WO1997003190A1

WO1997003190A1 - PROTEINE HUMAINE SEMBLABLE A GALECTINE-4 ET ADNc CODANT CETTE PROTEINE

Info

Publication number: WO1997003190A1
Application number: PCT/JP1996/001899
Authority: WO
Inventors: Seishi Kato; Tomoko Yamaguchi; Shingo Sekine; Kouju Kamata
Original assignee: Sagami Chemical Research Center
Priority date: 1995-07-11
Filing date: 1996-07-09
Publication date: 1997-01-30
Also published as: EP0841393A4; EP0841393A1

Description

明細

ヒトガレクチン一 4様蛋白質およびそれをコードする cDNA 技術分野

本発明は、ヒト細胞内で繊している mRNAに由来する f¾¾DNA、およびそれがコ一ドするガレクチン一 4様蛋白質に関する。本発明のヒト cDNAは、 ii^:

用プローブ伝子治療用遺伝子源として用いることが出来る。また、該 cDNAがコ一ドしてし、る蛋白質をするため伝子源として用 L、ることが出来る。本発明白質は、医薬ゃ飄職のためのとして用、ることが出来る。景技術

ガレクチンはガラクトースと結合する¾¾レクチンの »である。■レクチンは細胞質、核、細臓表面なと様々な部位に存在し、細歸殖、分化、癌化、転移、嫉などに関与して t、ると考えられてし、る [Drickamer, K.， Annu. Rev. Cell Biol. , 9:237-264(1993):。この中で、ガレクチン一 4はラットの腸の抽出物中に多量に含まれているレクチンとして見いだされた。ガレクチン一 4は、胃や腸などの消化管に特異的に繊し、粘膜に多量に ί¾してし、ることから、これらの器官の ^t¾«fに^!欠な蛋白あると考えられている。これまでにラットからガレクチン一 4をコ一ドする cDNAがクローン化されて t、る力ぐ L0da, Y. et al.， J. Biol. Chen，268:5929-5939(1993)]、ヒトガレクチン一 4様蛋白質をコードする cDNAにっし、ての報告はなし、。発明の開示

本発明者ら (撒意研究 ©課、ガレクチン一 4様蛋白質をコードするヒト cDXA をクローン化し、本発明を誠した。すなわち、本発明は、ガレクチン一 4様蛋白ある、酉番号 1で表されるアミノ酸酉を^ 蛋白質を !1»る。また本発明は ±1己ァミノ翻」をコ一ドする cDNA及び、その具体例としての酉」番号 2又は 3で表される塩基 ffi^を^ d)Mを提供する。本発明のヒト cDNAは、ヒト細胞由 ^cDNAライブラリ一力ヽらク口一ン化することが出来る。こ ©cMAライブラリ一はヒト細ヽら抽出したポリ（A)+RNAを βとして腿する。ヒト細胞としては、人体から »などによって摘出されたものでも培翻胞でも良い。難例では胃織扁、ら単離したポリ (A)+RNAを用いた。 c DNA(½成にあたっては、岡山— Berg法 [OkayamaJ. and Berg, P. , Mol. Cell. Biol. ' 2: 161-170(1982)], Gubler- Hoffman法 [Gubler, U. and Hoffman, J. Gene, 25 :263 - 269(1983)]などし、かなる方法を用し、てもよ t、が、長ク口一ンを効率的に得るためには、雄例にあげたようなキヤッビング法 [Kato， S. et al.， Gene, 150:243-250(1994)]を用いることか望ましい。 cDNAの同定は、シ一ゲンシングによる全塩翻 ijの、

る白質の^^、インビトロ翻訳による蛋白質皿：«菌による発の定によって行なう。 S1¾』定は、ラクトースとの結合能を鶴忍することによって行なう。

本発明の cDNAは、酉 ϋ番号 1で表されるアミノ酸酉 2 ^をコードする塩基酉」、例えば」番号 2で表される塩翻 3^を含むこと纖とするものである。例えば、酉リ番号 3で表されるものは、 1113bpからなる塩基酉」を有し、 972bpのォ —プンリ一ディングフレームを有して t、る。このオープンリ一ディングフレームは、 323アミノ^ ¾からなる蛋白質をコードしている。こ白質はアミノ酸酉 B^IJレベルでラットガレクチン一 4と 76. 3%という高 « (性を有している。なお、

に基づし、て合成したォリゴヌクレォチドプローブを用し、て、胃臌膽あるし、は胃腸由細胞、らしたヒト cD NAライブラリ一をスクリーニンク、'することにより、本発明の cDNAと同一のクロ一ンを容易に得ることが出来る。

