WO1997010359A1 - Procede de concentration d'acide nucleique variant et materiel de test de concentration d'acide nucleique de mise en application du procede - Google Patents

Description

明 細 書

変異核酸の濃縮方法、 該濃縮方法を実施する ための核酸濃縮用検査 セ ッ 卜 技術分野

本発明は、 検体中の目的核酸の特定領域の特定の塩基配列を有す る核酸と、 それとはわずかに異な る塩基配列を有する微量の変異核 酸とが混在する検体中から、 正常核酸を選択的に分離 · 除去し、 又 は変異核酸を選択的に分離 * 捕獲 して、 変異核酸を濃縮する核酸の 濃縮方法、 及び該濃縮方法を実施するための核酸濃縮用検査セ ッ 卜 に関する。

背景技術

近年、 分子生物学、 遺伝学の進歩は著 し く 、 こ れ らの蓄積された 成果は生命現象の化学的、 物理学的解明に寄与する のみな らず、 人 間に対して、 特に医学や医療に対して も大きな影響を与え、 D N A から出発する D N A医学が予想を遥かに超えて臨床分野にま で急速 に広がりつつある。 また、 最近では、 ほとんどすべての疾患に D N A が関与している こ とが解明されてき てお り 、 遺伝子レベルでの診断 が必要不可欠な もの とな ってきている。

今日 、 遺伝子疾患と し て知られている も の には先天的代謝異常と して古く か ら知られていた数多 く の酵素欠損症がほとんど該当する こ とがわかってきてお り 、 これらの遺伝子診断をするためには遺伝 子上の塩基配列の変異を検出する こ とが極めて有効である。

一方、 後天的な遺伝子異常によ って引き起こ される疾患、 即ち癌 などの遺伝子診断を行う場合、 癌病片から癌細胞のみを集める こ と は非常に困難であ り 、 常に正常細胞が混入 して しま う。 従って、 正 常細胞と癌細胞が共存する状況下で、 癌細胞中の変異遺伝子のみを 特異的に検出する こ とが必要となる。 こ の場合、 現在用い られてい る検出方法では、 変異遺伝子が正常遺伝子の 1 0分の 1 程度、 即ち、 癌細胞が正常細胞の 5 〜 1 0分の 1 程度存在している場合はその検 出が可能であるか、 それ以下の微量の場合には検出は困難であ り 、 癌の早期診断、 早期治療に十分な成果を上げる には至っ ていない。 近年、 Pし R (P o l ym e r a s e C h a i n R e a c t i o n) 法等の遺伝子増幅法の開発によ り単に遺伝子量を増大させる こ とは 容易とな っ た。 しか し、 癌細胞と正常細胞、 或いは正常人と特定の 遗伝病患者の原因とな っている遺伝子の変異を同定する場合には、 単に遺伝子量を増大させるだけではな く 、 試料中に含まれる変異遺 伝子の比率を増大させる こ とが必要となる。 この場合、 一方の細胞 で特定遺伝子がかな り大きな領域で欠損又は挿入されて いた り 、 或 いは一方の細胞だけでその遺伝子が発現 してい る場合にはサブ ト ラ クシヨン法 ( I n し u r r e n t P r o t o c o l i n Mo l e c u l a r B i o l o g y , ( 1 9 9 2 ) , J o h n W i l e y & S o n s , I n c . によ り特定遺伝子を選択的に濃縮する こ とが可能である。 し力、 しな力 ら、 上記サブ ト ラ ク シ ヨ ン法では、 原因とな る遺伝子 の変異がわずかな場合、 即ち、 遺伝子の欠失、 付加或いは置換等変 異の領域が極めて小さ い場合や、 両者の遺伝子発現の レベルに差が 見られない場合には、 変異遺伝子の同定は事実上困難であ っ た。 発明の開示

本発明は、 上記事情に鑑みなされた も のであ り 、 検体中の目的核 酸の特定領域の正常核酸と微量に存在する変異核酸とが混在するよ う な状態であ っ て も、 容易かつ確実に検体中の変異核酸を濃縮する こ とができ、 微量な変異核酸の検出及び変異核酸の同定を可能とす る核酸の濃縮方法、 及び該濃縮方法を実施する ための核酸濃縮用検 査セ ッ 卜 を提供する こ とを 目的とする。

本発明者らは、 上記目的を達成するために、 検体中の目的核酸の 特定領域の正常核酸とその変異核酸とが混在している検体中から変 異核酸のみを選択的に濃縮する方法について鋭意検討を行った結果、 検体中の正常核酸及び変異核酸を増幅して試料核酸と し、 固相担体 と結合可能な標識物を導入した正常核酸増幅物を標識檩準核酸と し て、 上記試料核酸に対して等量以上の標識標準核酸を添加 · 混合し、 熱変性を行っ た後、 非常に緩やかな温度勾配でコ ンぺテ ィ テ ィ ブハ イ ブ リ ダイ ゼー シ ョ ンを行い、 ハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン後の反応液 中か ら固相担体と結合可能な標識物を有するハイ プ リ ダイ ゼ一 シ ョ ン生成物を固相担体に ト ラ ッ プして分離 · 除去する こ と に よ り 、 反 応液中か ら正常核酸のみを選択的に除去し得、 容易かつ確実に変異 核酸を濃縮する こ とができ る こ とを見出 し、 本発明を完成した もの であ る。

即ち、 本発明は、 本発明者らが、 先に提案した核酸の同一性を識 別する方法である P C R - P H F A法 （ P C T Z J P 9 4 Z 0 1 1 0 6、 N u c 1 . A c i d s . R e c . 2 2 , 1 5 4 1 ( 1 9 9 4 ) ) を 変異核酸の濃縮方法と して改良 · 発展させた ものであ り 、 正常核酸 と変異核酸とがわずか 1塩基でも異なる場合には上記 P C R— P H F A 法の コ ンペテ ィ テ ィ ブハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ンに よ り 、 完全に相補 的な塩基配列を持つ もの同士がよ り優先的に二本鎖を形成する性質 を利用 して変異核酸の濃縮を行う も のであ る。

そ の原理を説明すれば、 例えば正常核酸とわずかに変異した核酸 が微量混在している検体を増幅して試料核酸と し、 一方、 正常核酸 を増幅し、 こ の増幅物に固相担体に結合可能な標識物を導入 して標 識標準核酸と し、 こ の標識標準核酸を上記試料核酸に等モル以上添 加 · 混合 して非常に緩やかな温度勾配によ り コ ンぺテ ィ テ ィ ブハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ンを行う と、 ハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ン後の反応液 中に含まれる正常核酸は、 固相担体と結合可能な標識物が導入され た標識標準核酸の核酸鎖 （正常核酸から増幅反応によ り得られた核 酸鎖） と完全に相補的な塩基配列を持つこ と にな り 、 これと二本鎖 を形成する。 こ のため、 変異核酸に由来する ものはこの条件では固 相担体と結合可能な標識物が導入された合成核酸鎖よ り も、 元の相 補鎖 （固相担体と結合可能な標識物を持たない） と優先的に二本鎖 を形成する。 従っ て、 こ の反応液を上記標識物と特異的に結合する 官能基を導入 した固相担体に吸着させれば、 固相担体と結合可能な 標識物が導入された二本鎖核酸が選択的に固相担体に結合する。 そ して、 こ の固相担体に結合 しなかっ た画分を回収すれば元の増幅物 から正常核酸だけが除去されたものを得る こ とができ、 結果と して、 変異核酸が濃縮される こ と となる。

この場合、 検体中に含まれる変異核酸が極微量であ って も、 上記 一連の濃縮操作或いは上記コ ン ぺテ ィ テ ィ ブハイ プ リ ダイゼー シ ョ ン以降の操作を 2 回以上繰 り返すこ とによ り 、 変異核酸のみを選択 的に濃縮して検出可能な濃度にま で確実に濃縮する こ とが可能とな る。 こ の結果、 変異核酸量が増大する だけでな く 、 試料中に含まれ る変異核酸の比率も増大するために変異核酸の検出が容易かつ確実 とな り 、 更には変異核酸の同定を可能と し、 変異の解析によ り遺伝 病の解明、 更には治療へと発展させる こ とが可能とな る。

更に、 この方法によれば、 癌細胞と正常細胞、 或いは正常人と特 定の遺伝病患者で原因と な っ ている遺伝子の変異を同定する場合に おいて、 従来のサブ ト ラ ク シ ョ ン法では濃縮する こ とが困難であ つ た、 原因となる遺伝子の変異がわずかな場合、 即ち遺伝子の欠失、 付加或いは置換等変異の領域が極めて小さ く 、 遺伝子発現の レベル に差が見られないよ う な場合で も、 その遺伝子を選択的かつ確実に 濃縮する こ とができ、 変異遺伝子の同定を容易かつ確実に行う こ と が可能となる。

ま た、 正常細胞と異常細胞が共存する検体の中から微量に含まれ る異常細胞由来の変異核酸を濃縮する際には、 目的核酸が二本鎖の D N Aの場合に限られず、 一本鎖 D N A、 一本鎖若し く は二本鎖の R N Aを目的に合わせて組み合わせて使用する こ とができ、 D N A の変異だけでなく、 細胞内の m R N A (m e s s e n g e r R N A の異常の検出、 更には、 m R N Aに対する染色体 D N Aの異常の検 出に も幅広く 適応する こ とができ る ものである。 従って、 本発明は第 1 の発明と して、 目的核酸の特定領域の変異 核酸を選択的に濃縮する方法であって、

下記工程 （ 1 ) 〜 ( 3 )

( 1 ) 目的核酸の特定領域を増幅 して試料核酸を調製する工程、 ( 2 ) 目的核酸の特定領域の正常核酸と相補な塩基配列を有する核 酸に固相担体と結合可能な標識物を導入した標識標準核酸を、 試料 核酸に対して等モ ル以上添加 · 混合し、 コ ン ペテ ィ テ ィ ブハ イ プリ ダイ ゼ一 シ ヨ ンを行う工程、

( 3 ) コ ンペテ ィ テ ィ ブハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン後の反応液中に含 まれる、 固相担体と結合可能な標識物を有するハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ョ ン生成物及び残存する標識標準核酸を固相担体に ト ラ ッ プして反 応液から分離 · 除去する工程、

からなる一連の工程を 1 サイ ク ルと し、 該サイ ク ルを 1 回若し く は 複数回繰り返すか、 又は上記サイ クルを 1 回行った後、 上記工程 （ 2 ) と （ 3 ) を 1 回若し く は複数回繰り返すこ とを特徴とする変異核酸 の濃縮方法を提供する。

ま た、 こ の濃縮方法を実施するための濃縮用検査セ ッ ト と して、 目的核酸の特定領域を増幅して試料核酸を調製する た めの試料核酸 増幅用試薬と、 目的核酸の特定領域の正常核酸と相補な塩基配列を 有する核酸に固相担体と結合可能な標識物を導入 した標識標準核酸 と、 上記標識物と結合可能な部位を有する固相担体とを具備してな る こ とを特徴とする核酸濃縮用検査セ ッ ト を提供する。

