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WO1997013860A1 - Sous-unite tbp2 de neisseria meningitidis - Google Patents

Sous-unite tbp2 de neisseria meningitidis Download PDF

Info

Publication number
WO1997013860A1
WO1997013860A1 PCT/FR1996/001580 FR9601580W WO9713860A1 WO 1997013860 A1 WO1997013860 A1 WO 1997013860A1 FR 9601580 W FR9601580 W FR 9601580W WO 9713860 A1 WO9713860 A1 WO 9713860A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tbp2
gly
lys
ala
thr
Prior art date
Application number
PCT/FR1996/001580
Other languages
English (en)
Inventor
Marie-José Quentin-Millet
Bachra Rokbi
Original Assignee
Pasteur Merieux Serums & Vaccins
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pasteur Merieux Serums & Vaccins filed Critical Pasteur Merieux Serums & Vaccins
Priority to AU72213/96A priority Critical patent/AU720789C/en
Priority to JP9514773A priority patent/JPH11500630A/ja
Priority to EP96933511A priority patent/EP0796332A1/fr
Publication of WO1997013860A1 publication Critical patent/WO1997013860A1/fr
Priority to NO972314A priority patent/NO972314L/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the subject of the present invention is a new variant of the Tbp2 subunit of the Neisseria meningitidis transferrin receptor, its use as a medicament, as well as the DNA fragment coding for this variant.
  • meningitis is either of viral origin or of bacterial origin.
  • the bacteria mainly responsible are: N. meningitidis and Haemophilus in ⁇ uen ⁇ ae, respectively involved in approximately 40 and 50% of cases of bacterial meningitis.
  • the N. meningitidis species is subdivided into serogroups according to the nature of the capsular polysaccharides. Although there are a dozen serogroups, 90% of meningitis cases are attributable to 3 serogroups: A. B and C.
  • N. meningitidis group B is not or little immunogenic in humans, whether it is in conjugated form or not. Thus, it appears highly desirable to seek a vaccine against meningitis induced by N meningitidis, in particular serogroup B. other than a polysaccharide-based vaccine.
  • transferrin and lactoferrin since the amount of iron in free form is negligible in humans (of the order of 10 * 18 M), in any case insufficient to allow bacterial growth.
  • N. meningitidis has a receptor for human transferrin and a receptor for human lactoferrin which allow it to fix these iron chelating proteins and subsequently capture the iron necessary for its growth.
  • the transferrin receptor of the N. meningitidis B16B6 strain was purified by Schryvers et al (WO 90/12591) from a membrane extract.
  • This protein as purified appears essentially made up of 2 types of polypeptides: a polypeptide of a high apparent molecular weight of 100 kDa and a polypeptide of a lower apparent molecular weight of approximately 70 kDa, as revealed after electrophoresis on gel of polyacrylamide in the presence of SDS.
  • the purification product used in particular by Schryvers is by definition arbitrary and for the purposes of this patent application, called the human transferrin receptor (RTH) and the polypeptides constituting it, subunits.
  • RTH human transferrin receptor
  • the high molecular weight and lower molecular weight subunits are respectively called Tbpl and Tbp2.
  • the recognition of the transferrin receptor subunits is revealed by addition of a rabbit anti-immunoglobulin antibody coupled to peroxidase, then by addition of the substrate for this enzyme.
  • Tables I and II below indicate the profile of certain representative strains as it appears on 7.5% polyacrylamide gel after electrophoresis in the presence of SDS; the bands are characterized by their apparent molecular weights expressed in kilodaltons (kDa):
  • NB In brackets, the serogroup is indicated in order. the serotype. subtype and immunotype. e »e> o
  • NB In brackets, the serogroup, the serotype, the subtype and the immunotype are indicated in order. ns * o- * (Jt ce o
  • the first type corresponds to strains which have a receptor whose 2 subunits under the experimental conditions used, are recognized in Western blot by the anti-receptor antiserum IM2394, while only the high subunit molecular weight is recognized by the anti-receptor antiserum IM2169.
  • the second type corresponds to strains which have a receptor whose 2 subunits under the experimental conditions used, are recognized in Western blot by the anti-receptor antiserum IM2169, while only the high subunit molecular weight is recognized by the anti-receptor antiserum IM2394.
  • strains of type M982 are, for example, strains S3032 (12. P 1.12.16). 6940 (19. P 1.6). M978 (8. P 1.1, 7). 2223 (B: nd). 1610 (B: nd), C708 (A: 4. P 1.7), M981 (B: 4). also called 891. and 2996 (B: 2b, P 1.2).
  • strain IM2154 (serogroup C) is cited by way of example as being of type B16B6.
  • the protein Tbp2 rather than Tbpl, has a number of characteristics which make it a potential vaccine candidate: ubiquitous expression, accessibility to the surface of the germ, the capacity to induce neutralizing antibodies and limited variability since as this has just been exposed, two major groups have been identified to date.
  • compositions have already been proposed containing:
  • Tbp2 from at least one type B 16B6 strain and Tbp2 from at least one type M982 strain (WO 93/7172).
  • Tbp2 M982 and Tbp2 B16B6 were fixed as shown in the table below, indicating the position of the amino acids, bounds included for the different domains, and by reference to the numbering appearing in SEQ ID NO 1 and 3.
  • This definition also applies to all Tbp2s of type M982 or B16B6, after alignment of a sequence type M982 or B16B6 on the reference sequence, to the maximum of homology.
  • the position of the domains of the Tbp2 subunit of the strain 8680 is indicated as follows: first domain (1 - 334), second domain (335 - 530) and third domain (531 - 677).
  • the N-terminal or first domain includes in its entirety the transferrin binding site and is therefore most likely exposed to the outside. Consequently, the N-terminal domain alone constitutes an element of choice for purposes i ci. vaccine.
  • the hinge region of strains of the M982 type constitutes a major problem in the production of a vaccine.
  • this region is immunodominant, during an immunization, the antibodies induced will be directed mainly against this region and consequently the immune response will be specific for the protein Tbp2 of the homologous strain.
  • Tbp2s of type M982 no longer whole Tbp2s of type M982, but Tbp2s at least deleted from their four hyper ⁇ 'ariables portions or, alternatively, deleted from the second and third domains.
  • composition of choice Since an essential region for the induction of broad spectrum immunity is probably the first domain, a pharmaceutical composition of choice has appeared to be, for example, at least composed:
  • Tbp2 M982 protein (100% Tbp2);
  • Tbp2 M982 protein comprising only the first 350 N-terminal amino acids (Tbp2 50%);
  • Tbp2s proteins were first produced in E. coli by the recombinant route.
  • Tbp2 M982 its production is described in EPA 586 266 (published March 9, 1994).
  • Those of the other two Tbp2s M982 are reported in Examples 4 and 6 of the present application.
  • Example 8 The preparation of hyperimmune sera and the analysis of these sera. preliminary to the immunodominance study. is the subject of Example 8 of the present application. The study of cross-reactivity is the subject of more details in Example 9.
  • strains classified as type M982 either by analysis of the outer membrane proteins by SDS-Page electrophoresis followed by immunorevelation. either on the basis of the size of the tpb2 gene amplified by PCR, were studied in dot blot (analysis on whole genes) for their cross reactivity (see Example 9). These strains were obtained free of charge from Dr D.A. Caugant. They have been isolated in very diverse regions of the world and at different times. Therefore, this collection should be representative. 14 strains are not recognized by the anti-Tbp2 M982 100% serum, while only 4 escape recognition by the anti-Tbp2 M982 80% serum and 1 by the anti-Tbp2 M982 50% serum.
  • the subject of the invention is a protein in substantially purified form, which is the lower molecular weight subunit (Tbp2) of the human transferrin receptor (RTH) of a strain of N. meningitidis; the strain being characterized in that it is not recognized in dot blot by an antiserum obtained against a polypeptide corresponding to the Tbp2 of the strain N.
  • Tbp2 the lower molecular weight subunit
  • RTH human transferrin receptor
  • Tbp2 M982 meningitidis M982 (Tbp2 M982) deleted from the hypervariable portions of its hinge region (Tbp2 M982 ⁇ 362 - 379; ⁇ 418 - 444; ⁇ 465 - 481; ⁇ 500 - 520); and the Tbp2 subunit being characterized (i) in that it is encoded by a DNA fragment of approximately 2.1 kb.
  • the Tbp2 subunit according to the invention is characterized (i) in that it is encoded by a DNA fragment of approximately 2.1 kb
  • the strain of N. meningitidis which it derives is itself characterized in that its genome comprises an open reading frame (ORF) coding for said Tbp2 subunit of approximately 2.1 kb.
  • the protein according to the invention is encoded by a DNA fragment of approximately 2.1 kb. it is quite obvious, given what has been said previously, that this protein has a hinge region of the M982 type.
  • Tbp2 protein derived from this strain therefore very particularly constitutes a vaccine candidate of choice.
  • a Tbp2 subunit according to the invention advantageously derives from a strain of N. meningitidis which is not recognized in dot blot by an antiserum obtained against a fragment of Tbp2 M982 ranging from the amino acid in position 1 to the amino acid in position 350, that is to say against a polypeptide corresponding to the Tbp2 of the strain N. meningitidis M982 substantially deleted from the second and third domains.
  • a Tbp2 subunit according to the invention derives in particular from a strain of N. meningitidis whose Tbp2 subunit is recognized in Western blot of membrane fractions by an antiserum obtained against the RTH of the strain M982 (anti antiserum -RTH M982) and by an antiserum obtained against the RTH of the strain B 1616 (anti-RTH antiserum B16B6).
  • antisera have been described in patent application WO 93/6861.
  • a Tbp2 subunit according to the invention comprises an amino acid sequence whose degree of homology (of identity) with the amino acid sequence of Tbp2 M982, as shown in ID SEQ No. 1 , is from 60 to 70%, advantageously about 65%.
  • a Tbp2 subunit according to the invention comprises an amino acid sequence whose degree of homology with the amino acid sequence of Tbp2 8680, as shown in ID SEQ No. the amino acid in position 1 to the amino acid in position 677. is from 80 to 100%, advantageously from 90 to 100%. preferably from 95 to 100%.
  • it comprises an amino acid sequence substantially as shown in ID SEQ No. 5 starting with the amino acid residue in position 1 and ending with the amino acid residue in position 677.
  • a Tbp2 subunit according to the invention can be in dissociated form from the high molecular weight subunit (Tbpl) of the N. meningitidis strain from which Tbp2 is derived or else in association with this Tbpl, thus forming a complex Tbpl-Tbp2 considered to be the receptor for human transferrin.
  • Tbpl high molecular weight subunit
  • the Tbp2 subunit according to the invention must be substantially purified; that is to say separate from the environment in which it exists in a natural way. Among others, it may be a preparation in particular devoid of the cytoplasmic and periplasmic proteins to H. pylori.
  • the invention also relates to an isolated DNA fragment coding for a protein according to the invention as well as for a precursor of this protein; the latter comprising a signal peptide homologous or heterologous to the protein according to the invention.
  • a DNA fragment coding for a protein according to the invention is described in ID SEQ NO 5 from nucleic acid in position 30 to nucleic acid in position 2061.
  • a DNA fragment coding for a precursor of a protein according to the invention is described in ID SEQ NO 5 from nucleic acid in position 1 to nucleic acid in position 2061.
  • a DNA fragment according to the invention can also comprise a nucleic acid sequence other than that shown in ID SEQ NO 5 provided that it can hybridize to the DNA fragment shown in ID SEQ NO 5, under conditions of high stringency.
  • Hybridization methods as well as the implementation of high stringency conditions are within the reach of those skilled in the art.
  • hybridization procedures are described in Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc .. 1994; Silhavy et al. Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Lab .. 1984: Davis et al, A Manual for Genetic Engineering: Advanced Bacterial Genetics, CSH Lab .. 1980.
  • important parameters are indicated which must be taken into account in order to optimize the conditions. of hybridization, are found in the formula which makes it possible to calculate a critical value, the melting temperature (Tm), above which two complementary strands separate (Casey & Davidson, Nucl. Acid Res.
  • Tm melting temperature
  • Tm 81.5 + 0.5 X (% G + C) + 1.6 log (positive ion concentration) - 0.6 X (% formamide).
  • the hybridization temperature is about 20-25 ° C below the melting temperature as calculated.
  • high stringency conditions are obtained by carrying out pre-hybridization and hybridization incubations for 4 - 16 hrs, at approximately 55 - 60 ° C, in 6 x SSC solution (1 M NaCl, 0.1 M sodium citrate . pH 7.0).
  • the invention also relates to (i) a polypeptide derived in particular by deletion of a Tbp2 subunit according to the invention; and (ii) an isolated DNA fragment coding for such a polypeptide.
  • a polypeptide having an amino acid sequence which derives from that of a Tbp2 subunit according to the invention, the first, second and third domains of which are defined by alignment to the maximum of homology, on the sequence of the Tbp2 subunit of the reference strain M982; in particular by total or partial deletion of at least one domain of said Tbp2 subunit according to the invention, provided that the first and second domains are not simultaneously and completely deleted.
  • sequence which derives from another sequence is obviously understood a sequence resulting by intellectual process from this other sequence.
  • it is a polypeptide capable of binding to human transferrin and derived from a Tbp2 subunit according to the invention, in particular by deletion of one or more amino acids located on the side of the C-terminus or in the region of the first forty amino acids of the Tbp2 subunit.
  • the C-terminal end is defined as being the part of Tbp2 corresponding to the second and third domains.
  • a polypeptide according to the invention has an amino acid sequence which derives from a Tbp2 subunit according to the invention:
  • a polypeptide according to the invention has a partial, almost total or total deletion of the third domain, preferably total.
  • the first as well as the second domain can be maintained in their entirety, partially or totally deleted; this independently of each other.
  • the following combinations are possible (knowing that the first, second and third domains in their entirety are respectively represented by 1, 2 and 3, and that O and ⁇ mean respectively, partially and totally deleted):
  • polypeptide derived from a Tbp2 subunit according to the invention by partial deletion of the second domain, which comprises in their entirety or almost entirely the first and third domains; or the combination 1, O 2.3.
  • a polypeptide according to the invention can also respond to the combination Ol .02, 3, the partial deletion of the first domain advantageously covering all or part of the region homologous to that of Tbp2 M982, ranging from the amino acid in position 1 to the amino acid approximately in position 40.
  • this partial deletion relates substantially to one or more regions of the second domain which are the homologs of the regions of the sequence M982 going:
  • a partial deletion of the second domain relates substantially to one or more hypervariable portions. These portions are, after alignment to the maximum of homology, the counterparts of the portions of the sequence M982 going:
  • the partial deletion relates simultaneously to the four portions (i) to (iv) described above.
  • the almost integral deletion of the second domain extends over the region which is the homolog of the region of the second domain of the Tbp2 M982 subunit ranging from the amino acid in one of the positions 346 to 361 with the amino acid in position 543.
  • this partial deletion advantageously relates to all or part of the region which is the homolog of the region of the first domain of the sub - Tbp2 unit of type M982 going from the amino acid in position 1 to the amino acid in position 281.
  • a deletion of interest relates to all or part of the region which is the homolog of the region of the first domain of said Tbp2 subunit of type M982 ranging from acid amino in position 1 to the amino acid approximately in position 40.
  • the degree of homology can be easily calculated by aligning the sequences so as to obtain the maximum degree of homology; to do this, it may be necessary to artificially introduce vacant spaces, as illustrated in the Figure 1. Once the optimal alignment is achieved, the degree of homology is established by counting all the positions in which the amino acids of the two sequences are found identically, compared to the total number of positions.
  • polypeptide according to the invention is cited, the sequence of which has at least 70-75%, advantageously at least 80%. preferably at least 90%. most preferably 100% homology with:
  • a polypeptide according to the invention has an amino acid sequence which comprises at least 10, advantageously at least 20. preferably at least 50, most preferably at least 100 amino acids.
  • a polypeptide according to the invention can also additionally comprise an amino acid sequence which does not have any homology with the sequences of the Tbp2 subunits according to the invention.
  • an additional sequence can be that of any other polypeptide to the exclusion of Tbp2.
  • an additional sequence may be that of a signal peptide located in the N-terminal position of a polypeptide according to the invention.
  • Examples of signal sequence are shown in ID SEQ Nos. 1 to 4.
  • an appropriate heterologous signal sequence may be a signal sequence found in the precursor of a lipoprotein.
  • a Tbp2 subunit according to the invention can be directly purified from the native strain or advantageously, obtained by recombinant route in a heterologous or homologous expression system.
  • the polypeptides according to the invention are preferably recombinant products.
  • the DNA fragment coding for the Tbp2 of strain 8680 was cloned and sequenced.
  • the subject of the invention is therefore also:
  • the DNA fragment according to the invention may or may not be associated with a DNA block coding for a heterologous signal peptide or not. to the polypeptide encoded by said DNA fragment, depending on whether or not secretion of the polypeptide is sought. Preferably, this secretion will be sought.
  • signal region or a promoter already exist in fairly large numbers and are known to the skilled person. His general skills will allow him to choose a particular signal region or promoter which will be adapted to the host cell in which he envisages expression.
  • the host cell can be a mammalian cell, a bacterium or a yeast; the latter two being preferred. Again, the choice of a particular line is within the reach of the skilled person.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as active principle, a Tbp2 subunit or a polypeptide according to the invention.
  • a pharmaceutical composition according to the invention is in particular useful for inducing an immune response in humans against N meningitidis, inter alia a vaccine effect so as to protect humans against infections with N meningitidis, in prevention or in therapy.
  • composition according to the invention can also comprise:
  • ⁇ ⁇ a polypeptide capable of binding human transferrin and derived from a Tbp2 subunit of N meningitidis whose Tbp2 subunit is not recognized in Western blot of membrane fractions by an anti-RTH M982 antiserum and is recognized by a anti-RTH antiserum B16B6, in particular by deletion of one or more amino acids located on the side of the C-terminal end of the Tbp2 subunit.
  • composition according to the invention advantageously comprises at least one, preferably two additional elements chosen from the four set out above.
  • the additional Tbp2 subunit of type M982 advantageously comprises an amino acid sequence the degree of homology of which with the amino acid sequence of Tbp2 M982, as shown in ID SEQ No. 1, is 90 100 %. It is preferably the Tbp2 M982 subunit.
  • the additional type B 16B6 Tbp2 subunit advantageously comprises an amino acid sequence the degree of homology of which with the amino acid sequence of Tbp2 B16B6, as shown in ID SEQ No. 3, is 90 to 100%. It is preferably the Tbp2 B 16B6 subunit.
  • the additional polypeptide (ii) derives from a Tbp2 subunit of a strain of N. meningitidis whose Tbp2 is recognized in Western blot of membrane fractions by an anti-RTH M982 antiserum and is not recognized by an anti-RTH B16B6 antiserum. in particular by partial deletion of the second domain, inter alia by substantial deletion of the hypervariable regions of the second domain of the Tbp2 subunit or by substantial deletion of the second or third domain of the Tbp2 subunit.
  • this polypeptide is derived from a Tbp2 subunit which comprises an amino acid sequence whose degree of homology with the amino acid sequence of Tbp2 M982, as shown in ID SEQ No. 1. is 90 to 100%.
  • it is a polypeptide which is derived from Tbp2 M982.
  • the additional polypeptide (iv) derives from a Tbp2 subunit of a strain of N. meningitidis whose Tbp2 is not recognized in Western blot of membrane fractions by an anti-RTH M982 antiserum and is recognized by an anti antiserum -RTH B 16B6. in particular by substantial deletion of the second or third domain of the Tbp2 subunit, preferably of the second and third domains.
  • this polypeptide derives from a Tbp2 subunit which comprises an amino acid sequence whose degree of homology with the amino acid sequence of Tbp2 M982. as shown in ID SEQ No 3, is 95 to 100%
  • it is a polypeptide which derives from Tbp2 B16B6
  • composition according to the invention comprises
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be manufactured in a conventional manner.
  • the polypeptide (s) according to the invention are combined with an adjuvant, a diluent or a support acceptable from a pharmaceutical point of view.
  • a composition according to The invention can be administered by any conventional route used in the field of vaccines, in particular by the subcutaneous route, by the intramuscular route or by the intravenous route, for example in the form of an injectable suspension. can be given as a single dose or repeated once or several times after a certain interval The appropriate dosage varies depending on various parameters, for example, the individual treated or the method of administration
  • Figure 1 respectively show the alignments of the Tbp2 M982 and 8680 sequences. Maximum homology according to the Kanehisa program (Bisance ISIC-2). The degree of homology is 65%.
  • Figure 2 shows the maximum homology alignments of the sequences of the hinge domains (second domain) of Tbp2 M982 (1). 6940 (2), 2223 (3), C708 (4), M978 (5), 1610 (6), 867 (7), S3032 (8) and 981 (9). In italics is given the numbering of the sequence of Tbp2 M982, as it appears in ID SEQ NO 1. In bold appear the sequences of the hypervariable portions which can be deleted according to a preferred mode. (C) indicates the consensus sequence.
  • Figures 3 to 5 respectively illustrate the construction of plasmids pTG5782. pTG5755 and pTG5783.
  • a freezing of the strain N. meningitidis 8680 is taken up in approximately 1 ml of Muller Hinton broth (BMH, Difco). The bacterial suspension is then spread on the Muller Hinton solid medium containing cooked blood (5%).
  • the purification method is essentially as described by Schryvers et al (supra).
  • the bacterial pellet obtained in IA is thawed, then resuspended in 200 ml of 50 mM Tris HCl buffer, pH 8.0 (buffer A). The suspension is centrifuged for 20 min at 15,000 xg at 4 ° C. The pellet is recovered, then resuspended in buffer A at the final concentration of 150 g / 1. 150 ml fractions are treated for 8 min at 800 bars in a cell lyser working under high pressure (Rannie, model 8.30H). The cell lysate thus obtained is centrifuged for 15 min at 4 ° C at 15,000 x g. The supernatant is recovered and then centrifuged for 75 min at 4 ° C at 200,000 x g.
  • the pellet After removing the supernatant, the pellet is taken up in buffer A and after assaying proteins according to Lowry, the concentration of the suspension is adjusted to 5 mg / ml. To 1.4 ml of the membrane suspension is added 1.75 mg of biotynylated human transferrin according to the method described by Schryvers. The final concentration of the membrane fraction is 4 mg / ml. The mixture is incubated for 1 hour at 37 ° C. and then centrifuged at 100,000 xg for 75 min. at 4 ° C. The membrane pellet is taken up in buffer A containing 0.1 M NaCl and incubated for 60 min. at room temperature.
  • the resin is washed with 3 column volumes of 50 mM Tris-HCl buffer pH 8.0 containing IM NaCl, 10 mM EDTA 0.5% Sarkosyl (buffer B) and then with one column volume of buffer B containing guanidine HCl 750 mM.
  • the transferrin receptor is then eluted by buffer B containing guanidine HCl 2M.
  • the eluate is collected as a fraction, the volume of which corresponds to IV. in tubes containing IV of 50 mM Tris HCl pH 8.0. NaCl IM.
  • the optical density at 280 nm of the eluate is measured at the column outlet using a UV detector.
  • the fractions corresponding to the elution peak are collected and dialyzed against 10 mM phosphate buffer. pH 8.0 containing 0.05% Sarkosyl and lyophilized The lyophilisate is taken up in water at a concentration 10 times higher. The solution is dialyzed a second time against 50 mM phosphate buffer pH 8.0 containing 0.05% Sarkosyl (buffer C) then the solution is filtered through a membrane with a porosity of 0.22 ⁇ m.
  • the culture of the strain N. meningitidis 8640, as well as the purification steps up to the preparation of the membrane suspension are carried out under conditions identical to those described in Example 1.
  • the resin is washed with 3 column volumes of 50 mM Tris-HCl buffer pH 8.0 containing 1 M NaCl, 0.5 m EDTA 10 mM Sarkosyl (buffer B) and then with one column column of buffer B containing 750 mM guanidine HCl.
  • the transfe ⁇ ine receptor is then eluted with the 50 mM Tris-HCl buffer pH 8.0 1 M NaCl 0.05% EDTA 10 mM Sarkosyl and 2 M guanidine HCl.
  • the optical density at 280 nm of the eluate is measured at the column outlet using a UV detector.
  • the fractions corresponding to the elution peak are combined and the protein is precipitated by the addition of three volumes of cooled ethanol.
  • the protein is collected by centrifugation for one hour at 10,000 x g.
  • the precipitate is taken up in a certain volume of 10 mM phosphate buffer pH 7.0 containing 0.5 M NaCl, 5 M guanidine-HCl (buffer D) so that the final protein concentration is approximately 1 mg / ml.
