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WO1997049427A1 - Medicament permettant d'attenuer les problemes renaux - Google Patents

Medicament permettant d'attenuer les problemes renaux Download PDF

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Publication number
WO1997049427A1
WO1997049427A1 PCT/JP1997/002241 JP9702241W WO9749427A1 WO 1997049427 A1 WO1997049427 A1 WO 1997049427A1 JP 9702241 W JP9702241 W JP 9702241W WO 9749427 A1 WO9749427 A1 WO 9749427A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
phospholipase
ser
type
antibody
thr
Prior art date
Application number
PCT/JP1997/002241
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yasushi Kawauchi
Jun Takasaki
Kazumi Hayashi
Yasuhiko Masuho
Original Assignee
Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. filed Critical Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority to AU32761/97A priority Critical patent/AU3276197A/en
Publication of WO1997049427A1 publication Critical patent/WO1997049427A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to an agent for improving kidney injury, and more particularly to an agent for preventing, modifying, or treating a disorder caused by administration of a gold compound.
  • I-metallized compounds are anti-Mi ⁇ drugs and are widely used for urinary / genital tumors in the polar region as well as in the iH: region.
  • bladder cancer ovarian cancer, cervical cancer, esophageal cancer, cancer and other panpan.
  • the bone marrow gap 'there are side effects the river, such as Utsuwasuki 1 ⁇ 2, especially ⁇ ' hearing is low / 11 ri:! Order to occur in 1 to ⁇ mn Because of this, throw ⁇ . Is restricted.
  • Cisplatin is filtered from the glomerulus and is secreted from the proximal fibrils and excreted in the urine, so that cisbratin at the skin ft depth; Renal damage is seen in the proximal renal fine of ⁇ , in extraordinary I un-h; ⁇ cause fine ⁇ necrosis of the state (Shigeru Kimura ⁇ ::., Et al., 1 ⁇ of Cis-Diaminedichloroplatinum (1 1); of electron microscopy , E1 Urinary Society 76: 1439-1453, 1985).
  • 24-hour continuous infusion Jac obs, C. et al., 24-hour infusion ⁇ cis-platinum in head and neck cancer.
  • the suppression of renal injury by cisplatin is defined as F1 ⁇ vasodilator, adenosine A1 receptor antagonist, radical scavenger, lysolime membrane stabilization ⁇ (Deegan, PM et al. Renal Failure 17, pll7-123 (1995), Nagashima, K. et al. Jpn. J. Pharmacol. 67, p349-357 (1995), Mc Ginness, JE et al. Physiol. Chem. Physics. 10, p267-277 (1978) Lab. Invest. 55, p557-563 (1986), Kobayashi; Akira, et al., Japan Obstetrics and Gynecology Association 41. ⁇ 683-687 (1989)), etc. ⁇ ', but not to clinical Okawa. Under these circumstances, the use of cisplatin ⁇ ⁇ ) is a drug that can be used as a drug.
  • JJ Phospholipase
  • Phospholipase is known as an element that hydrolyzes the ester bond at the C2 position of 1,2-diacylphosphoglyceride, which is a component of the upper resting component.
  • This enzyme is found in the extreme organs and cells of ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , and not only regulates the metabolism and metabolism of biological membrane phospholipids, but also has the role of arachidonic acid cascade as a yeast: It is known that the products of the process, such as prostaglandin, leukotriene, tromboxane, and PAF, have various properties.
  • Phospholipase ⁇ 2 contains ⁇ , ⁇ ⁇ ! The intracellular ⁇ is known (II IIRa ⁇ Clinic, 1994 Special Issue, 202-206). Even in this block, the type 11 phospholipase ⁇ 2 is induced into the exudate block of the inflamed site along with the inflammation reaction, and many ⁇ are released into the blood. In addition, there are rare reports suggesting that this enzyme is a part of the cause of the disease in some inflammatory diseases.
  • Kikuchi- Yano shita discovered that distribution I 1 to the model of ⁇ Blood heart disease in rats, a model of myocardial infarction in correspondence with the progress of organ ⁇ harm the activity of this enzyme is elevated; to (K i kuc hi -Ya noshita, R. et al., J. Biochemistry, 114: 33-38, 1993)
  • Monoclonal antibody that releases II phospholipase bound to the cell crotch which is a monoclonal antibody, or a part thereof, is used to test the antimicrobial activity.
  • Pharmaceutical composition which is a modification of ⁇ ⁇ by administration of Guangqi ⁇ ⁇ ⁇ as an active ingredient
  • Phospholipase ⁇ 2 is human! The composition according to any one of (1) to (3),
  • the monoclonal antibody has a function of releasing human native type II phospholipase A2 bound to the cell membrane, and the monkey f1: l native type II phospholipase A2 bound to the cell membrane and / or mouse-derived type 11 phospholipase A2 (2) the medical composition according to (2), wherein
  • Monoclonal antibody is one of the types II phospholipase A2 derived from human, and the monkey I II's phospholipase A2 and / or mouse Yamaki 11 11 '! (3)
  • the pharmaceutical composition according to (3) which is a monoclonal stake rest that is capable of acting and capable of releasing 11 ⁇ phospholipase ⁇ 2 that has been linked to cell detachment.
  • Antibodies refers to ⁇ - ⁇ ⁇ ⁇ that are / -stimulated by the immune response, are '- ⁇ in the rest of the day, and have the activity to specifically bind to the immune j (antigen).
  • a “monoclonal antibody” is an antibody that is produced by a single-clone pile rest cell (Biochemical Dictionary 2nd ed., 1359 ⁇ , Tokyo Chemical Co., Ltd. (1990)).
  • ⁇ White matter is the 'L: essential component of an organism, consisting of a polypeptide chain in which approximately 20 L-amino acids (including glycine) are linked by peptide bonds. ; : 'Dictionary 2nd edition, 810 shellfish, ⁇ ⁇ Chemical Doujin (1990)) ⁇
  • Peptide means two or more amino acids joined by a peptide ⁇ It means that the number of amino acids is about 10 or less is called lipopeptide, and the one with less than 1 is called polypeptide (Biogenesis ⁇ Dictionary 2nd edition, 1202 ⁇ ⁇ Kagaku Doujin (1990)).
  • Epitope means the structure of the i-position that is present in the antigen component f-10 and identified by the antibody. ( ⁇ Chemical Dictionary 2nd ed., 195 ⁇ , Tsukakyokadoujin (1990); ⁇ , Bio i Shinkawa Dictionary 4th Edition, 93, Saito Biotech (1995)).
  • revision j refers to an agent that reduces the harm of the A metallized pedestal and reduces the damage.
  • the pile rest of the Hjj, antibodies as possible out to inhibit the ' ⁇ ⁇ ⁇ of II phospholipase A2 Kuikyu is preferably dry.
  • ⁇ ⁇ : from the things ⁇ rest to W.1 is the river Iruko Toga ⁇ 1 ⁇ a, ⁇ No 'A monoclonal antibody with' reaction ' would be suitable. It is also known that phospholipase A2fi ':?
  • Antibodies that release phospholipase A2 enzyme from cell membranes Is used.
  • Specific antibodies include, for example, the monoclonal antibody described in International Publication No. ⁇ 96 / 20959, and the monoclonal antibody 12 ⁇ 5, 10.1 or 1.4 is preferred. Is more preferred.
  • hybridomas 12H5, 1.4, and 10.1 These monochrome piles have an nj ability to pick up and remove hybrids that have these / rests, namely, the hybridomas 12H5, 1.4, and 10.1.
  • hybridomas 12H5, 1.4, and 10.1 These hybridomas were obtained by increasing the immunity and increasing the immunity Kfj'ij, and spleen cells of BALB / c mice sensitized with 11-phospholipase A2 in healthy volunteers and Pffix cells of mouse P3x63Ag8 / U 1 (P3U1) can be fused by a conventional method, for example, the cell fusion fY method of Kayla and Milstein, and j: is effective (International Publication No. 96/20959 ⁇ ' ⁇ ⁇ / j Details).
  • the mouse hybridomas 12H5, 1.4, and 10.1 obtained by the present inventors have been deposited as follows.
  • Dulbecco's modified minimum essential medium As a medium for culturing the hybridoma, for example, Dulbecco's modified minimum essential medium (Dalbecco's modified minimum essential medium; hereafter abbreviated as “DMEMj”) is used.
  • DMEMj Dulbecco's modified minimum essential medium
  • a medium containing glutamine, glucose, sodium pyruvate, 2-mercaptoethanol, and stake organisms for example, penicillin 0, streptomycin, genyumycin, etc. is used.
  • Hybridoma cultures are usually 5% at 37 ° C in medium 11 '-carbon oxide, 95% empty In the abdominal cavity of BALB / c mice pre-treated with 2,6,10,14-tetramethylpentyldecane (e.g., Aldrich i, Pristane) for 2-4 days in the gas phase
  • the purification is carried out in about 10 to 20 ⁇ g to produce antibodies that can be purified.
  • the antibody used in the liquid assay may be a part thereof, or may be a part retaining the action of inhibiting II phospholipase A2 activity.
  • Pile rest is digested with a protease such as pepsin by a conventional method, and is isolated and purified by a conventional method for decoupling I'l protein. ) You can get 2 .
  • the H chain and H promotion of the pile body and the H / A are converted to U (: I) by the dialkylation of the disulfide bond connecting H'i and L by the flow of dithiothreitol and odoacetamide.
  • Hl and L ⁇ ' ⁇ can be ⁇ littered 'by the J bond alone, and the ⁇ alkyl rest can be achieved (“Useful immunity test method I: Scientific, 1984”) j See 39 shellfish).
  • Monoclonal antibody lysate that is introduced in the water is used to inject proteins or peptides that contain the components of the stake.
  • Examples of such monoclonal suspensions include: (1) an antibody consisting of a single amino acid sequence derived from an animal such as a mouse only in the i and J variable regions, and a normal region consisting of the amino acid sequence of human wildlife.
  • a so-called “chimeric antibody” (2) only the complementarity determining region (or super- one- variable region: abbreviated as "CM_i” (abbreviated as “omplementarity-determining region”))
  • the remaining region is composed of amino acid sequences, and the other region is a stake rest consisting of the amino acid K sequence of human wildlife, that is, a so-called "humanized an tibody”.
  • “Chimeric pile rest” or “humanized antibody” means, for example,
  • SEQ ID NOs: 2, 4, and 19 are shown in any of 21.
  • the amino acid sequence listed above is CDR part (SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 22, 23) , 24, 25, 26
  • a DNA containing a base sequence encoding 27) is also preferably used.
  • the chimeric antibody according to the present invention which encodes humanized anti-bacterial activity, - for inhibiting the activity, it is also possible to have ffl the IgG 4 ⁇ Ko as a framework portion (J.Exp.Med.166,1351-1361 (1987)).
  • the gene encoding the antibody can be isolated from the hybridoma producing the antibody of the present invention by a known method (Cancer Research, 47, 999-1005 (1987): Proc. Natl. Acad. Sci. .84, 2936-2940 (1987)). For example, it is possible to ⁇ ) separate from the aforementioned mouse hybridomas 12H5, 1.4, 10.1 by a known method.
  • the protein or peptide comprising the monoclonal pile of the present invention or a part thereof may be incorporated into the expression vector by incorporating the ordinal portion or a part of the gene encoding the antibody of the present gf! Ij, Large m ⁇ , fermented fii or ⁇ of course to the cell! It is the "J ability" that can also be obtained by letting them do it.
  • the amino acid exchange and the deletion of the antibody or a part thereof introduced in the present invention can guide the change of import.
  • the introduction of an amino acid alteration can be performed by introducing an alteration such as base substitution, ablation or insertion into a DNA encoding the amino acid.
  • the conversion of DNA can be conducted by a known method (Gillamn et al., Gene, 8, 81-97 (1979): Roberts et al. 'Nature, 328, 731-734 ( 1987)).
  • a force method based on the phage display method (Annu. Rev. Immunol., 12,433-455 (1994)).
  • Monoclonal antibodies 12H5 and 10.1 ligase can also bind to the epitope linked by 1.4.
  • Those skilled in the art can easily identify the peptide to which a specific monoclonal antibody binds by using a conventional method (see “Monoclonal Experiment J. (See Tokyo Kagaku Doujin (1989).)
  • various monoclonal antibodies that bind to the epitope can be obtained by immunization using the synthesized epitope or the like. Yes (E. Cordelia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10290-102 94 (1993)).
  • all or a part of the antibody clones directed against a part thereof may be subjected to an ELISA method using an epitope to screen a specific monochrome-null pile. It is possible.
  • the agent for improving renal impairment of the present invention is determined depending on the case in consideration of the administration route, disease symptoms, age and sex of the administration subject, and the like.
  • the renal stimulant-improving agent of the present invention is particularly effective when an antibody is used as an active ingredient, non-oral injection, that is, subcutaneous, intramuscular or intravenous injection.
  • I-streams usually consist of a solution of protein or peptide in a water-repellent, preferably aqueous, solution. Each aqueous solution can be used 4 times, for example, water, buffer, 0.4% saline, (1.3% glycine, 5% glucose, human albumin solution. These solutions are free.
  • Auxiliary materials that are necessary for approaching Ui! Conditions such as chemicals, etc., are used as vegetative materials, for example, sodium acetate, sodium chloride, chlorination power It can produce lithium, calcium chloride, sodium lactate, sodium citrate I, and lium ji.
  • Well-known ridges have the ability to perform well-known techniques, such as, for example, Remington's Pharmaceutical Science, l5J; k, Mack Publ.
  • 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 'It can be used by dissolving it in a suitable solvent, and can be used in freeze-drying and ffi-living.
  • the administration method is as follows: [Before gold compound administration, at the same time as I gold compound injection, or after gold compound injection 'J. 3 ⁇ 4Can submit drug accusations.
  • the dose m of the monochromatic pile rest that is used in the present development is preferably 0.1 mg / kg to 500 mg / kg, and is usually injected into the pulse.
  • ⁇ ' is a joint action machine i ⁇ , (3 ⁇ 4found and ,, 22, ll, p57 (l 988), Physician's desk reference, BOedition p705 (1996))
  • Compounds with anti-inflammatory properties such as cisplatin, carboplatin, nedaplatin, ticoblatin, or ⁇ cancer chemotherapy '' (p27, 1990-1991, Chugai ' 254-5, DWA2114R, NK121 and the like described above.
  • cisplatin or carboplatin Simple theory of drawing
  • Figure 2 shows the results of the ELISA for 10.1 and 1.4 for 'li liU Koitayama ⁇ phospholipase A2 ⁇ '.
  • [1]] 4 shows the inhibition of 12H5, 10.1 and 1.4 against rat II phospholipase A2.
  • J6 shows an additive effect on each of the polar platelet Yamato phospholipases A2? V, 'I: of 10.1.
  • 1-18 indicates the action of releasing phosphorivase-2 bound to ⁇ -3A cells at 12 ⁇ 5, 1.1 and 1.4.
  • This section describes the method for anchored PCR cloning of the 1.4 and 12H5 positions' ⁇ and Lii'J: region cDNA.
  • M10 is the cDNA sequence and translated amino acid sequence of the uj domain of L Is shown. In addition, it is predicted to correspond to the CDR sequence (the row is labeled with a linear force.
  • FIG. 11 shows the cDNA sequence and translated amino acid sequence of the variable region of the H chain of antibody 1.4. The sequences predicted to correspond to the CDR sequences are underlined
  • Figure 12 shows the method for PCR cloning of the H and L chain variable regions cMA in 10.]
  • Figure 13 shows the piles 1 shows the cDNA sequence and translated amino acid sequence of the variable region of the L chain of 12H5, and the sequence corresponding to the CDR sequence is underlined.
  • I 14 shows the cDNA sequence and translated amino acid sequence of the variable region of the heavy chain of antibody 12H5. Note that the sequence that is considered to correspond to the CDR sequence is marked with a dotted line. l3 ⁇ 4l 15 shows phospholipase A2 i.: in mouse 4 ′ after cisplatin injection.
  • f3 ⁇ 4l 16 shows the mouse “I'y-GTPgu properties” after administration of cisplatin.
  • FIG. 17 shows mouse BUN i at 4 4! I after administration of cisplatin.
  • Moto monochrome one monoclonal antibody is ⁇ is by immune a Rikonbinan Bokuhi Bok II phospholipase A2, but recombinant human WINCH 1 1 3 ⁇ 4 Hosuhoripa its tone ⁇ all Japanese ⁇ 7 5- 192167 ⁇ Publication Ichize ⁇ 2 Performed according to the method described above.
  • BALB / c strain male mice the (seismic & 6 weeks old at ⁇ Hajimeji), ginseng ⁇ Example la) ⁇ animals the convenor emissions Bok human type II phospholipase A2 or purified, 1 'I Ri 20 ⁇ G, 0 , 1 ml of ⁇ ⁇ .
