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WO1997011373A1 - Procede d'identification precoce d'une maladie auto-immune, utilisation dans le domaine du diagnostic et necessaire de dosage pour mettre en oeuvre - Google Patents

Procede d'identification precoce d'une maladie auto-immune, utilisation dans le domaine du diagnostic et necessaire de dosage pour mettre en oeuvre Download PDF

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WO1997011373A1
WO1997011373A1 PCT/FR1996/001441 FR9601441W WO9711373A1 WO 1997011373 A1 WO1997011373 A1 WO 1997011373A1 FR 9601441 W FR9601441 W FR 9601441W WO 9711373 A1 WO9711373 A1 WO 9711373A1
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WO
WIPO (PCT)
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cytokine
antibody
type
chemokine
chemokines
Prior art date
Application number
PCT/FR1996/001441
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English (en)
Inventor
Jean Amiral
Anne-Marie Vissac
Original Assignee
Societe Diagnostica Stago
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Filing date
Publication date
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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Definitions

  • the present invention relates to the early detection of autoimmune diseases or disorders. More specifically, it relates to a method for identifying these immune diseases or disorders,
  • T lymphocytes T lymphocytes, B lymphocytes, macrophages, neutrophils, hematopoietic progenitors, etc.
  • B lymphocytes B lymphocytes, macrophages, neutrophils, hematopoietic progenitors, etc.
  • mediators particular proteins, namely cytokines.
  • chemokines other nomenclatures: “intercrines” or “cytokines of the PF4 superfamily”
  • intercrines or “cytokines of the PF4 superfamily”
  • cytokines of the PF4 superfamily are involved in particular in inflammatory and especially proinflammatory mechanisms during the defense of the the organism vis-à-vis a foreign host, is in monomeric form (single-stranded structure having a molecular weight of approximately 8-10 kD) and especially in polymeric form (mainly the dimeric and tetrameric form), have four Cys groups in their single-stranded structure and are divided into two subfamilies according to the first two Cys encountered going from the N-terminal end to the C-terminal end depending on whether the two said first Cys are separated or not with another amino acid.
  • R. HORUK A distinction is thus made, in particular according to the articles by R. HORUK,
  • chemokines of the CXC type (where C is Cys and X is an amino acid different from Cys), which comprises in particular IL-8, PF4, GRO, IP-10 and NAP-2 [the definitions of the abbreviations are given below], which is also referred to as the ⁇ -intercrine subfamily, and (ii) the subfamily of CC type chemokines (where C is Cys as indicated above), which includes in particular the RANTES and MCP-1, and which is also called the sub-family of ⁇ -intercrines.
  • chemokines act mainly as chemoattractants (i.e. "chemoattractants") and activators of particular leukocytes.
  • chemoattractants chemoattractants
  • activators of particular leukocytes i.e. "chemoattractants”
  • each chemokine has activities which are unique, on the one hand, and which overlap or overlap with those of other chemokines, on the other hand.
  • chemokines which present on the side of the N-terminal an ELR sequence (ie Glu-Leu-Arg) immediately before the first Cys are chemoattractants and activators for neutrophils; CXC chemokines lacking said ELR sequence generally have weak or even zero activities with regard to the attraction of neutrophils, as is notably the case for PF4 and IP-10; and, CC chemokines are chemoattractants and activators for monocytes and T cells, as is notably the case for RANTES, MIP-1 and MCP-1.
  • chemokines play an important role in rheumatic inflammations and, since a large number of them are detectable in the serum of rheumatic patients, they can serve as markers for identification or the diagnosis of said inflammations.
  • chemokine his specific anti-antibody
  • HIT heparin-induced thrombocytopenia
  • HIT is the major complication of heparin therapies.
  • type I where the thrombocytopenia is moderate, reversible, not associated with clinical disorders, and type II much less frequent (at most 5% of patients hospitalized and subjected to heparin therapy) which is characterized by a crisis. severe occurring on average 7 to 15 days after the start of heparin therapy and which can lead to thrombosis.
  • cytokines and anti-cytokine antibodies are now marketed for analytical purposes; to this end, see the 1994 and 1995 catalogs of the company R & D SYSTEMS relating to cytokines.
  • autoimmune diseases which include thrombocytopenia, neutropenia, proinflammatory pathologies or those likely to induce thrombosis, can cause (generally very quickly) severe crises ranging from thrombocytopenia and neutropenia to ischemia, thrombosis and amputation.
  • a new technical solution for identifying or detecting said autoimmune diseases at an early stage there is therefore a need for a new technical solution for identifying or detecting said autoimmune diseases at an early stage.
  • a method for the early identification of an autoimmune disease is recommended, said method which implements an immunological reaction of the antigen-antibody type with a view to detecting the immune material responsible for said disease, being characterized in what he understands:
  • a cytokine (Z) into contact with a liquid biological sample capable of containing said responsible immune material, which is an autoantibody (anti (Z)) directed against said cytokine (Z), in order to trigger the reaction: anti (Z) + Z -> anti (Z) -Z then,
  • cytokine an anti autoantibody (cytokine) capable of being pathogenic by the reaction cytokine -f anti (cytokine) - > anti-cytokine (cytokine) and the revelation of the cytokine-anti complex (cytokine) formed.