にヒト遺伝子は個体差による多勸纖に認られる。従って酉噃号 1 で表されるアミノ酸酉』をコードする塩翻』あるいは酉噃号 3において、 1 又は »固のヌクレオチドの口、欠失および Z又は他のヌクレオチドによる置 ^^なされてし、る cDNAも本発明の範疇にはし、る。

同様に、これらの^!によって生じる、 1又は観固のアミノ酸の 0、欠失および Z又は他のアミノ酸による^^なされている蛋白質も、本発明の範疇に入る。本発明 ©cDNAには、 E^j番号 2あるいは 3で表される塩 ^の、かなる部分塩翻を^ d)M断片 (10bp以上)も含まれる。また、センス鎖およびアンチセンス嶽ヽらなる DNA断片もこの範疇にはし、る。これらの DNA断片 (άϋ伝子囊用のプローブとして用 t、ることカ^きる。

本発明白質は、本発明 0cDNAを有するベクターからインビトロ転写によつて R Aを調製し、これ^ «としてィンビト口翻訳を行なうことによりインビト口で^ ¾出来る。また翻訳 H域を ^0の方法を用 t、て適当な^ ¾ベクターにえることにより、菌、枯^ ¾、酵母、 ¾5f¾ffl胞等で、コードしている蛋白質をに繊させることもできる。ある、は下記 E^J表に^"ァミノ酸酉 5?iJに基づき、ィ合成によってペプチドを調製することも出来る。

本発明白質の範囲には、ラクト一ス結合を有するものであれば、他の任意白質との ¾^蛋白質も含まれる。例えば、鍾例に举； fたマルト—ス結合蛋白質との ΐ! ^蛋白質力示できる。図面の簡単な説明

図 1 (i*発明のプラスミド PHP01049の構造を。

図 2 (i*発明の；^菌用^ ¾ベクター pMKGAL4の構造を^"。発明を鎌するための: の形態

次に錢例により発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例にされるものではない。 DNA©« ^に関する的な樹乍および素 maま、 ¾

L Molecular Cloning. A Laboratory Manual， Cold spring Harbor Laboratory, 1989]に従った。制限酵素および各種修飾酵素は、特に言 S ^の無合、宝酷謂のものを用いた。髓素讓城、並びに跡細ま付属の説明書に従った。 cDNA合成は [Kato, S. et al.， Gene, 150 :243-250(1994)]に従った。ポリ (A) +脆の調製

ヒ卜胃 Wlgを 5. 5Mグァニジゥムチオシァネ一ト^ ¾20ml中でホモジナイズした後、；5¾[0kayama、H. et al. , Methods in Enzymology" Vol. 164, Academic Press, 1987]に従い、 750 g©niRNAを調製した。これを 20mMトリス^ «衝液 (pH 7. 6)、 0. 5 NaCl、 ImM EDTA ¾^したオリゴ dTセノレロースカラムにかけ、上掲 «に従いポリ (A)+RNA l(^gを得た。 cDNAライブラリーの

±1己ポリ（A)⁺RNA 10 gを lOOmMトリス^ g衝液 (pH 8)に溶解し、 RNaseを含まないバクテリア由来アルカリホスファタ一ゼ 1単位を翻 13し、 37°C1時間させた。 SiT液をフエノール抽出後、ェタノ一ノ ¾ ^を行ない、ペレツ卜を 50mM 薩ナトリウム (pH 6)、 ImM EDTA、 0. 1% 2-メノレカプトエタノール、 0. 01% Triton X-100 に溶解した。これに、タバコ由ピロホスファタ一ゼ (ェピセンタ一テクノロジ一ズ機) 1単位を励 Dして、総量 100 // 1で 37°C1時間させた。反応液をフエノール抽出後、エタノール «を行ない、ペレツトを水に溶解し、脱キヤップ処理したポリ（A) +RNA ' を得た。

脱キヤップしたポリ（A)⁺RNA、 DNA-RNAキメラオリゴヌクレオチド

(5， -dG-dG-dG-dG-dA-dA-dT-dT-dC-dG-dA-G-G-A-3' )3nmolを 50mM トリス^ ϋ衝液 (pH 7. 5)、 0. 5mM ATP, 5mM MgCl₂、 lOmM 2-メルカプトエタノーノレ、 25%ポリエチレングリコール水滅に溶解し、 T4RNAリガーゼ 50単位を添加し、総量 30 μ.1 で 20°C12時間させた。 ®Τ液をフエノール抽出後、エタノール «を行ない、ペレツトを水に溶解し、キメラオリゴキヤップ口ポリ（A)+RNAを得た。