また、 本発明者らは、 更に検討を進めた結果、 上記の方法とは逆 に、 検体中の正常核酸及び変異核酸を増幅した試料核酸に固相担体 と結合可能な 2種類の標識物を導入して標識試料核酸と し、 この標 識試料核酸に正常核酸増幅物を標準核酸と して等量以上添加 · 混合 し、 熱変性を行っ た後、 非常に緩やかな温度勾配でコ ン ペテ ィ テ ィ ブハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ンを行い、 ハ イ ブ リ ダ イ ゼー シ ョ ン後の反 応液中か ら上記一方の標識物を有するハイ プリ ダイ ゼー シ ョ ン生成 物を、 該一方の標識物と選択的に結合する第 1 の固相担体に ト ラ ッ プ して捕獲 し、 更に こ の捕獲 したハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン生成物の 中から上記他方の標識物を有するハイ プリ ダイゼー シ ョ ン生成物を、 該他方の標識物と選択的に結合する第 2 の固相担体に ト ラ ッ プして、 上記両標識物を有するハイ プ リ ダイゼー シ ョ ン生成物を捕獲するか、 又は第 1 の固相担体に ト ラ ッ プしたハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン生成物 を変性させて 1 本鎖核酸に した後、 該 1 本鎖核酸を他方の標識物と 選択的に結合する第 2 の固相担体に 卜 ラ ッ プ して、 他方の標識物の みを有する 1 本鎖核酸を捕獲する こ と に よ つ て も、 反応液中から変 異核酸のみを選択的に取 り 出 して、 容易かつ確実に変異核酸を濃縮 する こ と ができ る こ と を見い出 し た。

即ち、 正常核酸とわずかに変異 した核酸が微量混在 している検体 を増幅する と共に、 こ の増幅物に固相担体に結合可能な 2種類の標 識物を導入 して標識試料核酸と し、 一方、 正常核酸を増幅して標準 核酸と し、 こ の標準核酸を上記標識試料核酸に等モル以上添加 · 混 合 して非常に緩やかな温度勾配によ り コ ン ペテ ィ テ ィ ブハイ プ リ ダ ィ ゼ一 シ ョ ンを行う と、 ハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン後の反応液中に含 まれる上記標識物を有する正常核酸の核酸鎖は、 標準核酸の核酸鎖 (正常核酸か ら増幅反応によ り得られた核酸鎖） と完全に相補的な 塩基配列を持つこ とにな り 、 これと二本鎖を形成する。 このため、 変異核酸に由来する も のは こ の条件では上記標準核酸の核酸鎖よ り も、 元の相補鎖 （固相担体と結合可能な標識物を持つ核酸鎖） と優 先的に二本鎖を形成する。 従って、 標識試料核酸中の正常核酸は、 標識物を持たない上記標準核酸と相補鎖の置換が生 じて、 いずれか 一方の標識物のみを有する二本鎖を形成し、 標識試料核酸中の変異 核酸は、 上記標準核酸との間て相補鎖の置換が生じずに、 2種類の 標識物を有する元の二本鎖のまま とな り、 更に残存する標準核酸は、 標識物を有さない元の二本鎖のま ま とな る。 そ して、 こ の反応液の 中か ら まず上記一方の標識物と選択的に結合する第 1 の固相担体を 用いて一方の標識物を有するハ イ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン生成物を捕獲 し、 更に こ の捕獲 したハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン生成物の中から上記 他方の標識物と選択的に結合する第 2 の固相担体を用いて他方の標 識物を有するハイ ブ リ ダィゼーシ ョ ン生成物を捕獲する こ と によ り 、 上記 2種類の標識物の両方を有するハイ ブリ ダイゼー シ ョ ン生成物、 即ち上記コ ンペテ ィ テ ィ ブハイ プ リ ダイ ゼ一 シ ョ ン で標準核酸と相 補鎖の置換が生 じなかっ た変異核酸が選択的に取り 出され、 結果と して、 変異核酸を濃縮する こ と ができ る も のであ る。 なお、 第 1 の 固相担体で捕獲 したハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン生成物を第 1 の固相担 体か ら分離 · 回収する際、 二本鎖のハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン生成物 を変性させて固相担体との結合に関与していない側の一本鎖核酸を 分離 · 回収 し、 これを更に上記第 2 の固相担体に 卜 ラ ッ プして、 上 記 2種類の標識物の両方を有するハイ プ リ ダイゼー シ ョ ン生成物由 来の一本鎖核酸を捕獲する よ う に して もよ く 、 こ の よ う に目的核酸 中の変異核酸を一本鎖核酸と して濃縮した後、 こ の一本鎖核酸をプ ライ マー等を用いて増幅する こ と に よ り 、 ニ本鎮核酸とする こ とが でき る。

この場合、 こ の第 2 の方法において も、 上記一連の濃縮操作或い は上記コ ン ペテ ィ テ ィ ブハイ プ リ ダイゼー シ ョ ン以降の操作を 2 回 以上繰り返すこ と に よ り 、 検体中に含まれる変異核酸が極微量であ つ て も、 変異核酸のみを選択的に濃縮 して検出可能な濃度にまで確 実に濃縮する こ とが可能であ り 、 また、 遺伝子の欠失、 付加或いは 置換等変異の領域が極めて小さ く 、 遺伝子発現の レベルに差が見ら れないよ う な場合でも、 その遺伝子を選択的かつ確実に濃縮する こ とができ、 更に 目的核酸が二本鎖の D N Aの場合に限られず、 一本 鎖 D N A、 一本鎖若し く は二本鎖の R N Aの場合で も使用する こ と ができ、 D N Aの変異だけでなく、 細胞内の m R N A ( m e s s e n g e r R N A ) の異常の検出、 更には、 m R N Aに対する染色体 D N Aの 異常の検出に も幅広く 適応する こ とができ る ものである。 従っ て、 本発明は、 第 2 の発明と して、 目的核酸の特定領域の変 異核酸を選択的に濃縮する方法であっ て、

下記工程 （ 1 ' ') 〜 （ 4 ' )

( 1 ' ) 目的核酸の特定領域を増幅する と共に、 該増幅物に固相担 体と結合可能な 2 種類の標識物を導入 して標識試料核酸を調製する 工程、

( 2 ' ) 目的核酸の特定領域の正常核酸と相補な塩基配列を有する 標準核酸を、 標識試料核酸に対して等モ ル以上添加 · 混合し、 コ ン ペテ ィ テ ィ ブハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ンを行う工程、

( 3 ' ) コ ン ペテ ィ テ ィ ブハ イ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ン後の反応液を一 方の標識物と選択的に結合する第 1 の固相担体に ト ラ ッ プさ せて、 該一方の標識物を有するハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン生成物を捕獲する 工程、

( 4 ' ) 上記 （ 3 ' ) 工程で捕獲 したハ イ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ン生成 物を他方の標識物と選択的に結合する第 2 の固相担体に ト ラ ッ プさ せて 、 上記両標識物を有するハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン生成物又はこ のハイ プリ ダイゼ― シ ョ ン生成物由来の一本鎖核酸を捕獲する工程、 からな る一連の工程を 1 サイ ク ルと し、 該サイ ク ルを 1 回若 し く は 複数回繰り返すか、 又は上記サイ ク ルを 1回行った後、 上記工程 （ 2 ' ) 〜 （ 4 ' ) を 1 回若し く は複数回繰り返す こ とを特徴とする変異核 酸の濃縮方法を提供する。

ま た、 こ の第 2 の濃縮方法を実施するための濃縮用検査セ ッ 卜 と して、 変異核酸の濃縮を行う ための検査セ ッ 卜 であ っ て、

目的核酸の特定領域を増幅する と共に、 該増幅物に 2 種類の標識物 を導入 して標識試料核酸を調製するための標識試料核酸増幅用試薬 目的核酸の特定領域の正常核酸と相補な塩基配列を有する標準核酸 と、

上記一方の標識物と結合可能な部位を有する第 1 の固相担体と、 上記他方の標識物と結合可能な部位を有する第 2 の固—相担体とを具 備してな る こ とを特徴とする核酸濃縮用検査セ ッ ト を提供する。

なお、 上記第 1 及び第 2 の濃縮方法並びにこ れ ら濃縮方法を実施 するための上記検査セ ッ 卜 において、 上記標準核酸における 「目的 核酸の特定領域の正常核酸と相補な塩基配列を有する核酸」 は、 目 的核酸が二本鎖 D N Aである場合には、 該 D N Aの二本鎖の一方の 核酸鎖の正常な塩基配列と相補な塩基配列を有する一本鎖核酸、 又 は該ニ本鎖の正常な塩基配列とそれぞれ相補な一対の核酸鎖からな る二本鎖核酸のいずれであ つて もよい。

発明を実施する ための最良の形態

以下、 本発明につき詳し く 説明する。

本発明の変異核酸の濃縮方法は、 上述のよ う に、 目的核酸の特定 領域の変異核酸を選択的に濃縮する方法であ り 、 まず上記第 1 の方 法は、 （ 1 ) 目的核酸の特定領域を増幅して試料核酸を調製するェ 程、 （ 2 ) 該試料核酸と標識標準核酸とをコ ンペテ ィ テ ィ ブハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ンする工程、 及び （ ₃ ) コ ンペテ ィ テ ィ ブハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン反応液から標識物を利用 して正常核酸由来のコ ンペ テ ィ テ ィ ブハイ プ リ ダイゼー シ ョ ン生成物及び残存標識標準核酸を 分離 · 除去する工程とか らなる ものである。

上記工程 （ 1 ) におけ る 目的核酸は、 通常生体から分離した検体 から得られる も のであ り 、 この場合検体と しては、 ヒ 卜 よ り得られ る血液、 組織病片等、 或いは糞尿などの排泄物等が挙げられる。 更 に出生前診断を行う場合には、 羊水中に存在する胎児の細胞や試験 管中での分裂卵細胞の一部を検体とする こ と もでき る。 また、 これ らの検体は直接、 又は必要に応じて遠心分離操作等によ り沈査と し て濃縮した後、 例えば酵素処理、 熱処理、 界面活性剤処理、 超音波 処理、 或いはこ れ らの組み合わせ等によ る細胞破壊処理を予め施し た ものを使用する こ とができ る。 この場合、 前記細胞破壊処理は、 目的とする組織由来の D N A或いは R N Aを顕在化する 目的で行わ れる ものである。 なお、 具体的な方法は P C Rプロ ドコルス 、 ァカ デ ミ ッ ク プ レ ス イ ン ク P 1 4 、 P 3 5 2 ( 1 9 9 0 ) ( P C R P R O T O C O L S , A c a d e m i c P r e s s I n c . , P I 4 , P 3 5 2 ( 1 9 9 0 ) ) 等の文献に記載さ れた公知の方法 に従って行う こ とができ 、 また検体中の D N A又は R N Aは ト 一タ ル量で 1 〜 1 0 0 β g程度である こ とが望ま しいが、 1 μ g以下で も十分増幅可能である。 そ して、 得られた D N Aを適当な制限酵素 で切断し、 決ま っ た末端を持っ た特定領域の D N A断片を得る。 こ の場合、 目的核酸が m R N Aである場合には逆転写酵素によ り c D N A ( c o m p l e m e n t a r y D N A ) と し 、 こ れを制限酵素で 切断する 。

次に、 上記 D N A断片につき、 固相担体と結合可能な標識物を有 しないプラ イ マ —を用いて遺伝子増幅を行い、 試料核酸を調製する。 この場合、 上記 D N A断片の両末端にそれぞれ上記プラ イ マーの塩 基配列と相補的な塩基配列の リ ン カ ーをつないでテ ンプレー 卜 と し てお く こ とができ る。 なお、 上記プラ イ マー と しては、 特に制限さ れず、 通常遺伝子増幅に使用されるオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドを用いる こ と がで き 、 二 の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドの 5 ' 末端にア ミ ノ ア ルキ ル基 を導入 した ものを使用する こ と もでき る。