  • cytokine an anti autoantibody
  • kit, kit or assay kit which comprises: at least one Z cytokine, at least one reagent for revealing the formation of the anti (Z) -Z complex, and
  • CSF colony stimulating factor in English: "colony stimulating factor”
  • G-CSF G-CSF
  • GM-CSF GM-CSF
  • M-CSF M-CSF which stimulate the colonies of granulocytes, granulocytes-macrophages and respectively CTAP-III macrophages type III connective tissue activation peptide
  • connective tissue activating peptide III is a derivative of
  • PBP which does not have the first 9 amino acids of mature PBP EDTA ethylenediaminotetraacetic acid
  • the disodium salt of this acid is written here in the form Na2 EDTA EGF epithelial growth factor (in English: “excellentthelial growth factor”), we know several EGFs in particular TGF- ⁇ , and
  • ENA-78 peptide activating epithelial neutrophils (in English: “ wentthe ⁇ lial neutrophil activating peptide-78") comprising 78 amino acids
  • FGF fibroblast growth factor in English: "fibroblast growth factor”
  • FGF-1 to FGF-7 FGFa fibrobast acid growth factor in English: “acidic fibroblast growth factor”
  • FGF-1 FGFb basic factor of growth of fibrobiastes in English: "basic fibroblast growth factor”
  • FGF-2 FIA immunofluorescent test in English: "fluorescence immunoassay”
  • GRO product of a growth gene in English: "growth-related gene” [other nomenclature: MGSA], several GROs are known: GRO ⁇ whose mature protein comprises 73 amino acids, GRO ⁇ and GRO ⁇ , (unless otherwise indicated, GRO will denote here GRO ⁇ or MGSA) HAT thrombocytopenia associated with heparin (in English: “heparin- associated thrombocytopenia”)
  • HB-EGF factor analogous to the epithelial growth factor binding heparin (in English: "heparin-binding EGF-like factor"), it is a particular EGF Hep heparin, in particular normal unfractionated heparin and fractionated heparin; Hep is part of the GAGs
  • HGF hepatocyte growth factor in English: "hepatocyte growth factor”
  • HIT heparin-induced thrombocytopenia ie thrombocytopenia characterized by the presence of an anti autoantibody (Hep-PF4)
  • Hep-PF4 en English: "heparin-induced thrombocytopenia”
  • IP-10 protein inducible by interferon ⁇ in English: "interferon- ⁇ - inducible protein”
  • the mature protein of IP-10 contains 77 amino acids IL-8 interleucine 8 (other nomenclature NAP-1)
  • the protein expressed by the corresponding cDNA contains 99 amino acids including a possible signal peptide
  • at least 4 variants of human IL 8 are known according to the cleavages of the N-terminal end containing 79, 77, 72 and respectively 69 amino acids, the variant of 72 amino acids (which is the most active) was used here.
  • MCP-1 chemotactic protein of type 1 monocytes in English: “monocytes chemotactic protein-1”
  • MCAF from "monocyte chemotactic and activating factor”
  • MGSA product having a melanoma growth stimulating activity in English: “melanoma growth-stimulating activity”
  • GRO above MIP-1 macrophage inflammatory protein type 1 in English: “macrophage inflammatory protein-1 ")
  • two neighboring molecules have recently been distinguished: MlP-l ⁇ and MlP-l ⁇ MW molecular weight
  • NAP-2 peptide activating type 2 neutrophils in English:
  • mature human NAP-2 contains 70 amino acids and can in particular be obtained by cleavage of the N-terminal end of ⁇ TG OPD orthophenylenediamine
  • PBP basic platelet protein in English: "platelet basic protein”
  • the mature human protein contains 94 amino acids
  • the proteolytic cleavages of the N-terminal end of PBP give CTAP-III (85 amino acids), ⁇ TG (81 amino acids ) and respectively NAP-2 (70 amino acids)
  • PDGF platelet-derived growth factor in English: “platelet- derived growth factor”
  • PF4 platelet factor 4 in English: "platelet factor-4"
  • RANTES chemokine CC whose name is the acronym for "Regulated upon activation, normal T cell Expressed and Secreted", the mature human protein contains 68 amino acids RIA radioimmunoassay (in English: “radio immunoassay”) RT room temperature (15-25 °) ⁇ TG ⁇ -thromboglobulin (other nomenclature: BTG), derived from PBP and
  • CTAP-III in particular by loss of 3 amino acids at the N-terminal end of CTAP-III TGF- ⁇ transforming growth factor of type ⁇ (in English: "transforming growth factor- ⁇ "), substance belonging to the set TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇ -type EGFs (in English: “transforming growth factor- ⁇ ”), five molecules TGF- ⁇ 1 (or TGF- ⁇ ) and TGF- ⁇ 2 to TGF are currently known - ⁇ 5 which have 30 to 80% similarity to TGF- ⁇ 1 VEGF vascular endothelial growth factor (in French: "vascular endothelial growth factor”) Brief description of the drawings
  • FIG. 2 shows the kinetic evolution of the number of wafers (PC) over time expressed in days (d).
  • the autoantibodies responsible or characteristic of autoimmune diseases and disorders are directed against cytokines and among these mainly (from a statistical point of view) against chemokines.
  • autoimmune diseases such as thrombocytopenia, neutropenia and proinflammatory pathologies, are characterized by the presence in the organism of patients (mainly in plasma and serum) of anti autoantibody (cytokine).
  • a given cytokine Z binds to a body Y, which is (i) a target cell (Y ⁇ ) of Z, (ii) a portion of the wall of a foreign cell (Y2) comprising at least one of the receptors for Z (for this purpose see the aforementioned article by R. HORUK which reports the presence of the erythrocyte receptor CK, which fixes IL -8, on the malaria parasite in humans (Plasmodium vivax) or (iii) a molecule capable of fixing said cytokine, to form a ZY complex such as Z-Yj,
  • HITs of type II it differs from them however by the nature of the responsible antibodies, namely the anti (cytokine), whereas the said HITs are heparino-dependent and characterized by the presence of anti (Hep-1)
  • the presence of a GAG amplifies the manifestations and the severity of the pathologies linked to the existence of anti-antibodies (cytokine), since the GAGs bind to a large number of cytokines and practically to all chemokines.
  • cytokine anti-antibodies
  • chondroitin-sulfuric acids in particular dermatan sulfate
  • GAGs such as Hep fix cytokines
  • they have the possibility of conveying them to other cells (for example erythrocytes, endothelium, etc. for Hep) which are devoid of receptors for said cytokines; new targets are then obtained for autoantibodies.
  • CSFs in particular G-CSF, GM-CSF and MCSF
  • EGFs in particular TGF- ⁇
  • FGFs in particular FGFa and GFGb
  • HGF HGF
  • PDGF PDGF
  • TGF- ⁇ VEGF
  • cytokine Z will advantageously be chosen from the group consisting of chemokines.
  • chemokines from which the organism generates autoantibodies responsible (or characteristic) for thrombo-penetrant, neutropenic, pro-inflammatory pathologies or liable to induce thrombosis
  • - substances of the CXC type where C denotes Cys and X an amino acid residue different from Cys, and
  • C denotes Cys, namely: among the CXC chemokines comprising the ELR fragment as indicated above: GROs (in particular GRO ⁇ , GRO ⁇ and GRO ⁇ ), IL 8, PBP, PBP derivatives ( CTAP-III, ⁇ TG and NAP-2) and ENA-78, among CXC chemokines not comprising said ELR fragment: PF4 and IP-10, and among CC chemokines: RANTES, MCP-1 and MIP-2.
  • GROs in particular GRO ⁇ , GRO ⁇ and GRO ⁇
  • IL 8 interleukin-1
  • PBP PBP derivatives
  • CTAP-III CTAP-III, ⁇ TG and NAP-2
  • ENA-78 ENA-78
  • a biological sample capable of containing one of the responsible or characteristic autoantibodies.