  • the solution is brought into contact with the phenyl-Sepharose resin (Pharmacia) previously equilibrated with the same buffer.
  • the incubation is carried out in a bath with rotary shaking for 2 hours at room temperature.
  • the gel is then conditioned in a column.
  • the high molecular weight subunit (Tbpl) is collected in the direct eluate, while the lower molecular weight subunit (Tbp2) is fixed on the resin.
  • the column is rinsed with three volumes of buffer D then with 5 volumes of 10 mM phosphate buffer pH 7.0.
  • Tbp2 is eluted with 1 OmM phosphate buffer pH 7.0 containing 0.5% Sarkosyl.
  • the excess of Sarkosyl contained in the Tbp2 elution buffer is eliminated by ethanol precipitation, the protein is then taken up in the 50 mM phosphate buffer pH 8.0 containing 0.05% Sarkosyl (buffer C).
  • the solution is then filtered through a membrane with a porosity of 0.22 ⁇ m.
  • the protein content is determined and adjusted to 1 mg / ml by the addition of buffer C, under aseptic conditions. This preparation is stored at -70 ° C.
  • the DNA is extracted by a conventional phenol chloroform method.
  • the pellet is taken up in 25 ml of lysis solution (glucose 50 mM, EDTA, 10 mM, Tris, 25 mM pH 8.0) supplemented with 1 ml of proteinase K (Sigma) at 10 mg / ml.
  • lysis solution glucose 50 mM, EDTA, 10 mM, Tris, 25 mM pH 8.0
  • proteinase K Sigma
  • RNAse A (Sigma) at 2 mg / ml is added and the suspension is incubated at 37 ° C for 90 min.
  • the DNA is extracted by adding 0.5 volumes of phenol.
  • the extraction is carried out by stirring for 10 min. then 0.5 volumes of chloroform-isoamyl alcohol (24: 1) are added.
  • the supernatant is removed and is again treated with phenol / chloroform.
  • the phenol / chloroform extraction step is repeated until the aqueous phase is cleared.
  • the DNA is precipitated with 2 volumes of absolute ethanol in the presence of 0.3 M sodium acetate pH 7. Then rinsed in 70% ethanol. The DNA is taken up in 1 ml of distilled water, then assayed with a spectrophotometer at 260 nm and at 280 nm. One unit of OD 260 nm corresponds to 50 ng of DNA / ⁇ l. DNA preparations are considered satisfactory and usable if the DO 260 / DO 280 ratio is between 1.8 and 2.
  • tbp2 From 10 ng of genomic DNA the tbp2 gene is amplified by PCR using the following primers:
  • the reaction medium is as follows: 10 ng of genomic DNA; 0.5 ⁇ M of 5 'and 3' primers; 200 ⁇ M of dNTPs (Boehringer); 10 ⁇ l of Ox l PCR buffer (Biotaq) and 2.5 U of Taq polymerase (Biotaq).
  • the reaction volume is adjusted to 100 ⁇ l with distilled water.
  • the amplification conditions in a Trioblock device are as follows: denaturation: 94 ° C, 1 min; hybridization: 58 ° C, 2 min; elongation: 72 ° C, 3 min; number of cycles: 25.
  • the DNA fragment amplified by PCR is subjected to electrophoresis on a 1% preparative agarose gel ("Electrophoresis grade”. BRL) is prepared in TAE buffer (Tris acetate 0.04M, EDTA 0.002M pH 8.0). The amplified band corresponding to the tbpl gene is cut.
  • the DNA contained in the agarose is purified using a Geneclean kit (Bio 101). The DNA is then digested with EcoRI and BamHI for 2 h at 37 ° C. The digested DNA is then repurified by extraction with phenol / chloroform, precipitated with 2 volumes of ethanol, then taken up in 20 ⁇ l of Tris-EDTA (TE) buffer (10 mM Tris-HCl. 1 mM EDTA pH 8.0) .
  • TE Tris-EDTA
  • the vector pBSK (-) (Stratagene) is digested with £ coRI and BamH] and then purified as described above for the EcoRllBamHl insert.
  • the EcoRl / BamUl insert and pBSK are ligated in the presence of T4 ligase (Boehringer) at 16 ° C. overnight under the following conditions: vector 100 ng; insert 200-300 ng; buffer T4 ligase 10X (Boehringer) 1 ⁇ l; 5U ligase; water qs 10 ⁇ l.
  • T4 ligase Boehringer
  • E. coli XLl-Blue (recAl. EndA ⁇ , gyr A96, thi- ⁇ . /,. hi/R17. SupE44. RelAl. Lac. (F proAB, lacQZ ⁇ MlS, TnlO (tet 1 " )) is precultured in 10 ml of SB medium (Difco) in the presence of tetracycline at 10 ⁇ g / ml overnight at 37 ° C. 500 ⁇ l of preculture are used to seed 11 of SB medium.
  • the germs are washed three times with 10% glycerol in water, reducing the washing volumes from 500 ml to 120 ml, the supernatant is removed after centrifugation at 2500 xg for 15 min at 4 ° C. After the last washing, the bacteria are taken up in 3 ml of 10% glycerol 1 mM Hepes pH 7.5 The germs are aliquoted under 100 ⁇ l in tubes placed in liquid nitrogen The electrocompetent bacteria are stored for one month at -70 ° vs. Five ⁇ l of the ligation reaction are used to transform 100 ⁇ l of E.
  • coli XL-1 bacteria by electroporation in 2 mm thick cells (Eurogentec) at a voltage of 2500 volts. After electroporation, the germs are incubated for 1 hour at 37 ° C. then 1/10 and 9/10 of the volume of the preparation are spread on boxes of LB medium (Difco) plus ampicillin (100 ⁇ g / ml) supplemented with X- gal (25 ⁇ g / ml) and IPTG (25 ⁇ g / ml) allowing a white / blue selection of the recombinant clones.
  • LB medium Difco
  • ampicillin 100 ⁇ g / ml
  • X- gal 25 ⁇ g / ml
  • IPTG 25 ⁇ g / ml
  • the recombinant clones (white) are analyzed after mini-preparation of plasmid according to a conventional method (Maniatis et al., 1989) by double digestion EcoRI, BamHI.
  • the clones selected are those which have integrated a 2.1 kb fragment.
  • the direction of integration of the insert is determined after digestion with Hincll.
  • the plasmid DNA of the clones of interest is prepared in large quantity by a maxi-preparation using a purification method on a tip-250 column (Quiagen Kit).
  • EXAMPLE 4 Polypeptide T / 2169 (1.02, ⁇ 3; 1-350) whose sequence as shown in ID SEQ NO 1 (IM2169). from amino acid in position 1 to amino acid in position 350.
  • the PCR fragment is then digested with BspHI and Hc / ell and inserted simultaneously with the H ⁇ ell-Hindlll fragment of pTG4704 which contains the 3 ′ part of the region coding for Tbp2. in the plasmid pTG3704 described in the application EPA 586 266, digested with Ncol and Hin ⁇ U ⁇ , to generate the plasmid pTG5768.
  • OTG5011 TGCGCAAGCTTACAGTTTGTCTTTGGTTTTCGCGCTGCCG HindiII
  • This PCR fragment is digested with Sphl and HmdlII, then cloned into the plasmid pTG4710 described in application EPA 586,266; the plasmid pTG5740 is thus generated.
  • the Haell-HindIII fragment of pTG5740 comprising the 3 ′ part of the sequence coding for the human transferrin binding domain (hTf) (3 ′ of the region coding for the first domain) is inserted into the plasmid pTG3704 digested with BamHI and H / ⁇ dlII, simultaneously with the BamHI-Haell fragment of pTG5768 comprising the araE promoter, the signal sequence rlpB and the start of the coding sequence of Tbp2; plasmid pTG5782 is thus generated.
  • This vector includes the araB promoter. the sequence coding for the RlpB secretion signal fused to the sequence coding for the N-terminal domain of Tbp2 (1 - 350).
  • a strain of E. coli is transformed with pTG5782.
  • the transformants are cultured at 37 ° C. in M9 medium + 0.5% succinate + arginine 50 ⁇ g / ml + ampicillin 100 ⁇ g / ml.
  • 0.2% arabinose (inducer) is added. After one hour of induction, cells are taken and extracts are prepared.
  • a Western blot analysis followed by a revelation by hTF-peroxidase makes it possible to detect a majority band whose PM corresponds to that expected for this truncated form of Tbp2.
  • T / 2169 In a test as described in Example 4 of WO93 / 6861 (published: 15/04/93) purified T / 2169 is found to be capable of inducing bactericidal antibodies and therefore should be useful for vaccine purposes.
  • EXAMPLE 5 Polypeptide T / 2394 (1.02, ⁇ 3; 1-340) whose sequence as shown in ID SEQ NO 2 (IM2394), from amino acid in position 1 to amino acid in position 340.
  • the plasmid pTG4710 is digested with Mlul and Hindlll.
  • the Mlul-HmdlII fragment comprising the 3 ′ part of the sequence coding for Tbp2 is replaced by the PCR fragment coding for the C-terminal part of the hTf binding domain.
  • the plasmid pTG5707 is thus generated. Then replaced in the plasmid pTG5707.
  • the plasmid pTG5755 is thus generated.
  • This vector includes the araB promoter, the sequence coding for the RlpB secretion signal fused to the sequence coding for the N-terminal domain of Tbp2 (1 - 340).
  • T / 2394 (1-340) is produced and purified as described in Example 4B. - jl -
  • EXAMPLE 6 Polypeptide D4 / 2169 (1, 02, 3) whose sequence is identical to that as shown in ID SEQ NO 1, from the amino acid in position 1 to the amino acid in position 691, deleted from regions 362-379, 418-444, 465-481 and 500-520.
  • Polypeptide D4 / 2169 (1, 02, 3) whose sequence is identical to that as shown in ID SEQ NO 1, from amino acid in position 1 to amino acid in position 691. deleted from regions 362 -379, 418-444, 465-481 and 500-520.
  • the DNA fragment coding for the Tbp2 subunit of the N. meningitidis IM2169 strain is amplified by PCR (Polymerase chain reaction) using specific primers complementary to the 5 'and 3' regions, (respectively
  • a DNA fragment is thus obtained and after digestion with EcoRI. it counts 2150 nt. This EcoRI fragment is then ligated to the dephosphorylated EcoRI ends of the phagemid pBluescriptSK (-) (Stratagene) to give the recombinant phagemid pSK / 2169tbp2. 1.2. Implementation of deletions.
  • the phage form of the recombinant phagemid pSK / 2169tbp2 is obtained after rescue by the phage "helper" VCS Ml 3 according to the technique described by Stratagene, supplier of the basic vector, and used to infect the bacterial strain CJ236.
  • the mutations dut and ung carried by the strain CJ236 result in the synthesis of DNA molecules which have incorporated the nucleotide precursor dUTP.
  • the phages are harvested and the single-stranded DNA is extracted with a phenol / chloroform mixture. This DNA is hybridized, under conventional conditions, to the following oligonucleotides:
  • 2169dl 5 'CGCATCCAAAACCGTACCTGTGCTGCCTGA 3 2169d2 5' TTTATCACTTTCCGGGGGCAGGAGCGGAAT 3 2169d3 5 'GTTGGAACAGCAGACAGCGGTTTGCGCCCC 3 2169d4 5' GAACATACTTTGTTCGTTTTTGC
  • the hybridization reaction is continued for 30 min. in decreasing temperature from 70 ° C to 30 ° C.
  • the second complementary strand is then completed by complete synthesis in the presence of the four deoxynucleotides.
  • T4 DNA polymerase and T4 DNA ligase according to standard conditions.
  • the E. coli SURE strain (Stratagene) is transformed by the DNA thus obtained.
  • the molecules carrying dUTP. that is to say, non-mutated, are destroyed.
  • the phages obtained are analyzed by standard techniques for rapid preparation of plasmid DNA and digestion with the appropriate restriction enzymes. The presence of the mutation sought is then verified by nucleotide sequencing.
  • the clone pSK2169 # 7, carrying the four mutations ⁇ 1203-1256, ⁇ 1371-1451, ⁇ 1512-1562, and ⁇ 1617-1679 is selected.
  • the plasmid pTG5768 described above is digested with Hpal and Xcml.
  • An Xcml-Xcml fragment from pTG5768 and the Hp ⁇ l-Xcml fragment from the plasmid pSK / 2169ed # 7 are simultaneously inserted into this vector. to generate the plasmid pTG5783.
  • This vector includes the araB promoter, the sequence coding for the RlpB secretion signal fused to the modified tbpl sequence (deletions dl to d4).
  • the level of expression of the protein by N. meningitidis RTH is determined by measuring the ability of "a specified number of nuclei to fix the Tfh coupled to peroxidase.
  • Bacterial density of the culture is calculated from the absorbance of the suspension measured at 600 nm knowing that a unit of absorbance corresponds to 3.1 ⁇ "CFU / ml.
  • One ml of a bacterial culture is centrifuged for 15 min at 2500 g then the bacterial pellet is taken up in a volume of 50 mM Tris-HCl pH 8.0 so as to obtain a suspension of 1.10 ⁇ CFU / ml.
  • a series of dilutions of reason 2 is carried out from this suspension (1/2 to 1/2048). Fifty ⁇ l of each of these
  • a culture of the strain of E. coli described in Example 4B above or in Example 6B above is lysed by passage through a lysis apparatus (Rannie) and then centrifuged. Insoluble material is loaded onto a 5% 10% acrylamide gel
  • RTH M982 and B16B6 are purified as described in Examples 1 and 2 of WO 93/6861.
  • Albino New Zealand rabbits receive, multisite subcutaneously, 50 ⁇ g of one of the products described above in the present example, in the presence of complete Freund's adjuvant. 21 days and 42 days after the first injection, the rabbits again receive 50 ⁇ g of the same product, but these times in the presence of incomplete Freund's adjuvant. 15 days after the last injection, the animal serum is removed, then decomplemented for 30 min at 56 ° C and sterilized by filtration on a membrane with a porosity of 0.22 ⁇ m (Millipore).
  • the filtrate is subsequently exhausted by contact with the initial strain (M982 or B 16B6) which, to do this, has been cultivated beforehand in the presence of iron in free form (under these conditions, the synthesis of the transferrin receptor is repressed ).
  • the contact methods are as follows: 10 ml of the filtrate are added to 10 ⁇ cfu (colony-forming units) of a culture of the initial strain. Addition is continued overnight at 4 ° C. with stirring. The bacteria are then eliminated by centrifugation for 15 min at 2500 x g. The supernatant is recovered and then subjected again to 3 successive adsorption operations as previously described.
  • the adsorbed sera are filtered through a membrane with a porosity of 0.22 ⁇ m (Millipore) and stored at -20 ° C.
  • the capacity of anti-RTH or anti-Tbp2 sera to induce the lysis of the different strains of N. meningitidis is evaluated by a bactericidal test. This technique consists in bringing together two volumes of dilutions of reason 2 (1/4 to 1/2048) of the adsorbed and decomplemented serum to be titrated, a volume of young rabbit supplement diluted to 1 / 1.5 and a volume of bacterial suspension containing 70 germs from culture for 5 h at 37 ° C. in MHB broth pH 7.2, EDDA 30 ⁇ M. The reagents are mixed with each other in wells and incubated for 30 min at 37 ° C with shaking.
  • the bactericidal reaction of the serum with respect to germs is stopped by the addition of 1 ml of agar consisting of MH broth pH 7.2, 20% of supplement G (Pasteur Diagnostic) and 15% of noble agar ( Difco). The wells are then incubated overnight at 37 ° C. in the presence of 10% CO2. Reading the results consists in counting the colonies formed from the non-lysed bacteria.
  • the titer is defined as the inverse of the last dilution of the serum inducing the lysis of 50% of the bacteria initially introduced.
  • Tbp2-100% serum 577
  • Tbp2-80% 580
  • Tbp2-50% 583
  • a nonsense protein of Escherichia coli control serum 582
  • M982 and B16B6 are cultivated in the absence or in the presence of a chelating agent.
  • the membrane is incubated with a different hyperimmune sera to be examined (diluted in blocking buffer: dilutions ranging from 1/500 to 1/10000) for ih at 37 ° C.
  • the membrane is then washed twice in blocking buffer with strong stirring then, in order to reveal the first serum, it is again incubated with a goat anti rabbit IgG serum coupled with peroxidase (Zymed) diluted to 1/1000 in buffer blocking.
  • the peroxidase substrate used is a chemiluminescent substrate (Kit ECL, Amersham) used according to the manufacturer's recommendations.
  • the M982 strain is cultivated in an iron depleted medium. Five ml of the culture in the exponential phase (approximately 1.10 ° germs / ml) are centrifuged at
  • the suspension is lysed by sonication (Branson-Sonifer 450 device, probe 3 mm in diameter) for 2 min. Lysis is continued by adding
  • Triton XI 00 at 1% final and incubation 30 min in ice.
  • the suspension is centrifuged at 8000 g to remove the non-lysed bacteria. then the supernatant is centrifuged for 30 min at 10,000 g to obtain the external membranes in the form of a pellet.
  • the pellet is taken up in Tris-HCI 125 mM. pH 8.0. then dosed in proteins by a micromethod (Kit Micro-BCA. Pierce) used according to the manufacturer's recommendations.
  • Electrophoresis is carried out on polyacrylamide gel in the presence of SDS according to the Laemmli method (Laemli. 1970).
  • the separator gel contains 12.5% acrylamide and the concentration gel contains 5%.
  • the samples to be analyzed are diluted to half in sample buffer (0.125 M Tris buffer at pH 6.8; 25% glycerol; 2.5% 2-Mercaptoethanol: 0.001% Bromophenol blue) and hydrolyzed at 100 ° C .
  • sample buffer 0.125 M Tris buffer at pH 6.8; 25% glycerol; 2.5% 2-Mercaptoethanol: 0.001% Bromophenol blue
  • Fifty ⁇ g of protein is deposited for a large gel and 1 ⁇ g for Phast gels (Pharmacia, crosslinking 12.5%).
  • the migration is carried out at a constant voltage 50 V for gels of 15x12 cm
  • the proteins are transferred onto a nitrocellulose membrane (Schleicher &Schull; 0.45 ⁇ m) according to the Towbin method (Towbin et al., 1979).
  • the transfer takes place under constant amperage (1 mAJcxxfi) for 90 min for a large gel and 1 hour for a Phast gel.
  • the effectiveness of the transfer is revealed by staining with Ponceau red (Kodak).
  • the nitrocellulose is washed in blocking buffer (Tris-HCl 0.5 M pH 7.5; 1% skimmed milk; 150 mM NaCl) for 1 hour at room temperature.
  • Tbp2 protein of the M982 strain is specifically recognized by the anti-Tbp2 100%), anti-Tbp2 80% and anti-Tbp2 50% sera. No other N. meningitidis protein is recognized by these sera.
  • the anti-protein serum of E. coli does not recognize the Tbp2 of the N. meningitidis M982 strain.
  • a first filter is revealed with human transferrin coupled to peroxidase (TGH) and makes it possible to define a titer for fixing the TFH:
  • the third is revealed with a serum directed against a whole recombinant Tbp2 M982 protein (100%);
  • the fourth is revealed with a serum directed against a recombinant Tbp2 M982 protein deleted from the hypervariable portion of the "hinge” region (80%);
  • the fifth is revealed with a serum directed against a recombinant Tbp2 M982 protein corresponding to the 50% N-terminal region.
  • the titles are defined as the inverse of the last dilution for which a coloration is visible.
  • Example 1 A preparation of RTH 8680 as obtained in Example 1 is used as an immunogen in order to prepare an antiserum according to the protocol described in Example 8B. 10B. Culture of strains
  • N. meningitidis strains 92/04. M871. 504/91, 8680, 8726, BZ83, 44, 52 and 8710 strains from the meningococcal reference laboratory: Dr. Caugant, WHO-collaborationg center for reference and research on meningococci, NIPH. Oslo, Norway; and part of electrophoretic group ET5 (B. Mohamed-Rokbi, Thesis presented on October 10, 1995, in front of Claude Bernard University. Lyon, France for obtaining the Doctorate degree) as well as the strains M982 and B16B6 are cultivated as described in Example 1 A.
  • the bactericidal activity of the antiserum prepared in 10A is tested against the strains cultivated in 10B according to the protocol described in Example 8C.
  • the bactericidal titers obtained against the strains of the electrophoretic group ET5 highlight a cross bactericidal activity.
  • Those obtained at against the strains B16B6 and M982 on the other hand testify to an absence of cross bactericidal disease.
  • ATTTGTTAAA AATAAATAAA ATAATAATCC TTATCATTCT TTAATTGAAT TGGGTTTAT 59
  • AGC GAC GAT CAA AAA GTT GCC GTT GTC GGC
  • AGC GCG AAA ACC AAA GAC 1163 Ser Asp Asp Gin Lys Val Ala Val Val Gly Ser Ala Lys Thr Lys Asp 335 340 345
  • AAC AGT AGT CAA GCT GAT GCT AAA ACG GAA CAA GTT GAA CAA AGT ATG 1691 Asn Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gin Val Glu Gin Ser Met 510 515 520
  • AAA AGC CAG CCT GAA AGC CAA CAG GAT GTA TCG GAA AAC AGC GGC GCG 192 Lys Ser Gin Pro Glu Ser Gin Gin Asp Val Ser Glu Asn Ser Gly Ala 30 35 40
  • GAG GGC AAT AAG GCG GCA TTT CAG CAC GAG ATT GAG CAA AAC GGC GTG 1248 Glu Gly Asn Lys Ala Ala Phe Gin His Glu Ile Glu Gin Asn Gly Val 385 390 395

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Abstract

L'invention a pour objet une protéine sous forme substantiellement purifiée, qui est la sous-unité de moindre poids moléculaire (Tbp2) du récepteur de la transferrine humaine (RTH) d'une souche de N. meningitidis; la souche étant caractérisée en ce qu'elle n'est pas reconnue en dot blot par un antisérum obtenu à l'encontre d'un polypeptide correspondant à la Tbp2 de la souche N. meningitidis M982 (Tbp2 M982) délétée des portions hypervariables du deuxième domaine; et la sous-unité Tbp2 étant caractérisée (i) en ce qu'elle est codée par un fragment d'ADN d'environ 2,1 kb et (ii) en ce qu'elle possède une région charnière de type M982. Cette sous-unité Tbp2 ainsi que les fragments polypeptidiques qui en sont dérivés sont notamment utiles à des fins vaccinales, plus particulièrement en association avec des sous-unités Tbp2 de N. meningitidis déjà connues. L'invention fournit également des fragments d'ADN codant pour ces nouvelles Tbp2 et polypeptides dérivés.

Description

SOUS-UNITE TBP2 DE NEISSERIA MENINGITIDIS
La présente invention a pour objet un nouveau variant de la sous-unité Tbp2 du récepteur transferrine de Neisseria meningitidis, son utilisation à titre de médicament, ainsi que le fragment d'ADN codant pour ce variant.
D'une manière générale, les méningites sont soit d'origine virale, soit d'origine bactérienne. Les bactéries principalement responsables sont : N. meningitidis et Haemophilus inβuen∑ae, respectivement impliquées dans environ 40 et 50 % des cas de méningites bactériennes.
On dénombre en France, environ 600 à 800 cas par an de méningites à N. meningitidis. Aux Etats-Unis, le nombre de cas s'élève à environ 2 500 à 3 000 par an.
L'espèce N. meningitidis est subdivisée en sérogroupes selon la nature des polysaccharides capsulaires. Bien qu'il existe une douzaine de sérogroupes, 90 % des cas de méningites sont attribuables à 3 sérogroupes : A. B et C.
Il existe des vaccins efficaces à base de polysaccharides capsulaires pour prévenir les méningites à /V. meningitidis sérogroupes A et C. Ces poh saccharides tels quels ne sont que peu ou pas immunogéniques chez les enfants de moins de 2 ans et n'induisent pas de mémoire immunitaire. Toutefois, ces inconvénients peuvent être surmontés en conjuguant ces polysaccharides à une protéine porteuse.
Par contre, le polysaccharide de N. meningitidis groupe B n'est pas ou peu immunogène chez l'homme, qu'il soit sous forme conjuguée ou non. Ainsi, il apparaît hautement souhaitable de rechercher un vaccin à l'encontre des méningites induites par N meningitidis notamment du sérogroupe B. autre qu'un vaccin à base de polysaccharide.
A cette fin. différentes protéines de la membrane externe de .Y. meningitidis ont déjà été proposées. Il s'agit en particulier du récepteur membranaire de la transferrine humaine.
