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WO1997048790A1 - Procede de production de substance-cible par fermentation - Google Patents

Procede de production de substance-cible par fermentation Download PDF

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Publication number
WO1997048790A1
WO1997048790A1 PCT/JP1997/001886 JP9701886W WO9748790A1 WO 1997048790 A1 WO1997048790 A1 WO 1997048790A1 JP 9701886 W JP9701886 W JP 9701886W WO 9748790 A1 WO9748790 A1 WO 9748790A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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ala
gene
gly
leu
val
Prior art date
Application number
PCT/JP1997/001886
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoko Kuwabara
Eiichiro Kimura
Yoshio Kawahara
Tsuyoshi Nakamatsu
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Priority to EP97924309A priority Critical patent/EP0974647A4/en
Publication of WO1997048790A1 publication Critical patent/WO1997048790A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/69—Increasing the copy number of the vector

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a target substance by a fermentation method, and more particularly, to a method for efficiently producing a useful substance such as amino acid.
  • Enzymes that adversely affect the production of the target substance such as enzymes that degrade the poor target or convert it to other substances, and biosynthesis of the target substance, in order to increase the production efficiency of the target substance by fermentation using microorganisms
  • a method using a microorganism which is deficient or weakened in an enzyme or the like belonging to another pathway branched from a system There is known a method using a microorganism which is deficient or weakened in an enzyme or the like belonging to another pathway branched from a system.
  • a mutant deficient in homoserine dehydrogenase (hereinafter referred to as “HD”), which is said to be the enzyme that most affects L-lysine productivity, is known.
  • Microbiol. (Nakayama, K. et al .; J. Gen. Appl. Microbiol. F. (3), 145-154 (1961)).
  • the first reaction, aspartic acid-semialdehyde is performed in the synthesis pathway unique to heathreonine, which branches via the L-lysine synthesis pathway through aspartic acid; S-semialdehyde.
  • L-threonine is not synthesized due to the lack of HD that catalyzes the reaction to generate homoserine, and as a result, L-lysine synthesis reaction is not inhibited because L-threonine does not inhibit aspartokinase activity, which is feed-blocked. Progresses.
  • the present inventors transformed a coryneform L-glutamic acid-producing bacterium with a plasmid containing a gene for the hyke glutaglutarate dehydrogenase (hereinafter referred to as ⁇ -KGDH), and obtained the resulting transformant.
  • ⁇ -KGDH a coryneform L-glutamic acid-producing bacterium with a plasmid containing a gene for the hyke glutaglutarate dehydrogenase
  • a biotin-inhibiting substance such as a surfactant or benicillin is used in the medium. It has been found that it produces and accumulates a significant amount of L-glutamic acid without being added to the water (W095 / 34672 International Publication Pamphlet). Usually, coryne type L-gluta When culturing in a medium with restricted biotin, the bacterium produces significant fibrous L-glutamic acid, but does not produce L-glutamic acid when cultured in a medium containing excess biotin. Are known.
  • L-glutamic acid In order to produce L-glutamic acid in the presence of biotin, it is necessary to add a surfactant or penicillin to the culture medium.For a KGDH gene-disrupted strain, do not add these substances. It also produces L_glutamic acid (W095 / 34672 International Publication Pamphlet).
  • the present inventors have conducted studies on the mechanism of action of limiting biotin or adding a surfactant or benicillin on the productivity of L-glutamic acid in coryneform bacteria.
  • the present inventors have identified the existence of a gene that is thought to be involved in L-glutamate production (hereinafter, this gene is referred to as “dtsR gene J”, and the protein encoded by the gene is referred to as “DTSR protein J.”). It was confirmed that the strain in which the R gene was disrupted produced a remarkable amount of L-glutamic acid even under conditions where the wild-type strain had an amount of biotin that hardly produced L-glutamic acid (W095 / 23224 International Public pamphlet).
  • the production of the target substance can be increased by deleting specific genes, but the deletion of these genes may not be preferable for the growth of microorganisms.
  • an HD-deficient strain cannot synthesize L-threonine and L-methionine, it cannot grow without these amino acids in the medium.
  • DTSR protein-deficient strains have high L-glutamic acid-producing ability but have a slow growth rate and require oleic acid for cultivation (W09S / 23224 pamphlet, International Publication). It is necessary to add and culture.
  • Addition of oleic acid or a derivative thereof not only increases the cost of raw materials, but also has a growth inhibitory effect by itself, thereby impairing the growth of DTSR protein-deficient strains. Similarly, there is a problem that one KGDH-deficient strain grows poorly as compared with a wild strain.
  • the above-described gene is retained in the cell.
  • a method is known in which a specific gene is retained on a chromosome when a bacterial cell is grown, and the gene is eliminated from the chromosome when a desired product is produced.
  • Escherichia coli after culturing the cells, lysogenic; using the temperature-sensitive repressor of phage to remove the tyrosine biosynthesis gene from the chromosome to produce fenilalanine (Japanese Patent Laid-Open Publication No. (Showa 6 1-2 4 7 3 8 9).
  • This method requires the use of a lysogenic ⁇ phage to integrate the gene into the chromosome D ⁇ ⁇ , in which case the gene present in the region of the chromosomal DNA into which the I phage DNA is integrated is destroyed. there is a possibility.
  • a method for modifying chromosomal genes As a method for modifying chromosomal genes, a method using a plasmid having a temperature-sensitive replication origin has been known (Japanese Patent Publication No. 2008-228 No. 8).
  • the recombinant DNA in which the target gene is inserted into a plasmid having a temperature-sensitive replication origin is introduced into microbial cells, the target gene is incorporated into chromosomal DNA, and then cultured at high temperature to transform the recombinant DNA. It is intended to intentionally integrate the gene into the chromosome or to eliminate the gene on the chromosome by removing it from the cell.
  • the main purpose of this method is to permanently modify genes on the chromosome, and it controls the retention and loss of the gene outside the chromosome during culture, thereby It does not attempt to achieve both growth and efficient production of the target substance.
  • the present invention has been made from the above viewpoint, and controls extrachromosomal retention and shedding of genes that act disadvantageously on the production of a target substance, particularly genes that act favorably on the growth of microorganisms. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for efficiently producing a target substance while achieving both growth of a microorganism and production of a target substance. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, by using a plasmid containing a temperature-sensitive replication origin (hereinafter, also referred to as “temperature-sensitive plasmid”), Intracellular retention and shedding could be controlled, and as a result, the target substance was successfully produced efficiently, leading to the present invention.
  • the present invention is a microorganism that has a plasmid containing a gene that adversely affects the production of a target substance and a temperature-sensitive replication origin.
  • the present invention also provides a step of culturing and growing the microorganism at a temperature at which the plasmid can replicate, and culturing the microorganism at a temperature at which the plasmid cannot replicate to drop the plasmid from cells, and And producing the target substance by a fermentation method.
  • the target substance is not particularly limited as long as it is a substance that can be produced by a fermentation method using a microorganism and a specific gene product adversely affects the production thereof. Examples include amino acids such as glutamic acid, L-lysine, L-phenylalanine, and tyrosine, nucleic acids such as guanylic acid and inosinic acid, vitamins, antibiotics, growth factors, physiologically active substances, and proteins.
  • the present invention can be applied to substances that are not currently produced using microorganisms, as long as they can be biosynthesized by microorganisms.
  • Genes that adversely affect the production of a target substance include genes that have the effect of reducing the production of the target substance, and genes that require a specific substance to produce the target substance when the gene is present. Including. Specific examples of the gene include enzymes belonging to other pathways diverging from the biosynthetic pathway of the target substance, in particular, genes encoding enzymes that catalyze a reaction that determines the rate-limiting step of the pathway. . In other words, it is a gene encoding an intermediate that is in the biosynthetic pathway of the target substance, or an enzyme that reduces the amount of the intermediate that flows into this pathway. Examples of the gene include a gene encoding an enzyme that decomposes a target substance or converts the substance into another substance.
  • these genes are preferably genes that advantageously act on the growth of microorganisms.
  • Genes that act favorably on the growth of microorganisms are genes that, when the gene functions, grow better than when they do not function, and when the gene functions, certain substances that are necessary for the growth of the microorganism when the gene does not function. This includes messengers that are no longer needed.
  • Specific examples of the combination of the gene and the target substance include a dtsR gene or a KGDH gene and an L-glutamic acid, an HD gene and an L-lysine, a tyrA gene, and a phenylalanine and a pheA gene.
  • the DTSR-deficient strain is capable of producing extremely fibrous L-glutamic acid even under the condition that the strain having the dtsR gene hardly produces L-glutamic acid and in the presence of biotin.
  • DTSR-deficient strains require oleic acid for culture.
  • the Hi-KGDH-deficient strain produces L-glutamate without the addition of detergent or penicillin to the medium even in the presence of excess biotin, while the Hi-KGDH-deficient strain is a wild-type strain. Growth is poor compared to.
  • HD-deficient strain heathreonine was not synthesized. Aspartokinase activity, which is inhibited by threonine in the liquid pack, is not inhibited, and the L-lysine synthesis reaction proceeds. On the other hand, HD-deficient strains cannot grow without these amino acids in the medium because they cannot synthesize L-threonine and L-methionine.
  • the microorganism of the present invention is a microorganism that retains a temperature-sensitive plasmid containing the gene as described above and does not retain the functional gene on the chromosome DNA.
  • Temperature-sensitive plasmids are capable of autonomous growth at low temperatures, for example, 20 ° C, but are not autonomous at high temperatures, for example, 34 ° C, because the origin of replication is temperature-sensitive. Since the copy number of the plasmid decreases each time the microorganisms that carry it divide, the number of microorganisms that do not carry the plasmid occupies a large part and practically falls off.
  • a transformant into which a temperature-sensitive plasmid containing a specific gene has been introduced retains the gene in cells when cultured at a low temperature, and loses the gene when cultured at a high temperature.
  • the temperature-sensitive plasmid used in the examples of the present application can be replicated at low temperatures and cannot be replicated at high temperatures as described above, but, on the contrary, cannot be replicated at low temperatures and can be replicated at high temperatures. If an appropriate temperature-sensitive replication origin can be obtained, this may be used.
  • the temperature at which the temperature-sensitive plasmid cannot be replicated is described as a high temperature, but this is not intended to exclude the possibility of a low temperature.
  • the use of the rec A- strain as the microorganism used in the present invention is preferable in that the gene on the plasmid can be prevented from being integrated into the chromosome during cultivation at a low temperature, and the loss of the gene can be ensured. .
  • the functional gene be retained only on the temperature-sensitive plasmid. That is, if a functional gene is present on chromosomal DNA or on a plasmid other than the temperature-sensitive plasmid, the gene is maintained in the cell even if the temperature-sensitive plasmid is dropped, The effect of dropping plasmid is low.
  • a functional gene on temperature-sensitive plasmid only, e.g., by mutating or disrupting the gene present on the chromosome so that it does not produce an active gene product I just need.
  • a gene promoter may be mutated so that the gene is not expressed, or a mutation such as S-substitution, deletion, insertion, addition or transfer of a base may be caused in the coding region.
  • the expression product may lose its activity.
  • a method for disrupting a gene there is a gene disruption method by homologous recombination between a deletion gene and a normal gene on a chromosome. This is preferable because the possibility of reversion is extremely low. When using a microorganism that does not originally have the gene in question, mutation or disruption of the gene is not required.
  • the gene to be retained on the temperature-sensitive plasmid and the gene on the chromosome DNA to be deleted need not be the same, and may be any as long as they have substantially the same function.
  • a unique gene present on a chromosome of a microorganism may be deleted, and the microorganism may retain a temperature-sensitive plasmid containing a foreign gene having the same function as the gene.
  • the microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it can be used for fermentative production of a target substance, can apply a genetic recombination technique, and can obtain a temperature-sensitive replication origin.
  • examples of such microorganisms include coryneform bacteria, Escherichia bacteria, and Serratia bacteria.
  • the present invention can be applied even if genetic recombination is not performed at present, provided that genetic recombination becomes possible in the future.
  • microorganism used in the present invention include coryneform bacteria.
  • the coryneform bacterium referred to in the present invention is a purges manual. Bargey's Manual of
  • Bacteriol bacteria int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)), which was classified as a territory but is now integrated as a bacterium belonging to the genus Corynebacterium. And bacteria closely related to Brevipacterium and Microbarium. Examples of such coryneform bacteria include the following.
  • Brevibacterium 'Dipari Power Tam (Corynebacterium. Glutamicum) Brevibacterium .. Flavum (Corynebacterium Glutamicum) Brevi Pacte) Pem In Mario Filum
  • Corynebacterium Jumiumium (Corynebacterium glutamicum) A T C C 159 0
  • the temperature at which the temperature-sensitive plasmid can replicate the microorganism of the present invention (for example, low
  • the plasmid is retained in the microbial cells, and the gene contained in the plasmid can function.