  • This biological sample will be an aqueous liquid and more precisely a body liquid. If one can effectively look for and detect an anti (cytokine) antibody in urine, saliva, synovial fluid or pus, it is rather recommended that said body fluid is plasma or serum which, compared to others body fluids, higher antibody concentrations.
  • the liquid biological sample (advantageously plasma or serum) will be sought for the presence or absence of an anti-autoantibody (Z) directed against a cytokine belonging to the subfamily of chemokines of the type CXC and chosen from the group consisting of PBP, CTAP-III and ⁇ -TG, and better still the presence or absence of an anti (Z) autoantibody directed against a cytokine belonging to the subfamily of chemokines of the type CXC and chosen from the group consisting of IL-8, NAP-2, GRO, IP-10 and ENA-78.
  • Z anti-autoantibody
  • an anti-autoantibody directed against a cytokine belonging to the subfamily of chemokines of the CC type and chosen from the group consisting of RANTES, MIP-1 and MCP- 1.
  • the anti (Z) antibody which may be contained in the plasma or the serum, with the corresponding antigen Z immobilized, - after rinsing, the anti (Z) -Z complex with a labeled anti (antibody) [such as anti (IgG), anti (IgA), anti (IgM) or anti (IgG, A, M) coupled with pero ⁇ xydase], then
  • a labeled anti (antibody) such as anti (IgG), anti (IgA), anti (IgM) or anti (IgG, A, M) coupled with pero ⁇ xydase
  • the cytokines that are used according to the invention are human cytokines (because the cytokines of animal origin are not generally 100% identical to the corresponding human cytokines). These human cytokines are prepared by genetic engineering from the corresponding cDNAs; for the preparation of PF4, it is also possible to use the extraction and purification process described in the aforementioned document EP-A-0 495 971.
  • the purpose of using the method according to the invention is to detect an anti (chemokine) antibody directed against a chemokine of the CXC or CC type, in particular for the purpose of early diagnosis of immune diseases which in particular result in thrombocytopenia, neutropenia and syndromes. inflammatory and thrombosis.
  • said use relates to the detection of an anti (Il-8), anti (NAP-2), anti (GRO), anti (ENA-78) or respectively anti (IP-10) antibody, by reaction with a chemokine chosen from IL-8, NAP-2, GRO, ENA-78 and respectively IP-10, for the early diagnosis of immune diseases, in particular chosen from thrombocytopenic, neutropenic, proinflammatory pathologies and capable of inducing thrombosis .
  • PF4 / anti (Hep-PF4) autoantibodies [ie principally anti (PF4) when Hep was not present in the coating containing PF4, or anti (Hep-PF4) when Hep was present in said coating], anti (IL-8), anti (NAP-2), anti ( ⁇ TG), anti (CTAP-III) and respectively anti (PBP) according to a method EIA sandwich.
  • microcuvettes Rinsed to remove each unbound protein and then saturate with i the coating buffer containing 10% v / v goat serum.
  • 200 ⁇ l of plasma are incubated (prediluted at 1: 100 using a diluent consisting of 0.05 M phosphate buffer of 0.15 M NaCl and 10% goat serum) for lh at RT.
  • the microcuvettes are rinsed with a solution of 0.025 M phosphate buffer, 0.15 M NaCl, 0.1% of TWEEN® 20, at pH 7.5.
  • the blood of 5 patients was collected on Na2 EDTA.
  • blood has was collected on trisodium citrate, conventional anticoagulant (at the rate of 9 volumes of blood for 1 volume of trisodium citrate), and centrifuged for 20 minutes at 3000 g, the citrate plasma constituting the supernatant being collected, distributed in vials of determined volume and frozen at -80 ° C for storage, said plasma being thawed at 37 ° C for 0.25 h before use.
  • results obtained were recorded in table I and represented graphically in figures la to the for the 5 patients (numbered 1 to 5). If the value measured for the absorbance is such that ( ⁇ ) A492 ⁇ 0.30, it is considered having regard to control C that the plasma tested is devoid of the antibody sought, ( ⁇ ) 0.30 ⁇ A492 ⁇ 0, 50, it is considered that there is a doubt as to the presence of said antibody, and
  • Figure 2 represents, in the number of platelets (PC) / days system, the numbering of the platelets of each patient, each arrow (in bold in said figure 2) indicating the day on which he stopped administering Hep for each patients. All of these results show that patients 1-3
  • NAP-2 antibodies directed against "precursors" of NAP-2 (essentially CTAP-III and

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Abstract

La présente invention concerne un procédé pour identification précoce d'une maladie auto-immune, ledit procédé, qui met en oeuvre une réaction immunologique du type antigène-anticorps en vue de détecter le matériau immunitaire responsable de ladite maladie, étant caractérisé en ce qu'il comprend: (1) la mise en contact d'une cytokine (Z) avec un échantillon biologique susceptible de contenir ledit matériau immunitaire responsable, qui est un autoanticorps (anti(Z)) dirigé contre ladite cytokine (Z), afin de déclencher la réaction: anti(Z) + Z ---> anti(Z)-Z puis, (2) la révélation du produit de réaction ainsi obtenu, le complexe anti(Z)-Z, pour évaluer la présence ou l'absence dudit anticorps anti(Z) dans ledit échantillon. Elle concerne également l'utilisation de ce procédé pour la détection des autoanticorps et un nécessaire de dosage pour le mettre en oeuvre.

Description

PROCEDE D ' IDENTIFICATION PRECOCE D ' UNE MALADIE AUTO-IMMUNE, UTILISATION DANS LE DOMAINE DU DIAGNOSTIC ET NECESSAIRE DE DOSAGE POUR METTRE EN OEUVRE.
Domaine de l'invention
La présente invention a trait à la détection précoce de maladies ou désordres de nature auto-immune. Plus précisément, elle concerne un procédé d'identification de ces maladies ou désordres immunitaires,
10 l'utilisation de ce procédé pour détecter la présence ou l'absence des anticorps responsables, et un nécessaire, kit ou trousse de dosage pour mettre en oeuvre ce procédé. Art antérieur
On sait que la communication entre les différentes cellules du 5 système immunitaire (lymphocytes T, lymphocytes B, macrophages, neutro- philes, progéniteurs hématopoïétiques, etc.) est assurée au moins partiel¬ lement par une cascade complexe d'interactions mettant en oeuvre, en tant que médiateurs, des protéines particulières à savoir les cytokines.
