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WO1997008947A1 - Transformant - Google Patents

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Publication number
WO1997008947A1
WO1997008947A1 PCT/JP1996/002402 JP9602402W WO9708947A1 WO 1997008947 A1 WO1997008947 A1 WO 1997008947A1 JP 9602402 W JP9602402 W JP 9602402W WO 9708947 A1 WO9708947 A1 WO 9708947A1
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WO
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thr
pro
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ser
stem cells
Prior art date
Application number
PCT/JP1996/002402
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takashi Okado
Yi Zhang
Hideyuki Matsushita
Kiyozo Asada
Ikunoshin Kato
Original Assignee
Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takara Shuzo Co., Ltd. filed Critical Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority to AU68365/96A priority Critical patent/AU6836596A/en
Publication of WO1997008947A1 publication Critical patent/WO1997008947A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated

Definitions

  • the present invention relates to a transformant having excellent growth properties and a method for producing the same.
  • transgenic embryos that incorporate the foreign genomic material (DNA) into the nucleus of the embryo or infect it with the substance integrated into the chromosome of the embryo.
  • DNA foreign genomic material
  • This embryo can be grown by transplantation into a foster parent, and the resulting adult animal has incorporated the foreign DNA into its chromosome and can express it.
  • Transformed individuals are generally called transgenic animals [Science, vol. 214, pp. 1244-1246 (1981)].
  • the incorporated exogenous DNA is called a transgene and generally consists of a promoter and a gene of interest such as cDNA.
  • the transgenic animal Since the transgenic animal is produced as an animal having the target gene by transplanting the transformed embryo into a foster parent, developing and giving birth to the offspring, it takes a long time to produce the transgenic animal. In addition, when the probability of obtaining an animal having the target gene is low, a large number of mother animals as foster mothers are required.
  • An object of the present invention is to develop a method for transforming a living body without using a foster parent, and obtain a transformant capable of growing in a short period of time and the transformant. It is to provide a method for.
  • the first invention of the present invention relates to a growth transformant, comprising the following steps (A) and (B):
  • step (B) a step of introducing the stem cells obtained in the step (A) into a living body
  • the second invention of the present invention relates to a method for producing a growth transformant, comprising the following steps (A), (B) and (C):
  • step (B) a step of introducing the stem cells obtained in the step (A) into a living body
  • step (C) a step of expressing growth hormone in the living body obtained in the step (B).
  • a novel growth-transformed organism using a genetically modified living stem cell is provided, and the organism can be efficiently produced in a short period of time without using embryonic tissue, and thus without the need for a foster parent. It is a very useful organism that has excellent growth potential, grows in a short period of time, and has improved weight gain and milk yield.
  • the transformants of the present invention include mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, sheep, goats, pigs, pigs, horses, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.), birds (eg, chickens, turkeys). , Quail, ducks, ducks, etc.), reptiles (eg, snakes, turtles, etc.), amphibians (eg, power elephant, sanshowo, imimo etc.), fishes (eg, horse mackerel, mackerel, sea bass, sea bass, grouper It is an organism such as yellowtail, tuna, bonito, salmon, trout, perch, flounder, shark, ray, sturgeon, etc.).
  • mammals eg, mice, rats, rabbits, sheep, sheep, goats, pigs, pigs, horses, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.
  • birds eg, chickens, turkeys.
  • a stem cell is prepared from the living organism of the organism, a gene encoding a growth hormone is incorporated into the stem cell, and then a recombinant stem cell incorporating the gene encoding the growth hormone is introduced into the living organism to obtain the stem cell.
  • the growth hormone in the present invention includes a growth hormone of the same species as the transformant and a heterologous growth hormone which does not show antigenicity in the transformant and can exert its action on the organism. It is a transformant that exhibits stable expression and function.
  • Mammalian growth hormone is produced in the pituitary gland, and their activity and structure are known. For example, J. Human Growth Hormone.
  • Gastrointestinal hormonal growth hormone gene JP-A-63-197
  • porcine growth hormone gene Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 59-173083
  • human growth hormone gene Science, vol. 205, p. 602 (1979)] and the like
  • the growth hormone gene of avian two Wa tri growth hormone gene is known [J. Exp. 2 00 1. # 232, pp. 465].
  • the growth hormone gene of fish is also the growth hormone gene of salmon (JP-A-61-9).
  • the target growth hormone gene may be isolated by a known method and used. Further, a known isolated growth hormone gene may be used.
  • the growth hormone is not limited to natural growth hormone, but a polypeptide having substantially the same activity as these growth hormones, that is, a growth hormone which has essentially the same activity as natural growth hormone. It includes polypeptides in which the amino acid of growth hormone has been replaced with other amino acids, polypeptides in which amino acids have been deleted, and polypeptides in which amino acids have been inserted, without impairing them.
  • the living body stem cell in the present invention is a cell having a pluripotency derived from a living body after differentiation from embryonic tissue and having a self-renewal ability.
  • Examples thereof include hematopoietic stem cells, peripheral blood stem cells, epithelial stem cells, exocrine gland stem cells, and endocrine glands.
  • Stem cells hepatic stem cells, Teng stem cells, neuroendocrine stem cells, connective tissue stem cells, stromal stem cells, fibroblast stem cells, mesenchymal stem cells, adipocyte stem cells, breast gland stem cells, reticuloendothelial stem cells, lipid stem cells, chondrocytes Stem cells, osteoproge nitor stem cells, osteocyte stem cells, muscle fiber stem cells, neuronal stem cells, epidermal stem cells, keratinocyte stem cells, Langerhans stem cells, melanocyte stem cells, sebaceous stem cells, sweat gland stem cells, mucus stem cells , Serosal stem cells, odontogenic stem cells, islet stem cells, alveolar stem cells Cells, retinal stem cells and the like can be used.
  • stem cells can be obtained from various tissues of a living animal to be used.
  • the hematopoietic stem cells are cells not exist only at a frequency of 1 Bruno 1 0 5 in the bone marrow cells
  • stearyl ⁇ cell factor one cell surface receptor of the hematopoietic stem cell (stem cell factor: SCF) receptor It can be purified using an antibody against the c-kit receptor [Blood, Vol. 78, pp. 176-172 (1991)].
  • a method of introducing a growth hormone gene into stem cells calcium phosphate, microinjection, electroporation, adenovirus, SV40 virus, simple virus, etc. are used. A method using a retroviral vector is most suitable.
  • the gene of interest can be stably inserted into the chromosome of a dividing cell.
  • a replication-defective system has been established so that a recombinant virus does not produce a new virus even if it infects target cells, and a high-titer, stable supply method has been reported (Hum. Gen. Ther. Vol. 5, pp. 19-28 (1994)].
  • the infection efficiency depends on the titer of the recombinant virus, co-culture of recombinant virus-producing cells and target cells is necessary for highly efficient gene transfer into hematopoietic stem cells [Nature, No. 3 Vol. 10, p. 476 (1994)].
  • the fibronectin fragment is represented by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-111498, and is Escherichia coli. ichia coli)
  • a polypeptide produced by HB101 / pHD102 (FERM P-10721), also represented by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing, and Escherichia coli HB101 / pCH102 (FERMBP) -2800), and using these polypeptides, it is possible to introduce a gene encoding a heterologous protein into target cells with high efficiency by the above method.
  • FERM P-10721 also represented by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing
  • Escherichia coli HB101 / pCH102 (FERMBP) -2800
  • the growth hormone gene integrated into a retroviral vector generally consists of a promoter and DNA encoding growth hormone.
  • various promoters that function in the organism can be used as the promoter.
  • mouse metallothionein I promoter-1 [Nature, vol. 296, p. 39 (1982)] and the like can be used. it can.
  • a promoter such as LTR provided in the retrovirus vector can also be used.
  • only the DNA encoding growth hormone need be inserted downstream of the promoter.
  • a cDNA prepared from the growth hormone mRNA or a growth hormone-encoding region DNA derived from genomic DNA can be used.
  • the recombinant stem cell into which the gene encoding the target growth hormone has been introduced is introduced into a living organism.
  • the stem cells may be administered intravenously, or may be directly injected into the tissue from which the stem cells are derived.
  • hematopoietic stem cells When hematopoietic stem cells are used as recombinant stem cells, living organisms may have a compromised immune function. As a method for deficient immunity of the living animal, for example, irradiation may be performed, and an immunocompromised drug may be used. May be administered.
  • a pure mouse is irradiated with about 1,000 rads of radioactivity. This dose is lethal to mice, after a while blood cells are depleted, white blood cells are lost, immunity is compromised, infection occurs, and death occurs in about two weeks [Rad. Res. Vol. 14, pp. 31-32 (1961)].
  • mice can continue to survive due to hematopoietic cells reconstituted from the administered hematopoietic stem cells.
  • immunodeficiency drugs include anti-lymphocyte serum, corticosteroids such as prednisolone, methylprednisolone, and dexamethasone; purine antagonists such as azathioprine and 6-MP; alkylating agents such as cyclophosphamide and busulfan; Cyclosporin 8, FK506 etc. can be used.
  • anti-lymphocyte serum administer intravenously or intramuscularly a dose of 1-2 Omg / kg as agropurine, and 10--15 when using methylprednisolone as a corticosteroid. High doses of mgZkg may be given.
  • azathioprine When azathioprine is used, 2-3 mgZkg may be administered, and when cyclophosphamide is used, a large dose of 40-5 Omg / kg may be administered.
  • these immunodeficiency drugs the immune ability of living animals is compromised. Similarly, an immunodeficient living animal can survive by introducing recombinant hematopoietic stem cells.