  • the microorganism is cultured at a temperature at which a temperature-sensitive plasmid cannot be replicated (for example, at a high temperature)
  • the gene is eliminated from the cell together with the plasmid.
  • the microorganism of the present invention by culturing the microorganism of the present invention at a low temperature until a desired cell density is reached, and then culturing at a high temperature to remove the plasmid and continuing the cultivation, efficient growth of the microorganism and efficient production of the target substance can be achieved. Production can be compatible.
  • the culture After dropping the plasmid, the culture may be continued at a high temperature or may be returned to a low temperature again according to the preferred temperature for producing the target substance. Continued culturing at a high temperature can prevent an increase in the number of cells retaining plasmid. If culturing at a high temperature is not preferable for production of the target substance, the culture may be returned to a low temperature. When culturing at low temperature, the number of remaining plasmid-bearing cells may increase, but the production of the target substance can be performed efficiently while the cells that do not retain plasmid are predominant.
  • the temperature shift specifically, a method in which seed culture is performed at a low temperature and culture in the main fermentation medium (main culture) is performed at a high temperature can be mentioned.
  • the temperature shift may be performed during the pre-culture or the main culture. It should be noted that the process of growing cells and the process of removing plasmid are not clearly distinguished, and the process of removing plasmid involves the growth of cells.
  • the timing of the temperature shift varies depending on the gene used, the microorganism, the origin of temperature-sensitive replication, the culture conditions, and the type of target substance.However, by performing a preliminary experiment by changing the culture time until the temperature shift, The cultivation time can be easily determined. Generally, after culturing until the desired cell density is reached in the logarithmic growth phase, the temperature may be shifted to a temperature at which plasmid cannot be replicated.
  • the medium used for the culture is not particularly limited, and a medium suitable for the microorganism used may be used.
  • the medium used for cultivating coryneform bacteria is a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions and, if necessary, other organic nutrients.
  • carbon sources include sugars such as glucose, lactose, galactose, fructose and starch hydrolysates, alcohols such as ethanoyldiinositol, and organic acids such as acetic acid, fumaric acid, citric acid, and succinic acid. Acids can be used.
  • Nitrogen sources include inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate; organic nitrogen such as soybean hydrolyzate; For example, ammonia gas, ammonia water, or the like can be used.
  • inorganic ions small amounts of potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ions, manganese ions and the like are added.
  • organic trace nutrients it is desirable to include required g such as vitamin Bi or an appropriate amount of yeast extract as necessary.
  • the culture is preferably performed under aerobic conditions for 16 to 72 hours, and the culture temperature is controlled at 20 to 45 ° C, and the pH is controlled at 5 to 8.5 during the culture.
  • an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas, or the like can be used.
  • a strain retaining the dtsR gene on a temperature-sensitive plasmid can produce a significant amount of L-glutamic acid even when a medium containing an excess amount of bitin is used. it can.
  • Strains that maintain the KGDH gene on a temperature-sensitive plasmid can produce L-glutamic acid without adding a surfactant or penicillin to the medium, even when using a medium containing an excessive amount of biotin. it can. In some cases, it is possible to further improve the glutamic acid yield by adding a surfactant or benicillin to the medium or by limiting the amount of biotin in the medium.
  • a strain retaining the HD gene on a temperature-sensitive plasmid can efficiently produce L-lysine even when using a medium free of L-threonine and monomethionine.
  • the target substance can be collected from the fermented liquor in the same manner as in the usual method for producing a substance by fermentation production.
  • amino acids can be collected from a culture medium by a combination of an ion exchange resin method, a precipitation method and other known methods.
  • Figure 1 is a conceptual diagram of gene integration and gene replacement.
  • FIG. 2 is a restriction map of a DNA fragment containing the human KGDH gene. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the dtsR gene is a gene isolated by the present inventors as a gene involved in surfactant resistance derived from a coryneform bacterium.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment containing the dtsR gene derived from Corynebacterium bacteria is shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
  • the coding region of the dtsR gene has at least a sequence from the 46th to 469th ATG to the 1985 to 1987th CTG.
  • An ATG (nucleotide numbers 359 to 361) further exists in the same frame upstream of the 46th to 469th ATG, and the possibility that this ATG is the start codon cannot be denied, but the upstream region of this gene cannot be denied.
  • the ATG at positions 46 to 469 is presumed to be the start codon. That is, among the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence consisting of amino acids 37-543 is presumed to be the amino acid sequence of the DTSR protein.
  • the amino acid sequence of the DTSR protein and the nucleotide sequence of the dtsR gene are referred to in the present specification, the ATG at positions 46 to 469 may be described as an initiation codon.
  • the dtsR gene when the dtsR gene is to be introduced into a coryneform bacterium, it may be possible to express the sequence consisting of nucleotides 46 to 1987 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the DTSR protein can be used regardless of which ATG is the initiation codon. It can be easily understood by those skilled in the art that can be expressed correctly.
  • the dtsR gene when expressed in the cells, the N-terminal Met encoded by the initiation codon may be cleaved by aminopeptidase.
  • a transformant obtained by introducing the plasmid pDTR6 containing the dtsR gene into Escherichia coli JM109 was named AJ12967, February 2, 1994. Deposited at the Research Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry on March 2 (zip code 1-3-5, Higashi 1-3-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) under the accession number FERMP—14 16 Transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on February 9, 1995, and given the accession number FERMBP-9494 (W095 / 23224 International Pamphlet) dts R ⁇ DNA fragment containing pDTR6 from the deposited strain It is obtained by digesting the plasmid DNA with restriction enzymes KpnI and XbaI. ''
  • the dts R ⁇ gene is a polymerase chain reaction (PCR) using an oligonucleotide synthesized based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a primer and a coryneform chromosomal DNA as a type II. White, TJ et al; Trends Genet. 5, 185 (1989)), by amplifying a DNA fragment containing the dtsR gene.
  • What kind of primers can be used in the PCR reaction as long as they satisfy the conditions that the base composition is random, the G + C content is around 50%, no special secondary structure is formed, and they are not complementary to each other A good array is fine. Usually, a length of 20 to 30 bases is often used.
  • two oligonucleotides having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequences at both 3 'ends of the DNA duplex including at least the entire coding region of the dtsR gene are used. preferable.
  • Oligonucleotides are synthesized by a conventional method such as the phosphoramidite method (see Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)) using a commercially available DNA synthesizer (eg, a DNA synthesizer model 380B manufactured by Applied Biosystems). can do.
  • the PCR reaction was carried out using a commercially available PCR reaction device (Takara Shuzo Co., Ltd. DNA Thermal Cycler PJ2000, etc.)
  • a DNA fragment containing the dtsR gene can be obtained from a chromosome DNA library of a coryneform bacterium by colony hybridization using a probe with an oligonucleotide synthesized based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the chromosome DNA library can be prepared as follows. First, chromosomal DNA is prepared from coryneform bacteria by the method of Saito and Miura (H. Saito and K. Miura Biochem. Biophys. Acta 72, 619, (1963)). The chromosomal DNA is partially digested with an appropriate restriction enzyme to obtain a mixture of various fragments. A wide variety of restriction enzymes can be used by adjusting the degree of cleavage by adjusting the cleavage reaction time and the like. For example, Sau3AI acts on chromosomal DNA at a temperature of 30 ° C. or higher, preferably 37 ° enzyme; for 1 to 10 nit / ml, for various times (1 minute to 2 hours) to digest it.
  • the digested chromosomal DNA fragment is ligated to a vector DNA capable of autonomous replication in Escherichia coli (E. coli) cells, and the recombinant DNA is ligated.
  • a restriction enzyme that generates the same terminal sequence as the restriction enzyme Sau3A I used for cutting chromosomal DNA for example, BamHI,
  • the DNA is allowed to act on vector DNA for at least 1 hour, preferably 1 to 3 hours, at a temperature of 30 ° C or more and an enzyme concentration of 1 to 100 units per ml of Zml to completely digest the DNA and cleave and cleave it.
  • the chromosomal DNA fragment mixture obtained as described above and the cleaved vector DNA are mixed, and DNA ligase, preferably T4 DNA ligase, is added to the mixture at a temperature of 4 to 16 ° (enzyme temperature). 1 to "! 00 Units are allowed to act for 1 hour or more, preferably 6 to 24 hours, to obtain recombinant DNA.
  • a plasmid vector As a vector capable of autonomous replication in E. coli cells, a plasmid vector is preferable, and a vector capable of autonomous replication in a host cell is preferable.
  • a vector capable of autonomous replication in a host cell For example, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398,
  • DNA fragments capable of autonomously replicating plasmid in coryneform bacteria for example, pAM330 (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-67699)), pHM1519 (see Japanese Patent Application Laid-Open No. JP-A-77895), pCG1 (see JP-A-57-134500), pCG2 (see JP-A-58-35197), pCG
  • PAJ18 Essi Irichia 'Cori AJ11883 (FERM BP-13F)
  • PAJ611 Escherichia Kori AJ11884 (FERM BP-138)
  • an E. coli K-12 strain is transformed to prepare a chromosomal DNA library. This transformation is
  • DM Morrison's method (Methods in Enzymology, 68, 326, 1979) A method of treating recipient cells with calcium chloride to increase DNA permeability. (Mandel'M. And Higa, A., J. Mol., Biol., 53, 159 (1970)) and the like.
  • recombinant DNA containing the dtsR gene was prepared, for example, by the method of p. Guerry et al. (J. Bacterid., 116/1064, (1973)), D. ⁇ Clewell's method
  • the HD gene of a coryneform bacterium has been obtained by the present inventors (W095 / 23S64 International Publication Pamphlet).
  • the nucleotide sequence of the HD gene of Brevipacterium 'lacto-mentamentum AJ12036 strain (FERM BP-734) and the amino acid sequence deduced from this sequence are shown in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing. Further, the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing.
  • This sequence and the sequence of the HD gene of Corynebacterium glutamicum reported by Peoples et al.
  • the HD gene used in the examples of the present application has a sequence known from Corynepacificium glutamicum (Peoples, OP et al; Molecular Microbiology, 2 (1), 63-72 (1983)) was used as the primer and the breeder nucleonucleotide (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6) was used as the primer 1 ′, and Brevipacterium lactofarmentum AJ12036 ( FERM BP-734) obtained by amplifying a DNA fragment containing the HD gene by PCR using chromosomal DNA of type III.
  • the primers used in the PCR method are not limited to those described above, and can be prepared based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3. What kind of sequence can be used as a primer as long as the base composition is random, the G + C content is around 50%, it does not form a special secondary structure, and it is not complementary to each other May be. Usually, a length of 20 to 30 bases is often used.
  • As the primer two oligonucleotides having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequences at both 3 'ends of the DNA double-stranded chain containing at least the entire coding region of the HD gene are preferable.
  • a DNA fragment containing the HD gene can be obtained from a chromosomal DNA library of a coryneform bacterium by hybridization using an oligonucleotide synthesized based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 using a probe.
  • a sequence to be used for the probe is preferable to select a sequence to be used for the probe from a region corresponding to about 100 amino acid residues on the C-terminal side of HD.
  • E. coli HD genes There are two types of E. coli HD genes (HD-1, HD-2) (Zakin, MM et al; JBC, 258, 3028-3031 (1983)). Does not have a region corresponding to about 100 amino acid residues at the C-terminal side of Corynebacterium 'glutamicum HD. Because it does not hybridize to the HD gene.
  • the amplified DNA fragment does not contain the entire length of the gene encoding HD, cut the chromosomal DNA with another restriction enzyme used for the preparation of the above chromosomal DNA library, and then re-create the chromosomal DNA library.
  • the DNA fragment containing the full length of the HD gene can be obtained by preparing again, and selecting again by hybridization and analyzing the restriction enzyme fragment. At this time, hybridization can be performed more easily by using the DNA fragment obtained first as a probe.
  • Oligonucleotide synthesis and preparation of a chromosomal DNA library can be performed in the same manner as in (1).
  • the KGD H gene of coryneform bacterium has been obtained by the present inventors (W095 / 34672, International Publication Pamphlet).
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment containing the Hi KGDH ⁇ gene derived from Brevibacterium-lactofermentum ATCCC13869 is shown in SEQ ID NO: F in the Sequence Listing.
  • An open reading frame was deduced from the nucleotide sequence, and the amino acid sequence of the product deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the methionine residue at the N-terminus of the protein is derived from the initiation codon ATG and is often unrelated to the original function of the protein, and is removed by the action of beptidase after translation. It is well known that the removal of methionine residues may occur in the case of the above-mentioned KGDH protein.
