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WO1997000971A1 - Methode de dosage du cholesterol dans un amas de hdl et trousse de dosage associee - Google Patents

Methode de dosage du cholesterol dans un amas de hdl et trousse de dosage associee Download PDF

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WO1997000971A1
WO1997000971A1 PCT/JP1996/001602 JP9601602W WO9700971A1 WO 1997000971 A1 WO1997000971 A1 WO 1997000971A1 JP 9601602 W JP9601602 W JP 9601602W WO 9700971 A1 WO9700971 A1 WO 9700971A1
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WO
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cholesterol
hdl
fraction
enzyme
hydrogen peroxide
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Application number
PCT/JP1996/001602
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English (en)
French (fr)
Inventor
Masafumi Ikeda
Hiromasa Tabata
Tsutomu Kakuyama
Yoichi Hashiguchi
Original Assignee
International Reagents Corporation
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Publication date
Application filed by International Reagents Corporation filed Critical International Reagents Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/904—Oxidoreductases (1.) acting on CHOH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)

Definitions

  • the present invention relates to a method for quantifying cholesterol in a high-density lipoprotein (HDL) fraction (hereinafter also referred to as “HDL cholesterol”) and a reagent kit for quantification.
  • the present invention relates to a method for quantifying HDL cholesterol in a sample, and a reagent kit for quantifying HDL cholesterol.
  • Lipoproteins in blood are classified into chylomicron (specific gravity 1,006), ultra-low-density lipoprotein ( ⁇ 101 ⁇ , specific gravity 1.006-1.019), low-density lipoprotein (LDL, specific gravity) 1.019-1.063), high-density lipoprotein (HDL, specific gravity 1.063-1.21), etc., and research on diseases that affect the metabolism of these lipoproteins is ongoing.
  • chylomicron specific gravity 1,006
  • ultra-low-density lipoprotein ⁇ 101 ⁇ , specific gravity 1.006-1.019
  • low-density lipoprotein LDL, specific gravity
  • HDL high-density lipoprotein
  • the quantification of HDL cholesterol has been measured by a known method for cholesterol, a component of the HDL fraction separated by a precipitation fractionation method, an ultracentrifugation method, an electrophoresis method, or the like.
  • Precipitation fractionation is commonly used in clinical laboratory measurements. This involves precipitating a lipoprotein fraction other than HDL using a precipitant, and centrifuging it to obtain an HDL fraction.
  • a combination of polyadione and divalent thione is often used.
  • Such polyadiones include polyethylene glycol, phosphotungstic acid, dextran sulfate, and the like, and divalent cations such as Mg, Mn, Ca, Li, and Ni are known.
  • centrifugation is required to separate the HDL fraction using such a conventional method using a precipitant, so an automatic analyzer is used to improve efficiency in daily clinical testing.
  • an automatic analyzer is used to improve efficiency in daily clinical testing.
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems and to provide a useful method for efficiently measuring HD L cholesterol, particularly for a clinical test using an automatic analyzer, and a reagent kit therefor. .
  • the present inventors have conducted intensive studies and found that a surfactant that causes an enzyme to preferentially act on cholesterol in a lipoprotein fraction other than HDL, and an enzyme action on cholesterol in a lipoprotein fraction other than HDL. It has been found that cholesterol in the HDL fraction can be measured by using a surfactant that suppresses cholesterol. As a result of further studies, they found that the above-mentioned object was achieved, and completed the present invention.
  • the present invention provides a reaction product obtained by causing an enzyme to preferentially act on cholesterol in a lipoprotein fraction other than HDL by using an acylpolyoxyethylene sorbitan ester to guide the reaction product out of the reaction system.
  • the polyoxyethylene ester suppresses the action of enzymes on cholesterol remaining in lipoprotein fractions other than HDL, and allows the enzyme to act on HD L cholesterol to promote the reaction. It relates to a method for quantifying HD L cholesterol.
  • the present invention relates to a reagent kit for quantifying HD L cholesterol, comprising: a first reagent containing an acyl polyoxyethylene sorbitan ester and an enzyme; and a second reagent containing an alkyl polyoxyethylene ether.