  • the target growth hormone gene is permanently expressed in the transgenic organism, and can transform a host organism. It is preferable to introduce the growth hormone gene into the living body during the period before growth, the introduced growth hormone gene is expressed in the living body, and the expressed growth hormone enhances skeletal growth, nitrogen retention, protein synthesis, and traits of the living body. Significant increase in growth rate, weight, and meat production in transformants Thus, a transformant of the present invention having excellent growth properties, that is, a transformant having a growth property can be obtained.
  • the present invention provides a transformed organism using the transgenic living stem cell.
  • the organism is very useful because it can be efficiently produced in a short period of time without using embryonic tissue, has excellent growth potential, and has an improved weight gain and milk yield.
  • mGH mouse growth hormone
  • mGH mouse growth hormone
  • a mouse brain cDNA library (Clontech) was used as type II DNA of PCR. Prepare 1 reaction solution of this cDNA library 1HF1, MGHF 1 and MGH R1 using 1 Opmol and Takara Shuzo PCR Amplification Kit, respectively, and prepare them at 94 ° C for 1 minute and at 55 ° C. Temperature cycles were shifted for 30 minutes at 72 ° C for 1 minute. After completion of the reaction, 51 was removed from the reaction solution and subjected to 1% agarose gel electrophoresis. As a result, a single band having a size of about 75 Obp was observed. This reaction solution was diluted 100-fold with water, the mixture was made into type II, and MGHF2 and MGHR2 were primed. When PCR and electrophoresis were performed under the same conditions as above, a single band of about 700 base pairs was observed, indicating that PCR was able to specifically amplify the desired mGH cDNA. .
  • a large amount of cDNA for ⁇ lGH was prepared by preparing 10 more reaction systems of the above 501 using the primers of MGHF1 and MGHR1 and performing PCR.
  • the cDNA fragment of about 75 Obp was replaced with TE buffer [1 OmM Tris-HCl ( pH 7.5) and 0.1 mM EDTA [50 xl]. Of these (20 Hi), the cDNA ends were blunted using the DNA Blunting Kit (Takara Shuzo), followed by phenol extraction and ethanol precipitation. The cDNA was recovered by centrifugation in 101 TE buffer, and a phosphate group was added to the 5 'end of cDNA using a MEGA LABEL kit (Takara Shuzo).
  • the plasmid vector pUC1180.2 (2 ul), which had been digested with the restriction enzyme Hincl I and then dephosphorylated with Calf Intestine Alkaline Phosphatase (Takara Shuzo), and the above-recovered cDNA fragment of about 0.5 / zg was mixed and the cDNA fragment was ligated to the vector DNA using DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo).
  • E. coli J Ml09 was transformed using the reaction solution 4-1.
  • X-Gal and I An agar medium supplemented with PTG was used.
  • This linker is composed of a Pstl cleavage site BamHI site and a HindII site.
  • This linker 0.1 (0.05) was mixed with pMGH 7 Pstl and Hind III digest 0.5 fig (51), and pMGH was synthesized using the DNA Ligation Kit Ver. 2 described above. A linker sequence was inserted between the Pstl site of 7 and the Hind III site.
  • E. coli J M109 is transformed using reaction mixture 2 // 1, cultured on L-agar medium containing 100 gZml of ampicillin, and ampicillin resistant on the medium. Colonies were obtained. Then, 10 clones were arbitrarily selected, and each clone was cultured overnight in 5 ml of L-liquid medium containing 50 gZml of ampicillin, and a plasmid was prepared from 1.5 ml of the culture solution. . The restriction enzyme BamHI was allowed to act on the plasmid, and the digest was analyzed by 1% agarose gel electrophoresis. As a result, a fragment of about 75 Obp was confirmed.
  • the cDNA fragment of raGH excised with BamHI described above was prepared by extracting from the agarose gel, and the same procedure was carried out using the above ligation kit to carry out the same operation to obtain the retrovirus vector pZI.
  • P-NeoS V (X) 1 was inserted into the BamHI site of Cell. Vol. 37, p. 1053 (1984).
  • E. coli JMl09 was transformed with the reaction mixture 2 ⁇ 1, and cultured on an L-agar medium containing 50 zgZnil of ampicillin, and ampicillin-resistant colonies were cultured on the medium.
  • PCR was performed on 24 ampicillin-resistant colonies obtained on the obtained c- plate in combination with MGH F1 and the primers shown in SEQ ID NOs: 8 and 9 in the sequence listing to obtain the mGH cDNA in the correct direction.
  • a search for clones with the inserted fragments revealed that the four clones were the target.
  • the correct orientation means that the 5 'position of the sequence encoding the mGH cDNA is inserted into the UTR sequence of the LTR, and the 3' position is inserted into the neomycin resistance gene.
  • plasmid was named pRMGH3, and used in subsequent experiments.
  • Producer cells that produce a retrovirus incorporating the mGH cDNA sequence can be obtained from the above-described pRMGH3 by packaging mouse GP + E-86 derived from mouse NI HZ3T3 cells (AT CC CRL-1658) [J. Viol., 62, 1120 (1988)] by the calcium phosphate method. The transfection was performed according to the protocol described in the laboratory manual Animal Genetic Engineering [Michael Kriegler, translated by Ikuyuki Kato, Takara Shuzo Publishing Co., Ltd. (1994)], pp. 203-204.
  • the mGH cDNA sequence was integrated into the cell genome.
  • the titer of the virus in the cell supernatant produced from the seven clones was determined by the method described in the aforementioned Genetic Engineering of Animal Cells, pp. 204-206. Producer cells showing the highest titer (2 ⁇ 1 OsCFUZnil) were used for subsequent gene transfer experiments into hematopoietic stem cells.
  • Primers MMETF1, MMETF2, and MMETR2 for obtaining a DNA fragment containing the mouse metamouth thionein I promoter (hereinafter abbreviated as mMET promoter) are described in Nature, Vol. 292, p. 267 (1981), and Nature, respectively. Designed with reference to the nucleotide sequence described in Vol. 296, p. 39 (1982) did.
  • the nucleotide sequences of primers MMETF1, MMETF2, and MMETR2 are shown in SEQ ID NOs: 12, 13 and 14, respectively, in the sequence listing.
  • a part of the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis to amplify a DNA fragment corresponding to about 42 Obp.Acn, Bgin, Haen, HapE, Sac I (all manufactured by Takara Shuzo) After confirming that the fragment contained the mM ET promoter region by restriction enzyme digestion using), amplified DNA fragments were recovered from the reaction solution using the QI Aquick PCR Purification Kit (Qiagen). .
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment was determined by the didequin method. Two of the three plasmids contained a region of the mMET promoter having the same nucleotide sequence as in the above-mentioned literature, and one of them was named plasmid pMPT and used for the subsequent experiments.
  • the nucleotide sequence of the PCR-amplified DNA fragment inserted into plasmid pMPT is shown as SEQ ID NO: 15 in the sequence listing.
  • Plasmid pHGHG containing genomic DNA encoding human growth hormone (hereinafter abbreviated as hGH) was obtained from Nicholas Institute Diagnostic.
  • the nucleotide sequence of an approximately 2.1 kb BamHI-EcoRI DNA fragment containing the hGH coding region in the plasmid is shown in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequences of primers HGHF4 and HGHR4, which were designed based on the base sequence and were used in the detection of the DNA fragment containing the hGH coding region in the following examples, are shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 17, respectively. See Figure 18.
  • the DNA fragment contains the genomic DNA encoding the mMET promoter and hGH located downstream thereof, and has BamHI ends at both ends.
  • the pEmi vector which is a retrovirus vector, is composed of a 2.2 kb SalI-Clal fragment derived from a pLRNL vector [Virology ⁇ Vol. 171: 331 (1989)] and a pBabe Blue vector [Nucl. Acids. Res. Vol. 35, p. 87 (1990)].
  • Plasmid pMHE is a retrovirus vector containing genomic DNA encoding hGH located downstream of the raMET promoter and a neomycin resistance gene as a selectable marker.
  • NI HZ3T3 cells were modified from dalbecco containing 10% fetal calf serum (FCS, manufactured by Dainippon Pharmaceuticals) and 100 units / ml of penicillin and 1 ⁇ 0 gZml of streptomycin (both manufactured by Gibco). After culturing in Eagle's medium (DMEM, manufactured by JRH Biosciences), and adding 70 g of confluent, add 10 g of plasmid pMHE together with DOTAP transfection solution (Boehringer Mannheim), and add cells. Transfection was performed.
  • FCS fetal calf serum
  • FCS fetal calf serum
  • streptomycin both manufactured by Gibco
  • DMEM All the media hereinafter referred to as DMEM contain FCS, benicillin, and streptomycin as described above.
  • G418-resistant cells were selected according to the method described in Yodosha, 1994, Gene Transfer and Expression, Analytical Methods, pp. 74-80.
  • the obtained G418-resistant colonies were transferred to a new dish, and cultured in the above medium containing 0.7 SingZml of G418 at a final concentration of 90% confluent.
  • the culture ground in the above medium containing Z n S 0 4 at a final concentration of 100 M, and incubated an additional 4 0 h.
  • the culture supernatant was collected and filtered through a 0.22 m filter (Millipore), and 20/1 was subjected to 15% SDS-PAGE. Was.
  • the gel was subjected to Western blotting using an anti-human growth hormone antibody (UCB Bioproducts) according to the method described in Ryrent 'Protocol in Molecular' Technology, 10.2.2 to 10.2.10. Was done.