  • Plasmid pPKS-X containing the HKGDH gene is brevivac. 'Lactofamentum ⁇ ' ⁇ 1 060 (Japanese Patent Publication No. 59-107
  • the transformed strain obtained was named Brevibacterium-Lactofamentum AJ 1999, and dated June 3, 1994, Ministry of International Trade and Industry Deposited at the Technical Research Institute (zip code 305, 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) with accession number FE RM P-14349, and internationally deposited based on the Budapest Treaty on June 2, 1995 Has been transferred to the accession number FERBP-5123.
  • the DNA fragment containing the KGDH gene can be obtained by collecting pPKS—X from the deposited strain and cutting the plasmid DNA with the restriction enzymes SaIII and XbaI.
  • the E. coli K-KDH complex is E1 (a-ketoglutarate
  • succinyltrans f erase EC 2.3.1.61
  • c3 lipo amide
  • dehydrogenase 1.6.4.3
  • E1 and E2 genes form an operon structure
  • E3 is pyruvate dehydrogenase.
  • E 1 E 2 gene nucleotide sequence of E. coli has been elucidated '(Eur. J. Biochem., 141, 351 (1984), Eur. J. Biochem., 141, 361 (1984)) 0
  • nucleotide sequence of the E1 and E2 genes has also been determined for Bacillus subtilis (J. Bacteriol., 171, 366 (1989), Gene, 61, 217 (1987). )etc) .
  • the primers used in the PCR method are not limited to those described above, and can be prepared based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 7. Any primer can be used as long as it satisfies the conditions that the base composition is random, the G + C content is around 50%, no special secondary structure is formed, and the primers are not complementary to each other. It may be an array. Usually, a length of 20 to 30 bases is often used.
  • the primer two oligonucleotides having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequences at both 3 'ends of the DNA double-stranded chain containing at least the entire coding region of the HKGDH gene are preferable.
  • a DNA fragment containing a KGDH gene can also be obtained from a chromosome DNA library of a coryneform bacterium by hybridization using an oligonucleotide synthesized based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 as a probe.
  • Oligonucleotide synthesis and chromosomal DNA library preparation can be performed in the same manner as in (1).
  • the temperature-sensitive replication origin is capable of autonomous growth in microbial cells, mutagenizes a drug-resistant plasmid, transforms the microorganism with the plasmid, grows in a medium containing the drug at low temperatures, and cannot grow at high temperatures Obtained by recovering plasmid from the transformation.
  • Mutation treatment of plasmid can be performed, for example, by treating plasmid with hydroxyamine in vitro (G. ⁇ . Humpheryseta I: oIec. Gen. Gnet. 144, 101-108) 1 9 7 6))).
  • low temperature as used herein is a concept relative to “high temperature”, and the boundary between low temperature and high temperature is not particularly limited, but at least “low temperature” refers to when a microorganism is cultured.
  • the temperature is a temperature range in which microorganisms can grow
  • the “high temperature” is a temperature range in which microorganisms do not die.
  • the boundary between these low and high temperatures indicates that transformants carrying temperature-sensitive plasmids It can be determined by culturing at a different temperature in a medium containing the drug and examining the lower limit of the temperature at which the cells cannot grow.
  • Plasmids having a temperature-sensitive replication origin that functions in coryneform bacterial cells include pHS4, pHS22, and pHS23. These are capable of autonomous growth in both Escherichia coli and coryneform bacteria, and are treated with a kanamycin-resistant plasmid vector, pHK4, in vitro with hydroxylamine to give a brevipacterium. Transforms mu-lactofermentum and can grow on M-CM2G plates containing kanamycin 25 ig Zml at low temperatures (20 ° C) but not at high temperatures (34 ° C) It is a plasmid recovered from the stock
  • Escherichia Hori 'coli AJ 1 2 5 7 0 holding p HS 4 was established on October 11, 1990 in the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (Postal code: 30 5 Ibaraki, Japan Deposit No. FERMP—1 1 7 6 2 at Higashi 1-3-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Prefecture), transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on August 26, 1991, and transferred to FERMBP-3. Deposited as 5 2 3.
  • each DNA fragment containing the origin of replication derived from coryneform bacterium excised from pHS4, pHS22, and pHS23 was transferred to pHSG398, which is a vector for Escherichia coli.
  • the plasmids pHSC4, pHSC22 and pHSC23 obtained by the connection can also be used in the present invention as temperature-sensitive plasmids.
  • pHSC4, pHSC22 and pHSC23 grow autonomously in coryneform bacterium and Escherichia coli, and confer resistance to ostium ramphenicol to the host (Japanese Patent Application Publication No. 7-108). See No. 228).
  • Escherichia coli HJ4 which holds HSC4, was submitted to the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry on January 11, 1990, under the accession number FE RM P— Deposited as 11763, transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on August 26, 1991, and deposited under the accession number FERMBP-32524.
  • Escherichia coli E. coli AJ1 26 15 holding pHSC22 and Escherichia coli E. coli AJ1 2616 carrying pHSC23 were obtained on April 24, 1991.
  • FE RM P- 1 2 2 1 3 and FERMP- 1 2 2 14 respectively, respectively, under the accession numbers of the Ministry of Economy, Trade and Industry of Japan. (Chome 1-3), August 19, 1980
  • temperature-sensitive plasmids can grow autonomously in coryneform bacterial cells at about 0 to 32 ° C, but not at about 34 ° C or higher.
  • a DNA fragment having a temperature-sensitive replication origin can be obtained, for example, by excising the above pHSC4 with BamHI and Kp ⁇ I.
  • the temperature-sensitive plasmid used in the present invention is a plasmid containing a temperature-sensitive replication origin and a gene that adversely affects the production of a target substance.
  • a plasmid can be obtained by ligating a DNA fragment containing a temperature-sensitive replication origin and a DNA fragment containing the gene using a ligase such as T4DNA ligase.
  • the temperature-sensitive plasmid is convenient for the preparation of the plasmid if it contains, in addition to these DNA fragments, a replication origin and a marker such as a drug resistance gene that functions in E. coli.
  • the microorganism of the present invention is a microorganism in which a gene that adversely affects the production of the target substance as described above is preferably present only on the plasmid.
  • a microorganism can be obtained by transforming a host microorganism that does not have the gene capable of functioning on chromosome DNA with a temperature-sensitive plasmid containing the gene.
  • a host microorganism that does not have the gene capable of functioning on chromosome DNA can be obtained by mutating each gene present on the chromosome so that it does not function normally.
  • the mutation may be a mutation that interferes with the transcription or translation of the gene, or may be a mutation that produces a non-functional protein.
  • the gene may be partially or entirely deleted, that is, the gene may be disrupted.
  • a strain that does not have a functional gene is also referred to as a “defective strain”.
  • Gene-deficient strains can also be obtained by subjecting a microorganism that produces a wild-type gene to ultraviolet irradiation or treatment with a chemical agent, and selecting a strain that does not produce a substantially functional gene product. Gene-deficient strains can also be obtained by breeding methods using gene recombination. In particular, when the S gene has been obtained, the gene can be easily destroyed by a homologous recombination method using a genetic recombination method. Gene disruption by homologous recombination has already been established, and a method using linear DNA or a method using temperature-sensitive plasmid can be used. Specifically, site-directed mutagenesis (Kramer, W.
  • the site-directed mutagenesis method is a method using a synthetic oligonucleotide, and is a technique that can introduce an arbitrary substitution, deletion, insertion, addition or inversion into only an arbitrary limited base pair.
  • a single strand is prepared by denaturing a plasmid having a target gene whose cloned DNA sequence has been determined.
  • a synthetic oligonucleotide complementary to the portion to be mutated is synthesized.At this time, the synthetic oligonucleotide does not have a completely complementary sequence, and any base substitution, deletion, insertion, or attachment is required. Have an addition or inversion.
  • the DNA fragment containing the target gene can be directly treated with sodium hyposulfite, hydroxylamine, etc. to randomly substitute, delete, insert, or add bases to the DNA fragment.
  • it is a method of introducing a mutation having an inversion.
  • a method using homologous recombination can be used to convert the thus-acquired or altered or disrupted gene into a normal gene on the chromosome of a microorganism such as a coryneform bacterium. in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S-, J. Bacteriol-, 162, 1196 (1985)).
  • Homologous recombination is a plasmid that has a sequence homologous to a sequence on the chromosome. When introduced into a cell, recombination occurs at a site of homology at a certain frequency, and the entire introduced plasmid is integrated into the chromosome.
  • the plasmid will fall off the chromosome again.
  • the gene in which the mutation has been introduced at the position S where recombination occurs will be the chromosome. It is fixed on top and the original normal gene may fall off the chromosome along with the plasmid.
  • the recombinant DNA is inserted by inserting a temperature-sensitive replication origin derived from brevipaccurium 'lactofarmentum, a mutant ⁇ -KGD ⁇ gene, and a marker gene that is resistant to drugs such as chloramphenicol into a plasmid vector. Prepared, transform the coryneform bacterium with this recombinant DNA, culture the transformant at a temperature at which the temperature-sensitive replication origin does not work, and then cultivate it in a drug-containing medium to obtain the recombinant DNA. A transformant integrated into the chromosomal DNA is obtained.
  • the strain in which the recombinant DNA has been integrated into the chromosome undergoes recombination with the original KGDH gene sequence existing on the chromosome, resulting in the fusion of the chromosome 1 KGDH gene with the mutant type 1 KGDH gene.
  • Two genes have been inserted into the chromosome with the other part of the recombinant DNA (vector part, temperature-sensitive replication origin and drug resistance marker) interposed therebetween. Therefore, in this state, the wild-type-KGDH is dominant and shows the same growth as the wild-type strain.
  • one copy of the ⁇ -KGD K gene was recombined by recombination of the two KGDH genes into the vector portion (temperature-sensitive replication origin and drug (Including the resistance marker).
  • the vector portion temperature-sensitive replication origin and drug (Including the resistance marker).
  • a chromosome-integrated strain is cultured, and the cultured cells are plated on a drug-free plate medium and cultured. The grown colonies are replicated on a plate medium containing the drug and cultured to obtain a drug-sensitive strain.
  • the absence of the vector portion from the chromosome of the obtained drug-sensitive strain is confirmed by Southern hybridization, and further, it is confirmed that normal ⁇ -KGD G is not expressed.
  • a dtsR gene-deficient strain and an HD gene-deficient strain can be obtained.
  • the site to be deleted in the HD gene is the N-terminal region.
  • a region within 350 amino acids from the N-terminus for example, a region of 100 to 200th amino acids, or a region of 250 to 350th amino acids.
  • the HD gene is in the same operon as the homoserine kinase present downstream, it is preferable not to delete the promoter site of the HD gene so as not to inhibit the expression of homoserine kinase.
  • Recombinant DNA can be introduced into coryneform bacterial cells by treating the recipient cells with calcium chloride to increase DA permeability as described for E. coli K-12 (Mandel / M . and Higa, A., J. Mol., Biol., 53, 159 (1970), or a growth stage (so-called combinatable cells) such that cells can take up D DII as described for Bacillus' subtilis. (Duncan, CH, Wilson, GA and Young, FE., Gene, 1, 153 (1977)). Alternatively, learn about Bacillus' subtilis, actinomycetes and yeast. (Chang, S. and
  • the method of incorporating DNA into a corynepacterium or brevipacrium protoplast described in 5F-183799 in the presence of polyethylene glycol or polyvinyl alcohol and a divalent metal ion can also be used. it can. Equivalent results can be obtained by a method that promotes the uptake of DNA by adding carboxymethylcellulose, dextran, ficoll, or Blu-Nick F68 (Selva) instead of polyethylene glycol or polyvinyl alcohol. Furthermore, the recombinant DNA can also be introduced into a recipient bacterium belonging to the genus Brevipacterium or Corynebacterium by the electric pulse method (Sugimoto et al., JP-A-2-207791).
  • gene-disrupted strains that can be used in the present invention include, for example, an HD-disrupted strain derived from Brevipacterium 'lactofermentum AJ12036 strain ( ⁇ BP-734), such as Brevipacterium lactofamentumum.
  • the host microorganism into which the temperature-sensitive plasmid is introduced is preferably a recA-mutant. If a strain that retains temperature-sensitive plasmid is cultured at low temperature, homologous recombination between the normal gene contained in the plasmid and the mutant gene on chromosomal DNA may occur, and the normal gene may be integrated into the chromosome. However, when the integration occurs, the normal gene in question remains on the chromosome together with the plasmid DNA even if the plasmid is dropped from the host cells by culturing at a high temperature. In order to prevent such homologous recombination, it is preferable to use a recA- mutant.
  • the recA gene of the coryneform bacterium has already been isolated, its nucleotide sequence is known (Japanese Patent Laid-Open No. 7-322879), and it is registered in the database (EMB L Accession Nampa: X 77384). Primers are prepared based on this sequence, and the recA gene can be isolated by PCR. Furthermore, if a recA gene-disrupted strain is obtained in the same manner as described above using the obtained recA gene, a recA- strain can be obtained.