D'une manière générale, la grande majorité des bactéries ont besoin de fer pour leur croissance et elles ont développé des systèmes spécifiques d'acquisition de ce métal. En ce qui concerne notamment N. meningitidis qui est un pathogène strict de l'homme, le fer ne peut être prélevé qu'à partir de protéines humaines de transport du fer telles que la - ? .
transferrine et la lactoferrine puisque la quantité de fer sous forme libre est négligeable chez l'homme (de l'ordre de 10*18 M), en tout cas insuffisante pour permettre la croissance bactérienne.
Ainsi, N. meningitidis possède un récepteur de la transferrine humaine et un récepteur de la lactoferrine humaine qui lui permettent de fixer ces protéines chélatrices du fer et de capter par la suite le fer nécessaire à sa croissance.
Le récepteur de la transferrine de la souche N. meningitidis B16B6 a été purifié par Schryvers et al (WO 90/12591) à partir d'un extrait membranaire. Cette protéine telle que purifiée apparaît essentiellement constituée de 2 types de polypeptides : un polypeptide d'un poids moléculaire apparent élevé de 100 kDa et un polypeptide d'un poids moléculaire apparent moindre d'environ 70 kDa, telles que révélés après électrophorese sur gel de polyacrylamide en présence de SDS.
Le produit de la purification notamment mise en oeuvre par Schryvers est par définition arbitraire et pour les besoins de la présente demande de brevet, appelé récepteur de la transferrine humaine (RTH) et les polypeptides le constituant, des sous-unités. Dans la suite du texte, les sous-unités de poids moléculaire élevé et de poids moléculaire moindre sont respectivement appelées Tbpl et Tbp2.
Depuis les travaux pionniers de Schryvers et al. on a découvert qu'il existait en fait au moins 2 types de souches qui diffèrent par la constitution de leurs récepteurs de la transferrine respectifs. Ceci a été mis en évidence en étudiant des extraits de membrane externe de plusieurs dizaines de souches de N. meningitidis d'origines variées. Ces extraits membranaires ont tout d'abord été soumis à une électrophorese sur gel de polyacrylamide en présence de SDS, puis électrotransférés sur feuilles de nitrocellulose (Western Blot). Ces feuilles de nitrocellulose ont été incubées :
a) en présence d'un antisérum de lapin dirigé contre le récepteur de la transferrine purifié à partir de la souche N. meningitidis B16B6. aussi appelée IM2394 ;
b) en présence d'un antisérum de lapin dirigé contre le récepteur de la transferrine purifié à partir de la souche /V. meningitidis M982. aussi appelée IM2169 ; ou
c) en présence de la transferrine humaine conjuguée à la peroxydase. j -
En ce qui concerne a) et b), la reconnaissance des sous-unités du récepteur de la transferrine est révélée par addition d'un anticorps anti-immunoglobulines de lapin couplé à la peroxydase, puis par addition du substrat de cette enzyme.
Les tableaux I et II ci-dessous indiquent le profil de certaines souches représentatives tel qu'il apparaît sur gel de polyacrylamide à 7.5 % après électrophorese en présence de SDS ; les bandes sont caractérisées par leur poids moléculaires apparents exprimés en kilodaltons (kDa) :
Figure imgf000005_0001
N.B. : Entre parenthèses sont indiqués dans l'ordre le sérogroupe. le sérotype. le sous-type et l'immunotype. e» e> o
Figure imgf000006_0001
N.B. : Entre parenthèses sont indiqués dans l'ordre le sérogroupe, le sérotype, le sous-type et l'immunotype. n s * o-* (Jt ce o
Les résultats répertoriés dans les 2 premières lignes des tableaux montrent qu'il existe 2 types de souches :
Le premier type (Tableau I) correspond à des souches qui possèdent un récepteur dont les 2 sous-unités dans les conditions expérimentales utilisées, sont reconnues en Western blot par l'antiserum anti-récepteur IM2394, tandis que seule la sous-unité de haut poids moléculaire est reconnue par l'antiserum anti-récepteur IM2169.
Le second type (Tableau II) correspond à des souches qui possèdent un récepteur dont les 2 sous-unités dans les conditions expérimentales utilisées, sont reconnues en Western blot par l'antiserum anti-récepteur IM2169, tandis que seule la sous-unité de haut poids moléculaire est reconnue par l'antiserum anti-récepteur IM2394.
En conséquence, il existe une diversité antigénique au niveau de la sous-unité de moindre poids moléculaire. Cette diversité est toutefois restreinte puisqu'elle se résout en 2 grands types, contrairement à ce qui est suggéré par Griffiths et al. FEMS Microbiol. Lett. ( 1990) 69 : 31.
Sur la base de ces observations, la demande WO 93/6861 distingue des souches de type M982 (IM2169) ou de type B 16B6 (IM2394).
Outre ies souches cités dans le tableau II. des souches de type M982 sont par exemples les souches S3032 (12. P 1.12.16). 6940 ( 19. P 1.6). M978 (8. P 1.1 , 7). 2223 (B : nd). 1610 (B : nd), C708 (A : 4. P 1.7), M981 (B : 4). aussi appelée 891. et 2996 (B : 2b, P 1.2). Le déposant a reçu, par envoi gracieux, les souches S3032, M978 et M981 du Dr. J. Poolman (RIVM, Bilthoven. Pays-Bas), et la souche C708 du Dr. Achtman (Max Planck Institute. Berlin, Allemagne).
La souche IM2154 (sérogroupe C) est citée à titre d'exemple comme étant de type B16B6.
En vertu des précédentes constatations, on pouvait supposer qu'un vaccin efficace à l'encontre de toutes les infections à N. meningitidis pourrait être constitué de manière suffisante, de la sous-unité de haut poids moléculaire, queile que soit la souche d'origine du récepteur, puisque cette dernière est reconnue par les 2 types d'antisérums. Toutefois, il semble que cela ne puisse être le cas dans la mesure où la sous-unité de haut poids moléculaire ne serait pas capable d'induire la production d'anticorps de type neutralisant. Seule la plus petite des 2 sous-unités du récepteur (Tbp2) serait capable de remplir cette fonction.
En fait, la protéine Tbp2 plutôt que Tbpl, possède un certain nombre de caractéristiques qui en font un candidat vaccinal potentiel : une expression ubiquitaire, une accessibilité à la surface du germe, la capacité d'induire des anticorps neutralisants et une variabilité limitée puisque comme cela vient d'être exposé, deux groupes majeurs ont été identifiés à ce jour.
En vertu de cette découverte, on a déjà proposé des compositions pharmaceutiques contenant :
(i) le RTH d'au moins une souche de type B 16B6 et le RTH d'au moins une souche de type M982 ( WO 93/6861 ) ; ou
(ii) la Tbp2 d'au moins une souche de type B 16B6 et la Tbp2 d'au moins une souche de type M982 (WO 93/7172).
Pour accéder à de grandes quantités de protéines en vue d'un développement à l'échelle industrielle, on a clone les fragments d'ADN codant i.a. pour diverses Tbp2s. Les séquences en acides aminés des sous-unités Tbp2 des souches M982 et B 16B6 ont été divulguées dans la demande de brevet EPA 586 266 (publiée le 9 Ivlars 1994) ainsi que les fragments d'ADN correspondants. Ces séquences sont reprises dans les SEQ ID NO 1 à 4 de la présente demande.
L'étude des sous-unités Tbp2 quelque soit la souche d'origine, a permis de mettre en évidence, trois domaines de structure principaux associés pour au moins l'un d'entre eux à des propriétés particulières. Par définition, les domaines de Tbp2 M982 et Tbp2 B16B6 ont été fixés comme le montre le tableau ci-après, en indiquant la position des acides aminés, bornes incluses des différents domaines, et par référence à la numérotation apparaissant dans les SEQ ID NO 1 et 3.
Figure imgf000009_0001
Cette définition s'applique de même à toutes les Tbp2s de type M982 ou B16B6, après alignement d'une séquence type M982 ou B16B6 sur la séquence de référence, au maximum d'homologie. Ainsi, à titre d'exemple et par référence à la Figure 1 , on indique la position des domaines de la sous-unité Tbp2 de la souche 8680 comme suit : premier domaine (1 - 334), deuxième domaine (335 - 530) et troisième domaine (531 - 677).
Il est maintenant connu que le domaine N-terminal ou premier domaine comporte dans son intégralité le site de liaison à la transferrine et se trouve donc très vraisemblablement exposé vers l'extérieur. En conséquence le seul domaine N-terminal constitue un élément de choix à des fins i ci. vaccinales.
D'autre part, l'étude comparative des séquences Tbp2s M982 et B16B6 alignées au maximum d'homologie, a mis en évidence quatre portions hypervariables localisées au sein de la région charnière (aussi appelée domaine charnière, comme cela apparaît dans le tableau ci-dessus) de Tbp2 M982 ; portions qui sont absentes dans la Tbp2 B16B6. Ces portions hypervariables se retrouvent chez toutes ies Tbp2s de type M982 (Figure 2). Les souches de type B16B6 en sont dépourvues. Par la suite, on entend par "région charnière de type M982" une région charnière qui possède ces quatre portions hypervariables.
L'étude des séquences a permis de faire évoluer les définitions des types M982 et B 16B6, originellement fournies dans WO 93/6861. On convient maintenant de définir les types de souches sur la base de la présence ou l'absence des régions hypervariables et par conséquent sur la taille du gène tbp2 : environ 2.1 kb pour tbp2 de type M982 et 1.8 kb pour tbp2 de type B 16B6.
Par comparaison des séquences de diverses Tbp2s de type M982. on sait aussi que la région charnière présente une variabilité supérieure à celle des deux autres domaines. Dans la mesure où la région charnière ne semblait pas indispensable à la fonction de fixation de la transferrine humaine, on a postulé que le rôle de cette région est au moins en partie d'induire une variabilité-"écran" afin d'éviter la reconnaissance d'une souche par le système immunitaire d'un individu ayant connu ultérieurement une autre souche.
Dans cette hypothèse, la région charnière des souches de type M982 constitue un problème majeur dans la réalisation d'un vaccin. En effet si cette région est immunodominante, lors d'une immunisation, les anticorps induits seront dirigés majoritairement contre cette région et par conséquent la réponse immunitaire sera spécifique de la protéine Tbp2 de la souche homologue.
En tenant compte des observations et hypothèses évoquées ci-dessus, il déjà été proposé d'utiliser i.a. à des fins vaccinales, non plus des Tbp2s de type M982 entières, mais des Tbp2s au moins délétées de leurs quatre portions hyperλ'ariables ou de façon alternative, délétées des deuxième et troisième domaines.
Une région essentielle pour l'induction d'une immunité à large spectre étant vraisemblablement le premier domaine, une composition pharmaceutique de choix est apparue comme pouvant être par exemple, au moins composée :
(i) d'un polypeptide correspondant à une Tbp2 de type M982 délétée au moins partiellement du deuxième ou du troisième domaine e.g. d'un polypeptide correspondant au premier domaine d'une Tbp2 de type M982 ; et
(ii) d'une Tbp2 de type B16B6 ou d'un polypeptide correspondant à une Tbp2 de type B 16B6, délétée au moins partiellement du deuxième ou du troisième domaine e.g. d'un polypeptide correspondant au premier domaine d'une Tbp2 de type B 16B6 (demande PCT n° de dépôt PCT/FR95/000701 ; référence est faite aux définitions initiales des types de souches).
Par la suite, l'étude de l'immunodominance de la région charnière des Tbp2s de type M982 a été poursuivie et complétée en analysant vis-à-vis d'un grand nombre de souches de type M982. la réactivité croisée des sérums obtenus à l'encontre :
(i) de la protéine Tbp2 M982 entière (Tbp2 100%) ; (ii) de la protéine Tbp2 M982 tronquée ne comportant que les 350 premiers acides aminés N-terminaux (Tbp2 50%) ; et
(iii) de la protéine Tbp2 M982 délétée des quatre portions hypervariables (Δ 362- 379 ; Δ 418-444 ; Δ 465-481 ; et Δ 500-520) de la région charnière (Tbp2
80%).
Pour ce faire, les protéines Tbp2s entières, tronquées et délétées ont été tout d'abord produites dans E. coli par voie recombinante. Pour ce qui concerne Tbp2 M982 entière, sa production est décrite dans EPA 586 266 (publiée le 9 mars 1994). Celles des deux autres Tbp2s M982 sont reportées dans les Exemples 4 et 6 de la présente demande.
La préparation des sérums hyperimmuns ainsi que l'analyse de ces sérums. préliminaire à l'étude d'immunodominance. fait l'objet de l'Exemple 8 de la présente demande. L'étude de la réactivité croisée fait l'objet de plus de détails dans l'Exemple 9.
Cinquante quatre souches classées dans le type M982 soit par analyse des protéines de membrane externe en électrophorese de SDS-Page suivie d'une immunorévélation. soit sur la base de la taille du gène tpb2 amplifié par PCR, ont été étudiées en dot blot (analyse sur geπnes entiers) pour leur réactivité croisée (voir l'Exemple 9). Ces souches ont été obtenues à titre gracieux auprès du Dr D.A. Caugant. Elles ont été isolées dans des régions du monde très diverses et à différentes périodes. Par conséquent, cette collection devrait être représentative. 14 souches ne sont pas reconnues par le sérum anti-Tbp2 M982 100%, tandis que seulement 4 échappent à la reconnaissance par le sérum anti-Tbp2 M982 80% et 1 par le sérum anti-Tbp2 M982 50%.
Ces résultats confirment l'hypothèse initiale selon laquelle une protéine Tbp2 délétée des portions hypervariables induit une réactivité croisée plus importante que celle observée avec une protéine entière. La réactivité croisée est encore améliorée dans le cas d'une protéine Tbp2 n'ayant conservé que le domaine de liaison à la transferrine, puisque seulement une souche parmi 54. n'est pas reconnue. L'immunogénicité d'une Tbp2 est influencée par la présence de la région charnière qui induit des anticorps spécifiques de la souche homologue. En supprimant au moins les quatre portions hypervariables, la réponse immune contre des épitopes situés en dehors de la région charnière, semble favorisée. Seulement 4 souches parmi les 54 souches de type M982 n'ont pas réagi avec le sérum anti-Tbp2 80%. Ce résultat peut s'expliquer notamment par le fait qu'au moins une de ces souches diffère très largement de la souche de référence M982. Par conséquent il apparaît nécessaire d'ajouter aux compositions pharmaceutiques déjà connues, au moins une troisième valence.
C'est pourquoi l'invention a pour objet une protéine sous forme substantiellement purifiée, qui est la sous-unité de moindre poids moléculaire (Tbp2) du récepteur de la transferrine humaine (RTH) d'une souche de N. meningitidis ; la souche étant caractérisée en ce qu'elle n'est pas reconnue en dot blot par un antisérum obtenu à l'encontre d'un polypeptide correspondant à la Tbp2 de la souche N. meningitidis M982 (Tbp2 M982) délétée des portions hypervariables de sa région charnière (Tbp2 M982 Δ 362 - 379 ; Δ 418 - 444 ; Δ 465 - 481 ; Δ 500 - 520) ; et la sous-unité Tbp2 étant caractérisée (i) en ce qu'elle est codée par un fragment d'ADN d'environ 2,1 kb.
En d'autres termes, puisque la sous-unité Tbp2 selon l'invention est caractérisée (i) en ce qu'elle est codée par un fragment d'ADN d'environ 2,1 kb, la souche de N. meningitidis dont elle dérive, est elle-même caractérisée en ce que son génome comprend un cadre de lecture ouvert (ORF) codant pour ladite sous-unité Tbp2 d'environ 2,1 kb.
Puisque la protéine selon l'invention est codée par un fragment d'ADN d'environ 2,1 kb. il est bien évident, compte tenu de ce qui a été dit précédemment, que cette protéine possède une région charnière de type M982.
La réactivité entre un sérum anti-Tbp2 80% et un sérum anti-Tbp2 50% peut aussi s'expliquer par le fait que dans la construction qui a servi à la production du sérum anti- Tbp2 80% certaines séquences variables demeurent alors que dans les protéines 50%, toutes ces séquences sont supprimées. En effet, seule une souche parmi les 54 souches de type M982 n'a pas réagi avec le sérum anti-Tbp2 50%. Il s'agit de la souche 8680 B: 15:P1.3, isolée au Chili lors de l'épidémie de 1987, et appartenant au groupe électrophorétique ET-5. Cette souche provient de la collection du Dr D.A. Caugant, WHO Collaborating Centre for Référence and Research on Meningococci, National Institute of Public Health, Oslo, Norway. La protéine Tbp2 issue de cette souche constitue donc tout particulièrement un candidat vaccinal de choix. C'est pourquoi une sous-unité Tbp2 selon l'invention dérive de manière avantageuse d'une souche de N. meningitidis qui n'est pas reconnue en dot blot par un antisérum obtenu à l'encontre d'un fragment de Tbp2 M982 allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en positon 350 c'est-à-dire à l'encontre d'un polypeptide correspondant à la Tbp2 de la souche N. meningitidis M982 substantiellement délétée des deuxième et troisième domaines.
Une sous-unité Tbp2 selon l'invention dérive notamment d'une souche de N. meningitidis dont la sous-unité Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum obtenu à l'encontre du RTH de la souche M982 (antisérum anti-RTH M982) et par un antisérum obtenu à l'encontre du RTH de la souche B 1616 (antisérum anti-RTH B16B6). De tels antisérums ont été décrits dans la demande de brevet WO 93/6861.
Par "sous-unité Tbp2 qui dérive d'une souche de Λ'. meningitidis" on entend bien évidemment une dérive prise dans son sens le plus général ; c'est-à-dire non limitée à un procédé physique, mais le fruit d'un processus intellectuel. Ainsi cette expression recouvre i.a. une Tbp2 produite par voie recombinante e.g. dans E. coli.
Une sous-unité Tbp2 selon l'invention comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie (d'identité) avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 M982, telle que montrée dans l'ID SEQ No. 1, est de 60 à 70%, avantageusement d'environ 65%. Sous un autre aspect, une sous-unité Tbp2 selon l'invention comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 8680, telle que montrée dans l'ID SEQ No. de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 677. est de 80 à 100%, avantageusement de 90 à 100%. de manière préférée de 95 à 100%. Selon un mode particulier, elle comprend une séquence d'acides aminés substantiellement telle que montrée dans l'ID SEQ No. 5 commençant avec le résidu acide aminé en position 1 et finissant avec le résidu acide aminé en position 677.
Une sous-unité Tbp2 selon l'invention peut être sous forme dissociée de la sous-unité de haut poids moléculaire (Tbpl) de la souche de N. meningitidis dont est issue la Tbp2 ou bien en association avec cette Tbpl, formant ainsi un complexe Tbpl-Tbp2 considéré comme le récepteur de la transferrine humaine. Qu'elle soit sous forme dissociée ou sous forme de complexe Tbpl-Tbp2, la sous-unité Tbp2 selon l'invention doit être substantiellement purifiée ; c'est-à-dire séparée de l'environnement dans lequel elle existe de manière naturelle. Entre autres, il peut s'agir d'une préparation notamment dépourvue des protéines cytoplasmiques et périplasmiques à'H.pylori.
L'invention concerne également un fragment d'ADN isolé codant pour une protéine selon l'invention ainsi que pour un précurseur de cette protéine ; ce dernier comprenant un peptide signal homoloque ou hétérologue à la protéine selon l'invention. Un fragment d'ADN codant pour une protéine selon l'invention est décrit dans le ID SEQ NO 5 de l'acide nucléique en position 30 à l'acide nucléique en position 2061. Un fragment d'ADN codant pour un précurseur d'une protéine selon l'invention est décrit dans le ID SEQ NO 5 de l'acide nucléique en position 1 à l'acide nucléique en position 2061.
Un fragment d'ADN selon l'invention peut aussi comprendre une séquence d'acides nucléiques autre que celle montrée dans l'ID SEQ NO 5 à condition qu'il puisse s'hybrider au fragment d'ADN montré dans l'ID SEQ NO 5, dans des conditions de forte stringence.
Des méthodes d'hybridation ainsi que la mise en oeuvre de conditions de forte stringence sont à la portée de l'homme de l'art. Par exemple, des procédures d'hybridation sont décrites dans Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc.. 1994 ; Silhavy et al. Experiments with Gène Fusions. Cold Spring Harbor Lab.. 1984 : Davis et al, A Manual for Genetic Engineering : Advanced Bacterial Genetics, CSH Lab.. 1980. Pour ligne de conduite générale, on indique des paramètres importants dont on doit tenir compte afin d'optimiser les conditions d'hybridation, se retrouvent dans la formule qui permet de calculer une valeur critique, la température de fusion (Tm), au dessus de laquelle deux brins complémentaires se séparent (Casey & Davidson, Nucl. Acid Res. ( 1977) 4 : 1539). Cette formule est comme suit : Tm = 81.5 + 0.5 X (% G+C) + 1.6 log (positive ion concentration) - 0.6 X (% formamide). Dans des conditions de forte stringence. la température d'hybridation est environ 20-25°C en dessous de la température de fusion telle que calculée. Par exemple, des conditions de forte stringence sont obtenus en réalisant des incubations de pré-hybridation et d'hybridation pendant 4 - 16 hrs, à environ 55 - 60°C, en solution 6 x SSC (NaCl 1 M, sodium citrate 0.1 M. pH 7.0).
L'invention concerne également (i) un polypeptide dérivé notamment par délétion d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention ; et (ii) un fragment d'ADN isolé codant pour un tel polypeptide. II s'agit plus particulièrement d'un polypeptide ayant une séquence en acides aminés qui dérive de celle d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention dont le premier, deuxième et troisième domaines sont définis par alignement au maximum d'homologie, sur la séquence de la sous-unité Tbp2 de la souche de référence M982 ; notamment par délétion totale ou partielle d'au moins un domaine de ladite sous-unité Tbp2 selon l'invention, à condition que le premier et deuxième domaines ne soient pas simultanément et totalement délétés.
Par "séquence qui dérive d'une autre séquence" on entend bien évidemment une séquence issue par processus intellectuel de cette autre séquence.
Sous un autre aspect, il s'agit d'un polypeptide capable de se lier à la transferrine humaine et dérivé d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention, notamment par délétion d'un ou plusieurs acides aminés localisés du côté de l'extrémité C-terminale ou dans la région des quarante premiers acides aminés de la sous-unité Tbp2. L'extrémité C-terminale est définie comme étant la partie de Tbp2 correspondant aux deuxième et troisième domaines.
De manière plus particulière, un polypeptide selon l'invention possède une séquence d'acides aminés qui dérive d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention :
(i) notamment par délétion totale ou partielle d'au moins un domaine de ladite sous-unité Tbp2. sélectionné parmi les deuxième et troisième domaines ; de préférence par délétion totale ou partielle du troisième domaine ou des deuxième et troisième domaines ;
(ii) notamment par délétion totale des premier et troisième domaines, ou
(iii) notamment par délétion intégrale du troisième domaine et par délétion partielle du premier domaine, optionellement par délétion partielle du deuxième domaine.
D'une manière avantageuse, un polypeptide selon l'invention présente une délétion partielle, quasi totale ou totale du troisième domaine, de préférence totale. Dans ce cas là, le premier ainsi que le deuxième domaine peuvent être maintenus dans leur intégralité, partiellement ou totalement délétés; ceci indépendamment l'un de l'autre. Sont possibles les combinaisons suivantes (sachant que les premier, deuxième et troisième domaines dans leur intégralité sont respectivement représentés par 1, 2 et 3, et que O et Δ signifient de manière respective, partiellement et totalement délété) :
1,2,Δ3; l,θ2,Δ3; 1,Δ2,Δ3;
01,2,Δ3;01,02,Δ3;01,Δ2,Δ3; Δl,2,Δ3;Δl,θ2,Δ3 ;
1,2,03;1,02, 03;1,Δ2,03; 01,2, 03; 01,02,03 ;01,Δ2, 03;
Δl,2, 03 ;Δ1,02, 03 ;
Est aussi d'intérêt tout particulier, un polypeptide dérivé d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention par délétion partielle du deuxième domaine, qui comporte dans leur intégralité ou quasi intégralité le premier et troisième domaines ; soit la combinaison 1, O 2.3. (Par "domaine maintenu dans sa quasi-intégralité" on entend ici et dans la suite du texte, un domaine modifié en un très faible nombre de positions, environ 5 maximum.) Un polypeptide selon l'invention peut aussi répondre à la combinaison Ol.02, 3, la délétion partielle du premier domaine portant avantageusement sur tout ou partie de la région homologue de celle de Tbp2 M982, allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé approximativement en position 40.
