WO1997001628A1

WO1997001628A1 - Milieu liquide destine a des cellules nerveuses, son procede de production et procede d'incubation de cellules nerveuses dans ce milieu

Info

Publication number: WO1997001628A1
Application number: PCT/JP1996/001764
Authority: WO
Inventors: Yoshiaki Watanabe
Original assignee: Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
Priority date: 1995-06-27
Filing date: 1996-06-26
Publication date: 1997-01-16
Also published as: EP0776968A1; EP0776968A4; JPH09289891A; EP0776968B1; DE69633604T2; JP3093974B2; DE69633604D1; US6376238B1

Description

明細書神経細胞用培養液、その製造方法及びこれを用いる神経細胞の培養方法技術分野

本発明は、神経細胞の培養に用いるための培養液、当該培養液の製造方法、及びこれを用いる神経細胞の培養方法に関する。景技術

神経細胞を生体外で培養するために、古くから幾多の検討がなされてきた。神経成長因子（N G F) の発見は、神経細胞に特異的に働く因子のはじめての発見であり、神経生物学の分野に大きな影響を与えた。神経細胞の培養に於いても、神経繊維の成長が誘導できるようになり、より生体内に近い条件で培養できるようになつた。

最近になって、毛様体神経栄養因子（C N T F ) 、脳由来神経栄養因子 ( B DN F ) 、神経栄養因子— 3 (NT— 3 ) 、神経栄養因子— 4 (NT— 4 )、神経栄養因子一 5 (NT— 5 ) 、グリア細胞株由来神経栄養因子（G DN F) と、次々に新しい神経成長因子が発見されてきた。これらは培養神経細胞によって、その効果や作用メカニズムが検討され、更には実用化されている遺伝子工学の手法により、疾病治療のための医薬としての利用も検討されるまでになっている。

しかし、これらの因子を通常の中枢神経細胞の培養系で調べてみると、単一物質の添加だけで各種の神経細胞に対して著しい効果を示すとは言いにくく、特定の細胞に対してのみ効果を示すという場合が多い。

中枢神経細胞の培養に関しては、これらとは別の流れとして、ホルモン（インシュリン、サイロキシン、プロジェステロン等）、ビタミン、不飽和脂肪酸、細胞成長因子（塩基性繊維芽細胞増殖因子等）などが検討され続けてきており、これらの因子を種々組み合わせた無血清培養液が報告されている〔ジャーナル ·ォブ ·ニューロサイエンス ·メソッド（Journal of Neuroscience Methods, 23:75 (1988)等〕。しかしこれらのものも、株化細胞（株化グリア細胞等）には効果的であるが、神経細胞に対しては安定培養ができない場合や、神經細胞には効果があるものの、同時にグリァ細胞の増殖が促進されてしまい、いわゆるグリァ細胞との混合培養系になってしまう場合など、神経細胞に対する薬理作用を検討する場合には不適切なものが多い。例えば、ボテンシュタイン（Bottenstein) らの N 2添加物〔インシュリン（ 5 g /id) 、トランスフェリン（ 1 0 0 g /mi) 、プロジエステロン（2 O nM) 、プトレシン（ 1 0 0 M ) 、及び亜セレン酸塩（3 0 nM ) 〕〔プロスィ一ディング'ォブ'ナショナル 'アカデミー ·ォブ 'サイエンス

(Proceeding of National Academy of Science, U. S. A. ) ， 76:514(1979)〕は、株化グリア細胞の培養には適しているカ初代神経細胞の場合は安定した細胞の生存維持が図れない。また、プリュヮー（Brewer) らの処方の培養液〔ブレイ ' リサーチ（Brain. Research), 65:494(1989)) も、中枢神経細胞に対して短期間の培養は可能であるが、長期間に渡って培養した場合、細胞機能を安定して維持することができない。

また、神経細胞の培養に株化グリァ細胞ないしは初代グリァ細胞の培養上清を用いる方法が知られている。し力、し、株化グリア細胞の培養上清を用いた場合は、一般的に、神経細胞に対しても作用するカ同時にグリア細胞にも作用し増殖が促進される。つまり神経細胞の生存に対する効果だけでなく、それ以上にグリア細胞に対して効果を示す。グリア細胞増殖因子と呼称される因子は、これらの培養上清より精製されている〔ジャーナル ·ォブ■バイオロジカル 'ケミストリー

(Journal of Biological Chemistry), 268 :2857(1993)など〕。

また特開平 7— 1 0 1 9 9 0号公報には株化グリア細胞であるァストロサイト —マの培養上清を濃縮したものが神経細胞の培養に 3 0〜5 0 %の活性増加効果を示すことが報告されている。また、神経芽細胞腫の増殖を抑制することが示されている。これは株化グリア細胞の培養上清を用いた場合の欠点であるグリア細胞の増殖を抑えるため、培養上清を濃縮し一部の有効成分をとりだしたものである。しかし神経細胞を安定に培養するためには単一物質ではなく複数の成分による総合的な作用が必要である。この濃縮物を用いないものに比べた活性増加効果が 3 0 %程度では、安定な神経細胞の培養系を構成することはできない。初代グリア細胞を用いる方法では、培養上清を得るために、通常の無血清培養液ないしは血清が含まれている培養液を用いる。しカヽし、通常の無血清培養液を用いる培養上清の採取方法では、グリァ細胞の生存に対して充分な培養液とはならず、安定培養ができない。このため培養上清に含まれる神経細胞に作用する因子群の量が少なく、神経細胞の培養に対して効果が低い。また培養上清の採取には限度があり、数回程度で、安定した効果を持つ培養上清の採取は難しくなる。血清含有培養液を用いた場合には、安定した培養上清の採取は行えるが、神経細胞を培養する際に、神経細胞よりも共存するグリア細胞に対して増殖因子が作用し細胞増殖が促進される。その結果、神経細胞の安定培養が障害される。