  • examples of the enzyme acting on cholesterol include cholesterol esterase (CE) and cholesterol oxidase (CO). Since lipoprotein fractions contain cholesterol esters in addition to cholesterol, cholesterol esterase (CE) is usually converted from cholesterol oxidase (CO) to hydrolyze cholesterol esters and convert them to cholesterol. ) And coexist.
  • CE cholesterol esterase
  • CO cholesterol oxidase
  • the enzyme in the first reagent in the reagent kit of the present invention is 1 unit / m1 to 100 units / m1, preferably 1 unit Zm1 to 50 units In the case of C0, 0.5 unit Zml to l00 unit Zm, preferably 1 unit / ml to 50 units Zml, but it is appropriately determined according to the type of sample, etc. .
  • C n sorbitan E An acylboroxethylene ethylene sorbitan ester that causes the above enzyme to preferentially act on cholesterol contained in riboprotein fractions other than HDL, such as LDL, VLDL, and chylomicron, is usually abbreviated as C n sorbitan E. Any non-ionic surfactant having polyoxyethylene in the hydrophilic portion and which meets the purpose of the present invention can be used. Specific trade names, Tween 2 1 ( ⁇ 12 sorbitan E 4), Tween 8 1 ( C!
  • the acylpolyoxyethylene sorbin ester in the first reagent in the reagent kit of the present invention is usually contained in the reaction solution at a concentration of from 0.001 ⁇ ⁇ % to 0.1 lw / v%, preferably 0.001%. It is blended so as to be 1 w / v% to 0.05 w / v%, but it is appropriately determined according to the type of the sample.
  • the alkyl polyoxyethylene ether to be used is a nonionic surfactant having a polyoxyethylene in the hydrophilic portion, usually abbreviated as C n Ex, and should be used if it is compatible with the purpose of the present invention.
  • C n Ex a nonionic surfactant having a polyoxyethylene in the hydrophilic portion
  • Emulogphene BC 720 (C 12 E 9. 8) Sterox AJ 1 0 0 (C13E9.
  • the alkylpolyoxyethylene ether in the second reagent in the reagent kit of the present invention is usually 0.001 wZv to 5 wZv%, preferably 0.05 w / v to 2 w / v in the reaction solution. %, And it is blended so as to have a higher concentration than that of the acylpolyoxyethylene sorbitan ester blended in the first reagent, but it is appropriately determined according to the type of the sample and the like.
  • an enzyme acting on cholesterol, the above-mentioned acylpolyoxyethylene sorbitan ester, and a sample are mixed. Then, due to the presence of acyl polyoxyethylene sorbitan ester, the enzyme contained in the reaction solution acts preferentially on cholesterol in the riboprotein fraction other than HDL.
  • a chromogen is an organic compound containing a chromophore such as a nitro group, an azo group, a carbonyl group, an ethylene bond, and a cyan group, and not containing an auxiliary chromophore such as a hydroxyl group or an amino group.
  • a chromogen having a low color-forming ability by itself, but having an enhanced color-forming ability due to the coexistence of the organic compound containing the auxiliary chromophore is preferable.
  • the reaction product is hydrogen peroxide, N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -1,3,5-dimethoxya in the presence of peroxidase (POD)
  • POD peroxidase
  • a colorless complex is formed by reacting chromogens such as sodium diphosphate (HDAOS) and N-ethyl (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine (TOOS) with hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide can be led out of the reaction system.
  • the POD is from 0.01 U / ml to 10 UZm1, preferably 0.5 UZm1 to 5 U / ml, and the concentration of the chromogen is 0.001 wZv% to lwZv%, preferably 0. 0.1 wZv% to 0.5 wZv%, which is determined as appropriate according to the type of sample.
  • this reaction produces hydrogen peroxide.
  • this hydrogen peroxide can be converted to an organic compound containing an auxiliary chromophore such as, for example, 4-aminoantipyrine (0.001 wZv% to 0.1 wZv%, preferably 0.001 wZv% to 0.001 wZv% to 0.001 wZv% to 0.001 wZv% to 0.001 wZv% to 0.001 wZv%).