De manière avantageuse, lorsqu'un polypeptide dérive notamment par délétion partielle du deuxième domaine d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention, cette délétion partielle porte substantiellement sur une ou des régions du deuxième domaine qui sont les homologues des régions de la séquence M982 allant :
(i) de l'acide aminé en position 388 à l'acide aminé en position 396 ;
(ii) de l'acide aminé en position 418 à l'acide aminé en position 476 ; ef
(iii) de l'acide aminé en position 499 à l'acide aminé en position 521.
De manière alternative, une délétion partielle du deuxième domaine porte substantiellement sur une ou des portions hypervariables. Ces portions sont, après alignement au maximum d'homologie, les homologues des portions de la séquence M982 allant :
(i) de l'acide aminé en position 362 à l'acide aminé en position 379 ;
(ii) de l'acide aminé en position 418 à l'acide aminé en position 444 ;
(iii) de l'acide aminé en position 465 à l'acide aminé en position 481 ; et
(iv) de l'acide aminé en position 500 à l'acide aminé en position 520.
De préférence, la délétion partielle porte simultanément sur les quatre portions (i) à (iv) sus-décrites.
Lorsqu'un polypeptide selon l'invention dérive notamment par délétion intégrale du troisième domaine et délétion quasi intégrale du deuxième domaine d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention et comporte l'intégralité du premier domaine ou dérive en outre par délétion de la partie N-terminale du premier domaine, la délétion quasi intégrale du deuxième domaine s'étend sur ia région qui est l'homologue de la région du deuxième domaine de la sous-unité Tbp2 M982 allant de l'acide aminé dans l'une des positions 346 à 361 à l'acide aminé en position 543.
Lorsqu'un polypeptide dérive notamment par délétion partielle du premier domaine d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention, cette délétion partielle porte avantageusement sur tout ou partie de la région qui est l'homologue de la région du premier domaine de la sous- unité Tbp2 de type M982 allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 281.
A titre d'exemple de ce qui précède, on cite une délétion d'intérêt portant sur tout ou partie de la région qui est l'homologue de la région du premier domaine de ladite sous-unité Tbp2 de type M982 allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé approximativement en position 40.
Le degré d'homologie peut être aisément calculé en alignant les séquences de manière à obtenir le degré maximal d'homologie ; pour ce faire, il peut être nécessaire d'introduire artificiellement des emplacements vacants, comme cela est illustré dans la Figure 1. Une fois que l'alignement optimal est réalisé, le degré d'homologie est établi en comptabilisant toutes les positions dans lesquelles les acides aminés des deux séquences se retrouvent à l'identique, par rapport au nombre total de positions.
II serait fastidieux de décrire des séquences homologues autrement que de manière générique, en raison du trop grand nombre de combinaisons. L'homme du métier connaît toutefois les règles générales qui permettent de remplacer un acide aminé par un autre sans abolir la fonction biologique ou immunologique d'une protéine.
A titre d'exemple préféré, on cite un polypeptide selon l'invention dont la séquence possède au moins 70-75%, de manière avantageuse au moins 80%. de préférence au moins 90%. de manière tout à fait préférée 100% d'homologie avec :
(i) la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ NO 5. de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé dans l'une des positions 334 à 351, avantageusement en position en position 334 ;
(ii) la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ NO 5, de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 677. délétée des régions 377-385, 407- 465 et 488-508 ;
(iii) la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ NO 5. de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 677, délétée des portions 351-368. 407-433, 454-470 et 489-508; ou avec
(iv) la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ NO 5. de l'acide aminé en position 335 à l'acide aminé en position 530.
Un polypeptide selon l'invention possède une séquence d'acide aminés qui comprend au moins 10, avantageusement au moins 20. de préférence au moins 50, de manière tout à fait préférée au moins 100 acides aminés.
Bien évidemment, un polypeptide selon l'invention peut aussi comprendre de manière additionnelle, une séquence d'acides aminés qui ne présente pas d'homologie avec les séquences des sous-unités Tbp2 selon l'invention. D'une manière générale, une séquence additionnelle peut être celle de tout autre polypeptide à l'exclusion de Tbp2.
Par exemple, une séquence additionnelle peut être celle d'un peptide signal localisé en position N-terminale d'un polypeptide selon l'invention. Des exemples de séquence signal sont montrés dans les ID SEQ NO 1 à 4. D'autre part, on indique qu'une séquence signal hétérologue appropriée peut être une séquence signal retrouvée chez le précurseur d'une lipoprotéine.
Une sous-unité Tbp2 selon l'invention peut être directement purifiée à partir de la souche native ou bien de manière avantageuse, obtenue par voie recombinante dans un système d'expression hétérologue ou homologue. Les polypeptides selon l'invention sont de préférence des produits recombinants. Afin de mettre en oeuvre une expression par voie recombinante, le fragment d'ADN codant pour la Tbp2 de la souche 8680 a été clone et séquence.
L'invention a donc aussi pour objet :
(i) un fragment d'ADN isolé codant pour une sous-unité Tbp2 ou un polypeptide selon l'invention ;
(ii) une cassette d'expression qui comprend au moins un fragment d'ADN selon l'invention, placé sous le contrôle d'éléments capables d'assurer son expression dans une cellule-hôte appropriée : et
(iii) un procédé de production d'un polypeptide selon l'invention, selon lequel on cultive une cellule-hôte comportant une cassette d'expression selon l'invention.
Dans la cassette d'expression, le fragment d'ADN selon l'invention peut être ou non associé à un bloc d'ADN codant pour un peptide signal hétérologue ou non. au polypeptide codé par ledit fragment d'ADN, selon que l'on recherche ou non la sécrétion du polypeptide. De préférence, cette sécrétion sera recherchée.
Des éléments tels qu'un bloc d'ADN codant pour un peptide signal hétérologue
(région signal) ou un promoteur existent déjà en assez grand nombre et sont connus de l'homme du métier. Ses compétences générales lui permettront de choisir une région signal ou un promoteur particulier qui seront adaptés à la cellule-hôte dans laquelle il envisage l'expression.
Aux fins du procédé selon l'invention, la cellule-hôte peut être une cellule de mammifère, une bactérie ou une levure ; ces deux dernières étant préférées. Là aussi, le choix d'une lignée particulière est à la portée de l'homme du métier.
Enfin, l'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif, une sous-unité Tbp2 ou un polypeptide selon l'invention.
Une composition pharmaceutique selon l'invention est notamment utile pour induire une réponse immunitaire chez les humains à l'encontre de N meningitidis, entre autre un effet vaccinal de manière à protéger les humains contre des infections à N meningitidis, en prévention ou en thérapie.
Une composition selon l'invention peut comprendre en outre :
(i) une sous-unité Tbp2 additionnelle qui dérive d'une souche de N meningitidis dont la sous-unité Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et n'est pas reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6 ; ou
(ii) un polypeptide capable de lier la transferrine humaine et dérivé d'une sous-unité Tbp2 d'une souche de N. mentngiiidis dont la Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et n'est pas reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6, notamment par délétion d'un ou plusieurs acides aminés localisés du côté de l'extrémité C-terminale de la sous-unité Tbp2 ; ou
(iii) une sous-unité Tbp2 additionnelle qui dérive d'une souche de N meningitidis dont la sous-unité Tbp2 n'est pas reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et est reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6 ; ou
(ι\ ) un polypeptide capable de lier la transferrine humaine et dérivé d'une sous-unité Tbp2 de N meningitidis dont la sous-unité Tbp2 n'est pas reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et est reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6, notamment par délétion d'un ou plusieurs acides aminés localisés du côté de l'extrémité C-terminale de la sous-unité Tbp2.
Une composition selon l'invention comprend avantageusement au moins un, de préférence deux éléments additionnels choisis parmi les quatre énoncées ci-avant.
La sous-unité Tbp2 additionnelle de type M982 comprend avantageusement une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 M982, telle que montrée dans l'ID SEQ No. 1, est de 90 à 100 %. Il s'agit de préférence de la sous-unité Tbp2 M982.
La sous-unité Tbp2 additionnelle de type B 16B6 comprend avantageusement une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 B16B6, telle que montrée dans l'ID SEQ No. 3, est de 90 à 100 %. Il s'agit de préférence de la sous-unité Tbp2 B 16B6.
De préférence, le polypeptide additionnel (ii) dérive d'une sous-unité Tbp2 d'une souche de N. meningitidis dont la Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et n'est pas reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6. notamment par délétion partielle du deuxième domaine, entre autre par délétion substantielle des régions hypervariables du deuxième domaine de la sous-unité Tbp2 ou par délétion substantielle du deuxième ou du troisième domaine de la sous-unité Tbp2.
Avantageusement, ce polypeptide dérive d'une sous-unité Tbp2 qui comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 M982, telle que montrée dans l'ID SEQ No. 1. est de 90 à 100 %. De manière préférée, il s'agit d'un polypeptide qui dérive de la Tbp2 M982.
De préférence. le polypeptide additionnel (iv) dérive d'une sous-unité Tbp2 d'une souche de N. meningitidis dont la Tbp2 n'est pas reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et est reconnue par un antisérum anti-RTH B 16B6. notamment par délétion substantielle du deuxième ou du troisième domaine de la sous-unité Tbp2, de préférence des deuxième et troisième domaines. Avantageusement, ce polypeptide denve d'une sous-unite Tbp2 qui comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 M982. telle que montrée dans l'ID SEQ No 3, est de 95 a 100 % De manière préférée, il s'agit d'un polypeptide qui denve de la Tbp2 B16B6
Selon un mode préféré, une composition selon l'invention comprend
(i) un polypeptide qui dérive d'une sous-unité Tbp2 selon l'invention, notamment par délétion partielle du deuxième domaine de la sous-unité Tbp2, entre autre par délétion substantielle des portions hypervanables du deuxième domaine de la sous- unite Tbp2 ,
(u) un polypeptide qui denve d'une sous-unité Tbp2 d'une souche de N meningitidis dont la Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et n'est pas reconnue par un antisérum anti-RTH B 16B6, notamment par délétion partielle du deuxième domaine, entre autre par délétion substantielle des portions hypervanables du deuxième domaine de la sous-unité Tbp2 . et
( m) une sous-unité Tbp2 qui dérive d'une souche de N meningitidis dont la sous-unité Tbp2 n'est pas reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et est reconnue par un antisérum anti-RTH B I 6B6
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle En particulier on associe le ou les polypeptιde(s) selon l'invention avec un adjuvant, un diluant ou un support acceptable d'un point de vue phaπnaceutique Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conv entionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie sous-cutanee, par voie intra-musculaire ou par voie intra- veineuse, par exemple sous forme de suspension injectable L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle Le dosage approprie varie en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu traité ou du mode d'administration
Afin de déterminer l'objet de la présente invention, on précise que les souches de N meningitidn IM2394 (M982) et IM2169 (B 16B6) sont publiquement disponibles auprès de la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur. 25 rue du Dr Roux 75015 Paris sous les numéros d'enregistrement respectifs LNP N 1511 et LNP N 1520.
L'invention est décrite plus en détails dans les exemples ci-après et par référence aux Figures 1 à 5.
La Figure 1 présentent respectivement les alignements des séquences Tbp2 M982 et 8680. au maximum d'homologie selon le programme Kanehisa (Bisance CITI-2). Le degré d'homologie est de 65%.
La Figure 2 présente les alignements au maximum d'homologie des séquences des domaines charnières (deuxième domaine) de Tbp2 M982 ( 1 ). 6940 (2), 2223 (3), C708 (4), M978 (5), 1610 (6), 867 (7), S3032 (8) et 981 (9). En italiques est donnée la numérotation de la séquence de Tbp2 M982, telle qu'elle apparaît dans ID SEQ NO 1. En gras apparaissent les séquences des portions hypervariables que l'on peut déléter selon un mode préféré. (C) indique la séquence consensus.
Les Figures 3 à 5 illustrent respectivement la construction des plasmides pTG5782. pTG5755 et pTG5783.
EXEMPLE 1 : Purification du RTH de la souche de N. meningitidis 8680
IA - Culture
Un congelât de la souche N. meningitidis 8680 est repris dans environ 1 ml de bouillon Muller Hinton (BMH, Difco). La suspension bactérienne est ensuite étalée sur le milieu solide Muller Hinton contenant du sang cuit (5 %).
Après 24 h d'incubation à 37°C dans une atmosphère contenant 10 % de CO2, la nappe bactérienne est recueillie pour ensemencer 150 ml de BMH pH 7.2, répartis en 3 erlens de 250 ml. L'incubation est poursuivie pendant 3 h à 37°C sous agitation. Chacune des 3 cultures ainsi réalisées permet d'ensemencer 400 ml de BMH pH 7,2 supplémenté avec 30 μm de Ethylènediamine - Di (O-Hydroxyphenyl - acetic acid (EDDA, Sigma), qui est un agent chélatant du fer sous forme libre.
Après 16 h de culture à 37°C sous agitation, les cultures sont contrôlées pour leur pureté par observation au microscope après une coloration de Gram. La suspension est centrifugée, le culot contenant les germes est pesé et conservé à - 20°C.
IB - Purification
La méthode de purification est essentiellement telle que décrite par Schryvers et al (supra).
Le culot bactérien obtenu en IA est décongelé, puis remis en suspension dans 200 ml de tampon Tris HCl 50 mM, pH 8.0 (tampon A). La suspension est centrifugée pendant 20 min à 15 000 xg à 4°C. Le culot est récupéré, puis remis en suspension dans du tampon A à la concentration finale de 150 g/1. Des fractions de 150 ml sont traitées pendant 8 min à 800 bars dans un lyseur de cellules travaillant sous haute pression (Rannie, modèle 8.30H). Le lysat cellulaire ainsi obtenu est centrifugé pendant 15 min à 4°C à 15 000 x g. Le surnageant est récupéré, puis centrifugé pendant 75 min à 4°C à 200 000 x g. Après élimination du surnageant, le culot est repris dans du tampon A et après dosage de protéines selon Lowry, la concentration de la suspension est ajustée à 5 mg/ml. A 1,4 ml de la suspension de membrane on ajoute 1,75 mg de transferrine humaine biotynylée selon le procédé décrit par Schryvers. La concentration finale de la fraction membranaire est de 4 mg/ml. Le mélange est incubé 1 heure à 37°C puis centrifugé à 100 000 xg pendant 75 min. à 4°C. Le culot de membranes est repris par le tampon A contenant du NaCl 0,1 M et incubé pendant 60 min. à température ambiante.
Après solubilisation, on ajoute à cette suspension un certain volume de N Lauroyl Sarkosine à 30% (p/v) et d'EDTA 500 mM de façon que les concentrations finales en Sarkosyl et EDTA soient de 0,5% et 5 mM respectivement. Après une incubation de 15 min. à 37°C sous agitation, on ajoute 1 ml de résine streptavidine- agarose (Pierce) préalablement lavée en tampon A. La suspension est incubée à 15 min. à température ambiante puis centrifugée à 1 000 x g pendant 10 min. La résine est ensuite conditionnée dans une colonne et l'éluat est éliminé.
La résine est lavée par 3 volumes de colonnes de tampon Tris-HCI 50 mM pH 8.0 contenant NaCl IM, EDTA 10 mM Sarkosyl 0.5 % (tampon B) puis par un volume de colonne de tampon B contenant de la guanidine HCl 750 mM. Le récepteur de la transferrine est ensuite élue par le tampon B contenant de la guanidine HCl 2M. L'éluat est collecté en fraction dont le volume correspond à IV. dans des tubes contenant IV de Tris HCl 50 mM pH 8.0. NaCl IM. La densité optique à 280 nm de l'éluat est mesurée en sortie de colonne à l'aide d'un détecteur UV.
Les fractions correspondant au pic d'elution sont recueillies, dialysées contre du tampon phosphate 10 mM. pH 8.0 contenant du Sarkosyl 0.05 % et lyophilisées Le lyophilisât est repris dans de l'eau à une concentration 10 fois supérieure. La solution est dialysée une seconde fois contre du tampon phosphate 50 mM pH 8.0 contenant du Sarkosyl 0.05 % (tampon C) puis la solution est filtrée sur une membrane de porosité 0.22 μm.
Le contenu en protéines est déterminé et ajusté à 1 mg/ml par addition de tampon C, sous conditions aseptiques. Cette préparation est conservée à -70°C. EXEMPLE 2 : Purification de la sous-unité Tbp2 de la souche de N. meningitidis 8680 par chromatographie hydrophobe
La culture de la souche N. meningitidis 8640, ainsi que les étapes de purification allant jusqu'à la préparation de la suspension membranaire sont effectuées dans des conditions identiques à celles décrites dans l'Exemple 1.
A un volume de la suspension de membranes, on ajoute un volume identique de Tris- HCI 50mM pH 8,0 contenant NaCl 2M, EDTA 20 mM, Sarkosyl 1 % (p/v). Le mélange est incubé 15 min à 37°C sous agitation douce. Puis un volume de cette suspension est mis en contact avec un volume identique de résine Sepharose 4B couplée à la transferrine humaine. Cette résine d'affinité a été couplée en greffant de la transferrine humaine (Sigma, St Louis USA) à du Sepharose 4B-CNBr (Pharmacia) selon les recommandations du fabricant. La densité du ligand et de 5 mg transferrine/ml de résine. Le contact se fait en bain pendant 1 h à température ambiante sous agitation rotative douce. La résine est ensuite conditionnée dans une colonne, l'éluat direct est éliminé.
La résine est lavée par 3 volumes de colonnes de tampon Tris-HCI 50 mM pH 8.0 contenant NaCl I M, EDTA lO mM Sarkosyl 0.5 % (tampon B) puis par un volume de colonne de tampon B contenant de la guanidine HCl 750 mM. Le récepteur de la transfeσine est ensuite élue par le tampon Tris-HCI 50 mM pH 8.0 NaCl 1 M EDTA lOmM Sarkosyl 0.05 % et guanidine HCl 2M. La densité optique à 280 nm de l'éluat est mesurée en sortie de colonne à l'aide d'un détecteur UV. Les fractions correspondant au pic d'elution sont réunies et la protéine est précipitée par addition de trois volumes d'éthanol refroidi.
Après une nuit d'incubation à + 4°C, la protéine est recueillie par centrifugation pendant une heure à 10.000 x g. Le précipité est repris par un certain volume de tampon phosphate 10 mM pH 7,0 contenant NaCl 0,5 M, guanidine-HCl 5 M (tampon D) de façon à ce que la concentration finale en protéine soit d'environ 1 mg/ml. La solution est mise en contact avec la résine de phényl-Sépharose (Pharmacia) préalablement équilibrée avec le même tampon. L'incubation se fait en bain sous agitation rotative pendant 2 heures à température ambiante. Le gel est ensuite conditionné dans une colonne.
Dans ces conditions, la sous-unité de haut poids moléculaire (Tbpl ) est recueillie dans l'éluat direct, tandis que la sous-unité de moindre poids moléculaire (Tbp2) est fixée sur la résine. La colonne est rincée par trois volumes de tampon D puis par 5 volumes de tampon phosphate 10 mM pH 7,0. Tbp2 est éluée par le tampon phosphate 1 OmM pH 7,0 contenant 0,5 % de Sarkosyl. L'excès de Sarkosyl contenu dans le tampon d'elution de Tbp2 est éliminé par précipitation à l'éthanol, la protéine est ensuite reprise dans le tampon phosphate 50 mM pH 8,0 contenant du Sarkosyl 0,05 % (tampon C).
La solution est ensuite filtrée sur une membrane de porosité 0,22 μm. Le contenu en protéine est déterminé et ajusté à 1 mg/ml par addition de tampon C, sous conditions aseptiques. Cette préparation est conservée à -70°C.
EXEMPLE 3 : Clonage du fragment d'ADN codant pour Tbp2 8680
L'ADN est extrait par une méthode classique au phénol chloroforme. Pour une quantité de germes correspondant à 1 à 2 g de poids humide, le culot est repris par 25 ml de solution de lyse (glucose 50 mM, EDTA, 10 mM, Tris, 25 mM pH 8.0) supplémentée par 1 ml de protéinase K (Sigma) à 10 mg/ml. Le mélange est incubé 10 min à température ambiante, puis 0,5 ml de sarkosyl à 20% sont ajoutés. Ceci est suivi par une incubation de 10 min à 4°C. Après passage de la suspension à travers une aiguille de 18G, 1 ml de RNAse A (Sigma) à 2 mg/ml est ajouté puis la suspension est incubée à 37°C pendant 90 min. A l'issue de cette étape, l'ADN est extrait par addition de 0.5 volume de phénol . L'extraction se fait par agitation pendant 10 min. puis 0.5 volume de chloroforme-alcool isoamylique (24: 1 ) sont ajoutés. Après centrifugation du mélange à 5000 tours/min, pendant 15 min le surnageant est prélevé et est de nouveau traité au phénol/chloroforme. L'étape d'extraction au phénol/chloroforme est répétée jusqu'à éclaircissement de la phase aqueuse.
A l'issue de l'extraction, l'ADN est précipité par 2 volumes d'éthanol absolu en présence d'acétate de sodium 0,3 M pH 7. puis rincé en éthanol à 70 %. L'ADN est repris dans 1 ml d'eau distillée, puis dosé au spectrophotomètre à 260 nm et à 280 nm. Une unité de DO 260 nm correspond à 50 ng d'ADN/μl. Les préparations d'ADN sont considérées comme satisfaisantes et utilisables si le rapport DO 260/DO 280 est compris entre 1.8 et 2.
A partir de 10 ng d'ADN génomique le gène tbp2 est amplifié Par PCR à l'aide des amorces suivantes :
Interl Bam : 5 ' - CCACGGATCCTGCCGTCTGAAGCCTTATTC- 3 - 3 ' Met 2 Eco : 5 • -CGCGGATCCTGCTATGGTG- 3 '
Le milieu réactionnel est comme suit : 10 ng d'ADN génomique ; 0,5 μM d'amorces 5' et 3' ; 200 μM de dNTPs (Boehringer) ; 10 μl de tampon PCR l Ox (Biotaq) et 2,5 U de Taq polymérase (Biotaq). Le volume réactionnel est ajusté à 100 μl avec de l'eau distillée. Les conditions d'amplification dans un appareil Trioblock (Biolabs) sont les suivantes : dénaturation : 94°C, 1 min ; hybridation : 58°C, 2 min ; elongation : 72°C, 3 min ; nombre de cycles : 25.
Le fragment d'ADN amplifié par PCR est soumis à une électrophorese sur gel d'agarose préparatif 1% ("Electrophoresis grade". BRL) est préparé en tampon TAE (Tris acétate 0.04M, EDTA 0,002M pH 8,0). La bande amplifiée correspondant au gène tbpl est découpée. L'ADN contenu dans l'agarose est purifié à l'aide d'un kit Geneclean (Bio 101). L'ADN est ensuite digéré par EcoRI et BamHI pendant 2h à 37°C. L'ADN digéré est ensuite repurifié par extraction au phénol/chloroforme, précipité par 2 volumes d' éthanol, puis repris par 20 μl de tampon Tris-EDTA (TE) (10 mM Tris-HCI. 1 mM EDTA pH 8,0).
Le vecteur pBSK (-) (Stratagène) est digéré par £coRI et BamH] puis purifié comme décrit ci-avant pour l'insert EcoRllBamHl.
L'insert EcoRl/BamUl et pBSK sont ligués en présence de ligase T4 (Boehringer) à 16°C pendant la nuit dans les conditions suivantes : vecteur 100 ng; insert 200-300 ng; tampon T4 ligase 10X (Boehringer) 1 μl; ligase 5U; eau qsp 10 μl.
E. coli XLl-Blue (recAl. endA\ , gyr A96, thi- \ . /,.«/R17. supE44. relAl . lac. (F proAB, lacQZδMlS, TnlO (tet1")) est précultivées dans 10 ml de milieu SB (Difco) en présence de tétracycline à 10 μg/ml pendant une nuit à 37°C. 500 μl de préculture sont utilisés pour ensemencer 11 de milieu SB. Lorsque la culture atteint la phase exponentielle (DO 600 nm = 0,8), les germes sont lavés trois fois en glycerol 10% en eau en diminuant les volumes de lavage de 500 ml à 120 ml. Le surnageant est éliminé après centrifugation à 2500 x g pendant 15 min à 4°C. Après le dernier lavage, les bactéries sont reprises dans 3 ml de glycerol 10%. 1 mM Hepes pH 7,5. Les germes sont aliquotés sous 100 μl dans des tubes placés dans de l'azote liquide. Les bactéries electrocompétentes sont conservées pendant un mois à -70°C. Cinq μl de la réaction de ligation sont utilisés pour transformer 100 μl de bactéries E.coli XL-1 par électroporation dans des cuves de 2 mm d'épaisseur (Eurogentec) sous un voltage de 2500 volts. Après électroporation, les germes sont incubés 1 heure à 37°C puis 1/10 et 9/10 du volume de la préparation sont étalés sur des boites de milieu LB (Difco) plus ampicilline (100 μg/ml) supplémenté avec du X-gal (25 μg/ml) et de l'IPTG (25 μg/ml) permettant une sélection blanc/bleu des clones recombinants.