  • the fact that the obtained strain is a rec A- strain is supported by examining the sensitivity to DNA-damaging drugs such as mitomycin C and methyl methanesulfonate, the sensitivity to UV irradiation, and the ability of homologous recombination. You.
  • the rec A- strain has an increased sensitivity to the above-mentioned drugs and UV irradiation and a lower homologous recombination ability than the rec A + strain.
  • plasmid DNA may be integrated during culturing even if cells in which the gene in question is integrated into chromosomal DNA appear. If a large number of cells do not occur, it does not matter. In such a case, it is advisable to perform single-coin knee isolation of cells in which the gene in question is not integrated into chromosomal DNA, and use this for the production of the target substance. -If there is no site on the chromosomal DNA of the host microorganism that is homologous to a gene that adversely affects the production of the target substance, the above integration problem does not occur even if the rec A + strain is used.
  • microorganism used for obtaining the gene-deficient strain a microorganism having the ability to produce the target substance is used.
  • various L-amino acid-producing bacteria of coryneform bacteria are shown as specific examples of microorganisms that produce the target substance.
  • L-lysine producing bacteria of coryneform bacteria include the following. S- (2-aminoethyl) monocysteine (hereinafter abbreviated as “AEC”) resistant mutant, mutant that requires an amino acid such as L-homoserine for its growth (JP-B-48-280) No. 78, Japanese Patent Publication No. 56-649-9), resistant to AEC, L-leucine, L-homoserine, L-proline, L-serine, L-arginine, L-alanine, L-vari Mutants that require amino acids such as amino acids (U.S. Pat. Nos.
  • AEC S- (2-aminoethyl) monocysteine
  • L-lysine-producing E. coli examples include mutants having resistance to L-lysine analogs. This L-lysine analog is such that it inhibits the growth of Escherichia bacteria, but its inhibition is completely or partially released when L-lysine coexists in the medium. It is a thing. Examples include oxalidine, lysine hydroxamate, AEC, r-methyllysine, monochlorocaprolactam, and the like. These mutant strains having resistance to rosin anaphylaxis can be obtained by subjecting a microorganism of the genus Escherichia I to a conventional artificial mutation procedure.
  • strain used for the production of L-lysine examples include Escherichia coli AJ1142 (FERMBP-1543, NRRLB-121885; Japanese Patent Application Laid-Open No. 56-18559). No. 6 and U.S. Pat. No. 4,346,170). AJ 1 1 4 4 2 shares were acquired on May 1, 1981, by the Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Institute of Biotechnology and Industrial Technology (Zip code: 03-5, 1-3-1, Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan) No. FERM P-5084, and on October 29, 1987, this original deposit was transferred to an international deposit under the Budapest Treaty, and FEBM BP- Deposited as 1543. Aspartic kinase of the above microorganisms, the feed-pack inhibition by L-lysine has been released.
  • L-threonine-producing bacteria examples include L-threonine-producing bacteria. This is because L-sleonin-producing bacteria also generally have their L-lysine inhibition of aspartokinase released. As an E. coli L-threonine-producing bacterium, the VKPM B-3996 strain has the highest productivity among the currently known strains. have. VKFM B-3996 shares became USSR All on January 19, 1987. ⁇ All-Union Scientific Center of Antibiotics
  • the L-lysine biosynthesis gene in amplification of the L-lysine biosynthesis gene may be enhanced.
  • examples of such a gene include a gene encoding phosphoenolpyruvate carboxylase having a mutation that cancels the inhibition of feed-pack by aspartic acid (Japanese Patent Publication No. 7-83714). See).
  • Examples of the coryneform bacterium having the ability to produce L-glutamic acid include a glutamate-producing wild strain of a coryneform bacterium and a mutant strain derived therefrom. Such mutants include, for example,
  • Escherichia coli glutamic acid-producing bacteria include Escherichia coli AJ1 2628 (FE RM BP—3854) and Escherichia coli E. coli AJ 1 624 (FE RM BP—3853, French Patent Application Publication No. 2). , 680, 178)
  • the glutamate biosynthesis gene of the above-mentioned glutamate-producing bacterium may be enhanced.
  • enhanced glutamate biosynthesis genes include digestive phosphofructokinase (PFK, JP-A-63-102692), anaplerotitic. Phosphoenol pyruvate carboxylase (PEPC, Japanese Patent Publication No.
  • L-pheniralanine-producing bacteria of coryneform bacteria examples include Brevibacterium 'lactofamentum AJ12637 (FERM BP-4160) (see French Patent Application Publication No. 2,686,898).
  • dilaranine-producing bacteria examples include Escherichia coli 'AJ 12604 (FERM BP-3579) (see European Patent Application Publication No. 488,424).
  • the AJ12604 strain is a transformant obtained by introducing a plasmid containing a mutant aroG gene and a plasmid containing a mutant pheA gene into E. coli tyA- host (Japanese Patent Laid-Open No. 5 — 344881 No. 1).
  • PDTR6 is autonomous in both Escherichia coli and Corynebacterium bacteria.
  • Replicable plasmid This is a recombinant plasmid using PSAC4 as a vector, and has the highest resistance to chloramphenicol.
  • pHSGX-K is capable of autonomous replication in the cells of Escherichia coli.
  • a temperature-sensitive replication origin (hereinafter, referred to as “TSori”) derived from a coryneform bacterium was introduced into the K pn I site of the pHSGX-K obtained as described above.
  • the DNA fragment containing TSori Sori was digested with BamHI and Kpnl from the plasmid pHSC4 containing TSori, and both ends of the obtained DNII fragment were blunted using a Blunting kit manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • the plasmid pKCT4 obtained by binding ⁇ I linker (Takara Shuzo Co., Ltd.) and then self-linking was obtained by digestion with KPnI.
  • This DNA fragment was inserted into the KpnI site of pHSGX—K to obtain pKCTXX—K. Cleavage of pHSC4 with BamHI and Kp ⁇ I, blunting both ends of the obtained DNA fragment, and adding a Kpnl site to the KpnI site of pHSGX-K directly. Plasmida having the same structure as pKCTX-K can also be obtained by insertion into pKCTX-K.
  • the dtsR gene-disrupted strain was obtained by homologous recombination using temperature-sensitive plasmid.
  • a deletion type dtsR gene used for gene disruption was prepared.
  • Eco52I digestion sites exist at the 766th position and the 136th position of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • pHSGX—K was completely digested with Eco52I and self-ligated to prepare a plasmid pHSGX—— ⁇ containing the dtsR gene in which 600 base pairs of the Eco52I fragment had been deleted.
  • the dtsR ⁇ ⁇ gene on pHSGX-KmE has a structure in which the central portion has been deleted in frame.
  • pHSGX- ⁇ E JP-B-7-108228
  • pHM1519 is digested with restriction enzymes BamHI and ⁇ I to obtain a gene fragment containing an origin of replication, and the obtained fragment is purified using a Blunting kit manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. After blunt-ending, it was inserted into the H ⁇ I site of pHSGX- ⁇ E using KpnI linker (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) to obtain pKCX- ⁇ .
  • P SAC4 into which the replication origin of pHM1519 was inserted was also prepared using Shuzo Co., Ltd.).
  • pKCX—KumE and pSAC4 were isolated using the above-mentioned electric pulse method, and the varieties of the bacterium strain brevipacterium ′ lactofermentum AJ111, which had increased sensitivity to detergents, were used. The strain was introduced into 060 strains, and the degree of resistance to surfactants was examined.
  • a DNA fragment containing TSori obtained by cutting pKCT4 with Kp ⁇ I was inserted into the KpnI cleavage site of pHSGX- ⁇ E to prepare a plasmid pKTCX- ⁇ .
  • This pKTCX- ⁇ was introduced into the wild strain Brevibaculium 'lactofermentum ATCC 13869 using the electric pulse method, and the dts on the chromosome was obtained by the method described in JP-B-7-108228.
  • the R gene was replaced with a deletion type.
  • ATCC 13869 / p KTCX— ⁇ was shake-cultured at 25 ° C for 6 hours in M-CM2G liquid medium containing 50 / g / ml oleic acid, and then 5 ⁇ g The strain was spread on an M-CM2G medium containing no mI Kuguchi lamb fenicole and 50 ug / mI oleic acid, and a strain that formed colonies at 34 ° C was obtained as a plasmid-incorporated strain. Next, a strain which became susceptible to chloramphenicol at 34 ° C was obtained from this strain by the repli-force method.
  • the chromosome of this susceptible strain was obtained by a conventional method, and the structure of the dtsR gene on the chromosome was examined by the Southern hybridization method. After confirmation, it was named ⁇ strain.
  • ⁇ strain For the acquisition of the dts R gene and the production of the dt SR gene disruptor, see W095 / 23224 It is detailed in the open brochure.
  • the strain E showed a strong L-glutamic acid-producing ability, a strong requirement for oleic acid, and could not grow on a medium containing no oleic acid.
  • the ⁇ E strain was transfected with the temperature-sensitive plasmid pKCTXX-K containing the full-length dtsR gene by an electric pulse method to obtain a ⁇ - ⁇ strain. At that time, the culture was performed so that p K C ⁇ X— ⁇ was retained in the cells.
  • the seed culture and the main culture were performed by dispensing 30 OmI portions into a 500 ml glass jar fermenter and heat-sterilized.
  • the components of the medium are shown in Table 1.
  • the pH of the medium was maintained at 7.3 using ammonia gas.
  • the air flow rate is 2 / "! ⁇ 1Z1VVM and 800 ⁇ 1.
  • Seed culture was performed at the culture temperature shown in Table 2 for 3 to 14 hours, and main culture was performed at the culture temperature shown in Table 3 for 35 hours.
  • main culture 50 to 100 ml of a 50 g / L aqueous glucose solution was fed.
  • Tween 80 polyoxyethylene sorbitan monozolumitate
  • Tables 2 and 3 show (OD620), the accumulated amount of L-glutamic acid (glu) (glu (g / dl)) and the culture time.
  • the HD gene was isolated from Brevibacterium 'lactofermentum AJ12036 strain (FERM BP-734) as follows.
  • the nucleotide sequence of the HD gene has been reported in Corynebacterium glutamicum (Peoples, 0. P. et al; Molecular Microbiology 2 (1) 63-72 (1988)), Brevipaccurium ⁇ Since it was expected that the HD gene sequences of Armentum and Corynepacteria glutamicum had high similarity, synthetic primer DNAs for PCR were prepared based on the sequences of Corynepacterium glutamicum. .
  • Chromosome DNA was prepared from Brevipacium. Lactofermentum AJ12036 strain. Approximately 1500 bp D containing HD gene from this chromosomal DNA To extend the NA fragment by PCR, use the DNA synthesizer model 381A manufactured by ABI, and
  • the PCR reaction was carried out using a PCR amplifying device (DNA thermocycler PJ2000: Takara Shuzo Co., Ltd.) and a PCR kit (Takara GeneAmpTM kit: Takara Shuzo Co., Ltd.) with the composition shown in Table 4.
  • Table 4 Table 4
  • a DNA fragment obtained by digesting the amplified fragment thus obtained with KpnI was used as a vector plasmid * pHSG399 (see Takeshita, S. et al .; Gene (1987), 61, 63-74; Takara Shuzo) Inserted into the Kpnl site of The recombinant plasmid was named pHDW, and this plasmid was introduced into E. coli JM109 strain to obtain a transformant. ⁇ -Brevibacterium '' Lactofamentum thus obtained
  • the nucleotide sequence of the HD gene fragment of the AJ12036 strain was determined by the dideoxy method.
  • the determined nucleotide sequence and deduced amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 in the Sequence Listing.
  • the plasmid pHDW containing the HD gene was digested with Kp ⁇ I to excise the HD gene fragment, which was digested with KpnI and used with T4 DNA ligase for pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.). And ligated to obtain plasmid pHHDW.
  • TSori was introduced into the BamHI site of the PHDW obtained as described above.
  • the DNA fragment containing TSori was obtained by cutting pHSC4 with BamHI and KpnI. After blunt-ending both ends of this DNA fragment, a DNA fragment with a BamHI site added thereto was inserted into the BamHI site of pHDW to obtain pTSHD.
  • An HD gene-disrupted strain was obtained by homologous recombination using a temperature-sensitive plasmid.
  • a deletion type HD gene used for gene disruption was prepared. Plasmid pHDW containing the wild-type HD gene is cut with Aatll and then self-ligated to delete between the two Aatll sites present in the HD gene (SEQ ID NO: 3, base numbers 716 to 721, 1082-1087). Thus, a plasmid containing the HD gene (HD-II gene) lacking the lary region was prepared. This plasmid was cut with ⁇ ⁇ I to obtain an HD- ⁇ gene fragment, which was inserted into the KpnI site of pHSG398, and a DNA fragment containing TSori was inserted into the BamHI site. A plasmid pTSHDA for HD- ⁇ gene replacement was constructed.