  • auxiliary chromophore such as, for example, 4-aminoantipyrine (0.001 wZv% to 0.1 wZv%, preferably 0.001 wZv% to 0.001 wZv% to 0.001 wZv% to 0.001 wZv% to 0.001 wZv%).
  • 05 wZv%) and a chromogen to form a quinone dye includes HDAOS and TOOS described above. HDL cholesterol can be measured by colorimetric measurement of this qui
  • Each reaction in the method of the present invention that is, each reaction before or after mixing the second reagent in the reaction system, is usually performed at room temperature for 1 minute to 10 minutes, preferably 3 minutes to 7 minutes. However, it is not particularly limited to this condition.
  • the reagent kit for quantifying HDL cholesterol comprises a first reagent containing the above-mentioned acylpolyoxyethylene sorbin ester and an enzyme, and a second reagent containing an alkylpolyoxyethylene ether.
  • Examples of the enzyme in the first reagent include CE, CO, and the like. Also the
  • reagent besides the enzyme, usually, for example, the enzyme POD, HDAOS, TO Chromogens such as OS can be blended, but those that react with these chromogens to produce quinone dyes, such as 4-aminoantipyrine, are not blended.
  • the enzyme POD, HDAOS, TO Chromogens such as OS can be blended, but those that react with these chromogens to produce quinone dyes, such as 4-aminoantipyrine, are not blended.
  • the second reagent usually contains a substance which reacts with the chromogen to form a quinone dye, for example, 4-aminoantipyrine.
  • the reagent kit of the present invention may be divided into the first and second reagents at the latest at the time of quantitative measurement of HDL cholesterol at the latest. Therefore, in general, the form of a reagent kit should be divided into three or more types of reagents in consideration of stability, etc., and prepared into the above-mentioned first and second types of reagents at the time of use for measurement. May be something.
  • first and second reagents were prepared using Tween 85 (trade name) as an acylpolyoxyethylene sorbitan ester and Brij 98 (trade name) as an alkylpolyoxyethylene ether.
  • the operation of centrifugation conventionally required in the precipitation fractionation method is not required, so that the operation is simplified, and a large number of samples can be prepared in a short time. Can be easily processed.
  • continuous measurement can be performed using a general-purpose automatic analyzer, and HDL cholesterol can be measured in a multichannel manner with other test items.
  • the risk of virus infection is reduced because the chances of directly handling the sample in handling the sample are significantly reduced.
  • it can measure even small amounts of sample Because of its ability, it can be measured even when blood collection is limited, such as in children and the elderly. Therefore, the method of the present invention is extremely useful in the field of clinical testing, and can contribute to improvement of work efficiency in daily clinical testing.
  • the reagent kit for quantifying HDL cholesterol of the present invention has an effect as a reagent kit for performing the method of the present invention.