Parmi les cytokines, on connaît une famille de produits, les 0 "chémokines" (autres nomenclatures : "intercrines" ou "cytokines de la superfamille du PF4"), qui interviennent notamment dans les mécanismes inflammatoires et surtout proinflammatoires lors de la défense de l'organisme vis-à-vis d'un hôte étranger, se présentent sous forme monomère (structure monocaténaire ayant un poids moléculaire d'environ 8-10 kD) et 5 surtout sous forme polymère (principalement la forme dimère et la forme tétramère), ont quatre groupes Cys dans leur structure monocaténaire et sont réparties en deux sous-familles en fonction des deux premiers Cys rencontrés en allant de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale selon que les deux dits premiers Cys sont séparés ou non par un autre aminoacide. 0 On distingue ainsi, notamment selon les articles de R. HORUK,
Immunol. Today, 1994, ϋ (No. 4), pages 169-174, de E. BRANDT et al. , Platelets, 1992, 3_, pages 295-305, et de A.E. KOCH et al., J. Invest. Med. , 1995, 42, pages 28-38,
(i) la sous famille des chémokines de type CXC (où C est Cys et X un 5 aminoacide différent de Cys), qui comprend en particulier les IL-8 , PF4, GRO, IP-10 et NAP-2 [les définitions des abréviations sont données ci- après], et qui est également dénommée sous-famille des α-intercrines, et (ii) la sous-famille des chémokines de type CC (où C est Cys comme indiqué ci-dessus), qui comprend en particulier les RANTES et MCP-1 , et qui est également dénommée sous-famille des β-intercrines.
En bref, les chémokines agissent principalement en tant qu'agents chémoattirants (i.e. "chémoattractants") et activants de leucocytes particuliers. A l'intérieur d'une même sous-famille, chaque chémokine a des activités qui sont uniques, d'une part, et qui recouvrent ou chevauchent celles d'autres chémokines, d'autre part. Ainsi, les chémokines qui présentent du côté de l'extrémité N-terminale une séquence ELR (i.e. Glu- Leu-Arg) immédiatement avant le premier Cys (c'est-à-dire une structure ELRC), comme par exemple GRO, IL-8, PBP, CTAP-III, βTG, NAP-2 et ENA-78 sont pour les neutrophiles des agents chémoattractants et activants ; les chémokines CXC dépourvues de ladite séquence ELR ont en général des activités faibles voire nulles en ce qui concerne l'attraction des neutrophiles, comme cela est le cas notamment de PF4 et IP-10 ; et, les chémokines CC sont des agents chémoattractants et activants pour les monocytes et les cellules T, comme cela est le cas notamment de RANTES, MIP-1 et MCP-1. Selon l'article de A.E. KOCH et al. précité (voir notamment page
34, paragraphe "Conclusions"), il est indiqué que les chémokines jouent un rôle important dans les inflammations rhumatismales et, comme un grand nombre d'entre elles est détectable dans le sérum de patients rhumatismaux, elles peuvent servir de marqueurs pour l'identification ou le diagnostic desdites inflammations. Or, si l'homme de l'art est en mesure de détecter une chémokine dans un milieu biologique tel que le sérum par réaction avec son anticorps spécifique anti(chémokine) puis révélation du complexe formé, il ne peut pas s'appuyer sur l'identification d'une chémokine ni sur une éventuelle différence de concentration d' une chémokine donnée par rapport à une valeur normale du sujet sain pour diagnostiquer une maladie auto- immune ou un risque d'une telle maladie. D'une part, cette façon de procéder serait contraire à la thérapeutique envisagée par d'autres auteurs qui consisterait à administrer au sujet atteint d' une maladie auto-immune la chémokine qui ferait défaut. D'autre part, elle ne permettrait pas de distinguer aisément la chémokine libre de la chémokine logiquement liée à (ou aux) récepteur(s) de sa cible.
On sait par ailleurs, notamment de J. AMIRAL et al. , Thromb.
Haemost., 1992, 68, pages 95-96, J. AMIRAL et al. , Tromb. Haemost. , 1995, 73, pages 21-28, et EP-A-0 495 971 , que les thrombopénies induites par l'héparine (HIT) de type II sont provoquées par un autoanticorps anti(Hep-PF4) généré par l'organisme contre le complexe héparine-PF4.
Il est rappelé que les HIT constituent la complication majeure des héparino-thérapies. On distingue le type I, où la thrombopénie est modérée, réversible, non associée à des troubles cliniques, et le type II beaucoup moins fréquent (au plus 5 % des patients hospitalisés et soumis à une héparino-thérapie) qui est caractérisé par une crise sévère intervenant en moyenne 7 à 15 jours après le début de l' héparino-thérapie et pouvant conduire à une thrombose. On sait enfin que beaucoup de cytokines et d'anticorps anti(cytokine) sont à présents commercialisés dans des buts analytiques ; voir à cet effet les catalogues de 1994 et 1995 de la société R & D SYSTEMS relatifs aux cytokines.
L'art antérieur sus-visé ne décrit ni ne suggère que (i) des maladies auto-immunes résultent de l'action d' autoanticorps anti(cytokine), et que (ii) ces maladies auto-immunes peuvent être détectées précocement par l'intermédiaire de la réaction : cytokine + anti(cytokine) -> cytokine-anti(cytokine) Buts de l'invention On vient de découvrir de façon surprenante que les matériaux responsables de certaines maladies auto-immunes, notamment celles qui sont susceptibles de conduire à une thrombose, sont des autoanticorps anti(cytokine) et en particulier des autoanticorps anti(chémokine).
Ces maladies auto-immunes qui comprennent notamment les pathologies thrombopéniantes, neutropéniantes, proinflammatoires ou susceptibles d'induire une thrombose, peuvent provoquer (en général très rapidement) des crises sévères allant des thrombopénies et neutropénies aux ischémies, thromboses et amputations.
Il existe donc un besoin d' une nouvelle solution technique pour identifier ou détecter de façon précoce lesdites maladies auto-immunes. Selon un premier aspect de l'invention, on se propose de fournir un nouveau procédé pour identification précoce d'une maladie auto-immune, qui met en oeuvre une réaction du type antigène-anticorps.
Selon un second aspect de l'invention, on se propose d'utiliser ce procédé pour détecter l' autoanticorps responsable de ladite maladie auto- immune.
Selon un troisième aspect de l'invention, on se propose de fournir un nécessaire pour mettre en oeuvre ledit procédé. Objet de l'invention La solution technique que l'on préconise pour satisfaire le besoin sus-visé consiste à rechercher la présence ou l'absence d'un autoanticorps responsable dans un milieu biologique liquide provenant du patient.