  • Saline solution was mixed with Freund's complete adjuvant, emulsified, and injected intracrotally (primary immunization). Afterwards, 2-3 ⁇
  • nj phospholipase ⁇ 2 Was mixed with Freund's complete adjuvant of the same volume and emulsified, and a booth was thrown.
  • phospholipase A2 Twenty-four days after the seventh immunization, 20 / g of phospholipase A2 per animal was dissolved in 0.2 ml of physiological saline and administered intraperitoneally (final immunization). Three days after the final immunization, splenic armpit cells were collected from 1 P mice and suspended in DMEM-ground.
  • DMEMlOml kept at 37 ° C was dropped to terminate the cell lysis reaction.
  • the reaction mixture was centrifuged, after removing the h3 ⁇ 4 solution, HAT medium [hypoxanthine (1x10 ' ⁇ ), Ami Noputerin (4x10- 7 ⁇ ), 10% ⁇ sheet fetal thymidine was added (1 .6x10 ⁇ ⁇ ) It was added to the residue DMEM medium] containing linf, spleen cell concentration; was set to 6XlO s cell number / ml. The suspension was dispensed into a 96-well plastic plate at a rate of 200 ⁇ 1 ( ⁇ 1.2 ⁇ 10 : 'cells) per well.
  • the medium was removed by suction, and the medium was added. Cell fusion? About 10 holes later, about half of the holes had Hypri-doma ⁇ ⁇ .
  • the antibody activity in the supernatant was measured by the method of d). Positive clones were transferred to a 48-well plastic plate and further transferred to a 24-well plastic plate and cultured in the same manner as described above except that aminopterin was eliminated. On a 24-well plastic plate culture, the antibody activity was confirmed by the method of d), and the enzyme inhibitory activity was measured by the method of e).
  • the purified recombinant human type II phospholipase A2 was dissolved in 0.05 ⁇ g / ml of 20 mM Tris-buffered saline (TBS, pH 7.4) in each well (well) of a 96-well incisor microplate. And stored at 4 ° C overnight in a humid chamber. Thereafter, the solution is discarded, and TBS containing 1% blood serum albumin (hereinafter, abbreviated as BSA) is added in 200 ⁇ 1 each, and incubated at 37 ° C for 1 hour to block an adsorbed portion of each gel. did.
  • TBS Tris-buffered saline
  • BSA blood serum albumin
  • the o High Priestess dormer culture say yes ascites say yes that was TBS (TBS-Tween) several times with a solution washing ⁇ containing 0.05% Tween 20 (Tween 20 trade name): the Seikuikyushirube ⁇ , 0.2% BSA
  • TBS-Tween BSA-TBS-Tween
  • Recombinant human type II phospholipase A2i 0.5 ⁇ and a culture supernatant or a purified pile were prepared using a 125 mM Tris-HCl buffer containing 150 mM sodium chloride, 12.5 mM calcium chloride, and 250 ⁇ g / ml BSA.
  • the solution (pH 8.0) was subjected to preincubation at room temperature for 2 times at room temperature.
  • 25 ⁇ ⁇ ⁇ 1 (10 cpm from 5 nogo) of the autoclave SN17 containing tritium-labeled oleic acid was added to the reaction solution, and the mixture was reacted at 37 ° C for 30 minutes. I let you.
  • reaction was transferred to ice, and 4N hydrochloric acid was added in 25 ⁇ 1 to give ⁇ II :. After the reaction was stopped, 25 mg / ml of 40 mg / ml BSA was added, mixed, and then released on ice for 30 minutes.
  • the supernatant was centrifuged at 15000 rpm for 2 minutes to measure the radioactivity of the supernatant.
  • the value obtained by subtracting the negative control (radioactivity of a sample not containing phospholipase II and antibody) from the obtained radioactivity was defined as the phospholipase A2 activity.
  • the Ml ',' ratio for the phospholipase A2 activity of the antibody was calculated based on the phospholipase-2 activity of the positive control (phospholipase-2 activity of a sample containing only the phospholipase-2 and not producing the antibody). It was a fraction.
  • Phospholipase A2 (1) (Phospholipase A2 and I, 1 ⁇ Phospholipase A2 i,) / (n-control phospholipase A2 activity)
  • the same volume of binding buffer was added to the gamma globulin fraction, mixed, and then mixed with the same binding buffer, and the column (gel) filled with “Protein A-Sepha rose CL4B” (Pharmacia) was used.
  • the solution was applied to a bed volume of 20 m 1) and washed with three columns of binding buffer.
  • IgG was eluted with about 3 column volumes of the output buffer contained in the key.
  • the eluted IgG was dialyzed against 20 mM Tris-buffered saline (PH7.4) and the like, and used as an antibody standard. Usually, 5 to 10 mg of IgG was obtained in 1 ml of ascites.
  • the IgG subclass was determined using Amersham's mouse monoclonal antibody, Swiping River kit. This method was based on the ELISA method and determined to be 12H5 (IgG2a), 1.4 (IgG2a), and 10.1 (IgGl).
  • the solution was passed through a sulfated cell mouth fine (Seikagaku Corporation) column (econo column; column size 20 ml; BIO-HAD) equilibrated with O.IM acetate buffer (pH 6.0). 200 ml of washing solution (Om acetate buffer (pH 6.0) containing 0.5 M sodium chloride) was passed through the column to wash thoroughly, and the eluate (0.1 M acetate buffer containing 1.5 M sodium chloride (p. H6.0)) was passed through 30 ml of the solution, and the resulting fractions were used as sulfated cell-port fine bonded I solids. Next, the sulfated cellulomin-bound fraction was separated by HPLC.
  • the column was CAPCELL PAK C18 (4.6 Wake 10 2501]; ⁇ / 1: manufactured by Dodo), and the HPLC system was LC-4A 3 ⁇ 4 ⁇ manufactured by Seiko Seisakusho), all at a flow rate of 1 ml / min.
  • the solution was passed through 0.1% h trifluoroacetic acid for 60 minutes.
  • phospholipase A2 was dissolved in a linear gradient of 0-50% acetonitrile under 0.1% trifluoroacetic acid ⁇ 1 :. Since the peak of phospholipase A2 appears at about 30% acetonitrile, this peak was collected.
  • PRP platelet 3 ⁇ 4 ⁇ plasma
  • EDTA is added to a final concentration of 2 mM
  • the cells are centrifuged at 2500 xg for 10 minutes.
  • the cells were suspended in 30 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 120 mM sodium chloride and 2 ⁇ EDTA, and centrifuged at 2500 xg for 10 minutes.
  • the dialysis operation was performed on 5 OrnMff acid buffer (pH 4.5) containing 200 mM sodium chloride. After the dialysis, the cell lysate was centrifuged at 15,000 xg for 40 minutes at 4 ° C, and the ⁇ ⁇ ' ⁇ ' was collected to obtain platelet Yamagi phospholipase II.
  • the IgG preparation was adjusted to 10 ⁇ g / ml with BSA-TBS-Tween to prepare a three-fold dilution series.
  • An ELISA was performed according to Reference Example Id), and the interaction with recombinant human phospholipase A2 and rat phospholipase A2 was performed for tl.
  • ELISA against rat II phospholipase A2 was carried out by replacing reference recombinant Id) glue-combinant human phospholipase A2 with rat II type phospholipase A2.
  • FIG. 3 shows the inhibition ratio of each antibody against the recombinant human type II phospholipase A2 activity by taking the concentration of the antibody upon preincubation of the antibody preparation with phospholipase A2 on the horizontal axis. 12H5 and 1.4 almost completely fluffed phospholipase A2 at a concentration of 10 ⁇ g / ml. On the other hand, 10.1 showed an 80% inhibition at a concentration of 3 ⁇ g / ml).
  • Figure 7 shows. 12 ⁇ 5, 1.4 and 10.1 showed that phospholipase 2 activity from human liil platelet ill was recombined with recombinant human phospholipase 2
  • I'm c'i! The rest had the ability to identify i of natural human 11 phospholipase A2.
  • the antibody of the invention was a PU from phospholipase A2 ⁇ 'i: from rhesus monkeys and mice. In addition, the-part of the phospholipase A2 activity of dog fill Koitayama was determined.
  • I0D0GEN manufactured by Pierce Co., Ltd.
  • 100 ⁇ M lOOmM Tris-HCl buffer ( ⁇ 7.4) containing 30 ⁇ g of recombinant human type II phospholipase A2 was added to the test.
  • 6 ⁇ 1 of 100 mCi / ml of Na 2 ('I (ICN ⁇ )
  • the reaction solution was taken out from the glass test tube to remove the ⁇ . . Na 1 2 5 1 of reaction was removed by gel filtration.
  • the radioactivity of the culture solution was measured when the purified antibody preparation of each degree was added to the cells to which phospholipase A2 had been bound and incubated.
  • the horizontal axis shows the antibody concentration in the coagulation fluid after the addition of the antibody, and the ability to release phospholipase A2 bound to the cells of each antibody is shown in FIG. 18.
  • Control mouse stakes did not release phospholipase ⁇ 2 from cells at all, but 12 ⁇ 5, 10.1 and 1.4 released phospholipase ⁇ 2 from cells in a concentration-dependent manner.
  • the anti-rest 1.4 H and L chain variable region cDNAs were prepared as shown in Fig. 9 using "5, RACE System Kit” (manufactured by Gibco). That is, the constant region gene (C) and High Priestess head formed to primer first and reverse fc 'enzyme (SUPER SCRIPT II Reverse Transcri ptase) messenger one RNA of 1 ⁇ using ⁇ ;. 4'a manner present; T! CDNA was synthesized.
  • C constant region gene
  • High Priestess head formed to primer first and reverse fc 'enzyme (SUPER SCRIPT II Reverse Transcri ptase) messenger one RNA of 1 ⁇ using ⁇ ;. 4'a manner present; T! CDNA was synthesized.
  • GSP1L (5'-GGCACCTCCAGATGTTAACTGC-3 ') /
  • GSP1H 5'-GGAA (AG) r rA (AGC) CCCTTGACCAGGC -3 ') Z-sequence number 3 ⁇ 4: 12 ".
  • the sequence in parentheses ⁇ reduces the nucleotide corresponding to 3 ⁇ .
  • the mRNA-mRNA was digested with RNaseH, and then ⁇ i'ic DNA was purified using GLASS MAX Spin Cartridgej.
  • a poly (dC) tail was ligated to the T-terminus H chain and Li TJ variable region construction-(V) is an anchor-primer (5, -CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGG) that hybridizes with the poly (dC) tail.
  • the H chain and Ui'inJ variable region cDNA of antibody 10.1 were prepared by the method shown in Fig. 12 using "Marathon cDNA Amplification Kit” (manufactured by Clontechne I :). That is, "M Single-stranded cDNA was synthesized using 1 g of messenger RNA using arathon cDNA synthesis primer and reverse fe enzyme. The reaction solution was further reacted with RNaseH, DNA polymerase I (DNA polymerase), and DNA ligase to form double-stranded cDNA. Furthermore, double-stranded cDNA was blunt-ended by reacting this reaction solution with T4 DNA polymerase (T4 DNA polymerase erase).
  • T4 DNA polymerase erase T4 DNA polymerase erase
  • the Rathon cDNA adapter was ligated to the single-stranded jcDNA using T4 DNA 1 igase.
  • the H- and L-chain variable region promoters (V) are applied to the adapter primer-1 and the primer -GSP2L (the i-chain of the light chain or GSP2H (place of "H"!) Which form a hybrid with the adapter.
  • V variable region promoters
  • the PCR-amplified product was subjected to 1.2% agarose gel II swimming, the band was detected at about 550 to 570 salt ⁇ pair for both Satoshi and the L chain. did it.
  • the PCR amplified fragment was inserted into the pCRT Mini vector.
  • the pCRTMI I plasmid into which the fragment was inserted was transformed into a competent cell of Escherichia coli JM109 (manufactured by ' ⁇ '). ! Play Bok on the> colonies and pCR 1 M II and Haipuri' Bok 'to form "5, primer UD (5' -ACCGAGCTCGGATCCACTAG-3 ' ) 3 ⁇ 4 column *: 16" and "3, primers one DU (5' - ATGCATGCTCGAGCGGCCGCC-3 ') Z sequence ⁇
  • Figure 10 shows the L chain of antibody 1.4
  • ⁇ 11 shows the H chain of antibody 1.4
  • the i-th CD i column of the L chain of antibody 1.4 is 1%! Column number: 5 to 7, and the predicted CDR sequence of the H chain of antibody 1.4 is reduced to SEQ ID NOs: 8 to 10.
  • the antibody 1.4 can be used, for example, for Pag-1 pile rest (Hughes-Jones, NC et.al. Biochem. J., 268, 135-140 (1990)) and WEA anti-rest (Goni, F. et. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4837-4841 (1983)).
  • Messenger RNA was dry to the cDNA cloning by Shikawa the "QuickPreP Micro mRNA Puri fi cat ion Kit (Pharmacia Biotech Inc.) j, was prepared from hybrid doughs Ma cells lxl0 7 I. That is, cells extraction buffer ( The mixture was turbidly dissolved in an extraction buffer, and oligo dT cellulose (Oligo (dT) -Cellulose) was applied to release messenger RNA.
  • the H-chain and L-promoting variable region cDNA of antibody 12H5 was prepared using the 5 ′ RACE System Kit (GIBC0 BRL) j as shown in FIG. 9; that is, the normal region (C)
  • the iDNA was synthesized by ffl using 1 mg of messenger RNA by ffl using a primer which forms a hybrid and SUPER SCRIPT II Reverse Transcriptase.
  • GSP1L 5 '-GGCACCTCCAGATGTTAACTGC-3'
  • 3 ⁇ 4 In the H chain, it was "GSP1H (5'-GGAA (AG) TA (AGC) CCCTTGACCAGGC-3 ') / sequence number: 12".
  • the sequence in parentheses indicates the base corresponding to the degeneration.
  • the messenger RNA in the form of a gun was digested with RNaseH, and the -strand cDNA was purified using GLASS MAX Spin Cartridge j. Single-strand cDNA was obtained using dCTP and terminal deoxynucleotide transferase.
  • a poly (dC) tail was attached to the 3 'end of the cDNA, and the H and L chain variable region genes (V) were anchor primers that hybridized with the poly (dC) tail (5'-CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGI I GGGI IGGGI IG -3, / ffi column «Re: 13) and ⁇ Regional region-Primer that forms a hybrid with (C) GSP2L (5'-TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3,) / ft!
  • the reaction products were analyzed by 1% agarose gel electrophoresis, and clones in which amplification of DNA fragments of about 600 to 620 salt pairs were observed were selected.
  • the cloned E. coli was cultivated, and plasmid DNA was prepared using rQIAGEN Plasmid Mini Kit (QIAGEN) j.
  • the prepared plasmid DNA of each clone was purified using the DNA Sequencing Kit (Perkin Elmer) and the 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems Inc.) using the primers UD and DU. The nucleobase sequence analysis was performed.
  • Keizo Ushikawa purchased a male BALB / c mouse (4 weeks old, body; 15-20g) from SLC, raised it for 4 yen, and went to the bell.
  • Cisplatin-inducible 1 ⁇ non ⁇ A model was prepared as follows. Specifically, 0.6 ml of cisplatin (Landa, ⁇ ”
  • Rat phospholipase-2 monoclonal pile rest (1.0 mg / 0.2ni1 / mouse) was injected intraperitoneally in the same manner as the anti-human phospholipase-2 monoclonal antibody injection method. Inject 0.6 ml of U'l! & Saline in the back subcutaneously instead of cis-bratin, and inject saline (0.2 ml) with anti-human I and II phospholipase A2 The mice were intraperitoneally administered in the same manner as described in (1) and (2) mice were used.
  • mice After administration of cisplatin, all mice were treated with ether hemp at 3 f: IM, and heparinized 1! Via an abdominal human vein. After that, the abdominal human artery was cut off, the mouse was killed, and the left 3 ⁇ 4 was removed. The blood sample was subjected to 5,000 rpm for 20 minutes, and the BUN was measured using plasma as BUN Kainos (available from Kainos). For 3 ⁇ 4, after removing the capsule, the capsule was removed, and the slice was cut along the red rim.
  • BUN Kainos available from Kainos
  • the slices were incubated for 8 hours with 10% formalin buffer, and then washed with water to remove formalin, and ethanol (70, 80, 90, 99.5, 100%), dehydrate the benzene series, complete the benzene series, and paraffin-saturated benzene.
  • I went to the river.
  • a microtome was cut into a 2 ⁇ m thick tissue section, stained with hematoxylin and eosin (HE), and subjected to string-like examination.
  • the body K of the mice was measured every day during the sudden examination period. First, the body ffi of a normal mouse was about 20 g at the beginning of the test, and about 21 g at the end of the abrupt test, showing an increase in lgB.