また、 上記工程 （ 2、） で用いる標識標準核酸は、 上記工程 （ 1 ) における プラ イ マー と同 じ塩基配列を有するプラ イ マ ー本体に固相 担体に結合可能な標識物を導入 したプラ イ マ ーを用いて正常細胞に 由来するテ ンプレー 卜 や確定された D N A標品を増幅し、 調製する こ とができ る。 この場合、 上記プライ マ ー中の標識物の位置はブラ イ マ一の伸長反応の効率に大き く 影響を与えないと こ ろであればよ く 、 好ま し く は 5 ' 末端付近の水酸基部分、 塩基部分或いは リ ン酸 ジ エ ス テ ル部分の活性基が挙げられ、 固相担体に結合可能な標識物 は固相担体の性質、 或いは固相担体を修飾する物質の特性によ り選 択する こ とができ る。 こ の場合、 プラ イ マ ーのォ リ ゴヌ ク レ オチ ドに導入する上記標識 物は、 上記工程 （ 3 ) において固相担体を結合さ せて不要な D N A を分離 ' 除去する ための も ので、 該標識物と 、 それに結合 し得る固 相担体上の物質の組み合わせは、 例えば ビォチ ン と ス ト レ ブ ト ア ビ ジ ン或いはア ビ ジ ン、 ハプテ ン と抗体、 リ ガ ン ド と レセプタ 一、 特 定の核酸と それに結合する D N A結合蛋白な どの組み合わせが挙げ られ る。 こ れ らの う ち、 一般的にはオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドの方に、 熱 に対 して安定性の高 く 、 分子の大き さ の小さ い も のを用い る こ と が 好ま しい。 例えば、 ピオチ ン と ス ト レ プ ト ア ビジ ンの場合に はオ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドに ビォチ ン標識を施 し、 固相担体に ス ト レ プ 卜 ア ビ ジ ン を結合さ せてお く こ と が好ま し く 、 オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドは ビォ チ ン と ス ト レ プ 卜 ア ビ ジ ンの結合に よ っ て固相担体に結合す る。 ま た、 上記ハプテ ン と して は 2 ， 4 — ジニ ト ロ フ ヱ ニル基を有す る化 合物や、 ジ ゴキ シ ゲニ ン を使う こ と ができ 、 更には上述の ピオチ ン 或いは フ ヱ ニルチオィ ソ シ ァネ 一 ト な どの蛍光物質等も ハプテ ン と して使用す る こ とができ る。 こ れ ら ピオチ ン、 ハプテ ン 、 及び リ ガ ン ド等の標識物は、 いずれ も単独、 或いは必要があれば複数種の組 み合わせで公知の手段 （特開昭 5 9— 9 3 0 9 9号、 同 5 9 — 1 4 8 7 9 8 号、 同 5 9 — 2 0 4 2 0 0号各公報参照） に よ り 、 導入する こ と が でき る 。 な お、 固相担体は、 上記標識物 と結合する部位を導入 した ゥ エ ルやマ グネ ッ ト ビー ズな どを用いる こ と ができ 、 こ の場合マ グ ネ ッ ト ビー ズは、 反応液中に投入 して核酸と結合さ せ、 こ れを磁石 を用いて反応液中か ら回収す る こ とができ る。

検体を固相担体に結合可能な標識物を持たないプラ イ マ ー で増幅 する場合、 及び標識標準核酸を固相担体に結合可能な標識物を持つ プラ イ マ — で増幅する場合、 プラ イ マ —の伸長反応に基づ く 遺伝子 増幅反応を行う こ と ができ る。 こ の際の遺伝子増幅法と して は、 公 知の P C R ( P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n ) &、 L C R ( L i g a s e C h a i n R e a c t i o n ) 法、 3 S R ( S e 1 f 一 s u s t a i n e d S e q u e n c e R e p l i c a t i o n) 法、 SDA (S t r a n d D i s p l a c eme n t A m p 1 i f i c a t i o n ) 法等が用い られ （M a n a k , D N A P r o b e s 2 n d E d i t i o n p 2 5 5〜 2 9 1， S t o c k t o n P r e s s ( 1 9 9 3 ) 、 特に、 P C R法が好適であ る。

こ の場合、 プラ イ マ ーの伸長反応は、 4 種類の ヌ ク レオチ ド三 リ ン酸 [デォキ シ ア デ ノ シ ン三 リ ン酸 （ d A T P ) 、 デォキ シ グア ノ シ ン三リ ン酸 （ d G T P ) 、 デォキ シ シ チ ジ ン三 リ ン酸 （ d C T P ) 及びデォキシチ ミ ジ ン三リ ン酸 （ d T T P ) ( これらの混合物を d N T P と い う こ と も あ る ） ] を基質 と し て該プラ イ マ ー に取 り 込ま せる こ と に よ り 行われ る 。

こ の伸長反応を行う 場合、 通常核酸鎖を増幅す る ために上記ヌ ク レオチ ド三 リ ン酸、 及び核酸伸長酵素を含む増幅反応試薬が用い ら れ、 この場合核酸伸長酵素と しては E . c o l i D N Aポ リ メ ラ ー ゼ I 、 E . c o l i D N Aポ リ メ ラ ー ゼ I の ク レ ノ ウ断片、 T 4 D N Aポ リ メ ラ 一ゼな どの任意の D N A ポ リ メ ラ 一ゼを用い る こ と ができ る が、 特に T a q D N A ポ リ メ ラ ーゼ、 T t h D N Aポ リ メ ラ ーゼ、 V e n t D N Aポ リ メ ラ ーゼ等の熱安定性 D N Aポ リ メ ラ 一ゼを用いる こ と が望ま し く 、 こ れに よ り サ イ ク ル毎にあ ら たな酵素の添加の必要性がな く な り 自動的にサ イ ク ルを繰 り 返す こ とが可能と な り 、 更にァ リ 一 リ ン グ温度を 5 0 〜 6 0てに設定する こ と が可能な ためプラ イ マ 一 に よ る標的配列認識の特異性を高める こ と ができ 、 迅速かつ特異的に遺伝子増幅反応を行 う こ と ができ る (詳細について は特開平 1 — 3 1 4 9 6 5号、 同 1 一 2 5 2 3 0 0 号公報参照） 。

ま た、 こ の反応を行 う 際に、 反応溶液の水分の蒸発を防止する た めにオイ ノレを添加す る こ と ができ る。 こ の場合、 こ のオ イ ルは水と 分配可能で、 かつ水よ り も比重の軽い も のであれば何れの もの も使 用す る こ と かで き 、 具体的には シ リ コ ー ン オ イ ル、 ミ ネ ラ ノレオ イ ル 等が例示される。 ま た、 遺伝子増幅装置によ っては こ のよ う なオイ ルを必要と しないもの もあ り 、 このよ う な遺伝子増幅装置を用いて プラ イ マーの伸長反応を行う こ と もでき る。

こ の よ う に、 上記核酸増幅用プライ マ ーを用いて伸長反応を繰り 返すこ と に よ り 、 核酸を効率よ く 増幅 して試料核酸及び標識標準核 酸を調製する こ と ができ る。 なお、 この遺伝子増幅反応を行う具体 的な条件等については実験医学、 羊土社、 8， N o . 9 ( 1 9 9 0 ) 、 P C Rテ ク ノ ロ ジ ー ス ト ッ ク ト ン プ レ ス （ 1 9 8 9 ) ( P C R T e c h n o l o g y , S t o c k t o n p r e s s ( 1 9 8 9 ) ) 等の文献に記載された公知の方法に従っ て行う こ とができ る。

更に、 試料核酸について は、 こ の よ う に して増幅 した D N Aを宿 主/ベ ク タ 一系、 即ちプラ ス ミ ドベ ク タ ー 、 フ ァ ー ジベ ク タ ー、 又 はプラ ス ミ ド と フ ァ ー ジのキメ ラベク タ ー力、ら選ばれるベク タ ーに 組み み、 大腸菌 （ E s c h e r i c h i a c o 1 i ) 、 枯草菌 ( B a c i 1 l u s s u b t i 1 i s ) 等の細菌或いは酵母 ( S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) な どの増 殖可能な任意の宿主に導入 して大量に調製する こ と も でき る （遺伝 子ク ロ一ニ ン グ） 。

ま た、 標識標準核酸については、 遺伝子増幅を利用 しないで天然 の遺伝子から制限酵素によ り酵素的に直接切り 出 して もよ く 、 更に は、 正常核酸を増幅した ものを上記試料核酸の場合と同様に遺伝子 ク ローニ ン グによ り 、 大量に調製する こ と もでき、 場合によ っ ては 化学合成によ って調製する こ と も可能である。 化学合成と しては、 ト リ エス テ ル法、 亜 リ ン酸法等が挙げられ、 これらは液相法又は不 溶性の担体を使っ た固相合成法な どによ り 自動合成機によ り一本鎖 の D N Aを大量に調製する こ とができ、 その後ァニ ー リ ン グを行う こ とによ って二本鎖 D N Aを調製する こ とができ る。

ま た、 本発明における 目的核酸は、 必ず し も D N Aである必要は な く 、 R N Aであ っ て もよい。 この場合、 R N A と しては、 t R N A ( t r a n s f e r R N A ) 、 m R N A ( m e s s e n g e r R N A ) 、 r R N A ( r i b o s o m a 1 R N A ) が挙げ られる が、 特に D N Aの遺伝情報を読み取って遺伝情報を伝える m R N A が対象と して好適であ る。 m R N Aを目的核酸とする場合には、 そ の塩基配列はィ ン ト ロ ン を含ま ない、 ヱキ ソ ン （遺伝情報を指定す る部分） のみからな るので、 その変異の検出 ' 同定は直接遺伝情報 を発現する異常を見出すこ とができ る点において意義がある。 即ち、 D N Aは遺伝子の基本設計図であるが、 こ れのみから発現形質を 1 0 0 %推定でき る と は限らず、 1 つの遺伝子 （一種類の転写産物 p r e - m R A ) 力、 ら選択的ス プ ラ イ シ ン グ （ a 1 t e r n a t i v e s 1 i c i n g ) に よ っ て複数の m R N A ( つ ま り複数の タ ン パ ク質） が作られる こ とかあ り 、 ま た p r e — m R N A→m R N Aの 過程で一部ヌ ク レオチ ドが加えられたり減らされたりする現象 （ R N A e d i t i n g ) が起き る こ とがある。 従っ て、 制御遺伝子やプロ モーター領域の変異、 又は組織特異的な発現を解析するには、 D N A ではな く m R N Aを解析しなければな らないが、 こ の場合本発明の 漢縮方法は、 目的核酸と して m R N Aを用いる こ と に よ り 、 良好に こ の変異 m R N Aを濃縮する こ と がで き 、 m R N Aの解析に大き く 寄与する ものである。 なお、 目的核酸と し て m R N Aを用いる場合 には、 こ の m R N Aをそのま ま増幅して試料核酸とする こ と もでき る が 、 通常 は上述 し た よ う に 、 逆転写酵素 （ R e V e r s e T r a n s c r i p t a s e ) を反応させて m R N Aを c D N A と した後 P C R法によ り増幅する方法 （ R T — P C R法） によ り得ら れた D N Aを試料核酸と して用いる こ とが好ま しい。