  • UMB Bioproducts anti-human growth hormone antibody
  • 1 zg of purified human growth hormone manufactured by Seikagaku Corporation was used. As a result, it was confirmed that hGH reacting with the above antibody was generated in the culture supernatant.
  • Producer cells that produce recombinant retroviruses for use in the introduction of the hGH gene are packaging cells that contain the above plasmid pMHE. + £ -86 prepared by transfection. Transfection of the cells was performed in the same manner as in the transfection of NIHZ3T3 cells described above. From the obtained G418-resistant colonies, 50 colonies distant from other colonies were selected, and were simply obtained by the method described in REALIZE INC., Animal Cell Practical Use Manual, pages 88 to 89 (1984). Released. After culturing the isolated cells to 90-95% confluence in a 90-dragon dish, genomic DNA was prepared from the cells collected by centrifugation in the manner described above.
  • genomic DNA was synthesized by PCR using primers HGHF4 and NEOR1 (25-cycle reaction with 94 ° C, 1 minute to 55 ° C, 1 minute to 72 ° C, 2 minutes as one cycle) was performed. Then, cells in which amplification of a DNA fragment of about 1.9 kb was observed were selected. The plasmid pMHE DNA is integrated on the genomic DNA of these cells.
  • the virus producing ability of the obtained producer cells was evaluated as follows. After these cells were grown in a semi-confluent in a 90-band dish, 9 ml of DMEM was added to the dish, cultured overnight, centrifuged, and the supernatant was collected. Filter the collected culture supernatant with a 0.45 ⁇ m filter ( (Lipore), to give a virus supernatant. The virus titer in these virus supernatants was measured using NI HZ3T3 cells by a standard method [J. Virol., Vol. 62, pp. 1120-1124 (1988)].
  • DMEM containing 2000 NIH / 3T3 cells per 1-well was added to a 6-well tissue culture plate, cultured overnight, and the serially diluted virus supernatant was added to a final concentration of 7.5 / g.
  • the mixture was added to each well together with 1 / ml hexadimetrim-promide (Polybrene: Aldrich). After incubating the plate at 37 ° C for 24 hours, the medium was exchanged for one containing G418 (final concentration: 0.75 mg / ml, Gibco), and the plate was further incubated.
  • mice Six-week-old mice (C 3HZH e J) were administered 15-mg / kg of 5-fluorouracil (5-FU, manufactured by Amresco) via the tail vein, and two days later, the femur and ribs were removed and bone marrow was removed. Collected. The obtained bone marrow was subjected to density gradient centrifugation using Ficoll-Hypaque (density 1.0875 gZml, manufactured by Pharmacia) to prepare a low-density mononuclear cell fraction, which was used as mouse bone marrow cells. Mouse bone marrow cells were prestimulated prior to retrovirus infection according to the method of Lusky et al. [Blood, Vol. 80, p.
  • the above mouse bone marrow cells were co-cultured with the producer cells prepared in Example 1-1 (2) or Example 2- (3) in the presence of rhlL-6 and rrSCF at 37 ° C for 24 hours. .
  • the medium used for the above pre-stimulation of bone marrow cells was used, and 7.5 g / ffll of polypropylene was further added. After the culture, non-adherent cells were collected and used as transgenic bone marrow cells.
  • transgenic bone marrow cells described above were administered from the tail vein of a 6-week-old C3HZHe J mouse, and three days later, the transgenic bone marrow cells were administered again.
  • mice to which physiological saline was administered instead of bone marrow cells were prepared and bred in the same manner.
  • mice to which bone marrow cells transfected with the producer cells prepared in Example 2 (3) having the mMET promoter were administered, 25 mM ZnS Z Given water containing 4 .
  • mice receiving the bone marrow cells transfected with the growth hormone gene were significantly more weighed than the control group (mean 25 g). There was an increase. Furthermore, growth hormone gene is under the control of mMET promoter, in the group given water containing Z n S 0 4 of 25 mM, further weight gain was observed.
  • the efficiency is improved without using a foster parent.
  • Good growth transformants can be provided.
  • the transformant has excellent growth properties, and can permanently enlarge a living body by expressing growth hormone permanently.
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Description

明 細 書 形質転換体 発明の分野
本発明は成長性に優れた形質転換体およびその製造方法に関する。
従来の技術
最近の発生工学の発展により、 外来性遺伝物 （DNA) を胚の核内に注 入するか、 感染させることにより、 胚の染色体にその物質を組み込んだ形 質転換胚を作成できるようになった [Pro Natl. Acad. Sci. , USA, 第 77卷、 第 7380〜 7384頁 （1980) ； Cell, 第 32卷、 第 20 9〜 216頁 （1982) ] 。 この胚は、 仮親に移植することにより、 成 長させることができ、 得られた成体動物は外来性 DN Aを自らの染色体に 取り込んでおり、 かつそれを発現することができる。 形質転換された個体 は、 一般的にトランスジヱニック動物と呼ばれる [Science、 第 214巻、 第 1244〜 1246頁 （1981) ] 。 取り込まれた外来性 D N Aはト ランスジーン （transgene) と呼ばれ、 一般的にプロモーターと cD N A等 の目的遺伝子とから成る。
発明の目的
上記トランスジュニック動物は、 形質転換胚を仮親に移植し、 仔に発生、 出産させ目的とする遺伝子を持つ動物として生産されるため、 その作出に は長時間を要する。 また、 目的とする遺伝子を持つ動物が得られる確率が 低い場合には、 仮親となる母動物を大量に必要とする。
本発明の目的は、 仮親を使用することなく、 生体を形質転換するための 方法を開発し、 短期間で成長可能な形質転換体および当該形質転換体を得 るための方法を提供することにある。
発明の概要
本発明の第 1の発明は成長形質転換体に関し、 下記工程 （A) および ( B ) :
(A) 成長ホルモンをコードする遺伝子を生体幹細胞に組み込む工程、 および
( B ) (A) 工程で得られる幹細胞を生体に導入する工程、
を包含する工程により得られる新規成長形質転換体である。
本発明の第 2の発明は成長形質転換体の製造方法に関し、 下記工程（A)、 ( B ) および （C ) ：
(A) 成長ホルモンをコードする遺伝子を生体幹細胞に組み込む工程、
( B ) (A) 工程で得られる幹細胞を生体に導入する工程、 および
( C ) ( B ) 工程で得られる生体で成長ホルモンを発現させる工程、 を包含することを特徴とする。
本発明によれば、 遺伝子組換え生体幹細胞を使用した新規成長形質転換 生物が提供され、 当該生物は胚組織を使用することなく、 したがって、 仮 親の必要なしに短期間に、 効率よく作成でき、 成長性において優れ、 短期 間に巨大化し、 増体重、 乳量等が改善された非常に有用な生物となる。
発明の詳細な説明
本発明の形質転換体は、 哺乳類 （例、 マウス、 ラッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ィヌ、 サル、 チンパンジー等） 、 鳥類 （例、 ニヮ トリ、 七面鳥、 ゥズラ、 ァヒル、 カモ等） 、爬虫類 （例、 へビ、 ヮ二- カメ等） 、 両生類 （例、 力エル、 サンショウォ、 ィモリ等） 、 魚類 （例、 アジ、 サバ、 スズキ、 タイ、 ハタ、 ブリ、 マグロ、 カツォ、 サケ、 マス、 ゥナギ、 ヒラメ、 サメ、 エイ、 チョウザメ等） 等の生物である。 当該生物の生体より幹細胞を調製し、 該幹細胞に、 成長ホルモンをコー ドする遺伝子を組み込み、 ついで、 生体生物に、 該成長ホルモンをコード する遺伝子が組み込まれた組換え幹細胞を導入して、 得ることができる。 本発明における成長ホルモンとは、 形質転換体と同種の成長ホルモンお よび形質転換体に抗原性を示さず、 かつ当該生物にその作用を示しうる異 種成長ホルモンを包含するもので、 本発明の形質転換体で、 安定に発現、 機能を発揮するものである。
哺乳類の成長ホルモンは脳下垂体において生産されるが、 それらの活性 ならびに構造は公知である。 例えば、 ヒ ト成長ホルモンについては、 J.