  • Blood BUN was reduced to 17.5 mg / d 1 in ⁇ mice. Was increased to 33.9 mg / d 1 to about 2 ⁇ ⁇ by cisplatin administration .
  • Mouse anti-rat type II phospholipase ⁇ 2 monounal suspension was almost similar to cis-platin administration in Ifn serum BUN.
  • the average value of liuil BUN which was obtained by throwing a pile of human phospholipase A2 monoclonal (0.3 mg / mouse), was 27.5 mg / d1, and ⁇ ⁇ About 40% of BUNft that had been exposed to I ⁇ W was suppressed by cis-bratin injection in mice.Pile human phospholipase ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 2 Monochrome-Null stake (l.Omg / mouse)
  • the average plasma BUN in the group was 24.7 mg / dl, which suppressed about 60% of BUNiii'i: increased in rats by cisplatin administration in mice.
  • the cisplatin group and mouse anti-rat type II phospholipase A2 In the case of monochromatic stagnation ⁇ !
  • mice Male BALB / c mice (4 weeks old, body SU5-20g) purchased from SLC, raised one in four, and then submitted to the experiment.
  • Cisplatin induction Injury model mouse was prepared by subcutaneous injection of cisplatin (lander injection, H-Hon Kayaku Co., Ltd., 0.5 ig / ml) 0.6 mU iW subcutaneously to the ⁇ part of the mouse.
  • Control monoclonal anti-reactivity that does not react with mouse 11-phospholipase A2 as a control group (5H8; Sugita Y. et al., I ⁇ imology, 82, p34-41 (1994)) (1.0 mg / 0.2 ml / mouse) ) was injected into the hip cavity in the same manner as in the administration of anti-human type 11 phospholipase A2 monoclonal pile.
  • the urine was centrifuged using i-Rose G rTPTP (manufactured by Diatron) to produce urinary glu-mil-trans-peptidase (7-glutamylyl). transpeptidase) activity was measured and, at the same time, corrected for urine width creatinine content measured using CRE-EN Kainos (manufactured by Kainos Corporation).
  • Phospholipase A2 activity is expressed as a percentage of the amount of tritium oleoleic acid released by hydrolysis of the group added to the reaction mixture (a large intestine 1 cleat product incorporating tritium-labeled oleic acid).
  • the control antibody did not suppress the increase in phospholipase A2 activity.
  • the anti-human type II phospholipase A2 monoclonal antibody administered once 24 hours before cisplatin administration maintained its effect even in the kidney 4 days after cisplatin administration (C1 on 5 days after antibody administration).
  • FIG. 16 shows urinary y-GTP activity on day 1 after administration of cisplatin.
  • A-GTP an indicator of tubular injury
  • Anti-human II 3 ⁇ 4 phospholipase A2 monoclonal antibody injection-/ ⁇ In the case of 0.3H, 12mg administration of 12H5, 1.4mg of 0.1mg, 0.3mg, 1.Omg injection of H-GTP by cisplatin injection The upper bound of activity was significantly reduced by 76%, 87%, 82%, 62% and 84%, respectively. However, the control monoclonal pile did not suppress the upper W of ⁇ -GTP.
  • FIG. 17 shows the plasma BUN i at 4 H after administration of cisplatin.
  • the plasma BUN which is the fingerling of the ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ + ⁇ ⁇
  • the plasma BUN which is the fingerling of the ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ + ⁇ ⁇
  • 0.1%, 0.3mg, l.Orag administration of 12H5; 0.3mg, 1.4Omg injection of 1.4H, and plasma BUN by cisplatin administration in 1.4H injection The increase in ars
  • anti-human type II phospholipase A2 monoclonal antibody can be used as a drug to suppress the onset and progression of cisplatin and dystrophy by inhibiting phospholipase A2.
  • an anti-human ⁇ type phospholipase A2 monoclonal antibody, or a platinum compound of a protein or peptide having a U-harmful potential containing a part thereof was revealed that it can be used as a drug to suppress the onset and progress of renal injury caused by cisplatin administration. That is, it was possible to suppress nephrotoxicity, which is an obvious side effect, of cisplatin. By increasing the dose of cisplatin, it became possible to increase the efficacy of cisplatin.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is ffl as an inhibitor of harm caused by administration of a gold compound.
  • Iwakawa is also a prophylactic agent that stops the team by f-dosing before or during administration of gold compounds.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Tyr lie Arg Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 SEQ ID NO: 10
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • N represents inosine (I).
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明細 Ί 障害改善剤 技術分野
本発明は、 腎^害改善剤に関し、 特に^金化合物投 による^障 の予防剤、 改 剂または治療剤に関する。
I金化 Γτ物、 特にシスブラチンは抗 Mi攛薬であり、 泌 / 器 · W'人 iH:域のみな らず、 ^極領域の恶性腫癟に対して広く使用されている。 例えば、 膀胱ガン、 卵 ¾ガン、 子宮頸ガンを始め食道ガン、 ガンなどで汎川されている。 しかし、 シ スプラチンには^陣害、 消化管障 ¾、 骨髄隙 、 聴 '器隙 ½などの副作川があり 、 特に ΨΠν ' は低い /11 !ri:でおこるため、 卞に1^ mnのために投 <.が制限されて いる。 シスブラチンは 郃は糸球体から濾過され、 は近位 細 fiから分泌さ れて尿中へ排泄されるので、 皮 ft深 ；でのシスブラチン ¾ は他脇器の敉 にも 辻する。 腎 害は^の近位尿細 にみられ、 臨 I未 hでは；^ 細 Γί壊死の 態を きたす （木村茂 ÷：:.ら、 Cis-Diaminedichloroplatinum( 1 1 )の1 †;の電顕的親察、 E1泌尿会 76 : 1439-1453, 1985) 。 この予防法として、 24時間持続点滴法 (Jac obs，C . et al . , 24-hour infusion οτ c is-platinum in head and neck cancer.
Cancer. 42 : 2135-2140, 1978) 、 輸液にフロセミ ドゃマンニトールなどの利尿剤 をひ f川した方法が実験的に試みられ '効であった ( ard,M. J. et al . , Prevension of renal faikure in rats receiving cis-diamminedichloroplatinum( 1 1 ) by administration of furosemid. Cancer Res .37: 1238-1240, 1977) ことから現在で はこれらの方法が^末的に用いられている。 しかし、 シスブラチンは (ill屮 ; 度依 存的に作川する抗力'ン剤であり、 m fiな効 wを^るために人 fit使川をする ¾ tが ある力 これらの 法では十分な副作^の予防効 ¾を期待できない。 そして、 現 在、 シスブラチンによる腎陣害の抑制を F1的として ^血管拡張剤、 アデノシン A 1受容体拮抗剤、 ラジカルスカベンジャー、 リゾリ一ム膜安定化剂 （Deegan, P. M. et al. Renal Failure 17， pll7-123( 1995) , Nagashima, K. et al. Jpn. J . Pharmacol. 67， p349-357(1995), Mc Ginness, J. E. et al. Physiol. Chem. Physics. 10, p267-277( 1978), Dobyan, D. C. et al. Lab. Invest. 55, p557 -563( 1986), 小林；告ほか、 ΓΙ本産婦人科 会雑 41. ρ683-687(1989)) などが勁 物モデルで ^験 r† 'であるが臨床応川には つていない。 このような状況から、 シ スプラチンの^
Figure imgf000004_0001
を弥く讓する薬剤の ί)允が ¾まれている。
JJ、 ホスホリパーゼ 、 '上休股榄成成分の 1 , 2-ジァシルホスホグリセリ ド の C2位のエステル結合を加水分解する 素として知られる。 この酵素は ΙΐιΠ乳勅物 の極々の臓器や細胞に見られ、 生体膜リン脂質の新 .や代謝を司るのみならず、 ァラキドン酸カスケ一ドの ί:|ϊ速酵 としての役割があり、 その代 産物のプロス 夕グランジン、 ロイコ 卜リエン、 卜ロンボキサン、 PAF等はさまざまな を もつことが知られている。
ホスホリパ一ゼ Α2には、 Ι 、 Ι ·！、 細胞内^の砘烦が知られている ( IIお ■ らヽ Η本臨床、 1994年特別号、 202-206) 。 この屮でも、 11型ホスホリパーゼ Α2は 、 炎 反応に伴い炎症 所の浸出液屮に誘導されたり、 多 の^^が血中に放出 される。 さらにこの酵素は柳:々の炎症性疾患においてその病態の^悪化あるレ、は その原因の -部であることを示唆する稀々の報 がある。 例えば、 Kikuchi- Yano shitaらは、 心筋梗塞のモデルであるラットの^血 心疾患のモデルで臓器^害の 進展と相応してこの酵素の活性が上昇していることを報 ί1;している （ K i kuc h i -Ya noshita,R. et al.,J. Biochemistry, 114:33-38, 1993 ) „
Lauritzenらは、 脳桢 の虚血内かん流障害において、 病態の恶化に本?^素が主 要な役割を していることを示唆する報告をしている （Lauritzen I. et al., B rain Research, 651: 353-356, 1994) 。 Murakamiらは、 喘忠^のアレルギー性疾 忠において屮心的な役割を果たす、 肥満細胞のヒスタミン顆粒放出をこの酵素が 促進し、 この醉尜を 害することにより喘^等のァレルギー忤疾患の治療薬につ ながる【Γ能性を示唆している (Murakami , Μ· et al . , Journal of Immunology, 151 : 5675-5684, 1993) 。
Smithらおよび Pruzanskiらは、 慢性関節炎リゥマチ忠者では、 その血中に正 人より多： に本酵素が存在することを報 し、 その原因あるいはその増悪化を行 つている nj能' があることを 唆している ( Smi th G. M. et al . , British Journ al of Rheumatology, 31 ： 175-178, 1992、 Pruzanski W. et al . , J. Rheumato 1. , 15 ： 1351 -1355 , 1988) 。
また、 ホスホリパ一ゼ A2酵^が膜リン脂 flを加水分解する^、 細胞に結合する ことが必須であることが知られている （Suga H. et al . , Eur. J. Biochem. , 218 ： 807-813, 1993/Murakami M. et al . , J. Biol . Chem. , 268: 839-844, 1993) 。 従って、 血中あるいは浸出液中で遊離状態にある酵素を するばかりでなく、 その股リン脂' fiが加水分解される細胞に結 したホスホリパーゼ Λ2 素を抗体が はずすことができれば、 これらの抗体は新^な作川機 I に ½づくさらに強力なホ スホリパ一ゼ A2附', 効果を^することが期待される。 しかも、 細胞 に結合し たホスホリパーゼ A2に抗体が ^すると、 その細胞を袖休及び/またはェフエク タ一細胞が攻撃し副作川をもたらすことが予想される。 しかしながら、 細胞に結 合したホスホリパーゼ Λ2をはずすことができる抗体も未だ得られていない。
このように本酵素がいろレ、ろの疢忠と阅 することを示唆する報告、 び本酵 素に^する報告は多数ある。 しかしながら、 ¾/」:までのところ、 杭ガン剤である Π金化 物、 特にシスプラチンに¾づく ^^害に本^素が^わつているという報 ';-は全くされていない。
¾叨の開
本 叨は、 化 物、 特にシスブラチンの i も '! な リ作川であり 金化合 物、 特にシスブラチンの投 を制限していた1 ,mを抑 i!iijすることを課题とす る。
本発明者らは、 II型ホスホリパーゼ A2と疾忠との関係を鋭意研究した。 その結 1*、 f'想外にも、 マウスのシスブラチン誘導 ' : ^不全モデルにおいて臀臓のホ スホリパーゼ A2活性がヒ兄すること、 また、 II ホスホリパーゼ A2l;ll 活忤をお する抗体、 乂は細胞膜に結合した II型ホスホリパーゼ Λ2を遊離する作川を有する 抗体を投^すると、 腎臓屮のホスホリパ一ゼ A2¾' :が仰制されるとともに^臓陣 が明らかに改 されることを いだし、 ½叨を ^した。 本杭体は、 マウス II ホスホリパーゼ Λ2はもちろんヒ I、 H ホスホリパ--ゼ A2の ^^忤をも強く PlU!iすることから、 ί'Ι企化合物、 特にシスブラチンに ½づくヒ トの^^; ifにも適 川' 能である。
即ち本¾明は、 ！ 休的には
( 1 ) 11 ホスホリパ一ゼ Α2の沾忤を 'するモノクロ一ナル杭体、 又はその - 部分を Αみ該附 ¾能を する itU もしくはべプチドをィ j効成分とする、 ΓΙ金化 物投与による腎^^の改^剂である 1 薬糾成物、