更に、 本発明においては、 試料核酸或いは標識標準核酸の一方を 一本鎖 D N A又は一本鎖 R N A とする こ と も可能であ る。 こ こ で、 上記一本鎖 R N Aの調製方法と しては化学合成の他には S P 6 、 或 い は T 7 な どの フ ァ ー ジ の R N Aポ リ メ ラ 一 ゼを用 い る試験管内で の転写反応によ って調製する こ とができ る。 また、 一本鎖 D N Aは 上記と同様の化学合成によ り調製して も よ く 、 ま た一本鎖 D N Aを 調製する こ と が可能な M 1 3 フ ァ ー ジな どの フ ァ ー ジ D N A或いは フ ァ ー ジ プラ ス ミ ド D N Aに組み込み、 ク ロ ーニ ン グに よ り調製す る こ とができ る。

なお、 標識標準核酸と して R N Aを用いる場合及びプライ マ ーを 用いる以外の方法で D N Aの増幅を行う場合も、 固相担体に結合可 能な標識物は上記と同様の標識物とする こ とができ、 上記標識物を 公知の方法に従つて化学的或いは酵素的に導入する こ とができ る （特 開平 1 — 2 5 2 3 0 0号、 特開平 1 — 6 3 3 9 3号公報等参照） 。 次に、 上記遺伝子増幅の結果、 目的核酸から得られた固相担体に 結合可能な標識物を持たない D N A又は R N Aを試料核酸と し、 標 品から調製した固相担体に結合可能な標識物を持つ D N A又は R N A を標識標準核酸と して、 試料核酸に標識標準核酸を等モル以上加え、 コ ンペテ ィ テ ィ ブハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン を行う。

この場合、 上記標識標準核酸は上記試料核酸と両末端と も等しい 塩基配列の二本鎖 D N Aである こ とが理想的であるが、 必ずし も両 末端の塩基配列が完全に等しい ものでな く て もよ く 、 その目安と し ては、 試料 D N Aと標準 D N Aの鎖長の違いは両末端でそれぞれ 1 0 塩基以内程度であれば良好に濃縮を行う こ と がで き る 。 なお、 試料 核酸或いは標識標準核酸の一方を一本鎮 D N A又は一本鎖 R N A と する場合には試料核酸と標識標準核酸との鎖長の違いに特に制限は ない。

本発明の変異核酸の濃縮方法においては、 目的核酸が D N A若し く は R N Aであるかによ り 、 試料核酸と標識標準核酸のコ ンペテ ィ ティ ブハイプリ ダイゼーシ ョ ンを行う際の組み合わせが D N A— D N A ハイ ブ リ ッ ド、 D N A — R N Aハ イ ブ リ ッ ド、 R N A — R N Aハイ ブリ ツ ドの 3種類が考え られ、 これらのいずれの組み合わせにおい て も変異 D N A又は変異 R N Aを効果的に濃縮する こ とができ る も のである。 特に、 目的核酸が R N Aの場合には、 上述のよ う に、 細 胞内の特定 m R N Aの検出及び m R N Aに対する染色体 D N Aの検 出に優れた効果を発揮する こ とができ る。

コ ンペテ ィ テ ィ ブハイ プ リ ダイゼ一 シ ョ ン の際には、 まず上記試 料核酸と標識標準核酸とを変性する必要があ るが、 こ の変性は熱に よる方法或いはア ル力 リ によ る方法が好ま しい。 ま た、 両核酸を混 合する時期は変性直前で もよい し、 変性後で も よい。 こ こ で、 本発 明においては、 試料核酸に対して標識標準核酸を等モ ル以上加える 必要があ り 、 通常は 1 0〜 5 0倍モ ル程度に過剰に加える こ とが好 ま しいか、 核酸の鎖長、 塩基配列及び変異の程度に応 じて最適条件 は異な る。

ま た、 コ ン ペテ ィ テ ィ ブハ イ ブ リ ダ ィ ゼ ー シ ヨ ン に お いて は 、 溶 液の組成、 特に塩濃度を核酸の鎖長に応じて最適にな る よ う に調整 する必要がある。 この場合ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン においては、 一 般に塩濃度の調整に、 S S C ( 2 0 X S S C ： 3 M塩化ナ ト リ ウ ム、 0. 3 N ク ェ ン酸ナ ト リ ウ ム ） や S S P E ( 2 0 X S S P E ： 3 . 6 M塩化ナ ト リ ウ ム、 0. 2 M リ ン酸ナ ト リ ウ ム、 2 m M E D T A) が使われてお り 、 本発明の濃縮方法で も こ れ ら の溶液を好適な濃度 に希釈 して使用する こ と がで き る 。 ま た 、 必要に応じて ジ メ チ ル ス ル フ ォ キ シ ド （ D M S 0 ) 、 ジ メ チ ル フ オ ル 厶 丁 ミ ド （ D M F ) な どの有機溶媒を添加する こ と も で き る 。

コ ン ペテ ィ テ ィ ブハ イ ブ リ ダ イ ゼ一 シ ョ ン は、 上記の方法で変性 した試料核酸に標識標準核酸を等モ ル以上添加 · 混合 し、 高温から 徐々 に温度を下げる こ とで達成する こ とが可能である _c こ の際の温 度条件については、 ハイ プ リ ダイ ゼ― シ ョ ンを行う核酸の鎖長や塩 基配列及び、 標識標準核酸と試料核酸との間における変異の種類、 程度によ って適宜最適条件が設定されるが、 通常は 9 8〜 5 8てま での範囲で 3〜 1 0分間に 1 °Cの速度、 よ り好ま し く は 9 8〜 7 0 °Cま での範囲で 1 0分間に 1 ての速度で温度を下げる条件とする こ とが好適である。 次に、 コ ンペテ ィ テ ィ ブハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン生成物について、 標識標準核酸に存在する固相担体に結合可能な標識物を用いて、 残 存する標識標準核酸及び標識標準核酸とハ イ プ リ ダイ ズ した試料核 酸を固相担体と ト ラ ッ プさせる こ と によ つて固相担体に結合させて、 分離 ' 除去する。 なお、 上記操作は 1 回以上、 好ま し く は 3 回程度 繰り返すこ とが好ま し く 、 これによ り残存する標識標準核酸及び標 識標準核酸とハイ プ リ ダイ ズした試料核酸を確実に固相担体に結合 さ せて、 分離 · 除去す る こ とができ る。

こ の場合、 標識標準核酸が有する固相担体に結合可能な標識物が ピオチ ン であ り 、 固相担体がス ト レ プ ト ア ビ ジ ンを固定化 し たマイ ク ロ タ イ 夕 一 ゥ エ ルの場合には、 コ ンペテ ィ テ ィ ブハイ プ リ ダイ ゼ一 シ ョ ン生成物を ゥ ヱ ルに加え、 2 5 °C或いは室温で 1 5 〜 3 0 分間 程度振盪反応させればよいが、 標識物及び固相担体の種類によ つて は こ れ ら の条件は異な る。

こ れ らの操作によ り 、 固相担体に結合 しなかっ た画分、 即ち反応 残液には、 元の検体に比べて標識標準核酸と二本鎖形成しなかった もの、 即ち標識標準核酸と異なる塩基配列を持つ も のが高い割合で 含ま れてい る こ と に な る 。 こ の際に、 元の検体中に含ま れていた変 異核酸の含量が極微量である場合には、 一度の上記濃縮操作では検 出限界にまで達 しない こ と があ り 、 この場合には、 上記一連の濃縮 操作を 2 回以上繰り返すこ と に よ り 、 変異核酸を段階的に濃縮 し、 検出可能な濃度にまで確実に濃縮するこ とが可能である。 この場合、

2回目以降の濃縮操作は、 目的核酸の増幅操作か ら全工程を繰り返 すこ と によ り濃縮する変異核酸の絶対量を増大する こ とができるが、 必ず し も全工程を繰り返す必要はな く 、 濃縮操作と しては上記コ ン ペテ ィ テ ィ ブハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン以降の操作のみを繰り返すこ と に よ っ て も濃縮率を高め る こ とができ る。

次に、 第 2 の発明にかかる濃縮方法は、 （ 1 ' ) 2種類の標識物 で標識した標識試料核酸を調製する工程、 （ 2 ' ) 該標識試料核酸 と非標識の標準核酸とを コ ンペテ ィ テ ィ ブハイ プ リ ダイ ゼ一 シ ョ ン する工程、 （ 3 ' ) コ ン ペテ ィ テ ィ ブハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン反応 液か ら上記 2種類の標識物の少な く と も一方を有するハイ プ リ ダイ ゼー シ ヨ ン生成物を捕獲する工程、 及び （ 4 ' ) 捕獲 したハイ プ リ ダイ ゼ一 シ ョ ン生成物か ら 2種類の標識物を両方有するハイ プ リ ダ ィ ゼー シ ョ ン生成物又は こ のハ イ プ リ ダイ ゼ一 シ ョ ン生成物由来の 一本鎖核酸を捕獲 して変異核酸を選択的に取り 出す工程からなる も のである。 即ち、 こ の第 2 の方法は、 上記第 1 の方法とは逆に、 2 種類の標識物で標識した標識試料核酸と非標識の標準核酸とで コ ン ペテ ィ テ ィ ブハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ンを行い、 上記 2 種類の標識物 を利用 して試料核酸中の変異核酸のみを分離 · 捕獲する こ とによ り、 変異核酸を濃縮する ものである。

上記 （ 1 ' ) の標識試料核酸を調製する工程は、 検体から得られ た目的核酸を上記第 1 の方法の場合と同様に して増幅する こ とによ り調製する こ と がで き 、 こ の場合こ の第 2 の方法においては、 こ の 試料核酸中に 2種類の標識物を導入 して標識試料核酸とする もので ある。 こ の標識物を導入する方法と しては、 上記第 1 の方法におけ る標識標準核酸を調製する場合と同様の方法によ る こ と ができ、 具 体的には標識物を導入 したプラ イ マ 一を用いて P C R法によ り 目的 核酸を増幅する方法が好ま し く 採用され、 この場合こ の第 2 の方法 にあ っては、 2 種類のブラ イ マーにそれぞれ異な る標識物を導入し て、 異な る標識物を有する 2 種類のプラ イ マ ーを調製し、 この 2種 類のプラ イ マ ーを用いて 目的核酸を増幅する こ と によ り 、 2種類の 標識物が導入された標識試料核酸を調製する も のであ る。 なお、 目 的核酸の前処理や P C R法によ る増幅の条件等は、 上記第 1 の方法 と同様に行う こ とができ る。

こ こ で、 上記標識試料核酸に導入される 2 種類の標識物は互いに 異な る も のであればいずれの も のでもよ く 、 上記第 1 の方法におけ る標識試料核酸に導入される標識物と同様の ものを用いる こ とがで き るが、 特に結合部位との結合特異性の高い ものが好ま し く 使用さ れ、 例えば ピオチ ン とハプテ ン と の組み合わせが好ま し く 用い られ る。

なお、 こ の標識試料核酸は、 上記第 1 の濃縮方法の場合と同様に、 プラ イ マ一を用いずに、 プラ ス ミ ドベク タ 一、 フ ァ ー ジベク タ ー、 又はブラ ス ミ ドと フ ァ 一 ジ とのキヌ ラベク タ ーから選ばれる宿主 Z ベク タ ー系によ り増幅して調製する こ と も可能であ り 、 この場合上 記 2種類の標識物は、 目的核酸の増幅を行っ た後、 公知の方法に従 つて化学的或いは酵素的に導入する こ とができ る。