通常、無血清培養液にはホルモン等の栄養因子を加える方法が採られる。例えば、特開平 3— 6 6 7 0 0号公報には、ダルベッコ改変イーグル培地（以下 D M E Mと略す）培養液にインシュリン（5〃g /mi) 、トランスフェリン（ 1 z g 、ハイド口コーチゾン（2 O nM) 、及び 3 , 3 ' , 5 —トリョード—L— チロニン（0 . 3 nM) を添加する培養法が開示されている。しかしこの培養上清を用いて神経細胞を培養しても数日間の培養しか行えず安定した培養を行うことができない。また、同じく神経突起伸展因子として明示されているひ 2—マクログロブリンは、中枢神経の培養においては安定培養の効果が低く、主要な役割を果たすものではなく補助的役割を果たすにすぎないものである。

更に、特開平 3— 1 5 5 7 7 7号公報には、ミクログリア細胞の產生する因子が、神経細胞の突起伸展に効果があることが示されている。ミクログリア細胞は、マクロファージ（貧食細胞）のような免疫系細胞の機能を示すといわれ、組織が障害を受けたときに活性化の度合いが高くなる。し力、し、一般的に生体内では、ァストログリァ钿胞を含むマク口グリァ細胞の比率が高く、炎症などの場合を除き、主としてマクログリァ細胞が恒常性を維持していると考えられている。

上記のような従来の培養液群を中枢神経細胞の培養に用いた場合、その効果は低く、神経細胞の安定した培養を行うことができない。すなわち、神経薬理試験等を行った場合に於いて、期待する充分な結果が得られない。従って本発明は、神経細胞の培養におけるこのような現状に鑑みてなされたもので、神経細胞を長期間安定に培養できる培養液を提供することを目的とするものである。発明の開示

本発明者らは神経細胞を安定に培養するためには種々の栄養因子が必要であると考え、これらの栄養因子に関して神経細胞の培養に与える効果を検討した。初代ァストログリア細胞の培養上清も栄養因子の一つとし検討したが、これらの栄養素は単独の使用ではその効果が低い。特に、初代ァストログリア細胞の培養上清は、神経細胞の安定培養に対して、これまで報告されて来た程の効果がない事が明らかになった。そこで本発明者らは、栄養因子を複数を用いることによる複合効果、相乗効果の検討をすすめ、種々の培養効果について鋭意研究を進めた結果、本発明を完成するに至ったものである。

すなわち、本発明は（A) インシュリン及びトランスフェリンを添加した栄養培地中で初代ァストログリア細胞を培養して採取した培養上清に、 ( B) アルブミンを配合したことを特徴とする神経細胞用培養液を提供するものである。また、本発明は初代ァストログリア細胞を動物血清を添加した培地中で培養、増殖させた後、インシュリン及びトランスフェリンを添加した栄養培地中で培養し、その上清を採取し、得られた培養上清にアルブミンを添加することを特徴とする上記の神経細胞用培養液の製造方法を提供するものである。

更にまた、本発明は、上記神経細胞用培養液中で神経細胞を培養することを特徵とする神経細胞の培養方法を提供するものである。発明を実施するための最良の形態

本発明の神経細胞用培養液を調製するには、まず動物の脳よりァストログリア細胞を採取し、初代ァストログリァ細胞を増殖させて充分量の初代ァストログリァ細胞を得る。動物の脳よりァストログリア細胞を採取するには、動物の新生仔 ( 1〜2日）の大脳より採取するのがよい。ここでァストログリア細胞採取用の動物としては、ラット、マウス、ゥシ、ゥマ、ブ夕、サル、ゥサギ、ニヮトリ等が挙げられる力 \ ラット又はマウス力好ましい。

具体的には、新生仔の脳より大脳を切り出し、脳膜を除いた後、トリプシン、デイスパーゼ、コラゲナ一ゼ、ノ、。パイン等の酵素を用いて細胞を分散させる。これらの中でも特にトリプシン 0 . 0 5〜 0 . 3 5 wZ v % (以下、単にで示す）を用いるのが好ましい。この酵素に更に、デォキシリボヌクレアーゼ