本発明者らが開発したベクター pKAKEP 426455-A)を Kpnlで消化後、 «転移酵素により約 60個の dTテールを^ ¾口した。これを EcoRV消化して片側 ®dTテールを除去したものをべクタ一プライマーとして用いた。

先に調製したキメラオリゴキヤップ^ J口ポリ（A)+RNA 6 ^gを、ベクタ一プライマ一 1. 2 /gとァニールさせた後、 50mM トリス^ g衝液 (pH 8. 3)、 75mM KC1、 3m MgCl₂、 lOmMジチオスレィト一ル、 1. 25mM dNTP(dATP+dCTP+dGTP+dTTP)^¾ に溶解し、逆転 GIBC0-BRL機) 200単位を ^!JDし、 ΙΚϋ 1で 42°C1時間させた。 ίΤ液をフヱノール抽出後、エタノールを行ない、ペレツ卜を 50mMトリス ¾^ 衝液 (ρΗ 7. 5)、 lOOmM NaCl、 lOmM MgCl₂、 lmMジチオスレィトール碰に溶解した。これ i oRI 100単位を黝 Πし、 *1¾20 1で 37°C1時間反応させた。液をフエノール抽出後、エタノールを行ない、ペレツトを 20 mMトリス塩腿衝液 (pH 7. 5)、 lOOmM KC1、 4mM MgCl₂、 lOmM (NH₄)₂S0₄、 50 /ml牛血清アルブミン鎌に溶解した。これに藤 Mリガーゼ 60単位を励 Π し、 16°C16時間 ®Sさせた。に 2mM d TP ； ^藤 NAポリメラ一ゼ I 4単位、 ^¾R aseH 0. 1単位を'¾¾し、 12°C1時間ついで 22°C1時間させた。次、で cMA合^ ®Τ液を用し、て^^ S H12S(GIBC0 - BRL機)の形を行なつた。形辦通はエレクトロポレーシヨン法によって行なった。 i o - 部を 100 g/ml了ンピシリン含^ 2xYT寒天培に蒔、て 37°C—鴨養した。寒に生じた任意のコロニーを拾、100 g/mlアンピシリン含有 2xYTig¾2mlに接種して 37°C2時間 ί咅 «¾、ヘルパーファージ ΜΚ13Κ〇7(フアルマシア社)をさせ、さらに 37°c—？^音養した。 ±咅養液を遠心して、菌体と ±mに分け、菌体からはアルカリリシス法により 2本鎖プラスミド Aを、勖、らは常法に従本鎖ファージ DNAを単離した。 2本鎖プラスミド MA(iEcoRIと Notlで二重消化した後、 0. 8%ァガロースゲル 7j動を行な ;DNAィンサ一卜の大きさを求めた。一方一本鎖ファージ]) NAは、で; Sし cM13ュくーサルプライマーと Taqポリメラ一ゼ (アプライドバイォシステムズ機キッ卜）を用いてシーケンスを行なった後、 ¾¾DNAシーケンサ一 (アプライドバイォシステムズ社)にかけて cDNA の 5' 勺 400bpの塩基をした。デ一夕はホモ .プロティン cDNAバンクデータベースとしてファイル化した。 cDNAクローニング

±l£cDNAラィブラリ一から任意に尺したクロ一ンの塩基酉 £ ^ を行な I \ 得られた塩基酉を 3フレームのアミノ酸酉」にした後、これらの酉でプ口ティンデータべ一スを髓した。騰ソフ卜ウェアは GENETYX- C (ソフトウェァ開 fc )を用いた。そ果、クローン HP01049がコードしている蛋白質は、ラットガレクチン- 4とァミノ翻」レベルで翻以性を有していることカ绊 IJ明した c このク口一ンのネ冓造を図 1に^ T cDNAィンサート© ^塩 SIS ^をしたところ、 56bpの 5'非翻訳領 972bpのオープンリーディングフレーム、 85bpの 3'非翻訳領域、 37bpのポリ (A)テーノ Wヽらなる構造を有していた (酉洌番号 3 )。ォープンリ一ディングフレームは 323アミノ^ ¾からなる蛋白質をコードしており、この酉 ijを用いてプロテインデータベースを職したところ、頁域にわたってラッ卜ガレクチン- 4のアミノ酸酉洌と 76.3 という高し潮以性を有していた。表 1 に、本発明のヒ卜ガレクチン- 4様蛋白質 (HS)とラッ卜ガレクチン- 4(RN)のァミノ酸酉』の J ^を^ Τ。 -(マ付ス)はギャップを、アスタリスク) (±Φ発明白質と同一ァミノ^ sを、 .（ドット) (鉢発明白質と翻以ァミノ«¾をそれそ'; n¾す。表 1