  • the DNA fragment having TSori was obtained by blunting both ends of a DNA fragment obtained by cleaving pHSC4 with a restriction enzyme KpnI using a DMA Blunting kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.). It was prepared from a modified plasmid which was cut out by cutting only with BamHI by connecting it with AmHI linker (Takara Shuzo).
  • AJ11446 strain was performed using the pTSHDA, a plasmid for S-replacement of the deletion type HD gene obtained above, by the air pulse method (Sugimoto et al., Japanese Patent Laid-Open No. No. Gazette).
  • the AJ11446 strain is an L-lysine-producing bacterium described in Japanese Examined Patent Publication No. 62-24073. Since August 23, 979, the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (postal code 305: Higashi Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Japan) Deposit No. 3 at 1-chome under the accession number of FE RM P-5 163.
  • the obtained transformant was cultured in M-CM2G medium at 25 ° C. until it reached full gloss (about 1 to 2 ⁇ 109 / ml). Dilute the cultured cells to 105 cells per plate, spread on M-CM2G plate medium containing chloramphenicol (5 ig / mL), culture at 34 ° C for 2-7 days, and colony I got one. The resulting colonies were confirmed to be free of plasmid in the cells, and further analyzed by Southern hybridization analysis using linear pHSG398 as a probe. Confirmed integration into
  • the wild type HD gene and vector were dropped from the chromosomal DNA to obtain a mutant type HD gene replacement strain and a deletion type HD gene replacement strain. . Deletion of the wild-type HD gene and the vector was performed as follows.
  • Each integrated strain was cultured in M-CM2G medium containing chloramph I-nicole (10 g / mL) at 34 ° C until it reached full growth (1-2 X 109 / ⁇ ).
  • the cultured cells were seeded on an M-CM2G plate medium containing no clos ramphenicol so as to have 50 to 200 colonies per plate, and cultured at 34 ° C.
  • the grown colonies were replicated on an M-CM2G plate medium containing chloramphenicol (5 g / mL), and cultured at 34 ° C to obtain a clonal ramfenicol-sensitive strain.
  • the absence of the vector from the chromosome of the ramphenicol-sensitive strain was confirmed by Southern hybridization, and it was further confirmed that the mutant HD was expressed. In addition, it was confirmed that the obtained strain exhibited methionine auxotrophy and threonine auxotrophy.
  • the gene-disrupted strain thus obtained was named HDA strain.
  • the nucleotide sequence of the chromosome DNA of the HDA strain was confirmed to be the deletion type of the gene.
  • the temperature-sensitive plasmid pTSHD containing the full-length HD gene was introduced into the HDA strain by the electric pulse method to obtain an HD ⁇ pTSHD strain.
  • the culture is performed at 25 ° C so that pTSHD is retained in the cells.
  • ⁇ 4> Production of L-lysine Next, the growth and L-lysine productivity of the HD ⁇ strain and the HD ⁇ / p TSHD strain were compared. Seed culture and main culture were performed by dispensing 300 ml each into a 500-ml glass jar fermenter, and using a heat-sterilized medium. Table 5 shows the components of the medium. The pH of the medium was maintained at 7.3 using ammonia gas.
  • the aeration was performed at 21 to 1 Z1 V VM, and the mixture was agitated at 800 to 300 rpm. Seed culture was performed at the culture temperature shown in Table 5 for 15 to 25 hours, and main culture was performed at the culture temperature shown in Table 6. In addition, when L-methylmethine and glucose threonine were added to the culture of the HD strain, 70 mg / d I was added, respectively. Nourished.
  • Table 6 and Table 7 show (OD620), the accumulated amount (g / dl) of L-lysine (lys) and the culture time.
  • Table 5 shows (OD620), the accumulated amount (g / dl) of L-lysine (lys) and the culture time.
  • oligonucleotide 0.25 moIe of the oligonucleotide as a primer, Bacillus subtilis NA64 prepared by a conventional method as type I (the strain was obtained from Bacillus Genetic, Stock, Center (Ohio State University, USA)) 0.1 g of chromosomal DNA and tack DNA polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) 2.5 units of d ATP, d CTP, d GTP, and cinch 200 1 ⁇ 1, potassium chloride 50 mM, magnesium chloride 1 5 Add 0.1 ml of 0.1 mM Tris-monohydrochloride buffer (pH 8,3) containing 1 ⁇ 1 and 0.0001% gelatin, and add 94 ° C for 1 minute and 55 ° C for 2 minutes.
  • Tris-monohydrochloride buffer pH 8,3 containing 1 ⁇ 1 and 0.0001% gelatin
  • the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and the desired DNA fragment was recovered using glass powder (Takara Shuzo).
  • This DNA fragment was recognized according to a conventional method of labeling using Klenow fragment (Amersham) and [HI-32P] dCTP (Amersham) and used as a probe.
  • T-Y medium (pH 7.2) consisting of 1% of Pakto Tripton (manufactured by Difco), 0.5% of Pakto Extract Extract (manufactured by Difco) and 0.5% of sodium chloride )
  • 500 ml of Brevipacterium lactofermentum ATCC 13869 was inoculated and cultured at 31.5 ° C for 6 hours to obtain a culture. This culture was centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes to obtain 2 g of wet cells as a sediment.
  • Chromosomal DNA was extracted from the cells by the method of Saito and Miura (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, (1963)). This chromosomal DNA 2 s and 200 units of EcoRI restriction enzyme were mixed with 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5) containing 1 OmM magnesium chloride, O0 OmM sodium chloride and 1 mM dithiothreitol at a temperature of 37 ° C. The reaction was carried out with C for 15 hours.
  • reaction-terminated liquid was subjected to rifenol extraction by a conventional method, followed by ethanol precipitation, to obtain a chromosome DNA fragment of Brevipacterium-lactofamentum ATCC13869 digested with Ec0RI.
  • Plasmid vector p UCI 8 (manufactured by Takara Shuzo) 1 ⁇ g and restriction enzyme ⁇ 20 units of coRI 50 mM Tris monochloride buffer containing 1 OmM magnesium chloride, 0 OmM sodium chloride and 1 mM dithiothreitol mixed (p H 7. 5), reacted for 2 hours at a temperature 37 e C to give a digested solution, and Rifuwenoru extraction and ethanol ⁇ by the liquid in the usual manner. Thereafter, to prevent recombining of the DNA fragment derived from the plasmid vector, use Molecular Cloning 2nd edition (J. Sambrook, EF, Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pi. 60). (1989)), the DNA fragment was dephosphorylated by treatment with bacterial al phosphatase, and extracted with ethanol by a conventional method, followed by ethanol precipitation.
  • Escherichia coli JMl09 manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • Escherichia coli JMl09 was transformed with the DNA mixture by a conventional method, and this was spread on an L agar medium containing 100 / g / mI of ampicillin, and the resulting mixture was spread for about 10 minutes. , 000 transformants were obtained.
  • Transformants hybridizing with the probe DNA obtained in (i) were selected by the method of Sambrook, EF Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pi. 90 (1989)).
  • the plasmid is cleaved with the restriction enzymes EcoRI and XhoI with the reaction composition of (iii), subjected to agarose gel electrophoresis according to a conventional method, subjected to Southern hybridization in the same manner as in (iii), and used as a probe DNA. Hybridizing fragments were identified. As a result, it was found that a cut fragment of about 3 kilobases cut with EcoRI and XhoI hybridized. The DNA fragment was ligated to a plasmid vector pHSG397 (Takara Shuzo) digested with EcoRI and Xh0I as in (iii) and cloned.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment was determined.
  • the nucleotide sequence was determined using the Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (manufactured by Apfidio Chemical) according to the method of Sanger (J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)).
  • the obtained or NA fragment is completely open.
  • the chromosomal DN of Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 was changed to Xh0I as described in (iii) because it did not contain a reading frame. Transform with the recombinant plasmid cut and ligated to PHS G397.
  • a transformant that hybridized was selected using the 0 I digested fragment labeled according to the method (i) as a probe.
  • the plasmid contained in the obtained transformant contained a DNA fragment of about 9 kilobases.
  • FIG. 2 shows a restriction map of the gene containing the DNA fragment.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment of about 0.4 kilobase from the SaII cleavage point to the EcoRI cleavage point in the 1I and XhoI cleavage fragments was determined in the same manner as described above. I went.
  • the nucleotide sequence of the thus obtained Sa1I- and XhoI-cleaved gene fragments is as shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
  • the open reading frame was estimated, and the amino acid sequence of the product deduced from the nucleotide sequence was shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing. That is, the gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing is the Hi-KGDH gene of Brevipacterium 'lactofamentum ATCCC3869.
  • the methionine residue at the N-terminus of the protein is often independent of the original function of the protein because it is derived from the initiation codon ATG, and it is well known that it is removed after translation by the action of beptidase. Therefore, it is possible that methionine residues have been removed even in the case of the above proteins.
  • pHSGSX obtained as described above was digested with the restriction enzymes BamHI and SaIII to obtain a DNA fragment containing the HiKGDH gene.
  • This DNA fragment was ligated with a plasmid pHSG299 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) cleaved with BamHI and Sal1 using T4DNA ligase to prepare pHSG-X '.
  • TSori derived from a coryneform bacterium was introduced into the BamHI site of pHGSGS—X ′.
  • the DNA fragment containing TSori was obtained by digesting pHSC4 with BamHI and KPnI, blunt-ending both ends of the obtained DNA fragment, and binding the BamHI linker to plasmid.
  • De TBC T4 was obtained by cutting with BamHI. This DNA fragment was inserted into the BamHI site of pHSGS-X 'to obtain plasmid pBKTS-X.
  • the Hiichi KGDH gene-disrupted strain was obtained by the homologous recombination method using temperature-sensitive plasmid. Specifically, one KGDH gene has two sites at 1340th and 3266th in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, which are digested with KpnI. Thus, the above-obtained pHGSGS-X was partially digested with Kp ⁇ and then self-ligated to prepare a plasmid pHSGS- ⁇ lacking 1926 base pairs of Kp ⁇ new fragments.
  • the hGDH gene on pH563-Am1 has a structure with the central part deleted.
  • Tsori was introduced into the BamHI recognition site of pHGSGS- ⁇ K to produce a plasmid pBTTS-X ⁇ K.
  • pHSC4 was digested with the restriction enzyme KpnI, blunt-ended using a DNA blunt-end kit (Takara Shuzo, Blunting kit), and then BamHI linker (Takara Shuzo). ) After binding, the plasmid obtained by self-ligation is converted to the restriction enzyme BamH! Digested with
  • a gene fragment containing TSori was obtained, and this was inserted into the BamHI site of pHSGS— ⁇ to obtain a plasmid pBTSS—X ⁇ K.
  • This plasmid was introduced into Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, a wild strain of coryneform L-glutamic acid producing bacterium, using the electric pulse method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-207791).
  • the KGDH gene was S-converted to the deletion type.
  • plasmid-introduced ATCC 13869 / pBT S ⁇ was converted to CM2 G (polypeptone 1%, yeast extract 1%, sodium chloride 0.5%, glucose 0.5%, ⁇ ⁇ 7.2) After shaking culture in a liquid medium at 25 ° C for 6 hours, add 5 g ZmI chloramphenicol. The colonies formed by dissemination on CM2G agar medium and culturing at 34 ° C were obtained as plasmid-incorporated strains. Next, a strain that became susceptible to chloramphenicol at 34 ° C was obtained from this strain by the replica method.
  • CM2 G polypeptone 1%, yeast extract 1%, sodium chloride 0.5%, glucose 0.5%, ⁇ ⁇ 7.2
  • the temperature-sensitive plasmid pBKTS-X containing the full-length Hi-KGDH gene was re-introduced into the AS strain by an electric pulse method, to obtain an ASZpBKTS-X strain. At that time, the culture was performed so that pBKTS-X was retained in the cells.
  • Table 9 shows (OD620), the amount of accumulated L-glutamic acid (glia) (filtration (g / dl)), and the amount of residual sugar (cr / dl).
  • the microorganism of the present invention can control extrachromosomal retention and shedding of a gene that adversely affects the production of the desired product, which is particularly advantageous for the growth of the microorganism.
  • the target substance AA can be efficiently produced.
  • Applicant's name or name Ajinomoto Co., Inc., Yoko Kuwabara, Eiichiro Kimura, Yoshio Kawahara, Wataru Nakamatsu
  • Sequence type nucleic acid
  • GCC CAT TTC CCC ATG GGT GAA AAG GCA.