0. 0 1 % ( 1 0 0〜5 0 0

や、エチレンジァミン一 Ν， Ν, N' ， N' —四酢酸（EDTA) 0. 0 1 %を加える方法も効果的である。

採取されたァストログリア細胞の培養、増殖は動物血清を添加した培地中で行うのが好ましい。ここで用いられる動物血清としては、ゥシ血清が好ましく、ゥシ胎児血清、仔ゥシ血清、新生仔ゥシ血清が特に好ましい。また、動物血清の添加量は 5〜20%となる量が好ましい。また、培地としては、動物細胞培養用の栄養培地であれば特に制限されず、イーグルの最小必須培地（以下、 MEMと略す）、ダルベッコ改変イーグル培地（以下、 DMEMと略す）、 DMEM/ハムの F— 1 2培地（以下、 F— 1 2と略す）、 F— 1 2、ハムの F— 1 0培地（以下、 F- 1 0と略す）などの培地を用いることができる。 DMEMZF— 1 2混合培地は混合比を各種変えたものが用いられる力両培地の特徵を合わせ持つ、 60/ 40〜40/60 (重量比）程度の範囲の混合培地が特に好ましい。培養液に分散したァストログリア細胞は、細胞培養用のフラスコ、ディッシュ、プレート、もしくはポリリジンコートを施したフラスコ、ディッシュ、プレートやマイクロキャリア一などを用いて、コンフルェントに（培養面全体に密に）なるまで培養し、増殖させる。培養面積は、新生仔 1に対して 1 0〜1 00cm² とするのが好適である。そして、更に継代培養を行うが培養面積は 2〜1 0倍程度が適当である。同様にコンフルェントになるまで培養する。このコンフルェントになった細胞は主として 1型ァストログリア（又は 1型ァストロサイト）に分類されるものである。 1型ァスト口グリァであることは免疫細胞化学染色を行うことにより確認できる。この細胞は抗 GFAP (グリア織維性酸性蛋白質）抗体で染色され、抗 A 2 B 5抗体（抗シアル酸含有糖蛋白質抗体）で染色されない。細胞がコンフルェントの状態になつた時点で培養液を除去し、リン酸塩緩衝液等で洗浄する。

かくして得られた初代ァストログリア細胞を、インシユリン及びトランスフエリンを添加した栄養培地中で培養し、その上清を採取する。ここで用いられる栄養培地としては、 MEM、 DMEM, F— 1 0及び F— 1 2から選ばれる 1 種又は 2種以上が挙げられるが、 MEM、 DMEM, DMEMZF— 1 0又は DMEMZF— 1 2が好ましく、 DMEMZF— 1 2が特に好ましい。更に DMEMZF— 1 2は 6 0/4 0〜4 0/ 60 (重量比）の混合比のものが好ましい。

これらの栄養培地にはインシュリン及びトランスフェリンを添加するが、更に亜セレン酸又はその塩を添加するのがより好ましい。ここでインシユリンは 1〜 1 0 0 / g /n 好ましくは 3〜20 g Zwの濃度となるように添加される。トランスフヱリンは 1〜1 00 / g /m 好ましくは 3〜2 O ig Ζτ^の濃度となるように添加される。また、亜セレン酸の塩としては、亜セレン酸ナトリウム、亜セレン酸カリウム等が挙げられる。亜セレン酸又はその塩は 1〜1 0 0nM、特に 3〜5 ΟηΜの濃度となるように添加するのが好ましレ、。インシュリン、トランスフヱリン、亜セレン酸塩はいずれも水溶性であり、そのまま添加してもよいが、各成分を混合した高濃度溶液を調製しておき、その一定量加えるのも好ましい方法である。

培養期間は 1日程度でよく、上清を採取した後、再び新しい培地及び添加剤を加えて培養を行えば、上清を繰り返し採取することが出来る。このようにして 1 日毎に上清を採取すれば、初代ァスト口グリァ細胞の 1回の準備操作で、 1 0回以上、 1 5回程度まで上清を採取することが可能である。

採取した培養上清は、孔径 0. 02〜 4 5 m のフィルタ一により濾過滅菌し、細胞片などを除いて用いるのが好ましい。

この培養上清のみを培養液として用いても神経細胞の安定培養はできない。了ルブミンを添加することにより安定培養が可能となる。当該アルブミンに加えてプロジヱステロンを添加するのがより好ましい。ここでアルブミンは 0. 5〜 2. 5 mgZ の濃度となるように添加するのが好ましく、プロジェステロンは 1 〜1 0 OnMの濃度となるように添加するのが好ましい。

また、培養上清中のインシュリン、トランスフェリン及び亜セレン酸又はその塩の濃度が低い場合には、インシュリン 1〜 1 0 0〃g /mi、トランスフェリン 1〜1 0 0 zg /m 亜セレン酸又はその塩 1〜1 0 OnMとなるように添加するのが好ましい。

更に、前記培養上清中にはスーパ一ォキシドジスム夕一ゼとカタラーゼの組み合わせ、及び z又はひ—トコフエロール類を添加するのがより好ましい。これらの添加剤の好ましい濃度は、スーパーォキシドジス厶ターゼ 1〜 1 0 0〃g /nk 力夕ラーゼ 1〜 1 0 0 z g /r 、 ~トコフエロール類 1〜 1 0 0〃g /τηβである。ここで一トコフエロール類としては一トコフエロール、酢酸トコフエ口 —ル、コハク酸トコフエロール等のひ一トコフエロールエステルが挙げられる。このように前記培養上清にアルブミン及びその他の添加剤を加えた培養液では、神経細胞を安定に培養することが可能で、従来の培養液に見られた低密度培養時の不安定性も改善され、高い安定性を示す。