ま た、 上記 （ 2 ' ) 工程で用い られる標準核酸は、 標識物を導入 しないこ と以外は、 上記第 1 の方法における標識標準核酸の場合と 同様に して得る こ とができ、 また上記標識試料核酸と標準核酸との コ ンペテ ィ テ ィ ブハイ プ リ ダイ ゼ一 シ ョ ン も上記第 1 の方法におけ る コ ンペテ ィ テ ィ ブハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン と同様に行う こ とがで き る。

そ して、 この第 2 の方法では、 上記 （ 3 ' ) 及び （ 4 ' ) の工程 によ り 、 こ のハイ プ リ ダイゼー シ ョ ン反応液中から変異核酸を選択 的に分離 ' 捕獲する も のであ る。 即ち、 まず得られたハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ョ ン反応液を上記 2種類の標識物の う ちの一方の標識物と選 択的に結合する第 1 の固相担体に 卜 ラ ッ プして、 少な く と も一方の 標識物を有するハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン生成物を捕獲する。 この操 作によ り捕獲されるハイ ブ リ ダィゼー シ ョ ン生成物は、 標準核酸と 標識試料核酸中の正常核酸とがハイ ブ リ ダィ ズした一方の標識物の みを有する もの、 及び標準核酸とハイ プ リ ダイ ズせずに元のま まの 2本鎖からなる 2種類の標識物を有する変異核酸とが含まれている。 ついで、 この捕獲したハイ プリ ダイゼ一 シ ョ ン生成物を上記 2種類 の標識物の う ちの他方の標識物と選択的に結合する第 2 の固相担体 に ト ラ ッ プ して、 他方の標識物を有するハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン生 成物を捕獲する。 この操作によ り捕獲されるハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン生成物は、 上記第 1 の固相担体で捕獲 した一方の標識物を有する ハイ プ リ ダイ ゼ一 シ ョ ン生成物のう ち、 更に他方の標識物を有する もの、 即ち両方の標識物を有する変異核酸が分離 · 捕獲され、 変異 核酸を濃縮する こ と がで き る ものである。

この場合、 上記第 1 及び第 2 の固相担体は、 それぞれ上記第 1 の 方法の場合と同様に調製する こ と ができ 、 この場合標識物が結合す る結合部位と しては、 上記標識試料核酸に導入した 2種類の標識物 に応じて、 各標識物と選択的に結合する も のが用い られ、 上記第 1 の方法で説明 した もの と同様の ものを使用する こ とができ る。 例え ば、 2種類の標識物と して ピオチ ン と ハプテ ン と を用いた場合には、 ビォチ ン と選択的に結合する もの と して ス 卜 レ プ ト ア ビジ ン又はァ ビジ ンが用い られ、 ハプテ ン と選択的に結合する ものと してその抗 体が用い られる。 ま た、 固相担体に捕獲 したハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ョ ン生成物を固相担体から分離 · 回収する方法は、 用いた標識物と固 相担体の結合部位との種類に応じて、 適宜公知の方法に従って行う こ とができ る。 こ の場合、 第 1 の固相担体で捕獲 したハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ョ ン生成物は、 通常は二本鎖核酸のま ま固相担体から分離回 収して第 2 の固相担体に供するが、 例えば単に変異核酸を検出する ために濃縮を行う場合な どには、 二本鎖を分離して固相担体との結 合に関与していな い側の一本鎖のみを分離回収 して、 第 2 の固相担 体に供する こ と もでき る。 この場合、 変異核酸は一本鎖核酸と して 濃縮されるが、 これをプライ マ ー等を用いて増幅する こ とによ り 、 容易に二本鎖核酸とす る こ と がで き る。 ま た、 こ の よ う に一本鎖核 酸と して濃縮する場合には、 第 2 の標識物と結合する部位を導入 し たマグネ ッ ト ビー ズを第 2 の固相担体と して用いる こ とができ、 こ のマグネ ッ 卜 ビーズを磁石を用いて反応液中から回収する方法が好 適に採用される。

なお、 この第 2 の濃縮方法において、 上述した以外の操作につい ては、 上記第 1 の濃縮方法と同様に して行う こ とができ る。 ま た、 こ の第 2 の濃縮方法において も、 一連の工程或いはコ ンペテ ィ テ ィ ブハイ プ リ ダイゼー シ ョ ン以降の工程を 2 回以上繰り返して、 濃縮 度を向上させる こ とができ る。

これ ら本発明にかかる両濃縮方法によれば、 得られた濃縮処理液 から変異核酸の検出を行う こ と に よ り 、 従来法では困難であ っ た検 体中に微量に含まれる変異核酸の検出を容易かつ確実に行う こ とが でき る。 更に、 こ の よ う な変異核酸の含まれる割合を高める こ と に よ っ てこの変異核酸の単離を容易と し、 その変異核酸の構造及び機 能を容易に解析する こ とができ る。 即ち、 物理学的な分析、 例えば ヌ ク レオチ ドの塩基配列のような遺伝子構造を決定し、 遺伝子操作、 更には遺伝病の解析によ り遺伝子治療へと発展させる こ とが可能と な る も のであ る。

こ こで、 本発明の濃縮方法によ り濃縮液から変異核酸を検出する 方法と しては、 公知の方法を用いる こ とができ、 例えば、 ポ リ アク リ ルァ ミ ドゲルを用いた電気泳動によ る検出法や検出可能な標識物 を結合させたプローブを用いる検出法な どが好適に使用 し得る。 こ の場合、 検出可能な標識物と しては、 非放射性、 放射性物質の どち らを用いて も よいが、 好ま し く は非放射性物質が用い られる。 標識 物と して用いられる非放射性物質と しては、 直接標識可能な ものと して蛍光物質 [例えばフ ルォ レ ツ セイ ン誘導体 （ フ ルォ レ ツ セイ ン イ ソ チオ シ ァ ネ ー ト等） 、 ロ ー ダ ミ ン及びそ の誘導体 （テ ト ラ メ チ ルロ ー ダ ミ ン イ ソチオ シ ァネー ト等） ] 、 化学発光物質 （例えばァ ク リ ジ ン等） や遅延蛍光を発する物質 （ D T T A : フ ア ルマ シア社 製） な どが挙げられる。

また、 特定遺伝子の機能やその遺伝子から翻訳される タ ンパク質 の機能等を解明するために特定核酸に人為的に変異を起こ させた既 知の変異核酸が必要とな る場合があるが、 本発明の濃縮方法は、 特 定核酸に人為的に核酸の変異を起こ させた後、 変異した核酸を選択 的に濃縮する こ と ができ 、 効率よ く 変異核酸を調製する こ とができ る。 即ち、 特定核酸に亜硫酸な どの変異誘起物質を作用させて人為 的に変異を起こ させた後、 これら混合物中の特定核酸を 目的核酸と する と共に、 変異前の核酸をから標識又は非標識の標準核酸を調製 して、 上記本発明の濃縮操作を繰り返すこ と に よ り 、 変異した核酸 を選択的に濃縮 · 回収する こ と ができ 、 変異核酸の調製を効率よ く 行う こ と ができ る ものであ る。

次に、 本発明の核酸の濃縮用検査セ ッ ト は、 上記本発明の変異核 酸の濃縮方法に従って、 容易かつ確実に変異核酸を濃縮するための 検査セ ッ 卜 であり、 上記第 1 の濃縮方法を実施するためのセ ッ 卜は、 目的核酸の特定領域を増幅して試料核酸を調製するための試料核酸 増幅用試薬と、 目的核酸の特定領域の正常核酸と相補な塩基配列を 有する核酸に固相担体と結合可能な標識物を導入 した標識標準核酸 と、 上記標識物と結合可能な部位を有する固相担体とを具備 してな る も のであ る。

こ の検査セ ッ 卜 は、 上記第 1 の濃縮方法に従って、 細胞破壊等の 前処理を施した検体中の目的核酸又は必要によ り合成した目的核酸 を上記試料核酸増幅用試薬を用いて増幅する こ と によ り試料核酸を 調製 し、 こ れに固相担体に結合可能な標識物を持つ上記標識標準核 酸を加え て コ ンペテ ィ テ ィ ブハイ プ リ ダイ ゼ一 シ ョ ン を行っ た後、 得られたハイ プ リ ダイ ゼ一 シ ョ ン生成物を固相担体に ト ラ ッ プして 標識標準核酸とハイ プ リ ダイ ズ した ものを分離 · 除去する も のであ る。

この場合、 試料核酸を調製する上記試料核酸増幅用試薬と しては、 上記第 1 の濃縮方法で説明 した標識物を有さないプライ マーやフ ァー ジ D N A、 フ ァ ー ジ プラ ス ミ ド D N A或いは、 R N A調製用 と して は R N Aポ リ メ ラ一ゼ等を用いる こ とができ るが、 通常は上記ブラ イ マ一が好適に用い られる。 また、 核酸の増幅やハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン等を行う際の試薬類及び上記固相担体と しては、 公知のもの、 具体的には上記本発明の濃縮方法で説明 した ものと同様の ものを使 用する こ とができ、 更に、 上記本発明の濃縮方法で説明 した検体前 処理用の細胞破壊試薬、 反応溶液の水分の蒸発を防止するためのォ ィ ル及び固相担体に結合させた後、 固相担体に結合しなかっ た核酸 等を洗浄する ための洗浄液等を用いる こ とができ、 こ れ ら と組み合 わせて本発明の核酸濃縮用検査セ ッ 卜 とする こ と もでき る。

こ こ で、 上記標識標準核酸は、 上記本発明の濃縮方法で説明 した 方法で調製した標識物を有する D N Aを用いる こ とができ る。 また、 こ の標識標準核酸に代えて、 標識標準核酸を調製するための目的核 酸の特定領域を増幅可能なプラ イ マーに固相担体に結合可能な標識 物を導入 したプライ マ ーを含む標識標準核酸増幅用試薬を用いて本 発明の濃縮用検査セ ッ 卜 を構成する こ と もでき、 濃縮を行う際にこ の標識標準核酸増幅用試薬を用いて上記濃縮方法で説明 した方法に よ り 、 その都度、 標識標準核酸を調製する よ う に して もよい。

ま た、 上記第 2 の濃縮方法を実施する ための検査セ ッ ト は、 目的 核酸の特定領域を増幅する と共に、 該増幅物に 2 種類の標識物を導 入 して標識試料核酸を調製する ための標識試料核酸増幅用試薬と、 目的核酸の特定領域の正常核酸と相補な塩基配列を有する標準核酸 と、 上記一方の標識物と結合可能な部位を有する第 1 の固相担体と、 上記他方の標識物と結合可能な部位を有する第 2 の固相担体とを具 備してな る ものであ る。