Am. Cheni. Soc.第 80巻、 第 4429頁 （1958) 、 Biochem. J.第 1 00巻、 第 754頁 （1966) 等に報告されている。 魚類の成長ホルモ ンについても、 ティラピアよりの単離例 [Gen. Comp. Endocrin.、 第 30 卷、 第 91頁 （1976) ] 、 チョウザメよりの単離例 [Endocrinologyヽ 第 108巻、 第 377頁 （1981) ] 、 コィよりの単離例 [Gen. Comp. Endocrin.、 第 50巻、 第 335頁 （1983) ] 等が報告されている。 また、 哺乳類の成長ホルモン遺伝子についてはラッ ト成長ホルモン遺伝 子 [Nature、 第 270巻、 第 486頁 （1977) ] 、 マウス成長ホルモ ン遺伝子 [J. Biol. Chem.、 第 260巻、 第 9574頁 （ 1985 ) ] 、 ゥシおよびブタの成長ホルモン遺伝子 [DNA、 第 2巻、 第 37頁 （19 83) ] .、 ゥシ成長ホルモン遺伝子 （特開昭 63— 197号公報） 、 ブタ 成長ホルモン遺伝子 （特開昭 59- 173083号公報） 、 ヒ ト成長ホル モン遺伝子 [Science、 第 205巻、 第 602頁 （1979) ] 等が知ら れている。 鳥類の成長ホルモン遺伝子としてはニヮ トリ成長ホルモン遺伝 子が知られている [J. Exp. 2001.第232巻、 第 465頁] 。 魚類の成 長ホルモン遺伝子についてもサケの成長ホルモン遺伝子 （特開昭 61 -9 3 1 9 6号公報、 同 6 1— 2 1 0 1 0 0号公報） 、 マダイ成長ホルモン遺 伝子 （特開平 2— 2 1 9 5 7 6号公報） 、 ヒラメ成長ホルモン遺伝子 （特 開平 2— 2 3 8 8 4号公報） 、 マグロ成長ホルモン遺伝子 （特開平 1一 1 0 4 1 8 0号公報） 、 カツォ成長ホルモン遺伝子 （特開平 1—1 6 0 4 8 5号公報） などが単離されている。
本発明においては、 目的の成長ホルモン遺伝子を公知の方法で単離し、 使用すれば良い。 また、 公知の単離された成長ホルモン遺伝子を使用して も良い。 なお、 本発明において成長ホルモンとは天然型の成長ホルモンば かりでなく、 これら成長ホルモンと実質的に同一の活性を有するポリぺプ チド、 すなわち、 天然型成長ホルモンが本来持つ活性を実質的に損なうこ とのない範囲で成長ホルモンのァミノ酸が他のァミノ酸に置き換わったポ リペプチド、 アミノ酸が欠失したポリペプチド、 アミノ酸が挿入されたポ リベプチドを包含する。
本発明における生体幹細胞は、 胚組織から分化後の生体由来の多分化能 を有するとともに、 自己複製能をもつ細胞であり、 例えば、 造血幹細胞、 末梢血幹細胞、 上皮幹細胞、 外分泌腺幹細胞、 内分泌腺幹細胞、 肝幹細胞、 滕幹細胞、 神経内分泌幹細胞、 結合組織幹細胞、 間質幹細胞、 線維芽細胞 幹細胞、 間葉織幹細胞、 脂肪細胞幹細胞、 乳房腺幹細胞、 網内皮組織幹細 胞、 脂質幹細胞、 軟骨細胞幹細胞、 ォステオプロジェ二ター （osteoproge nitor) 幹細胞、 骨細胞幹細胞、 筋線維幹細胞、 ニューロン幹細胞、 表皮 幹細胞、 ケラチノサイ ト幹細胞、 ランゲルハンス幹細胞、 メラニン形成細 胞幹細胞、 脂腺幹細胞、 汗腺幹細胞、 ムクス （mucous) 幹細胞、 漿膜幹細 胞、 造歯細胞幹細胞、 ランゲルハンス島幹細胞、 肺胞幹細胞、 網膜幹細胞 等が使用できる。 これらの幹細胞は使用する生体動物の諸組織より得るこ とができる。 例えば、 造血幹細胞は骨髄細胞の中で 1ノ 1 0 5の頻度でしか存在しな い細胞であるが、 造血幹細胞の細胞表面レセプターでステ厶セルファクタ 一 （stem cell factor： S C F ) の受容体である c- kitレセプターに対す る抗体を用いて純化することが可能である [Blood、 第 7 8巻、 第 1 7 0 6〜1 7 1 2頁 （1 9 9 1 ) ] 。
成長ホルモン遺伝子の幹細胞への遺伝子導入方法としてはリン酸カルシ ゥム法、 マイクロインジヱクション法、 エレク トロポレーション法、 アデ ノウィルス、 S V 4 0ウィルス、 単純へルぺスウィルス等を使用する方法 等がある力 レトロウィルスベクターを用いた系が最適である。
例えば、 レトロウイルスベクタ一を用いると、 分裂増殖している細胞の 染色体に目的の遺伝子を安定して挿入することができる。 組換えウィルス は標的細胞に感染しても新たなウイルスは生産されないような複製能欠損 系が確立されており、 高力価で安定な供給方法が報告されている [Hum. G en. Ther.、 第 5巻、 第 1 9〜 2 8頁 （1 9 9 4 ) ] 。 感染効率は組換え ウィルスの力価に依存するが、 造血幹細胞に高効率で遺伝子を導入するた めには組換えゥィルス産生細胞と標的細胞との共培養が必要である [Natu re、 第 3 1 0巻、 第 4 7 6頁 （1 9 8 4 ) ] 。
—方、 ウィルス上清、 すなわち、 ウィルス粒子のみを標的細胞に加え、 培養し、 高効率で遺伝子を導入する方法として、 例えば、 フイブロネクチ ン （F N ) フラグメントを被覆した培養皿中で、 ウィルス上清と標的細胞 を培養することにより、 共培養と同等の高効率で目的の遺伝子を導入する ことが可能である [J. Clin. Invest.、 第 9 3巻、 第 1 4 5 1頁 （1 9 9 4 ) ] 。
フィブロネクチンフラグメントとしては、 特開平 2— 3 1 1 4 9 8号公 報に記載の配列表の配列番号 1 0で表され、 エシュリヒア ' コリ （Escher ichia coli) HB 101/pHD 102 (FERM P— 10721) に より産生されるポリペプチド、 同じく配列表の配列番号 11で表され、 ェ シエリヒア · コリ （Escherichia coli) HB 101/pCH 102 (F E RM BP— 2800) により産生されるポリペプチド等があり、 これら のポリペプチドを使用し、 上記方法により、 高効率で異種タンパクをコー ドする遺伝子を標的細胞に導入することが可能である。 当該方法は、 19 95年 10月 5日に国際公開された WO 95/26200号公報に記載 されている。
レトロウィルスベクターに組み込む成長ホルモン遺伝子は、 一般的にプ 口モーターと成長ホルモンをコードする DNAからなつている。 その場合、 プロモーターとしては当該生物内で機能する種々のプロモーターが使用で き、 例えば、 マウスメタロチォネィン Iプロモータ一 [Nature, 第 296 巻、 第 39頁 （1982) ] 等を使用することができる。 また、 レトロゥ ィルスべクタ一に備わっている LTR等のプロモーターを用いることもで きる。 この場合には、 成長ホルモンをコードする DNAのみをプロモータ 一の下流に挿入すれば良い。 成長ホルモンをコードする DN Aとしては、 成長ホルモンの mR N Aから作製された cD N Aまたはゲノム D N A由来の 成長ホルモンコード領域 DN Aを使用することができる。
目的の成長ホルモンをコ一ドする遺伝子が組み込まれた組換え幹細胞は、 生体生物に導入される。 生体生物への幹細胞の導入方法としては、 該幹細 胞を静脈内投与しても良く、 また、 幹細胞の由来組織内に直接注入しても 良い。
なお、 造血幹細胞を組換え幹細胞として使用する場合には、 生体生物は 免疫能を不全化されていても良い。 当該生体動物の免疫能を不全化する方 法としては、 例えば、 放射線を照射しても良く、 また、 免疫不全化薬物を 投与しても良い。
例えば、 純系のマウスに約 1 , 0 0 0ラ ドの放射能を照射する。 マウス に対してこの線量は致死量であり、 しばらくすると血液細胞は激減し、 白 血球がなくなって、 免疫能が不全化し、 感染にかかり、 2週間位のうちに 死亡する [Rad. Res. . 第 1 4巻、 第 3 1 3〜 3 2 2頁 （1 9 6 1 ) ] 。 致死量放射線照射マゥスに組換え造血幹細胞を投与すると、 投与した造血 幹細胞から再構築された造血系細胞により、 マウスは生存し続けることが できる。
免疫不全化薬物としては、 抗リ ンパ球血清、 プレドニゾロン、 メチルプ レ ドニゾロン、 デキサメタゾン等の副腎皮質ホルモン、 ァザチォプリ ン、 6— M P等のプリ ン拮抗剤、 シクロホスフアミ ド、 ブスルファン等のアル キル化剤、 サイクロスポリン八、 F K 5 0 6等を使用することができる。 抗リンパ球血清を使用する場合は、 ァグロプリン量として 1〜2 O mg/ kgを静脈内または筋肉内に投与すれば良く、 副腎皮質ホルモンとしてメチ ルプレドニゾロンを使用する場合は、 1 0 ~ 1 5 mgZkgの多量投与を行つ ても良い。 また、 ァザチォプリンを使用する場合は、 2〜 3 mgZkgを投与 すれば良く、 シクロホスフアミ ドを使用する場合は 4 0〜5 O mg/kgの多 量投与を行つても良い。 これらの免疫不全化薬物を使用することによって、 生体動物の免疫能が不全化される。 同様に、 免疫不全化した生体動物は組 換え造血幹細胞を導入することにより生存し続けることができる。
遺伝子導入生物内で目的成長ホルモン遺伝子は永続的に発現し、 宿主生 物の形質を転換することができる。 生体への成長ホルモン遺伝子の導入は 成長前の期間が好適であり、 導入された成長ホルモン遺伝子は生体内で発 現し、 発現成長ホルモンは生体の骨格成長、 窒素保持、 タンパク質合成を 増進させ、 形質転換体において成長速度、 体重、 肉生産量を著しく増加さ せることができ、 本発明の成長性に優れた形質転換体、 すなわち、 成長形 質転換体を得ることができる。
かく して、 本発明により、 遺伝子組換え生体幹細胞を使用した成長形質 転換生物が提供される。 当該生物は胚組織を使用することなく短期間に、 効率よく作成でき、 成長性において優れ、 増体重、 乳量が改善等され非常 に有用である。
つぎに、 実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、 本発明は、 これら の実施例に限定されるものではない。
実施例 1
(1) マウス成長ホルモン遺伝子を組み込んだレトロウィルスベクター PRMGH3の構築
マウス成長ホルモン （以下、 mGHと略す） をコードする cDNAを P C R法により作成した。
上記 J. Biol. Chem. 記載のマウス成長ホルモン （mGH) の cDNA の配列に基づいて、 MGHF1、 MGHF2、 MGHRlおよび MGHR 2の 4つのプライマーを選定した。 各プライマーの配列を配列表の配列番 号 1〜4にそれぞれ示す。
P CRの铸型 DNAとして、 マウスの脳の cDNAライブラリ一 （Clont ech社） を用いた。 この cDNAライブラリー 1〃1、 MGHF 1と MGH R1をそれぞれ 1 Opmolおよび宝酒造社製 P CR Amplification Kitを用 いて 50 1の反応液を調製し、 94°Cにて 1分、 55°Cにて 1分、 72 °Cにて 1分の温度シフトを 30サイクル行った。 反応終了後、 反応液より 5 1を取り出し、 1%ァガロースゲル電気泳動を行ったところ、 約 75 Obpの大きさのシングルバンドが認められた。 この反応液を水で 100倍 に希釈し、 その を铸型とし、 MGHF 2および MGHR2をプライ マーとして、 上記と同様の条件で PCR、 電気泳動を行ったところ約 70 0塩基対のシングルバンドが見られ、 P CRによって目的の mGHの cDN Aを特異的に増幅できていることが解った。