また、前記培養上清には、神経細胞の栄養源として新たに前記の培地を添加してもよく、より好ましい培地としては DME MZF— 1 2混合培地が挙げられる。新たに加える培地の添加量は 0〜7 5 %、特に 0 . 1〜5 0 になる量が好ましい。

特に好ましい添加剤の組み合わせとしては、アルブミン、プロジヱステロン、インシユリン、トランスフェリン及び亜セレン酸又はその塩；当該 5種とひ一トコフヱロール類との組み合わせ；当該 5種とスーパーォキシドジスムターゼ及び力タラ一ゼとの組み合わせ：当該 5種と一トコフヱロール類、スーパーォキシドジスム夕一ゼ及び力夕ラーゼとの組み合わせ；並びにこれらの組み合わせに DM E M/F - 1 2混合培地を添加したもの、等が挙げられる。

培養上清への上記添加剤の添加の方法は、プロジヱステロンとして水溶性プロジエステロン、ひ一トコフエロールとして水溶†生一トコフヱロールを用いれば、前記と同様に各成分を混合した高濃度溶液として添加する方法が適用できる。また、非水溶性プロジェステロン、非水溶性ひ—トコフェロールを用いる場合は、エタノールにあらかじめ溶解したものを用いればよい。

培養上清は凍結することにより安定に保存することが可能である。そこで前記のように 1日毎に繰り返して上清を採取する場合は、その都度インシュリン等の添加剤を加えるのでなく、凍結して保存しておき、複数回分の上清の採取が終わつた時点で凍結した培養上清を融解し、全体を均一に混合し、これと上記の添加剤を混合すれば、より均質な神経細胞用培養液を得ることができる。この添加剤はあらかじめ溶液状に溶解したものを加える方がよい。添加剤は純水ないしは、リン酸塩緩衝液等の水溶液に溶解し凍結保存すれば安定に使用が可能である。プロジヱステロン、ひ一トコフヱロールなどの、非水溶性の成分はエタノール等に溶解し同様に凍結保存すればよい。また、このようにして調製した本発明の培養液も凍結して安定に保存することができる。培養上清、上記の添加剤、混合した培養液いずれも凍結保存温度は— 1 0〜一 8 0 °Cが適しており、冷蔵温度（4〜8 °C) では長期間の安定保存は難しい。また凍結融解の操作は繰り返さないことが好ましい。

本発明の培養液を用いて神経細胞の培養を行うには、この培養液に神経細胞を添加し常法に従い、培養すればよい。神経細胞は、初代ァストログリア細胞と同様の動物から細胞を調製することが可能である。生後の個体を用レ、ても培養は可能であるが、一般的に胎児を用いた方が神経細胞の生存率は高くなる。ラットでは胎生 1 5〜 2 0日程が好適であるが、より未熟な胎児を使用することも可能である。脳の特定領域、例えば、海馬、線条体、中隔野あるいは中脳、小脳などに限定しての培養も可能である。小脳の場合は神経細胞の分化にあわせた生後 1週間ほどの個体を用レ、ると効果的な培養が可能である。

脳を酵素処理し神経細胞を分散した場合には、通常、神経細胞の他にグリア細胞等（初代ァスト口グリァ細胞など）が混入してくる。初代ァスト口グリァ細胞には 1型と 2型があるが、血清添加培養液の場合には、このなかで 1型ァスト口グリァ細胞が増殖し問題となる。しかし本発明の培養液にはこの細胞の増殖を抑える効果がある。初代ァストログリア細胞の形態からの 1型、 2型の判別は確実とはいえず、免疫細胞化学染色法による判別方法を用いる。抗 G F A P抗体では 1型、 2型両方が染色されるが、抗 A 2 B 5抗体では 2型のみが染色される。この染色性の違いにより 1型と 2型の判別が可能である。

胎児の脳を用いた場合は未分化細胞の混入の比率が高くなる。本発明の培養液は、この未分化な幹細胞の一^ ^であるォリゴデンドログリア（又はォリゴデンド口サイト）一 2型ァストログリア（又は 2型ァスト口サイト）幹細胞（以下 0— 2 A幹細胞）の増殖分化を誘導する効果がある。培養を継続すると、培養系に、当初認められなかったォリゴデンドログリアを認めることができるようになる。これは 0— 2 A幹細胞が増殖、分化したものである。オリゴデンドログリアであることは、ァストログリア細胞を判別する場合と同様の免疫細胞化学染色の方法で適用できる。例えば抗 GC (ガラクトセレブ口シド）抗体、抗 MBP (ミエリン塩基性蛋白質）抗体などを用いて染色すると明確な判別が可能である。