( 2 ) 細胞股に結 した II ホスホリパ一ゼ を遊離する作川を するモノク Π —ナル抗体、 又はその ·部分を み,该作川をィ」する £! Γ Πもしくはべプチドをィ - j 効成分とする、 广 I金化^物投与による^^ ^の改^剂である 薬組成物、
(3) ιι型ホスホリパーゼ A2の活性を ffl ¾し、 かつ細謹に結合した 11 ホスホ リパーゼ A2を遊離する作用を するモノクロ一十ル杭休、 乂はその .部分を^み 該 能を苻する ¾ί もしくはべプチドをィ』効成分とする、 ΙΊ金化合物投与に よる^陣 の改 剂である医桨糾成物、 ましくは
( 4 ) ホスホリパーゼ Α2がヒト！1!来である、 （ 1 ) 〜 （3) のいずれかに記 載の ¾組成物、
( 5) モノクローナル抗体が、 ヒ 卜山来 1 ¾リホスホリパーゼ A2の活' Π:を K1害し、 かつサル由来 11¾リホスホリパーゼ Λ2及び/乂はマウス ΠΙ來 i I ホスホリパーゼ A2 の活性を阻害することができるモノクローナル抗体である、 （ 1 ) t¾載の医薬組 成物、
(6) モノクローナル抗体が、 細胞膜に結合したヒト ώ来 II型ホスホリパーゼ A2 を遊離する作 を有し、 かつ細胞膜に結合したサル f1:l来 Π型ホスホリパーゼ Α2及 び/又はマウス由来 11型ホスホリパーゼ A2を遊離する作川を有するモノクローナ ル抗休である、 （2) 記載の医躯組成物、
( 7 ) モノクロ一ナル抗体が、 ヒト由来 II型ホスホリパ一ゼ A2の^忤を 1 し、 かつサル I来 II 'ホスホリパーゼ A2及び/又はマウス山來 11 ¾'!ホスホリパーゼ A2 の沾性を PI I ' することができ、 かつ細胞脱に結 ^した 11 ^ホスホリパーゼ Λ2を遊 離する作川を するモノクローナル杭休である、 （3) の医薬組成物、
(8) モノクロ一ナル抗体が、 モノクローナル杭休 12H5、 10,1又は 1.4が結 する ェピトープに結合することができるモノクローナル抗体である、 （5) 〜 （7) のいずれかに記載の医薬糾成物、
である。
以卜、 水 明につき詳述する。
本¾明で使川される ¾句の定義を述べる。
「抗体」 とは ίΛ原刺激の結 ¾、 免疫反応によって ' 休内に/^ 1:される ίΰ-ΰϋで 、 免疫 j （抗原） と特異的に結合する活性をもつものを^味する （生化学辞典 ¾
2版、 81Γ-Κ 束京化学 RJ人 (1990) ； Π紆バイオS新川語辞典第 4版、 230貝、 Π経バイオテク （1995) ) 。
「モノクローナル抗体」 とは、 単 'クローンの杭休 上細胞が 生する抗体で ある (生化学辞典第 2版、 1359Π、 ¾京化学 Μ人 (1990) ) 。
「^白質」 とは、 生物体の 'L:要構成成分であって、 約 20种の L-ひ-アミノ酸 （グ リシンも含む） がべプチド結合により連結したポリベプチド鎖からなる （ 化'' ;:' 辞典第 2版、 810貝、 ίίί〖化学同人 (1990) ) ο
「ペプチド」 とは、 2個以ヒのアミノ酸がペプチド^ によって結合したもの を意味し、 ァミノ酸数が 10程度以下のものを才リゴぺプチドといい、 それ以 1:の ものをポリペプチドという (生化^辞典第 2版、 1202Πヽ 化学同人 (1990) ) 。
「ェピトープ」 とは、 抗原分 f-十に存在して、 抗体が識別する ^少 i位の構造 を意 π する （^化学辞典第 2版、 195ΪΙ, 束京化^同人 (1990) ； Π, バイオ i 新 川 辞典第 4版、 93 、 曰糸 バイオテク (1995) ) 。
「改^剂 j とは、 本発明においては、 A金化台物投- における^陣害を蛏減、 抑制乂は 防する ¾剤を, 味する。
本 Hjjの杭休としては、 II ホスホリパーゼ A2杭休の 'λΓί性を阻害することがで きる抗体が好適に川いられる。 なお、 新薬のヒ トでの^験を行う場^、 Γ'め動物 験によってその薬効を明らかにせねばならない。 その際は、 マウスのような小 動物およびサルの休内で II型ホスホリパーゼ Α2の沾 '|ί·:を W.1 する ίΛ休を川いるこ とが必1 ^であることから、 交ノ' Π反応 ½のあるモノクローナル抗体が好適であると 考えられる。 また、 ホスホリパ一ゼ A2fi':?Hが膜リン脂 fiを加水分解する際、 細胞 に結 tすることが必¾であることが知られていることから （Suga H. et al., Eu r.J. Biochem., 218: 807-813, 1993/Murakami M. et al. , J.Biol .Chem. , 268 ： 839-844, 1993) 、 ホスホリパーゼ A2酵^を細胞膜から遊離させる作川をィ jする 抗体が用いられる。 具体的な抗体としては、 例えば、 際公 ? β96/20959 公報 載のモノクロ一ナル抗体が挙げられ、 モノク Π—ナル抗体 12Η5、 10.1または 1. 4が好ましく、 そのリ 'でもモノクローナル杭休 または 1.4がより好ましい。 こ れらのモノクロ一ナル杭体は、 これらの /休を ゾ するハイブリ ド一一マ、 即ちノヽ イブリ ドーマ 12H5、 1.4、 10.1を 'ί莾して取^することが nj能である。 これらのハ イブリ ドーマは、 免疫の顿^を多くかつ免疫 Kfj ' ijを く して、 健常人 11¾ホスホ リパーゼ A2で感作した BALB/c系マゥスの脾細胞とマウスの' P ffi肫細胞 P3x63Ag8/U 1(P3U1)とを常法、 例えばケーラ一とミルスタインの細胞融 fY法により融^して j: ることが「 能である (国際公^第 96/20959■ '} Π/j細； 参照 ) 。 なお、 本 ¾明者らによって取得されたマウスハイプリ ドーマ 12H5、 1.4、 10.1は 、 それぞれ次の通り寄託されている。
ハイプリ ドーマ 12H5に関する寄託：
(ィ） 寄託機関の名称 ·あて名
名称：通商 業省 業技術院生命 Ί:学:「槳技術研究所
あて名 ： 13本国茨城県つくば市東 1丁 Π 1 «り- (郵便^ 305 ) (口） 寄託 [I (原寄託日） 成 6 | 1 Π 22 Π
(ハ） '2,!ΈΦ' 生命研条寄^ 5300 (FERM BP- 5300)
ハイプリ ドーマ 1.4に関する寄託：
(ィ） 寄 機関の名称 'あて名
名称：通商^業省工業技術 I 7 命 工業技術研究所
あて ： 曰本〖： E1茨城^つくば『 1 J I 1 3り (郵使^号 305 ) (口） 寄託 Π (^寄託 H) 成 6^ 1 1 )122口
(ハ） 受託 ¾ 生命研条寄第 5297 (FERM BP- 5297)
ハイプリ ドーマ 10.1に関する ^託：
(ィ） ^機 [¾の名称 ·あて名
名称：通商産業 エ^技術院^命ェ 工業技術研究所
あて名 ： 曰本国茨城県つくば小 1 J111«り. (郵便赉 305 ) (口） 寄託曰 （原寄託曰） 平成 6年 1 1 jj 22曰
(ハ） 受託番号 牛.命研条寄第 5298 S (FERM BP-5298)
上記ハイブリ ドーマを培莾する培地としては、 例えば、 ダルベッコ氏変法ィー ノレ氏 ϋ少必須 in地 (Dalbecco' s modified minimum essential medium；以下 厂 DMEMj と略称する）にゥシ胎仔血^、 いグルタミン、 グルコース、 ピルビン酸 ナ卜リゥム、 2-メルカプトエタノール及び杭生物 'Π (例えばぺニシリン0、 ス 卜 レブ卜マイシン、 ゲン夕マイシン等） を Γ冇せしめた培地 が使われる。
ハイブリ ド一マの培¾は通常、 培地 11 'で 37 °Cにて 5 % --酸化炭素、 95%空 気の気相で 2〜4日 f 、 又は 2,6, 10， 14-テ卜ラメチルペン夕デカン （例えばプリ スタン、 アルドリッチ社 i) で前処-匿された BALB/c系マウスの腹腔内にて 10〜 20闩間程度で行われ、 精製可能な ¾の抗体が産 .される。
水¾明に用いる抗体は、 その一部分でもよく、 II ホスホリパ一ゼ A2活性を阻 する作用を保持している部分でもよい。 杭休に対して常法によりペプシン等の タンパク 分解酵素によって消化を行い、 I 'lきタンパク Ώの 離結製の常法に よって単離精製を行って活性のある 部分、 例えば F(ab' )2を得ることができる。 さらにジチオスレィ 卜一ル及びョードアセ卜アミ ドなどを川いて' 法による杭体 の H鎖と H銷及び/乂は H 'iと L を結んでいるジスルフィ ド結 の 兀アルキル 化によって U (：ィ J結合のみで H lと L ίί'ίが 'ιびついた 'し休の^^アルキル休を ることができる （ 「役に立つ免疫 ¾験法 炎ネ I：サイエンティフィ ック、 1984年 ) j 39貝参照） 。
水 ¾明に川いられるモノクローナル抗体乂は 杭休の ·ί 分を むタンパク質 またはペプチドをヒ 卜に投 する ¾合は、 ヒ 卜山来の^分の; が いモノクロ 一ナル杭休又は ¾杭体の -部分を むタンパク またはべプチドを川いること力；
3ίましい。 そのようなモノクローナル杭休の例として、 （ 1 ) i，J変領域のみマウ ス等の動物由来のァミノ酸 1 列からなり、 常 ΪΠ域はヒ卜山来のアミノ酸配列か らなる抗体、 即ちいわゆる 「キメラ ίΛ体 (chimeric antibody) 」、 （2) 相補性 決 領域 (又は超1ί変 ΐ:域/以ド 厂 CM_i (じ omplementarity- determining region ) と略称） のみマウス等の動物巾来のアミノ酸配列からなり、 その他の領域はヒ 卜山来のアミノ酸 K列からなる杭休、 即ちいわゆる 「ヒ I、化杭休 (humanized an tibody) 」 が举げられ、 これらのタイプの/i休も gJjに まれる。 「キメラ抗 休」 については、 公知の方法に従って、 l ii ^が' ¾に ^することが t'J能であ る （Nature, 314, 268- 270(1985 )： Proc. Natl .Acad. Sci. USA. ,84, 3439-3443( 1987) ： Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84, 214-218(1987): Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ,81,6 851-6855(1984)) 。 また、 「ヒ 卜化杭休」 についても、 公知の方法に従って、 ^ 業者が容易に製造することが可能である (Nature, 321, 522-525(1986): Science, 239, 1534-1536(1988): Proc . Nat 1. Acad . Sc i . USA . , 86 , 10029- 10033 ( 1989 ) : Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88, 2869-2873(1991)) 。 なお、 これらの文献等によれば、 「 ヒト化抗体」 を製造する際、 CDR部位のみヒト以外の生物の CDRと置換されるヒ ト 抗体 （即ち 「ヒト化杭休」 の基本骨格を祸成する抗体/ 「ヒ 卜受容体杭休」 と称 する） として、 該移植される CDRが由来するヒ卜以外の生物の抗体とホモロジ一の
^いヒ 卜抗体を用いることが好ましいとされている。
「キメラ杭休」 又は 「ヒ卜化抗体」 は、 例えば、 杭体を^^するハイプリ ドー マから、 |J変領域乂は CDRに対応する JEi伝 を中.離して、 ヒ 卜杭休造伝 -f-と組 み換え、 細胞に導入して 现させることによって、 が に製造する ことが可能である （Int. J. Cancer, 44, 424〜433(1989)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,87,8095~8099(1990)参照） 。 また、 造 子は配列決定後、 対応する配列を合成 したものを川いることも、 またハイプリ ドーマゃヒ 卜抗体; ^細胞から^た逍伝 了-と合成した遺伝子を結合させて川いることもできる。 また、 π了変領域又は CDRに 対応する造 了-としては、 本発
Figure imgf000011_0001
らが^離した、 配列番 ： 1、 3、 18又は 20のいずれかに記載のίί基! ¾列又はその CDRi 分の塩 ¾1 列を む DNAが好適に 川いられる。 また、 配列番号： 2、 4、 1 9乂は 2 1のいずれかに ¾載のァミノ 酸配列乂はその CDR部分 （配列番 ： 5、 6、 7、 8、 9、 1 0、 22、 23、 2 4、 2 5、 26乂は 27) をコードする塩基配列を含む DNAも好適に川いられる。 また、 列番 ： 5、 6及び 7をコードする塩基配列、 1¾列¾¾ "： 8、 9及び 1 0をコードする塩 S配列、 配列 ¾ ·： 22、 23及び 24をコードする塩 ^配列 、 配列番号： 25、 26及び 27をコードする塩 ι 列は、 それぞれ、 特 ¾の抗 体をコードする造 子の -部として问時に川いることが望ましい。 Kに、 これら の DNAの塩基配列の一つ乂は複数の塩¾に対し塩 &の置換、 欠尖乂は揷人を行った 塩 配列をおする DNA乂はその -部をィ /する DNAも好適に川いうる。 更に、 これら 本 ¾明にかかるキメラ抗体、 ヒ 卜化抗休をコードする^伝ィ-として、 ェフエクタ —活性を抑制するために、 フレームワーク部分として IgG4遗伝子を fflいることも 可能である (J.Exp.Med.166,1351-1361(1987)) 。
なお、 抗体をコードする遺伝子は、 本 ¾Π刀の抗体を 生するハイプリ ドーマか ら、 公知の方法で単離することができる (Cancer Research,47,999-1005( 1987)： Proc. Natl. Acad. Sci.84, 2936-2940(1987)) 。 例えば、 前述のマウスハイプリ ド 一マ 12H5、 1.4、 10.1から公知の 法で Ι)ί離することが可能である。 また、 本 ¾明 のモノクロ一ナル杭体またはその .部分を^むタンパク質またはペプチドは、 本 gf!ijの抗体をコードする逍伝子の令部または一部を発現べク夕一に組み込み、 大 m \、 酵 fiiまたは ίΜ勿細胞に ¾人して ！ させることによつても得ることが" J能 である。
また、 11 ホスホリパーゼ A2活性を阻 ' する作川を有する限り、 本¾明に川い る抗体又はその一部分について、 アミノ酸の i 換、 欠失乂は揷入 の変 を導人 することができる。 アミノ酸の変¾の導入は、 アミノ酸をコードする DNAに対して 、 塩基の置換、 欠尖又は揷入等の変 ¾を導人することによって行うことができる 。 なお、 DNAへの変 ¾の導人は、 公知の方法で行うことができる （Gillamn et al .，Gene,8,81〜97( 1979):Roberts et al . 'Nature, 328， 731〜734( 1987) ) 。 また、 ί'?られた変 5¾塩基配列のうち好適な† 'は を^するァミノ 列をコードする ¾列 を選択するには、 ファージディスプレー法を利川した力法 (Annu. Rev. Immunol., 12,433-455(1994)) 等が用いられる。
また、 モノクロ一ナル抗体 12H5、 10.1乂は 1.4が結 するェピ卜ープに結合する ことができるモノクローナル抗体も、 本 叨に Αまれる。 特定のモノクローナル 抗体が結合するェピ卜一プは、 当業 であれば、 通常の方法を川いて容 ¾に特定 することができる ( 「モノクローナル 休 j .化 実験法 10、 火沢利叨、 東京化 学同人 （1989) 参照） 。 さらに、 合成されたェピ卜一プ等を用い免疫を行う方法 などによって、 該ェピ卜一プに結 する种々のモノクローナル抗体を得ることが 可能である （E. Cordelia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90,10290-102 94 ( 1993 ) ) 。 又、 11型ホスホリパーゼ A2乂はその一部に対して られた抗体クロ —ンの全畏又は -部を、 ェピトープを用いたエライザ法に供し、 Π的のモノクロ —ナル杭体をスクリーニングすることも可能である。
本発明の腎障害改善剤は、 投与ルート、 疾患の症状、 投与対象の年齢、 性別等 を考慮して 々の場合に応じて適 决定される。 本発明の腎陣^改善剤は、 抗体 を 効成分とする埸合、 非^口投 、 即ち、 皮下、 筋肉内又は静脈内投 '·が特に 効である。 ^し I投^川糾成物は、 通常、 投^可能な^休、 好ましくは水性 ¾ 休に した、 タンパク またはぺプチドの溶液からなる。 々の水性 ί4休、 例 えば水、 緩衝液、 0.4%の ί¾塩水、 （1.3%のグリシン、 5%のグルコース、 ヒ 卜アル ブミン溶液 を使川することができる。 これらの ¾液は無 ίであり、 そして一般 的に粒了-形成性物質を^していない。 これらの糾成物は、 十 Π川で I 知の滅 i技術 によって滅閑することができる。 これら糾成物は、 緩衝化剤、 等'】 化剂等のよう な、 Ui!的条件に近づけるのに必要な槃剂学的に , ^される袖助物、 例えば、 酢 酸ナトリウム、 塩化ナ卜リウム、 塩化力リウ厶、 塩化カルシウム、 乳酸ナトリゥ ム、 クェン酸ナ I、リウム^を Aィ iすることができる。 j i (的に投 できる組成 物の ¾際の製造は、 ， 技術分野の熟純 *†に既知乂は周知の 術を川いて うこ とが nj能であり、 例えば 厂 Remington' s Pharmaceutical Sc ience, l5J;k, Mack Publ ishing Company, ペンシルベニア州ィース トン（1980 )」 に, d裁されている。 ,¾夕ンパク 製剤は、 冷^して貯蔵するか、 ^結乾燥によって!!' j'蔵し使用する f¾ に適 ' Iな溶媒に溶解して 生して使川することができる。 凍結乾燥及び ffi生は、 業^に既知の ½術を jいることができる。
投与法としては、 [Ί金化合物投与前、 I 金化^物投 と同時、 又は 金化合物 投 'J.後に本允明の！ ¾薬糾成物を投 することができる。
なお、 本発叨に川いられるモノクロ一ナル杭休の投与 mは、 0.1mg/kg〜500mg/ kgが ¾ましく、 通常^脈内に投 ' される。
f- J金化 f 物としては、 ί ' が^じ作用機 i†，である (¾礎と臨 ， 22，l l，p57( l 988), Physician's desk reference, BOedition p705( 1996)) 抗肫 性をイ する 化合物、 例えばシスブラチン、 カルボブラチン、 ネダプラチン、 ティコブラチン 、 または 「癌化学療法」 (p27,1990〜1991,中外医' ·礼) に記載の 254-5、 DWA 21 14R、 NK121等が挙げられる。 好ましくは、 シスブラチンまたはカルボブラチンで ある。 図面の簡単な説 Π刀