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Description

W 7
明細書
高比重リポ蛋白分画中のコレステロ一ルの定量方法及び定量用試薬キット 技術分野
本発明は、 高比重リポ蛋白 （HDL) 分画中のコレステロール （以下 「HDL コレステロール」 ともいう。 ） の定量方法及び定量用試薬キットに関し、 とりわ け臨床検査の分野において、 血清などの生体試料中の HDLコレステロールの定 量方法、 及び HDLコレステロール定量用試薬キッ トに関する。
背景技術
血液中のリポ蛋白はその比重により、 カイロミクロン （比重く 1, 006 ) 、 超低比重リポ蛋白 （¥101^， 比重1. 006〜1. 0 1 9) 、 低比重リポ蛋白 (LDL, 比重 1. 0 1 9〜1. 063) 、 高比重リポ蛋白 （HDL, 比重 1. 063〜1. 21) などに分類され、 これらのリポ蛋白の代謝に影響を与える疾 患についての研究が進められてきた。 中でも HDLについては、 その分画中の成 分であるコレステロールが虚血性心疾患に密接に関係するとの 1 977年の
Framinghamの報告以来、 急速に研究が進んでいる。
従来、 HDLコレステロールの定量は沈澱分画法、 超遠心法、 電気泳動法など により分離された HDL分画について、 その成分であるコレステロールが公知の 方法にて測定されている。 臨床検査での測定では、 沈澱分画法がよく行われてい る。 これは沈澱剤を用いて HDL以外のリポ蛋白分画を沈澱させ、 それを遠心分 離して HDL分画を得る。 このときの沈澱剤としては、 ポリア二オンと 2価の力 チオンとの組み合わせが良く用いられる。 このようなポリア二オンにはポリェチ レングリコール、 リンタングステン酸、 デキストラン硫酸などがあり、 また 2価 のカチオンとしては Mg、 Mn、 Ca、 L i、 N iなどが知られている。
次に、 遠心分離により得られた HDL分画中のコレステロールを定量する公知 の方法としては、 酵素反応による測定が良く用いられる。 なかでも、 コレステロ —ルエステラーゼ （CE) とコレステロールォキシダーゼ （CO) を用い、 さら にペルォキシダーゼ （POD) と色原体とを組み合わせて可視部領域で吸光度を 測定する方法が良く知られている。
しかしながら、 このような従来の沈澱剤を用いる方法で、 H D L分画を分離す るには、 遠心分離の操作が必要となるため、 臨床検査の日常業務で効率化のため の自動分析装置を用いる場合には、 直接利用できないという制約があった。 その ため HD Lコレステロールを他の検査項目とマルチチャンネル化して測定するに は支障があった。
発明の開示
本発明は、 上述の課題を解決し、 HD Lコレステロールを効率良く測定するこ と、 とりわけ臨床検査において自動分析装置を用いて測定できる有用な方法及び そのための試薬キットを提供することを目的とする。
本発明者らは鋭意研究した結果、 H D L以外のリポ蛋白分画中のコレステロ一 ルに酵素を優先的に作用させる界面活性剤と、 H D L以外のリポ蛋白分画中のコ レステロールに対する酵素による作用を抑制させる界面活性剤とを用いることに より、 H D L分画中のコレステロールが測定できることを見い出した。 そして、 さらに研究を重ねた結果、 上述の目的が達成されることを見い出し、 本発明を完 成するに至った。
すなわち、 本発明は、 ァシルポリオキシエチレンソルビタンエステルにより、 H D L以外のリポ蛋白分画中のコレステロールに酵素を優先的に作用させて得ら れる反応生成物を反応系外に導き、 次にアルキルポリオキシエチレンェ一テルに より、 H D L以外のリポ蛋白分画中の残存するコレステロールに対する酵素によ る作用を抑制させるとともに、 HD Lコレステロールに酵素を作用させて反応を 進行させることを特徴とする HD Lコレステロールの定量方法に関するものであ る。
さらにまた、 本発明はァシルポリオキシエチレンソルビタンエステル及び酵素 を含む第 1試薬と、 アルキルポリオキシエチレンエーテルを含む第 2試薬とから なることを特徴とする HD Lコレステロール定量用試薬キットに関するものであ る 発明の詳钿な説明