HS MAYVPAPGYQPTYNPTLPYYQPIPGGL腿 SVYIQGVASEHM隱爾 VGQDPGSDV

RN AYVPAPGYQPWTLPYKRPIPGGLSVGMSIYIQGIAKDNMRRFHVNFAVGQDEGADI HS AFHFNPRFDGWDKVVFNTLQGGKWGSEERKRS PFKKGAAFELVFIVLAEHYKWVNGNP

RN AFHFNPRFDGWDK謂 TMQSGQWGKEEK匪 PFQKGHHFELVF薩 SEHYKWV GTP

HS FYEYGHRLPLQMVTHLQVDGDLQLQSINFIGGQPLRPQ- -GPPMMPPYPGPGHCHQQL S

RN FYEYG匿撃職 VDGDLELQSINFLGGQPAASQYPGTMTIPAYPSAGYNP唯' S

HS LPTMEGPPTFNPPVPYFGRLQGGLTARRTI I I GYVPPTGKSFAINFKVGSSGDIALHIN

RN LPVMAGPPIFNPPVPYVGTLQGGLTARRTI I IKGYVLPTAKNLI INFKVGSTGDI AFHMN HS PRMGNGTWRNSLLNGSWGSEEKKITHNPFGPGQFFDLSIRCGLDRFKVYANGQHLFDFA

RN PRIGD-CWRNSYMNGSWGSEERKIPYNPFGAGQFFDLSIRCGTDRFKVFANGQHLFDFS

HS HRLSAFQRVDTLEIQGDVTLSYVQI

RN HRFQAFQRVDMLEIKGDITLSYVQI

を^^しだ結果、 ESTデータベースの中に酉」番号 3で表される本発明 ©cDMの 3' 非翻訳領域 (1022番目から 1113番目）と部分的に^ Tる cDNAの部^ g ^Accession NO. D255T7)力観されていること力かった。ただし、部^！」が^ るからといって、この断片と本発明の : ¾DMが同じ mRNAに由来するという保証はな t、。またこの酉 IJからだけでは、コードして、るかもしれな白質のァミノ酸酉碰びに難はわからなしヽ。インビトロ翻訳による蛋白質合成

本発明 ©c Aを有するベクタ一 pHP01049を用し、て、 T_NTゥサギ糸 ffi^血球溶解物キット（プロメガ機)によるインビ卜ロ翻訳を行なった。この際 [³⁵S]メチォニンを黝 Πし、 ¾¾¾ /をラジオァイソトー ^'ラベノレした。い "T lのもキッ卜に付属のプロトコ一ルに従って行なった。プラスミド PHP01049 2 gを、 TJ ウサ^ ¾赫血球溶勵 50 1、緩衝液 (キッ卜に付属) 4 1、アミノ酸昆合液 (メチォニンを含まない) 2 1、 [³⁵S]メチォニン (アマ一シャム社) 8 l(0. 37MBq 1 )、 T7RNAポリメラ一ゼ 2 1、 RNasin 80Uを含む総量 100 1の SJ¾中で 30°Cで分間させた。 1に SDSサンプリングノく、ソファー (125πιΜトリス^ g 衝液、 pH6. 8、 120mM 2 メルカプトエタノーノレ、 2% SDS 、 0. 025%ブロモフエノールブル一、 20%グリセ口一ノレ) 2 1を加え、 95°C3分間加 «Sした後、 SDS- ポリアクリルアミドゲノ^^永動にかけた。ォ一トラジォグラフィ—を行な、、翻 IR¾ /の好量を求めた結果、本発明の cDNAは、好翻 6k aの翻を «した。こ 0{直は、酉噃号 3で表される塩基酉から予想される蛋白質の予想好量 35940と一致し、この cDNA力秦ヽに E^J番号 3で表される蛋白質をコ一ドしていること力示された。インビト口翻!^物のラクト一ス結合活 [^測定