Selon l'invention, on recommande un procédé pour identification précoce d'une maladie auto-immune, ledit procédé, qui met en oeuvre une réaction immunologique du type antigène-anticorps en vue de détecter le matériau immunitaire responsable de ladite maladie, étant caractérisé en ce qu'il comprend :
(1) la mise en contact d'une cytokine (Z) avec un échantillon biologique liquide susceptible de contenir ledit matériau immuni- taire responsable, qui est un autoanticorps (anti(Z)) dirigé contre ladite cytokine (Z), afin de déclencher la réaction : anti(Z) + Z — > anti(Z)-Z puis,
(2) la révélation du produit de réaction ainsi obtenu, le complexe anti(Z)-Z, pour évaluer la présence ou l'absence dudit anticorps anti(Z) dans ledit échantillon.
Selon l'invention, l'utilisation que l'on préconise est caractérisée en ce que l'on fait appel à une cytokine pour détecter un autoanticorps anti (cytokine) susceptible d'être pathogène par la réaction cytokine -f anti(cytokine) — > cytokine-anti(cytokine) et la révélation du complexe cytokine-anti(cytokine) formé.
Pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention, on préconise un nécessaire, kit ou trousse de dosage qui comprend : - au moins une cytokine Z, - au moins un réactif pour la révélation de la formation du complexe anti(Z)-Z, et
- le cas échéant, au moins un anticorps anti(Z) en tant que témoin positif. Abréviations
Dans la présente description on a utilisé par commodité les abréviations et acronymes suivants, qui sont notamment illustrés dans les catalogues précités de 1994 et 1995 de la société R & D SYSTEMS relatifs aux cytokines.
A492 (ou A 492 nm) mesure ou valeur de l' absorbance sous une lumière ayant une longueur d'onde de 492 nm BTG voir βTG ci-après
CSF facteur stimulant de colonies (en anglais : "colony stimulating factor"), on connaît notamment trois CSFs, à savoir les G-CSF, GM-CSF et M-CSF qui stimulent les colonies de granulocytes, de granulocytes-macrophages et respectivement de macrophages CTAP-III peptide d'activation du tissu conjonctif de type III (en anglais :
"connective tissue activating peptide III"), il s'agit d'un dérivé de
PBP qui ne possède pas les 9 premier aminoacides de PBP mature EDTA acide éthylènediaminotétraacétique, le sel disodique de cet acide est écrit ici sous la forme Na2 EDTA EGF facteur de croissance épithéliale (en anglais : "épithelial growth factor"), on connaît plusieurs EGFs notamment les TGF-α, et
HB-EGF EIA essai enzymoimmunologique (en anglais : "enzyme immunoas- say")
ENA-78 peptide activant les neutrophiles épithéliaux (en anglais : "épithe¬ lial neutrophil activating peptide-78") comportant 78 aminoacides
FGF facteur de croissance de fibrobiastes (en anglais : "fibroblast growth factor"), on connaît à l'heure actuelle sept molécules dans la famille des FGFs qui sont numérotées FGF-1 à FGF-7 FGFa facteur acide de croissance de fibrobiastes (en anglais : "acidic fibroblast growth factor"), autre nomenclature FGF-1 FGFb facteur basique de croissance de fibrobiastes (en anglais : "basic fibroblast growth factor"), autre nomenclature FGF-2 FIA essai immunofluorescent (en anglais : "fluorescence immunoas- say") GAG glycosaminoglycane
GRO produit d'un gène de croissance (en anglais : "growth-related gène") [autre nomenclature : MGSA], on connaît notamment plusieurs GROs : GROα dont la protéine mature comprend 73 aminoacides, GROβ et GROγ, (sauf indications contraires, GRO désignera ici GROα ou MGSA) HAT thrombopénie associée à l'héparine (en anglais : "heparin- associated thrombocytopenia")
HB-EGF facteur analogue au facteur de croissance épithéliale liant l'héparine (en anglais : "heparin-binding EGF-like factor"), il s'agit d'un EGF particulier Hep héparine, notamment l'héparine normale non- fractionnée et l'héparine fractionnée ; Hep fait partie des GAGs
Hep-PF4 complexe formé par l'héparine et le facteur plaquettaire 4
HGF facteur de croissance d'hépatocytes (en anglais : "hepatocyte growth factor") HIT thrombopénie induite par l'héparine, c'est-à-dire une thrombopénie caractérisée par la présence d'un autoanticorps anti(Hep-PF4) (en anglais : "heparin-induced thrombocytopenia") IP-10 protéine inductible par l'interféron γ (en anglais : "interferon-γ- inducible protein"), la protéine mature de IP-10 comporte 77 aminoacides IL-8 interleucine 8 (autre nomenclature NAP-1), la protéine exprimée par le cDNA correspondant comporte 99 aminoacides y compris un éventuel peptide signal, on connaît au moins 4 variants de IL 8 humaine selon les clivages de l'extrémité N-terminale contenant 79, 77, 72 et respectivement 69 aminoacides, le variant à 72 aminoacides (qui est le plus actif) a été utilisé ici.
MBSS m-maléimido-benzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide MCP-1 protéine chémotactique de monocytes de type 1 (en anglais : "monocytes chemotactic protein-1 "), autre nomenclature : MCAF (de "monocyte chemotactic and activating factor") MGSA produit ayant une activité de stimulation de la croissance de mélanomes (en anglais : "melanoma growth-stimulating activity"), voir GRO ci-dessus MIP-1 protéine inflammatoire de macrophages de type 1 (en anglais : "macrophage inflammatory protein-1 "), on distingue depuis peu deux molécules voisines : MlP-lα et MlP-l β MW poids moléculaire
NAP-2 peptide activant les neutrophiles de type 2 (en anglais :
"neutrophil-activating peptide-2"), NAP-2 mature humain comporte 70 aminoacides et peut notamment être obtenu par clivage de l'extrémité N-terminale de βTG OPD orthophénylènediamine
PBP protéine basique de plaquettes (en anglais : "platelet basic protein"), la protéine mature humaine comporte 94 aminoacides, les clivages protéoly tiques de l'extrémité N-terminale de PBP donnent CTAP-III (85 aminoacides), βTG (81 aminoacides) et respectivement NAP-2 (70 aminoacides) PDGF facteur de croissance dérivé de plaquettes (en anglais : "platelet- derived growth factor") PF4 facteur plaquettaire 4 (en anglais : "platelet factor-4")
RANTES chémokine CC dont le nom est l'acronyme de "Regulated upon activation, normal T cell Expressed and Secreted" , la protéine mature humaine comporte 68 aminoacides RIA essai radioimmunologique (en anglais : "radio immunoassay") RT température ambiante (15-25°) βTG β-thromboglobuline (autre nomenclature : BTG), dérivé de PBP et
CTAP-III, notamment par perte de 3 aminoacides à l'extrémité N- terminale de CTAP-III TGF-α facteur de croissance transformant de type α (en anglais : "transforming growth factor-α"), substance appartenant à l'ensemble des EGFs TGF-β facteur de croissance transformant de type β (en anglais : "transforming growth factor-β "), on connaît à l' heure actuelle cinq molécules TGF-β 1 (ou TGF-β) et TGF-β2 à TGF-β5 qui présentent 30 à 80 % de similitude avec TGF-β 1 VEGF facteur de croissance endothélial vasculaire (en anglais : "vascular endothelial growth factor") Brève description des dessins
Les dessins annexés sont fournis pour illustrer la présente invention en ce qui concerne la détection des autoanticorps responsables. Dans ces dessins :
- les figures la, lb, le, ld et respectivement le représentent graphiquement la détection d' autoanticorps anti(chémokine) dans le plasma des patients 1 , 2, 3, 4 et respectivement 5 avec diverses chémokines et un témoin à blanc (C), en présence (I) ou en l'absence (II) de Hep, et
- la figure 2 représente l'évolution cinétique du nombre de plaquette (PC) dans le temps exprimé en jours (j).