こ の検査セ ッ ト は、 上記第 2 の濃縮方法に従っ て、 細胞破壊等の 前処理を施した検体中の目的核酸又は必要によ り合成した目的核酸 を上記標識試料核酸増幅用試薬を用いて増幅する こ と に よ り 2種類 の標識物で標識された標識試料核酸を調製 し、 こ れに上記標準核酸 を加えて コ ンペテ ィ テ ィ ブハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ンを行った後、 得 られたハイ プ リ ダイゼ一 シ ョ ン生成物を第 1 及び第 2 の固相担体に 順次 ト ラ ッ プして標準核酸とハイ プ リ ダイ ズ しなかっ た 2種類の標 識物を有するハイ プ リ ダイゼー シ ョ ン生成物を分離 · 捕獲する もの であ る。 こ の場合、 試料核酸を調製する上記標識試料核酸増幅用試薬と し ては、 上記第 2 の濃縮方法で説明 したそれぞれ異な る標識物を有す る 2 種類のプラ イ マーやフ ァ ー ジ D N A、 フ ァ 一 ジプラ ス ミ ド D N A 或いは、 R N A調製用と しては R N Aポ リ メ ラ ーゼ等を用いる こ と ができ るが、 通常は上記 2 種類のプライ マーが好適に用いられる。 ま た、 核酸の増幅やハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン等を行う 際の試薬類及 び上記固相担体と しては、 公知の もの、 具体的には上記本発明の濃 縮方法で説明 した ものと同様の ものを使用する こ とができ、 更に、 上記本発明の濃縮方法で説明 した検体前処理用の細胞破壊試薬、 反 応溶液の水分の蒸発を防止するためのオイ ル及び固相担体に結合さ せた後、 固相担体に結合しなかった核酸等を洗浄するための洗净液、 固相担体に結合 した核酸を固相担体か ら分離 · 回収する ための試薬 等を用いる こ とができ、 これら と組み合わせて本発明の核酸濃縮用 検査セ ッ 卜 と す る こ と も で き る。

こ こ で、 上記標準核酸は、 上記本発明の濃縮方法で説明 した方法 で調製した標識物を有さない非標識の D N Aを用いる こ とができ る。 また、 こ の標準核酸に代えて、 標準核酸を調製する ための目的核酸 の特定領域を増幅可能なプラ イ マ ーを含む標準核酸増幅用試薬を用 いて本発明の濃縮用検査セ ッ 卜を構成する こ と も で き 、 濃縮を行う 際に この標準核酸増幅用試薬を用いて上記濃縮方法で説明 した方法 によ り 、 その都度、 標準核酸を調製する よ う に し て も よ い。

こ の よ う に、 本発明の変異核酸の濃縮方法によれば、 目的核酸の 特定領域において、 正常核酸とそれとはわずかに異な る塩基配列を 有する変異核酸とが混在する検体から、 正常核酸を選択的に分離除 去し、 或いは変異核酸を選択的に分離捕獲する こ と に よ り 、 検体中 の微量な変異核酸を濃縮する こ とができ、 微量な変異核酸の検出を 容易かつ確実に行う こ とができ る と共に、 更にはそ の同定を可能と する も のであ る 。 また、 特定遺伝子に人為的に突然変異を誘発させ た後、 変異した遣伝子だけを選択的に濃縮する こ と ができ 、 変異核 酸の調製を効率よ く 行う こ と もでき る。

ま た、 本発明によれば、 遺伝病や癌な どの原因となる遺伝子が不 明な場合に、 その候補とな る遺伝子を効率よ く 濃縮する こ とが可能 である。 こ の場合、 標準核酸を正常な人あるいは組織に由来する染 色体 D N Aあるいは m R N Aから調製 し、 試料核酸を該疾病を有す る患者又は癌組織から調製する こ とができ る。 標準核酸及び試料核 酸の増幅は、 染色体 D N Aの場合は直接、 m R N Aの場合は逆転写 によ り二本鎖 D N A と した後、 任意の制限酵素で切断して リ ンカー を付加 し、 該リ ンカー配列と相補的なプラ イ マ 一を用いて本発明の 方法によ り濃縮を行えば、 正常な人あ る いは組織と該疾病を有する 患者又は癌組織との間で塩基配列の異な る遺伝子群を選択的に得る こ と ができ る。

更に、 本発明の濃縮用検査セ ッ 卜 によれば、 上記本発明の変異核 酸の濃縮方法に したがって、 変異核酸を選択的に濃縮し、 検出や同 定操作に供する こ と ができ る。

従って、 本発明によれば十分量の変異核酸を確実に得る こ とがで き、 それを用いて変異核酸の構造や機能を解析する こ とによ り遺伝 病の解明、 遺伝子治療に大き く 貢献でき る ものである。

以下、 実施例を示 し本発明を具体的に説明するが、 本発明は下記 実施例に制限される も のではない。

〔実施例 1 〕

ヒ 卜 c - H - r a s 遺伝子についてそ の正常遺伝子と変異遺伝子 とが共存する検体から変異遺伝子を選択的に濃縮する方法について、 以下に説明する。

正常遺伝子と して、 ヒ ト c — H — r a s 遺伝子、 変異遺伝子と し てヒ 卜 c — H— r a s遺伝子の 1 2番目のコ ド ンが G G C ( G 1 y ) → G T C ( V a 1 ) の変異を起こ した ものを用いた。

遺伝子増幅

P C R法によ る D N Aの増幅は、 下記 p S K - 2 (正常遺伝子を 含むプラス ミ ド ） 或いは p K Y— 1 (変異遺伝子を含むプラス ミ ド） をそれぞれ 1 n gをテンプレー 卜 と し、 下記プライマ一 N H₂— P H R — 1 、 N H₂— C H R A S — 1 をそれぞれ l O O n g用いて、 各 2 0 0 / Mの d A T P , d G T P , d C T P , d T T P存在下、 1 0 0 1 の ト リ ス —塩酸緩衝液 （ p H 8. 8 ) ， 1 6. 6 mM ( N H₂) ₂ S Ο,, 6. 7 m M M g C l ₂、 l O m Mの 2 — メ ノレカ プ ト エ タ ノ ー ル及び 2 U n i t の T t h D N Aポ リ メ ラ 一ゼを含む溶液中で行っ た。 反応は 9 4 °Cで 1 0 分間加熱後、 9 4 て， 3 0 秒、 6 0 て， 3 0 秒、 7 2 °C , 6 0 秒のサイ ク ルで 3 0 回繰り返 した。 こ の反応液を ァガロ ー ス ゲ ル電気泳動にかけ、 増幅物のサ イ ズ と増幅率を確認し た。

N H₂ - 5 ' A T G A C G G A A T A T A A G C T G G T G 3 ' N H₂ - C H R A S - 1

N H₂ - 5 ' C T G G A 丁 G G T C A G C G C A C T C T T 3 ' p S K - 2

正常 r a s遺伝子を持つプラ ス ミ ド （ T. S e k i y a , G a n n , 7 4 , 7 9 4 ( 1 9 8 3 ) , J C R B ( J a a n C a n c e r R e s e a r c h R e s o u r c e s B a n k ) ) よ り 入手可 p K Y - 1

1 2 番目の コ ド ン に変異のあ るプラ ス ミ ド （ Μ. Η . K r a u s a n d Y . Υ u a s a , N a t u r e , 3 0 3， 7 7 5 ( 1 9 8 3 ) , J し RB (J a p a n C a n c e r R e s e a r c h R e s o u r c e s B a n k ) ) よ り 入手可

被検試料の調製

次に、 正常遺伝子に由来する増幅物と変異遺伝子に由来する増幅 物を表 1 に示 した割合に混合し、 正常遺伝子に対 して変異遺伝子の 割合が 0 %、 1 0 %、 5 0 %、 1 0 0 % とな る よ う にサ ンプルを調 製した。 これらサ ン プルを蒸留水で 1 0 0 0倍に希釈して被検試料 と した。 表— 1

ビォチ ン化正常遺伝子の調製

上記 p S K — 2 (正常遺伝子を含むプ ラ ス ミ ド） をテ ン プ レー ト と し、 5 ' 末端に固相担体に結合可能な標識物と して ピオチ ンを導 入した下記プラ イ マ ー B i o — P H R — 1 、 B i o — C H R A S — 1 をそれぞれ 1 O O n g用いて、 上記と同様の条件で P C R法によ り遺伝子増幅を行い、 得られた増幅物をァガロ ー ス ゲ ル電気泳動に かけ、 増幅物のサイ ズと増幅率を確認した。 こ の得られた増幅物を ビォチ ン化正常遺伝子とする。

B i o - P H R - 1

B i o t i n - 5 ' A T G A C G G A A T A T A A G C T G G T G 3 ' B i o - C H R A S - 1

B i o t i n - 5 ' C T G G A T G G T C A G C G C A C T C T T 3 ' 濃縮操作

上記各比率の被検試料各 1 μ 1 に上記プライ マ ー N H₂ _ P H R - 1 、 N H₂ — C H R A S — 1 をそれぞれ 1 O O n g用いて、 上記と同 様の条件で P C R法によ り増幅した。 この増幅物を蒸留水で 1 0倍 に希釈 し、 その 5 1 を取り、 これに上記ビォチ ン化正常遺伝子に よる遺伝子増幅物 5 / 1 、 1 0 X S S C ( 1 0 X S S C ： 0 . 3 M ク ェ ン酸ナ ト リ ウ ム、 p H 7 . 0 ， 0 . 3 M塩化ナ ト リ ウ ム ） 1 0 1 、 蒸留水 1 0 1 を混和 した。 即ち、 被検試料に対して 1 0倍 量の ビォチ ン化正常遺伝子増幅物を加えた こ と にな る。 こ の溶液を

9 8 °Cで 1 0分間加熱し熱変性を行った後、 9 8 °Cから 7 0 °Cまで、 1 ◦ 分間に 1 ての速度の非常に緩やかな温度勾配によ りニ本鎮形成 反応 （ コ ンペテ ィ テ ィ ブハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ン ） を行っ た。

こ の反応液に T E緩衝液 （ 1 O m M ト リ ス塩酸緩衝液 （ p H 8 . 0 ) 、 I m M E D T A ) 8 0 〃 1 を加えて希釈し、 こ の液をス ト レ ブ ト ア ビジ ン固定化ゥ エ ルに添加 した。 室温で 1 5 分間振盪後、 反 応残液を吸引 し、 こ の反応残液を新たな ゥ エ ルに移 し、 更に室温で 1 5 分間振盪後、 反応残液を吸引 し、 こ の反応残液を新たなゥ ニ ル に移 し、 更に も う一度室温で 1 5 分間振盪 した。 こ の反応液 1 a 1 に上記プライ マ一 N H₂— P H R — 1 N H₂— C H R A S - 1 をそれ ぞれ 1 O O n g用いて、 上記と同様の条件で P C R法によ り増幅し た。 こ の溶液 1 Q 1 を制限酵素 H p a I I で処理 した （制限酵素 H p a I I は正常遺伝子は切断するが変異遺伝子は切断しない） 。

L

こ の反応液をポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動にかけ、 生成した

D N A断片を分析し、 濃縮操作前の ものと比較した。 結果を表 2 に 示す。 表一 2

+ + ： バ ン ドがは っ き り と検出できた。

+ ： 不鲜明ではあるがバン ド ら しき ものが検出できた 一 ： バ ン ドが検出できない。

表 2 の結果から、 変異遺伝子を 1 0 %含むものでは、 濃縮操作を 行う前の も のではほとんど見られなかっ た変異遺伝子に由来する約

6 0 b p のパ ン ドがは っ き り と観察でき た。 ま た、 5 0 %の変異遺 伝子を含むものでは、 操作前でははつ き り と観察できた正常遺伝子 に由来する約 3 0 b p のバ ン ドが濃縮操作後ではほ とんど消失し、 変異遺伝子に由来する約 6 0 b pのバン ドがはっ き り と確認できた。 このこ とか ら、 本発明の濃縮方法によ って、 正常遺伝子と変異遺伝 子の混合物から選択的に変異遣伝子が濃縮でき る こ とが確認できた。 なお、 変異遺伝子の存在比率を更に高める必要かあ る場合には、 上 記濃縮までの一連の操作を複数回繰り返せばよい。

