H₃ (VI)

NH₂

〔 1 5〕ァルスロパク夕一属に属する微生物の培養により得ることのできる、（R) 体特異的なトランスアミナーゼ、

〔 1 6〕酵素蛋白のァミノ末端付近に、

Glu-Ile-Val-Tyr-Thr-His-Asp-Thr-Gly-Leu-Asp-Tyr

のァミノ酸配列を持つ、前記〔 1 5〕記載の（R) 体特異的なトランスァミナ一ゼ、に関する。

図面の簡単な説明

第 1 図は、本酵素の至適 p Hを示す図である。

第 2図は、本酵素の安定 p Hを示す図である。

発明を実施するための最良の形態

以下に、さらに詳しく本発明を説明する。まず、本発明における反応スキームを以下に示す。

X— ( C H₂)

(R) - X - ( C H₂)_n 一 C H - （ C H₂)_n — C H₃ (IV)

NH₂ 本発明者らは、ケトン類を基質にして（R) 体特異的に（R) — ァミノ化合物を生成する能力を有する菌を国内土壌より分離すベく、スクリーニングを重ねたところ、ァルスロバクタ一（A r t h r 0 b a c t e r ) 厲の細菌に本反応を触媒する強い活性を認めた。その中で代表的なァルスロバクタ一 · スピ一シーズ（A r t h r o b a c t e r s p . ) KNK 1 6 8 (F E R B P— 5 2 2 8 ) について、その菌学的な性質を以下に示す。

細胞の形態桿菌（コリネ型）

グラム染色陽性

胞子形成無し

i 動性無し

コロニ一の形態丸い、規則的な、完全な、黄色、スムースな、光沢のある、やや半透明な、凸面の、直径 2 m m (Be nnett の寒天培地）

生育（ 3 0。C) + ( 3 7。C )

カタラーゼ +

ォキシダーゼ

0 Fテスト（グルコース）：一（酸化的）

細胞壁：ミコール酸無し

ジアミノ酸はリジン

脂肪酸分析：殆どが 3つに技分かれしたィソ及びアンティソ酸本菌が生産するトランスアミナーゼは、後に詳述するように、ァミノ供与体としては、（R) — 1 —フエニルェチルァミンのような

(R) 体のアミンを利用し、かつ生成物は光学活性な（R) —アミノ化合物である点で、ァミノ供与体として（S) アミンを利用し、かつ生成物が光学活性な（S) —ァミノ化合物である、中道ら（Ap pl. Microbiol. Biotechnol. , 33, 634 - 640 (1990)) が用いているブレピノ、'クテリウム，リーネンス（B r e v i b a c t e r i u m 1 i n e n s ) I F 0 1 2 1 4 1の酵素や、ス夕一リングら（特開平 3— 1 0 3 1 9 2号公報）が利用した ω—アミノ酸トランスァミナ一ゼとは明らかに異なる。

さらに、本発明に用いられるァルスロバク夕一のトランスァミナーゼは、他の多くの点で上記のブレビバクテリゥムの酵素と異なつている。例えば、塩化アンモニゥム等の無機のアンモニゥ厶塩ゃグルタミン酸ゃァスパラギン酸等の L—アミノ酸（（S) ァミンである。）をァミノ供与体として用いることができない点等で違っている（表 1 ) 。表 1

また、本発明に用いられるァルスロバクターのトランスアミナーゼをスターリングら（特開平 3 - 1 0 3 1 9 2号公報）が用いている ω—アミノ酸トランスアミナ一ゼと比較すると、上記の基質特異性についての明確な相違に加えて、ァルスロバクタ一のトランスァミナーゼは、ーァラニンや 4 —ァミノ酪酸等の ω—アミノ酸、また η —ブチルァミン、ブトレツシンのような ω—アミン又は D L— 3 —アミノ酷酸等には作用しない点、そしてヒドロキシルァミンやフエニルヒドラジン等の反応阻害剤による影響が微弱である点等が違っている。

また、本発明者らの酵素と類似する他の酵素としては、ビルビン酸の存在下でベンジルアミンに強く作用して Lーァラニンとベンズアルデヒドを生成するベンジルァミントランスアミナーゼが岡田ら (特開平 6— 1 7 8 6 8 5号公報）によって開示されているが、この酵素によるトランスアミナ一ゼ反応の生成物の光学活性が、（ S ) 体である Lーァラニンである点で上記のブレビバクテリウムの酵素や ω—アミノ酸トランスアミナーゼと同種の光学特異性を示す酵素であり、本発明に使用されるァルスロバクタ一のトランスァミナ一ゼとは全く異なる酵素であるということができる。

さらに、これらの酵素を比較した場合、フヱニルヒドラジン、 D 一ぺニシラミン、そして p—クロロメルクリ安息香酸等の反応阻害剤による影響に差があるように思われる。

以下に ω—アミノ酸トランスアミナーゼとしてよく調べられているシユウドモナス s p . F— 1 由来の ω—アミノ酸トランスアミナーゼ（ァグリカルチュラル · ノくィォロジカル ' ケミストリー（ Ag ric. Biol. Chem. ), 42 巻， 2363-2367 頁（ 1978年）、ァグリカルチュラル ' バイオロジカル ' ケミストリ一（Agric. Biol. Chem. ), 43 巻， 1043-1048 頁（ 1979年）、ジャーナル . ォブ . バイオロジカル · ケミストリー（J. Biol. Chem. ), 258巻， 2260-2265 頁（19 83年））及び岡田らのベンジルァミントランスアミナ一ゼ（特開平 6 - 1 7 8 6 8 5号公報）との違いを表 2にまとめて示す。本発明のトランスアミナーゼ反応は精製酵素で、他の 2酵素についてはそれぞれの文献及び特許に記載されている精製酵素によるデータで示した。アミノ受容体はいずれもピルビン酸を用いている。

表 2 本発明の ω—了ミノ酸岡田らのトランス了ミナ-ゼトランス了ミナ-ゼトランスァミナ-ゼ基質特異性 (相対活性：％) (相対活性： (相対活性：％) yS—ァラニン 0 100 0