  • GTA GAG AAG GTC CAC
  • GCT 502 Ala His Phe Pro Met Gly Glu Lys Ala Val Glu Lys Val His Ala Ala
  • GTC TGC ATC TTC TCG CAG GAC GGC 3 ⁇ 4CC 694 Gly Thr lie Asp Gly Arg Glu Val Cys He Phe Ser Gin Asp Gly Thr
  • GCA ACC ACC CAC ATG GTG NZC GCT GGC 1078 Thr Gin Glu Glu Leu Gly Gly Ala Thr Thr His Met Val Thr Ala Gly
  • CAG GAC CTG GTG TCC TTC CTC CCA.
  • TCC AAC AAT CGC TCT TAC ACA CCA 1174 Gin Asp Leu Val Ser Phe Leu Pro Ser Asn Asii Arg Ser Tyr Thr Pro
  • TTT GTT GCC MC CAG CCA PCC 1414 Gly Arg lie Glu Gly Gin Ser Val Gly Phe Val Ala Asn Gin Pro Thr
  • Gly Thr lie Asp Gly Arg-Glu Val Cys lie Phe Ser Gin Asp Gly Thr
  • Glu Gly Ala Gly Ala Arg lie Gin Asp Gly Ala Val
  • Ser Leu Asp Phe 145 150 155 160 lie Ser Gin Thr Phe Tyr Gin Asn lie Gin Ala Ser Gly Val lie Pro
  • Ala Asp Asp Leu Lys Leu Asp Giu lie lie Pro Asp Ser Ala Thr Val 290 295 300
  • Gly Arg lie Glu Gly Gin Ser Val Gly Phe Val Ala Asn Gin Pro Thr
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Brevipacterium 'Lactofamentum
  • GGTACCCTTT TTGTTTTGGA CACATGTAGG GTGGCCGAAA CAAAGTAATA. GGACAACAAC 60 GCTCGACCGC GATTATTTTT GGAGAATC ATG? £ C TCA GCA. TCT GCC CCA AGC 112
  • ATC GTC GTT GAG GTT ATC GGC GGC ATT GAG TAC CCA.CGT GAG GT .GTT 400 lie Val Val Glu Val lie Gly Gly ly Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val
  • GCA TCC AAG GCT GCA ATT TTG GCA TCC ATC GCT TTC CAC ACC CGT GTT 784 Ala Ser Lys Ala Ala lie Leu Ala Ser lie Ala Phe His Thr Arg Val
  • AAG TCG GCT ⁇ TCT GCT 928 lie Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys Glu Gly Lys Ser Ala He Ser Ma
  • TCT GAT CTT TCC CGC NZC GTT 1360 lie Val Val Thr His Ser Ala Leu Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val
  • Ala Asn Leu Pro lie Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His 355 360 365
  • Val Lys Ala lie n Ser Val lie Arg Leu Glu Arg Asp
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid Number of chains: double strand
  • Organism name Brevibacurium 'Lactofamentum
  • GCG CCC AAG GAG TCT GCG AAA CCA GCA.
  • CCA AAG GCT GCC CCT GCA.
  • GCC 760 Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala
  • AAG GCC AAG GAG TCC TCA.GTG CCA CAG CAA CCT AAG CTT CCG GAG CCA 856 Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gin Gin Pro Lys Leu Pro Glu Pro
  • GTA GCA GCC ATC GAA NZC G3 ⁇ 43 AAG ATG AAC TTC TCC GAG TTC CTC 1240 Val Ala Ala lie Lys Glu Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu
  • AAG GGC CAG GGC ACC 1384 lie Gly Thr Arg His Ser Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Glxi Gly Thr
  • GAG ATC TTC GAC GCA ATG AAC GTT CCT TC? CC CCA ATG CGT TGG GCA 1624 Glu He Phe Asp Ala Met Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala
  • TTC AAC ATC GTG GGC AAG CCA CTG GCA.
  • TC ATC TTC ⁇ GAG TTT GAA 2248 Phe Asn He Val Gly Lys Pro Leu Ala Serlie Phe Asn Glu Phe Glu
  • GGC CAA ATG GAG C3 ⁇ 4G GGC CAG ATC GGT GGC TCC GGT GAC GTG AAG TAC 2296 Gly Gin Met Glu Gin Gly Gin lie Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr
  • GCT GTT RPC 2392 lie Lys Val Ser Leu Thr Ala? jsn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn
  • neq dsy ras naq; ⁇ ⁇ SJH 6 3 ⁇ 4-5JV ns; ne STH
  • BTV AID us BTV 33 ⁇ 4 dsv ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 UTO ⁇ ⁇ djj, ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ⁇ T3 ⁇ 4 ⁇ 96 ⁇ XDD DDD DDD DiX D3 ⁇ 4D ODD Dil D3 ⁇ 4D VDD 3 ⁇ 43 ⁇ 4 DDI VDD DID 01
  • GGC MG CTG T? £ TAG GAA. TTG GCA AAG CGC AAG GAG AAG GAC GGA. CGC 3928 Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Leu Ala Lys Arg Lys Glu Lys Asp Gly Arg
  • Gly Gly Thr lie His He Val Val Asn Asn Gin lie Gly Phe Thr Thr 05 05 710 715 720
  • Lys Asp Val Phe lie Asp Leu Val Cys Tyr Arg Leu Arg Gly His Asn 770 775 780
  • Val Thr Lys Phe Gin Ser Val lie Asp Asp Pro Asn Val Ala Asp Ala
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明細 発酵法による目的物質の製造法 技術分野
本発明は、 発酵法による目的物質の製造法に関し、 詳しくは、 ァミノ 酸等の有用物質を効率よく製造する方法に関する。 背景技術
微生物を用いた発酵法による目的物質の生産効率を高めるために、 目 的物質の産生に不利に働く酵素、 例えば目的物貧を分解し、 もしくは他 の物質に変換する酵素、 目的物質の生合成系路から分岐する他の経路に 属する酵素等を欠損させ、 あるいは弱化させた微生物を用いる方法が知 られている。
例えば、 コリネパクテリゥム · グルタミカムの L—リジン生産菌とし て、 Lーリジンの生産性に最も影響を与える酵素といわれているホモセ リンデヒ ドロゲナーゼ （以下、 「H D」 という） を欠損した変異株が知 られてしヽる (Nakayama, K . et al .； J. Gen . Appl . Microbiol . フ（3 ) , 145-154 ( 1961 ) ) 。 このような変異株においては、 L一リジン合成系路 からァスパラギン酸； S—セミアルデヒ ドを介して分岐するヒースレオニ ン固有の合成系路において、 第一の反応であるァスパラギン酸 ーセミ アルデヒ ドから L一ホモセリンを生成する反応を触媒する H Dが欠損し ているために Lースレオニンが合成されず、 その結果、 Lースレオニン によりフィードパック阻害を受けるァスパルトキナーゼ活性が阻害され ずに、 L一リジン合成反応が進行する。
また、 本発明者は、 ひーケ トグルタル酸デヒ ドロゲナーゼ （以下、 Γ α— K G D H」 という） 遺伝子を含むプラスミ ドでコ リネ型 Lーグル タミン酸生産菌を形質転換し、 得られた形質転換体のひ一 K G D H活性 のレベルと L一グルタミン酸の生産能を調べた結果、 a— K G D H活性 が增強された株は、 し一グルタミン酸の生産量が低下することを見いだ している。 さらに、 一 K G D Η遺伝子が破壊されたコリネ型 Lーグル タ ミン酸生産菌は、 過剰量のピオチンを含有する培地で培養したときに. 界面活性剤やべニシリンのようなビォチン作用抑制物質を培地に添加す ることなく著量の L一グルタミン酸を生成蓄積することを見いだしてい る （W095/34672号国際公開パンフレッ ト） 。 通常、 コ リネ型 L一グルタ ミン酸生産菌は、 ビォチン置を制限した培地で培養すると同細菌は著 fi の L—グルタミン酸を生産するが、 ビォチンが過剰量存在する培地中で 培養すると L—グルタ ミン酸を生産しないことが知られている。 ビォチ ンの過剰置存在下で L一グルタミン酸を生産させるには、 培地に界面活 性剤またはペニシリンを添加することが必要である力 一 K G D H遺 伝子破壊株では、 これらの物質を添加しなくても L _グルタ ミン酸を生 産する （W095/34672号国際公開パンフレッ ト） 。
さらに、 本発明者は、 ビォテンの制限または界面活性剤もしくはベニ シリンの添加が、 どの様な作用機作を通じてコリネ型細菌の L—グルタ ミン酸の生産性に影響するかについて研究を行った結果、 Lーグルタ ミ ン酸生産に関与すると思われる遺伝子の存在を突き止めた （以下、 この 遺伝子を 「 d t s R遺伝子 J 、 同遺伝子がコードする蛋白質を 「D T S R蛋白 J と称する。 ） 。 そして、 この d t s R遺伝子が破壊された株は、 野生株がほとんど L一グルタミン酸を生成しない量のビォチンが存在す る条件においても著量の L一グルタ ミン酸を生成することを確認した (W095/23224号国際公開パンフレッ ト） 。
以上のように、 特定の遺伝子を欠損させることにより、 目的物質の生 産量を増大させることができる一方、 これらの遺伝子の欠損は微生物の 生育にとっては好ましくない場合がある。 例えば、 H D欠損株は Lース レオニン及び L一メチォニンを合成できないために、 培地中にこれらの アミノ酸が存在しないと生育することができない。 また、 D T S Rタン パク欠損株は、 高い L一グルタミン酸生産能を有するが生育速度が遅く , 培養にォレイン酸を必要とする （W09S/23224号国際公開パンフレッ ト） < そのためにォレイン酸又はその誘導体を添加して培養する必要があるが. ォレイン酸又はその誘導体の添加は、 原料コストを上昇させるだけでな く、 それ自体が生育抑制作用を持っために、 D T S Rタンパク欠損株の 生育を悪くする。 同様に、 一 K G D H欠損株は野生株に比べて生育が よくないという問題がある。
したがって、 微生物を増殖させるという観点からは、 上記のような遺 伝子は細胞内に保持されていることが好ましい。 特定の遺伝子を、 菌体 を増殖させる際には染色体に保持させ、 目的物貧を産生させる際にはそ の遺伝子を染色体から脱落させる方法が知られている。 例えば、 ェシェ リ ヒア ' コ リにおいて、 菌体を增殖させた後に、 溶原性； ファージの温 度感受性リプレッサーを利用して、 染色体からチロシン生合成系遺伝子 を脱落させ、 フエ二ルァラニンを製造する方法が開示されている （特開 昭 6 1 — 2 4 7 3 8 9号公報） 。 この方法は、 予め溶原性 λファージを 用いて遺伝子を染色体 D Ν Αに組み込む必要があり、 そ-の際に； Iファー ジ D N Aが組み込まれる染色体 D N Aの領域に存在する遺伝子を破壊す る可能性がある。 しかし、 細胞内における特定遺伝子の保持と脱落を、 染色体外で制御することにより、 目的物質を効率よく製造する方法は知 られていない。