【 は、 12H5、 10.1および 1.4のリコンビナン 卜ヒ ト 11 ホスホリパーゼ A2のェ ライザの結果を小す。
図 2は、 、 10.1および 1.4のラ 'ソ 卜 liU小板山^ホスホリパーゼ A2沾' I ：に対す るェライザの結果を示す。
3は、 12H5、 10.1および 1.4のリコンビナントヒ 卜 Π ホスホリパーゼ A2活性 に対する阻害作川を示す。
1¾] 4は、 12H5、 10.1および 1.4のラヅ 卜 II ホスホリパーゼ A2沾' に対する阻害 作川を示す。
ズ I 5は、 12H5の^ 'Μώ物 liu小板 ill来ホスホリパーゼ A2;WI:に対する 作川を ^す。
[ズ J 6は、 10.1の各極勋物血小板山来ホスホリパーゼ A2?V,'I :に対する附^作用を 示す。
m 7は、 1.4の各種勅物血小板山来ホスホリパーゼ A2 I:に対する 作川を小 す。
1¾18は、 12Η5、 Ιϋ.1および 1.4の Βΐ - 3A細胞に結^したホスホリバ一ゼ Α2を遊離 する作 ^を示す。
は、 1.4、 12H5の職 'ίおよび L ii'J :域 cDNAのアンカ一ド PCRクローニング の方法を す。
M 1 0は、 ί/休 1.4の L の uj変颔域の cDNA¾列および翻, i されたァミノ酸配列 を示す。 なお、 CDR配列に対応すると予想される (¾列にはド線力 s付されている。 図 1 1は、 抗体 1.4の H鎖の可変領域の cDNA配列および翻訳されたアミノ酸配列 を示す。 なお、 CDR配列に対応すると予想される配列には下線が付されている。 図 1 2は、 10.】の H鎖および L鎖可変領域 cMAの PCRクローニングの方法を示す。 図 1 3は、 杭休 12H5の L鎖の可変領域の cDNA配列および翻訳されたアミノ酸配列 を示す。 なお、 CDR配列に対応すると f'想される配列には下線が付されている。
I 1 4は、 抗体 12H5の H鎖の可変領域の cDNA配列および翻訳されたアミノ酸配列 を示す。 なお、 CDR配列に対応すると 想される配列にはド線が付されている。 l¾l 1 5は、 シスブラチン投 後 4 Γ Ι Ηのマウス', 中のホスホリパーゼ A2 i .: を示す。
f¾l 1 6は、 シスブラチン投与後 1口 [ のマウス 「I ' y - GTP沽性を示す。
図 1 7は、 シスブラチン投与後 4 Π ! Iのマウス BUN iを示す。
¾明を荬施するための最良の形態
以下に本 ¾ HjJの実施例を示すが、 木 ½ li/jはこれらの籠列に制限を' けるもの ではない。
(参考例 1 ) ハイプリ ドーマ 12H5、 1.4、 10A 2MM
a ) リコンビナン トヒ ト I I 1 jホスホリパーゼ A2の調製
本 明のモノクロ一ナル抗体はリコンビナン卜ヒ 卜 I I型ホスホリパーゼ A2を免 疫することにより ί られるが、 リコンビナントヒ 卜 1 1 ¾ホスホリパ一ゼ Α2のその 調^はすべて特 ίϋ75- 192167 ·公報 ¾載の方法に举じて行った。
b ) 免疫した脾細胞の調製
BALB/c系雄マウス （免 &:ί 始時で 6週齢） に、 参^例 la)で精製したりコンビナ ン 卜ヒト I I型ホスホリパーゼ A2を ·匹、1' Iり 20〃g、 0, 1mlの ^ίΦ.的食塩水に ¾解さ せたものについて同 :のフロインド完 アジュバン卜と混 し乳濁化させ、 股 ^内投 した (初 Μ免疫) 。 以後 2〜3^|iijの ^ で 7|i'l、 |nj のホスホリパーゼ Α2 を同容 のフロインド完全アジュバン卜と混合して乳濁化させたものでブース夕 ー投 を行った。第 7回免疫の 24日後、一匹当り 20 / gのホスホリパーゼ A2を 0.2m 1の 生理的食塩水に溶解させて、 腹腔内投与した （最終免疫） 。 最終免疫の 3日後に脾 脇細胞を 1 P のマウスから採取し、 DMEM -地に懸濁させた。
c ) ハイプリ ド一マ 12Η5、 1.4、 10. 1の調製
上記で調製した脾細胞 ( lxl OHf[il) をマウス骨髄肫細胞 P3x63Ag8-Ul (P3Ul ) ( 2xl07f|A| ) と、 ケーラーとミルスタインの方法 [Nature,第 256卷第 495 （1975年 ) 参照] により融合した。 即ち肿細胞と P3U1細胞を DMEMで数回洗^した後、 両 を 50mlプラスチック製遠心 に人れ、 允分 ¾ した。 次いで^心分離して 地を 除去し、 これに 37°Cに保温した 50% (w/v) ポリエチレングリコール （シグマ社製 、 f均分了 ^:3350) を含む DMEMlmlを 1分問を要して ί党 卜'^々に加えた。
次に 37°Cに保温した DMEMlOmlを滴卜して細胞融 反応を終了させた。 反応液を 遠心分離し、 h¾液を除去した後、 HAT培地 [ヒポキサンチン （1x10 'Έ) 、 アミ ノプテリン （4x10— 7Μ) 、 チミジン （1 .6x10 ΠΜ) を添加した 10%ゥシ胎児 linf を 含む DMEM培地] を残さに加え、 脾細胞濃度; 6xlOs細胞数 / mlになるようにした 。 この '憑濁液を 96穴プラスチック ¾プレー卜に、 1穴、 り 200〃1 (肿細胞 1.2χ10:' 個） ずつ分注した。 11日後に培地の ；,;:を吸引除去し、 上^ ΗΛΤ培地を加えた。 細 胞融合の？〜 10口後約半数の穴の巾に於てハイプリ ドーマの^贿がみられた。 ド d )の方法で -凝 h清中の抗体活性を測 した。 陽性のクローンは 48穴プラスチッ ク製プレー卜に移し、 更に 24穴プラスチック製プレー卜に移し、 アミノプテリン をなくす以外は L述のものと Injじ -地で培莾した。 24穴プラスチック製プレー卜 培養上 を^いて抗体活性の 现忤を d)の方法で確認するとともに、 e )の方法で 酵^阻害活性を測 ¾した。
酵素阻害活性を した 3つのクローンは、 .クローン' M:を保■!£するために、 限界 希釈法によって、 順次クローニングを った。 こうして得られたクローンによつ て^ :.されるモノクローナル抗体をそれぞれ 12Η5、 1.4, 10. 1と命 した。 d ) ェライザ （ EL I SA ) 法による抗体活性の測定
96穴甲底マイクロ夕イタ一プレートの各ゥエル （穴） に精製したリコンビナン トヒト II型ホスホリパーゼ A2を 20mMトリス緩衝食塩水 （TBS、 pH7.4) で 0.05〃g/ mlに溶解し、 100〃1ずつ添加し、 湿潤室中で一晩 4°Cに保存した。 その後、 溶液を 捨て、 1%ゥシ血洁アルブミン （以下 BSAと略称する） を含む TBSを 200〃1ずつ添加 し、 37°Cで 1時問^置し、 各ゥヱルの来吸着部分をブロックした。 その後、 0.05% ツイーン 20 (Tween 20商品名） を含む TBS (TBS-Tween) 溶液で数回洗净を行った o ハイプリ ドーマ培養上 乂は腹水乂は :製杭休標^を、 0.2%BSAを む TBS - Tw een (BSA-TBS-Tween) 溶液で希釈し、 100/ 1ずつ ^ゥエルに添加し、 室温で 2時 j を行った。
先と同様に TBS- Tween溶液で洗浄後、 BSA-TBS- Tween溶液で 2000倍希釈した西洋 ヮサビペルォキシダ一ゼ標識抗マウスお!;体 （ザィメッ ド社製） を 100〃1ずつ各ゥ エルに添加し、 室温で 2時間反応を行った。 反応後、 先と同様に TBS-Tween溶液で 洗浄後、 fiHU質として、 0.006%過酸化水素水、 並びに0.11^/1111の3，3' ,5，5'— テ卜ラメチルベンチジンを含む 0.1M舴酸一クェン酸ナトリウム緩衝液 (pH5.8) を 100〃1ずつ添加し、 ¾温で 30分 , :した。^ 後、 31硫峻を 25〃1ずつ加え 応を停止し、 450nmの吸光 を測定した。
e ) ホスホリノ 一ゼ A2阻害活性の測定
抗体のホスホリパーゼ A2に対する阻害活性の測定法としては、 ジャーナル ォ ブ バイオロジカルケミストリー (Pepinsky,R.B.et.al.,J.Biol.Chem.,261(9), 4239-4246(1986)) を若千改良し、 以ドの方法で測定した。
リコンビナン トヒ 卜 II型ホスホリパ一ゼ A2 i製標品 0.5^と¾養上清又は精製杭 体 品を、 150mM 塩化ナトリウムと 12.5 mM塩化カルシウムおよび 250〃g/mlの BS Aを含む 125mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0) 100〃 1巾で室温で 2II、 プレインキュベ一 シヨンした。 次に、 卜リチウム標識ォレイン酸を取り込ませた大腸閣 SN17のォ一 トクレイブ標品 25〃 1 (5ノゴから 10 cpm) を反応液に添加し、 37°Cで 30分問反応さ せた。 反応は氷中に移して、 4規定塩酸を 25〃1添加して^ II：させた。 反応^止後 、 40mg/mlの BSAを 25〃1加えて混合した後氷中で 30分 放 した。
その後、 15000rpmで 2分問遠心した上清の放射活忤を測定した。 得られた放射活 性より陰性対照 （ホスホリパーゼ Λ2と抗体を^まないサンプルの放射活性） を減 じた値をホスホリバ一ゼ A2活性とした。 抗体のホスホリパーゼ A2活性に対する Ml ','ϊ率は陽忤対照 （ホスホリパーゼ Α2を み抗体を作わないサンプルのホスホリパ ーゼ Α2活性) のホスホリパーゼ Α2活性を¾ に以 卜の,:; :に^づいて ^分率で した。
ホスホリパーゼ A2沾忤阻 率二 [ 1一 (ホスホリパーゼ A2と I ,1 ί乂は 製抗 ί木 標 をインキュベーションしたときのホスホリパーゼ Λ2 i, ) / ( n対照のホ スホリパーゼ A2活性) ] X 100
なお、 ホスホリパ一ゼ A2¾性の測 の際に频として川いたトリチウム標識ォ レイン酸を取り込ませた大腸 [ のォ一 1、クレイブ^ ,1 は特 |jfj、l':5- 192167 公報 8 に ^載の方法に率じで調製した。
(参^例 2 ) モノクローナル抗体の^ .と j¾
a ) モノクローナル抗体の^
BALB/c系雄マウス、 /1.-:後5〜6週齢に2， 6 , 10， 14-テ 卜ラメチルペン夕デカン （プ リスタン、 シグマネ I：製） 0.5mlを股腔内注射した後、 14〜2U i後に 5xl ON 個のハイ ブリ ドーマを生 .的贪塩水 0.5mlに戀濁して腹腔内に ½郴した。 10〜20日後に^牛. された腹水を屠殺問腹したマウスより ¾取した。 I I のマウスより 5〜10mlのモノ クローナル 体^ 腹水が得られた。
b ) モノク口一ナル杭体の精製
この腹水につき遠心分離して不^物除去後、 M ·'ή:の飽和硫酸ァンモニゥム ¾ 液を加え、 氷上で 時問撹拌した。 生じた沈澱を ^心分離し、 少 ttの 0. 9%の塩化 ナ卜リゥムを含む 0. 1M燐酸緩衝溶液 ( pH7.4 ) に^解し、 -晚 4°Cにて 100倍容の M 衝液に対して透析を行 I、、 ¾ガンマグ口ブリン I' 分を た。 この m分より 、 MAPS- I Iマウスモノクローナル抗体粘製キッ ト （商標、 バイオラッ ドラボラ卜リ ーズ社製） を利川して IgGを精製した。
即ち、 ガンマグロブリン画分に同容量のバインディングバッファ一を加え、 混 合した後、 同じバインディングバッファ一で充分 衡化した 「Protein A -Sepha rose CL4B (フアルマシア社製） 」 を充 ίしたカラム （ゲルべヅ ドボリューム 20m 1 ) にかけ、 バインディングバッファー 3カラム容^で洗^した。 ついでキ'ソ 卜に まれる 出バッファ一約 3カラム容 ¾で IgGを溶出した。 溶出した I gGは、 20mM卜 リス緩衝食 ½水 (PH7.4) 等に対して透析し、 これを抗体標品とした。 通常腹水 1 ml ^り 5〜10mgの IgGが得られた。
(参^例 3 ) 抗体のサブクラスの决定
ハイプリ ドーマ培養上清を用いて、 アマシャム製マウスモノクローナル抗体夕 ィピング川キットにより IgGサブクラスを決 した。 本法はエラィザ法によるもの で、 々 12H5 ( IgG2a) 、 1.4 ( IgG2a) 、 10. 1 ( IgGl ) と决定した。
(参考例 4 ) 杭休の交差:反応性
a ) ラヅ 卜 11型ホスホリパーゼ A2のお i製
ラッ ト PRP ( liil. /J、扳 i, 血 !10 に 1 /5 Ηの ACD液 ( 65mMのクェン酸と 85mMのクェン 酸ナトリウムを含む 2% (w/v) のブドウ糖液） を添加し、 2500xgで 10分問 ϋ心し た。 沈澱した血小板を lmlあたり 2x10"細胞になるように ACD/F10 地 ( 1 : 5) (F1 0； Gibcoネ I：製） 混液を加えて^^した後、 2500xgで 10分問；^心した。 さらに沈澱 した【(小板を lmlあたり 2xlO^U 3になるように F lOii 也で i 濁した後に、 W終 度が 2mMおよび 2.5ュニッ 卜になるように 1Mの塩化カルシウムおよび 2500ュニッ 卜 /mlのトロンビンを順次添加した。
添加後、 37°Cで 5分問ィンキュベ一シヨンした後、 4°Cで 3000xgで 15分問遠心し た上清 （ラッ ト血小板トロンビン刺激上洁） を ' 1収し、 この上清をその後の結製 操作に供した。 ホスホリパ一ゼ A2の結製は特^ 5- 192167 公報の第 12H記載の 法を :丁-改良して った。 すなわち、 ラッ ト血小板卜ロンビン刺激上洁を、 T' め O.IM酢酸緩衝液 （pH6.0) で平衡化してある硫酸化セル口ファイン （生化学工業 社製） カラム （ェコノカラム ；カラムサイズ 20ml； BIO- HAD社製） に通液した。 力 ラムに洗净液 （0.5M塩化ナトリウムを含む O.m酢酸緩衝液 (pH6.0) ) を 200ml通 液して充分洗浄した後、 溶出液 （1.5M塩化ナトリウムを含む 0.1M酢酸緩衝液 （p H6.0) ) を 30ml通液して得られた両分を硫酸化セル口ファイン結合 I固分とした。 つぎに、 硫酸化セルロフマィン結合画分を HPLCにて分则した。
カラムは CAPCELL PAK C18 (4.6醒10 2501] ;资/1:.堂製） 、 HPLCシステムは LC- 4A ¾ ^製作所製） を用いて、 すべて lml/分の流速で行った。 硫酸化セルロフアイ ン糸,1 iYYlriij分を通液した後、 0.1% hリフルォロ舴酸を 60分問通液した。 その後、 0 .1%トリフルォロ齚酸^ 1:下で、 0〜50%ァセトニ卜リルのリニアグラジェン卜を かけてホスホリパーゼ A2を溶川した。 ホスホリパーゼ A2のピークは約 30%ァセ 卜 二卜リル付近に現れるのでこれを [Π1収した。
M収した画分を SDS—ポリアクリルァミ ドゲル ¾ 泳！/法および銀染色法を用い て検^したところホスホリパーゼ A2が バンドとして検出されたので、 これを ラッ 卜 11 リホスホリパ一ゼ A2とした。
b) ヒト、 サル、 ィヌ、 ゥサギ、 ネコ、 マウス ίίι 、板 1来 11 ホスホリパ一ゼ Α2の調製
各稗勁物血小板由来 11 ホスホリパーゼ A2の ,翻製はジャーナル ォブ バイオ ロジカルケミストリー （ Biol.Chem., 264 (10) ,5768-5775 (1989) ) のヒ ト liil 小板破砕液の調製法に準じて調製した。
すなわち、 ヒト、 ァカゲザル、 ィヌ、 ゥサギ、 マウス、 ネコより PRP (血小板 ¾ ^血漿） を¾製し、 終濃度 2mMになるように EDTAを添加した後に、 2500xgで 10分 問遠心をして細胞を问収した。 細胞を 120mMの塩化ナ卜リゥムと 2πιΜの EDTAを含む 30mMトリス塩酸緩衝液 （pH7.4) に懸濁し、 ffi. 2500xgで 10分間遠心をした。 この 操作を 2回行った後、 得られた細胞を lmlあたり 2xl0'j細胞になるように 120mM½化 ナトリウムと 2mMの EDTAを^む 30πι 卜リス塩酸緩衝液 （ρΗ7.4) で f¾懸濁して、 液 体窒素下で ^結した。
凍結した細胞懸濁液を融解し、 同^の 0.36¾!定の硫酸を添加して超 ΐί·波破砕 （ B I0 C 7040 ULTRA SONIC PROCESSOR：セイコー社製； output 80 , 15秒 x6回） を行 つた。 得られた細胞超音波破粋液を氷中に 60分問放置した後、 4°Cで lOOOOxgで 30 分問遠心し h清を回収した。 沈澱にはさらに遠心上 ¾の 1/3容の 0. 18規定の硫酸を 添加して W 濁後、 氷屮に 60分問放置した。 その後、 4°Cで 10000xgで 30分間遠心 しヒ を问収した。 f山]方の^心上洁を合わせて、 200mMの塩化ナ卜リウムを含む 5 OrnMff酸緩衝液 (pH4.5) に対してー晚透析操作を行った。 透析後、 細胞破碎液を 4°Cで 15000xgで 40分 遠心した ί'ϋ 'Ι収し、 血小板山来ホスホリパ一ゼ Α2とし た。
c ) ェライザ j 応性
参 例 2b )で nられた各極モノクロ一ナル杭休お :製 ,'„',を川いて以ドの を行つ た。
IgG標品を BSA-TBS- Tweenで 10〃g/mlとし、 3倍希釈系列を作製した。 参考例 Id ) に従ってェライザを行い、 リコンビナントヒ 卜 I I ホスホリパーゼ A2およびラッ 卜 Π¾ホスホリパーゼ Α2に対する交 ^ 応 を, tlベた。 ラッ 卜 I I ホスホリパー ゼ A2に対する ELI SAは、 参考例 Id )のりコンビナントヒ 卜 I ホスホリパ一ゼ A2を ラッ 卜 I I型ホスホリパーゼ A2に き換えて行った。
結果を、 横軸に抗体濃度、 縦籼に 450nmにおける吸光 ffiをとり、 II〜図 2に示し た。 12H5、 および 1.4にはラッ トホスホリパ一ゼ A2への交 反応忤が認められたが 、 10. 1には交差反応性は認められなかつた o
d ) 各枧勁物由来ホスホリパ一ゼ A2に対する 性
参 例 2b)で得られた^種モノクローナル 体粘製ん',を川いて、 以下の突験を つた。
1 ) リコンビナン卜ヒト ホスホリパーゼ A2に対する阻^活性
参 例 la)のリコンビナントヒト I I .ホスホリパーゼ A2を川い、 参^例 l e )に従 い、 ホスホリパーゼ A2に対する阻 性を測 した。 横軸にホスホリパ一ゼ A2と 抗体標品をプレインキュベーションしたときの抗体濃度をとつて、 各抗体のリコ ンビナン卜ヒ卜 II型ホスホリパーゼ A2活性に対する阻' 率を図 3に示した。 12H5お よび 1.4は 10〃 g/mlの濃度でホスホリパーゼ A2沾性をほぽ完全に ffl离した。 一方、 10.1は 3〃g/mlの濃度で 80%の阻害率に) した。