具体的な神経細胞の培養方法は、先ず前記と同様にして脳を切り出す。そしてトリプシン、パパイン、デイスパーゼなどの酵素を用いて神経細胞分散液を調製する。好ましくはパパイン（1 0〜5 Ου τηβ) を用いる方がよい。パパインを溶解したリン酸塩緩衝液に L一システィン（0. 5〜5raM) 、グルコース（5〜 5 OmM) を加え、 3 7°Cで 30〜1 20分、脳組織を酵素処理する。分散酵素液を丁寧に攪捽、混和することにより神経細胞を分散させる。デォキシリボヌクレァーゼ（0. 0 1 %) を更に添加した方が漏出した核酸による細胞の凝集を防ぐことができる。

次に、遠心分離機により細胞を分離し、前記のように調製した本発明の培養液を用いて 1 0， 00 0〜2， 0 0 0, 0 0 OcellsZ の細胞液を調製し、培養用のプレート、ディッシュなどを用いて、 37°Cの 5 %炭酸ガスインキュベータ一で培養する。培養に用いるプレート、ディッシュ等は、ガラス、プラスチック等材質は問わないが、ポリリジシン、ポリオル二チン、ポリアリルァミン、プロ夕ミン、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フイブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、及びこれらを混和したものを、単層ないしは複層コートしたものを用いるのが良い。実施例

以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例し比較例 1〜2

( 1 ) 培養液の調製

ウィスター系ラットの新生仔（生後 1 日） 3匹の脳より大脳を切り出し、 0. 25%のトリブシン/リン酸塩緩衝液（フロウ ·ラボラトリー社製）を用いて 3 7°Cで 30分酵素処理した。酵素液を除き、 1 0%牛胎児血清（ハイクローン社製）及びゲンタマイシン（シグマ社製） 5 0 ng Ζτ^を含む DMEMZF— 1 2等比混合培養液（ライフ ·テクノロジー社製）で組織を分散させ、細胞分離用遠心機（クボタ社製）により 9 0 0回転、 5分の条件で細胞を遠心分離した。分離した細胞は、 1 5 の同じ培養液を加え 7 5 cm² の培養フラスコ（住友べ一クライト社製）を用いて、 3 7 、 5 %の炭酸ガスインキュベーター内で 1 0 日間培養した。培養液を除き、フラスコ内にコンフルェントに増殖した細胞を、リン酸塩緩衝液で洗浄した後、 0 . 2 5 %のトリプシン Zリン酸塩緩衝液で、 3 7 °Cで 5分間酵素処理した。ここで再び同じ培養液 1 5 を加えて細胞を分散させ、同様に遠心分離し 1 5 の培養液に再分散させた後、これを

2 2 5 cm² の培養フラスコ（住友べ一クライト社製） 3個に分けて、 1 0日間培養した。なお、培養液は 2〜3日に 1回新しいものと交換した。

培養液を除去し、リン酸塩緩衝液で 2回洗浄した後、インシュリン（ 5〃g Z r 、トランスフェリン（5 g 、亜セレン酸ナトリウム（5 nM) (いずれもシグマ社製）を添加した DME MZF— 1 2等比混合培養液を加えて、 1日間培養し、その培養上清を全量採取して、再び同じ培養液を加えた。同様の操作を 1 0日間（1 0回）繰り返した。比較例 1として、上記の添加物を加えずに、同様に操作して培養上清を採取した。尚、培養液の量は、培養器の形態により適宜増減することが可能であるが、プレート、フラスコ、ディッシュ、トレ一などでは、培養面積当たりでは 0 . 1 5〜 0 . 3 5 me m² の範囲とするのが適切でめる。

採取した培養上清は、 0 . 2 2 m フィルター（ミリポア社製）で濾過滅菌して凍結保存し、 1 0回分の上清を探取した後、解凍し全体をまとめて均一に混合した。これに、アルブミン（A L B UMA X^TM I、ライフ ·テクノロジ一社製、 2. 5 rag/^) を加え、一 7 0 °Cで保存した。

( 2 ) 神経細胞の培養試験

試料となる神経細胞は、胎生 1 7日のラットより大脳を切り出し、 I mMシステイン、 2 5 mMグルコース、 l

ミン（各シグマ社製）を含有するリン酸塩緩衝液で、 2 に調製した、パパイン（ワージントン社製）を用いて

3 7 °Cで 4 5分酵素処理した。酵素液を除き、 DMEMZF— 1 2混合培養液で細胞を分散させた後、 7 0 0回転、 5分の遠心分離条件で細胞を分離した。 ( 1 ) で得られた本発明の培養液を用いて、 600， 000

の溶液を調製し、ポリリジンコート 24ゥエルプレート（住友べ一クライト社製）を用いて 0. 5 ゥエルで培養した。比較例 2としては、本発明の培養液を加えない DMEM/F - 1 2液等比混合培養を用いて、同じ条件で培養を行つた。

4日間培養した後、顕微鏡下で細胞の形態を観察した。本発明の培養液を用いたものは、良好な生存と長い神経突起の伸展が観察され、シナプスを形成する突起間のコンタクトがたいへん多く認められた。しかし、比較例 1の培養液を用ヽたものでは、神経突起の伸展が著しく劣っており、死細胞と思われる形態をしているものが多く認められた。また、比較例 2の培養液では、生存細胞は認められなかった。