MGHF 1と MGHR 1のプライマーを用いる上記の 50 1の反応系 を更に 10本用意して P CRを行うことによって、 πlGHのcDNAを大量 に調製した。
ついで、 SUPREC-02 (宝酒造社製） によって、 遊離のプライマー、 dN TPおよび緩衝液に含まれていた塩を除いた後、 約 75 Obpの cDNA断 片を TE緩衝液 [1 OmM Tris-HCl (pH 7.5 ) 、 0.1 mM EDT A] 50 xlに回収した。 このうち (20 Hi) について、 DNA Bl unting Kit (宝酒造社製） を用いてその cDNA末端を平滑化した後、 フエ ノール抽出、 エタノール沈殿を行った。 遠心分離により cDNAを 10 1 の TE緩衝液に回収し、 MEGA LABELキッ ト （宝酒造社製） を用いて cDN Aの 5'末端にリン酸基を付加した。 ただし、 ここでは標識されたもので はなく、 未標識の AT P (1 OmM) を用いた。 フヱノール抽出、 ェタノ ール沈殿を行った後、 cDNAを 10 /ilの TE緩衝液に回収し、 そのうち 1〃1を 1%ァガロースゲル電気泳動にかけ、 回収された cDN Aの量をチェ ックした。
ついで、 制限酵素 Hincl Iで切断後、 Calf Intestine Alkaline Phosp hatase (宝酒造社製） で脱リ ン化したプラスミ ドベクター pUC 118 0.2 (2 ul) と、 上記の回収された cDNA断片約 0.5 /zgとを混 合し、 DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社製） を用いて、 cDNA断 片をベクター DN Aに結合させた。 ライゲーシヨン反応終了後、 反応液 4 〃1を用いてィー · コリ （E. coli) J Ml 09の形質転換を行った。 こ こで cDNAが挿入されたクローンを選別するために、 予め X— Galと I PTGとを添加した寒天培地を用いた。 ィンサー卜が入っていない青色コ ロニーとは明らかに区別できる白色コロニーを任意に 1 0個選びだし、 該 コロニー菌体の熱抽出物を銬型とし、 MGHF 1と MGHR 1をプライマ 一として用い、 上記の条件で P CRを行ったところ、 8個のクローンに約 75 Obpの増幅バンドが認められた。 それぞれのクローンからプラスミ ド DN Aを調製した後、 挿入 cDN A断片の塩基配列を Dideoxy Chain Termi nation法によって決定し、 上記の J. Biol. Chem.に記載の配列と同一の 塩基配列である、 配列表の配列番号 5に示す塩基配列の核酸を有するク口 ーンを PMGH 7と命名し、 以後の実験に用いた。
配列表の配列番号 6および配列番号 7に示す 5 '位にリン酸基を付加し たオリゴデォキシリボヌクレオチドを合成し、 それぞれを 1 zgZ zlの濃 度になるように TE緩衝液中に混合溶解した後、 75°Cにて 1分処理した 後、 室温まで徐冷し、 両オリゴデォキンリボヌクレオチドをァニールさせ、 リンカーを調製した。 このリンカ一は Pst l切断サイ トー BamH Iサイ ト -Hind I I Iサイ 卜で構成されている。 このリンカ一 0. 1 (0. 05 ΐ) と pMGH 7の Pst l と Hind I I Iの消化物 0. 5 fig (5 1) を混 合し、 上記の DNA Ligation Kit Ver. 2を用いて、 pMGH 7の Pst l サイ トと Hind I I Iサイ トの間にリンカ一配列を挿入した。
ライゲーシヨン反応終了後、 反応液 2 //1を用いて、 ィ一 · コリ J M1 09を形質転換し、 アンピシリンを 1 00 gZmlの濃度で含む L—寒天 培地上で培養し、 培地上にアンピシリン耐性コロニーを得た。 ついで、 コ ロニーを任意に 1 0個選び、 それぞれのクローンをアンピシリンを 50 gZmlの濃度で含む 5 mlの L一液体培地で終夜培養後、 1. 5 ml©培養液よ りプラスミ ドを調製した。 プラスミ ドに制限酵素 BamH Iを作用させ、 消 化物を 1 %ァガロースゲル電気泳動で解析したところ、 8個のクローンに おいて、 約 75 Obpの断片を確認できた。 これらのクローンは、 リンカ一 配列が挿入された結果、 BamH Iで mG Hの cD N A断片が切り出されてき たことが明らかとなった。 この 8個のクローンの中から任意に 1クローン を選び、 そのプラスミ ドを pMGH 12と命名した。
上記の BamH Iで切り出されてくる raG Hの cD N A断片をァガロースゲ ルから抽出することによって調製し、 これを上記のライゲーシヨンキッ ト を用い、 同様の操作を行って、 レトロウィルスベクター pZ I P-NeoS V (X) 1 [Cell.第 37巻、 第 1053頁 （1984) ] の BamH Iサ ィ 卜に挿入した。 ライゲーション反応終了後、 反応液 2 ^1を用いて、 ィ 一 · コリ J Ml 09を形質転換し、 アンピシリンを 50 zgZnilの濃度で 含む L—寒天培地上で培養し、 培地上にアンピシリン耐性コロニーを得た c プレート上で得られたアンピシリン耐性コロニー 24個に関して、 MGH F 1と配列表の配列番号 8および 9にそれぞれ示されるプライマーを組み 合わせて P CRを行うことによって、 正しい方向に mGHの cDNA断片が 挿入されたクローンを検索した結果、 4個のクローンは、 目的とするもの であることが明らかになった。
ここで正しい方向とは、 mGHの cDNAをコードする配列の 5'位が L TRの U5配列の側に、 3'位がネオマイシン耐性遺伝子の側に挿入され ていることをいう。
4個のクローンのうち任意に 1クローンを選択し、 そのプラスミ ドを p RMGH3と命名し、 以降の実験に用いた。
(2) プロデューサ一細胞の調製
mGHの cDNA配列が組み込まれたレトロウィルスを生産するプロデュ —サー細胞は、 上記の pRMGH3を、 マウス N I HZ3T3細胞 （AT CC CRL- 1658) 由来のパッケージング細胞 G P + E— 86 [J. Viol.、 第 62巻、 第 1120頁 （1988) ] にリン酸カルシウム法で トランスフエクシヨンすることによって調製した。 トランスフエクシヨン は、 ラボマニュアル動物の遺伝子工学 [Michael Kriegler著、 加藤郁之進 鑑訳、 宝酒造社出版 （1994) ] の第 203〜204頁に記載されてい るプロ トコールに従って行った。 ついで、 G418を 800 gZinlの濃 度で含む選択培地上に、 他のコロニーからよく分離した位置に形成された コロニーを 15個任意に選び出し、 REALIZE INC社出版、 浅田恵子編集、 動物細胞実用化マニュアル、 第 88〜 89頁 （1984) に記載の方法で 単離し、 それぞれのクローンの細胞を 90匪ディ ッシュで別々に 80%コ ンフルェントの状態になるまで培養した。 細胞を遠心分離によって回収し てゲノム DNAを調製し、 その 1 gを铸型とし実施例 1一 （1) で用い たプライマー MGHF 1と MGHR1を実施例 1一 （1) と同じ条件で P CRを行ったところ、 7個のクローンで約 750 bpの増幅バンドを確認す ることができた。 これは、 これら 7個のクローンでは細胞のゲノムに mG Hの cDNA配列がィンテグレー卜されていることを意味している。 7個 のクローンから生産される細胞上清中のウィルスの力価を前述の動物細胞 の遺伝子工学の第 204〜206頁に記載の方法で測定した。 その中で最 も高い力価 （2 X 1 OsCFUZnil) を示すプロデューサー細胞を、 以後 の造血幹細胞への遺伝子導入実験に用いた。
実施例 2
(1) マウスメタ口チォネイン Iプロモーターの取得
マウスメタ口チォネイン Iプロモーター （以下、 mMETプロモーター と略す） を含む DNA断片を得るためのプライマー MMETF 1、 MME TF 2、 MME TR 2はそれぞれ Nature、 第 292巻、 第 267頁 （1981)、 および Nature、 第 296卷、 第 39頁 （1982) に記載の塩基配列を参考に設計 した。 プライマ一 MMETF1、 MMETF2、 MMETR2の塩基配列 をそれぞれ配列表の配列番号 12、 13および 14に示す。
マウスのゲノム DNAは N I HZ3 T 3細胞 （ATCC CRL- 16 58) より、 John Wiley & Sons Inc.、 1987年発行、 カレント ·プロ トコ 一ノレ · イン -モレキュラー くィォロジー (Current Protocols in Molec ular Biology) 、 2.2.1〜2.2.3に記載の方法に従って調製した。
PCR DNA Amplification Kit (宝酒造社製） を使用して、 上記の ゲノム DNA 250ng、 プライマー MMETF1、 MMETR2それぞ れ 1 Opmolずつを含む 50 1の P CR反応液を調製して 94°C、 1分間 の熱処理を行った後、 94 、 1分〜 56°C、 1分〜 72°C、 1分を 1サ ィクルとする 30サイクルの反応を行った。 反応液の一部をァガ口一スゲ ル電気泳動に供して約 42 Obpに相当する DNA断片が増幅されているこ と、 および Accn、 Bgin、 Haen、 HapE, Sac I (いずれも宝酒造社 製） を用いた制限酵素消化によつて該断片が mM E Tプロモータ一領域を 含むことを確認した後、 Q I Aqu i c k PCR Purification Kit (キ ァゲン社製） を用いて反応液より増幅 D N A断片を回収した。
回収された約 42 ObpDNA断片のうち 15 Ongを 5 Ongの pT 7 Blue Tベクター （ノバジェン社製） と混合し、 DN Αライゲーシヨンキッ ト V e r. 2 (宝酒造社製） を用いてライゲーシヨンを行った後、 反応液の —部を用いてィー ·コリ JM109を形質転換した。 得られた形質転換コ ロニーをいくつか選び、 MMETF2、 T 7プロモータープライマー （ス トラタジーン社製） を用いた P CR法 （94°C、 30秒〜 55°C、 30秒 〜72°C、 30秒を 1サイクルとする 25サイクル反応） によって目的の DNA断片を含むコロニーを検索した。 こうして選択されたコロニーのう ち、 3つを培養してプラスミ ドを調製し、 該プラスミ ドに挿入されている DN A断片の塩基配列をジデォキン法によって決定した。 3つのプラスミ ドのうち 2つは上記の文献と同一の塩基配列を有する mME Tプロモータ 一領域を含んでおり、 このうちの一方をプラスミ ド pMPTと命名して以 降の実験に使用した。 プラスミ ド pMPTに挿入された PCR増幅 DNA 断片の塩基配列を配列表の配列番号 15に示す。
(2) ヒ ト成長ホルモン遺伝子を組み込んだレ トロウィルスベクター p MHBの構築
上記のプラスミ ド pMPT 2^gを Kpnl、 BglH (ともに宝酒造社製） で消化した後、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 mMETプロモーター領 域を含む約 370 bpに相当する DN A断片をゲルより回収した。