2 ) ラッ 卜 II型ホスホリパーゼ A2に対する れ:
参考例 le)のリコンピナントヒト 11 ホスホリパ一ゼ A2を参 -例 4a)のラッ ト 11 ホスホリパ一ゼ A2¾製標ん (0.5ng) に き換えて、 ホスホリパーゼ A2に対す る附 性を測定した。 橫籼にホスホリパーゼ A2と杭休 ん',をプレインキュベ一 シヨンしたときの杭休濃度をとつて、 ^ 休のラッ 卜 Π ホスホリパーゼ A2活性 に対する阻^率を囟 4に示した。 12H5および 1.4はラヅ I、 II ホスホリパ一ゼ A2の 沾性をも 害し、 ホスホリパーゼ A2沾' Μ·:の 50%を附^するのに必¾な抗体濃度は 12H5で 5〃g/mlであった。
3) ヒ 卜、 サル、 ィヌ、 ゥサギ、 ネコ、 マウス、 ιίιι小板山来 II型ホスホリバ一 ゼ Α2に対する Ptl害活性
参考例 le)のリコンピナン卜ヒ 卜 Π ホスホリパーゼ Α2を^ ιίιι小板破碎液の - 定 iii ( 20から 40 1 ) に き換えて、 ホスホリパ一ゼ A2に Jする P[l ¾活性を測 し た。 誦に血小板破砕液と抗体 '品をプレインキュベーションしたときの抗体濃 度をとつて、 各杭体の血小板由来ホスホリパーゼ A2 i .に対する 'ΓΊ:率を図 5〜 ί¾ι
7に示した。 12Η5、 1.4および 10.1はヒ ト liil小板 ill来のホスホリパーゼ Α2活性をリ コンビナン卜ヒ ト Π ホスホリパーゼ Λ2 れ:と M梯に |5| 'ίした。 このことより本 允明のリコンビナン卜ヒ 卜 11 ホスホリ ノ、。一ゼ に c'iする '！:休は天然のヒ卜 11 ホスホリパーゼ A2の i .を ΡΓΙ ;する能力を していた。 づ jヽ 水発明の抗体はァ カゲザル、 マウス Ιίιΐ小板山来のホスホリパーゼ A2^'i :を PU した。 また、 ィヌ fill 小板山来のホスホリパーゼ A2活性の -部を ', した。 - '、 ゥサギ、 ネコ ίΐιι小板 山来のホスホリパーゼ A2¾'I :は しなかった。 (参考例 5 ) 抗体の細胞に結合した I I型ホスホリパ一ゼ A2を遊離する活性 肝細胞 （BRL- 3A：大 y本製薬より購入） を 96穴平板培養プレート （Falcon社製 ) で F12K/10%FCS (F12K：大口本製薬社製） を用いて培養した。 コンフルェント 迄培養した細胞の培養液を除き、 4ngの1 2 で標識したリコンビナントヒト I I型ホ スホリパーゼ A2を含む F12K/10%FCSを 50〃1添加し 37°Cでィンキュベ一シヨンし、 ホスホリパーゼ A2を細胞に結台させた。 1時間後、 結製杭体標品を含む Π2Κ/10% FCSまたは F 12K/10%FCSを 50〃1添加し St!に 2時問インキュベーションした。 ィンキ ュベーシヨン後、 養液を问収し、 その放射活性を測定した。 時に、 反応系に 添加した 4ngの で標識したホスホリパーゼ A2の放 活' :を別途に測定した。 杭休の細胞からホスホリパーゼ A2を遊離する沾忤:は、 添加したホスホリパーゼ Λ2の放射活性から、 ホスホリパーゼ A2を細胞に糸,1 ί Λ後 F 12Κ/ 10 % FCSを添加しイン キュベー卜したときの培養液の放射沾' | |·:を'引いた fitiを 100%として、 添加した抗休 濃度を変えィンキュベーションしたときのお 'ί 液の放射^性を fi分字-で示した。 なお、 リコンビナントヒト 1 1 リホスホリパーゼ Λ2の ' での標識は以 卜の方法 で行った。 I0D0GEN (ピアス社製） 10〃gでコートしたガラス, 験^に 30〃gのリコ ンビナン卜ヒ 卜 I I型ホスホリパーゼ A2を含む lOOmMの卜リス塩酸緩衝液 （ρΗ7· 4) 100 1を添加し、 100mCi/mlの Na l 2「' I ( ICN社^) を 6〃1添加した後、 20分問室温 にて放置した。 ガラス試験管より反応液を取り出すことで反^を^ II·.した。 反 応の Na 1 2 5 1はゲル濾過法により除いた。
ホスホリパーゼ A2を結 ^させた細胞に稗々の S度の精製抗体標品を添加してィ ンキュベーシヨンしたときの培養液の放射活性を測定した。 横軸に抗体添加後の お凝液中の抗体濃度をとつて、 各抗体の細胞に結^したホスホリパ一ゼ A2を遊離 する沽性を ¾18に示した。 コントロールのマウス杭 ί本は細胞からホスホリパ一ゼ Λ 2をまったく遊離しないが、 12Η5、 10. 1および 1 .4は濃度依^的に細胞よりホスホ リパーゼ Λ2を遊離した。
【参 例 6 )—杭休 1.4および 10. 1の簡および L ί "了変領域 cDMのクローニング cDNAクロ一ニングに川いたメッセンジャー RNAは 「QuickPrep Micro mRNA Puri f ication Ki t (フアルマシア社製） 」 を使用して約 107個のハイプリ ドーマ細胞か ら作成した。 すなわち細胞を抽出緩衝液 （Extraction buffer) で您濁溶解し、 ォ リゴ dTセルロース （Ol igo(dT)- Cel lulose) を用いて mRNAを^離した。
抗休 1.4の H鎖および L鎖可変領域 cDNAは 「5， RACE System Kit (ギブコ社製） 」 を使川して図 9に示す で作成した。 すなわち、 定常領域遺伝子（C)とハイプリ ッ ド形成するプライマ一および逆 fc ' 酵素 ( SUPER SCRIPT I I Reverse Transcri ptase) を使用して 1〃 のメッセンジャ一 RNAを銥;4'-にして .本; T!cDNAを合成した 。 ここで使川したブラィマ一は では 「GSP1L (5' -GGCACCTCCAGATGTTAACTGC-3' ) /|¾列番 .： 11」 で、 H iでは 「GSP1H ( 5' -GGAA(AG)rrA(AGC )CCCTTGACCAGGC-3' ) Z配列番¾： 12」 であった。 なお、 GSP1Hの配列で括弧內の配列は、 縮 3Ϊに対応 する塩基を小す。 次に、 銪 となつた mRNAを RNaseHにて消化した後、 「GLASS MA X Spin Cartridgej にて ^i'icDNAを精製した。 dCTPおよび末端デォキシヌクレ 才チドトランスフェラ一ゼを使用して 銷 cDNAの: T末端にポリ（dC)テールを結 させた。 H鎖および L i TJ変領域造ィム了- ( V )はポリ（ dC )テールとハイブリッ ド形成 するアンカ一プライマ一 (5， -CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGG 11 GGG 1 1 GGG UG- 3，/配列番 ： 13) および^常領域遗 ίム了 -(C)とハイプリッ ド形成するプライ マー 「GSP2L ( 5' -TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3' ) /(¾列 番^： 14」 (L鎖の場合) または 「GSP2H ( 5' -TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGAC( C AT )GATGGGG( GC )TGT( TC )GTTTTGGC-3' ) / i 列^り ： 15」 (H銷の¾合) を川いて L ATaq (宝 造社製) を使用して増幅させた。 GSP2Hの配列で括弧内の ¾列は、 縮 に対応する塩基を す。 この PCIU乂応物を 1.2 %ァガロースゲル' ί泳動にかけた ところ聰 1および Lli とも約 550〜570塩基対付近に単一バンドが検出できた。 また 、 抗体 12H5の H鎖および L鎖可変領域 cDNAも ヒ と f<¾様にして作成できる。
また、 抗体 10. 1の H鎖および Ui'i nJ変領域 cDNAは 「Marathon cDNA Ampl if icatio n Kit (クロンテックネ I:製） 」 を使川して図 12の方法で作成した。 すなわち、 「M arathon cDNA合成プライマ一」 および逆 fe 酵素を使用して l〃gのメッセンジャ 一 RNAを鍩 にして一本鎖 cDNAを合成した。 この反応液にさらに RNaseH、 DNAポリ メラ一ゼ I (DNA polymerasel ) 、 DNAライゲース （DNA l igase) を反応させて二 本鎖 cDNAを台成した。 さらに、 この反応液に T4 DNAポリメラ一ゼ （T4 DNA polym erase) を反応させて二本鎖 cDNAを平滑 端化した。 T4 DNA 1 igaseを使用して Ma rathon cDNAアダプターを一-本鮮 jcDNAに結合させた。 H鎖および L鎖可変領域追伝子 (V)はアダプタ一とハイプリッ ド形成するアダプタープライマ一 1およびプライマ -GSP2L (L鎖の iお または GSP2H (H "!の場 ） を川いて LATaq (宝酒造社製) を 使川して增巾 ί,ίさせた。 この PCR乂応物を 1.2%ァガロースゲル II 泳!！にかけたと ころ聰および L鎖とも約 550〜570塩^対付近に . 'バンドが検出できた。
ffi列決^のため 「TA cloning Kit (インビ卜ロジェンネ I：製） 」 を使川して pCRT Mi lベクターに PCRで増幅したフラグメン卜を糾み込んだ。 このフラグメン卜の挿 入された pCRTMI Iプラス ミ ドを、 大腸菌 JM109のコンビテン卜セル （' ί '造社製） にトランスフォ一メ一シヨンした。 プレー卜上に >!したコロニーおよび pCR1 M I Iとハイプリッ 卜'形成する 「5，プライマー UD ( 5' -ACCGAGCTCGGATCCACTAG-3' ) ¾ 列 * ： 16」 および 「3，プライマ一 DU (5' -ATGCATGCTCGAGCGGCCGCC-3' ) Z配列^
： 17 j を川い、 Taqポリメラ一ゼ (
Figure imgf000025_0001
) を川いたコロニー PCRを行った 。 ^幅した DNAフラグメントを 1.2%ァガロースゲル ' zメ ί泳 ί¾により分析し、 約 60 0〜620塩基対のフラグメン卜が増幅したコロニーを、 杭休 1.4Lttについは 3クロ一 ン、 H鎖については 4クローン、 またお L休 10. 1L鎖については 2クローン、 H銷につい ては 4クローンを選択した。 クローンの人腸 iを f養し 「QIAwel卜 8 Plasmid P urification Kit (キアゲン社^) 」 を使川してプラス ミ ド DNAを調製した。
調製した Aクローンのプラスミ ド DMおよびプライマー UD、 プライマ一 DU、 また は L銷では GSP2L、 H鎖では GSP2Hを川いて 「DNA Sequencing Kit (パーキンエルマ ーネ I：製) 」 を利川して配列決 反応を行い 「373DNA Sequencer (AB h製） j を用 いて解析を行った。 抗体 1.4の 3つの U'i^^ttおよび 4つの Hfi特^' I ：のクローン、 および抗体 10.1の 2つの L鎖特異性および 4つの H鎖特 性のクローンはそれぞれ配 列が同 -であった。 図 10 (配列番 - : 1及び 2) は抗体 1.4の L鎖について、 间 11 ( 配列番号： 3及び 4) は抗体 1.4の H鎖について、 それぞれ可変領域の cDNA配列およ び推定ァミノ酸配列を示す。 なお、 各図中、 CDR配列に対応すると了'想される配列 には下線が付されている。 (抗体 1.4の L鎖の ί'想 CD i列は 1%!列番 ： 5〜7、 抗体 1.4の H鎖の予想 CDR配列は配列番 ： 8~10にそれぞれ小されている。 )
(参考例 7 ) 抗体 1.4の H銷ぉよび L鎖 "J変領域ァミノ酸 列のヒ 卜抗休ァミノ 酸配列とのホモロジ一検索
参考例 6で得られた抗体 1.4の H iおよび Ufjni変 i域のァミノ酸配列とホモロジ 一の ,!¾いヒト抗休を GenBank、 EMBL、 SWISS-PROT, P1R, PRFデータベースより険^ した。 ホモロジ一検索は BLASTP 1.4.8MP (Altschul, . F. et. al. J.Mol.Bio 1., 215, 403-410(1990)) プログラムで ¾施した。 この結^、 抗体 1.4は、 例えば Pag- 1杭休 (Hughes-Jones, N. C. et. al. Biochem. J., 268, 135-140(1990)) や WEA抗休 (Goni, F. et. al. Proc.Natl. Acad. Sci .USA, 80, 4837-4841( 1983)) と^いホモロジ一を有していることが判 Iリ jした。
(参 -例 8 ) 杭休 12H5の H鉑および L l ''J変^域 cDNAのクローニング
cDNAクローニングに川いたメッセンジャー RNAは 「QuickPreP Micro mRNA Puri fi cat ion Kit (Pharmacia Biotech社製) j を使川して、 lxl07 Iのハイブリ ドー マ細胞から調製した。 即ち、 細胞を抽出緩衝液 (Extraction buffer) にて 濁溶 解し、 オリゴ dTセルロース （Oligo(dT)- Cellulose) を川いてメ ッセンジャ一 RNA を 離した。
抗体 12H5の H鎖および L銷可変領域 cDNAは 「5' RACE System Kit (GIBC0 BRL社製 ) j を使川して図 9に示す Τ·顺で作成した。 即ち、 常 ίίί域 (C) とハイブリ ツ ド 形成するプライマ一および逆転^ 尜 (SUPER SCRIPT II Reverse Transcriptas e) を使 fflして lmgのメ ッセンジャー RNAを鈸 にして 本 i cDNAを合成した。 ここ で使川したプライマ一は Urtでは Γ GSP1L (5' -GGCACCTCCAGATGTTAACTGC-3' ) /¾ 列番^： 11」 で、 H鎖では 「GSP1H (5' -GGAA(AG)TA(AGC)CCCTTGACCAGGC-3' ) / 配 列番号： 12」 であった。 尚、 GSP1Hの配列で括弧内の配列は縮 に対応する塩基を 示す。 次に、 銃型となったメッセンジャー RNAを RNaseHにて消化した後、 「GLASS MAX Spin Cartridge j にて -本鎖 cDNAを精製した。 dCTPおよび末端デォキシヌク レオチドトランスフェラ一ゼを使用して一本鎖 cDNAの 3'末端にボリ （dC) テール を結合させた。 H鎖および L鎖可変領域遺伝子 （V) はポリ （dC) テールとハイプリ ッ ド形成するアンカープライマー (5' -CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGI I GGGI IGGGI IG- 3，/ffi列 «リ ： 13) および^常 域逍 ίム - (C) とハイプリッ ド形成 するプライマー 「GSP2L (5' -TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC -3，） /ft!列番号： 14」 (L鎖の場合) または 厂 GSP2H (5' -TATAGAGCTCAAGCTTCCAG TGGATAGAC( CAT )GATGGGG( GC ) TGT( TC ) GTTTTGGC-3' ) /配列 り-： 15」 鎖の¾合 ) を用いて LA Taq ( g酒造社製） を使川して PCRを行うことにより増幅させた。 G
SP2Hの配列で括弧内の配列は、 m に対応する塩 ¾を示す o この PCR反応物に対し て 1 %ァガロースゲル電 ¾泳動を行ったところ、 H鎖および L鎖とも約 550~570塩 ½ 対付近に Φ. バン ドが検出できた。
配列泱定のため、 「ΤΛ Cloning Kit ( Invitrogen社 ; ) j を使川して pCRI Iべク 夕一に PCRで増 したフラグメン卜を紐み込んだ。 このフラグメン卜の柿入された pCRI Iプラスミ ドを、 大 I ¾JM109コンビテントセル （'- kffl—造社製） に トランスフ オームした。 プレー卜上に出現した大腸菌コロニーおよび pCRI Iベクタ一とハイブ リッ ド形成する 「5'プライマー UD (5' -ACCGAGCTCGGATCCACTAG-3' ) /配列拼 ： 16」 および 「3'プライマー DU (5' -ATGCATGCTCGAGCGGCCGCC-3' ) /配列桥 - ： 17」 を用い、 Taqポリメラーゼ （宝酒造ネ I：製） を川いてコロニー PCRを行った。 反応産 物を 1%ァガロースゲル ' 泳動により解析し、 約 600〜620塩¾対の DNAフラグメ ントの増幅がみとめられたクロ一ンを選択した。 ^クローンの大腸菌を培 ¾し、 rQIAGEN Plasmid Mini Kit (QIAGEN社.製) j を使川してプラスミ ド DNAを調製し た。 調製した各クロ- -ンのプラスミ ド DNAはプライマー UDおよびプライマ一 DUを川い 、 「DNA Sequencing Kit (Perkin Elmer社製) 」 、 「377 DNA Sequencer (Appli ed Biosystems Inc.製） 」 を用いてその核酸塩基配列解析を行った。 以 1:に関し て、 ハイプリ ドーマ細胞からのメッセンジャ一 RMの調製から L鎖 · H鎖の核酸塩 ¾ 配列解析までについて独 -.した 2回の操作を行い、 その結果の |ii現性を確認した。 抗体 12H5の L鎖に閲しては ¾なる 2種類の核酸塩丛配列が得られた。 塩基配列を 解析した 16クロ一ンのうち、 8クロ一ンは 「Mouse lg aberrantly rearranged ka ppa-chain mRNA V - J2 - C - regionj (Carroll, W. L. et. al . Molecular Immunol ogy, Vol.25, No.10, pp.991-995, 1988) と 致し、 残りの 8クローンの ft列は |nj - -であった。 また、 Η Πに ί¾1しては、 解析した 9クローンの配列は 1· ·であった。 図 13 (配列番 -： 18及び 19) は抗体 12H5の L iについて、 [¾114 (配列番号： 20及び 21) は H鎖について、 それぞれ nj変颌域の d)NAi¾列および推定アミノ酸配列を示す o 尚、 各図中、 CDR配列に対応すると予想される 列には下線が付されている。 ( 抗体 12H5の L鎖の了'想 CDR配列は配列赉 ： 22〜24、 H鎖の- ί'想 CDMd列は配列番号 ： 25〜27にそれぞれ^されている。 ）