更に、生細胞と死細胞の比率を求めるため、リン酸塩緩衝液に溶解し培養液に加えた二酢酸フルォレセイン（シグマ社製） 1 0 g Zw^と、ヨウ化プロピジゥ厶（シグマ社製） 1 5 ii% m とを反応させた。蛍光顕微鏡（オリンパス光学社製）で異なった蛍光を発する生細胞と死細胞の比率を測定したところ、本発明の培養液で培養したサンプルでは、生存率は 80%以上の良好な値を示した。

実施例 2、比較例 3

実施例 1と同様にして初代ァストログリア細胞を培養し、培養上清を採取した。得られた培養上清を用いて、培養上清と DMEMZF— 1 2等比混合培養液の比率が 75Z25、 50/50. 25 Z 75、及び 1 0 Z 90になるようにそれぞれ調製し、その全体量に対して、プロジェステロン（20nM) 及びアルブミン

(2. 5mg/^) (いずれもコラボレイティブ · リサーチ社製）の添加物を、各溶液に加えて培養液を調製した。更に、比較例 3として、 DMEMZF- 1 2等比混合液にゥシ胎児血清（ハイクローン社製） 1 0%を加えたものを用いた。実施例 1と同様にして神経細胞液を 500， 000

実施例

1と同様にして培養を行った。

4日間培養した後、顕微鏡下で観察したところ、培養上清と DMEMZF—

1 2混合液の比を 75/25, 及び 50ノ50とした培養液では、神経細胞の良好な生存維持と神経突起の伸展が観察された。 25/75の培養液では、生存細胞数がやや少なく、 1 0 Z 9 0の培養液では、生存細胞、神経突起の伸展のいずれも劣っていた。また、比較例 3のゥシ胎児血清を用いた培養液では、生存している神経細胞の数が少なく、グリァ細胞の存在が多く認められた。

培養上清と DME MZF— 1 2混合液の比が 7 5 " 2 5の培養液で培養したもの、及び比較例 3の血清添加で培養したものについて、神経細胞であることを確認するため、抗 MA P 2抗体（ベーリンガーマンハイム社製）による免疫組織化学染色を行った。培養液を除きリン酸塩緩衝液で洗浄した後バラフオル厶アルデヒド（和光純薬社製） 4 %のリン酸塩緩衝液で 2 0分、トリトン X— 1 0 0 (ベ一リンガ一マンハイム社製）の 0 . 1 %リン酸塩緩衝液を 2 0分、ヒッジ血清 1 %のリン酸塩緩衝液を 2 0分、順次反応させ、更に、抗 MA P 2抗体をリン酸塩緩衝液で 5 /zg ZTOに調製し、 3 0分間反応させた。なお、反応はいずれも室温で行い、各反応後にはリン酸塩緩衝液で洗浄した。

次に A B C免疫組織化学キット（ベクター社製）、及び D A B基質キット（ベクタ一社製）で染色を行った。その結果、前記の形態観察から神経細胞と判断された細胞は大半が染色され、神経細胞であることが確認された。しかし、比較例 3の血清添加で培養した方の細胞は染色される細胞が少なく、形態からグリァ細胞と判断されるものは染色されなかつた。

実施例 3、比較例 4

実施例 1と同様にして神経細胞用培養液を調製した。試料となる神経細胞は、ウィスター系ラッ卜の胎児（胎生 1 6日）の海馬より、実施例 1と同様にして調製した。 2 4ゥヱルラミニンコートプレート（住友べ一クライト社製）に 2 5 0 , 0 0 0 c Zゥエルの細胞を加え、 1 4日間培養した。培養 3〜5日の間は、シトシンァラビノフラノシド（シグマ社製）を 5 M加えた。培養液の交換は 1 / 2量を週 2度交換した。また、比較例 4として、 DMEMZF— 1 2等比混合培養液に、インシュリン（ 5 g /mi) 、トランスフエリン（ 5 g /ni)、プロジェステロン（2 0 nM) 、及び亜セレン酸ナトリウム（ 2 0 nM) を加えたが、アルブミンを加えないものを用いて、同様にして培養を行った。

培養 1 4日の時点で観察したところ、比較例 4の培養液を用いた方は細胞が全て死滅していたが、本発明の培養液を用いた場合では、神経細胞間の緊密なネットワーク形成力観察された。

実施例 4

( 1 ) 培養液の調製

実施例 1と同様にして初代ァストログリア細胞を培養し、培養上清を採取した。これに、インシュリン 5 /τ^、トランスフェリン 5 zg ZOT スーパーォキシドジスム夕一ゼ 2. 5 zg 力タラ一ゼ 2. 5〃g 亜セレン酸ナトリウム 1 0 0 nM、プロジェステロン 20 nM、酢酸トコフェロール l ^g / ァルブミン 2. 5 mg/τηβ (いずれもシグマ社製）で各栄養因子を加え培養液を調製し、一 70°Cで保存した。