一アミノ酸酸 0 40

DL-3-了ミノ酪酸 0 96

n—プチルァミン 0 60 0

ベンジルァミン 0. 8 45 100 プトレスシン 0 55 0 βーフ Xネチル了ミン 0 54 9 ァミノ基供与体

Lーァラニン + + 阻害剤（各 1 mM) (相対活性： (相対活性： (相対活性：％) (無添加） 100 100 100

ヒド πキシル了ミン 17 0 30 (0. ImM) フエニルヒドラジン 82 6 27

D-ベニシラミン 93 65 0

P-クルクり安息香酸 53 100 9 (0. ImM)

C u S 0 ₄ 44 5 (0. 5m ) ガバクリン 24 0

また、代表的な ω —ァミノトランスフヱラーゼの基質に対する、本発明に用いられるトランスアミナーゼ（菌体内酵素）の活性を表 3 に示す。 ω —アミノ酸、 ω —アミンをァミノ供与体とした場合は、 ω —アミノトランスフヱラ一ゼ活性は極めて小さく、また ω —ァミノ酸— ピルビン酸ァミノトランスフヱラーゼの代表的基質である 3—ァラニンには作用しない。（R ) — 1 —フエニルェチルァミンに対して特異的に高い活性を示す。従って、 ω —ァミノトランスァミナーゼとは、基質特異性が全く異なる。表 3

本発明に使用される、ァルスロバクタ一 ' スピーシーズ（A r t h r o b a c t e r s p . ) KN K 1 6 8 ( P E R B P - 5 2 2 8 ) の産生する（R) 体特異的なトランスアミナーゼは、酵素蛋白のァミノ末端付近に、配列表の配列番号： 1 で示される

Glu-Ile-Val-Tyr-Thr-His-Asp-Thr-Gly-Leu-Asp-Tyr

のァミノ酸配列を持っている。

本発明に使用されるァミノ基転移反応を行う際には、菌の培養時に誘導物質を添加すれば酵素活性が上昇する。かかる誘導物質としては（R S ) — 1 —メチルプロピルァミン、（R S ) — 1 一フエ二ルェチルァミン、（R S) — 1 一メチルプチルァミン、（R S ) — 3 —アミノー 2 , 2 —ジメチルブタン、（R S ) — 2 —ァミノ一 1 ーブ夕ノール、及び（R) 又は（R S ) — 1 - ( 3 , 4 —ジメトキシフヱニル）アミノブ口パン等のアミン類の 1 種以上が用いられる

0

本発明に用いられるァルスロバクタ一由来のトランスアミナ一ゼは、各種の態様で使用することができる。すなわち、菌の培養物、分離した菌体、菌体処理物をはじめ、無細胞抽出液、粗精製酵素、精製酵素等を用いることができ、更にはこれらの菌体の固定化物、菌体処理物の固定化物、酵素蛋白の固定化用担体（例えば、陰ィォン交換樹脂）への固定化物等が使用できる。なお、固定化は、常法 (例えば特開昭 6 3 — 1 8 5 3 8 2号公報）に従って行うことができる。

固定化に使用される支持体としては、デュオライト（Duolite)A 5 6 8又は D S 1 7 1 8 6 (ローム ' アンド ' ハース社：登録商標 ) 等のフヱノール一ホルムアルデヒド陰イオン交換樹脂、アンバーライト（Amberlite) I R A 9 3 5、 I R A 9 4 5 , I R A 9 0 1 ( ローム ' アンド ' ハース社：登録商標）、レワタイト（し ewatit)0 C 1 0 3 7 (バイエル社：登録商標）、ダイアイオン（D i a i on) E X— 0 5 (三菱化成工業：登録商標）等のボリスチレン樹脂のような各種ァミンゃアンモニゥム塩あるいはジエタノールアミン型の官能基を持つ各種の陰イオン交換樹脂が適している。その他 D E A E —セルロース等の支持体も使用することができる。

更に、酵素の吸着をより強固かつ安定にするため、通常、架橋剤を用いるが、好適な例として、グルタルアルデヒドを挙げることができる。使用する酵素は、精製酵素だけではなく、部分精製酵素、菌体破砕液、無細胞抽出液等、種々の精製度のものが使用できる。固定化酵素の調製は支持体に酵素を吸着後、架橋処理をする等の通常の調製法が使用できる。

即ち、本発明においては、一般式（ I ) で示されるアミノ受容体と一般式（Π ) で示されるァミノ供与体を（R ) 体特異的なトランスァミナ一ゼを生産する微生物の培養物、分離した菌体、菌体処理物、もしくは固定化菌体、又は（R ) 体特異的なトランスアミナーゼを生産する微生物の無細胞抽出物、粗精製酵素、精製酵素、又は固定化酵素と接触せしめることが好ましい。

本発明に使用されるアミノ受容体としては、一般式（ I ) で示されるケトン類が挙げられる。式中、 nは 0〜 5、 mは 0又は 1 を表し、 Xは炭素数 6〜 1 4の無置換のァリール基；炭素数 4〜 1 5のアルキル基、水酸基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、沃素原子、ニトロ基、及びカルボキシル基からなる群より選択される 1 種以上の置換基を有する炭素数 6〜 1 4のァリール基；又はメトキシ基を示す。

上記の中では、特に、 n = 1、 m = 0であるもの、例えば 1 ーァリール一 2 —プロパノン、又は 1 ーメトキシー 2 —プロパノンが好ましい。また、ァリール基がフヱニル基、 2 — メトキシフエ二ル基、 3 —メトキシフエニル、 4 ーメトキシフエ二ル、 2 , 4 —ジメトキシフヱニル、又は 3 , 4 —ジメトキシフヱニルであるものが好ましい。

本発明に使用されるァミノ供与体としては一般式（II) で示される非キラールもしくはラセミ体又は（R ) 体のアミノ化合物類が挙げられる。式中、、 X 2 はそれぞれ独立して、水素原子：炭素数 1 〜 1 0の直鎖アルキル基；炭素数 5〜 1 2の分岐アルキル基；炭素数 6〜 1 4 の無置換のァリール基；又は炭素数 1 〜 4 のアルキル基、水酸基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、沃素原子、ニト口基、およびカルボキシル基からなる群より選択される 1 種以上の置換基を有する炭素数 6〜 1 4 のァリール基を示す。