染色体遺伝子を改変する方法として、 温度感受性複製起点を有するプ ラスミ ドを用いる方法が知られている （特公平フー 1 0 8 2 2 8号公 報） 。 この方法は、 目的遺伝子が温度感受性複製起点を有するプラスミ ドに揷入された組換え D N Aを微生物細胞に導入し、 染色体 D N Aに目 的遺伝子を組み込み、 その後、 高温で培養して組換え D N Aを細胞から 脱落させることによって、 染色体への遺伝子の組み込み、 あるいは染色 体上の遺伝子の脱落を計画的に行おうとするものである。 すなわち、 こ の方法は、 染色体上の遺伝子を恒久的に改変することを主な目的とする ものであって、 培養中における染色体外での遺伝子の保持と脱落を制御 し、 それによつて微生物の増殖と目的物質の効率的な産生とを両立させ ようとするものではない。
本発明は、 上記観点からなされたものであり、 目的物質の産生に不利 に作用する遺伝子であって、 特に微生物の生育にとっては有利に作用す る遺伝子の、 染色体外での保持及び脱落を制御し、 それによつて、 微生 物の増殖と目的物質の産生とを両立させ、 目的物質を効率よく製造する 方法を提供することを課題とする。 発明の開示
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、 温 度感受性複製起点を含むプラスミ ド （以下、 「温度感受性プラスミ ド」 ともいう） を用いることにより、 特定の遺伝子の細胞内における保持及 び脱落を制御することができ、 それによつて目的物質を効率よく製造す ることに成功し、 本発明に至った。 すなわち本発明は、 目的物質の産 生に不利に作用する遺伝子と、 温度感受性複製起点とを含むプラスミ ド を保持する微生物である。
また本発明は、 この微生物を、 前記プラスミ ドが複製可能な温度で培 養して増殖させる工程と、 前記プラスミ ドが複製不能な温度で培養して プラスミ ドを細胞から脱落させ、 目的物質を産生させる工程とを含む、 発酵法による目的物質の製造法を提供する。 前記目的物質としては、 微生物を用いた発酵法により産生され得る物 質であって、 その産生に特定の遺伝子産物が不利に作用するものであれ ば特に制限されず、 具体的には、 L一グルタミン酸、 L一リジン、 L一 フエ二ルァラニン、 チロシン等のアミノ酸、 グァニル酸、 イノシン酸等 の核酸類、 ビタミン類、 抗生物質、 成長因子、 生理活性物質、 タンパク 質などが挙げられる。 また、 現在微生物を利用して生産されていない物 質であっても、 微生物によって生合成され得るものであれば本願発明を 適用することができる。
目的物質の産生に不利に作用する遺伝子とは、 目的物質の産生量を減 少させる作用を有する遺伝子の他、 その遺伝子が存在するときには目的 物質の産生に特定の物質が必要となる遺伝子等を含む。 前記遺伝子とし て具体的には、 目的物莨の生合成系路から分岐する他の経路に属する酵 素、 特にその経路の律速段階となる反応を触媒する酵素をコードする遺 伝子が挙げられる。 言い換えれば、 目的物莨の生合成系路にある中間体 またはこの経路に流入する中間体の量を減少させる酵素をコードする遗 伝子である。 また、 前記遺伝子として、 目的物質を分解し、 もしくは他 の物質に変換する酵素をコードする遺伝子が挙げられる。
本発明においてこれらの遺伝子は、 好ましくは、 微生物の生育にとつ て有利に作用する遣伝子である。 微生物の生育にとって有利に作用する 遺伝子とは、 その遺伝子が機能すると、 機能しない場合と比較して生育 がよくなる遺伝子、 その遺伝子が機能すると、 機能しない場合に微生物 の生育に必要な特定の物質を必要としなくなる遣伝子等が含まれる。 前記遺伝子と目的物質との組み合わせとして具体的には、 d t s R遺 伝子もしくはひ一 K G D H遺伝子と L一グルタミン酸、 H D遣伝子と L —リジン、 t y r A遺伝子とし一フエ二ルァラニン、 p h e A遺伝子と Lーチロシン、 p u r A遺伝子とグアノシン、 g u a B遺伝子とアデノ シン、 p u r A遺伝子及び g u a B遺伝子とイノ シン等が挙げられる。
D T S R欠損株は、 d t s R遺伝子を有する株がほとんど L—グルタ ミン酸を生成しない置のピオチンが存在する条件においても著 fiの L一 グルタ ミン酸を生成することができる。 一方、 D T S R欠損株は、 培養 にォレイン酸を必要とする。
ひ一 K G D H欠損株は、 ピオチンの過剰置存在下でも、 培地に界面活 性剤またはぺニシリンを添加しなくても L一グルタ ミン酸を生産する一 方、 ひ一 K G D H欠損株は、 野生株に比べて生育がよくない。
また、 H D欠損株は、 ヒースレオニンが合成されず、 その結果、 L一 スレオニンによリフィ一ドパック阻害を受けるァスパルトキナ一ゼ活性 が阻害されずに、 L一リジン合成反応が進行する。 方-、 H D欠損株は Lースレオニン及び L一メチォニンを合成できないために、 培地中にこ れらのァミノ酸が存在しないと生育することができない
本発明の微生物は、 上記のような遺伝子を含む温度感受性プラスミ ド を保持し、 かつ、 機能可能な前記遺伝子を染色体 D N A上に保持しない 微生物である。 温度感受性プラスミ ドは、 複製起点が温度感受性である ために、 低温、 例えば 2 0 °Cでは自律増殖することができるが、 高温、 例えば 3 4 °Cでは自律増殖することができず、 これを保持する微生物が 分裂を繰り返す毎にプラスミ ドのコピー数が減少するために、 プラスミ ドを保持しない微生物が大勢を占め、 実質的に脱落する。 したがって、 特定の遺伝子を含む温度感受性プラスミ ドを導入された形質転換体は、 低温で培養すれば前記遺伝子を細胞内に保持し、 高温で培養すれば前記 遺伝子を欠損する。 本願の実施例で用いた温度感受性プラスミ ドは、 上 記のように低温では複製可能であり、 高温では複製不能であるが、 これ とは反対に、 低温では複製不能であり、 高温では複製可能な温度感受性 複製起点が得られれば、 これを用いてもよい。 以下の記載において、 温 度感受性プラスミ ドが複製不能な温度を高温として説明するが、 これは 低温である可能性を排除する意図ではない。
尚、 本発明に用いる微生物として、 r e c A -株を用いると、 低温で 培養中にプラスミ ド上の遺伝子が染色体へ組み込まれるのを防ぎ、 遺伝 子の脱落を確実にすることができる点で好ましい。
遺伝子の保持、 脱落の効果を高めるためには、 機能可能な前記遺伝子 を温度感受性プラスミ ド上のみに保持することが好ましい。 すなわち、 染色体 D N A上または温度感受性プラスミ ド以外の他のプラスミ ド上に 機能可能な遺伝子が存在していると、 温度感受性プラスミ ドを脱落させ ても、 前記遺伝子が細胞内に維持されるため、 プラスミ ド脱落による効 果は低くなる。 機能可能な遗伝子を温度感受性プラスミ ド上のみに保持 させるには、 例えば、 染色体上に存在する前記遺伝子を変異、 または破 壊して、 活性のあるその遗伝子産物を生成しないようにすればよい。 具 体的には、 遺伝子のプロモーターに変異を起こさせ、 その遺伝子が発現 しないようにしてもよく、 また、 コード領域に塩基の S換、 欠失、 挿入, 付加又は転移等の変異を生じさせ、 発現産物が活性を失なうようにして もよい。 また、 遺伝子を破壊する方法として、 欠失型遺伝子と染色体上 の正常遣伝子との相同組換えによる遺伝子破壊法があるが、 この方法は, 復帰変異の可能性が極めて低い点で好ましい。 尚、 問題となる遺伝子を 元来有していない微生物を使用する場合には、 遺伝子の変異または破壊 を必要と しない。
尚、 温度感受性プラスミ ド上に保持させる遺伝子と、 欠損させる染色 体 D N A上の遺伝子は、 同一である必要はなく、 実質的に同一の機能を 有するものであればよい。 例えば、 微生物の染色体上に存在する固有の 遺伝子を欠損させ、 その遺伝子と同一の機能を有する外来の遺伝子を含 む温度感受性プラスミ ドをその微生物に保持させてもよい。
本発明に用いる微生物と しては、 目的物質の発酵生産に用いることが でき、 遺伝子組換え技術の適用が可能であり、 温度感受性複製起点が得 られるものであれば特に制限されない。 このような微生物としては、 例 えば、 コ リネ型細菌、 ェシエリヒア属細菌、 セラチア属細菌が挙げられ る。 また、 現在、 遺伝子組換えが行われていないものであっても、 将来 遺伝子組換えが可能になれば、 本発明を適用することができる。
本発明に用いる微生物と して具体的には、 コリネ型細菌が挙げられる。 本発明にいうコリネ型細菌とは、 パージーズ · マニュアル . ォブ ' デ タ一ミネイティブ■ ノくク亍リ才ロジ一 (Bargey ' s Manual of
Determinative Bacteriology) 第 8版 5 9 9頁 ( 1 9 7 4 ) に定義され ている一群の微生物であり、 好気性、 グラム陽性、 非抗酸性、 胞子形成 能を有しない桿菌であり、 従来ブレビパクテリゥム厲に分類されていた が現在コ リネパク亍リウム属細菌として統合されたブレビパク亍リゥム 属細菌 ( int . J . Syst . Bacteriol . , 41 , 255 ( 1981 ) ) を含み、 またコ リネパクテリゥム厲細菌と非常に近縁なブレビパクテリゥム属細菌及び ミクロバ亍リウム属細菌を含む。 このようなコリネ型細菌の例として、 以下のものが挙げられる。
コ リネバクテリゥム ■ ァセ 卜ァシドフィラム
コリネパク亍リウム · ァセトグルタ ミカム
コ リネパクテリゥム ' カルナェ
コリネバクテリゥム · グルタ ミカム
コリネパク亍リウム ■ リ リウム （コリネパクテリゥム · グルタミ力 ム）
コリネパクテリウム · メラセコーラ
ブレビパクテリゥム ' ディパリ力タム （コリネパクテリゥム . グルタ ミカム） ブレビバク亍リゥム .· フラバム （コリネバクテリゥム · グル タミカム） ブレビパクテ )ゥム インマリオフィラム
ブレビパクテ )ゥ厶 ラク トフアーメンタム （ Vネバクテリゥム グルタ ミカム）
ブレビバク亍 Jゥ厶 ロゼゥム
ブレビパクテリゥム サッカロリティカム
ブレビバク亍リゥ厶 チ才ゲニタリス
コ リネバク亍 Jゥム サーモアミノゲネス
具体的には、 下記のような菌株を例示することができる
コリネパク亍 Jゥム ァセトァシドフイラ厶 AT C C 1 3870 コ リネバク亍 Jゥム ァセ トグルタミカム AT C C 1 5806 コ リネバクテ Jゥム カルナェ A T C C 1 5991
コ リネバク亍 Jゥム グルタミカム AT CC 1 3020
コリネバクテ Jゥム リリウム （コリネバクテリゥム · グルタミカ ム） A T C C 1 59 0
コリネバク亍 」ゥム メラセコーラ A T C C 1 7 96 5
ブレビバク亍 Jゥム ディバリカタム （コリネパクテリゥム · グルタ ミカム） A T C C 1 4020
ブレビバク亍 Jゥム フ ム （コリネパクテリウム ' グルタミ力 ム） A T C C 1 40 フ
ブレビバク亍 Jゥム インマリオフィラム AT C C 1 4068 ブレビバク亍 Jゥム ラク 卜フェルメンタム （コ リネパクテリゥム グルタ ミカム） A T C C 1 3869
ブレビバク亍 Jゥム · 口ゼゥム A T C C 1 3825
ブレビバク亍リウム ' サッカロリ亍ィカム A T C C 1 4066 ブレビバク亍リウ厶 ' チォゲ二タリス AT C C 1 9240 コリネパク亍リウム · サ一モアミノゲネス A J 1 2340 (F E R B P - 1 539 )
これらを入手するには、 例えばアメ リカン · タイプ ' カルチャー · コ レクシヨン （AT CC ： ァメリカ合衆国 20852、 メ リーランド、 ロックビル、 パ一クローンドライブ 1 2301 ) よリ分譲を受けること ができる。 すなわち、 各微生物ごとに対応する登錄番号が付与されてお り、 この登録番号を引用して分譲を受けることができる。 各微生物に対 応する登録番号はァメ リカン ' タイプ ' カルチャー ' コ レクションの力 タ口グに記載されている。
本発明の微生物を温度感受性プラスミ ドが複製可能な温度 （例えば低 温） で培養すると、 前記プラスミ ドは微生物細胞中に保持され、 前記プ ラスミ ドに含まれる遺伝子は機能し得る。 次に前記微生物を温度感受性 プラスミ ドが複製不能な温度 （例えば高温） で培養すると、 前記遺伝子 はプラスミ ドとともに細胞から脱落する。 したがって、 本発明の微生物 を所望の細胞密度になるまで低温で培養し、 しかる後に高温で培養して プラスミ ドを脱落させ、 さらに培養を続けることによって、 微生物の增 殖と目的物質の効率的な産生とを両立させることができる。 プラスミ ド を脱落させた後は、 目的物質の産生に好ましい温度に応じて、 高温のま ま培養してもよいし、 再び低温に戻して培養してもよい。 高温で培養を 続ければプラスミ ドを保持する細胞が増加することを防止することがで きる。 高温で培養することが目的物質の産生に好ましくない場合には、 低温に戻して培養すればよい。 低温で培養すると、 残存するプラスミ ド 保持細胞が増加することがあるが、 プラスミ ドを保持しない細胞が優勢 な間に目的物質の産生を効率よく行なわせることができる。