比較のための培養液として、上記の培養上清に栄養因子を加えないもの（前記比較例 1と同じ）を、また培養上清に栄養因子としてインシュリン 5 g /m トランスフェリン 5 g /m プロジエステ口ン 20 nM及び亜セレン酸ナトリゥム 1 0 OnMを添加したが、アルブミンを加えない培養液（前記比較例 4と同じ）を調製した。

( 2 ) 神経細胞の培養試験

試料となる神経細胞は、胎生 1 7日のラッ卜より大脳を切り出し、 Im システイン、 25 mMグルコース、 lmgZ?^アルブミン（各シグマ社製）を含有するリン酸塩緩衝液で、 2 に調製したパパイン（ワージントン社製）液を用いて 37°Cで 4 5分酵素処理した。酵素液を除き、 5 0〃g /i のザンタマイシンを含む DMEMZF— 1 2混合培養液で細胞を分散させた後、 700回転、 5 分の遠心分離条件で钿胞を分離した。上記実施例、比較例培養液で調製した神経細胞は、 5 0 0 eel Is/謹²の培養密度で、ポリリジンコート 4 8ゥヱルプレート (住友べ一クライト社製）を用いて培養した。

4日間培養した後、顕微鏡下で細胞の形態を観察した。本発明の培養液を用いたものは、生細胞数が多く、また長い神経突起の伸展が観察された。しかし比較例 1の培養液で神経突起を伸長した良好な生存状態の細胞は認められず、比較例 2の培養液では、一部の細胞が認められるのみであった。 MTT (臭化 3 - (4， 5—ジメチルー 2—チアゾリル）一 2， 5—ジフエ二ルー 2Hテトラゾリゥム）細胞増殖測定キット（ケミコン 'インターナショナル社製）を用いて神経細胞の生存度合レ、を測定した。実施例の培養液と比較例の培養液との比率は比較例 1 /実施例 4は 5 %以下で、比較例 2 実施例 4は 20 %程であり、本発明の培養液に比べ、比較例の培養液は、著しく効果が劣っていた。

実施例 5、比較例 5

実施例 4と同様にして初代ァストログリア細胞を培養し、培養上清を採取した。得られた培養上清を用いて、培養上清と DMEM/F— 1 2等比混合培養液の比率が、 75Z25、 50/50. 25 Z 75、及び 1 0ノ 90になるようにそれぞれ調製し、その全体量に対して、インシュリン 5 ig /τ^、トランスフェリン

5 g /OT スーパーォキシドジスムターゼ 2. 5〃g 、カタラーゼ 2. 5 /mi、亜セレン酸ナトリウム 1 00 nM、プロジエステ口ン 20 ηΜ, 酢酸トコフエロール 1 g /nk アルブミン 2. 5 m(i (レ、ずれもシグマ社製）の添加物を、各溶液に加えて培養液を調製した。更に、比較のために DMEMZF—

1 2等比混合液にゥシ胎児血清（ハイクローン社製） 1 0%を加えたもの（前記比較例 3と同じ）を用いた。実施例 1と同様にして神経細胞液を調製し、 300 eel lsZ の培養密度でポリリジンコート 24ゥエルプレート（住友べ一クライト社製）で培養した。

4日間培養した後、顕微鏡下で観察したところ、培養上清と DMEM F—

1 2混合液の比を 75Z25、 50/50. とした培養液では、 75 25の方がより優っていたが、いずれも良好な生存維持と神経突起の伸展が観察された。

25/75では生存細胞は認められたが数が少なかった。 1 0Z90の培養液では、生存細胞は認められなかった。また、比較例のゥシ胎児血清を用いた培養液では、生存している神経細胞の数が少なく、グリア細胞の存在が多く認められた。実施例 6、比較例 6

実施例 4と同様にして培養液を調製した。比較例として比較例 3の培養液を使用した。実施例 1と同様に神経細胞液を調製し 1, 200 cellsZ謹²の培養密度でラミニンコート 1 2ゥエルプレート（住友ベークライト社製）を用い、 8日間培養した。

本発明の培養液を用いたものは、安定に培養された神経細胞の他に、形態からオリゴデンドログリアと判断される細胞が認められた。また比較例の方は神経細胞はわずかであり、形態からァストログリア細胞と判断される細胞が大半であつた。

グリア細胞の種類を確認するため、抗 GC抗体（ベーリンガーマンハイム社製、 5 g Z に調製）、抗 GFAP抗体（ベ一リンガーマンハイム社製、

に調製）、抗 A 2 B 5抗体（ベーリンガーマンハイム社製、に調製）を用いて免疫細胞化学染色を行った。培養液を除きリン酸塩緩衝液で洗浄した後バラフオルムアルデヒド（和光純薬社製） 4%のリン酸塩緩衝液で 20分、トリトン X— 1 00 (ベーリンガーマンハイム社製）の 0. 1 %リン酸塩緩衝液を 20分、ヒッジ血清 1 %のリン酸塩緩衝液を 20分、順次反応させ、更に上記抗体をそれぞれ 30分間反応させた。各抗体の反応は比較例、実施例各 1ゥエルずつ計 6ゥヱル、いずれも室温で行い、各反応液にはリン酸塩緩衝液で洗浄した。次に、 ABC免疫組織化学キット（ベクター社製）、及び DAB (3, 3' — ジァミノべンジジン）基質キット（ベクタ一社製）で染色を行った。本発明の培養液を用いたもので、形態からオリゴデンドログリアと判断される細胞はこの細胞と反応する抗 G C抗体で染色された。