ヒ ト成長ホルモン （以下 hGHと略す） をコードするゲノム DNAを含 むプラスミ ド pHGHGは Nicholas Institute Diagnostic社より入手し た。 該プラスミ ド中の hGHコード領域を含む約 2. lkbの BamH I— Ec oR I DNA断片の塩基配列を配列表の配列番号 16に示す。 また、 該塩 基配列をもとに設計され、 以下の実施例において hGHコード領域を含む DN A断片の検出に用いられたプライマー HGHF 4、 HGHR 4の塩基 配列をそれぞれ配列表の配列番号 17および 18に示す。
5 gのプラスミ ド pHGHGを BamH I、 EcoR I (ともに宝酒造社製） で消化した後、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 hGHをコードする領域 を含む約 2. lkbの DNA断片をゲルより回収した。
2 /zgのプラスミ ドベクター pBluescriptn (KS-) (ス トラタジーン社 製） を Kpnl、 EcoR Iで消化した後、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 約 3kbに相当する DNA断片をゲルより回収した。 このうち 12. 5ngを 上記の hGHコード領域を含む約 2. lkbDNA断片 50ng、 および上記 の mMETプロモーター領域を含む約 370bPDNA断片l 2ngと混合し、 DN Aライゲーシヨンキッ ト Ve r. 2を用いてライゲーシヨンを行つ た後、 反応液の一部を用いてィー · コリ J Ml 09を形質転換した。 得ら れた形質転換体コロニーをいくつか選び、 プライマー MMETF2、 およ び HGHR4を用いた PCR法 （94° (：、 1分〜 55て、 1分〜 72° (：、 1分を 1サイクルとする 25サイクル反応） によって目的の DN A断片を 含むコロニーの検索を行った。 この P CRによって約 lkbの DNA断片の 増幅が認められたコロニーを選び、 これよりプラスミ ドを調製してプラス ミ ド pMHBと命名した。
3 gのプラスミ ド pMHBを BamH I、 Vspl (宝酒造社製） で消化し た後、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 約 2. 4kbに相当する DNA断片 をゲルより回収した。 該 DNA断片は mME Tプロモーター、 およびその 下流に位置する hGHをコードするゲノム DNAを含有し、 その両端には BamH I末端を有している。
レトロウィルスベクターである pEm iベクターは、 pLRNLベクター [Virologyゝ 第 171巻、 第 331頁 （1989) ] 由来の 2. 2kbSalI -Clal 断片と pBab e B l e oベクター [Nucl. Acids. Res.、 第 18巻、 第 35 87頁 （1990) ] 由来の 4. lkbClal— Sal I断片から構成されている。
7. 2〃gの pEm iベクターを BamH I消化し、 アルカリホスファタ一 ゼ （C I AP、 宝酒造社製） を用いて脱リン酸化した後、 ァガロースゲル 電気泳動を行い、 約 6. 3kbに相当する DN A断片をゲルより回収した。 このうち 5 Ongを上記の約 2. 4kbDNA断片 20 Ongと混合し、 DNA ライゲーシヨンキッ ト Ve r. 2を用いてライゲ一シヨンを行った後、 反応液の一部を用いてィー · コリ JM109を形質転換した。 得られた形 質転換体コロニーをいくつか選び、 プライマー HGHF4、 および pEm iベクター上のネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列より設計されたプライ マー NEOR 1 (配列表の配列番号 19にプライマ— NE ORの塩基配列 を示す） を用いた PCR法 （94°C、 1分〜 55て、 1分〜 72て、 2分 を 1サイクルとする 25サイクル反応） によって目的の DN A断片を含む コロニーの検索を行った。 この PCRによって約 1. 9kbの DNA断片の 増幅が認められたコロニーを選び、 これよりプラスミ ドを調製してプラス ミ ド pMHEと命名した。 プラスミ ド pMHEは raMETプロモーター下流 に位置する hGHをコ一ドするゲノム DNA、 および選択マーカーとして ネオマイシン耐性遺伝子を有するレ卜ロウィルスベクターである。
ブラスミ ド pMH E上の hG H遺伝子の hG H発現能力を以下に示す操作 により確認した。 すなわち、 N I HZ3T3細胞を 10% ゥシ胎児血清 (FCS、 大日本製薬社製） ならびに 100単位/ mlのペニシリ ンおよび 1◦ 0 gZmlのストレプトマイシン （共にギブコ社製） を含有するダル べッコ改変イーグル培地 （DMEM、 J RHバイオサイエンス社製） 中で 培養し、 70%コンフルェン 卜になった段階で DOT A Pトランスフエク ション液 （ベーリンガーマンハイム社製） とともに 10 gのプラスミ ド p MHEを加え、 細胞へのトランスフエクションを行った。 なお、 以降に D MEMと記載される培地はすべて上記同様に FC S、 ベニシリ ンおよびス トレブトマイシンを含むものである。 細胞をさらに上記の培地中で培養し た後、 羊土社、 1994年発行、 遺伝子導入と発現、 解析法、 第 74〜80頁に記 載の方法に従って G 418耐性細胞の選択を行った。 得られた G 418耐 性コロニーを新たなディ ッシュに移し、 終濃度 0. 7 SingZmlの G418 を含む上記の培地で 90%コンフルェントになるまで培養した。 続いて培 地を終濃度 100 Mの Z n S 04を含む上記の培地に交換し、 さらに 4 0時間培養した。 培養液上清を回収し、 0. 22 mのフィルター （ミ リ ポア社製） でろ過した後、 その 20/ 1を 15% SDS— PAGEに供し た。 このゲルについて力レント 'プロ トコール ·イン ·モレキュラー 'ノく ィォロジ一、 10.2.2〜10.2.10に記載の方法に従って抗ヒ ト成長ホルモン 抗体 （UCB バイオプロダクツ社製） を用いたウェスタンブロッテイン グを行った。 ポジティブコントロールとしては 1 zgの精製ヒ ト成長ホル モン （生化学工業社製） を用いた。 この結果、 培養液上清中に上記抗体と 反応する hGHが生成されていることが確認された。
(3) プロデューサー細胞の調製
hG H遺伝子の導入に使用するための組換えレトロウイルスを産生する プロデューサー細胞は、 上記のプラスミ ド pMHEをパッケージング細胞 〇？ + £— 86にトランスフエクションして調製した。 細胞のトランスフエ クションは上記の N I HZ3 T 3細胞へのトランスフヱクシヨンと同様の 操作で行った。 得られた G 418耐性コロニーの中から他のコロニーから 離れたもの 50個を選んで、 REALIZE INC.社発行、 動物細胞実用化マニュ アル、 第 88~89頁 （1984) に記載の方法で単離した。 単離した細胞をそれ ぞれ 90龍ディッシュ中で 90〜95%コンフルェントとなるまで培養し た後、 遠心分離によって回収した細胞よりゲノム DN Aを上記の方法で調 製した。 このゲノム DNAを铸型とし、 プライマー HGHF 4および NE OR 1を用いた PCR (94°C、 1分〜 55°C、 1分〜 72°C、 2分を 1 サイクルとする 25サイクル反応） を行い、 約 1. 9kbの DNA断片の増 幅が見られる細胞を選択した。 これらの細胞のゲノム DNA上には上記の プラスミ ド pMHEの DNAがィンテグレー卜されている。
得られたプロデューサー細胞のウィルス産生能を以下のようにして評価 した。 これらの細胞を 90匪ディッシュ中にセミコンフルェン卜に生育さ せた後、 ディッシュに 9mlの DMEMを添加して一夜培養し、 遠心分離を 行って上清を採集した。 採集した培地上清を 0. 45〃mのフィルター （ミ リポア社製） でろ過し、 ウィルス上清液とした。 これらのウィルス上清液 中のウィルスの力価は N I HZ3T 3細胞を使用して標準的な方法 [J. V irol.、 第 62巻、 第 1120〜1124頁 （1988) ] により測定した。 すなわち、 6ゥエルの組織培養プレート中に 1ゥエルあたりに 2000個の N I H/ 3T3細胞を含む DMEMを添加し、 一夜培養させた後、 段階希釈したゥ ィルス上清液を終濃度 7. 5 /g/mlのへキサジメ トリ ン ·プロミ ド （ポ リブレン ：アルドリッチ社製） と共に各ゥエルに加えた。 これを 37°Cで 24時間インキュベートした後、 培地を G418 (終濃度 0. 75mg/ml、 ギブコ社製） を含有するものと交換してさらにプレートをィンキュベート した。 10〜12日後に生育した G418耐性コロニーをクリスタルバイ ォレツ 卜で染色しその数を記録した。 ゥエルあたりのコロニー数にウィル ス上清液の希釈倍率を乗じた値より、 上清 1 ml当たりに含まれる感染性粒 子数 （cfuZml) を算出し、 これを上清液の力価として用いた。 得られた 細胞のうち、 上清液の力価のもっとも高いものを選んで以下の操作に使用 した。
実施例 3
(1) マウス骨髄細胞の調製
6週齢のマウス （C 3HZH e J ) 尾静脈より 15 Omg/kgの 5—フル ォロウラシル （5— FU、 アムレスコ社製） を投与し、 その 2日後に大腿 骨および肋骨を摘出して骨髄を採取した。 得られた骨髄をフィコール—ハ ィパク （密度 1.0875gZml、 フアルマシア社製） を用いた密度勾配遠心 分離に供し、 低密度単核細胞画分を調製してこれをマウス骨髄細胞とした。 マウス骨髄細胞はルスキー （Luskey) 等の方法 [Blood、 第 80巻、 第 396 頁 （1992) ] に従い、 レ トロウイルス感染前に予備刺激を行った。 すなわ ち、 20% FCS、 100単位 Zml組換えヒトインターロイキン一 6 (r hi L— 6、 アムジユン社製） 、 1 OOngZml組換えラッ ト幹細胞因子 [】 rSCF、 ぺプコテク （Pepco Tech)社製] 、 50単位 /mlのペニシリ ン および 50 z/gZmlのストレプトマイシンを含有する α— MEM (ギブコ 社製） 中に 1 X 106cells/mlの細胞密度で上記のマウス骨髄細胞を添加 し、 5% C02中、 37°Cで 48時間インキュベートした。 予備刺激した 細胞は容器に付着したものを含め、 ピぺッ トを用いて吸引、 採集した。
(2) 形質転換体マウスの作成
上記のマウス骨髄細胞を実施例 1一 （2) または実施例 2— （3) で調 製されたプロデューサー細胞とともに rhl L— 6、 rrS CF存在化におい て、 37°C、 24時間共培養した。 培養には上記の骨髄細胞の予備刺激に 用いられた培地を使用し、 さらに 7. 5 g/ffllのポリプレンを添加した。 培養後、 非接着性の細胞を採取してこれを遺伝子導入骨髄細胞とした。
6週齢の C3HZHe Jマウス尾静脈より、 上記の遺伝子導入骨髄細胞 を投与し、 さらにその 3日後、 再度遺伝子導入骨髄細胞を投与した。 また、 対照として骨髄細胞のかわりに生理食塩水を投与したマウスを準備し、 同 様に飼育した。 投与後、 mMETプロモーターを有する、 実施例 2— （3) で調製されたプロデューサー細胞で遺伝子導入された骨髄細胞を投与され たマウスには、 mMETプロモーターを誘導するために、 25mMの Z n S 〇4を含む水を与えた。