本発明における、 コレステロールに作用する酵素としては、 コレステロールェ ステラ一ゼ （CE) 、 コレステロールォキシダ一ゼ （CO) などが例示される。 リポ蛋白分画中には、 コレステロールの他にコレステロールエステルも含まれて いるので、 通常、 コレステロールエステルを加水分解させてコレステロールに変 換させるために、 コレステロールエステラーゼ （C E) をコレステロールォキシ ダーゼ （CO) と共存させる。
本発明の試薬キッ トにおける第 1試薬中の酵素は、 例えば CEの場合には、 1 単位/ m 1〜 1 0 0単位/ m 1、 好ましくは 1単位 Zm 1〜 5 0単位ノ m 1、 C 0の場合には、 0. 5単位 Zm l〜l 00単位 Zmし 好ましくは 1単位/ m l 〜5 0単位 Zm lとなるように配合するが、 試料の種類などに応じて適宜決定さ れる。
HDL以外のリボ蛋白分画である LDL、 VLDL、 カイロミクロンなどに含 まれるコレステロールに対して、 上記酵素を優先的に作用させるァシルボリォキ シエチレンソルビタンエステルは、 通常 Cn ソルビタン E, と略記される、 親水 性部分にポリオキシエチレンを持つ非イオン性界面活性剤であり、 本発明の目的 に適合するものであれば全て用いることができる。 具体的な商品名としては、 Tween 2 1 (〇 12ソルビタン E4) 、 Tween 8 1 ( C！ 2ソルビタン E 5)、 Tween 20 (( 12ソルビタン E2。）、 Tween 40 (C 16ソルビタン E2。）、 Tween 60 (C 18ソルビタン E20)、 Tween 8 0 (C 18 ソルビタン E20)、 Emasol 4 1 3 0 ((：18ソルビタン Ex )、 Tween 8 5 (C 17 : ノルビタン E20) などが例示さ れる。
本発明の試薬キッ トにおける第 1試薬中のァシルポリォキシエチレンソルビ夕 ンエステルは、 通常、 反応液中において 0, 0 0 1 ^ ¥%〜0. l w/v%、 好ましくは 0. 00 1 w/v%〜0. 05w/v%となるように配合されるが、 試料の種類などに応じて適宜決定される。
HDL以外のリボ蛋白分画中のコレステロールに対する上記酵素の作用を抑制 9 71 T/
させるアルキルポリオキシエチレンエーテルは、 通常 Cn Ex と略記される、 親 水性部分にポリオキシエチレンを持つ非ィォン性界面活性剤であり、 本発明の目 的に適合するものであれば全て用いることができる。 具体的な商品名としては、 Atlas G 2 1 27 (C12E8 )、 Brij 36 T (C12E10) 、 Nopalcal 6— L (C12E14) . Brij 35 (C12E23) . Emulogphene B C 720 (C 12E9.8 ) Sterox A J 1 0 0 (C13E9.5 ) > Brij 5 6 (CieE,0) > Brij 5 8 (C,6 E20) 、 Brij 76 (C18E10)、 Brij 96 (C18:1E10)、 Brij 78 (C】8 E20) 、 Brij 98 (C18:1E23) などが例示される。
本発明の試薬キットにおける第 2試薬中のアルキルポリォキシェチレンエーテ ルは、 通常、 反応液中において 0. 00 1 wZv 〜 5 wZv%、 好ましくは 0. 05 w/v 〜 2 w/v%となり、 また第 1試薬中に配合されるァシルポリォキ シエチレンソルビタンエステルよりも高濃度となるように配合されるが、 試料の 種類などに応じて適宜決定される。
本発明の定量方法では、 まずコレステロールに作用する酵素と、 上記ァシルポ リオキシエチレンソルビタンエステルと、 試料とを混合させる。 すると、 ァシル ポリオキシエチレンソルビタンエステルの存在により、 反応液中に含まれる酵素 が、 HDL以外のリボ蛋白分画中のコレステロールに優先的に作用する。