〔実施例 2 〕

脖臓癌細胞を含む脖臓組織から、 癌細胞に由来する正常 K i - r a s 遺伝子と、 この正常遺伝子の 1 2番目の コ ド ンが G G T ( G 1 y ) から G A T ( A s p ) の変異を起こ した変異 K i - r a s 遺伝子と が混在する試料から m R N Aを抽出 し、 こ の m R N Aから変異遺伝 子を濃縮する方法について、 以下に説明する。

試料核酸の調製

腾臓組織から Q u i c k P r e mRNA P u r i f i c a t i o n K i t ( P h a r m a c i a社） に よ り m R N Aを抽出 した。 こ の m R N Aをテンプレー ト と して逆転写反応を以下の操作によ り行い、 c D N Aを調製 した。

mR N A 1 〃 mを含む 2 0 ^ 】 の 1 O mM ト リ ス—塩酸緩衝液 （ p H 8. 3 ) ， 2 mM M g C l ₂、 0. 0 1 %ゼラチン、 各 l mMの d A T P, d G T P , d C T P , d T T P、 2 0 u n i t p l a c e n t a l R N a s e i n h i b i t o r存在下、 5 gの o 1 i g o ( d T ) ₁₂— ₁₈ をプライマーと して l O O u n i t の m u r i n e r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e を用いて 3 7 °Cで 3 0分間逆転写反応 を行い、 c D N Aを得た （ c D N A溶液） 。 この c D N A溶液を 9 5 てで 5 分間加熱して酵素を失活させた。

次に、 上記 c D N A溶液を用いて P C R反応を以下の手順で行つ た。

c D N A溶液 2 0 1 に、 下記ブラ イ マ一 N H₂— K R A S F、 N H₂ 一 K R A S Rをそれぞれ 1 O p m o 1 用いて、 各 2 0 0 Mの d A T P, d G T P , d C T P , d T T Pの存在下、 8 0 1 の 1 0 m M ト リ ス ー塩酸緩衝液 （ p H 8 . 3 ) 、 5 0 m M K C 1 、 1 . 5 m M M g C 12 0. 0 1 %ゼ ラ チ ン 、 及び 2 u n i t の T a q D N A ポ リ メ ラーゼを加え、 ミ ネ ラ ルオイ ノレを重層 した。 こ の溶液を 9 4 °Cで 5分間加熱後、 9 4 °C , 3 0秒、 6 0て . 3 0秒、 7 2て， 6 0 秒のサイ ク ルを 3 0 回繰り返 し増幅 し、 試料核酸を調製 した。

H₂ - K R A S F

N H₂ - 5 ' A A C T T G T G G T A G T T G G A C C T 3 ' N H, - K R A S R

N H₂ - 5 ' C T A T T G T T G G A T C A T A T T C G 3 ' 標識標準核酸の調製

標識標準核酸の調製は下記方法で行った。

正常人の血液 5 0 0 l 力、ら S e p a G e n e (三光純薬製） を 用いて染色体 D N Aを抽出 した。 この D N Aの う ち 、 5 0 0 n gを テ ンプレー ト と して、 Ι Ο Ο ίζ Ι の l O mM ト リ ス一塩酸緩衝液 （ p H 8. 3 ) , 5 0 m M K C 1 , 1 . 5 m M M g C l ₂、 各 2 0 0 Mの d A T P , d G T P , d C T P , d T T P存在下、 下記プラ イ マ— B i o — K R A S F、 B i o — K R A S Rをそれぞれ 1 O p m o 1 用いて、 2 u n i t の T a q D N Aポ リ メ ラ 一ゼを加え、 ミ ネ ラ ルオ イ ルを重層 した。 こ の溶液を 9 4 °Cで 5 分間加熱後、 9 4 て， 3 0 秒、 6 0 °C , 3 0 秒、 7 2 °C , 6 0 秒のサイ ク ルを 3 0 回繰り 返し増幅し、 標識標準核酸を調製 した。

B i o - K R A S F

B i o t i n - 5 ' A A C T T G T G G T A G T T G G A C C T 3 ' B i o - K R A S R

B i o t i n - 5 ' C T A T T G T T G G A T C A T A T T C G 3 ' 濃縮操作

1 回目の濃縮操作

上記試料核酸を蒸留水で 1 0倍に希釈 し、 そ の 5 / 1 と、 標識標 準核酸 （ ピオ チ ン化正常遺伝子増幅物） 1 0 X S S C 1 0 1 、 蒸留水 1 0 1 を混和 した。 即ち、 試料核酸に対して 1 0倍 量の ピオチ ン化正常遺伝子増幅物を加えた こ とにな る。 こ の溶液を

9 8 °Cで 1 0分間加熱し熱変性を行った後、 9 8 °Cから 7 0 °Cまで、 1 0分間に 1 ての速度の非常に緩やかな温度勾配によ りニ本鎮形成 反応を行っ た。 こ の反応液に T E緩衝液 8 0 1 を加えて希釈 し、 こ の液をス ト レプ ト ア ビジ ン固定化ゥ ヱ ルに加えた。 室温で 1 5分 間振盪後、 反応残液を吸引 し、 こ の反応残液を新たなゥ エ ルに移 し、 更に室温で 1 5 分間振盪後、 反応残液を吸引 し、 この反応残液を新 たな ゥ エ ルに移 し、 更に も う一度室温で 1 5分間振盪した。

得られた反応液 1 μ 1 に上記プライマ ー N H₂— K R A S F、 N H₂ 一 K R A S Rをそれぞれ 1 O O n g用いて、 上記と同様の条件で増 幅した。 こ の反応液 1 0 μ 1 を制限酵素 B s t Ν 1 で処理した （制 限酵素 B s t N 1 は正常遺伝子は切断するが変異遺伝子は切断しな い） 。 この反応液をポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動にかけ、 生成 した D N A断片を分析した。 次いで、 残り の液によ り下記 2 回目の 濃縮操作を行っ た。

2 回目以降の濃縮操作

上記 1 回目の濃縮操作後の P C R増幅物を蒸留水で 1 0倍に希釈 し、 そ の 5 1 と、 標識標準核酸 （ ピオ チ ン化正常遺伝子増幅物）

5 1 、 1 0 X S S C 1 0 a 1 、 蒸留水 1 0 1 を混和した。 これ を 1 回目の濃縮操作と同様に熱変性、 温度勾配によ るアニー リ ン グ を行い、 同様に P C R増幅後、 制限酵素処理を行い、 上記と同様に 生成した D N A断片を分析した。 残り の液を用いて更に も う一度、 同様の濃縮操作を行い、 制限酵素処理後、 生成した D N A断片を上 記と同様に分析した。

各ス テ ッ プでの変異遺伝子と正常遺伝子の検出に関 しての結果を 表 3 に示す。 表一 3

+ + ： パ ン ドカ は っ き り と検出でき た。

+ ： 不鲜明であ るかバ ン ド ら し き も のが検出でき た。

一 ： パ ン ドが検出でき な い。

表 3 の結果から、 本発明の濃縮方法によれば、 目的核酸か m R N A の場合で も、 変異遺伝子を選択的に濃縮する こ とができ、 更に濃縮 操作を繰り返すこ と に よ り 、 変異遺伝子の存在割合を確実に高め得 る こ と が確認さ れた。

〔実施例 3

試料核酸を 2種類の標識プラ イ マーを用いて調製 した標識試料核 酸と 、 非標識の標準核酸とを用いて変異核酸の濃縮を行う方法につ いて、 以下に説明す る 。

標識試料核酸の調製

実施例 2 と同様に脬臓組織から m R N Aを抽出 し、 こ れを逆転写 して c D N Aを得た。 こ の c D N A溶液を用いて P C R反応を以下 の手順で行つ た。

c D N A溶液 2 0 ζ 1 に、 下記プラ イ マ 一 B i o — K R A S F , D N P — K R A S Rをそれぞれ l O p m o 1 用いて、 各 2 0 0 / M の d A T P , d G T P , d C T P , d T T P存在下、 8 0 1 の ト リ ス —塩酸緩衝液 （ ρ Η 8 · 3 ) ， 5 0 mMの K C 1 , 1 . 5 m M の M g C l ₂. 0 - 0 1 %のゼラチ ン及び 2ユニ ッ ト の T a q D N A ポ リ メ ラ 一ゼを加え、 ミ ネラルオイ ルを重層 した。 この溶液を 9 4 て， 3 0秒加熱後、 9 4 °C， 3 0秒、 6 0 °C , 3 0秒、 7 2 °C , 6 0 秒のサイ クルを 3 0回繰り返して増幅し、 標識試料核酸を調製した。 B i o - K R A S F

B i o t i n - 5 ' A A C T T G T G G T A G T T G G A C C T 3 ' D N P - K R A S R

D N P - 5 ' C T A T T G T T G G A T C A T A T T C G 3 ' 標準核酸の調製

標準核酸の調製は下記の方法で行った。

実施例 2 と同様に正常の血液から染色体 D N Aを調製し、 こ れを N H₂— K R A S F , N H₂ _ K R A S Rをそれぞれ 1 O p m o 1 用い て、 上記試料核酸と同様の条件で増幅し、 標準核酸を調製した。

H₂ - K R A S F

N H₂ - 5 ' A A C T T G T G G T A G T T G G A C C T 3 ' H₂ - K R A S R

N H₂ - 5 ' C T A T T G T T G G A T C A T A T T C G 3 ' 濃縮操作

1 回目の濃縮操作

上記標識試料核酸を蒸留水で 1 0 0倍に希釈し、 その 5 1 と、 上記標準核酸 5 1 , 1 0 S S C 1 0 μ 1 、 蒸留水 1 0 1 を混 和した。 即ち、 標識試料核酸に对して非標識の正常な配列を有する 核酸を 1 0 0倍量加えた こ と にな る。 こ の溶液を 9 8 °Cで 1 0分間 加熱し熱変性を行っ た後、 9 8 てから 7 0 てまで、 1 0分間に 1 °C の速度の非常に緩やかな温度勾配によ り二本鎖形成反応を行っ た。 この反応液に T E緩衝液 8 0 μ 1 を加えて希釈し、 この液をス ト レ ブ ト ア ビジ ン固定化ゥ ルに加えた。 室温で 1 5分間振盪後、 反応 残液を吸引 し、 この反応残液を新たなゥ エ ルに移し、 更に室温で 1 5 分間振盪後、 反応残液を吸引 し、 更にゥ ニ ルを 3 0 0 μ 1 の Τ Ε緩 衝液で 3 回洗浄した。

次に、 こ の ウ エ ノレに 1 0 〃 1 の 0 . 0 1 N N a O Hを加え、 ゥ エ ルに吸着した核酸を変性させた。 上清を回収し、 標識試料核酸中 の ピオチ ン標識を持たない側の一本鎖核酸を回収した。 この溶液に 1 0 / 1 の 0 . 1 M ト リ ス ー塩酸緩衝液 p H 7 . 0 ) , 1 5 0 m M N a C l 、 1 m M E D T Aを加えて中和 した。

こ の溶液に家兔抗 D N P抗体、 羊抗家兔 I g G抗体修飾マ グネ ッ 卜 ビ ー ズ （ D Y N A B E A D S (商標） M _ 2 8 0 S h e e a n t i - R a b b i t I g G、 D Y N A L社） を加え、 磁石に よ り D N P標識一本鎖試料核酸 Z家兔抗 D N P抗体 Z羊抗家兔 I g G 抗体修飾マグネ ッ 卜 ビー ズ複合体を回収した。 こ れを 3 0 0 mの 0 . 1 M 卜 リ ス —塩酸緩衝液 （ p H 7 . 0 ) . 1 5 0 m M N a C l 、 1 m M E D T Aで 3 回洗った。