Les clones recombinants (blancs) sont analysés après mini-préparation de plasmide selon une méthode classique (Maniatis et al., 1989) par double digestion EcoRI, BamHI. Les clones retenus sont ceux qui ont intégrés un fragment de 2,1 kb. Le sens d'intégration de l'insert est déterminé après digestion par Hincll. L'ADN plasmidique des clones d'intérêt est préparé en quantité importante par une maxi-préparation en utilisant une méthode de purification sur colonne tip-250 ( Kit Quiagen) .
L'ADN plasmidique purifié sur colonne (Quiagen) est séquence en utilisant le kit
Sequenase (USB, version 2.0). Cette technique dérive de la méthode de séquençage décrite par Sanger (Sanger et al., 1977). Trois à cinq μg d'ADN sont utilisés par réaction de séquence. Les réactions de séquences sont chargées sur un gel d'acrylamide 6% en présence d'urée 8M. La séquence nucléotidique révélée et la séquence d'acides aminés déduite sont telles que montrées dans l'ID SΕQ N° 5.
EXEMPLE 4 : Polypeptide T/2169 (1 , 02, Δ3 ; 1 -350) dont la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ NO 1 (IM2169). de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 350.
4A - Préparation du fragment d'ADN codant pour T/2169 (1-350) : Construction du vecteur pTG 5782.
A partir du plasmide pTG3721 décrit dans la demande EPA 586 266, on introduit, par mutagenèse dirigée, un site de restriction Hindlll en aval de la séquence codant pour Tbp2. pour générer le plasmide pTG4704.
A partir du plasmide pTG3721. on amplifie par PCR. à l'aide des amorces OTG4915 et OTG4651 , un fragment comportant la séquence codant pour le signal de sécrétion de RlpB et du début de la séquence codant pour Tbp2 mature jusqu'au site Haell interne.
OTG4915 : AAACCCGGATCCGTTGCCAGCGCTGCCGT Hael l
OTG4651 :
BspHI TTTTTTCATG AGA TAT CTG GCA ACA TTG TTG TTA TCT CTG Met Arg Tyr Leu Ala Thr Leu Leu Leu Ser Leu
GCG GTG TTA ATC ACC GCC GGG TGC CTG GGT GGC Ala Val Leu Ile Thr Ala Gly Cys Leu Gly ...
_clivage du peptide signal
GGC GGC AGT TTC
Le fragment PCR est ensuite digéré par BspHI et Hc/ell et inséré simultanément avec le fragment Hαell-Hindlll de pTG4704 qui comporte la partie 3' de la région codant pour Tbp2. dans le plasmide pTG3704 décrit dans la demande EPA 586 266, digéré par Ncol et HinόUï, pour générer le plasmide pTG5768.
A partir de plasmide pTG3721, on amplifie par PCR. à l'aide des amorces OTG4928 et OTG501 1, un fragment comportant la séquence codant pour la partie N- terminale de Tbp2.
S phi OTG4928 : GTG TTT TTG TTG AGT GCA TGC CTG GGT GGC Val Phe Leu Leu Ser Ala Cys Leu Gly Gly _Clivage du peptide signal
OTG5011 : TGCGCAAGCTTACAGTTTGTCTTTGGTTTTCGCGCTGCCG HindiII Ce fragment PCR est digéré par Sphl et HmdlII, puis clone dans le plasmide pTG4710 décrit dans la demande EPA 586 266 ; on génère ainsi le plasmide pTG5740.
Le fragment Haell-Hindlll de pTG5740 comportant la partie 3' de la séquence codant pour le domaine de liaison à la transferrine humaine (hTf) ( 3' de la région codant pour le premier domaine) est inséré dans le plasmide pTG3704 digéré par BamHI et H/πdlII, simultanément avec le fragment BamHl-Haell de pTG5768 comportant le promoteur araE, la séquence signal rlpB et le début de la séquence codante de Tbp2 ; on génère ainsi le plasmide pTG5782. Ce vecteur comporte le promoteur araB. la séquence codant pour le signal de sécrétion de RlpB fusionnée à la séquence codant pour le domaine N-terminal de Tbp2 ( 1 - 350).
4B - Production et purification de T/2169 (1-350)
Une souche d'E. coli est transformée par pTG5782. Les transformants sont mis en culture à 37°C en milieu M9 + succinate 0.5% + arginine 50μg/ml + ampicilline 100 μg/ml. En phase exponentielle, on ajoute 0.2% d'arabinose (inducteur). Après une heure d'induction, on prélève des cellules et des extraits sont préparés. Une analyse en Western Blot suivie d'une révélation par la hTF-peroxidase permet de détecter une bande majoritaire dont le P. M. correspond à celui attendu pour cette forme tronquée de Tbp2.
Dans un test tel décrit dans l'exemple 4 de W093/6861 (publié : 15. 04. 93) T/2169 purifié se révèle capable d'induire des anticorps bactéricides et par conséquent devrait être utile à des fins vaccinales.
EXEMPLE 5 : Polypeptide T/2394 (1, 02, Δ3 ; 1-340) dont la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ NO 2 (IM2394), de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 340.
5A - Préparation du fragment d'ADN codant pour T/2394 (1-340) :
Construction du vecteur pTG 5755
A partir du plasmide pTG4710 décrit dans la demande EPA 586 266, on amplifie par PCR, à l'aide des amorces OTG4873 et OTG4877, un fragment comportant la région codant pour la partie C-terminale du domaine de liaison à la hTf. Ce fragment est ensuite digéré par Mlul et Hindlll.
OTG4873 : AAAAAGCATGCATAAAAACTACGCGTTACACCATTCAAGC
Ml uJ
OTG4877 :TATATAAGCTTACGTTGCAGGCCCTGCCGCGTTTTCCCC HindiII
Le plasmide pTG4710 est digéré par Mlul et Hindlll. Le fragment Mlul- HmdlII comportant la partie 3' de la séquence codant pour Tbp2 est remplacé par le fragment PCR codant pour la partie C-terminale du domaine de liaison à la hTf. On génère ainsi le plasmide pTG5707. On remplace ensuite dans le plasmide pTG5707. un fragment BamHl-Mlul comportant le promoteur araB et le début de la séquence codant pour Tbp2, par un fragment BamHl-Mlul de pTG4764 décrit dans la demande EPA 586 266 qui comporte le promoteur araB, la séquence codant pour le signal de sécrétion RlpB fusionnée à la séquence codant pour le domaine N-terminal de Tbp2.
On génère ainsi le plasmide pTG5755. Ce vecteur comporte le promoteur araB, la séquence codant pour le signal de sécrétion de RlpB fusionnée à la séquence codant pour le domaine N-terminal de Tbp2 (1 - 340).
5B - Production et purification de T/2394 (1-340)
T/2394 (1 -340) est produit et purifié tel que décrit dans l'Exemple 4B. - j l -
Dans un test tel décrit dans l'exemple 4 de WO93/6861 (publié : 15. 04. 93) T/2394 purifié se révèle capable d'induire des anticorps bactéricides et par conséquent devrait être utile à des fins vaccinales.
EXEMPLE 6 : Polypeptide D4/2169 (1, 02, 3) dont la séquence est identique à celle telle que montrée dans l'ID SEQ NO 1 , de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 691, délétée des régions 362-379, 418-444, 465- 481 et 500-520.
Polypeptide D4/2169 (1 , 02, 3) dont la séquence est identique à celle telle que montrée dans l'ID SEQ NO 1, de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 691. délétée des régions 362-379, 418-444, 465-481 et 500-520.
6A - Préparation du fragment d'ADN codant pour D4/2169
1.1. Clonage du fragment d'ADN
Le fragment d'ADN codant pour la sous-unité Tbp2 de la souche de N. meningitidis IM2169 est amplifié par PCR (Polymérase chain reaction) à l'aide d'amorces spécifiques complémentaires des régions 5' et 3', (respectivement
A5' et A3') sur 10 ng d'ADN génomique extrait d'une culture de bactéries de la souche IM2169.
A5 ' : 5 ' CCCGAATTCTGCCGTCTGAAGCCTTATTC 3 '
A3 ' : 5 ' CCCGAATTCTGCTATGGTGCTGCCTGTG 3 '
Un fragment d'ADN est ainsi obtenu et après digestion par EcoRI. il compte 2150 nt. Ce fragment EcoRI est ensuite ligué aux extrémités EcoRI déphosphorylées du phagemide pBluescriptSK(-) (Stratagene) pour donner le phagemide recombinant pSK/2169tbp2. 1.2. Mise en oeuyre des délétions.
Le clone pSK/2169tbp2 contenant les séquences tbp2 de la souche M982 est délété par la technique de Kunkel, PNAS (1985) 82 : 448.
En bref, la forme phagique du phagemide recombinant pSK/2169tbp2 est obtenue après sauvetage par le phage "helper" VCS Ml 3 selon la technique décrite par Stratagene, fournisseur du vecteur de base, et utilisée pour infecter la souche bactérienne CJ236. Les mutations dut et ung portées par la souche CJ236 ont pour conséquence la synthèse de molécules d'ADN ayant incorporé le précurseur nucléotidique dUTP.
Les phages sont récoltés et l'ADN simple brin est extrait par un mélange phénol/chloroforme. Cet ADN est hybride dans les conditions classiques, aux oligonucléotides suivants :
2169dl 5 ' CGCATCCAAAACCGTACCTGTGCTGCCTGA 3 2169d2 5 ' TTTATCACTTTCCGGGGGCAGGAGCGGAAT 3 2169d3 5' GTTGGAACAGCAGACAGCGGTTTGCGCCCC 3 2169d4 5' GAACATACTTTGTTCGTTTTTGCGCGTCAA 3
La réaction d'hybridation est poursuivie 30 min. en température décroissante à partir de 70°C jusqu'à 30°C.
Le second brin complémentaire est ensuite achevé par synthèse complète en présence des quatre desoxynucléotides. de la T4 DNA polymérase et de la T4 DNA ligase, selon les conditions classiques.
La souche E. coli SURE (Stratagene) est transformée par l'ADN ainsi obtenu. Dans cette souche, les molécules porteuses de dUTP. c'est-à-dire non- mutées, sont détruites.
Les phages obtenus sont analysés par les techniques classiques de préparation rapide d'ADN plasmidique et de digestion par les enzymes de restriction appropriées. La présence de la mutation recherchée est ensuite vérifiée par séquençage nucléotidique. Le clone pSK2169#7, porteur des quatre mutations Δ 1203-1256, Δ 1371- 1451, Δ 1512-1562, et Δ 1617-1679 est sélectionné.
6B - Construction du vecteur d'expression pTG5783
Le plasmide pTG5768 décrit précédemment est digéré par Hpal et Xcml. On insère simultanément dans ce vecteur un fragment Xcml-Xcml de pTG5768 et le fragment Hpάl-Xcml du plasmide pSK/2169ed#7. pour générer le plasmide pTG5783. Ce vecteur comporte le promoteur araB, la séquence codant pour le signal de sécrétion de RlpB fusionnée à la séquence tbpl modifiée (délétions dl à d4).
6C - Préparation et purification de D4/2169.
D4/2169 est produit et purifié selon l'Exemple 4B.
Dans un test tel décrit dans l'exemple 4 de WO93/6861 (publié : 15. 04. 93) D4/2169 purifié s'est révélé capable d'induire des anticorps bactéricides et par conséquent devrait être utile à des fins vaccinales.
EXEMPLE 7 : Détermination du niveau d'expression des RTHs des souches de N. meningitidis
Le taux d'expression de la protéine RTH par N. meningitidis est déterminé par la mesure de la capacité d"un nombre défini de germes à fixer la Tfh couplée à la peroxydase.
Une préculture de 18 heures à 37°C sur MHA sert à ensemenser un erlen contenant 50 ml de MHB supplémenté avec 30 μM d'EDDA. La densité optique est mesurée à 600 nm au début de de la culture et après 5 heures de culture, on appelle croissance, la différence de densité optique entre ces deux temps. L'expression du RTH est mesurée après 5 heures de culture comme suit :
La densité bactérienne de la culture est calculée à partir de fabsorbance de la suspension mesurée à 600 nm sachant qu'une unité d'absorbance correspond à 3.1θ" CFU/ml. Un ml d'une culture bactérienne est centrifugé pendant 15 min à 2500 g puis le culot bactérien est repris par un volume de Tris-HCI 50 mM pH 8,0 de façon à obtenir une suspension de 1.10^ CFU/ml. Dans le même tampon une série de dilutions de raison 2 est effectuée à partir de cette suspension (1/2 à 1/2048). Cinquante μl de chacun de ces
5 échantillons sont déposés dans chacun des puits d'un appareil de "dot-blot" (Biorad) fonctionnant sous vide et équipé d'une membrane de nitrocellulose 0,45 μm (Schleicher et Schull) préalablement imbibée de tampon. Après dépôt des échantillons la membrane est incubée pendant lh à température ambiante en tampon bloquant (Tris-HCI 50 mM pH 8,0, NaCl 9g/l, lait écrémé 10 g/1). La membrane est ensuite incubée pendant lh à
10 37°C sous agitation avec une solution de Tfh-peroxydase à 1 μg/ml en tampon bloquant. Après trois lavages en tampon bloquant, la fixation de la Tfh-peroxydase est révélée par faddition d'un substrat colorimétrique de la peroxydase. le 4-Chloro-l-Naphtol (4-C1- N) à 0,01% dans de l'éthanol 1%.
15 Après 20 min d'incubation à température ambiante, le titre d'expression du RTH est déterminé: il correspond à l'inverse de la dernière dilution pour laquelle une coloration violette est encore visible. La lecture se fait soit visuellement soit en utilisant un densitomètre (Appareil Sebia-Preference).
20
EXEMPLE 8 : Préparation et titrage des sérums hyperimmuns anti-Tbp2s recombinantes (Tbp2M982 100 %. Tbp2 M982 80 % et Tbp2 M982 50 %), anti-RTH M982 et anti-RTH B16B6
">^ 8A - Préparation des immunogènes
Une culture de la souche d'E. coli décrite dans l'Exemple 4B ci-avant ou dans l'Exemple 6B ci-avant est lysée par passage dans un appareil de lyse (Rannie) puis centrifugée. Le matériel insoluble est chargé sur un gel d'acrylamide 10% de 5 mm
30 d'épaisseur (10 mg de protéines insolubles par gel) puis soumis à électrophorese. La protéine Tbp2 ainsi que les formes 80 et 50 % sont visualisées par coloration au Bleu de Coomassie puis extraites du gel. En parallèle, on réalise un témoin négatif correspondant à l'extraction d'une protéine d'E. coli de même taille que la protéine Tbp2.
35 Les RTH M982 et B16B6 sont quant à eux purifiés comme décrit dans les Exemples 1 et 2 de WO 93/6861.
8B - Préparation des antisérums
Des lapins néozélandais albinos reçoivent par voie sous-cutanée multisite, 50 μg d'un des produits décrit ci-avant dans le présent exemple, en présence d'adjuvant complet de Freund. 21 jours et 42 jours après la première injection, les lapins reçoivent à nouveau 50 μg du même produit mais ces fois-ci en présence d'adjuvant incomplet de Freund. 15 jours après la dernière injection, le sérum de animaux est prélevé, puis décomplémenté pendant 30 min à 56°C et stérilisé par filtration sur membrane de porosité 0,22 μm (Millipore).
Lorsque l'immunogène mis en oeuvre est un RTH. le filtrat est par la suite épuisé par contact avec la souche initiale (M982 ou B 16B6) qui pour se faire, a été cultivée au préalable en présence de fer sous forme libre (dans ces conditions, la synthèse du récepteur de la transferrine est réprimée). Les modalités de contact sont comme suit : 10 ml du filtrat sont ajoutés à 10^ cfu (unités formant des colonies) d'une culture de la souche initiale. L'adsoφtion est poursuivie une nuit à 4°C, sous agitation. Les bactéries sont ensuite éliminées par centrifugation de 15 min à 2500 x g. Le surnageant est récupéré puis soumis à nouveau à 3 opérations d'adsoφtion successives comme précédemment décrit. Les sérums adsorbés sont filtrés sur une membrane de porosité 0.22 μm (Millipore) et conservés à -20°C.
Dans le cas des sérums dirigés contre des protéines Tbp2 recombinantes, l'adsoφtion s'effectue contre la souche d'E coli qui a servi à produire les protéines recombinantes, cultivées pendant 5h en milieu LB (Difco) supplémenté en ampicilline à 100 μg/ml.
8C - Titrage de l'activité bactéricide des sérums
La capacité des sérums anti-RTH ou anti-Tbp2 à induire la lyse des différentes souches de N. meningitidis est évaluée par un essai de bactéricidie. Cette technique consiste à mettre en présence deux volumes des dilutions de raison 2 ( 1/4 à 1/2048) du sérum adsorbé et décomplémenté à titrer, un volume de complément de jeune lapin dilué au 1/1.5 et un volume de suspension bactérienne contenant 70 germes issue d'une culture de 5h à 37°C en bouillon MHB pH 7.2, EDDA 30 μM. Les réactifs sont mélangés les uns aux autres dans des cupules et incubés pendant 30 min à 37°C sous agitation. La réaction de bactéricidie du sérum vis à vis des germes est arrêtée par l'addition d'1 ml de gélose constituée de bouillon MH pH 7,2, de 20% de supplément G (Pasteur Diagnostic) et 15% d'agar noble (Difco). Les cupules sont ensuite incubées pendant une nuit à 37°C en présence de 10% CO2- La lecture des résultats consiste à numérer les colonies formées à partir des bactéries non lysées. Le titre est défini comme l'inverse de la dernière dilution du sérum induisant la lyse de 50% des bactéries introduites initialement.
8D - Caractérisation des sérums anti-Tbp2s M982 recombinantes
La spécificité de quatre sérums hyperimmuns dirigés respectivement contre une protéine Tbp2-100% (sérum 577), Tbp2-80% (580). Tbp2-50% (583) ou encore contre une protéine non-sens d' Escherichia coli (sérum témoin 582) est analysée soit par une méthode de "dot-blot" sur germes entiers, soit par la méthode de "western-blot" sur des protéines de membranes externes.
1.1. Analyse sur des geπnes entiers
La préparation des germes, leur dépôt sur membrane de nitrocellulose sont identiques à ce qui a été décrit dans l'Exemple 9. M982 et B16B6 sont cultivées en absence ou en présence d'agent chélatant.
Après l'étape de saturation en tampon bloquant, la membrane est incubée avec un des différents sérums hyperimmuns à analyser (dilué en tampon bloquant: dilutions allant de 1/500 à 1/10000) pendant i h à 37°C. La membrane est ensuite lavée deux fois en tampon bloquant sous agitation forte puis, afin de révéler le premier sérum, elle est de nouveau incubée avec un sérum de chèvre anti IgG de lapin couplé à la peroxydase (Zymed) dilué au 1/1000 en tampon bloquant. Pour augmenter la sensibilité de la détection du signal, le substrat de la peroxydase utilisée est un substrat chimioluminescent (Kit ECL, Amersham) utilisé selon les recommandations du fabriquant.
Les résultats que l'on obtient, indiquent que le sérum anti-protéine d'E. coli
(sérum 582) est un bon témoin négatif dans le sens ou il ne permet de détecter ni la souche M982, ni la souche B 16B6 quelque soit les conditions de culture. Les trois autres sérums reconnaissent uniquement la souche M982 et à un niveau plus élevé quand elle est cultivée en présence d'EDDA ce qui correspond à une reconnaissance du RTH. En effet la souche M982 exprime le RTH à un niveau basai quand elle est cultivée en l'absence d'agent chélatant et ce niveau augmente en présence d'agent chélatant. Les résultats indiquent que les sérums anti-Tbp2
100% (577), anti-Tbp2 80% (580) et anti-Tbp2 50% (583) sont spécifiques du RTH de la souche M982.
1.2. Analyse sur des protéines de membranes externes
La souche M982 est cultivée en milieu appauvri en fer. Cinq ml de la culture en phase exponentielle (environ 1.10° germes/ml) sont centrifugés à
1500 g pendant 15 min. Le culot est repris par 1,5 ml de Tris-HCI 125 mM, pH
8,0. La suspension est lysée par sonication (appareil Branson-Sonifer 450, sonde de 3 mm de diamètre) pendant 2 min. La lyse est poursuivie par addition de
Triton XI 00 à 1% final et incubation 30 min dans de la glace. La suspension est centrifugée à 8000 g pour éliminer les bactéries non lysées. puis le surnageant est centrifugé 30 min à 10000 g pour obtenir sous forme de culot les membranes externes. Le culot est repris en Tris-HCI 125 mM. pH 8.0. puis dosé en protéines par une microméthode (Kit Micro-BCA. Pierce) utilisée selon les recommandations du fabriquant.
Une électrophorese est réalisée sur gel de polyacrylamide en présence de SDS selon la méthode de Laemmli (Laemli. 1970). Le gel séparateur contient 12,5% d'acrylamide et le gel de concentration en contient 5 %. Les échantillons à analyser sont dilués au demi en tampon échantillon (0.125 M de tampon Tris à pH 6,8; 25 % de glycerol; 2,5 % de 2-Mercaptoethanol: 0,001 % de bleu de Bromophénol) et hydrolyses à 100°C. Cinquante μg de protéines sont déposés pour un grand gel et 1 μg pour les gels Phast (Pharmacia, reticulation 12,5%). La migration est réalisée à un voltage constant 50 V pour des gels de 15x12 cm
(appareil vertical Biorad) et de 250 V sur les gels Phast .
Après une étape de fixation de 30 min dans une solution d'acide acétique
10%, isopropanol 25%, les gels sont colorés au bleu de Coomassie (0,25 % bleu; 45% méthanol: 10% acide acétique). Les gels sont ensuite décolorés progressivement dans des bains successifs de méthanol 20%, acide acétique 10%.
Les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose (Schleicher & Schull ; 0,45 μm) selon la méthode de Towbin (Towbin et al., 1979). Le transfert se fait sous ampérage constant (1 mAJcxxfi) pendant 90 min pour un grand gel et 1 heure pour un gel Phast. L'efficacité du transfert est révélée par coloration au rouge Ponceau (Kodak). Après transfert, la nitrocellulose est lavée en tampon bloquant (Tris-HCI 0,5 M pH 7,5 ; 1 % lait écrémé ; 150 mM NaCl) pendant 1 heure à température ambiante.
L'incubation avec l'antiserum dilué en tampon bloquant a lieu pendant une heure à 37°C. Le premier sérum est révélé par un antisérum couplé à la peroxydase (chèvre anti-lapin, Zymed) pendant une heure à 37°C. Le substrat de la peroxydase est le 4-chloro 1 -naphtol à 1 % (coloration violette).
Les résultats obtenus indiquent que la protéine Tbp2 de la souche M982 est spécifiquement reconnue par les sérums anti-Tbp2 100%), anti-Tbp2 80% et anti-Tbp2 50%. Aucune autre protéine de N. meningitidis n'est reconnue par ces sérums. Le sérum anti-protéine d'E. coli ne reconnaît pas la Tbp2 de la souche N. meningitidis M982.
8Ε - Titrage des sérums anti-Tbp2 M982 recombinantes
Pour pouvoir comparer les sérums hyperimmuns anti-Tbp2 100, 80 et 50 % adsorbés sur E. coli, il est nécessaire de connaître leur titre vis à vis de la souche homologue. C'est pourquoi un titrage en "dot-blot" sur des germes M982 cultivés en milieu appauvri en fer est réalisé en appliquant le protocole décrit en 9.D.2.
Une concentration identique de germes ( 1.10° germes/ml) est déposée sur des filtres de nitrocellulose qui sont ensuite révélés avec des dilutions de raison 2 des différents sérums à titrer. Les titres sont définis comme l'inverse de la dernière dilution pour laquelle un signai positif est observé. Avec une révélation colorimétrique les titres obtenus sont les suivants: 512 pour le sérum anti-Tbp2 100% (sérum 577); 256 pour le sérum anti-Tbp2 80% (sérum 580); 256 pour le sérum anti-Tbp2 50% (sérum
583) Ceci indique que les trois sérums hyperimmuns anti-Tbp2 100, 80 et 50 % ont à une raison 2 près le même titre vis à vis de la souche M982. De ce fait pour l'analyse de leur réactivité croisée vis à vis de différentes souches type M982, ils peuvent être utilisés à la même concentration.