上記のァミン類の中では、特に、 X , が炭素数 2〜 1 0のアルキル基、フエニル基、ナフチル基であり、 X ₂ が炭素数 1 又は 2のァルキル基で示されるアミン類や、 D—ァラニンの炭素数 1 〜 8 のァルキルエステル等が好ましい。具体的には、（R) — 1 一フユニルェチルァミン、（R) — 1 一ナフチルェチルァミン、（R) — 1 一メチルプロピルァミン、（R) — 2 —ァミノペンタン、（R) — 2 一アミノー 1 一プロバノール、（R) — 1 ーメチルブチルァミン、 (R ) — 1 一フエニルメチルァミン、（R) — 1 一アミノー 1 ーフェニルエタノール、（R) — 2 —アミノー 2 —フエニルエタノール、（ R ) — 3 —ァミノヘプタン、（R) — 1 一アミノー 3 —フエ二ルプロパン、（R) — 2 —アミノー 4 一フエニルブタン、（ R) — 2 —アミノー 3 —フエニルブロバノール、（R ) — 3 , 4 -ジメトキシアミノブロノくン、（R) — 1 一メチルヘプチルアミン、ベンジルァミン、（ S ) — 2 —フエニルグリシノール、 3 —ァミノフエ二ルブタン、 L— フエ二ルァラ二ノール、（R) — 2 —アミノー 1 一メトキシプロパン、 D—ァラニンメチルエステル、又は D—ァラニンェチルエステル等が挙げられる。

反応に用いる基質の濃度は、アミノ受容体が 0. 1 〜 1 0 %、好ましくは 3〜 5 %であり、ァミノ供与体としては、キラールァミンの場合は（R) 体として、アミノ受容体に対して 8 0〜 1 5 0モル %程度の濃度で用いることが好ましい。アミノ供与体としてラセミ体のアミノ化合物を使用することもできる。ただし、使用濃度は（ R) 体の場合の 2倍量を要する。

反応時の p Hは、通常 p H 5. 0〜 1 2. 0、好ましくは p H 7 . 0〜 1 0. 0である。また、反応時の温度は、通常 2 5〜 4 0て、好ましくは 3 0〜 3 5 'Cである。

さらに、反応時にドデシル硫酸ナトリウム（ S D S：) 、トリトン X— 1 0 0、臭化セチルトリメチルアンモニゥム（ C TA B) 等の界面活性剤やリノール酸、ォレイン酸等の脂肪酸を 0. 1 〜 1 0 % 添加することにより、反応収率が向上することがある。

本発明の製造方法によって製造される光学活性なァミノ化合物は、一般式（ IV) で示される（R) —ァミノ化合物である。式中、 n 、 m、および Xは、それぞれ一般式（ I ) における n、 m、および Xと同意義を表す。

具体的には、（R) — 1 一フエ二ルー 2 —アミノブロバン、（R ) ー 1 一フエ二ルー 3 —アミノブタン、（R) — 1 一（ 3 , 4 —ジメトキシフエ二ル）一 2 —ァミノプロパン、（R) — 3 — （トリフルォロメチルフエニル）一 2 — ノブ 'ン、（R) — 3 — ( p ーメトキシフエニル）一 2 —アミノブン、（R) — 4 p— メトキシフエ二ル）一 2 —アミノブタン、（R) — 4 一 ( 3 ' , 4 ' ーメチレンジォキシフエニル）一 2—アミノブタン、（R) - 4 一（ p—ヒドロキシフエニル）一 2 —アミノブタン、（R) - 2 - アミノー 1 ーメトキシプロパン等が挙げられる。

本発明の製造方法によれば、例えば、ァルスロパクター . スピ一シーズ KNK 1 6 8 (F E RM B P— 5 2 2 8 ) を用い、 1 一（ 3 , 4 —ジメトキシフエ二ル）一 2—プロパノンをアミノ受容体、 ( R ) 一 1 一フエニルェチルアミンをァミノ供与体として、それぞれ 3 %濃度で 2 0時間程度の反応をさせた場合、ァミノ基転移反応によって、 7 5 %以上の 1 — ( 3 , 4 — ジメトキシフエ二ル）一 2 —プロパノンを 9 9 % e e以上の光学純度の（R) ― 1 一（ 3， 4 ージメトキシフヱニル）一 2 -ァミノプロパンに転換させることができる。

反応生成物として得られる光学活性なァミノ化合物の定量は、高速液体クロマトグラフィーによって行うことが可能である。例えば、反応液を逆相カラム（コスモシル 5 C ₁₈— A R、ナカライテスク等）を用い、 2 5 %ァセトニトリル等を移動相として分離し、 2 1 0 n mの吸収を、対照と比較することによって定量分析を行うことができる。また光学純度を測定する方法としては、いくつかの方法があるが、例えば、生成した光学活性なァミノ化合物を N—カルボキシ一 L一口イシンアンヒドライド等と結合させてジァステレオマ一を形成させ、これを上記の高速液体ク口マトグラフィ一の方法で分離、定量することによって、分析を行うことができる。

反応後に目的とする光学活性なァミノ化合物を分離する方法としては、有機溶媒による抽出と蒸留を組み合わせた通常の方法によつて行うことができる。例えば、抽出溶媒としては、醉酸ェチルゃトルェン等が使用可能で、反応液をまず酸性にして抽出を行うことにより、ケトン類を除き、その後アルカリ性にして抽出することにより目的化合物を含むアミン類を分離する。そしてこの抽出画分を更に蒸留することによって目的の光学活性なァミノ化合物を単離することができる。

本発明に用いられるトランスアミナ一ゼは、一般式（ΠΙ)で示されるケトン化合物（ァミノ受容体）の存在下に、一般式（V) で示されるラセミ体のアミノ化合物に作用させると、（R) 体のみに作用するため（R) 体のみが選択的にケトン化合物に変換され、（ S ) 体は変化を受けずにァミノ化合物として回収することができる。従って、本発明に用いられるトランスアミナ一ゼを用いて、ラセミ体のアミノ化合物から容易に一般式（VI) で示される（ S) —アミノ化合物を製造することが可能である。