遺伝子導入骨髄細胞の投与後 3力月間、 マウス生体重量を測定した結果、 成長ホルモン遺伝子を導入された骨髄細胞を投与されたマウス群は、 対照 群 （平均 25g) に比べて有為に体重の増加が見られた。 さらに、 成長ホ ルモン遺伝子が mMETプロモーターの制御下にあり、 25mMの Z n S 04を含む水を与えられた群では、 さらなる体重増加が観察された。
以上記載したごとく、 本発明によれば、 仮親を使用することなく、 効率 よく成長形質転換体が提供できる。 当該形質転換体は成長性に優れ、 永続 的に成長ホルモンが発現することにより、 生体を短期間に巨大化すること ができる。
配列表 配列番号： 1
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列：
AGCATCCTAG AGTCCAGATT 20
配列番号： 2
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列：
TTCCAAACTG CTCAGAGTCC 20 配列番号： 3
配列の長さ ： 17
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 D N A
配列：
GGGGCAGGGA GGCACAG 17 配列番号： 4
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列：
ACAGGAGAGT GCAGCAGAGA 20 配列番号： 5
配列の長さ ： 758
配列の型：核酸
鎖の数： 2
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cD N A
配列：
AGCATCCTAG AGTCCAGATT CCAAACTGCT CAGAGTCCTG TGGACAGATC ACTGCTTGGC 60 AATGGCTACA GACTCTCGGA CCTCCTGGCT CCTGACCGTC AGCCTGCTCT GCCTGCTCTG 120 GCCTCAGGAG GCTAGTGCTT TTCCCGCCAT GCCCTTGTCC AGTCTGTTTT CTAATGCTGT 180 GCTCCGAGCC CAGCACCTGC ACCAGCTGGC TGCTGACACC TACAAAGAGT TCGAGCGTGC 240 CTACATTCCC GAGGGACAGC GCTATTCCAT TCAGAATGCC CAGGCTGCTT TCTGCTTCTC 300 AGAGACCATC CCGGCCCCCA CAGGCAAGGA GGAGGCCCAG CAGAGAACCG ACATGGAATT 360
GCTTCGCTTC TCGCTGCTGC TCATCCAGTC ATGGCTGGGG CCCGTGCAGT TCCTCAGCAG 420
GATTTTCACC AACAGCCTGA TGTTCGGCAC CTCGGACCGT GTCTATGAGA AACTGAAGGA 480
CCTGGAAGAG GGCATCCAGG CTCTGATGCA GGAGCTGGAA GATGGCAGCC CCCGTGTTGG 540
GCAGATCCTC AAGCAAACCT ATGACAAGTT TGACGCCAAC ATGCGCAGCG ACGACGCGCT 600
GCTCAAAAAC TATGGGCTGC TCTCCTGCTT CAAGAAGGAC CTGCACAAAG CGGAGACCTA 660
CCTGCGGGTC ATGAAGTGTC GCCGCTTTGT GGAAAGCAGC TGTGCCTTCT AGCCACTCAC 720
CAGTGTCTCT GCTGCACTCT CCTGTGCCTC CCTGCCCC 758 配列番号： 6
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列：
GGGATCCGTC ATCTTGTCTT CCA 23 配列番号： 7
配列の長さ ： 31
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列： AGCTTGGAAG ACAAGATGAC GGATCCCTGC A 31 配列番号： 8
配列の長さ ： 18
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列：
GGTAGCCGGA TCAAGCGT 18 配列番号： 9
配列の長さ ： 18
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列：
AACACGGCGG CATCAGAG 18 配列番号： 10
配列の長さ ： 296
配列の型：アミノ酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状 配列の種類：ぺプチド
配列：
Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro
1 5 10 15
Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr
20 25 30
Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met
35 40 45
Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser
50 55 60
Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu
65 70 75
Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr
80 85 90
Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala
95 100 105
Thr Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr
110 115 120 lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr
125 130 135
Pro lie Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie
140 145 150
Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr
155 160 165
Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser 170 175 180
Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr
185 190 195
Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie
200 205 210
Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg
215 220 225
Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie
230 235 240
Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala
245 250 255
Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys
260 265 270
Thr Asp Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu
275 280 285
His Gly Pro Glu lie Leu Asp Val Pro Ser Thr
290 295 配列番号： 11
配列の長さ ： 574
配列の型：アミノ酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列： Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg
1 5 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35 40 45
Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin
65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp
80 85 90
Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe
95 100 105
Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg
110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr, Asn Leu Thr
140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg
155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp
170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe
215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys
230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg
260 265 270
Thr Glu He Asp Lys Pro Ser Met Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp
275 280 285
Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp
290 295 300
Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr
305 310 315
Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro
320 325 330
Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys
335 340 345
Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg
350 355 360
Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro
365 370 375 Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie
380 385 390
Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp
395 400 405
Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Lys
410 415 420
Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr
425 430 435
Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser
440 445 450
Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser
455 460 465
Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser
470 475 480
Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr
485 490 495
Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg
500 505 510
Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr
515 520 525
Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser
530 535 540
Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr Asp Glu Leu Pro Gin Leu
545 550 555
Val Thr Leu Pro His Pro Asn leu His Gly Pro Glu lie Leu Asp 560 565 570
Val Pro Ser Thr 配列番号： 12
配列の長さ： 19
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸 （合成 D N A)
配列：
TCTCGTAAAC TCCAGAGCA 19 配列番号： 13
配列の長さ ： 18
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸 （合成 D N A)
配列：
GAGCCAGTCG TGCCAAAG 18 配列番号： 14
配列の長さ ： 18
配列の型：核酸
鎖の数： 1 トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸 （合成 D N A)
配列：
AAGACCAAGG ATCGGGAG 18 配列番号： 15
配列の長さ ： 420
配列の型：核酸
鎖の数： 2
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （P C R増幅 D N A断片）
配列：
TCTCGTAAAC TCCAGAGCAG CGATAGGCCG TAATATCGGG GAAAGCACTA TAGGGACATG 60 ATGTTCCACA CGTCACATGG GTCGTCCTAT CCGAGCCAGT CGTGCCAAAG GGGCGGTCCC 120 GCTGTGCACA CTGGCGCTCC AGGGAGCTCT GCACTCCGCC CGAAAAGTGC GCTCGGCTCT 180 GCCAGGACGC GGGGCGCGTG ACTATGCGTG GGCTGGAGCA ACCGCCTGCT GGGTGCAAAC 240 CCTTTGCGCC CGGACTCGTC CAACGACTAT AAAGAGGGCA GGCTGTCCTC TAAGCGTCAC 300 CACGACTTCA ACGTCCTGAG TACCTTCTCC TCACTTACTC CGTAGCTCCA GCTTCACCAG 360 ATCTCGGAAT GGACCCCAAC TGCTCCTGCT CCACCGGTAA GACTCCCGAT CCTTGGTCTT 420 配列番号： 16
配列の長さ ： 2160
配列の型：核酸
鎖の数： 2
トポロジー：直鎖状 配列の種類： genomic D N A
配列：
GGATCCCAAG GCCCAACTCC CCGAACCACT CAGGGTCCTG TGGACAGCTC ACCTAGCTGC 60 AATGGCTACA GGTAAGCGCC CCTAAAATCC CTTTGGCACA ATGTGTCCTG AGGGGAGAGG 120 CAGCGACCTG TAGATGGGAC GGGGGCACTA ACCCTCAGGG TTTGGGGTTC TGAATGTGAG 180 TATCGCCATC TAAGCCCAGT ATTTGGCCAA TCTCAGAAAG CTCCTGGCTC CCTGGAGGAT 240 GGAGAGAGAA AAACAAACAG CTCCTGGAGC AGGGAGAGTG TTGGCCTCTT GCTCTCCGGC 300 TCCCTCTGTT GCCCTCTGGT TTCTCCCCAG GCTCCCGGAC GTCCCTGCTC CTGGCTTTTG 360 GCCTGCTCTG CCTGCCCTGG CTTCAAGAGG GCAGTGCCTT CCCAACCATT CCCTTATCCA 420 GGCTTTTTGA CAACGCTATG CTCCGCGCCC ATCGTCTGCA CCAGCTGGCC TTTGACACCT 480 ACCAGGAGTT TGTAAGCTCT TGGGGAATGG GTGCGCATCA GGGGTGGCAG GAAGGGGTGA 540 CTTTCCCCCG CTGGAAATAA GAGGAGGAGA CTAAGGAGCT CAGGGTTTTT CCCGACCGCG 600 AAAATGCAGG CAGATGAGCA CACGCTGAGC TAGGTTCCCA GAAAAGTAAA ATGGGAGCAG 660 GTCTCAGCTC AGACCTTGGT GGGCGGTCCT TCTCCTAGGA AGAAGCCTAT ATCCCAAAGG 720 AACAGAAGTA TTCATTCCTG CAGAACCCCC AGACCTCCCT CTGTTTCTCA GAGTCTATTC 780 CGACACCCTC CAACAGGGAG GAAACACAAC AGAAATCCGT GAGTGGATGC CTTCTCCCCA 840 GGCGGGGATG GGGGAGACCT GTAGTCAGAG CCCCCGGGCA GCACAGCCAA TGCCCGTCCT 900 TGCCCCTGCA GAACCTAGAG CTGCTCCGCA TCTCCCTGCT GCTCATCCAG TCGTGGCTGG 960 AGCCCGTGCA GTTCCTCAGG AGTGTCTTCG CCAACAGCCT GGTGTACGGC GCCTCTGACA 1020 GCAACGTCTA TGACCTCCTA AAGGACCTAG AGGAAGGCAT CCAAACGCTG ATGGGGGTGA 1080 GGGTGGCGCC AGGGGTCCCC AATCCTGGAG CCCCACTGAC TTTGAGAGAC TGTGTTAGAG 1140 AAACACTGGC TGCCCTCTTT TTAGCAGTCA GGCCCTGACC CAAGAGAACT CACCTTATTC 1200 TTCATTTCCC CTCGTGAATC CTCCAGGCCT TTCTCTACAC TGAAGGGGAG GGAGGAAAAT 1260 GAATGAATGA GAAAGGGAGG GAACAGTACC CAAGCGCTTG GCCTCTCCTT CTCTTCCTTC 1320 ACTTTGCAGA GGCTGGAAGA TGGCAGCCCC CGGACTGGGC AGATCTTCAA GCAGACCTAC 1380 AGCAAGTTCG ACACAAACTC ACACAACGAT GACGCACTAC TCAAGAACTA CGGGCTGCTC 1440 TACTGCTTCA GGAAGGACAT GGACAAGGTC GAGACATTCC TGCGCATCGT GCAGTGCCGC 1500 TCTGTGGAGG GCAGCTGTGG CTTCTAGCTG CCCGGGTGGC ATCCCTGTGA CCCCTCCCCA 1560 GTGCCTCTCC TGGCCCTGGA AGTTGCCACT CCAGTGCCCA CCAGCCTTGT CCTAATAAAA 1620 TTAAGTTGCA TCATTTTGTC TGACTAGGTG TCCTTCTATA ATATTATGGG GTGGAGGGGG 1680 GTGGTATGGA GCAAGGGGCC CAAGTTGGGA AGACAACCTG TAGGGCCTGC GGGGTCTATT 1740 CGGGAACCAA GCTGGAGTGC AGTGGCACAA TCTTGGCTCA CTGCAATCTC CGCCTCCTGG 1800 GTTCAAGCGA TTCTCCTGCC TCAGCCTCCC GAGTTGTTGG GATTCCAGGC ATGCATGACC 1860 AGGCTCAGCT AATTTTTGTT TTTTTGGTAG AGACGGGGTT TCACCATATT GGCCAGGCTG 1920 GTCTCCAACT CCTAATCTCA GGTGATCTAC CCACCTTGGC CTCCCAAATT GCTGGGATTA 1980 CAGGCGTGAA CCACTGCTCC CTTCCCTGTC CTTCTGATTT TAAAATAACT ATACCAGCAG 2040 GAGGACGTCC AGACACAGCA TAGGCTACCT GCCATGGCCC AACCGGTGGG ACATTTGAGT 2100 TGCTTGCTTG GCACTGTCCT CTCATGCGTT GGGTCCACTC AGTAGATGCC TGTTGAATTC 2160 配列番号： 17
配列の長さ ： 19
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸 （合成 D N A)
配列：
TTCAAGCAGA CCTACAGCA 19 配列番号： 18
配列の長さ ： 17 配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸 （合成 D N A)
配列：
GAGGTCTGGG GGTTCTG 17 配列番号： 19
配列の長さ ： 18
配列の型：核酸
鎖の数： 1
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸 （合成 D NA)
配列：
GGTAGCCGGA TCAAGCGT 18

Claims

請 求 の 範 囲
1. 下記工程 （A) および （B) ：
(A) 成長ホルモンをコードする遺伝子を生体幹細胞に組み込む工程、 および
(B) (A)工程で得られる幹細胞を生体に導入する工程、
を包含する工程により得られる成長形質転換体。
2. 成長形質転換体が哺乳類、 鳥類、 爬虫類、 両生類または魚類である 請求項 1記載の成長形質転換体。
3. 生体幹細胞への成長ホルモンをコードする遺伝子の組込を、 レトロ ウィルスベクタ一を用いて行う請求項 1記載の成長形質転換体。
4. 下記工程 （A) 、 (B) および （C) ： '
(A) 成長ホルモンをコードする遺伝子を生体幹細胞に組み込む工程、
(B) (A)工程で得られる幹細胞を生体に導入する工程、 および
(C) (B)工程で得られる生体で成長ホルモンを発現させる工程、 を包含することを特徴とする成長形質転換体の製造方法。
5. 成長形質転換体が哺乳類、 鳥類、 爬虫類、 両生類または魚類である 請求項 4記載の成長形質転換体の製造方法。
6. 生体幹細胞への成長ホルモンをコードする遺伝子の組込を、 レトロ ウィルスベクターを用いて行う請求項 4記載の成長形質転換体の製造方法：
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