酵素が C Eと C 0との組合せからなる場合には、 酵素の作用によりコレステロ ールの反応生成物として過酸化水素が生成する。 本発明の定量方法においては、 第 2試薬中のアルキルポリオキシエチレンエーテルを反応系に混在させる前に、 生成した反応生成物を反応系外に導く必要があり、 例えば色原体が用いられる。 色原体は、 ニトロ基、 ァゾ基、 カルボニル基、 エチレン結合、 シアン基などの発 色団を含み、 水酸基、 アミノ基などの助色団を含まない有機化合物である。 本発 明において用いられ得る色原体としては、 単独では発色能力が弱いが、 上記助色 団を含む有機化合物が共存することにより、 発色能力が増強されるものが好まし い。 反応生成物が過酸化水素である場合には、 ペルォキシダーゼ （POD) の存 在下で、 N— （2—ヒドロキシー 3 -スルホプロピル） 一 3, 5—ジメトキシァ 二リンナトリウム塩 （HDAOS) 、 N—ェチルー （2—ヒドロキシ— 3—スル ホプロピル） 一 m—トルイジン （TOOS) などの色原体と過酸化水素とを反応 させて、 無色の複合体を形成させ、 過酸化水素を反応系外に導くことができる。 通常、 PODは、 0. 0 l U/m l〜l 0 UZm 1、 好ましくは 0. 5 UZm l〜5U/ml、 色原体の濃度は、 0. 001 wZv%〜l wZv%、 好ましく は 0. 0 1wZv%〜0. 5 wZv%とするが、 試料の種類などに応じて適宜決 定される。
次に、 反応液中に、 第 2試薬中のアルキルポリオキシエチレンエーテルを混在 させることによって、 HDL以外のリポ蛋白分画中の残存するコレステロールに 対して、 酵素の作用が抑制されるとともに、 酵素が HDLコレステロールに対し て作用し、 酵素の作用によりコレステロールの反応が進行する。
酵素が C Eと C Oとの組合せからなる場合には、 この反応により過酸化水素が 生成される。 この過酸化水素は、 PODの存在下で、 例えば 4一ァミノアンチピ リンなどの助色団を含む有機化合物 （0. 00 1wZv%〜0. lwZv%、 好 ましくは 0. 00 1wZv%〜0. 05 wZv%) と、 色原体とを縮合反応させ、 キノン色素を生成させる。 なお、 色原体としては、 上述の HDAOS、 TOOS などを挙げることができる。 このキノン色素を比色測定することによって、 HD Lコレステロールが測定できる。 比色測定は既知の方法により行うことができ、 例えば自動分析装置を用いて行うことができる。
本発明方法における各反応、 即ち第 2試薬を反応系に混在させる前または混在 させた後の各反応は、 それぞれ通常、 室温下で、 1分間〜 1 0分間、 好ましくは 3分間〜 7分間行なわれるが、 特にこの条件に限定されるものではない。
本発明の HDLコレステロール定量用試薬キッ トは、 前述のァシルポリオキシ ェチレンソルビ夕ンエステル及び酵素を含む第 1試薬と、 アルキルポリォキシェ チレンエーテルを含む第 2試薬とからなる。
第 1試薬中の酵素には、 例えば CE、 COなどを挙げることができる。 また第
1試薬中には、 酵素の他に、 通常例えば、 酵素 POD、 さらに HDAOS、 TO OSなどの色原体が配合され得るが、 これらの色原体と反応してキノン色素を生 成するもの、 例えば 4ーァミノアンチピリンなどは配合されない。
これに対して、 第 2試薬中には、 通常、 色原体と反応してキノン色素を生成す るもの、 例えば 4—ァミノアンチピリンなどが配合される。
なお、 本発明の試薬キッ トは、 遅くとも HDLコレステロールの定量測定時に おいて、 このように第 1及び第 2の二種類の試薬に分かれていれば良い。 従って、 一般に試薬キットとしての形態は、 安定性などを考慮して三種類以上の試薬に分 けておき、 測定のため使用時において上記の第 1及び第 2の二種類の試薬に調製 するようなものでも良い。
実施例
以下、 本発明をより詳細に説明するため実施例を挙げるが、 本発明はこれらに 限定されるものではない。
〔実施例 1〕
ァシルポリオキシエチレンソルビタンエステルとして商品名が Tween 85、 ま たアルキルポリオキンエチレンエーテルとして商品名が Brij 9 8の界面活性剤 をそれぞれ使用して、 次の第 1及び第 2試薬を準備した。
〈第 1試薬〉
1 OmMのリン酸緩衝液 （pH7. 0) 、 0. 1 2 m gZm 1の HD AO S、 0. 6単位 Zm lの POD、 1 0単位ノ1!11の0 0、 1 0単位 11 1の〇£、 0. 0 1 w/v%の Tween 8 5
〈第 2試薬〉
1 OmMのリン酸緩衝液 （pH 7. 0)、 0. 1 5 m g/m 1の 4一アミノア ンチピリン、 1. 5w/v%の Brij 9 8