(参考 (列 9) 杭休 121 の L¾'jおよび贿 "ί変領域ァミノ酸 列のヒト杭休アミノ 酸とのホモロジ一検索
参考例 8で得られた抗体 12H5の L鎖および Η鎖可変領域のァミノ酸配列と钔同性 の r¾ぃヒト杭休を SwissProtデータベースより検索した。 ホモロジ一検索は BLAST P 1.4.9. MP [26- March- 1996] [Build 14:27:01 Apr 1 1996] (Altschul, S. F. et al. J.Mol.Biol. , Vol.215, pp.403-410, 1990)プログラムで ¾施した。 この 結 ¾、 (列えば LAY抗体 (Capra, J. D. & Klapper, D. G. Scand. J. Immunol., 5, 677-684 (1976) , Capra, J. D. k Kehoe, J. M. Proc. Natl. Acad. Sci. U SA, 71, 4032-4036 (1974) ) 、 EU抗体 (Gottlieb, P. D. et al. Biochemistry ， 9, 3155-3161 (1970) , Cunningham, B. A. et. al. Biochemistry, 9, 3161 -3170 (1970) ， Gall, W. E. & Edelman, G. M. Biochemistry, 9, 3188-3196 ( 1970) ) 、 GAL抗体 (Laure, C. J. et. al. Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. ， 354, 1505-1509 (1973) ) 等と卨ぃ相同性があることが判 Π刀した。
[突施例 1 ] マウス抗ヒ卜ホスホリパ一ゼ A2モノクローナル抗体 12H5のマウス シスブラチン誘導急件^不全モデルにおける効果
使川勁物は雄忤 BALB/c マウス （4週齢、 体 ;15- 20g) を SLCから購入し、 4円問 飼育した後に鐘に Λ]いた。
シスブラチン誘¾ 性1 ^不^:モデルは以下の通り作製した。 即ち、 マウスの背 部皮下にシスブラチン （ランダ 、 ί」|本化薬株式会ネ 1.、 0.5 mg/ml) を 0.6 ml注 射し作 ¾した。 投 ' ノゴ法は 「参 ^例 2」 で られたマゥス ヒ 卜 π ホスホリパ
—ゼ A2モノクローナル抗体（12H5) [0.3 および 1.0 mg/0.2 ml/マウス 、 生理^ ^水 （大塚 ^薬株式会社） にて溶解] をシスブラチン投' /.241 問¾および 2時問! ¾ そしてシスブラチン投与後 1日「-； jから 2口 Πまで 1 i！ 1问 : F1腹腔内に合^ 4 投 した。 対照 ί;としてマウス 11型ホスホリパーゼ Α2と反応しないモノクローナ ル杭休 （マウス抗ラヅ 卜 ホスホリパーゼ Α2モノクロ一ナル杭休 （1.0mg/0.2ni 1/マウス） を抗ヒ ト Π ホスホリパーゼ Α2モノクローナル抗体の投リ-法と同様の 方法で腹腔内に投 -した。 ιΐϋ〖丫;にはシスブラチンの代わりに U'l! &塩水を背部 皮下に 0.6 ml注射し、 '上埋食塩水 (0.2 ml) を抗ヒ I、 II型ホスホリパーゼ A2モノ ク口一ナル杭体の投^法と问様の方法で腹腔内に投与した。 なお、 マウスは各^ 1 0 づっ用いた。
シスブラチン投与後 3 f:I Mに全てのマウスにエーテル麻^を施し、 腹部人静脈 からへパリン処 1!を施した注射筒を川い採 した。 その後、 腹部人動脈を t刀断し マウスを ^殺した後、 左¾を摘 した。 血液サンプルは 5，000rpm、 20分問^心し 、 血漿とし BUNカイノス (株式会ネ i:カイノス製) を川い BUNを測定した。 ¾は摘出 後 ちに被膜を取り除き赤追而に沿つて輪切りにし、 10 %ホルマリン緩衝液にて 8時問 ^定し、 その後水洗しホルマリンを除去し、 エタノール （70,80,90, 99.5， 100%)を川い脱水し、 ベンゼン系列、 パラフィ ン飽和ベンゼンを終た後、 バラフ インを川い包 i¾した。 そしてミクロ トームを川い厚さ 2〃mの ^組織切片を作成し 、 へマトキシリン-ェォジン (H-E) 染色を施し、 紐織学的な検討を行った。 尚、 突験期問を通じて毎日マウスの体 K測定を行った。 まず、 正常マウスの体 ffi は 験問始時において約 20g程度であり、 突験最終 L 1においては約 21gと lg B度の 上昇を示した。 しかし、 シスブラチン投与^においては シスブラチン投' -j- 1 Π で約 lgの体^減少が認められ、 2日 Πで 、 3 | J Nで 5gという劇的な体 JB減少が 鋭察された。 また、 マウス抗ラヅ 卜 Π ホスホリパ一ゼ A2モノクロ一ナル抗休投 シスブラチン投' j.iffとほぼ冋様の休 ;減少が認められた。 b'i tト I I型ホスホリ パ一ゼ A2モノクローナル杭体（0.3 mg/kg)投 ' において' '験 終 1 1に約 4g、 1 . 0 mg/kg 投与群においては約 3.5gの休 ¾減少しか ' されず、 シスブラチン投与 による体 Si減少が ¾' "刀に改 ΐ'ίされた。 血 BUNの' Ι'. J匀ザ :は ι マウスにおいて 17 .5mg/d 1であったのに対し、 シスプラチン投 .により 33. 9mg/d 1と約 2ί· まで上 Ηし た。 マウス抗ラッ ト I I型ホスホリパーゼ Α2モノクロ一ナル 休投 においてもシ スプラチン投 Μ とほぼ冋様の Ifn漿 BUNの卜 '.であった。 これに対し、 杭ヒ ト ホスホリパ一ゼ A2モノクロ一ナル杭休（0.3mg/マウス）投 ^の liuil BUNの、卩均値は 27.5mg/d 1であり、 ιΙ· マウスのシスブラチン投 により I ·. Wした BUNftの約 40 % を抑制していた。 杭ヒ ト ホスホリパ一ゼ Λ2モノクロ--ナル杭休 （l . Omg/マウ ス ) 投与群の血漿 BUNの 均 は 24.7mg/dlであり、 ι マウスのシスプラチン投 与-により ヒ昇した BUNiii'i:の約 60%抑制していた。 シスブラチン投 群およびマウス 抗ラッ 卜 I I型ホスホリパーゼ A2モノクロ一ナル杭休 ·! ' において尿細管ヒ皮細 胞 S3フラグメン 卜の広範!？ mこ壊死が鋭察された。 杭ヒ 卜 I ホスホリパーゼ A2モ ノクローナル抗体（1.0 mg/マウス）投与ί'ί;においてその ¾死部位はわずかしか認め られず、 HjJらかにシスブラチンの W細 I：皮細胞 ',1 ίが抑制されていた。
以上のことから、 1 ) 杭ヒ 卜 Π ¾ホスホリパーゼ Α2モノク口一ナル杭体は シス ブラチン投' による腎陣 の: ίΐί標となる BUNi 'iの I 1を抑制し、 2 ) 抗ヒ ト I I型ホスホリパーゼ Λ2モノクローナル抗体はシスブラチン投' Jによる ¾陣¾が最も 顕¾に ¾察される腎臓尿細管上皮細胞 S3フラグメン卜の壊死も抑制する、 ことが 判明した。
[実施例 2] マウス抗ヒトホスホリパーゼ A2モノクローナル抗体 12H5及び 1.4の マウスシスブラチン誘導腎障 ¾モデルにおける効果
使用動物は雄性 BALB/c マウス （4週齢、 体 SU5-20g) を SLCから購入し、 4に 1問 飼育した後に実験に川いた。
シスブラチン誘導 陣害モデルマウスを、 マウスの^部皮下にシスブラチン （ ランダ注、 H本化薬株式会社、 0.5 ig/ml) を 0.6 mU iWし作製した。 「参考例 2」 で i!iられた結製マウス： ί·Λヒ 卜 II 'ホスホリパーゼ Λ2モノクローナル ' Li本 (12 H5または 1ノ 1) [0.1、 0.3または 1.0 mg/0.2 ml/マウス、 水 （人塚製薬株 式会社） にて溶解] をシスブラチン投 24時問前に Φ.回腹腔内投 した。 対照群 としてマウス 11¾ホスホリパーゼ A2と反応しないコン卜ロールモノクロ一ナル抗 休 (5H8; Sugita Y. et al · , I麵 imology, 82, p34-41 (1994)) (1.0mg/0.2ml/マ ウス） を抗ヒ卜 11型ホスホリパーゼ A2モノクローナル杭休の投与法と同様に股腔 内投^した。 常 にはシスブラチンの代わりに ^理 塩水を^部皮 ドに 0.6 ml 注射し、 ^塩水 (0.2 ml) を杭ヒ 卜 Π ホスホリパーゼ Λ2モノク口一ナル杭 体の投 法と 様の方法で腹腔内に投 .した。 なお、 マウスは各群 6 Pし:づっ用い た。
なお、 以下の 1)採尿を行い尿中の y—グル夕ミルトランスべプチダ一ゼを測 する' 験と 2) 411 Πに採血を行い、 血中の BUNを測定する灾験は、 それぞれ別々 に行った。 また、 3 ) 腎臓巾のホスホリパーゼ A2 性測定に川いた^臓は上記血 中の BUNを測定する実験の際のものを川いた。
1 ) シスブラチン投与 1 Π [：1に各群のマウスにエーテル麻 I*を施し、 膀胱内か ら蓄 J¾を採取した。 また、 2) シスブラチン投 .4 ΠΙΊに各胙のマウスにェ一テ ル麻 Wを施し、 眼底からへパリン処 ifl!を施したへマトクリツ 卜毛細管を用い採血 した。 3) その後、 腹部大動脈を切断しマウスを¾殺した後、 腎を摘出した。 1 ) 尿は 3，000 rpmで 10分間遠心し、 その上清をサンプルとし、 ィァ卜ロセヅ 卜 r- GTP (ダイアヤトロン製） を用い尿中 グル夕ミルトランスべプチダ一ゼ （ 7 -glutamyl transpeptidase) 活性を測定し、 同時に CRE-ENカイノス （株式会社 カイノス製） を用いて測定した尿巾クレアチニン含量で補正した。
2 ) 血液サンプルは 5，000 rpmで 20分間遠心し fill漿とし、 BUNカイノス （株式会 社カイノス製） を用い血漿屮尿素窒素含 M(BUN)を測定した。
3) 摘出^はホスホリパ一ゼ A2活忤測^/ Πにホモジェネー卜を作製した。 1 ホ モジェネートの作製は文献記載の方法（J.Clin. Invest., 98， 365-371(1996 ))¾ - 邰改変して行った。 すなわち、 ¾を ImM EDTAを む 10mMトリス塩酸緩衝液（pH7 .4 )存 卜でポッター ホモジェナイザーを川いてホモジェナイズし、 さらに 0.3 6規定の硫^を添加して超 波破砕 （ブランソン社製ソニファーヤ一モデル 250D) を行った。 氷中に 60分放 i¾後、 4°Cで 15000xgで 30分問 心し上¾を问収した。 「"1 収した 1·.^は 200mMの塩化ナトリゥムを む 50 1トリス塩酸緩衝液（pH7.4)に対し て -晚透析操作を行った。 透析終了後、 15000xgで 30分 遠心した上^を 収し、 その 20mlをホスホリパーゼ A2活性の測^に供した。 ホスホリパ一ゼ A2 †¾測定法 は 「参 例 ld)」 の方法に じた。 ホスホリパーゼ A2活性は、 反応液に加えた基 'Π (トリチウム標識ォレイン酸を取り込ませた大腸 1 の才ートクレーブ 品） のう ち加水分解により遊離してきた卜リチゥム 識ォレィン酸 をパーセントで し
、 31にプロテイ ンアツセィ （バイオラッ ドネ 1:製） を川いて BSAを標準として測定し た ホモジエネ一卜の ίί^1ϊ5 度で、 ホスホリバーゼ Α2¾性を袖 I「：し、 %加水分 解/分/ mgで表した。
シスブラチン投 後 4 EJ I」の^臓屮のホスホリバ一ゼ A2活性を |¾| 15に した o シスプラチン投 'J舴は正常 ffif:( 12.0± 1.1 %加水分解/分/ mg)に比べて約 3 に Y していた （32.2±4.2%加水分解/分/ mg) 。 抗ヒ ト ホスホリパーゼ Λ2 モノク 口一ナル抗体投 -? ΠΗこおいては、 12H5の 0.1mg、 0,3mg'、 l.Omg投 ^、 1.4の 0.3m g、 1. Omg投 でシスブラチン投 によるホスホリパーゼ A2沽' I' の卜— がそれぞ れ有意に 73%、 72%、 69%、 88%、 60%抑制されていた。 一方、 コントロール抗 体はホスホリパ一ゼ A2活性の上昇を抑制しなかった。 このことより、 シスプラチ ン投与前 24時間に単回投与した抗ヒト II型ホスホリパーゼ A2 モノクローナル抗 体はシスブラチン投与後 4日目 （抗体投与 5日 C1) の腎臓中でもその効果が持続さ れていた。
シスブラチン投与後 1日目の尿中 y-GTP活性を図 16に示した。 尿細管陣害の指 標であるァ -GTPは、 シスブラチン投与群で正常群 （260±26 I.U/mg クレアチニン ) に比べて約 5倍に k昇していた （1324 ±350 I.U/mg クレアチニン） 。 抗ヒ卜 II ¾ホスホリパ一ゼ A2 モノクローナル抗体投 -/Γί:においては、 12H5の 0.3mg、 1.0 mg投与胙、 1.4の 0.1mg、 0.3mg, 1.Omg投' ϋでシスブラチン投 によるァ -GTP活 性の上界がそれぞれ有意に 76%、 87%、 82%、 62%、 84%抑制されていた。 しか し、 コン卜ロールモノクローナル杭体はァ- GTPの上 Wを抑制しなかった。
また、 シスブラチン投与後 4 H の血漿 BUN iを図 17に示した。 ^機能陣^の指 楞である血漿 BUNはシスブラチン投与群は :常胙 （25.8土 1.6mg/dl ) に比べて約 4 倍にヒ昇していた （109.3±10.8mg/dl) 。 抗ヒ 卜 II型ホスホリパ一ゼ A2 モノク ローナル杭体投与群においては、 12H5の 0.1mg、 0.3mg、 l.Orag投 ΖΓί；、 1.4の 0.3m g、 1.Omg投 胙でシスプラチン投与による血漿 BUNのヒ昇が、 それぞれ有, に 58 %、 68%、 87%、 61%、 88%抑制されていた。 しかし、 コントロール抗休は BUN のヒ界を抑制しなかった。
以上のことから、 抗ヒト II型ホスホリパーゼ A2 モノクローナル抗体は、 ホス ホリパ一ゼ A2を抑制することによりシスブラチン,诱導^障^の発症および進展を 抑制する薬剤として利川可能であることが判叨した。 産業上の利用の可能性
本発明によって、 抗ヒト Π型ホスホリパーゼ A2モノクローナル抗体、 又はその 一部分を含み該 U害能を有する蛋白^もしくはペプチド力 ヒ 卜の白金化合物、 特にシスブラチン投与による腎陣害の発 および進展を抑制する薬剤として利用 可能であることが明らかになった。 即ち、 シスブラチンの ¾も顕 な副作用であ る腎毒性を抑制することが可能となった。 そして、 シスブラチンの投与量を上昇 させ、 シスブラチンの薬効を増大することが可能となった。
従って、 本 ¾I の医薬組成物は、 金化合物投与により^じる^陣害の抑制剤 として冇 fflである。 乂、 I金化合物投与前もしくは投 ' 時に投': f-することにより ^陣 を 1 止する予防剤としても冇川である。
配列表
( 1 ) 出願人氏名又は名称： 山之内製薬株式会社
( 2 ) 発明の名称： 腎障害改善剤
( 3 ) 整理番号： Y 1— 802 PCT
( 4 ) 出願番号：
(5) 出願日 ：
(6) 優先権のもととなった出願をした国名及び出願の番号： 曰本国 平成 8年特許願第 167286号
日本国 平成 8年特許願第 247635号
(7) 優先日 ： 1 996年 6月 27日
1 996年 9月 19日
(8) 配列の数： 27 配列番号 ： 1
配列の長さ ： 393
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： cDNA to mRNA
起源
セルライン ： 1.4
配列の特徴
特徴を表す記号 ： CDS
存在位置 ： 1 .. 393
特徴を決定した方法 ： E
配列 ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC TGG GTT CCA 48
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
GGT TCC ACA GGT GAC ATT GTG CTG ACC CAA TCT CCA GCT TCC TTG GCT 96
Gly Ser Thr Gly Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
GTG TCT TTA GGG CAG AGG GCC ACC ATA TCC TGC AGA GCC AGT GAA AGT 144 Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr l ie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
35 40 45
GTT GAT AGT TAT GGC ATT AGT TTT ATG CAC TGG TAT CAG CAG AAA CCA 192 Val Asp Ser Tyr Gly l ie Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro
50 55 60
GGA CAG CCC CCC AAA CTC CTC ATT TAT CGT GCA TCC AAC CTA GAA TCT 240 Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu l ie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
GGG ATC CCT GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT AGG ACA GAA TTC ACC 288 Gly l ie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Glu Phe Thr
85 90 95
CTC ACC ATT AAT CCT GTG GAG GCT GAT GAT GTT GCA ACC TAT CAC TGT 336 Leu Thr l ie Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr His Cys
100 105 110
CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAG TTG 384 Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
115 120 125
GAA ATA AAA 393 Glu l ie Lys 130 配列番号 ： 2
配列の長さ ： 131 .