例えば、ァルスロバクタ一 · スピーシ一ズ K N K 1 6 8 ( F E R M B P— 5 2 2 8 ) を用い、ラセミ体の 1 — ( 3 , 4 —ジメトキシフエニル）一 2 —アミノブロノ、'ンゃ 2 —アミノー 1 ーメトキシプ口パンをピルビン酸をァミノ受容体として反応させた場合、ァミノ基転移により（R) 体のアミノ化合物がケトン体に転換し、（ S ) 体のアミノ化合物が約 5 0 %の収率で得られ、高い光学純度まで濃縮された状態で取得することができる。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。実施例 1

国内各地より採取した土壌サンプル各 2 gを 5 m 1 の生理食塩水に懸濁し、その上澄液 0. 2 m 1 を 4 m 1 の S培地（ 2 g/L K H 2 P 04 . 2 g / L K₂ H P 0₄ 0. Z g /L g S 0 *

- l 9 - - 7 H₂ 0, 5 g/L グリセリン、 3 g/L N a C K 1 g/ L 粉末酵母エキス、 0. O O gZL F e S 0₄ · 7 Η₂ 0、 0. 0 0 0 5 g/L Z n S 04 · 7 Η₂ 0、 0. 0 0 0 5 g/L

Mn C 1 2 - 4 H₂ 0 ( p H 7. 5 ) 、高圧蒸気殺菌後除菌フィルターで慮過した 2—ォキソグルタル酸又はピルビン酸、及び（R ) - 1 - ( 3 , 4 ージメトキシフエ二ル）一 2—ァミノプロパンをそれぞれ最終濃度 1 . 5 gZL、 1 . 0 gZLとなるように添加）に加えて、 3 0てで 3〜 7 日間集稹培養を行った。菌が生育した培養液を 1 . 5 %寒天を含む S培地プレートに 0. 2 m l ずつ塗り付け、 3 0 ^eCにて培養を行って生育したコロニーについて、それぞれ S培地で振通培養し、菌体を集菌後 0. 1 M炭酸緩街液（ p H 8. 5 ) 、 5 0 mMピルビン酸、 3 0 mM (R) — 1 - ( 3 , 4 — ジメトキシフヱニル）一 2—ァミノプロパンを含む 0. 2 5 m l の反応液に懸濁し、 3 0てで撹拌しながら 2 4時間反応させた。

この反応液を薄層クロマトグラフィー（Kieselgel 60F254 (Merc k)) 、展開液はジェチルエーテル：メタノール：アンモニア水（ 2 7 %) = 5 0 ： 5 0 ： 2 ) で分離し、基質の減少をニンヒドリンで、生成物 1 一（ 3 , 4—ジメトキシフエ二ル）一 2—プロパノンの生成を 0. 4 % 2 , 4 —ジヒドロフエニルヒドラジンで検出した。生成物の生成が確認できた菌株については、その逆反応を行うことによって（R) 体特異的ァミノ基転移反応活性の有無を調べた。即ち、 0. 6 % 1 — （ 3 , 4 -ジメトキシフエ二ル）一 2—プロパノン、 0. 6 % (R) — 1 一フエニルェチルァミンを含む溶液中に培養した菌体を入れて 3 0 'Cで 2 日間反応させた。その結果、ァルスロバクタ一 ' スビーシーズ KNK 1 6 8株に（R) 体特異的なァミノ基転移活性を認めた。実施例 2

ァルスロパクター · スピーシーズ KNK 1 6 8株を実施例 1 に示す方法によって培養を行う際に、培地中に（R) — 1 一（ 3 , 4 — ジメトキシフエ二ル）一 2 —ァミノプロパン（（R) - D A) の代わりに、（R S ) — 1 一メチルプロピルアミン、（R S) — 1 — メチルプチルァミン、（ R S ) — 3 —アミノー 2， 2 —ジメチルブタン、（R S ) — 2 —アミノー 1 ーブタノール、又は（R S ) - 1 ーフ Xニルェチルァミンを添加した。その培養液から菌体を分離し、この菌体を用いて 1 % 1 — （ 3， 4 ージメトキシフヱニル）一 2 —ブロパノン、 1 % (R S ) - l —メチルプロピルアミンを含む反応液中で 3 0 ^eC、 2 0時間反応を行ったところ、表 4 に示すように反応性の向上がみられた。表 4 誘導物質生成 (R)-DMA

{ % )

(RS) 一 1 一メチルプロピルアミン 22.3

(RS) — 1 — メチルブチルァミン 13.0

(RS) 一 1 一フエニルェチルァミン 8.0

(RS) — 3 —アミノー 2 , 2 —ジメチルブタン 18.6

(RS) — 2 —ァミノ一 1 ーブタノール 12.9

(R) - DMA 0.9

無添加 0.3 実施例 3

ァルスロパクター · スビーシ一ズ KNK 1 6 8株を R培地（ 5 g ZL K H₂ P O 4 > 5 g/L K ₂ H P O * . 3 g/L Ν a C 1、 1 /L M g S 0₄ · 7 Η₂ 0、 0. 0 0 5 g/L F e S 04 · 7 Η₂ 0、 0. 0 0 1 g/L Z n S 04 · 7 Η₂ 0、 0. 0 0 1 g/L M n C 1 2 - 4 H₂ 0 ( ρ H 7. 5 ) 、 1 5 g/L グリセリン、 2 g L 粉末酵母エキス、 8 gZL プロエキス (播州調味料製）、高圧蒸気殺菌後除菌フィルタ一で滤過したピルビン酸、及び（R S ) — 1 一メチルプロビルアミンをそれぞれ最終濃度に 6 gZL、 2. 0 g/Lとなるように添加、 p H 7. 2に調製）に接種して、 3 0 'Cで 2 4時間振通培養した。その培養菌体を遠心分雜により集菌し、 1 % 1 — （ 3， 4 ージメトキシフエ二ル）一 2 —ブロバノン、 0. 1 % トリトン X - 1 0 0 と表 2に示すアミノ供与体 1 %を含む反応液（ p H 8. 5 ) 中に懸濁して 3 5 'C、 2 0時間反応させた。表 5に示すように、（R S ) — 1 ーフェニルェチルァミン、（R S ) — 1 ーメチルブチルァミン、（R S ) 一 1 一メチルプロピルアミン及び（R S) — 2 —ァミノベンタン等がアミノ供与体として働くことがわかったが、（R S ) - l —フェニルェチルアミンが最も良好であった。