Description détaillée de l'invention
Les autoanticorps responsables ou caractéristiques des maladies et désordres auto-immuns sont dirigés contre les cytokines et parmi celles-ci principalement (d'un point de vue statistique) contre les chémokines.
Le mécanisme conduisant à la formation desdits autoanticorps anti(cytokine) n'est pas encore élucidé ni déterminé. Néanmoins, le résultat global qui est observé est que les maladies auto-immunes, telles que les thrombopénies, les neutropénies et les pathologies proinflammatoires, sont caractérisées par la présence dans l'organisme des patients (principalement dans le plasma et le sérum) d' autoanticorps anti(cytokine).
On présume, mais il s'agit là d'une théorie qui ne lie pas la Demanderesse, que (A) une cytokine donnée Z se lie à un corps Y, qui est (i) une cellule cible (Y\) de Z, (ii) une portion de paroi d'une cellule étrangère (Y2) comportant au moins un des récepteurs de Z (voir à cet effet l' article précité de R. HORUK qui fait état de la présence du récepteur érythrocytaire CK, qui fixe IL-8, sur le parasite de la malaria chez l'homme à savoir Plasmodium vivax) ou (iii) une molécule susceptible de fixer ladite cytokine, pour former un complexe Z-Y tel que Z-Yj ,
Z-Y2 ou Z-Y3 ;
(B) le corps Y dudit complexe se lie à une autre cellule (X) de l'organisme
(l'adhésion des neutrophiles aux plaquettes est décrite notamment par G.B. NASH dans Thrombos. Res. , 1994, 74, Suppl. 1 , pages S3-S 1 1), pour former un complexe Z-Y-X ; en variante ledit complexe Z-Y-X peut être obtenu par réaction de Z sur Y-X ; et, (C) l'organisme qui ne reconnaît pas Z-Y-X génère des anticorps et en particulier les autoanticorps anti(cytokine) caractéristiques selon l'invention, que l'on se propose de détecter rapidement avant le déclenchement ou l'arrivée de la crise sévère, qui amène la thrombose l'amputation (des doigts, des orteils ou des membres) ou le décès.
Ce mécanisme comporte des similitudes avec celui qui conduit aux
HITs de type II, il en diffère cependant par la nature des anticorps responsables, à savoir les anti(cytokine), alors que lesdites HITs sont héparino-dépendantes et caractérisées par la présence d' anticorps anti(Hep-
PF4).
De plus, selon ledit mécanisme, la présence d'un GAG amplifie les manifestations et la sévérité des pathologies liées à l'existence d'anticorps anti(cytokine), dès lors que les GAGs se lient à un grand nombre de cytokines et pratiquement à toutes les chémokines. Il se trouve en effet qu'en particulier Hep [héparine de haut poids moléculaire (MW = 30000-6000 environ), héparine "standard" (MW = 12000 environ), héparine de bas poids moléculaire (MW = 6000-3000 environ)] et les acides chondroïtine- sulfurique (notamment le dermatan sulfate) ont une grande affinité pour les chémokines. Par ailleurs comme les GAGs tels que Hep fixent les cytokines, ils ont la possibilité de les convoyer vers d'autres cellules (par exemple erythrocytes, endothélium, etc. pour Hep) qui sont dépourvues de récepteurs desdites cytokines ; on obtient alors de nouvelles cibles pour des autoanticorps.
Parmi les cytokines, à partir desquelles l'organisme peut générer des autoanticorps responsables (ou caractéristiques) de pathologies thrombo- péniantes, neutropéniantes, proinflammatoires ou susceptibles d'induire une thrombose, on peut mentionner les CSFs (notamment G-CSF, GM-CSF et MCSF), EGFs (notamment TGF-α), FGFs (notamment FGFa et GFGb),
HGF, PDGF, TGF-β et VEGF.
Eu égard à la fréquence de ces pathologies chez l'homme, la cytokine Z sera avantageusement choisie parmi l'ensemble constitué par les chémokines. Parmi lesdites chémokines à partir desquelles l'organisme génère des autoanticorps responsables (ou caractéristiques) de pathologies thrombo- péniantes, neutropéniantes, proinflammatoires ou susceptibles d'induire une thrombose, on peut citer - les substances du type CXC, où C désigne Cys et X un reste aminoacide différent de Cys, et
- les substances du type CC, où C désigne Cys, à savoir : parmi les chémokines CXC comportant le fragment ELR comme indiqué ci- dessus : les GROs (notamment GROα, GROβ et GROγ), IL 8, PBP, les dérivés de PBP (CTAP-III, βTG et NAP-2) et ENA-78, parmi les chémokines CXC ne comportant pas ledit fragment ELR : les PF4 et IP-10, et parmi les chémokines CC : les RANTES, MCP-1 et MIP-2.
Pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention on fait appel à un échantillon biologique susceptible de contenir l'un des autoanticorps respon¬ sables ou caractéristiques. Cet échantillon biologique sera un liquide aqueux et plus précisément un liquide corporel. Si l'on peut effectivement rechercher et détecter un anticorps anti(cytokine) dans l'urine, la salive, le liquide synovial ou le pus, il est plutôt recommandé que ledit liquide corporel soit le plasma ou le sérum qui ont par rapport aux autres liquides corporels, des concentrations en anticorps plus élevées.