セファロース 4Bゲソ濁液 (ファゾレマシア社) 100mlを 0. 5M炭酸ナ卜リゥムで十分離した後、 100mlの 0. 5M離ナトリウムに懸濁した。これにビニルスルホン 10mlを動口し、室温で 1時間かに辦した。ゲルを 0. 5M碰ナトリウムで洗浄した後、 10%ラクトース、 0. 5M炭酸ナ卜リゥム -碰に懸濁し室温で一晩 »力、に辦した。ゲルを 0. 5M匿ナトリゥム、 7j、 0. 05Mリン隨衝液 (_PH 7. 0)で-順 m 。得られたラクト一ス固定化セファロース 4Bゲルは、 0. 02%アジ化ナ卜リゥムを^ 0. 05Mリン衝液 (pH 7. 0)中、 4°Cで保存した。

インビ卜口翻 irar液 loo μ ιをセフアデックス cにかけて、 ^^の [ ³⁵s] メチォニンを除去し、 36kDaの翻を^ 画分をた。この鎌を先に調製したラクトース固定化セファロース 4Bカラム (べッド^ ¾4 5ml)にかけ、ラクトースカラム用カラム緩衝液 (20mMトリス^ i衝液、 pH 7.5、 2m EDTA、 150m NaCU4mM 2 -メルカプトエタノ一ゾレ、 0. 01% Triton X- 100)20mlで游後、 0. 3Mラクトースを^:カラム緩謹 0mlで溶出した。そ 0 ¾果、溶出画分に 36kDaの翻が含まれていることから、本発明 ©S白質はラクトース結合能を有すること;^示された。菌による ¾^蛋白質

プラスミド pHP01049 1 gを、 20単位の Not Iで消化した後、クレノウ処理により平滑 ¾f匕を行なった。ついで Pstiで消ィ匕した後、 ι¾

動にかけ、 1. 2kbpの D 断片をゲノ^ヽら切り出した。

次ゝで pMAL™ - c2(ニューィングランくィオラボス社) 1 gを、 20単位の Hindi 11 で消化した後、クレノウ処理により平滑 «f匕をょつた。ついで Pstlで消化した後、 1%ァガ口一スゲノ U¾ ^永動にかけ、 6.7kbpの DM断片をゲノ! ^、ら切り出した。ベクタ一断片と cDNA断片をライゲ一シヨンキットにより連碰、 ¾¾J 109 を形質車適した。形質車激 ί本からプラスミド pMALGA を調製し、制限酵附也図により目的とする 1 ^体を鶴忍した。

pMALGAL4/JM109C ~^¾t咅鎌 10mlを 100 g/mlアンピシリン含有リツチ培地 (1 リットル当たりトリプトン 10g、酵母抽出物 5g、 NaCl 5g、グルコース 2gを含む) 500mlに懸濁し、 37°Cで養し、 A₆₀₀か約 0. 5になったときにイソプロピルチオガラクトシドをになるように添加した。さらに 37°Cで 3時間培鐘、遠心によって集菌し、菌体をアミロースカラム用カラム緩衝液 GOmMトリス髓、 pH 7.4、 200mM NaCl、 ImM EDTA)25mlに懸濁した。この鎌を超後、遠心し、上澄をべッド容積 3. 5mlのァミロースカラム (ニューィングランくィォラボス社) (こかけた。力ラム體の 8倍量の力ラソファーでカラムを'勝後、 lOmMマルトースを^ 、カラム緩衝淑 Omlでマルト一ス結合蛋白質/ガレクチン- 4 羅白質！^蛋白質を溶出し、 10. 9mgの 1^蛋白質を得た。 1^蛋白質を SDS-ポリアクリルアミド m ^動にかけたところ、約 81kDacZ i置に単一のバンドか認められた。こ量輔は、マルトース結合蛋白質/ガレクチン- 4酷蛋白質の予想、量と^ る。蛋白質のラクト一ス結合 ¾¾¾定

±1己で調製した ΐ½·蛋白質を、先に調製したラクトース固定化セファロース 4Β カラム (べッド容積 4. 5ml)にかけ、ラクト一スカラム用カラム緩衝 ¾20ml » 後、 0. 3Mラクトースを^ ί;カラム緩 «20mlで溶出した。溶出してきた蛋白質を SDS-ポリアクリノレァミド€^繊にかけたところ、 81kDa® i置に単一のノくンド力 Wfeられたこと力ヽら、菌でさせて得られたマルト一ス結合蛋白質/ガレクチン- 4 蛋白質は、ラクト一ス結合活性を有すること力示された。 ^菌によるガレクチン- 4様蛋白質 g)^¾