表 5

実施例 4

ァルスロバクタ一 · スビーシ一ズ KNK 1 6 8株を R培地で培養して得た菌体を、 2 % 1 — （ 3， 4 ージメトキシフエ二ル）一 2 ーブロバノン、 4 % ( R S ) 一 1 ーフヱニルェチルァミンを含む反応液に懸濁し、表 6 に示す界面活性剤や脂肪酸を添加して、 3 0 て、 p H 8. 5で 2 0時間反応させた。その結果、反応液にドデシル硫酸ナトリウムやリノール酸、ォレイン酸等を添加することによつて、反応率が向上することが判った。表 6

実施例 5

ァルスロパクター · スピーシーズ KNK 1 6 8株を R培地で培養した菌体を用い、 2 % 1 — （ 3 , 4 —ジメトキシフエ二ル）一 2 一プロパノン、 1 . 4 % (R S ) — 1 —フエニルェチルァミン、 0. 1 % ドデシル硫酸ナトリウムを含む反応液の p Hを 7. 5〜 9. 5 まで変化させて 3 5でで 2 0時間反応を行った。その結果、表 7に示すように、 p H 8. 5〜 9. 0での反応率が良好であった反応 P H 生成（R ) - D MA

(%)

7.5 16.8

8.0 30.8

8, 5 40.0

9.0 41.6

9.5 36.1

実施例 6

ァルスロバクタ一 · スピ一シーズ K N K 1 6 8株を 2 リットル容ミニジャーを用い、 1 . 5 リットルの J培地（ 5 g/L K H₂ P 0₄ 、 5 g /L K 2 Η Ρ 0 * , 1 g/L N a C l、 1 /L Μ g S 0 * · 7 Η ₂ 0、 0. 0 0 5 g/L F e S 0₄ · 7 H ₂ 0 、 0. 0 0 1 g/L Z n S 04 · 7 Η ₂ 0、 0. 0 0 1 g/L M n C 1 2 · 4 Η ₂ 0、 0. 0 0 0 5 g /L C u S 0₄ · 5 H ₂ 0 ( p H 7. 5 ) , 4 0 g/L グリセリン、 3 gZL 粉末酵母エキス、 2 0 gZL プロエキス（播州調味料製）、 p H 7. 5 に調整）に 3 0 m 1 の一晚前培養液を植菌し、 3 0て、 0. 5 V V m 、 4 5 0 111で 4 3時間、 p Hを 7. 5 に調整しながら培養した。なお、培養開始後、 1 4時間後に最終濃度 4 gZL となるように除菌フィルターで據過した（ R S ) — 1 —メチルプロピルアミンを添加して培養した。培養終了時の到達菌体濃度（ O D o)は約 2 9 で、その時のトランスアミナ一ゼ活性は培養液当たり 0. 3単位であった。なお、酵素活性単位は、 3 0でで 1 Mの基質 1 一（ 3 , 4 ージメトキシフエ二ル）一 2 —プロパノンを 1 分間で（R) — 1 一（ 3 , 4 —ジメトキシフエニル）一 2 —ァミノプロパンに転換する酵素活性量を示す。

培養液 1 . 5 リットルから集菌した菌体を用いて、 4 5 ^の 1 ー

( 3 , 4 —ジメトキシフエ二ル）一 2 —プノン、 2 8. 3 gの

(R) — 1 一フエニルェチルァミン、 6 5. O gのォレイン酸を含む反応液（ p H 8. 5 ) に懸 ¾し、 3 0 °Cで 3 9時間反応させたところ、基質の 8 1 . 6 %が（R) — l — （ 3 , 4 —ジメトキシフエニル） — 2—ァミノプロパンに転換した。この反応液の p Hを塩酸で 2. 0に調整した後、トルエンを用いて抽出し有機層にケトン類を移行させて分離した。水層の p Hを水酸化ナトリウムで 1 2に調整した後、再びトルエンを用いて抽出したところ、有機層に 3 2.

9 gの（R) - 1 - ( 3 , 4 —ジメトキシフエ二ル）一 2 —ァミノプロパンが含まれていた。この抽出物から蒸留によって目的化合物の分離を試みたところ、その主留画分に 3 0. 3 gの（R) - 1 -

( 3 , 4 —ジメトキシフヱニル）一 2 —アミノブ *ンが含まれていた。この一連の操作による総合収率は、約 6 8. 7 %であり、光学純度は 9 9. 6 % e e (R体）であった。実施例 7

ァルスロバクタ一 ' スピ一シーズ KNK 1 6 8株を 4 0 0 m l の R培地の入った坂口フラスコ中で 3 0 ^eC 3 0時間振盪培養した。集菌後、 4 0 m l の 2 0 mMリン酸カリゥム緩衝液（ p H 6. 8 ) 0. 1 %の 2—メルカブトエタノールに懸濁し、超音波によって菌体を破砕した後、遠心分離により沈殿物を除去して得られる上清として無細胞抽出液 3 4 m 1 を得た。この無細胞抽出液 1 0 m 1 を用い、 0. 5 gの 1 一（ 3 , 4 —ジメトキシフエニル）一 2—ブロパノン、 0. 3 4 gの（R) — 1 — フヱニルェチルァミンを含む 0. 1 M トリス—塩酸緩衝液（ p H 8 . 5 ) よりなる 1 0 0 m 1 の反応液で、 3 0 ^eC、 2 4時間反応させた。その結果、 0. 3 6 gの（R) — ( 3 , 4 —ジメトキシフエ二ル） — 2 —アミノブ口パンが生成した。実施例 8

実施例 7 と同様にしてァルスロパクター · スビーシーズ KNK 1 6 8株を培養し、その l m l から菌体を分離した。これを l m l の 0. 1 Mトリス塩酸緩衝液（ p H 8. 5 ) 、ラセミ体の 1 一（ 3 , 4 —ジメトキシフエ二ル）一 2 —アミノブロノ、'ン 4 0 m g、ピルビン酸 2 0 m g、ドデシル硫酸ナトリウム 2 %を含む反応液に懸濁し、 3 0 °Cで 4 8時間、擾拌しながら反応させた。その反応後の溶液の分析を行ったところ、 1 一（ 3 , 4 — ジメトキシフエ二ル） — 2 —ァミノプロパンが 2 0. 5 m g残存しており、その光学純度は 9 6 % e e ( S体）であった。実施例 9