一方、比較例の形態からァストログリア細胞と判断される細胞は、抗 GFAP 抗体で染色され、抗 A 2 B 5抗体には染色されないことから 1型ァスト口グリァ細胞と判断された。産業上の利用可能性

本発明による神経細胞用培養液を用いることにより、中枢神経細胞の培養を安定に行うことができ、低密度培養においては神経突起の伸展性に優れ迅速なシナブス形成が可能であり、高密度培養においては神経ネットワークを形成した細胞の長期安定性に優れている。これにより神経薬理試験、神経情報伝達試験等を確度高く実施することができ、神経薬理、衛生化学などの分野で痴呆症、神経疾患、神経毒性などの研究、病態の解明等に役立つ。

Claims

請求の範囲

1. (A) インシュ.リン及びトランスフェリンを添加した栄養培地中で初代ァストログリア細胞を培養して採取した培養上清に、 (B) アルブミンを配合したことを特徵とする神経細胞用培養液。

2. 栄養培地中に、更に亜セレン酸又はその塩を添加するものである請求項 1記載の神経細胞用培養液。

3. 栄養培地が、イーグルの基本培地（MEM) 、ダルベッコ改変ィ一グル培地 (DMEM) 、ハムの F - 1 0培地、及びハムの F— 1 2培地から選ばれる 1種又は 2種以上である請求項 1又は 2記載の神経細胞用培養液。

4. (B) アルブミンに加えて、プロジェステロンを配合したものである請求項 1〜 3のレ、ずれか 1項記載の神経細胞用培養液。

5. (B) アルブミンに加えて、プロジェステロン、インシュリン、トランスフェリン及び亜セレン酸又はその塩を配合したものである請求項 1〜3のいずれか 1項記載の神経細胞用培養液。

6. (B) アルブミンに加えて、プロジェステロン、インシュリン、トランスフエリン、亜セレン酸又はその塩、スーパ一ォキシドジスムターゼ及び力タラ一ゼを配合したものである請求項 1〜 3の何れか 1項記載の神経細胞用培養液。

7. (B) アルブミンに加えて、プロジェステロン、インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸又はその塩及び一トコフヱロール類を配合したものである請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の神経細胞用培養液。

8. (B) アルブミンに加えて、プロジェステロン、インシュリン、トランスフエリン、亜セレン酸又はその塩、スーパ一ォキシドジス厶夕一ゼ、カタラーゼ及びひ一トコフヱロール類を配合したものである請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の神経細胞用培養液。

9. 更に栄養培地を培養上清に配合するものである請求項 4〜8のいずれか 1項記載の神経細胞用培養液。

1 0. 初代ァストログリア細胞を動物血清を添加した培地中で培養、増殖させた後、インシュリン及びトランスフェリンを添加した栄養培地中で培養し、その上清を採取し、得られた培養上清にアルブミンを添加することを特徴とする請求項 1記載の神経細胞用培養液の製造方法。

1 1 . 栄養培地中に、更に亜セレン酸又はその塩を添加するものである請求項 1 0記載の神経細胞用培養液の製造方法。

1 2 . 栄養培地が、イーグルの基本培地 (ME M) , ダルベッコ改変イーグル培地（D ME M) 、ハムの F— 1 0培地、及びハムの F— 1 2培地から選ばれる 1 種又は 2種以上である請求項 1 0又は 1 1記載の神経細胞用培養液の製造方法。

1 3 . アルブミンに加えて、プロジェステロンを添加するものである請求項 1 0 〜 1 2のいずれか 1項記載の神経細胞用培養液の製造方法。

1 4 . アルブミンに加えて、プロジェステロン、インシュリン、トランスフェリン及び亜セレン酸又はその塩を添加するものである請求項 1 0〜 1 2のいずれか 1項記載の神経細胞用培養液の製造方法。

1 5 . アルブミンに加えて、プロジェステロン、インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸又はその塩、スーパーォキシドジス厶夕ーゼ及び力タラ一ゼを添加するものである請求項 1 0〜 1 2の何れか 1項記載の神経細胞用培養液の製造方法。

1 6 . アルブミンに加えて、プロジェステロン、インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸又はその塩及びひ—トコフヱロール類を添加するものである請求項 1 0〜 1 2のいずれか 1項記載の神経細胞用培養液の製造方法。

1 7 . アルブミンに加えて、プロジェステロン、インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸又はその塩、スーパ一ォキシドジス厶夕ーゼ、カタラーゼ及びひ一トコフェロール類を添加するものである請求項 1 0〜 1 2のいずれか 1項記載の神経細胞用培養液の製造方法。

1 8 . 更に栄養培地を培養上清に添加するものである請求項 1 3〜 1 7のいずれか 1項記載の神経細胞用培養液の製造方法。

1 9 . 請求項 1〜 9のいずれか 1項記載の神経細胞用培養液中で神経細胞を培養することを特徴とする神経細胞の培養方法。