プラスミド pHP01049 l gを、 20単位の Notlで消化した後、クレノウ βにより平滑繊匕を行なった。ついで Aatllで消ィ匕した後、 0. 8%ァガ口一スゲノ^ ¾ 泳動にかけ、約 lkbpの DNA断片をゲノ^、ら切り出した。ついで、 tacプロモ一夕一、メタピロカテカーゼの SDE^、 rrnBTlT2夕一ミネーターを有する ^菌用 ¾1ベクター pMPRA3( Japan Kokai Tokkyo koho, Jp 02, 182186)1 gを 20単位の Aatl Iと Smalで消ィ匕した後、 0.8%ァガ口一スゲノ永動にかけ、糸 8kbpの DNA断片をゲノ^)ヽら切り出した。両者の DNA断片をライゲーシヨンキットにより連後、大腸菌 JM109を形した。形体からプラスミド pffiGA - Aatllを調製し、制限酵„ 図により目的とする組体を確認した。

2本のオリゴヌクレオチドプライマ一 PR1(5' -GGGACGTCATGGCCTATGTCCCCGCACC- 3' ) と PR2(5' -GGCGACGTCTGAGCCCGGATCCTGCCC-3' )を DNA自動合謹アプライドバイォシステムズ社)により付属のプロ卜コールに従洽成した。プラスミド pHP01049 を lngとプライマ一 PR1、 PR2それぞれ lOOpmoleを用いて、 PCRキット (宝 St社)により cDMの 5' 掘訳領域を増幅した。フエノール抽出、エタノール »¾、 20単位の Aatn (纖方)で消化し、

約 190bpの DM断片をゲノ I ^ヽら切り出し精製した。プラスミド pMKGAL4- Aatll 1 zgを、 20単位の Aat IIで消化した後、 1 ァガ口一

3. 8kbpの DM断片をゲノヽら切り出した。この]) NA断片と先に PCRによって調製した約 190bpの DNA断片を、ライゲーシヨンキッ卜により連 T後、菌 JM109を形した。形ヽらプラスミド PMKGAL4を調製し、制限酵翻繊図により目的とする mi体を磁忍した。得られたプラスミドの構造を図 2に^ "T。

PMKGAU/JM109のー咅養液 10mlを 100 g/mlアンピシリン含 Β培 ¾100mlに懸濁し、 37°Cで膠咅養し、 A₆₀₀カ^ J0. 5になったときにイソプロピノォガラクトシドを ImMになるように勵口した。さらに 37°Cで 3B#^培難、遠心によつて集菌し、菌体をラク卜ースカラム用カラム緩謹 5mlに懸濁した。この'職を超舰理後、遠心し、 ±ϋを先に調製したラクト一ス固定化セファロ一ス 4Β力ラム (べッド容積 4. 5ml)にかけ、ラクト一スカラム用カラム緩衝 ¾20mlで洗浄後、 0. 3Mラク卜ースを^、カラム i «20mlで溶出した。溶出してきた蛋白質を SDS- ポリアクリルアミド¾^7漏にかけたところ、 36kDa© &置に単一のバンドか忍められた。こ量直は、ヒトガレクチン- 4様蛋白質の予想^ "量とる。すなわち、 ^^菌でさせたヒトガレクチン- 4様蛋白質はラクトース結合活性を有すること力く示された。産^ の利用可能 1¾

本発明はガレクチン- 4様蛋白質をコ一ドするヒト cDNA、このヒト cDNAがコ一ドする蛋白質をする。本発明の cDNAを用いることにより、蛋白質を大量に繊することかできる。識贩蛋白質は、錢、特に消化管用医薬として、あるいは if¾ffl纖、特に HI ^纖として利用すること力、できる。酉麵号： 1