実施例 6 と同様に、ァルスロパクター，スピーシーズ KNK 1 6 8株を 5 リットル容ミニジャーを用い、 3. 5 リットルの J培地で 3 0。C、 4 3時間培養した。菌体を遠心分雜によって集め、 1 リツトルの 2 0 mMリン酸カリウム緩衝液（ p H 6. 8 ) 、 0. 0 1 % の 2 — メルカプトエタノールに懸濁し、ダイノミル（ Dynomi 11®、スイス）で破砕後、遠心して上清 8 1 0 m 1 を分離した。これに、硫酸プロ夕ミンを 5 O m gZm 1 となるように添加し核酸を除き、 3 0 %飽和となるように硫安を添加して沈澱した蛋白を除いた後、 6 0 %飽和となるように硫安を添加して沈澱した蛋白を分離した。これを上記緩衝液に溶解させ、同緩衝液に対して透析した後、 2 0 % ( vZv ) グリセリン、 0. 3 M N a C 2 0 β Μ ピリドキサールリン酸となるように緩衝液組成を調整後、 D E A E—セフアロース、ファストフロー（フアルマシア）カラム（ 0 4. 4 2 0 c m) にチャージし、 0. 3〜 0. 5 M N a C l 直線濃度勾配によって溶出させた。この活性画分を集め透析後、 0. 2 Mとなるように硫安を添加した後、フエ二ルセファロース（フアルマシア）カラム（ 0 2. 2 X 1 7 c m) にチャージし、 0. 2〜 0 Mの硫安の直線濃度勾配により溶出した。この活性画分の硫安濃度を 0. 6 Mに調整した後、ブチル ' セファロ一ス（フアルマシア）カラム（ 0 2. 2 X 1 7 c m) にチャージし、 0. 6〜 0. 2 M硫安の直線濃度勾配によって溶出した。この活性画分を集め、限外濂過で濃縮した後、 S D S—ボリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、分子量約 3 7， 0 0 0に相当するところに、ほぼ単一のバンドを形成していた。実施例 1 0

実施例 9で得られた精製酵素蛋白を気相プロティンシークェンサ一（ 4 7 O A型、アプライド ' バイオシステム社）にて分析することにより、ァミノ末端付近のアミノ酸配列を調べた。その結果、該酵素は、ァミノ末端付近に、配列表の配列番号： 1 で示される

Glu-Ile-Val-Tyr-Thr-His-Asp-Thr-Gly-Leu-Asp-Tyr

のァミノ酸配列を持つことがわかった。実施例 1 1

実施例 9で得られた精製酵素を用いて、ビルビン酸をアミノ基受容体として、種々のァミノ化合物に対する反応性を調べた。 1 5 0 1 の基質溶液（ 0. 1 Mリン酸カリウム锾衢液（ p H 8. 3 ) 、 4 0 mMピルビン酸、 0. 1 mMピリドキサールリン酸、 4 0 mM 各種ァミノ化合物）に 1 0倍希釈した精製酵素液 1 5 0 1 を添加し、 3 O 'Cで 1 時間反応させた。反応チューブを沸騰水中に移して反応停止後、反応液の一部を 5倍希釈し、その 1 0 1 に 0. 1 M ホウ酸緩衝液（ p H 8. 0 ) 1 0 〃 1、 8 0 mM 4 一フルオロー 7—二トロ - 2 , 1 , 3—ベンゾキサジァゾ一ル（N B D— F ) のエタノール溶液 2 0 1 添加し、 6 0てで 1 分間反応後氷冷し、 5 mM H C 1 4 6 0 1 を添加した。この反応液をファインパック C 1 8 — 5 カラム、 0. 1 M リン酸カリウム緩衝液（ p H 6. 5 ) . C H ₃ C N ( 9 0 ： 1 0 ) を溶離液として高速液体クロマトグラフィ一で分析し、励起波長を 4 7 O n mとし、 5 3 0 mmで N B D化したァラニンの検出を行った。その結果を R— 1 ーフ Xニルェチルアミンを基質とした時の相対活性で表 8 に示す。

表 8から明らかなように（ S ) — 2—フエニルグリシノール、 3 一アミノフヱニルブタン等が良好な反応性を示した。

表 8

実施例 1 2

実施例 9で得られた精製酵素を用いて、（R) — 1 一フニルェチルアミンをァミノ基供与体として、種々のカルボニル化合物に対する反応性について調べた。 2 0 0 1 の基質溶液（ 0. 1 M T r i s · H C 1 緩衝液（ p H 8. 5 ) 、 2 5 mM (R) — 1 一フエニルェチルァミン、 0. I mM ピリドキサールリン酸、 2 5 mM 各種カルボニル化合物）に精製酵素 5 0 1 を添加し、 3 0てで 1 〜 3時間反応させた。反応チューブを沸騰水中に移して反応停止後、反応液をメタノールで 5倍希釈した。この希釈液をファインパック C 18— 5 カラムで、メタノール一水（ 2 0 ： 8 0 ) を溶雜液として、高速液体クロマトグラフィーで分析し、反応により生成したァセトフエノンの定量を行つた。その時の結果をピルビン酸を基質とした時の相対活性で表 9 に示す。表 9から明らかなように、ォキザ口酢酸ゃフノキシー 2 —プロパノン等も良好な反応性を示した表 9 化合物相対活性（％ )

ピルビン酸 100

ォキザロ齚酸 87

グリォキシル酸 4

2 - ケト酪酸 7

ピルビン酸ェチル 27

ァセト醉酸ェチル 4

2 — デカン 3

4 — メトキシフエ二ルアセトン 1

1 - (3. 4ージメトキシフェニル）ー2—プ πバ/ン 7

ベンジルアセトン 3

A- -i (·キシフェニル）一 2—プタノン 7

1 ーフ X ニル一 2 — ブタノン 1

フエニルァセトアルデヒド 13

ベンブイル齚酸ェチル 2

フエノキシ一 2 — プロパノン 83

ジァセチル 10

1 — メトキシ一 2 — ブロノノン 16

1 ーテトラロン 1

2 — ァセチルビリジン 19

3 一ァセチルビリジン 8

4 一ァセチルビリジン 27

3 — ァセトキシビリジン 1

2 一ァセチルビラジン 17

2 — ァセチルフラン 2

2 — ァセチルチオフェン 1

2 一ァセチルチアブール 10 実施例 1 3

実施例 7 と同様にしてァルスロバクタ一 · スピーシーズ KNK 1 6 8株を培養し、その l m l から菌体を分離した。これを l m l の 0. 1 M トリス塩酸緩衝液（ p H 8. 5 ) 、 1 0 0 mM (R) -