EXEMPLE 9 : Analyse de la réactivité croisée des sérums anti-Tbp2 M982 recombinantes
La détermination du niveau de réactivité croisée vis à vis des souches de type M982 est mise en oeuvre par la méthode de dot blot comme décrit dans l'Exemple 8.
Après culture en milieu MHB + 30mM EDDA pendant 5 heures, des dilutions de raison 2 des différentes suspensions bactériennes sont déposées sur 5 filtres de nitrocellulose différents :
un premier filtre est révélé avec de la transferrine humaine couplée à la peroxydase (TGH) et permet de définir un titre de fixation de la TFH :
- le second est révélé avec un sérum anti-protéine d'E. coli (sérum utilisé au
1 /2000e ; témoin négatif) ;
le troisième est révélé avec un sérum dirigé contre une protéine Tbp2 M982 recombinante entière ( 100%) ;
le quatrième est révélé avec un sérum dirigé contre une protéine Tbp2 M982 recombinante délétée des portion hypervariables de la région "charnière" (80%) ; et
- le cinquième est révélé avec un sérum dirigé contre une protéine Tbp2 M982 recombinante correspond à la région 50% N-terminale. Les titres sont définis comme l'inverse de la dernière dilution pour laquelle une coloration est visible.
Pour pouvoir quantifier la réactivité croisée de chacun des sérums avec chacune des souches, il est nécessaire de définir une valeur qui tienne compte de la variabilité du niveau d'expression du RTH parmi les souches analysées. C'est pourquoi un index correspondant au titre sérique rapporté au titre d'expression de la transferrine est calculé. Cet index est la valeur retenue pour l'analyse car elle tient compte du niveau variable d'expression du RTH d'une souche à l'autre dans nos conditions de culture. Cependant cet index ne peut pas rendre compte d'une éventuelle différence d'affinité des RTH.
Pour information, on présente dans le tableau ci-dessous un récapitulatif des valeurs d'index obtenus pour les 54 souches.
Figure imgf000042_0001
EXEMPLE 10 : Etude de bactéricidie croisée
10A. Préparation d'un antisérum anti-RTH de /V. meningitidis 8680
Une préparation de RTH 8680 telle qu'obtenue dans l'Exemple 1 est utilisée comme immunogène afin de préparer un antisérum selon le protocole décrit dans l'Exemple 8B. 10B. Culture des souches
Les souches N. meningitidis 92/04. M871. 504/91 , 8680, 8726, BZ83, 44, 52 et 8710 (souches provenant du laboratoire de référence des méningoccoques : Dr. Caugant, WHO-collaborationg center for référence and research on meningococci, NIPH. Oslo, Norway ; et faisant partie du groupe électrophorétique ET5 (B. Mohamed-Rokbi, Thèse présentée le 10 octobre 1995, devant l'Université Claude Bernard. Lyon, France pour l'obtention du diplôme de Doctorat) ainsi que les souches M982 et B16B6 sont cultivées comme décrit dans l'Exemple 1 A.
10C. Test de bactéricidie
L'activité bactéricide de l'antiserum préparé en 10A est testée à l'encontre des souches cultivées en 10B selon le protocole décrit dans l'Exemple 8C.
Les résultats sont présentés dans le tableau ci-après :
Figure imgf000043_0001
Les titres de bactéricidie obtenus à l'encontre des souches du groupe électrophorétique ET5 mettent en évidence une bactéricidie croisée. Ceux obtenus à l'encontre des souches B16B6 et M982 par contre témoignent d'une absence de bactéricidie croisée.
Ces résultats tendent à supporter la proposition faite par la présente demande, à savoir l'ajout éventuel d'une protéine Tbp2 ou d'un RTH qui dérive d'une souche de type 8680, à une composition vaccinale contenant (i) une Tbp2 ou un RTH qui dérive d'une souche de type M982 et (ii) une Tbp2 ou un RTH qui dérive d'une souche de type B16B6 ; ceci sans préjudice porté aux résultats déjà constatés en matière de reconnaissance de la souche 8680 en Western blot, par les antisérums anti-RTH M982 et anti-RTH B16B6.
ID SEQ NO Nom du Séquence Projet
1, 2 IM2169-2 Tbρ2 IM2169 complète
3, 4 IM2394-2 Tbp2 IM2394 complète
5, 6 8680 Tbp28680 complète
7 2D IM2169 2ième domaine de Tbp2 IM2169
8 2D6940 2ième domaine de Tbp26940
9 2D2223 2ième domaine de Tbp22223
10 2D 708 2ième domaine de Tbp2708
11 2D M978 2ième domaine de Tbp2 M978
12 2D 1610 2ième domaine de Tbp21610
13 2D867 2ième domaine de Tbp22D867
14 2D S3032 2ième domaine de Tbp2 S3032
15 2D891 2ième domaine de Tbp2 M981
16 OTG 4915 OTG 4915
17 OTG 4651 OTG 4651
18 OTG 4928 OTG 4928
19 OTG 5011 OTG 5011
20 OTG 4873 OTG 4873
21 OTG 4877 OTG 4877
22 A 5' A 5'
23 A 3' A 3'
24 2169 D1 2169 D1
25 2169 D2 2169 D2
26 2169 D3 2169 D3
27 2169 D4 2169 D4
28 Inter 1 Bam Inter 1 Bam
29 Met 2 Eco Met 2 Eco LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(l) DEPOSANT
(A) NOM Pasteur Merieux sérums et vaccins
(B) RUE 58, avenue leclerc (C) VILLE: Lyon
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 69007
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Fragments Tbp2 de N. meningitidis (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 29
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D1 EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2230 paires de bases
(B) TYPE: nucl,otιde
(C) NOMBRE DE BRINS: Simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (g,nomιque)
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Neisseria meningitidis
(B) SOUCHE: IM2169
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: sιg_peptιde
(B) EMPLACEMENT: 60..119
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: mat_peptιde
(B) EMPLACEMENT:120..2192
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:60..2192
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: mιsc_feature
(B) EMPLACEMENT: 120..1154
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: mιsc_feature
(B) EMPLACEMENT:1155..1748
(ix) CARACTERISTIQUE. (A) NOM/CLE: misc_feature
(B) EMPLACEMENT:1749..2192
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc_binding
(B) EMPLACEMENT:237..1169
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
ATTTGTTAAA AATAAATAAA ATAATAATCC TTATCATTCT TTAATTGAAT TGGGTTTAT 59
ATG AAC AAT CCA TTG GTA AAT CAG GCT GCT ATG GTG CTG CCT GTG TTT 107 Met Asn Asn Pro Leu Val Asn Gin Ala Ala Met Val Leu Pro Val Phe -20 -15 -10 -5
TTG TTG AGT GCC TGT CTG GGC GGC GGC GGC AGT TTC GAT CTT GAT TCT 155 Leu Leu Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser 1 5 10
GTC GAT ACC GAA GCC CCG CGT CCC GCG CCA AAG TAT CAA GAT GTT TCT 203 Val Asp Thr Glu Ala Pro Arg Pro Ala Pro Lys Tyr Gin Asp Val Ser 15 20 25
TCC GAA AAA CCG CAA GCC CAA AAA GAC CAA GGC GGA TAC GGT TTT GCG 251 Ser Glu Lys Pro Gin Ala Gin Lys Asp Gin Gly Gly Tyr Gly Phe Ala 30 35 40
ATG AGG TTG AAA CGG AGG AAT TGG TAT CCG GGG GCA GAA GAA AGC GAG 299 Met Arg Leu Lys Arg Arg Asn Trp Tyr Pro Gly Ala Glu Glu Ser Glu 45 50 55 60
GTT AAA CTG AAC GAG AGT GAT TGG GAG GCG ACG GGA TTG CCG ACA AAA 347 Val Lys Leu Asn Glu Ser Asp Trp Glu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Lys 65 70 75
CCC AAG GAA CTT CCT AAA CGG CAA AAA TCG GTT ATT GAA AAA GTA GAA 395 Pro Lys Glu Leu Pro Lys Arg Gin Lys Ser Val Ile Glu Lys Val Glu 80 B5 90
ACA GAC GGC GAC AGC GAT ATT TAT TCT TCC CCC TAT CTC ACA CCA TCA 443 Thr Asp Gly Asp Ser Asp Ile Tyr Ser Ser Pro Tyr Leu Thr Pro Ser 95 100 105
AAC CAT CAA AAC GGC AGC GCT GGC AAC GGT GTA AAT CAA CCT AAA AAT 491 Asn His Gin Asn Gly Ser Ala Gly Asn Gly Val Asn Gin Pro Lys Asn 110 115 120
CAG GCA ACA GGT CAC GAA AAT TTC CAA TAT GTT TAT TCC GGT TGG TTT 539 Gin Ala Thr Gly His Glu Asn Phe Gin Tyr Val Tyr Ser Gly Trp Phe 125 130 135 140
TAT AAA CAT GCA GCG AGT GAA AAA GAT TTC AGT AAC AAA AAA ATT AAG 587 Tyr Lys His Ala Ala Ser Glu Lys Asp Phe Ser Asn Lys Lys Ile Lys 145 150 155
TCA GGC GAC GAT GGT TAT ATC TTC TAT CAC GGT GAA AAA CCT TCC CGA 635 Ser Gly Asp Asp Gly Tyr Ile Phe Tyr His Gly Glu Lys Pro Ser Arg 160 165 170
CAA CTT CCT GCT TCT GGA AAA GTT ATC TAC AAA GGT GTG TGG CAT TTT 683 Gin Leu Pro Ala Ser Gly Lys Val Ile Tyr Lys Gly Val Trp His Phe 175 180 185
GTA ACC GAT ACA AAA AAG GGT CAA GAT TTT CGT GAA ATT ATC CAG CCT 731 Val Thr Asp Thr Lys Lys Gly Gin Asp Phe Arg Glu Ile Ile Gin Pro 190 195 200
TCA AAA AAA CAA GGC GAC AGG TAT AGC GGA TTT TCT GGT GAT GGC AGC 779 Ser Lys Lys Gin Gly Asp Arg Tyr Ser Gly Phe Ser Gly Asp Gly Ser 205 210 215 220
GAA GAA TAT TCC AAC AAA AAC GAA TCC ACG CTG AAA GAT GAT CAC GAG 827 Glu Glu Tyr Ser Asn Lys Asn Glu Ser Thr Leu Lys Asp Asp His Glu 225 230 235
GGT TAT GGT TTT ACC TCG AAT TTA GAA GTG GAT TTC GGC AAT AAG AAA 875 Gly Tyr Gly Phe Thr Ser Asn Leu Glu Val Asp Phe Gly Asn Lys Lys 240 245 250
TTG ACG GGT AAA TTA ATA CGC AAT AAT GCG AGC CTA AAT AAT AAT ACT 923 Leu Thr Gly Lys Leu Ile Arg Asn Asn Ala Ser Leu Asn Asn Asn Thr 255 260 265
AAT AAT GAC AAA CAT ACC ACC CAA TAC TAC AGC CTT GAT GCA CAA ATA 971 Asn Asn Asp Lys His Thr Thr Gin Tyr Tyr Ser Leu Asp Ala Gin Ile 270 275 280
ACA GGC AAC CGC TTC AAC GGC ACG GCA ACG GCA ACT GAC AAA AAA GAG 1019 Thr Gly Asn Arg Phe Asn Gly Thr Ala Thr Ala Thr Asp Lys Lys Glu 285 290 295 300
AAT GAA ACC AAA CTA CAT CCC TTT GTT TCC GAC TCG TCT TCT TTG AGC 1067 Asn Glu Thr Lys Leu His Pro Phe Val Ser Asp Ser Ser Ser Leu Ser 305 310 315
GGC GGC TTT TTC GGC CCG CAG GGT GAG GAA TTG GGT TTC CGC TTT TTG 1115 Gly Gly Phe Phe Gly Pro Gin Gly Glu Glu Leu Gly Phe Arg Phe Leu 320 325 330
AGC GAC GAT CAA AAA GTT GCC GTT GTC GGC AGC GCG AAA ACC AAA GAC 1163 Ser Asp Asp Gin Lys Val Ala Val Val Gly Ser Ala Lys Thr Lys Asp 335 340 345
AAA CTG GAA AAT GGC GCG GCG GCT TCA GGC AGC ACA GGT GCG GCA GCA 1211 Lys Leu Glu Asn Gly Ala Ala Ala Ser Gly Ser Thr Gly Ala Ala Ala 350 355 360
TCG GGC GGT GCG GCA GGC ACG TCG TCT GAA AAC AGT AAG CTG ACC ACG 1259 Ser Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Ser Lys Leu Thr Thr 365 370 375 380
GTT TTG GAT GCG GTT GAA TTG ACA CTA AAC GAC AAG AAA ATC AAA AAT 1307 Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys Ile Lys Asn 385 390 395 CTC GAC AAC TTC AGC AAT GCC GCC CAA CTG GTT GTC GAC GGC ATT ATG 1355 Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp Gly Ile Met 400 405 410
ATT CCG CTC CTG CCC AAG GAT TCC GAA AGC GGG AAC ACT CAG GCA GAT 1403 Ile Pro Leu Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly Asn Thr Gin Ala Asp 415 420 425
AAA GGT AAA AAC GGC GGA ACA GAA TTT ACC CGC AAA TTT GAA CAC ACG 1451 Lys Gly Lys Asn Gly Gly Thr Glu Phe Thr Arg Lys Phe Glu His Thr 430 435 440
CCG GAA AGT GAT AAA AAA GAC GCC CAA GCA GGT ACG CAG ACG AAT GGG 1499 Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gin Ala Gly Thr Gin Thr Asn Gly 445 450 455 460
GCG CAA ACC GCT TCA AAT ACG GCA GGT GAT ACC AAT GGC AAA ACA AAA 1547 Ala Gin Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly Lys Thr Lys 465 470 475
ACC TAT GAA GTC GAA GTC TGC TGT TCC AAC CTC AAT TAT CTG AAA TAC 1595 Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr 480 485 490
GGA ATG TTG ACG CGC AAA AAC AGC AAG TCC GCG ATG CAG GCA GGA GGA 1643 Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gin Ala Gly Gly 495 500 505
AAC AGT AGT CAA GCT GAT GCT AAA ACG GAA CAA GTT GAA CAA AGT ATG 1691 Asn Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gin Val Glu Gin Ser Met 510 515 520
TTC CTC CAA GGC GAG CGT ACC GAT GAA AAA GAG ATT CCA ACC GAC CAA 1739 Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro Thr Asp Gin 525 530 535 540
AAC GTC GTT TAT CGG GGG TCT TGG TAC GGG CAT ATT GCC AAC GGC ACA 1787 Asn Val Val Tyr Arg Gly Ser Trp Tyr Gly His Ile Ala Asn Gly Thr 545 550 555
AGC TGG AGC GGC AAT GCT TCT GAT AAA GAG GGC GGC AAC AGG GCG GAA 1835 Ser Trp Ser Gly Asn Ala Ser Asp Lys Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu 560 565 570
TTT ACT GTG AAT TTT GCC GAT AAA AAA ATT ACC GGC AAG TTA ACC GCT 1883 Phe Thr Val Asn Phe Ala Asp Lys Lys Ile Thr Gly Lys Leu Thr Ala 575 580 585
GAA AAC AGG CAG GCG CAA ACC TTT ACC ATT GAG GGA ATG ATT CAG GGC 1931 Glu Asn Arg Gin Ala Gin Thr Phe Thr Ile Glu Gly Met Ile Gin Gly 590 595 600
AAC GGC TTT GAA GGT ACG GCG AAA ACT GCT GAG TCA GGT TTT GAT CTC 1979 Asn Gly Phe Glu Gly Thr Ala Lys Thr Ala Glu Ser Gly Phe Asp Leu 605 610 615 620
GAT CAA AAA AAT ACC ACC CGC ACG CCT AAG GCA TAT ATC ACA GAT GCC 2027 Asp Gin Lys Asn Thr Thr Arg Thr Pro Lys Ala Tyr Ile Thr Asp Ala 625 630 635
AAG GTA AAG GGC GGT TTT TAC GGG CCT AAA GCC GAA GAG TTG GGC GGA 2075 Lys Val Lys Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Leu Gly Gly 640 645 650
TGG TTT GCC TAT CCG GGC GAT AAA CAA ACG GAA AAG GCA ACA GCT ACA 2123 Trp Phe Ala Tyr Pro Gly Asp Lys Gin Thr Glu Lys Ala Thr Ala Thr 655 660 665
TCC AGC GAT GGA AAT TCA GCA AGC AGC GCG ACC GTG GTA TTC GGT GCG 2171 Ser Ser Asp Gly Asn Ser Ala Ser Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala 670 675 680
AAA CGC CAA CAG CCT GTG CAA TAAGCACGGT TGCCGAACAA TCAAGAATAA 2222
Lys Arg Gin Gin Pro Val Gin 685 690
GGCTTCAG 2230
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 711 acides amin.s
(B) TYPE: acide amin,
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(il) TYPE DE MOLECULE: prot,ine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Asn Asn Pro Leu Val Asn Gin Ala Ala Met Val Leu Pro Val Phe -20 -15 -10 -5
Leu Leu Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser 1 5 10
Val Asp Thr Glu Ala Pro Arg Pro Ala Pro Lys Tyr Gin Asp Val Ser 15 20 25
Ser Glu Lys Pro Gin Ala Gin Lys Asp Gin Gly Gly Tyr Gly Phe Ala 30 35 40
Met Arg Leu Lys Arg Arg Asn Trp Tyr Pro Gly Ala Glu Glu Ser Glu 45 50 55 60
Val Lys Leu Asn Glu Ser Asp Trp Glu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Lys 65 70 75
Pro Lys Glu Leu Pro Lys Arg Gin Lys Ser Val Ile Glu Lys Val Glu 80 85 90
Thr Asp Gly Asp Ser Asp Ile Tyr Ser Ser Pro Tyr Leu Thr Pro Ser 95 100 105
Asn His Gin Asn Gly Ser Ala Gly Asn Gly Val Asn Gin Pro Lys Asn 110 115 120 Gln Ala Thr Gly His Glu Asn Phe Gin Tyr Val Tyr Ser Gly Trp Phe 125 130 135 140
Tyr Lys His Ala Ala Ser Glu Lys Asp Phe Ser Asn Lys Lys Ile Lys 145 150 155
Ser Gly Asp Asp Gly Tyr Ile Phe Tyr His Gly Glu Lys Pro Ser Arg 160 165 170
Gin Leu Pro Ala Ser Gly Lys Val Ile Tyr Lys Gly Val Trp His Phe 175 180 185
Val Thr Asp Thr Lys Lys Gly Gin Asp Phe Arg Glu Ile Ile Gin Pro 190 195 200
Ser Lys Lys Gin Gly Asp Arg Tyr Ser Gly Phe Ser Gly Asp Gly Ser 205 210 215 220
Glu Glu Tyr Ser Asn Lys Asn Glu Ser Thr Leu Lys Asp Asp His Glu 225 230 235
Gly Tyr Gly Phe Thr Ser Asn Leu Glu Val Asp Phe Gly Asn Lys Lys 240 245 250
Leu Thr Gly Lys Leu Ile Arg Asn Asn Ala Ser Leu Asn Asn Asn Thr 255 260 265
Asn Asn Asp Lys His Thr Thr Gin Tyr Tyr Ser Leu Asp Ala Gin Ile 270 275 280
Thr Gly Asn Arg Phe Asn Gly Thr Ala Thr Ala Thr Asp Lys Lys Glu 285 290 295 300
Asn Glu Thr Lys Leu His Pro Phe Val Ser Asp Ser Ser Ser Leu Ser 305 310 315
Gly Gly Phe Phe Gly Pro Gin Gly Glu Glu Leu Gly Phe Arg Phe Leu 320 325 330
Ser Asp Asp Gin Lys Val Ala Val Val Gly Ser Ala Lys Thr Lys Asp 335 340 345
Lys Leu Glu Asn Gly Ala Ala Ala Ser Gly Ser Thr Gly Ala Ala Ala 350 355 360
Ser Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Ser Lys Leu Thr Thr 365 370 375 380
Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys Ile Lys Asn 385 390 395
Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp Gly Ile Met 400 405 410
Ile Pro Leu Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly Asn Thr Gin Ala Asp 415 420 425
Lys Gly Lys Asn Gly Gly Thr Glu Phe Thr Arg Lys Phe Glu His Thr 430 435 440
Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gin Ala Gly Thr Gin Thr Asn Gly 445 450 455 460
Ala Gin Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly Lys Thr Lys 465 470 475
Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr 480 485 490
Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gin Ala Gly Gly 495 500 505
Asn Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gin Val Glu Gin Ser Met 510 515 520
Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro Thr Asp Gin 525 530 535 540
Asn Val Val Tyr Arg Gly Ser Trp Tyr Gly His Ile Ala Asn Gly Thr 545 550 555
Ser Trp Ser Gly Asn Ala Ser Asp Lys Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu 560 565 570
Phe Thr Val Asn Phe Ala Asp Lys Lys Ile Thr Gly Lys Leu Thr Ala 575 580 585
Glu Asn Arg Gin Ala Gin Thr Phe Thr Ile Glu Gly Met Ile Gin Gly 590 595 600
Asn Gly Phe Glu Gly Thr Ala Lys Thr Ala Glu Ser Gly Phe Asp Leu 605 610 615 620
Asp Gin Lys Asn Thr Thr Arg Thr Pro Lys Ala Tyr Ile Thr Asp Ala 625 630 635
Lys Val Lys Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Leu Gly Gly 640 645 650
Trp Phe Ala Tyr Pro Gly Asp Lys Gin Thr Glu Lys Ala Thr Ala Thr 655 660 665
Ser Ser Asp Gly Asn Ser Ala Ser Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala 670 675 680
Lys Arg Gin Gin Pro Val Gin 685 690
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1808 paires de bases
(B) TYPE: nucl.otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g,nomique)
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: IM2394
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: sig_peptide
(B) EMPLACEMENT:1..60
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: mat_peptide
(B) EMPLACEMENT:61..1797
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..1797
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc_feature
(B) EMPLACEMENT:61..1035
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc_feature
(B) EMPLACEMENT: 1036..1386
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc_feature
(B) EMPLACEMENT:1387..1797
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: misc_binding
(B) EMPLACEMENT:46..1050
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
ATG AAC AAT CCA TTG GTA AAT CAG GCT GCT ATG GTG CTG CCT GTG TTT 48 Met Asn Asn Pro Leu Val Asn Gin Ala Ala Met Val Leu Pro Val Phe -20 -15 -10 -5
TTG TTG AGT GCT TGT CTG GGT GGC GGC GGC AGT TTC GAT TTG GAC AGC 96 Leu Leu Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser 1 5 10
GTG GAA ACC GTG CAA GAT ATG CAC TCC AAA CCT AAG TAT GAG GAT GAA 144 Val Glu Thr Val Gin Asp Met His Ser Lys Pro Lys Tyr Glu Asp Glu 15 20 25
AAA AGC CAG CCT GAA AGC CAA CAG GAT GTA TCG GAA AAC AGC GGC GCG 192 Lys Ser Gin Pro Glu Ser Gin Gin Asp Val Ser Glu Asn Ser Gly Ala 30 35 40
GCT TAT GGC TTT GCA GTA AAA CTA CCT CGC CGG AAT GCA CAT TTT AAT 240 Ala Tyr Gly Phe Ala Val Lys Leu Pro Arg Arg Asn Ala His Phe Asn 45 50 55 60
CCT AAA TAT AAG GAA AAG CAC AAA CCA TTG GGT TCA ATG GAT TGG AAA 288 Pro Lys Tyr Lys Glu Lys His Lys Pro Leu Gly Ser Met Asp Trp Lys 65 70 75
AAA CTG CAA AGA GGA GAA CCA AAT AGT TTT AGT GAG AGG GAT GAA TTG 336 Lys Leu Gin Arg Gly Glu Pro Asn Ser Phe Ser Glu Arg Asp Glu Leu 80 85 90
GAA AAA AAA CGG GGT AGT TCT GAA CTT ATT GAA TCA AAA TGG GAA GAT 384 Glu Lys Lys Arg Gly Ser Ser Glu Leu Ile Glu Ser Lys Trp Glu Asp 95 100 105
GGG CAA AGT CGT GTA GTT GGT TAT ACA AAT TTC ACT TAT GTC CGT TCG 432 Gly Gin Ser Arg Val Val Gly Tyr Thr Asn Phe Thr Tyr Val Arg Ser 110 115 120
GGA TAT GTT TAC CTT AAT AAA AAT AAT ATT GAT ATT AAG AAT AAT ATA 480 Gly Tyr Val Tyr Leu Asn Lys Asn Asn Ile Asp Ile Lys Asn Asn Ile 125 130 135 140
GTT CTT TTT GGA CCT GAC GGA TAT CTT TAC TAT AAA GGG AAA GAA CCT 528 Val Leu Phe Gly Pro Asp Gly Tyr Leu Tyr Tyr Lys Gly Lys Glu Pro 145 150 155
TCC AAG GAG CTG CCA TCG GAA AAG ATA ACT TAT AAA GGT ACT TGG GAT 576 Ser Lys Glu Leu Pro Ser Glu Lys Ile Thr Tyr Lys Gly Thr Trp Asp 160 165 170
TAT GTT ACT GAT GCT ATG GAA AAA CAA AGG TTT GAA GGA TTG GGT AGT 624 Tyr Val Thr Asp Ala Met Glu Lys Gin Arg Phe Glu Gly Leu Gly Ser 175 180 185
GCA GCA GGA GGA GAT AAA TCG GGG GCG TTG TCT GCA TTA GAA GAA GGG 672 Ala Ala Gly Gly Asp Lys Ser Gly Ala Leu Ser Ala Leu Glu Glu Gly 190 195 200
GTA TTG CGT AAT CAG GCA GAG GCA TCA TCC GGT CAT ACC GAT TTT GGT 720 Val Leu Arg Asn Gin Ala Glu Ala Ser Ser Gly His Thr Asp Phe Gly 205 210 215 220
ATG ACT AGT GAG TTT GAG GTT GAT TTT TCT GAT AAA ACA ATA AAG GGC 768 Met Thr Ser Glu Phe Glu Val Asp Phe Ser Asp Lys Thr Ile Lys Gly 225 230 235
ACA CTT TAT CGT AAC AAC CGT ATT ACT CAA AAT AAT AGT GAA AAC AAA 816 Thr Leu Tyr Arg Asn Asn Arg Ile Thr Gin Asn Asn Ser Glu Asn Lys 240 245 250
CAA ATA AAA ACT ACG CGT TAC ACC ATT CAA GCA ACT CTT CAC GGC AAC 864 Gin Ile Lys Thr Thr Arg Tyr Thr Ile Gin Ala Thr Leu His Gly Asn 255 260 265
CGT TTC AAA GGT AAG GCG TTG GCG GCA GAT AAA GGT GCA ACA AAT GGA 912 Arg Phe Lys Gly Lys Ala Leu Ala Ala Asp Lys Gly Ala Thr Asn Gly 270 275 280