De façon pratique, on recherchera dans l'échantillon biologique liquide (avantageusement le plasma ou le sérum) la présence ou l'absence d'un auto-anticorps anti(Z) dirigé contre une cytokine appartenant à la sous- famille des chémokines du type CXC et choisie parmi l'ensemble constitué par les PBP, CTAP-III et β-TG, et mieux la présence ou l'absence d'un autoanticorps anti(Z) dirigé contre une cytokine appartenant à la sous-famille des chémokines du type CXC et choisie parmi l'ensemble constitué par les IL-8, NAP-2, GRO, IP-10 et ENA-78. Le cas échéant, on pourra rechercher dans ledit échantillon la présence ou l'absence d'un auto-anticorps anti(Z) dirigé contre une cytokine appartenant à la sous-famille des chémokines du type CC et choisie parmi l'ensemble constitué par les RANTES, MIP-1 et MCP- 1.
La révélation du complexe anti(Z)-Z, qui a été formé au stade (1), est mise en oeuvre au stade (2) selon une méthode connue en soi, notamment une méthode EIA, RIA, FIA. Dans les essais rapportés ci-après, une technique EIA sandwich, selon laquelle on fait réagir
- l'anticorps anti(Z), susceptible d'être contenu dans le plasma ou le sérum, avec l'antigène correspondant Z immobilisé, - après rinçage, le complexe anti(Z)-Z avec un anti(anticorps) marqué [tel que anti(IgG), anti(IgA), anti(IgM) ou anti(IgG,A,M) couplé à la pero¬ xydase], puis
- après rinçage, le complexe résultant avec le système OPD/H2O2 pour révélation et mesure de A492. Les cytokines que l'on utilise selon l'invention sont des cytokines humaines (car les cytokines d'origine animale ne sont pas en général identiques à 100 % aux cytokines humaines correspondantes). Ces cytokines humaines sont préparées par génie génétique à partir des cDNA corres¬ pondants ; pour la préparation de PF4 on peut en outre utiliser le procédé d'extraction et de purification décrit dans le document EP-A-0 495 971 précité.
L'utilisation du procédé selon l'invention a pour objet de détecter un anticorps anti(chémokine) dirigé contre une chémokine du type CXC ou CC, notamment dans un but de diagnostic précoce de maladies immunitaires ayant notamment pour conséquence des thrombopénies, neutropénies, syndromes inflammatoires et thromboses.
En particulier ladite utilisation concerne la détection d'un anticorps anti(Il-8), anti(NAP-2), anti(GRO), anti(ENA-78) ou respecti¬ vement anti(IP-lO), par réaction avec une chémokine choisie parmi les IL-8, NAP-2, GRO, ENA-78 et respectivement IP-10, en vue du diagnostic précoce de maladies immunitaires, notamment choisies parmi les pathologies thrombopéniantes, neutropéniantes, proinflammatoires et susceptibles d'induire une thrombose.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre d'exemples de réalisation et de résultats d'essais. Bien entendu l'ensemble de ces éléments est donné à titre d'illustration et n'est pas limitatif. Exemple 1
On a entrepris des essais sur le plasma de 5 patients, qui avaient été hospitalisés, soumis à une héparino-thérapie avec Hep non fractionnée (CALCIPARINE®, héparine standard de MW = 12000 environ sous forme de sel de calcium) ou Hep fractionnée (FRAXIPARINE®, héparine de MW = 4500 environ) et présentaient les symptômes d'une HIT de type II mais sans la présence caractéristique d'anticorps anti(Hep-PF4). Ces patients étaient en fait atteints de HAT de type II. On a recherché sur leur plasma la présence ou l'absence d' autoanticorps anti(PF4)/anti(Hep-PF4) [i.e. princi¬ palement anti(PF4) quand Hep n'était pas présent dans le revêtement contenant PF4, ou anti(Hep-PF4) quand Hep était présent dans ledit revêtement], anti(IL-8), anti(NAP-2), anti(βTG), anti (CTAP-III) et respec- tivement anti (PBP) selon une méthode EIA sandwich.
Dans les microcuvettes de plaques d'analyse (COVALINK®) on introduit 200 μl d'une solution de MBSS à 125 mg/1, incube pendant 4 h à RT (préactivation des parois) et lave avec un 1 M de tampon phosphate à pH 7,5. On introduit 200 μl d'une solution de 20 μg/ml de protéine humaine mature (rhPF4, rhIL-8, rhNAP-2, rhβTG, rhCTAP-III ou respectivement rhPBP) en association avec des concentrations de Hep standard croissante (0 à 2 IU/ml) et laisse reposer pendant une nuit àι RT. On rince pour écarter chaque protéine non fixée puis sature avec i le tampon de revêtement contenant 10 % v/v de sérum de chèvre. Dans les microcuvettes ainsi revêtues, on incube 200 μl de plasma (prédilué à 1 : 100 au moyen d'un diluant constitué de 0,05 M de tampon phosphate de 0, 15 M de NaCl et de 10 % de sérum de chèvre) pendant lh à RT. On rince les microcuvettes avec une solution de 0,025 M de tampon phosphate, 0, 15 M de NaCl, 0, 1 % de TWEEN® 20, à pH 7,5. On ajoute le conjugué [à savoir anti(IgG,A,M) global couplé à la peroxydase, à la concentration de 3 μg/ml dans le diluant du plasma] dans les microcuvettes. Après rinçage, on procède au développement de la coloration avec le système OPD/H2O2 pendant 3 minutes à RT puis stoppe la réaction avec 3M d'acide sulforique. On mesure ensuite A492 en 0,5 h. L'essai contrôle négatif désigné C (absence d'anticorps) a été réalisé en remplaçant le plasma des patients, qui a été dilué, par le milieu de dilution. Si nécessaire, des essais contrôles positifs peuvent être entrepris avec ledit milieu de dilution contenant une quantité donnée d' un anticorps identique à celui que l'on veut rechercher.
Pour la détermination du nombre de plaquettes, le sang de 5 patients a été recueilli sur Na2 EDTA. Pour tous les autres essais, le sang a été recueilli sur citrate trisodique, anticoagulant conventionnel (à raison de 9 volumes de sang pour 1 volume de citrate trisodique), et centrifugé pendant 20 minutes à 3000 g, le plasma citrate constituant le surnageant étant recueilli, réparti dans des fioles de volume déterminé et congelé à -80°C pour stockage, ledit plasma étant décongelé à 37 °C pendant 0,25 h avant utilisation.