1 —フエニルェチルァミン、 l O O mM メトキシ一 2—プロパノン、 0. 1 % ドデシル硫酸ナトリウムを含む反応液に懸濁し、 3 0 °Cで 2 0時間擾拌しながら反応させた。この反応液の分析を行ったところ、基質であるメトキシー 2 —プロパノンがほとんど消失して

2 —アミノー 1 ーメトキシプロパンに転換しており、その光学純度は 9 9. 4 % e e (R体）であった。実施例 1 4

実施例 1 3 と同様にしてァルスロバクタ一 · スビーシーズ KNK 1 6 8株を培養し、その l m l から菌体を分離した。これを l m l の 0. 1 M トリス塩酸緩衝液（ p H 8. 5 ) 、ラセミ体の 2 —アミノー 1 — メトキシプロパン 5 0 m g、ピルビン酸 3 7. 5 m g、ドデシル硫酸ナトリウム 0. 1 %を含む反応液に懸濁し、 3 0。Cで 2 4時間、攬拌しながら反応させた。この反応後の分折を行ったところ、 2 —アミノー 1 ーメトキシプロパンが 2 3. 4 m g残存しており、その光学純度は 9 5 % e e ( S体）であった。実施例 1 5

実施例 1 4 と同様の反応で、 2 0 0 mMのラセミ体の 2 -ァミノ一 1 ーメトキシプロパン、 1 5 O mMの n—ブチルアルデヒド又はブロピオンアルデヒドを用い、 3 0 °Cで 2 0時間反応させた。その分析の結果、（ S ) 体の 2—アミノー 1 ーメトキシプロパンが濃縮されており、（S) 体の比率が、 n—ブチルアルデヒドを用いた場合で 7 6 %、ブロピオンアルデヒドを用いた場合で 5 8 %となっていた。実施例 1 6

実施例 9で得られた精製酵素を用いて、 p Hが活性に及ぼす影響を調べた。 2 0 m o l 1 - ( 3, 4—ジメトキシフエニル）一 2—ブロバノン、 2 0〃m o l (R) — 1 —フエニルェチルアミン及び 1 〃m o 1 ピリドキサールリン酸を含み、以下に示す緩衝液によって p Hを調整した 0. 9 m l の溶液に、適当に希釈した酵素液 0. l m】を添加し、 3 0でで 1時間反応させた。使用した緩衝液はいずれも最終濃度 0. 1 Mで St酸バッファー（CH₃ C OON aと省略、 p H 4〜 6 ；リン酸カリウムバッファー（K P B、 p H 5〜 8〉及びトリス ' 塩酸バッファー（T r i s ' HC l、 p H 7 〜 1 0 ) である。反応後の反応液について生成した（R) - DMA を高速液体クロマトグラフィーで定量し、 p H 8. 5の活性を 1 0 0 としてそれぞれの p Hでの相対活性を第 1図に示した。本酵素は、 p H 8. 5付近（p H 7. 5〜 9. 0 ) が至適 p Hであることがわかった。実施例 1 7

実施例 9で得られた精製酵素を用いて、 p Hが酵素の安定性に及ぼす影響を調べた。酵素液の p Hを HC 1又は N a OHで調整後、 2 0 'Cで 2 3時間保温した後、実施例 1 6 と同様にして p H 8. 5 で反応させ、生成した（R) — DMAを定量した。その結果を未処理の酵素液の活性を 1 0 0 %として各々の p Hでの処理サンプルの活性を相対活性で第 2図に示した。本酵素は、 P H 7付近が最も安定であることがわかった。産業上の利用可能性

本発明により、従来合成の困難であった 1位にァリール基等を有する光学活性な（R) —ァミノ化合物等を高収率で容易に製造することが可能となる。寄託された微生物への言及

① 寄託機関の名称 · あて名

通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所

日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1 番 3号（郵便番号 3 0 5 )

② 寄託日

平成 7年 9月 8 日（原寄託日）

③ 受託番号

F E RM B P— 5 2 2 8

配列表一般情報：

出願人：

氏名又は名称：鐘淵化学工業株式会社

住所又は居所：大阪府大阪市北区中之島 3丁目 2番 4号所在国：日本国

郵便番号： 5 3 0 発明の名称：光学活性なァミノ化合物の製造方法配列の数： 1 配列番号： 1 に関する情報：

配列の特徴

配列の長さ： 1 2

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ぺプチド

配列：配列番号： 1

Glu lie Val Tyr Thr His Asp Thr Gly Leu Asp Tyr

1 5 10

Claims

請求の範囲

1 . 下記一般式（ I )

X— （ C H₂) ( C H₂)_n - C H ( I )

(式中、 nは 0〜 5、 mは 0又は 1、 Xは炭素数 6〜 1 4の無置換のァリール基；炭素数 4〜 1 5のアルキル基、水酸基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、沃素原子、ニトロ基、およびカルボキシル基からなる群より選択される 1 種以上の置換基を有する炭素数 6〜 1 4のァリール基；又はメトキシ基を示す。）

で示されるケトン化合物（ァミノ受容体）と、一般式

Η

(式中、 X , 、 X 2 はそれぞれ独立して、水素原子；炭素数 1 〜 1 0の直鎖アルキル基；炭素数 5〜 1 2の分岐アルキル基；炭素数 6 〜 1 4の無置換のァリール基；又は炭素数 1 〜 4のアルキル基、水酸基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、沃素原子、ニトロ基、およびカルボキシル基からなる群より選択される 1種以上の置換基を有する炭素数 6〜 1 4のァリール基を示す。）

で示される非キラールもしくはラセミ体又は（R ) 体のアミノ化合物（ァミノ供与体）の共存下、（R) 体特異的なトランスアミナーゼを作用させることにより、立体選択的にアミノ基転移を行い、一般式 (IV) (R) - X - (C H₂)n - C H - (CH₂),n - C H₃ (IV)