日立 7 1 70型自動分析装置を用いて、 試料 4 1に第 1試薬 25 0 / 1を加 え、 5分後に第 2試薬 5 0 1を加え、 5分後に波長 6 0 0 nm/ 7 0 0 nmで 測定した。 試料として HDLコレステロール濃度が 1 5 0mg/d 1の血清を 1 0段階に希釈したものを用いたところ、 表 1に示すように、 良好な直線性が得ら れた <
表 1
Figure imgf000009_0001
この実施例においては、 第 1試薬を添加した後に、 遠心分雜などの煩雑な操作 を必要とせず、 試料中に第 2試薬を添加するだけで、 試料中の HDLコレステロ ールの量に対応して生成されたキノン色素の比色測定が行なわれる。
〔実施例 2〕
実施例 1 と同様の試薬を用いて、 同様に日立 7 1 70型自動分析装置で 20例 のヒト血清を試料として測定し、 標準液の測定から HDLコレステロール値を求 めた。 そして同じ試料について市販製品 〔商品名： HDL—コレス （PG) 、 国 際試薬社製〕 を用いて測定した値と比較した。 その結果、 表 2に示すように、 良 好な相関性が得られた。 表 2 試料 Νοι 本発明の方法 従来の方法 （市販製品）
1 5 7. 3 5 5. 8
2 5 5. 6 5 8. 6
3 28. 5 2 1. 0
4 75， 4 74. 4
5 5 5. 1 5 0. 8
D 6 9. 0 6 5. 5
7 6 7. 0 6 1. 5
8 3 7. 3 3 3. 2
9 4 3. 8 4 0. 1
1 0 77. 8 7 8. 4
1 1 6 5. 6 5 6. 7
1 2 8 3. 5 8 2. 0
1 3 54. 4 5 2. 1
1 4 4 9. 4 4 7. 5
1 5 57. 9 5 5. 5
1 6 4 8. 3 44. 0
1 7 5 6. 1 5 5. 1
1 8 52. 9 4 9. 7
1 9 6 0. 3 5 2. 9
2 0 1 27. 4 1 24. 5
単位： /d£
産業上の利用可能性
本発明の HDLコレステロールの定量方法によれば、 従来、 沈澱分画法におい て必要とされていた遠心分離の操作が不要となるので、 操作が簡略化され、 多数 の試料を短時間で、 かつ容易に処理できる。 しかも 2種類の試薬を用いる方法に 応用できるので、 汎用型の自動分析装置を用いた連続的な測定が可能となり、 H D Lコレステロールを他の検査項目とマルチチャンネル化して測定することがで きる。 また、 試料を取り扱う上で、 試料に直接手を触れる機会が著しく減少する ので、 ウィルス感染の危険性も減少する。 さらに、 微量の試料に対しても測定可 能であるので、 小児や老人など採血量に制限がある場合でも測定が可能となる。 従って、 本発明方法は、 臨床検査の分野において極めて有用であり、 臨床検査の 日常業務における作業効率の向上に貢献することができる。
また、 本発明の H D Lコレステロール定量用試薬キッ トは、 本発明方法を実施 するための試薬キットとしての効果を奏する。

Claims

請求の範囲
1 . ァシルポリオキシエチレンソルビ夕ンエステルにより、 高比重リボ蛋白以外 のリポ蛋白分画中のコレステロールに酵素を優先的に作用させて得られる反応生 成物を反応系外に導き、 次にアルキルポリオキシエチレンエーテルにより、 高比 重リボ蛋白以外のリボ蛋白分画中の残存するコレステロールに対する酵素による 作用を抑制させるとともに、 高比重リポ蛋白分画中のコレステロールに酵素を作 用させて反応を進行させることを特徵とする高比重リポ蛋白分画中のコレステロ ールの定量方法。
2 . 酵素がコレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダ一ゼである 請求項 1記載の方法。
3 . ァシルポリォキシェチレンソルビ夕ンエステル及び酵素を含む第 1試薬と、 アルキルポリオキシエチレンエーテルを含む第 2試薬とからなることを特徵とす る高比重リボ蛋白分画中のコレステロール定量用試薬キット。
4 . 酵素がコレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダ一ゼである 請求項 3記載の試薬キット。
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