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 1.4
配列
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp l ie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr l ie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
35 40 45
Val Asp Ser Tyr Gly l ie Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro
50 55 60
Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu He Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80
Gly l ie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Glu Phe Thr
85 90 95
Leu Thr l ie Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr His Cys
100 105 110
Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
115 120 125 Glu l ie Lys
130 配列番号 ： 3
配列の長さ ： 408
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： cDNA to mRNA
起源
セルライン ： 1.4
配列の特徴
特徴を表す記号 ： CDS
存在位置 ： 1 . . 408
特徴を決定した方法 ： E
配列
ATG AGA GTG CTG ATT CTT TTG TGG CTG TTC ACA GCC TTT CCT GGT TTC 48
Met Arg Val Leu He Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Phe
1 5 10 15
CTG TCT GAT GTG CAG CTT CAG GAA TCG GGA CCT GGC CTG GTG AAA CCT 96
Leu Ser Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
20 25 30
TCT CAA TCT CTG TCC CTC ACC TGC ATG GTC ACT GGC TAC TCA ATC ACC 144 Ser Gin Ser Leu Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Gly Tyr Ser l ie Thr
35 40 45
AGT GAT TAT GCC TGG AAC TGG ATC CGG CAG TTT CCG GGA AAC AAA CTG 192 Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp He Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu
50 55 60
GAG CGG ATG GGA TAC ATA AGG TAC AGT GGT TAC ACT AGC TAC AAC CCA 240 Glu Arg Met Gly Tyr l ie Arg Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro
65 70 75 80
TCT CTC AAA AGT CGA ATC TTT ATC ACG CGA GAC ACA TCC CAG AAC CAG 288 Ser Leu Lys Ser Arg l ie Phe l ie Thr Arg Asp Thr Ser Gin Asn Gin
85 90 95
TTC TTC CTA CAT TTG ACT TCT GTG ACT ACT GAG GAC ACA GCC ACA TAT 336 Phe Phe Leu His Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
100 105 110
TAC TGT ACA AGA GAC TTG GAC GCC TGG TAC TTC GAT GTT TGG GGC GCA 384 Tyr Cys Thr Arg Asp Leu Asp Ala Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
115 120 125
GGG ACA ACG GTC ACC GTC TCC TCA 408 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 配列番号 ： 4
配列の長さ ： 136
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 1.4
配列 Met Arg Val Leu l ie Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Phe 1 5 10 15
Leu Ser Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
20 25 30
Ser Gin Ser Leu Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Gly Tyr Ser He Thr
35 40 45
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp l ie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu
50 55 60
Glu Arg Met Gly Tyr He Arg Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro 65 70 75 80
Ser Leu Lys Ser Arg He Phe l ie Thr Arg Asp Thr Ser Gin Asn Gin
85 90 95
Phe Phe Leu His Leu Thr Ser Va] Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Thr Arg Asp Leu Asp Ala Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
115 120 125
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 配列番号 ： 5
配列の長さ ： 15
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 1.4 配列
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly l ie Ser Phe Met His 1 5 10 15 配列番号 ： 6
配列の長さ ： 7
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 1.4
配列
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5 配列番号 ： 7
配列の長さ ： 9
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 1.4
配列
Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr
1 5 配列番号 ： 8
配列の長さ ： 6
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 1.4
配列
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5 配列番号 ： 9
配列の長さ ： 16
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 1.4
配列
Tyr l ie Arg Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 配列番号 ： 1 0
配列の長さ ： 9
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状 配列の種類 ：
起源
セルライン ： 1 .4
配列
Asp Leu Asp Ala Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 配列番号： 11
配列の さ ： 22
配列の型： 核酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列
GGCACCTCCA GATGTTAACT GC 22 配列番号： 12
配列の長さ ： 21
配列の型： 核酸
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列
GGAARTAVCC CTTGACCAGG C 21
配列番 ： 13
配列の長さ ： 48
配列の型 ： 核酸 トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
配列の特徴
存在位置： 36,37,41,42,46,47
その他の特徴： Nはイノシン （ I ) を表す。
配列
CUACUACUAC UAGGCCACGC GTCGACTAGT ACGGGNNGGG NNGGGNNG 48 配列番号： 14
配列の長さ ： 46
配列の型： 核酸
トポロジー： ifi鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
配列
TATAGAGCTC AAGCTTGGAT GGTGGGAAGA TGGATACAGT TGGTGC 46 配列番号： 15
配列の長さ ： 50
配列の型： 核酸
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
配列
TATAGAGCTC AAGCTTCCAG TGGATAGACH GATGGGGSTG TYGTTTTGGC 50 配列番号： 16
配列の長さ ： 20 配列の型： 核酸
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列
ACCGAGCTCG GATCCACTAG 20 配列番号： 17
配列の長さ ： 21
配列の型 ： 核酸
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列
ATGCATGCTC GAGCGGCCGC C 21 配列番号： 18
配列の長さ ： 381
配列の型： 核酸
鎖の数： 二本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
起源
セルライン ： 12H5
配列の特徴
特徴を表す記号
存在位置： 1 . . 381
特徴を決定した方法： E 配列
ATG GTA TCC ACA CCT CAG TTC CTT GTA CTT TTG CTT TTC TGG ATT CCA 48 Met Val Ser Thr Pro Gin Phe Leu Val Leu Leu Leu Phe Trp l ie Pro
1 5 10 15
GCC TCC AGA GGT GAC ATC TTG CTG ACT CAG TCT CCA GCC ATC CTG TCT 96 Ala Ser Arg Gly Asp l ie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Ala l ie Leu Ser
20 25 30
GTG AGT CCA GGA GAA AGA GTC ACT TTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGC 144 Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser
35 40 45
ATT GGC ACA AGC ATA CAC TGG TAT CAG CAA AGA ACA AAT GGT TCT CCA 192 l ie Gly Thr Ser He His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro
50 55 60
AGG CTT CTC ATA AAG TAT GAA TCT GAG GCT ATA TCT GGG ATC CCT TCC 240 Arg Leu Leu l ie Lys Tyr Glu Ser Glu Ala He Ser Gly l ie Pro Ser
65 70 75 80
AGA TTT AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTT ACT CTA AGT ATT AAC 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser l ie Asn
85 90 95
AGT GTG GAG TCT GAA GAT ATT GCA GAT TAT TAC TGT CAA CAA AGT CAT 336 Ser Val Glu Ser Glu Asp l ie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser His
100 105 110
AGC TGG CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAG TTG GAA ATA AAC 381 Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu l ie Asn
115 120 125 配列番号： 19
配列の長さ ： 127
配列の型： アミノ酸
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： タンパク質
起源
セルライン： 12H5
配列
Met Val Ser Thr Pro Gin Phe Leu Val Leu Leu Leu Phe Trp l ie Pro
1 5 10 15
Ala Ser Arg Gly Asp l ie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Ala He Leu Ser
20 25 30
Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser
35 40 45
l ie Gly Thr Ser l ie His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro
50 55 60
Arg Leu Leu l ie Lys Tyr Glu Ser Glu Ala He Ser Gly l ie Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser l ie Asn
85 90 95
Ser Val Glu Ser Glu Asp He Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser His
100 105 110
Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu l ie Asn
115 120 125 配列番号： 0 配列の長さ ： 411
配列の型： 核酸
鎖の数： 二本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
起源
セルライン
配列の特徴
特徴を表す記^ : CDS
存在位^： 1 . . 411
特徴を決定した方法： E
配列
ATG GGA TGG AGC TAT ATC ATC CTC TTT TTG GTA GCA ACA GCT ACA GAT 48 Met Gly Trp Ser Tyr l ie l ie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp
1 5 10 15
GTC CAC TCC CAG GTC CAA CTG CAG CAG CCT GGG GCT GAA CTG GTG GAG 96 Val His Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
CCT GGG GCT TCA GTG AAG CTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
ACC ACC TAC TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGC CCT GGA CAA GGC CTT 192 Thr Thr Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gin Ser Pro Gly Gin Gly Leu
50 55 60
GAG TGG ATT GGA GAG ATT AAC CCT ACC AAC GGT CGA ACT AAT TAC AAT 240 Glu Trp l ie Gly Glu He Asn Pro Thr Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80
GAG AAT TTC AGG ACC AAG AAT AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC AAA TCC 288 Glu Asn Phe Arg Thr Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser
85 90 95
TCC ACC ACA GCC TAC ATG CAC CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT 336
Ser Thr Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
GCG GTC TAT TTT TGT GTA GGG GGG CTG GAC TAC TTT GAC TAC TGG GGC 384
Ala Val Tyr Phe Cys Val Gly Gly Leu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
CAA GGC ACC ACT CTC ATA GTC TCC TCA 411
Gin Gly Thr Thr Leu l ie Val Ser Ser
130 135 配列番号： 21
配列の長さ ： 137
配列の型： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： タンパク質
起源
セルライン： 12H5
配列
Met Gly Trp Ser Tyr l ie He Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp
1 5 10 15
Val Hi s Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro G ly Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30 01 9 I
STH an S Jqi ^ID 8U J3S "to s BIV Say
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9t- 0 SC aqd Jqi J ^IV s s J9S na^ s q 八 J9S ¾IV OJJ
lflZOIL6A£IL3d LZP6PIL6 OfA. 配列番号： 23
配列の長さ ： 7
配列の型： アミノ酸
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： タンパク質
起源
セルライン： 12H5
配列
Tyr Glu Ser Glu Ala l ie Ser
1 5 配列番号： 24
配列の長さ ： 9
配列の型： アミノ酸
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： タンパク質
起源
セルライン：
配列
Gin Gin Ser His Ser Trp Pro Phe Thr 1 5 配列番号： 25
配列の長さ ： 5
配列の型： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状 配列の種類： タンパク質
起源
セルライン： 12H5
配列
Thr Tyr Trp Met His
1 5 配列番号： 26
配列の長さ ： 19
配列の型： アミノ酸
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： タンパク質
起源
セルライン： 12H5
配列
Glu l i e Asn Pro Thr Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Arg
1 5 10 15
Thr Lys Asn 配列番号： 27
配列の良さ ： 7
配列の型： アミノ酸
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： タンパク質
起源
セルライン： 12H5
S I
J dsy 9qd dAi dsy λ{ urn
19
\ ZZQIL6d£l∑DA LZ 6PIL6 OAX―

Claims

請求の範囲
1 . I I型ホスホリパ一ゼ A2の活性を阻害するモノクローナル抗体、 又はその一 部分を含み該阻害能を有する蛋白質もしくはべプチドを有効成分とする、 白金化 合物投与による腎障害の改善剤である医薬組成物。
2 . 細胞膜に結合した II型ホスホリパーゼ A2を遊離する作用を有するモノクロ —ナル抗体、 又はその一部分を含み該作用を有する蛋白質もしくはべプチドを有 効成分とする、 白金化合物投与による腎障害の改善剤である医薬組成物。
3 . I I型ホスホリパ一ゼ A2の活性を阻害し、 かつ細胞膜に結合した I I型ホスホ リパーゼ A2を遊離する作用を有するモノクローナル抗体、 又はその一部分を含み 該阻害能を有する蛋白質もしくはべプチドを有効成分とする、 白金化合物投与に よる腎障害の改善剤である医薬組成物。
4 . I I型ホスホリパ一ゼ A2がヒ ト由来である、 詰求 J貝；！〜 3のいずれかに記載 の医薬組成物。
5 . モノクローナル抗体が、 ヒ ト由来 II型ホスホリパ一ゼ A2の活性を阻害し、 かつサル由来 I I型ホスホリパーゼ A2及び/又はマウス由来 I I型ホスホリパ一ゼ A2 の活性を阻害することができるモノクローナル抗体である、 請求項 1記載の医薬 組成物。
6 . モノクローナル抗体が、 細胞膜に結合したヒト由来 I I型ホスホリパーゼ A2 を遊離する作用を有し、 かつ細胞膜に結合したサル由来 I I型ホスホリパーゼ A2及 び Z又はマウス由来 I I型ホスホリパーゼ A2を遊離する作用を有するモノクロ一ナ ル抗体である、 請求項 2記載の医薬組成物。
7 . モノクローナル抗体が、 ヒ ト由来 I I型ホスホリパーゼ A2の活性を阻害し、 かつサル由来 I I型ホスホリパーゼ A2及び/又はマウス由来 I I型ホスホリパ一ゼ A2 の活性を阻害することができ、 かつ細胞膜に結合した I I型ホスホリパ一ゼ A2を遊 離する作用を有するモノクローナル抗体である、 請求頌 3記載の医薬組成物。
8 . モノクローナル抗体が、 モノクローナル抗体 12H5、 10. 1又は 1.4が結合する ェビト一プに結合することができるモノクロ一ナル抗体である、 請求項 5〜 7の いずれかに記載の医薬組成物。
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