Pour la détection des anticorps anti(PF4)/anti(Hep-PF4), anti(IL- 8), anti(NAP-2), anti(βTG), anti(CTAP-III) et respectivement anti(PBP), les résultats obtenus ont été consignés dans le tableau I et représentés graphiquement dans les figures la à le pour les 5 patients (numérotés 1 à 5). Si la valeur mesurée pour l' absorbance est telle que (α) A492 < 0,30, on considère eu égard au témoin C que le plasma testé est dépourvu de l'anticorps recherché, (β) 0,30 < A492 ≤ 0,50, on considère qu'il y a un doute quant à la présence dudit anticorps, et
(γ) 0,50 < A492, on considère que le plasma testé contient l'anticorps recherché.
De plus dans la figure 1 , on a indiqué que le complexe anti(Z)-Z a été obtenu en présence (I) ou en l'absence (II) de Hep. Le tableau II comporte les données cliniques desdits patients.
La figure 2 représente, dans le système nombre de plaquettes (PC)/jours, la numérotation des plaquettes de chaque patient, chaque flèche (en gras dans ladite figure 2) indiquant le jour où l'on a cessé d'administrer Hep pour chacun des patients. L'ensemble de ces résultats met en évidence que les patients 1-3
(voir figures la-lc) présentaient dans leur plasma l'anticorps anti(IL-8) responsable de la thrombopénie HAT de type II, et que les patients 4-5 (voir figures ld-le) présentaient dans leur plasma l'anticorps anti(NAP-2) responsable de la thrombopénie HAT de type II. De plus des anticorps dirigés contre des "précurseurs" de NAP-2 (essentiellement CTAP-III et
PBP), ont été détectés dans le plasma du patient 4.
Par ailleurs, comme les figures l a à le montrent que les résultats ne sont pas influencés par la présence de Hep, les valeurs A492 étant identiques en présence (I) ou en l'absence (II) de Hep, il est clair que les autoanticorps responsables sont dirigés contre des protéines (ici IL-8, NAP-2 et, le cas échéant, des précurseurs de NAP-2) et non contre des complexes de Hep avec lesdites protéines.
TABLEAU I
Absorbance à 492 nm lors de la détection des anticorps
Figure imgf000017_0001
TABLEAU π
Données cliniques
Exemple 2
Sur un lot de 815 patients atteints de thrombopénies ou de neutropénies on a recherché la présence dans le plasma d'anticorps anti(Hep- PF4), anti(PF4), anti(IL-8), anti(NAP-2), anti(βTG), anti(CTAP-III) et respectivement anti(PBP). On a sélectionné 17 patients chez lesquels le plasma était dépourvu de ces anticorps puis, selon le procédé décrit à l'exemple 1 en remplaçant les produits PF4, IL-8, NAP-2, βTG, CTAP-III et respectivement PBP par ENA-78, GRO, TFG-α, FGFa, FGFb, PDGF, et respectivement GM-CSF, on a déterminé la présence d'anticorps anti(ENA- 78), anti-(GRO), anti(TFG-α), anti(FGFa), anti (FGFb), anti(PDGF), et respectivement anti(GM-CSF). La répartition des maladies auto-immunes était celle consignée dans le tableau III
TABLEAU III
Figure imgf000019_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour identification précoce d'une maladie auto-immune, ledit procédé, qui met en oeuvre une réaction immunologique du type antigène-anticorps en vue de détecter le matériau immunitaire responsable de ladite maladie, étant caractérisé en ce qu'il comprend :
(1) la mise en contact d'une cytokine (Z) avec un échantillon biologique susceptible de contenir ledit matériau immunitaire responsable, qui est un autoanticorps (anti(Z)) dirigé contre ladite cytokine (Z), afin de déclencher la réaction
anti(Z) + Z — > anti(Z)-Z puis, (2) la révélation du produit de réaction ainsi obtenu, le complexe anti(Z)-Z, pour évaluer la présence ou l'absence dudit anticorps anti(Z) dans ledit échantillon.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que Z est une cytokine choisie parmi l'ensemble constitué par les chémokines.
3. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la cytokine
Z est une chémokine du type CXC, où C désigne Cys et X un reste aminoacide différent de Cys.
4. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la cytokine
Z est une chémokine du type CC, où C désigne Cys.
5. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel on recherche la présence ou l'absence d'un autoanticorps anti(Z) dirigé contre une cytokine appartenant à la sous-famille des chémokines du type CXC et choisie parmi l'ensemble constitué par les IL-8, NAP-2, GRO, IP-10 et ENA-78.
6. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel on recherche la présence ou l'absence d'un auto-anticorps anti(Z) dirigé contre une cytokine appartenant à la sous-famille des chémokines du type CXC et choisie parmi l'ensemble constitué par les PBP, CTAP-III et β-TG.
7. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel on recherche la présence ou l'absence d' un auto-anticorps anti(Z) dirigé contre une cytokine appartenant à la sous-famille des chémokines du type CC et choisie parmi l'ensemble constitué par les RANTES, MIP-1 et MCP-1.
8. Utilisation du procédé selon la revendication 1 , ladite utilisation étant caractérisée en ce que l'on fait appel à une cytokine pour détecter un anticorps anti(cytokine) susceptible d'être pathogène par la réaction cytokine + anti(cytokine) — > cytokine-anti(cytokine) et la révélation du complexe cytokine-anti(cytokine) formé.
9. Utilisation selon la revendication 8, pour détecter un anticorps anti(chémokine) dirigé contre une chémokine du type CXC ou CC, notamment dans un but de diagnostic précoce de maladies immunitaires ayant notamment pour conséquence des thrombopénies, neutropénies, syndromes inflammatoires et thromboses.
10. Utilisation selon la revendication 8, pour détecter un anticorps anti(Il-8), anti(NAP-2), anti(GRO), anti(ENA-78) ou respectivement anti(IP- 10), par réaction avec une chémokine choisie parmi les IL-8, NAP-2, GRO, ENA-78 et respectivement IP-10, en vue du diagnostic précoce de maladies immunitaires, notamment choisies parmi les pathologies thrombopéniantes, neutropéniantes, proinflammatoires et susceptibles d'induire une thrombose.
11. Nécessaire de dosage pour mettre en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend :
- au moins une cytokine Z,
- au moins un réactif pour la révélation de la formation du complexe anti(Z)-Z, et
- le cas échéant, au moins un anticorps anti(Z) en tant que témoin positif.
PCT/FR1996/001441 1995-09-20 1996-09-16 Procede d'identification precoce d'une maladie auto-immune, utilisation dans le domaine du diagnostic et necessaire de dosage pour mettre en oeuvre WO1997011373A1 (fr)

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