AGT CAT CCC TTT ATT TCC GAC TCC GAC AGT TTG GAA GGC GGA TTT TAC 960 Ser His Pro Phe Ile Ser Asp Ser Asp Ser Leu Glu Gly Gly Phe Tyr 285 290 295 300 GGG CCG AAA GGC GAG GAA CTT GCC GGT AAA TTC TTG AGC AAC GAC AAC 1008 Gly Pro Lys Gly Glu Glu Leu Ala Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Asn 305 310 315
AAA GTT GCA GCG GTG TTT GGT GCG AAG CAG AAA GAT AAG AAG GAT GGG 1056 Lys Val Ala Ala Val Phe Gly Ala Lys Gin Lys Asp Lys Lys Asp Gly 320 325 330
GAA AAC GCG GCA GGG CCT GCA ACG GAA ACC GTG ATA GAT GCA TAC CGT 1104 Glu Asn Ala Ala Gly Pro Ala Thr Glu Thr Val Ile Asp Ala Tyr Arg 335 340 345
ATT ACC GGC GAG GAG TTT AAG AAA GAG CAA ATA GAC AGT TTT GGA GAT 1152 Ile Thr Gly Glu Glu Phe Lys Lys Glu Gin Ile Asp Ser Phe Gly Asp 350 355 360
GTG AAA AAG CTG CTG GTT GAC GGA GTG GAG CTT TCA CTG CTG CCG TCT 1200 Val Lys Lys Leu Leu Val Asp Gly Val Glu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 365 370 375 380
GAG GGC AAT AAG GCG GCA TTT CAG CAC GAG ATT GAG CAA AAC GGC GTG 1248 Glu Gly Asn Lys Ala Ala Phe Gin His Glu Ile Glu Gin Asn Gly Val 385 390 395
AAG GCA ACG GTG TGT TGT TCC AAC TTG GAT TAC ATG AGT TTT GGG AAG 1296 Lys Ala Thr Val Cys Cys Ser Asn Leu Asp Tyr Met Ser Phe Gly Lys 400 405 410
CTG TCA AAA GAA AAT AAA GAC GAT ATG TTC CTG CAA GGT GTC CGC ACT 1344 Leu Ser Lys Glu Asn Lys Asp Asp Met Phe Leu Gin Gly Val Arg Thr 415 420 425
CCA GTA TCC GAT GTG GCG GCA AGG ACG GAG GCA AAC GCC AAA TAT CGC 1392 Pro Val Ser Asp Val Ala Ala Arg Thr Glu Ala Asn Ala Lys Tyr Arg 430 435 440
GGT ACT TGG TAC GGA TAT ATT GCC AAC GGC ACA AGC TGG AGC GGC GAA 1440 Gly Thr Trp Tyr Gly Tyr Ile Ala Asn Gly Thr Ser Trp Ser Gly Glu 445 450 455 460
GCC TCC AAT CAG GAA GGT GGT AAT AGG GCA GAG TTT GAC GTG GAT TTT 1488 Ala Ser Asn Gin Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu Phe Asp Val Asp Phe 465 470 475
TCC ACT AAA AAA ATC AGT GGC ACA CTG ACG GCA AAA GAC CGT ACG TCT 1536 Ser Thr Lys Lys Ile Ser Gly Thr Leu Thr Ala Lys Asp Arg Thr Ser 480 485 490
CCT GCG TTT ACT ATT ACT GCC ATG ATT AAG GAC AAC GGT TTT TCA GGT 1584 Pro Ala Phe Thr Ile Thr Ala Met Ile Lys Asp Asn Gly Phe Ser Gly 495 500 505
GTG GCG AAA ACC GGT GAA AAC GGC TTT GCG CTG GAT CCG CAA AAT ACC 1632 Val Ala Lys Thr Gly Glu Asn Gly Phe Ala Leu Asp Pro Gin Asn Thr 510 515 520
GGA AAT TCC CAC TAT ACG CAT ATT GAA GCC ACT GTA TCC GGC GGT TTC 1680 Giy Asn Ser His Tyr Thr His Ile Glu Ala Thr Val Ser Gly Gly Phe 525 530 535 540
TAC GGC AAA AAC GCC ATC GAG ATG GGC GGA TCG TTC TCA TTT CCG GGA 1728 Tyr Gly Lys Asn Ala Ile Glu Met Gly Gly Ser Phe Ser Phe Pro Gly 545 550 555
AAT GCA CCA GAG GGA AAA CAA GAA AAA GCA TCG GTG GTA TTC GGT GCG 1776 Asn Ala Pro Glu Gly Lys Gin Glu Lys Ala Ser Val Val Phe Gly Ala 560 565 570
AAA CGC CAA CAG CTT GTG CAA TAAGCACGGC T 1808
Lys Arg Gin Gin Leu Val Gin 575
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 599 acides amin,s
(B) TYPE: acide amin,
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: prot, ine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Met Asn Asn Pro Leu Val Asn Gin Ala Ala Met Val Leu Pro Val Phe -20 -15 -10 -5
Leu Leu Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser 1 5 10
Val Glu Thr Val Gin Asp Met His Ser Lys Pro Lys Tyr Glu Asp Glu 15 20 25
Lys Ser Gin Pro Glu Ser Gin Gin Asp Val Ser Glu Asn Ser Gly Ala 30 35 40
Ala Tyr Gly Phe Ala Val Lys Leu Pro Arg Arg Asn Ala His Phe Asn 45 50 55 60
Pro Lys Tyr Lys Glu Lys His Lys Pro Leu Gly Ser Met Asp Trp Lys 65 70 75
Lys Leu Gin Arg Gly Glu Pro Asn Ser Phe Ser Glu Arg Asp Glu Leu 80 85 90
Glu Lys Lys Arg Gly Ser Ser Glu Leu Ile Glu Ser Lys Trp Glu Asp 95 100 105
Gly Gin Ser Arg Val Val Gly Tyr Thr Asn Phe Thr Tyr Val Arg Ser 110 115 120
Gly Tyr Val Tyr Leu Asn Lys Asn Asn Ile Asp Ile Lys Asn Asn Ile 125 130 135 140
Val Leu Phe Gly Pro Asp Gly Tyr Leu Tyr Tyr Lys Gly Lys Glu Pro 145 150 155 Ser Lys Glu Leu Pro Ser Glu Lys Ile Thr Tyr Lys Gly Thr Trp Asp 160 165 170
Tyr Val Thr Asp Ala Met Glu Lys Gin Arg Phe Glu Gly Leu Gly Ser 175 180 185
Ala Ala Gly Gly Asp Lys Ser Gly Ala Leu Ser Ala Leu Glu Glu Gly 190 195 200
Val Leu Arg Asn Gin Ala Glu Ala Ser Ser Gly His Thr Asp Phe Gly 205 210 215 220
Met Thr Ser Glu Phe Glu Val Asp Phe Ser Asp Lys Thr Ile Lys Gly 225 230 235
Thr Leu Tyr Arg Asn Asn Arg Ile Thr Gin Asn Asn Ser Glu Asn Lys 240 245 250
Gin Ile Lys Thr Thr Arg Tyr Thr Ile Gin Ala Thr Leu His Gly Asn 255 260 265
Arg Phe Lys Gly Lys Ala Leu Ala Ala Asp Lys Gly Ala Thr Asn Gly 270 275 280
Ser His Pro Phe Ile Ser Asp Ser Asp Ser Leu Glu Gly Gly Phe Tyr 285 290 295 300
Gly Pro Lys Gly Glu Glu Leu Ala Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Asn 305 310 315
Lys Val Ala Ala Val Phe Gly Ala Lys Gin Lys Asp Lys Lys Asp Gly 320 325 330
Glu Asn Ala Ala Gly Pro Ala Thr Glu Thr Val Ile Asp Ala Tyr Arg 335 340 345
Ile Thr Gly Glu Glu Phe Lys Lys Glu Gin Ile Asp Ser Phe Gly Asp 350 355 360
Val Lys Lys Leu Leu Val Asp Gly Val Glu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 365 370 375 380
Glu Gly Asn Lys Ala Ala Phe Gin His Glu Ile Glu Gin Asn Gly Val 385 390 395
Lys Ala Thr Val Cys Cys Ser Asn Leu Asp Tyr Met Ser Phe Gly Lys 400 405 410
Leu Ser Lys Glu Asn Lys Asp Asp Met Phe Leu Gin Gly Val Arg Thr 415 420 425
Pro Val Ser Asp Val Ala Ala Arg Thr Glu Ala Asn Ala Lys Tyr Arg 430 435 440
Gly Thr Trp Tyr Gly Tyr Ile Ala Asn Gly Thr Ser Trp Ser Gly Glu 445 450 455 460 Ala Ser Asn Gin Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu Phe Asp Val Asp Phe 465 470 475
Ser Thr Lys Lys Ile Ser Gly Thr Leu Thr Ala Lys Asp Arg Thr Ser 480 485 490
Pro Ala Phe Thr Ile Thr Ala Met Ile Lys Asp Asn Gly Phe Ser Gly 495 500 505
Val Ala Lys Thr Gly Glu Asn Gly Phe Ala Leu Asp Pro Gin Asn Thr 510 515 520
Gly Asn Ser His Tyr Thr His Ile Glu Ala Thr Val Ser Gly Gly Phe 525 530 535 540
Tyr Gly Lys Asn Ala Ile Glu Met Gly Gly Ser Phe Ser Phe Pro Gly 545 550 555
Asn Ala Pro Glu Gly Lys Gin Glu Lys Ala Ser Val Val Phe Gly Ala 560 565 570
Lys Arg Gin Gin Leu Val Gin 575
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2064 paires de bases
(B) TYPE: nucl.otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Neisseria meningitidis
(B) SOUCHE: 8680
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..2061
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: sig_peptide
(B) EMPLACEMENT:1..30
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: mat peptide
(B) EMPLACEMENT:31..2061
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
ATG GTG CTG CCT GTG TTT TTG TCG AGT GCT TGT CTG GGC GGA GGC GGC 48
Met Val Leu Pro Val Phe Leu Ser Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly -10 -5 1 5
GGC AGT TTC GAT CTT GAT TCT GTC GAT ACC GAA GCC CCG CGT CCC GCG 96 Giy Ser Phe Asp Leu Asp Ser Val Asp Thr Glu Ala Pro Arg Pro Ala 10 15 20
CCA AAG TAT CAA GAT GTT TCT TCC GAA AAG CCG AAA GCC CAA AAA GAC 144 Pro Lys Tyr Gin Asp Val Ser Ser Glu Lys Pro Lys Ala Gin Lys Asp 25 30 35
CAA GGC GGA TAC GGT TTT GCA ATG CGC TTT AAG CGG AGG AAT TGG TAT 192 Gin Gly Gly Tyr Gly Phe Ala Met Arg Phe Lys Arg Arg Asn Trp Tyr 40 45 50
CAG AAG GCG AAT CCT AAA GAA GAT GAG ATA AAA CTC TCT GAA AAT GAT 240 Gin Lys Ala Asn Pro Lys Glu Asp Glu Ile Lys Leu Ser Glu Asn Asp 55 60 65 70
TGG GAA CAA ACG GAT AAT GGT GAT ATC AAA AAC CCT TCC AAA CAA AAA 288 Trp Glu Gin Thr Asp Asn Gly Asp Ile Lys Asn Pro Ser Lys Gin Lys 75 80 85
AAT ATT ATT AAT GCC TTA CCT GGA AAT AAT GGA GGA GCT ACA TTG CAA 336 Asn Ile Ile Asn Ala Leu Pro Gly Asn Asn Gly Gly Ala Thr Leu Gin 90 95 100
GAT TCC AGT CAA GAA AAT CAG GGT ATA TCT AAG GTT ACG GAC TAT CAC 384 Asp Ser Ser Gin Glu Asn Gin Gly Ile Ser Lys Val Thr Asp Tyr His 105 110 115
AAT TTC CAA TAC GTA TGG TCG GGG TTT TTT TAT AAA CAG ATT AAA AAT 432 Asn Phe Gin Tyr Val Trp Ser Gly Phe Phe Tyr Lys Gin Ile Lys Asn 120 125 130
ACA ATT GAA AAA AAC GGT TCA TCT ATA ACC GCA GCC AGA AAC GGT CCT 480 Thr Ile Glu Lys Asn Gly Ser Ser Ile Thr Ala Ala Arg Asn Gly Pro 135 140 145 150
GAC GGT TAT ATT TTT TAT AAA GGC AAA GAT CCC TCG AGA CAA CTC CCT 528 Asp Gly Tyr Ile Phe Tyr Lys Gly Lys Asp Pro Ser Arg Gin Leu Pro 155 160 165
GTA TTG GGA CAG GTT ACG TAT AAA GGG ACT TGG GAT TTC TTA ACT GAT 576 Val Leu Gly Gin Val Thr Tyr Lys Gly Thr Trp Asp Phe Leu Thr Asp 170 175 180
GTG AAA ATA AAT CAG AAA TTT ATA GAT TTA GGG AAT ACT TCT ACG AAA 624 Val Lys Ile Asn Gin Lys Phe Ile Asp Leu Gly Asn Thr Ser Thr Lys 185 190 195
CCC GGC GAC CGA TAT AGT GCT TTT TCC GGG GAG TTG GAT TAT ATC GTC 672 Pro Gly Asp Arg Tyr Ser Ala Phe Ser Gly Glu Leu Asp Tyr Ile Val 200 205 210
AAT AAA GAT AGC GAT AAG AAA GAC GGG CAC GTA GCA AAG GGA TTA ACA 720 Asn Lys Asp Ser Asp Lys Lys Asp Gly His Val Ala Lys Gly Leu Thr 215 220 225 230
ACG GAA ATA ACG GTT GAT TTT GAG AAA AAA ACC CTC AAC GGA AAA TTA 768 Thr Glu Ile Thr Val Asp Phe Glu Lys Lys Thr Leu Asn Gly Lys Leu 235 240 245 ATT AAA AAC AAC AGT GTA AGC AAT AAT GAG TTC AAC GCT AAA TAC ACC 816 Ile Lys Asn Asn Ser Val Ser Asn Asn Glu Phe Asn Ala Lys Tyr Thr 250 255 260
ACC CAA TAC TAT AGC CTT GAT GCG ACG CTT AGG GGA AAC CGC TTC AAC 864 Thr Gin Tyr Tyr Ser Leu Asp Ala Thr Leu Arg Gly Asn Arg Phe Asn 265 270 275
GGC AAG GCA ACG GCA ACC GAC AAA CCT GGC ACT GGA GAA ACC AAA CAA 912 Gly Lys Ala Thr Ala Thr Asp Lys Pro Gly Thr Gly Glu Thr Lys Gin 280 285 290
CAT CCC TTT GTT TCC GAC TCG TCT TCT TTG AGC GGC GGC TTT TTC GGC 960 His Pro Phe Val Ser Asp Ser Ser Ser Leu Ser Gly Gly Phe Phe Gly 295 300 305 310
CCG AAG GGT GAG GAA TTG GGT TTC CGC TTT TTG AGC GAC GAT AAA AAA 1008 Pro Lys Gly Glu Glu Leu Gly Phe Arg Phe Leu Ser Asp Asp Lys Lys 315 320 325
GTT GCG GTT GTC GGC AGC GCG AAA ACC CAA GAC AAA CCG GGA AAT GGC 1056 Val Ala Val Val Gly Ser Ala Lys Thr Gin Asp Lys Pro Gly Asn Gly 330 335 340
GCG GCG GCT TCA GAC GGC GAG GTG CGG CAG CAT CAA ACG GTG CGG CAG 1104 Ala Ala Ala Ser Asp Gly Glu Val Arg Gin His Gin Thr Val Arg Gin 345 350 355
CTA GAT GGC TCT GAA AAC GGT AAG CTG ACC ACG GTT TTG GAT GCG GTC 1152 Leu Asp Gly Ser Glu Asn Gly Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val 360 365 370
GAG CTG ACG CAC GGC GGC ACA GCA ATC AAA AAT CTC GAC AAC TTC AGC 1200 Glu Leu Thr His Gly Gly Thr Ala Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser 375 380 385 390
AAC GCC GCC CAA CTG GTT GTC GAC GGC ATT ATG ATT CCG CTC CCT GCC 1248 Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp Gly Ile Met Ile Pro Leu Pro Ala 395 400 405
GAG GCT TCC GAA AGT GGG AAC AAT CAA GCC AAT CAA GGT ACA AAT GGC 1296 Glu Ala Ser Glu Ser Gly Asn Asn Gin Ala Asn Gin Gly Thr Asn Gly 410 415 420
GGA ACA GCC TTT ACC CGC AAA TTT GAC CAC ACG CCG AAA AGC GAT GAA 1344 Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe Asp His Thr Pro Lys Ser Asp Glu 425 430 435
AAA GAC ACC CAA GCA GGT ACG GCG GCG AAT GGC AAT CCA GCC GCT TCA 1392 Lys Asp Thr Gin Ala Gly Thr Ala Ala Asn Gly Asn Pro Ala Ala Ser 440 445 450
AAT ACG GCA GGT GAT ACC AAT GGC AAA ACA AAA ACC TAT GAA GTC GAA 1440 Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu 455 460 465 470
GTC TGC TGT TCC AAC CTC AAT TAT CTG AAA TAC GGG TTG CTG ACG CGC 1488 Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Leu Leu Thr Arg 475 480 485
AAA ACT GCC GGT AAC ACG GTG GGA AGC GGC AAC GGC AGC CCA ACC GCC 1536 Lys Thr Ala Gly Asn Thr Val Gly Ser Gly Asn Gly Ser Pro Thr Ala 490 495 500
GCC GCC CAA ACG GAC GCG CAG AGT ATG TTC TTA CAA GGC GAG CGC ACC 1584 Ala Ala Gin Thr Asp Ala Gin Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr 505 510 515
GAT GAA AAA GAG ATT CCA AGC GAG CAA AAC GTC GTT TAT CGG GGG TCT 1632 Asp Glu Lys Glu Ile Pro Ser Glu Gin Asn Val Val Tyr Arg Gly Ser 520 525 530
TGG TAC GGG CAT ATT GCC AAC AGC ACA AGC TGG AGC GGC AAT GCT TCC 1680 Trp Tyr Gly His Ile Ala Asn Ser Thr Ser Trp Ser Gly Asn Ala Ser 535 540 545 550
AAT GCA ACG AGT GGC AAC AAG GCG GAC TTT ACC GTG AAT TTT GGC GAG 1728 Asn Ala Thr Ser Gly Asn Lys Ala Asp Phe Thr Val Asn Phe Gly Glu 555 560 565
AAA AAA ATT ACC GGC ATG TTA ACC GCT GAA AAC AGG CAG GCG GCA ACC 1776 Lys Lys Ile Thr Gly Met Leu Thr Ala Glu Asn Arg Gin Ala Ala Thr 570 575 580
TTT ACC ATT GAG GGA ACG ATT CAG GGC AAC GGT TTT TCC GGT ACG GCA 1824 Phe Thr Ile Glu Gly Thr Ile Gin Gly Asn Gly Phe Ser Gly Thr Ala 585 590 595
AAA ACT GCT GAC TCA GGC TTT GAT CTC GAT CAA AGC AAT ACC ACC GGC 1872 Lys Thr Ala Asp Ser Gly Phe Asp Leu Asp Gin Ser Asn Thr Thr Gly 600 605 610
ACG CCT AAG GCA TAT ATC ACA AAC GCC AAG GTG CAG GGC GGT TTT TAC 1920 Thr Pro Lys Ala Tyr Ile Thr Asn Ala Lys Val Gin Gly Gly Phe Tyr 615 620 625 630
GGG CCT AAA GCC GAA GAA ATG GGT GGA TGG TTT GCT TAT CCG GGC GAC 1968 Gly Pro Lys Ala Glu Glu Met Gly Gly Trp Phe Ala Tyr Pro Gly Asp 635 640 645
AGT CAG ACG CAG CGG TCC GCT TCG GGG TCA GGC GCA TCA GCC GCC AAC 2016 Ser Gin Thr Gin Arg Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ala Asn 650 655 660
AGC GCG ACC GTG GTA TTC GGT GCG AAA CGC CAA CAG CTT GTG CAA 2061
Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala Lys Arg Gin Gin Leu Val Gin 665 670 675
TAA 2064
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 687 acides amin,s (B) TYPE: acide amin,
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: prot.ine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Met Val Leu Pro Val Phe Leu Ser Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly -10 -5 1 5
Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser Val Asp Thr Glu Ala Pro Arg Pro Ala 10 15 20
Pro Lys Tyr Gin Asp Val Ser Ser Glu Lys Pro Lys Ala Gin Lys Asp 25 30 35
Gin Gly Gly Tyr Gly Phe Ala Met Arg Phe Lys Arg Arg Asn Trp Tyr 40 45 50
Gin Lys Ala Asn Pro Lys Glu Asp Glu Ile Lys Leu Ser Glu Asn Asp 55 60 65 70
Trp Glu Gin Thr Asp Asn Gly Asp Ile Lys Asn Pro Ser Lys Gin Lys 75 80 85
Asn Ile Ile Asn Ala Leu Pro Gly Asn Asn Gly Gly Ala Thr Leu Gin 90 95 100
Asp Ser Ser Gin Glu Asn Gin Gly Ile Ser Lys Val Thr Asp Tyr His 105 110 115
Asn Phe Gin Tyr Val Trp Ser Gly Phe Phe Tyr Lys Gin Ile Lys Asn 120 125 130
Thr Ile Glu Lys Asn Gly Ser Ser Ile Thr Ala Ala Arg Asn Gly Pro 135 140 145 150
Asp Gly Tyr Ile Phe Tyr Lys Gly Lys Asp Pro Ser Arg Gin Leu Pro 155 160 165
Val Leu Gly Gin Val Thr Tyr Lys Gly Thr Trp Asp Phe Leu Thr Asp 170 175 180
Val Lys Ile Asn Gin Lys Phe Ile Asp Leu Gly Asn Thr Ser Thr Lys 185 190 195
Pro Gly Asp Arg Tyr Ser Ala Phe Ser Gly Glu Leu Asp Tyr Ile Val 200 205 210
Asn Lys Asp Ser Asp Lys Lys Asp Gly His Val Ala Lys Gly Leu Thr 215 220 225 230
Thr Glu Ile Thr Val Asp Phe Glu Lys Lys Thr Leu Asn Gly Lys Leu 235 240 245
Ile Lys Asn Asn Ser Val Ser Asn Asn Glu Phe Asn Ala Lys Tyr Thr 250 255 260
Thr Gin Tyr Tyr Ser Leu Asp Ala Thr Leu Arg Gly Asn Arg Phe Asn 265 270 275
Gly Lys Ala Thr Ala Thr Asp Lys Pro Gly Thr Gly Glu Thr Lys Gin 280 285 290
His Pro Phe Val Ser Asp Ser Ser Ser Leu Ser Gly Gly Phe Phe Gly 295 300 305 310
Pro Lys Gly Glu Glu Leu Gly Phe Arg Phe Leu Ser Asp Asp Lys Lys 315 320 325
Val Ala Val Val Gly Ser Ala Lys Thr Gin Asp Lys Pro Gly Asn Gly 330 335 340
Ala Ala Ala Ser Asp Gly Glu Val Arg Gin His Gin Thr Val Arg Gin 345 350 355
Leu Asp Gly Ser Glu Asn Gly Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val 360 365 370
Glu Leu Thr His Gly Gly Thr Ala Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser 375 380 385 390
Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp Gly Ile Met Ile Pro Leu Pro Ala 395 400 405
Glu Ala Ser Glu Ser Gly Asn Asn Gin Ala Asn Gin Gly Thr Asn Gly 410 415 420
Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe Asp His Thr Pro Lys Ser Asp Glu 425 430 435
Lys Asp Thr Gin Ala Gly Thr Ala Ala Asn Gly Asn Pro Ala Ala Ser 440 445 450
Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu 455 460 465 470
Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Leu Leu Thr Arg 475 480 485
Lys Thr Ala Gly Asn Thr Val Gly Ser Gly Asn Gly Ser Pro Thr Ala 490 495 500
Ala Ala Gin Thr Asp Ala Gin Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr 505 510 515
Asp Glu Lys Glu Ile Pro Ser Glu Gin Asn Val Val Tyr Arg Gly Ser 520 525 530
Trp Tyr Gly His Ile Ala Asn Ser Thr Ser Trp Ser Gly Asn Ala Ser 535 540 545 550
Asn Ala Thr Ser Gly Asn Lys Ala Asp Phe Thr Val Asn Phe Gly Glu 555 560 565
Lys Lys Ile Thr Gly Met Leu Thr Ala Glu Asn Arg Gin Ala Ala Thr 570 575 580 Phe Thr Ile Glu Gly Thr Ile Gin Gly Asn Gly Phe Ser Gly Thr Ala 585 590 595
Lys Thr Ala Asp Ser Gly Phe Asp Leu Asp Gin Ser Asn Thr Thr Gly 600 605 610
Thr Pro Lys Ala Tyr Ile Thr Asn Ala Lys Val Gin Gly Gly Phe Tyr 615 620 625 630
Gly Pro Lys Ala Glu Glu Met Gly Gly Trp Phe Ala Tyr Pro Gly Asp 635 640 645
Ser Gin Thr Gin Arg Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ala Asn 650 655 660
Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala Lys Arg Gin Gin Leu Val Gin 665 670 675
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 198 acides amin,s
(B) TYPE: acide amin,
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: IM2169
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
Thr Lys Asp Lys Leu Glu Asn Gly Ala Ala Ala Ser Gly Ser Thr Gly 1 5 10 15
Ala Ala Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Ser Lys 20 25 30
Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys 35 40 45
Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp 50 55 60
Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly Asn Thr 65 70 75 80
Gin Ala Asp Lys Gly Lys Asn Gly Gly Thr Glu Phe Thr Arg Lys Phe 85 90 95
Glu His Thr Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gin Ala Gly Thr Gin 100 105 110
Thr Asn Gly Ala Gin Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly 115 120 125
Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr 130 135 140
Leu Lys Tyr Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gin 145 150 155 160
Ala Gly Gly Asn Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gin Val Glu 165 170 175
Gin Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro 180 185 190
Thr Asp Gin Asn Val Val 195
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 198 acides amin,s
(B) TYPE: acide amin,
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: 6940
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Thr Lys Asp Lys Thr Glu Asn Gly Ala Val Ala Ser Gly Gly Thr Asp 1 5 10 15
Ala Ala Ala Ser Asn Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Ser Lys 20 25 30
Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Lys Leu Gly Asp Lys Glu 35 40 45
Val Gin Lys Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp 50 55 60
Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Glu Ala Ser Glu Ser Gly Asn Asn 65 70 75 80
Gin Ala Asn Gin Gly Thr Asn Gly Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe 85 90 95
Asp His Thr Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gin Ala Gly Thr Gin 100 105 110
Thr Asn Gly Ala Gin Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly 115 120 125 Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr 130 135 140
Leu Lys Tyr Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gin 145 150 155 160
Ala Gly Glu Ser Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gin Val Glu 165 170 175
Gin Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro 180 185 190
Ser Glu Gin Asn Ile Val 195
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 198 acides amin,s
(B) TYPE: acide amin,
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: 2223
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Thr Lys Asp Lys Thr Glu Asn Gly Ala Val Ala Ser Gly Gly Thr Asp 1 5 10 15
Ala Ala Ala Ser Asn Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Ser Lys 20 25 30
Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Lys Leu Gly Asp Lys Glu 35 40 45
Val Gin Lys Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp 50 55 60
Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Glu Ala Ser Glu Ser Gly Asn Asn 65 70 75 80
Gin Ala Asn Gin Gly Thr Asn Gly Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe 85 90 95
Asp His Thr Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gin Ala Gly Thr Gin 100 105 110
Ala Asn Gly Ala Gin Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly 115 120 125
Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr 130 135 140 Leu Lys Tyr Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gin 145 150 155 160
Ala Gly Glu Ser Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gin Val Gly 165 170 175
Gin Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro 180 185 190