NH₂

で示される光学活性な（R) —ァミノ化合物を得ることを特徴とする、光学活性な（R) —ァミノ化合物の製造方法。

2. —般式（II) の X , が炭素数 2〜 1 0のアルキル基、フヱニル基、ナフチル基であり、 X₂ が炭素数 1又は 2のアルキル基であることを特徴とする請求項 1記載の光学活性な（R) —ァミノ化合物の製造方法。

3. —般式（II) で示されるアミノ供与体が、 D—ァラニンの炭素数 1〜 8のアルキルエステルであることを特徴とする請求項 1記載の光学活性な（R) —ァミノ化合物の製造方法。

4. 一般式（II) で示されるアミノ供与体が、（R) — 1 一フエ二ルェチルァミン、（R) — 1 一ナフチルェチルァミン、（R) — 1 一メチルプロピルァミン、（R) — 2—ァミノベンタン、（R) — 2—アミノー 1 —プロバノール、（R) — 1 一メチルブチルアミン、（R) — 1 —フエニルメチルァミン、（R) — 1 —アミノー 1 一フエニルエタノール、（R) — 2—アミノー 2— フエニルエタノール、（R) — 3—ァミノへブタン、（R) — 1 一アミノー 3— フエニルプロパン、（R) — 2—アミノー 4一フエニルブタン、（R) 一 2—アミノー 3—フエニルブロバノール、（R) — 3, 4 — ジメトキシァミノブロノ、 'ン、（R) - 1 一メチルヘプチルアミン、ベンジルァミン、（S) — 2— フエニルグリシノール、 3—ァミノフエニルブタン、 L— フエ二ルァラ二ノール、（R) — 2—ァミノ一 1 ーメトキシプロパン、 D—ァラニンメチルエステル、若しくは D— ァラニンェチルエステルである又はこれらの化合物のラセミ体である請求項 1記載の光学活性な（R) -ァミノ化合物の製造方法。

5. —般式（ I ) および一般式（IV) の n、 mが n = 1、 m = 0であることを特徴とする、請求項 1〜請求項 4いずれか 1項に記載の光学活性な（R) —ァミノ化合物の製造方法。

6. —般式（ I ) および一般式（IV) の Xが、フヱニル、 2— メトキシフエニル、 3— メトキシフエ二ル、 4— メトキシフエニル、 2 , 4ージメトキシフヱニル、 3, 4— ジメトキシフヱニル、又はメトキシであることを特徴とする、請求項 1〜請求項 5いずれか 1項に記載の光学活性な（R) —ァミノ化合物の製造方法。

7. 一般式（ I ) で示されるァミノ受容体と一般式（II) で示されるァミノ供与体を（R) 体特異的なトランスアミナーゼを生産する微生物の培養物、分離した菌体、菌体処理物、又は固定化菌体と接触せしめることを特徵とする請求項 1〜請求項 6いずれか 1項に記載の光学活性な（R) -ァミノ化合物の製造方法。

8. —股式（ I ) で示されるアミノ受容体と一般式（II) で示されるァミノ供与体を（R) 体特異的なトランスアミナ一ゼを生産する微生物の無細胞抽出物、粗精製酵素、精製酵素、又は固定化酵素と接触せしめることを特徵とする請求項 1 〜請求項 6いずれか 1 項に記載の光学活性な（R) -ァミノ化合物の製造方法。

9. 該トランスアミナーゼを生産する微生物がァルスロバクタ一（ A r t h r o b a c t e r ) 厲に厲する微生物である請求項 1 〜請求項 8いずれか 1項に記載の光学活性な（R) -ァミノ化合物の製造方法。

1 0. 該ァルスロバクター属に属する微生物がァルスロパクター ■ スビーシ一ズ（A r t h r o b a c t e r s p . ) K N K 1 6 8

( F Ε RM B P— 5 2 2 8 ) である請求項 9記載の光学活性な（ R) —ァミノ化合物の製造方法。

1 1 . 該トランスアミナーゼを生産する微生物を培養する際に、該酵素の誘導物質として（R S ) - l —メチルプロピルァミン、（R S ) 一 1 —フエニルェチルアミン、（R S ) — 1 一メチルプチルァミン、（R S ) — 3 —アミノー 2 , 2—ジメチルブタン、（R S ) 一 2 —アミノー 1 ーブ夕ノール、及び（R) 又は（R S ) — 1 一（ 3， 4 ージメトキシフヱニル）ァミノプロパンからなる群より選択される 1 種以上を培地に添加することを特徴とする請求項 1 〜請求項 1 0いずれか 1項に記載の光学活性な（R) -ァミノ化合物の製造方法。

1 2. アミノ基転移反応において、 5以上 1 2以下の p Hで反応を行うことを特徴とする請求項 1 記載の光学活性な（R) —ァミノ化合物の製造方法。

1 3. アミノ基転移反応において、反応時に反応促進物質として界面活性剤又は脂肪酸を添加して反応を行うことを特徴とする請求項 1記載の光学活性な（R) —ァミノ化合物の製造方法。

1 4. —股式（III) で示されるケトン化合物（ァミノ受容体）の存在下、一般式（V) で示されるラセミ体のアミノ化合物に（R) 体特異的な卜ランスアミナーゼを作用させることにより、立体選択的にァミノ基転移反応を行い、一般式（VI) で示される光学活性な（ S) ーァミノ化合物を得ることを特徴とする、光学活性な（S) — ァミノ化合物の製造方法。

X

>= 〇

X

H

( S) —X— (CH₂) C - (CH₂)_n - C H₃ (V)

NH₂

H

( S ) 一 X— (CH₂)_n 一 C一（ C H ₂)„ C H (VI)

NH₂

1 5. ァルスロバクタ一属に属する微生物の培養により得ることのできる、（R) 体特異的なトランスアミナーゼ。

1 6. 酵素蛋白のァミノ末端付近に、

Glu-Ile-Val-Tyr-Thr-His-Asp-Thr-Gly-Leu-Asp-Tyr

のァミノ酸配列を持つ、請求項 1 5記載の（R) 体特異的なトランスァミナーゼ。