酉秦長さ： 323

酉 ijの型：アミノ酸

酉洌の観：タンパク質

酉洌

Met Ala Tyr Val Pro Ala Pro Gly Tyr Gin Pro Thr Tyr Asn Pro Thr

1 5 10 15

Leu Pro Tyr Tyr Gin Pro lie Pro Gly Gly Leu Asn Val Gly Met Ser

20 25 30

Val Tyr lie Gin Gly Val Ala Ser Glu His Met Lys Arg Phe Phe Val

35 40 45

Asn Phe Val Val Gly Gin Asp Pro Gly Ser Asp Val Ala Phe His Phe

50 55 60

Asn Pro Arg Phe Asp Gly Trp Asp Lys Val Val Phe Asn Thr Leu Gin 65 70 75 80

Gly Gly Lys Trp Gly Ser Glu Glu Arg Lys Arg Ser Met Pro Phe Lys

85 90 95

Lys Gly Ala Ala Phe Glu Leu Val Phe lie Val Leu Ala Glu His Tyr

100 105 110

Lys Val Val Val Asn Gly Asn Pro Phe Tyr Glu Tyr Gly His Arg Leu

115 120 125

Pro Leu Gin Met Val Thr His Leu Gin Val Asp Gly Asp Leu Gin Leu

130 135 140

Gin Ser lie Asn Phe lie Gly Gly Gin Pro Leu Arg Pro Gin Gly Pro 145 150 155 160

Pro Met Met Pro Pro Tyr Pro Gly Pro Gly His Cys His Gin Gin Leu

165 170 175

Asn Ser Leu Pro Thr Met Glu Gly Pro Pro Thr Phe Asn Pro Pro Val

180 185 190

Pro Tyr Phe Gly Arg Leu Gin Gly Gly Leu Thr Ala Arg Arg Thr lie 195 200 205 lie lie Lys Gly Tyr Val Pro Pro Thr Gly Lys Ser Phe Ala lie Asn

210 215 220

Phe Lys Val Gly Ser Ser Gly Asp lie Ala Leu His lie Asn Pro Arg

225 230 235 240

Met Gly Asn Gly Thr Val Val Arg Asn Ser Leu Leu Asn Gly Ser Trp

245 250 255

Gly Ser Glu Glu Lys Lys lie Thr His Asn Pro Phe Gly Pro Gly Gin

260 265 270

Phe Phe Asp Leu Ser lie Arg Cys Gly Leu Asp Arg Phe Lys Val Tyr

275 280 285

Ala Asn Gly Gin His Leu Phe Asp Phe Ala His Arg Leu Ser Ala Phe

290 295 300

Gin Arg Val Asp Thr Leu Glu lie Gin Gly Asp Val Thr Leu Ser Tyr

305 310 315 320

Val Gin lie 酉号： 2

： 969

酉 3 ^の型：核酸

mm .- ニネ鎖

トポロジー：状

酉 3 ^の翻： cDNA to mRNA

應：

m

ATGGCCTATG TCCCCGCACC GGGCTACCAG CCCACCTACA ACCCGACGCT GCOTACTAC 60 CAGCCCATCC CGGGCGGGCT CAACGTGGGA ATGTCTGTTT ACATOCMGG AGTGGCCAGC 120 GAGCACATGA AGCGGTTCTT CGTGAACTIT GTGGTTGGGC AGGATCCGGG CTCAGACGTC 180 GCCTTCCACT TCAATCCGCG GTnGACGGC TGGGACAAGG TGGTCTTCM CACGTTGCAG 240 GGCGGGAAGT GGGGCAGCGA GGAGAGGAAG AGGAGCATGC CCTTCAAAAA GGGTGCCGCC 300 mGAGCTGG TCTTCATAGT CCTGGCTGAG CACTACAAGG TGGTGGTAAA TGGAAATCCC 360

TTCTATGAGT ACGGGCACCG GCnCCCCTA CAGATGGTCA CCCACCTGCA AGTGGATGGG 420

GATCTGCAAC TTCAATCAAT CAACTTCATC GGAGGCCAGC CCCTCCGGCC CCAGGGACCC 480

CCGATGATGC CACCTTACCC TGGTCCCGGA CAHGCCATC AACAGCTGAA CAGCCTGCCC 540 ACCATGGAAG GACCCCCAAC CTTCAACCCG CCTGTGCCAT ATTTCGGGAG GCTGCAAGGA 600

GGGCTCACAG CTCGAAGAAC CATCATCATC AAGGGCTATG TGCCTCCCAC AGGCAAGAGC 660

THGCTATCA ACTTCAAGGT GGGCTCCTCA GGGGACATAG CTCTGCACAT TAATCCCCGC 720

ATGGGCAACG GTACCGTGGT CCGGAACAGC CHCTGAATG GCTCGTGGGG ATCCGAGGAG 780

AAGAAGATCA CCCACAACCC AT TGGTCCC GGACAGTTCT HGATCTGTC CATTCGCTGT 840 GGCTTGGATC GCTTCAAGGT nACGCCAAT GGCCAGCACC TCTTTGACH TGCCCATCGC 900