上記複合体を 3 0 z l の 0 . 1 M ト リ ス —塩酸緩衝液 （ p H 7 . 0 ) 、 1 5 0 m M N a C l 、 1 m M E D T Aに懸濁し、 9 8。 5分間加熱し、 抗体分子を失活させた。 磁石によ り マ グネ ッ ト ビ— ズを除き、 D N P標識一本鎮試料核酸を含む上清を回収した。

得られた上清 1 1 をプラ イ マー B i o — K R A S F , D N P — K R A S Rを用いて、 上記標識試料核酸の調製の際と同様の条件で P C R増幅した。 こ の反応液 1 0 β 1 を制限酵素 B s t N I で処理 した （制限酵素 B s t N I は正常遺伝子は切断するが変異遺伝子は 切断しない） 。 こ の反応液をポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動にか け、 生成 した D N A断片を分析した。 次いで残り の液によ り 、 下記 2回目以降の濃縮操作を行っ た。

2 回目以降の漶縮操作

上記 1 回目の濃縮操作後の P C R增幅物を蒸留水で 1 0 0倍に希 釈し、 その う ちの 5 1 と、 上記標準核酸 5 1 、 1 0 X S S C 1 0 β 1 、 蒸留水 1 0 β 1 を混和した。 こ れを 1 回目の濃縮操作と同様 に熱変性、 温度勾配によるアニー リ ング、 固相担体への吸着を行い、 同様に P C R増幅後、 制限酵素処理を行い、 上記と同様に生成した D N A断片を分析した。 2 回目の濃縮操作後の P C R増幅物を用い て更に も う一度同様に濃縮操作を行い、 生成した D N A断片を上記 と同様に分析した。

各ステ ッ プでの変異遺伝子と正常遺伝子の検出に関 して結果を表 4 に示す。 表一 4

+ + ： バ ン ドカ ま っ き り と検出できた。

+ ： 不鲜明であるがバン ド ら しき ものが検出でき た。

— ： パ ン ドが検出できない。

表 4 の結果から、 この濃縮方法によれば、 目的核酸の特定領域に 関 して、 正常遺伝子と、 正常遺伝子とはわずかに異な る塩基配列を 有する変異核酸とが混在する検体から、 変異核酸を選択的に分雜 * 捕獲 して検体中の微量な変異核酸を検出 し得る こ とが確認された。

Claims

請求の範囲

1 . 目的核酸の特定領域の変異核酸を選択的に濃縮する方法であ つ て、

下記工程 （ 1 ：) 〜 （ 3 )

( 1 ) 目的核酸の特定領域を増幅して試料核酸を調製する工程、

( 2 ) 目的核酸の特定領域の正常核酸と相補な塩基配列を有する核 酸に固相担体と結合可能な標識物を導入 した標識標準核酸を、 上記 試料核酸に対して等モ ル以上添加 · 混合 し、 コ ンペテ ィ テ ィ ブハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ンを行 う 工程、

( 3 ) コ ン ペテ ィ テ ィ ブハ イ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン後の反応液中に含 まれる、 固相担体と結合可能な標識物を有するハイ プ リ ダイ ゼ一 シ ョ ン生成物及び残存する標識標準核酸を固相担体に 卜 ラ ッ プして反 応液から分離 · 除去する工程、

からなる一連の工程を 1 サイ ク ルと し、 該サイ ク ルを 1 回若し く は 複数回繰り返すか、 又は上記サイ クルを 1 回行った後、 上記工程 （ 2 ) と （ 3 ) を 1 回若し く は複数回繰り返すこ とを特徴とする変異核酸 の濃縮方法。

2. 目的核酸の特定領域をプラ イ マ ーを用いて P C R法によ り増 幅し、 試料核酸と して一本鎖若し く は二本鎖の D N Aを調製する請 求の範囲第 1 項記載の記載の変異核酸の濃縮方法。

3 . 標識標準核酸が、 正常な塩基配列と相補な塩基配列を有する 核酸標品を固相担体と結合可能な標識物を導入したプラ イ マ ーを用 いて P C R法によ り増幅して調製された一本鎖若し く は二本鎖 D N A である請求の範囲第 1 項又は第 2項記載の変異核酸の濃縮方法。

4 . 標識標準核酸が、 プラ ス ミ ドベ ク タ 一、 フ ァ ー ジベク タ 一、 又はプラ ス ミ ド と フ ァ ー ジ と のキメ ラ ベ ク 夕 一か ら選ばれる宿主ノ べク タ ー系によ り調製された一本鎖若し く はニ本鎮 D N Aに固相担 体と結合可能な標識物を導入した ものであ る請求の範囲第 1 項又は 第 2項に記載の変異核酸の濃縮方法。

5 . 上記固相担体に結合可能な標識物と して ピオチ ンを用いる と 共に、 固相担体の結合部位と してア ビジ ン或いはス ト レブ ト ァ ビジ ンを用いる請求の範囲第 1 項乃至第 4項のいずれか 1 項に記載の変 異核酸の濃縮方法。

6 . 目的核酸が m R N Aであ り 、 こ の m R N Aを逆転写酵素を用 いて c D N A と し、 これを増幅して試料核酸を調製する請求の範囲 第 1 項乃至第 5項のいずれか 1 項に記載の変異核酸の濃縮方法。

7 . 目的核酸の特定領域の変異核酸を選択的に濃縮する方法であ つ て、

下記工程 （ 1 ， ） 〜 （ 4 ' )

( 1 ' ) 目的核酸の特定領域を増幅する と共に、 該増幅物に固相担 体と結合可能な 2種類の標識物を導入して標識試料核酸を調製する 工程、

( 2 ' ) 目的核酸の特定領域の正常核酸と相補な塩基配列を有する 標準核酸を、 上記標識試料核酸に対して等モ ル以上添加 ' 混合 し、 コ ンペテ ィ テ ィ ブハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ン を行う 工程、

( 3 ' ) コ ンペテ ィ テ ィ ブハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ン後の反応液を上 記 2種類の標識物の う ちの一方の標識物と選択的に結合する第 1 の 固相担体に ト ラ ッ プさせて、 該一方の標識物を有するハイ プ リ ダイ ゼ一 シ ョ ン生成物を捕獲する工程、

( 4 ' ) 上記 （ 3 ' 工程で捕獲したハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン生成 物を上記 2種類の標識物の う ちの他方の標識物と選択的に結合する 第 2 の固相担体に ト ラ ッ プさせて、 上記両標識物を有するハイ プリ ダイゼー シ ョ ン生成物又はこ のハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン生成物由来 の一本鎖核酸を捕獲する工程、

からなる一連の工程を 1 サイ ク ルと し、 該サイ ク ルを 1 回若し く は 複数回繰り返すか、 又は上記サイ クルを 1回行った後、 上記工程 （ 2 ' ) 〜 （ 4 ' ) を 1 回若し く は複数回繰り返すこ とを特徴とする変異核 酸の濃縮方法。

8 . 目的核酸の特定領域を、 第 1 の標識物を導入 したプラ イ マ — と、 第 2 の標識物を導入 したプラ イ マー とを用いて P C R法によ り 増幅する こ と に よ り 、 標識試料核酸を調製する請求の範囲第 7項記 載の変異核酸の濃縮方法。

9 . 上記第 1 及び第 2 の標識物と して ビォチ ン とハプテ ン とを用 いる と共に、 第 1 及び第 2 の固相担体の結合部位と してス ト レ プ ト ア ビジ ン又はア ビジ ン と抗体とを用いる請求の範囲第 7項又は 8項 記載の変異核酸の濃縮方法。

1 0 . 標準核酸が、 正常な塩基配列と相補な塩基配列を有する核 酸標品をプラ イ マ 一を用いて P C R法によ り増幅 して調製された一 本鎖若し く は二本鎖 D N Aである請求の範囲第 7項乃至第 9項のい ずれか 1 項に記載の変異核酸の濃縮方法。

1 1 . 標準核酸が、 プラ ス Ϊ ドベク タ 一、 フ ァ ー ジベク タ ー、 又 はプラ ス ミ ド と フ ァ ー ジ と のキ メ ラ ベ ク タ ー力、 ら選ばれ る宿主/ベ ク 夕 一系によ り調製された一本鎖若し く は二本鎖 D N Aである請求 の範囲第 7項乃至第 9項のいずれか 1 項に記載の変異核酸の濃縮方 法。

1 2 . 目的核酸が m R N A であ り 、 この m R N Aを逆転写酵素を 用いて c D N A と し、 これを増幅して試料核酸を調製する請求の範 囲第 7項乃至第 1 1 項いずれか 1 項に記載の変異核酸の漢縮方法。

1 3 . 請求の範囲第 1 項記載の方法によ り変異核酸の濃縮を行う ための検査セ ッ 卜 であ っ て、

目的核酸の特定領域を増幅して試料核酸を調製する ための試料核酸 増幅用試薬と、

目的核酸の特定領域の正常核酸と相補な塩基配列を有する核酸に固 相担体と結合可能な標識物を導入した標識標準核酸と、

上記標識物と結合可能な部位を有する固相担体とを具備してな る こ とを特徴とする核酸濃縮用検査セ ッ 卜。

1 4 . 請求の範囲第 3項記載の方法によ り変異核酸の澳縮を行う ための検査セ ッ 卜 であ っ て、

目的核酸の特定領域を増幅して試料核酸を調製するための試料核酸 増幅用試薬と、

正常な塩基配列と相補な塩基配列を有する核酸標品を増幅可能なプ ライ マーに固相担体に結合可能な標識物を導入した標識プライ マ ー を含む標識標準核酸増幅用試薬と、

上記標識物と結合可能な部位を有する固相担体とを具備してな る こ とを特徴とする核酸濃縮用検査セ ッ ト 。

1 5 . 請求の範囲第 7項記載の方法によ り変異核酸の濃縮を行う ための検査セ ッ 卜 であ っ て、

目的核酸の特定領域を増幅する と共に、 該増幅物に 2種類の標識物 を導入 して標識試料核酸を調製する ための標識試料核酸増幅用試薬 と、

目的核酸の特定領域の正常核酸と相補な塩基配列を有する標準核酸 と、

上記 2 種類の標識物の う ちの一方の標識物と結合可能な部位を有す る第 1 の固相担体と、

上記 2種類の標識物のう ちの他方の標識物と結合可能な部位を有す る第 2 の固相担体とを具備 してな る こ とを特徴とする核酸濃縮用検 査セ ッ 卜 。

1 6 . 請求の範囲第 8項記載の方法によ り変異核酸の濃縮を行う ための検査セ ッ ト であ っ て、

目的核酸の特定領域を増幅可能な 2種類のプライ マーにそれぞれ異 なる標識物を導入 した 2 種類の標識プライ マ ーを含む標識試料核酸 増幅用試薬と、

正常な塩基配列と相補な塩基配列を有する核酸標品を増幅可能な標 準核酸増幅用試薬と、

上記 2種類の標識物の う ちの一方の標識物と結合可能な部位を有す る第 1 の固相担体と、

上記 2種類の標識物の う ちの他方の標識物と結合可能な部位を有す る第 2 の固相担体とを具備してなる こ とを特徴とする核酸濃縮用検 査セ ッ ト。