Ser Glu Gin Asn Ile Val 195
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 198 acides amin, s
(B) TYPE: acide amin,
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: C708
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
Thr Gin Asp Lys Pro Arg Asn Gly Ala Val Ala Ser Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15
Ala Ala Arg Ser Asn Gly Ala Ala Gly Gin Ser Ser Glu Asn Ser Lys 20 25 30
Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys 35 40 45
Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp 50 55 60
Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Glu Ala Ser Glu Ser Gly Lys Asn 65 70 75 80
Gin Ala Asn Gin Gly Thr Asn Gly Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe 85 90 95
Asn His Thr Pro Lys Ser Asp Glu Lys Asp Thr Gin Ala Gly Thr Ala 100 105 110
Glu Asn Gly Asn Pro Ala Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Ala Asn Gly 115 120 125
Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr 130 135 140
Leu Lys Tyr Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gin 145 150 155 160
Ala Gly Glu Ser Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gin Val Gly 165 170 175
Gin Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro 180 185 190
Asn Asp Gin Asn Val Val 195
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 211 acides amin,s
(B) TYPE: acide amin,
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: M978
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
Thr Gin Asp Lys Ala Ala Asn Gly Asn Thr Ala Ala Ala Ser Gly Gly 1 5 10 15
Thr Asp Ala Ala Ala Ser Asn Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn 20 25 30
Ser Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp 35 40 45
Lys Lys Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val 50 55 60
Val Asp Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Glu Thr Ser Glu Ser Gly 65 70 75 80
Ser Asn Gin Ala Asp Lys Gly Lys Lys Gly Lys Asn Gly Lys Asn Gly 85 90 95
Gly Thr Asp Phe Thr Tyr Lys Thr Thr Tyr Thr Pro Lys Asn Asp Asp 100 105 110
Lys Asp Thr Lys Ala Gin Thr Gly Ala Ala Gly Ser Ser Gly Ala Gin 115 120 125
Thr Asp Leu Gly Lys Ala Asp Val Asn Gly Gly Lys Ala Glu Thr Lys 130 135 140
Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr 145 150 155 160 Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Met Gin Ala Gly Gly 165 170 175
Asn Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gin Val Glu Gin Ser Met 180 185 190
Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro Asn Asp Gin 195 200 205
Asn Val Val 210
12) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 200 acides amin, s
(B) TYPE: acide amin,
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: 1610
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
Lys Arg Asp Lys Ala Glu Ser Gly Gly Gly Asn Gly Ala Ser Gly Gly 1 5 10 15
Thr Asp Ala Ala Ala Ser Asn Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn 20 25 30
Ser Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Lys Ser Gly Gly 35 40 45
Lys Glu Val Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val 50 55 60
Val Asp Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly 65 70 75 80
Asn Thr Gin Ala Asp Lys Gly Lys Asn Gly Gly Thr Lys Phe Thr Arg 85 90 95
Lys Phe Glu His Thr Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gin Ala Gly 100 105 110
Thr Gin Thr Asn Gly Ala Gin Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr 115 120 125
Asn Gly Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu 130 135 140
Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Leu Leu Thr Arg Lys Thr Ala Gly Asn Thr 145 150 155 160 Gly Glu Gly Gly Asn Gly Ser Gin Thr Ala Ala Ala Gin Thr Ala Gin 165 170 175
Gly Ala Gin Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu 180 185 190
Ile Pro Ser Glu Gin Asn Val Val 195 200
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 200 acides amin,s
(B) TYPE: acide amin,
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: 867
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
Thr Lys Asp Lys Pro Arg Asn Gly Ala Val Ala Ser Gly Gly Thr Asp 1 5 10 15
Ala Ala Ala Ser Asn Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Gly Lys 20 25 30
Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys 35 40 45
Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Ser 50 55 60
Gly Ile Met Ile Pro Leu Met Pro Glu Thr Ser Glu Ser Gly Asn Asn 65 70 75 80
Gin Ala Asp Lys Gly Lys Asn Gly Gly Thr Ala Phe Thr Arg Lys Phe 85 90 95
Asp His Thr Pro Lys Ser Asp Glu Lys Asp Thr Gin Ala Gly Thr Pro 100 105 110
Thr Asn Gly Ala Gin Thr Ala Ser Gly Thr Ala Gly Val Thr Gly Gly 115 120 125
Gin Ala Gly Lys Thr Tyr Ala Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn 130 135 140
Tyr Leu Lys Tyr Gly Leu Leu Thr Arg Lys Thr Ala Asp Asn Thr Val 145 150 155 160
Gly Ser Gly Asn Gly Ser Ser Thr Ala Ala Ala Gin Thr Ala Gin Gly 165 170 175
Ala Gin Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile 180 185 190
Pro Lys Glu Gin Gin Asp Ile Val 195 200
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 198 acides amin, s
(B) TYPE: acide amin,
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: S3032
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
Thr Lys Asp Lys Pro Ala Asn Gly Asn Thr Ala Glu Ala Ser Gly Gly 1 5 10 15
Thr Asp Ala Ala Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn 20 25 30
Ser Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Thr His Gly Gly 35 40 45
Thr Ala Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val 50 55 60
Val Asp Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Gin Asn Ser Thr Gly Lys 65 70 75 80
Asn Asn Gin Pro Asp Gin Gly Lys Asn Gly Gly Thr Ala Phe Ile Tyr 85 90 95
Lys Thr Thr Tyr Thr Pro Lys Asn Asp Asp Lys Asp Thr Lys Ala Gin 100 105 110
Thr Val Thr Gly Gly Thr Gin Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Ala 115 120 125
Asn Gly Lys Thr Lys Thr Tyr Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu 130 135 140
Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Leu Leu Thr Arg Lys Thr Ala Gly Asn Thr 145 150 155 160
Val Gly Ser Gly Asn Ser Ser Pro Thr Ala Ala Ala Gin Thr Asp Ala 165 170 175 Gln Ser Met Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Asn Lys Ile Pro 180 185 190
Ser Glu Gin Asn Val Val 195
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 195 acides amin,s
(B) TYPE: acide amin,
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: N. meningitidis
(B) SOUCHE: 891
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
Thr Lys Asp Lys Pro Gly Asn Gly Ala Arg Leu Gin Ala Ala Arg Cys 1 5 10 15
Gly Thr Ser Asn Gly Ala Ala Gly Gin Ser Ser Glu Asn Ser Lys Leu 20 25 30
Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Lys Leu Gly Asp Lys Glu Val 35 40 45
Gin Lys Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gin Leu Val Val Asp Gly 50 55 60
Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly Lys Asn Gin 65 70 75 80
Ala Asp Lys Gly Lys Asn Gly Glu Thr Glu Phe Thr Arg Lys Phe Glu 85 90 95
His Thr Pro Glu Ser Asp Glu Lys Asp Ala Gin Ala Gly Thr Pro Ser 100 105 110
Asn Gly Ala Gin Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly Lys 115 120 125
Thr Lys Thr Tyr Glu Val Asn Leu Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys 130 135 140
Tyr Gly Leu Leu Thr Arg Lys Thr Ala Gly Asn Thr Gly Glu Gly Gly 145 150 155 160
Asn Ser Ser Pro Thr Ala Ala Gin Thr Ala Gin Gly Ala Gin Ser Met 165 170 175
Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro Asn Asp Gin 180 185 190 Asn Val Val 195
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: nucl.otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g,nomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: AAACCCGGAT CCGTTGCCAG CGCTGCCGT 29
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 85 paires de bases
(B) TYPE: nucl.otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: TTTTTTCATG AGATATCTGG CAACATTGTT GTTATCTCTG GCGGTGTTAA TCACCGCCGG 60 GTGCCTGGGT GGCGGCGGCA GTTTC 85
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucl.otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
GTGTTTTTGT TGAGTGCATG CCTGGGTGGC 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 40 paires de bases (B) TYPE: nucl,otιde
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(11) TYPE DE MOLECULE: ADN (g,nomιque)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: TGCGCAAGCT TACAGTTTGT CTTTGGTTTT CGCGCTGCCG 40
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 40 paires de bases
(B) TYPE: nucl,otιde
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20: AAAAAGCATG CATAAAAACT ACGCGTTACA CCATTCAAGC 40
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR- 39 paires de bases
(B) TYPE: nucl.otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE. SEQ ID NO: 21: TATATAAGCT TACGTTGCAG GCCCTGCCGC GTTTTCCCC 39
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: nucl.otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (g,nomιque)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO• 22' CCCGAATTCT GCCGTCTGAA GCCTTATTC 29
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 28 paires de bases
(B) TYPE: nucl.otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g,nomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23: CCCGAATTCT GCTATGGTGC TGCCTGTG 28
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 24:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucl,otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24: CGCATCCAAA ACCGTACCTG TGCTGCCTGA 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucl.otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25: TTTATCACTT TCCGGGGGCA GGAGCGGAAT 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucl.otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26: GTTGGAACAG CAGACAGCGG TTTGCGCCCC 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 27:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucl.otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g.nomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27: GAACATACTT TGTTCGTTTT TGCGCGTCAA 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 28:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucl.otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g,nomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 28: CCACGGATCC TGCCGTCTGA AGCCTTATTC 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 29:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucl.otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g,nomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 29: CGCGGATCCT GCTATGGTG 19

Claims

Revendications
1. Une protéine sous forme substantiellement purifiée, qui est la sous-unité de moindre poids moléculaire (Tbp2) du récepteur de la transferrine humaine (RTH) d'une souche de N. meningitidis ; la souche étant caractérisée en ce qu'elle n'est pas reconnue en dot blot par un antisérum obtenu à l'encontre d'un polypeptide correspondant à la Tbp2 de la souche N. meningitidis M982 (Tbp2 M982) délétée des portions hypervariables du deuxième domaine (région charnière) (Tbp2 M982 Δ 362 - 379 ; Δ 418 - 444 ; Δ 465 - 481 ; Δ 500 - 520) ; et la sous-unité Tbp2 étant caractérisée (i) en ce qu'elle est codée par un fragment d'ADN d'environ 2,1 kb.
2. Une sous-unité Tbp2 selon la revendication 1 , qui dérive d'une souche de N. meningitidis qui n'est pas reconnue en dot blot par un antisérum obtenu à l'encontre d'un fragment de Tbp2 M982 allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 350.
3. Une sous-unité Tbp2 selon la revendication 1 ou 2, qui dérive d'une souche de N. meningitidis dont la sous-unité Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum obtenu à l'encontre du RTH de la souche M982 (antisérum anti-RTH M982) et par un antisérum obtenu à l'encontre du RTH de la souche B 1616 (antisérum anti-RTH B 16B6).
4. Une sous-unité Tbp2 selon l'une des revendications 1 à 3. qui comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 M982, telle que montrée dans l'ID SEQ Νo. 1. est de 60 à 70%.
5. Une sous-unité Tbp2 selon la revendication 4, qui comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 de la souche M982, telle que montrée dans l'ID SEQ Νo. 1 , est d'environ 65%.
6. Une sous-unité Tbp2 selon la revendication 5, qui comprend une séquence d'acides aminés substantiellement telle que montrée dans l'ID SEQ Νo. 5.
7. Une sous-unité Tbp2 selon l'une des revendications 1 à 6, en association avec la sous-unité de haut poids moléculaire (Tbpl) de la souche de N. meningitidis dont est issue la sous-unité Tbp2.
8. Un polypeptide capable de se lier à la transferrine humaine et dérivé d'une sous-unité Tbp2 selon l'une des revendications 1 à 6, notamment par délétion d'un ou plusieurs acides aminés localisés du côté de l'extrémité C-terminale ou dans la région des quarante premiers acides aminés de la sous-unité Tbp2.
9. Un polypeptide selon la revendication 8, qui dérive de la sous-unité Tbp2 selon l'une des revendications 1 à 6, notamment par délétion partielle du deuxième domaine (ou région charnière) de la sous-unité Tbp2.
10. Un polypeptide selon la revendication 9, qui dérive de la sous-unité Tbp2 selon l'une des revendications 1 à 6, notamment par délétion partielle des régions du deuxième domaine qui sont les homologues des régions de la séquence M982 allant :
(i) de l'acide aminé en position 388 à l'acide aminé en position396 ; (ii) de l'acide aminé en position 418 à l'acide aminé en position 476 ; et (iii) de l'acide aminé en position 499 à l'acide aminé en position 521.
1 1 Un polypeptide selon la revendication 10, qui dérive de la sous-unité Tbp2 selon la revendication 6, par délétion des régions 377-385. 407-465 et 488-508.
12. Un polypeptide selon la revendication 9, qui dérive de la sous-unité Tbp2 selon l'une des revendications 1 à 6, notamment par délétion substantielle des portions hypervariables du deuxième domaine (ou région charnière) de la sous-unité Tbp2.
13. Un polypeptide selon la revendication 12, qui dérive de la sous-unité Tbp2 selon l'une des revendications 1 à 6, par délétion substantielle des portions hypervariables du deuxième domaine (ou région charnière) de la sous-unité Tbp2 et qui contient le premier et le troisième domaines de la sous-unité Tbp2.
14. Un polypeptide selon la revendication 13, qui dérive de la sous-unité Tbp2 selon la revendication 6, par délétion des portions 351 -368, 407-433, 454-470 et 489-508.
15. Un polypeptide selon la revendication 8, qui dérive de la sous-unité Tbp2 selon l'une des revendications 1 à 6, notamment par délétion substantielle du deuxième ou du troisième domaine de la sous-unité Tbp2.
16. Un polypeptide selon la revendication 15, qui dérive de la sous-unité Tbp2 selon l'une des revendications 1 à 6, par délétion substantielle des deuxième et troisième domaines de la sous-unité Tbp2.
17. Un polypeptide selon la revendication 16, qui correspond à l'extrémité N-terminale de la sous-unité Tbp2 selon la revendication 6, allant de l'acide aminé dans l'une des positions 1 à 40, à l'acide aminé dans l'une des positions 334 à 351.
18. Un polypeptide selon la revendication 17, qui correspond à l'extrémité N-terminale de la sous-unité Tbp2 selon la revendication 6, allant de l'acide aminé en position 1, à l'acide aminé dans l'une des positions 334 à 351.
19. Une composition pharmaceutique qui comprend à titre de principe actif, une sous- unité Tbp2 selon l'une des revendications 1 à 7 ou un polypeptide selon l'une des revendications 8 à 18.
20. Une composition selon la revendication 19, qui comprend en outre une sous-unité Tbp2 additionnelle qui dérive d'une souche de N. meningitidis dont la sous-unité Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti- RTH M982 et n'est pas reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6.
21. Une composition selon la revendication 20. dans laquelle la sous-unité Tbp2 additionnelle comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 M982, telle que montrée dans l'ID SEQ Νo. 1 , est de 90 à 100 %.
τ> Une composition selon la revendication 21 , dans laquelle la sous-unité Tbp2 additionnelle est la Tbp2 M982.
23. Une composition selon la revendication 19, qui comprend en outre un polypeptide capable de lier la transferrine humaine et dérivé d'une sous-unité Tbp2 d'une souche de /V. meningitidis dont la Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et n'est pas reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6, notamment par délétion d'un ou plusieurs acides aminés localisés du côté de l'extrémité C-terminale de la sous-unité Tbp2.
24. Une composition selon la revendication 23, dans laquelle le polypeptide dérive d'une sous-unité Tbp2 d'une souche de N. meningitidis dont la Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et n'est pas reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6, notamment par délétion substantielle des régions hypervariables du deuxième domaine (ou région charnière) de la sous- unité Tbp2.
25. Une composition selon la revendication 23, dans laquelle le polypeptide dérive d'une sous-unité Tbp2 d'une souche de N. meningitidis dont la Tbp2 est reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et n'est pas reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6, notamment par délétion substantielle du deuxième ou du troisième domaine de la sous-unité Tbp2.
26. Une composition selon l'une des revendications 23 à 25. dans laquelle le polypeptide dérive d'une sous-unité Tbp2 qui comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 M982. telle que montrée dans l'ID SEQ Νo. 1. est de 90 à 100 %.
27. Une composition selon la revendication 26, dans laquelle le polypeptide dérive de la Tbp2 M982.
28. Une composition selon la revendication 19, qui comprend en outre une sous-unité Tbp2 additionnelle qui dérive d'une souche de /V. meningitidis dont la sous-unité Tbp2 n'est pas reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et est reconnue par un antisérum anti-RTH B 16B6.
29. Une composition selon la revendication 28, dans laquelle la sous-unité Tbp2 additionnelle comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 B16B6. telle que montrée dans l'ID SEQ Νo. 2. est de 95 à 100 %.
30. Une composition selon la revendication 29, dans laquelle la sous-unité Tbp2 additionnelle est la Tbp2 B16B6.
31. Une composition selon la revendication 19, qui comprend en outre un polypeptide capable de lier la transferrine humaine et dérivé d'une sous-unité Tbp2 de N. meningitidis dont la sous-unité Tbp2 n'est pas reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et est reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6, notamment par délétion d'un ou plusieurs acides aminés localisés du côté de l'extrémité C-terminale de la sous-unité Tbp2.
32. Une composition selon la revendication 31. dans laquelle le polypeptide dérive d'une sous-unité Tbp2 de N. meningitidis dont la sous-unité Tbp2 n'est pas reconnue en Western blot de fractions membranaires par un antisérum anti-RTH M982 et est reconnue par un antisérum anti-RTH B16B6. notamment par délétion substantielle des deuxième et troisième domaines de la sous-unité Tbp2.
33. Une composition selon l'une des revendications 30 à 32. dans laquelle le polypeptide dérive d'une sous-unité Tbp2 qui comprend une séquence d'acides aminés dont le degré d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la Tbp2 B16B6, telle que montrée dans l'ID SEQ No. 2, est de 95 à 100 %.
34. Une composition selon la revendication 33. dans laquelle le polypeptide dérive de la Tbp2 B16B6.
35. Une composition selon les revendications 20, 21. 22. 23. 24. 25, 26 ou 27 et 28, 29, 30, 31 , 32, 33 ou 34.
36. Une composition selon la revendication 35, qui comprend : (i) un polypeptide selon l'une des revendications 9 à 14 ;
(ii) un polypeptide tel que décrit dans la revendication 24 ou dans les revendications
24 et 26 ou 27 ; et (iii) une sous-unité Tbp2 telle que décrite dans l'une des revendications 28 à 30.
37. Un fragment d'ADN isolé codant pour une sous-unité Tbp2 selon l'une des revendications 1 à 6 ou pour un polypeptide selon l'une des revendications 8 à 18.
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