CTCTCGGCCT TCCAGAGGGT GGACACAHG GAAATCCAGG GTGATGTCAC OTGTCCTAT 960

GTCCAGATC 969 酉洌番号： 3

酉の長さ： 1113

酉秦型：核酸

mm：

トポロジー：直鎖状

酉」の： cDNA to mRNA

：

生物名：ホモ-サピエンス

細胞の觀：胃攝赚

クローン名： HP01049

mmm：

髓を表す記号： CDS

存在位置： 57.. 1029

髓をした方法： E

酉洌

ATCTCCCACT CCTGCAGCTC TTCTCACAGG ACCAGCTACT AGCGCAGCCT CGAGCG ATG 59

Met

1 GCC TAT GTC CCC GCA CCG GGC TAC CAG CCC ACC TAC AAC CCG ACG CTG 107 Ala Tyr Val Pro Ala Pro Gly Tyr Gin Pro Thr Tyr Asn Pro Thr Leu

5 10 15

CCT TAC TAC CAG CCC ATC CCG GGC GGG CTC AAC GTG GGA ATG TCT GH 155 Pro Tyr Tyr Gin Pro lie Pro Gly Gly Leu Asn Val Gly Met Ser Val

20 25 30

TAC ATC CAA GGA GTG GCC AGC GAG CAC ATG AAG CGG TTC TTC GTG AAC 203 Tyr He. Gin Gly Val Ala Ser Glu His Met Lys Arg Phe Phe Val Asn

35 40 45

TTT GTG GTT GGG CAG GAT CCG GGC TCA GAC GTC GCC TTC CAC TTC AAT 251 Phe Val Val Gly Gin Asp Pro Gly Ser Asp Val Ala Phe His Phe Asn

50 55 60 65

CCG CGG ΤΠ GAC GGC TGG GAC AAG GTG GTC TTC AAC ACG nG CAG GGC 299 Pro Arg Phe Asp Gly Trp Asp Lys Val Val Phe Asn Thr Leu Gin Gly

70 75 80

GGG AAG TGG GGC AGC GAG GAG AGG AAG AGG AGC ATG CCC TTC AAA AAG 347 Gly Lys Trp Gly Ser Glu Glu Arg Lys Arg Ser Met Pro Phe Lys Lys

85 90 95

GGT GCC GCC TTT GAG CTG GTC TTC ATA GTC CTG GCT GAG CAC TAC AAG 395 Gly Ala Ala Phe Glu Leu Val Phe lie Val Leu Ala Glu His Tyr Lys

100 105 110

GTG GTG GTA AAT GGA AAT CCC TTC TAT GAG TAC GGG CAC CGG CTT CCC 443 Val Val Val Asn Gly Asn Pro Phe Tyr Glu Tyr Gly His Arg Leu Pro

115 120 125

CTA CAG ATG GTC ACC CAC CTG CAA GTG GAT GGG GAT CTG CAA CTT CAA 491 Leu Gin Met Val Thr His Leu Gin Val Asp Gly Asp Leu Gin Leu Gin

130 135 140 145

TCA ATC AAC TTC ATC GGA GGC CAG CCC CTC CGG CCC CAG GGA CCC CCG 539 Ser lie Asn Phe lie Gly Gly Gin Pro Leu Arg Pro Gin Gly Pro Pro

150 155 160 9ΐε οιε οε ΐ¾ ^{J J3}S Π9ΐ J¾ l dsy 3 "TO ^TI "TO ^ュ¾ dsy ΐ¾ V 6101 310 XVI 331 OIL 33V 3X0 IVO 109 0V3 OIV WO Oil V3V 3V0 010 09V

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02 002 961

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S89 3IV OIV 33V V3V V93丄 39 VOV 313 933 VOO VV3 9 99V 393 OIL IVI

061 581 081

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529 V33 010 X33 333 3W 3X1 03V V33 330 V09 VV9 9IV 30V 333 9X3 39V

LI Oil S9I usy "97 "TO ；） STH s STH ^13 o ¾ OJJ αΑ OJJ o_¾ Θ« I

OW 310 9V3 VV3 IVO OOI IVO V09 33D 100 133 3VI丄 33 V33 3XV 3XV 68lO/96df/IDJ 06I£0/ 6 OAV

≤ ΐ CAG ATC TAATCTATTC CTGGGGCCAT AACTCATGGG AAAACAGAAT TATCC 1070 Gin He

CCTAGGACTC CTTTCTAAGC CCCTAATAAA ATGTCTGAGG GTG 1113

Claims

請求の範囲

1. 酉洌番号 1で表される了ミノ酸酉洌を^;蛋白質。

2. 酉 IJ番号 1で表されるアミノ酸酉 B?lJをコードする c D NA。

3. 酉番号 2で表される塩勘を^;、請求項 2言 ¾feの c DNAo

4. 酉 I墦号 3で表される塩 Sie^からなる、請求項 3言¾¾の c DNA_C