温度シフ トの態様と して、 具体的には、 種培養を低温で行い、 主発酵 培地での培養 （本培養） を高温で行う方法が挙げられる。 また、 前培養 の途中、 又は本培養の途中で温度シフ トを行ってもよい。 尚、 菌体の増 殖工程とプラスミ ドの脱落工程は、 明確に区分されるものではなく、 プ ラスミ ドの脱落工程は菌体の増殖を伴う。
温度シフ トのタイミングは、 用いる遣伝子、 微生物、 温度感受性複製 起点、 培養条件、 及び目的物 の種類によっても異なるが、 温度シフ ト までの培養時間を変えて予備実験を行うことにより、 低温での培養時間 を容易に決定することができる。 一般的には、 対数増殖期において所望 の細胞密度に達するまで培養した後、 プラスミ ドが複製不能な温度にシ フ 卜すればよい。
培養に用いる培地は特に制限されず、 使用する微生物に適した培地を 用いればよい。 例えば、 コ リネ型細菌の培養に用いる培地は、 炭素源、 窒素源、 無機イオン及び必要に応じその他の有機微置栄養素を含有する 通常の培地である。
炭素源としては、 グルコース、 ラク ト一ス、 ガラク トース、 フラク トースゃ澱粉加水分解物などの糖類、 エタノ一ルゃィノシ トールなどの アルコール類、 酢酸、 フマール酸、 クェン酸、 コハク酸等の有機酸類を 用いることができる。
窒素源としては、 硫酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥム、 リン酸アン モニゥム等の無機アンモニゥム塩、 大豆加水分解物などの有機窒素、 ァ ンモニァガス、 アンモニア水等を用いることができる。
無機イオンとしては、 リン酸カリウム、 硫酸マグネシウム、 鉄イオン、 マンガンイオン等が少量添加される。 有機微量栄養素と しては、 ビタミ ン B iなどの要求物 gまたは酵母エキス等を必要に応じ適量含有させる ことが望ましい。
培養は好気的条件下で 1 6〜 7 2時間実施するのがよく、 培養温度は 2 0 °C〜4 5 °Cに、 培養中 p Hは 5〜8 . 5に制御する。 尚、 p H調整 には無機あるいは有機の酸性あるいはアル力リ性物質、 更にアンモニア ガス等を使用することができる。
本発明によれば、 例えば、 d t s R遺伝子を温度感受性プラスミ ド上 に保持する株は、 過剰量のビ才チンを含む培地を用いても、 著量の L一 グルタ ミン酸を生成することができる。
ひ一 K G D H遺伝子を温度感受性プラスミ ド上に保持する株は、 過剰 量のビォチンを含む培地を用いても、 培地に界面活性剤またはぺニシリ ンを添加せずに L—グルタミン酸を生成することができる。 尚、 培地に 界面活性剤やべニシリンを添加したリ、 培地中のピオチンを制限したリ することによリグルタ ミン酸收率を更に向上させることも出来る場合が め 。
また、 H D遺伝子を温度感受性プラスミ ド上に保持する株は、 Lース レオニン及びし一メチォニンを含まない培地を用いても、 L一リジンを 効率よく生成することができる。
発酵液からの目的物質の採取は、 通常の発酵生産による物質の製造法 と同様にして行えばよい。 例えば、 アミノ酸は、 イオン交換樹脂法、 沈 澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより培地から採取するこ とができる。 図面の簡単な説明
図 1 は、 遺伝子組込み及び遺伝子置換の概念図である。
図 2は、 ひ — K G D H遺伝子を含む D N A断片の制限酵素地図である。 発明を実施するための最良の形態
以下に、 本発明に好適に用いられる遺伝子とその遺伝子を欠損する微 生物、 及び温度感受性プラスミ ドについて説明する。 ここでは、 説明を 具体的にするために主としてコリネ型細菌について記載するが、 前述し たように本発明はコリネ型細菌に限定されるものではない。 < 1 >本発明に用いる遠伝子
( 1 ) d t s R遗伝子
d t s R遺伝子は、 コリネ型細菌由来の界面活性剤耐性に関与する遺 伝子と して本発明者らによって単離された遗伝子である。 コリネパク亍 リゥム属細菌由来の d t s R遣伝子を含む D N A断片のヌク レオチド配 列を配列表配列番号 1 に示す。 この配列のうち d t s R遺伝子のコ 一ド 領域は、 46フ〜 469番目の A T Gから 1985〜 1987番目の C T Gにいたる配 列を少なく とも有する。
前記 46フ〜 469番目の A T Gの上流にさらに A T G (ヌク レオチド番号 359〜 361 ) が同一フレームで存在し、 この A T Gが開始コ ドンである可 能性は否定できないが、 この遺伝子の上流領域に存在するコンセンサス 配列の解析から前記 46フ〜 469番目の A T Gが開始コ ドンであると推定さ れる。 すなわち、 配列番号 2に示されるアミノ酸配列のうちアミノ酸番 号 3 7 ~ 5 4 3からなるァミノ酸配列が、 D T S R蛋白のァミノ酸配列 であると推定される。 本願明細書において D T S R蛋白のアミノ酸配列 及び d t s R遺伝子の塩基配列について言及している場合、 46フ〜 469番 目の A T Gを開始コ ドンとして記載されていることがある力 359- 361番目'の A T Gが開始コ ドンである可能性も考慮されたい。 したがつ て、 コリネ型細菌に d t s R遺伝子を導入しょうとする場合、 配列番号 1 に示す塩基配列のうちヌクレ才チド番号 46フ〜 1987からなる配列を発 現させればよいと考えられるが、 ヌクレ才チド番号 359〜 466を含めて配 列番号 1 に示す塩基配列のコード領域及び上流領域をコリネバク亍リゥ ム属細菌に導入すれば、 いずれの A T Gが開始コ ドンであっても D T S R蛋白を正しく発現させることができることは当業者に容易に理解され るであろう。 尚、 d t s R遺伝子が菌体内で発現する際、 開始コ ドンに よってコ 一ドされる N末端の M e tはアミノぺプチダーゼによって切断 される場合もある。
d t s R遺伝子を含むプラスミ ド p D T R 6をェシエリ ヒア ' コリ J M 1 0 9に導入して得られた形質転換株は、 A J 1 2 9 6 7と命名さ れ、 1 9 9 4年 2月 2 2日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研 究所 （郵便番号 3 0 5 日本国茨城県つくば市東一丁目 1 番 3号） に受 託番号 F E R M P— 1 4 1 6 8として寄託され、 1 9 9 5年 2月 9日 にブダペス ト条約に基づく国際寄託に移管され、 受託番号 F E R M B P - 4 9 9 4が付与されている （W095/23224号国際公開パンフレッ ト） d t s R遗伝子を含む D N A断片は、 上記寄託菌株から p D T R 6を回 収し、 プラスミ ド D N Aを制限酵素 K p n I 及び X b a I で切断するこ とにより得られる。 ' '
d t s R遗伝子は、 配列番号 1 に示す塩基配列を基に合成したオリゴ ヌク レオチドをプライマ一と し、 コリネ型細菌染色体 D N Aを錶型とす るポリメラ一ゼチェインリアク ヨン法 （ P C R ： polymerase chain reaction； White, T.J. et al ； Trends Genet. 5, 185 ( 1989)参照） に よって、 d t s R遺伝子を含む D N A断片を増幅することによつても得 られる。 P C R反応に用いるプライマーとしては、 塩基組成がランダム で G + C含量が 50%付近であり、 特殊な 2次構造を形成せず、 互いに 相補的でない、 との条件を満たすものであればどのような配列でもよし、。 長さは通常 20ないし 30塩基のものがよく用いられる。 また、 プライ マ一と しては、 d t s R遺伝子の少なく とも全コ一ド領域を含む D N A 二重鎖の両 3 ' 末端の塩基配列に相補的な塩基配列を有する 2本のオリ ゴヌク レオチドが好ましい。
オリゴヌクレオチドの合成は、 ホスホアミダイ ト法 （Tetrahedron Letters, 22, 1859(1981)参照） 等の常法により、 市販の D N A合成装置 (例えば、 Applied Biosystems社製 D N A合成機 model 380B等） を用 いて合成することができる。 P C R反応は、 市販の P C R反応装置 （宝 酒造 （株） 製 D N Aサーマルサイクラ一 PJ2000型等） を使用し、
TaqDNAポリメラーゼ （宝酒造 （株） より供給されている） を用い、 供給 者により指定された方法に従って行うことができる。
また、 コ リネ型細菌の染色体 D N Aライブラリーから、 配列番号 1 に 示す塩基配列を基に合成したオリゴヌクレオチドをプローブを用いるコ ロニーハイブリダイゼーションによっても、 d t s R遺伝子を含む D N A断片は取得できる。
染色体 D N Aライブラリ一は、 以下のようにして作製することができ る。 まず、 コリネ型細菌から斎藤、 三浦の方法 （H.Saito and K.Miura Biochem.Biophys.Acta 72, 619, (1963) ) 等により染色体 D N Aを調製す る。 該染色体 D N Aを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物 を得る。 切断反応時間等を調節して切断の程度を調節すれば、 幅広い種 類の制限酵素が使用できる。 例えば、 Sau3AIを、 温度 30°C以上、 好ま しくは 37° 酵素; 度 1 ~ 1 0ュニッ 卜/ mlで様々な時間 （ 1分〜 2 時間） 染色体 D N Aに作用させてこれを消化する。
ついで、 切断された染色体 D N A断片を、 ェシエリ ヒア . コリ （E. coli) 細胞内で自律複製可能なベクター DNAに連結し、 組換え D N Aを 作製する。 具体的には、 染色体 D N Aの切断に用いた制限酵素 Sau3A I と同一末端塩基配列を生じさせる制限酵素、 例えば B a m H I を、 温度
30°C以上、 酵素溏度 1 ~100ュニッ ト Zmlの条件下で 1 時間以上、 好 ましくは 1 〜3時間、 ベクタ一 D N Aに作用させてこれを完全消化し、 切断開裂する。 次いで、 上記のようにして得た染色体 D N A断片混合物 と開裂切断されたベクター D N Aを混合し、 これに D N Aリガーゼ、 好 ましくは T 4 D N Aリガーゼを、 温度 4〜 1 6° ( 、 酵素 ¾度 1〜 "！ 00 ュニッ トノ mlの条件下で 1時間以上、 好ましくは 6 ~ 24時間作用させ て組換え D N Aを得る。
E. coli細胞内において自律複製可能なベクタ一としては、 プラスミ ドベクタ一が好ましく、 宿主の細胞内で自立複製可能なものが好ましく、 例えば pUC19、 pUC18、 pBR322、 pHSG299、 pHSG399、 pHSG398、
RSF1010等が挙げられる。
また、 これらのベクターにコリネ型細菌中でプラスミ ドを自律複製可 能にする能力をもつ D N A断片 （例えば、 pAM 330 (特開昭 58- 67699号 公報参照） 、 pHM 1519 (特開昭 58- 77895号公報参照） 、 pCG 1 (特開昭 57-134500号公報参照） 、 pCG 2 (特開昭 58- 35197号公報参照） 、 pCG
4 (特開昭 57- 183フ99号公報参照） 、 pCG 11 (特開昭 57- 183フ99号公報参 照） 等から調製できる） を挿入すると、 E. coli及びコ リネ型細菌の両 方で自律複製可能ないわゆるシャ トルべクタ一として使用することがで きる。
このようなシャ トルベクタ一としては、 以下のものが挙げられる。 尚、 それぞれのべクターを保持する微生物及び国際寄託機関の寄託番号を かっこ内に示した。
pAJ655 ェシ Iリ tァ'コリ AJ118S2 (FERiM BP - 136)
コリネハ'ク Tリウム -ク'ルタミクム SR8201 (ATCC39135)
PAJ18 ェシ Iリヒア 'コリ AJ11883 (FERM BP-13フ）
コリネ Λ·ク于リウム 'ク'ルタミクム SR8202 (ATCC39136)
PAJ611 ェシエリヒア'コリ AJ11884 (FERM BP - 138)
pAJ31 8 コリネ Λ·ク亍リウム-ク♦ルタミクム SR8203 (ATCC39137)
PAJ440 ハ 'チルス 'ス ·フ'チリ XAJ11901 (FERM BP— 140)
得られた組換え D N Aを用いて、 例えば E. coli K-12株を形質転換し て染色体 D N Aライブラリーを作製する。 この形質転換は
D.M. Morrisonの方法 (Methods in Enzymology, 68, 326, 1979) あるしヽ は受容菌細胞を塩化カルシウムで処理して D N Aの透過性を增す方法 (Mandel'M. and Higa, A. , J.Mol . , Biol . , 53, 159 (1970) ) 等 I二より ί了つ ことができる。
ハイプリダイゼーションによリ選択された形質転換株から、 d t s R 遺伝子を含有する組換え D N Aを、 例えば p. Guerry らの方法 （J. Bacterid. , 116/ 1064, (1973) ) 、 D. Β. Clewell の方法
(j.Bacteriol.,110,667, (1972) ) などにより単離することができる。
D N Aの切断及び連結、 形質転換、 形質転換株からの組換え D N Aの 抽出、 及びコロニーハイプリダイゼーション等の一般的な遺伝子組換え に用いられる技術は、 当業者によく知られた書籍、 例えばモレキュラー - ク口一ニンク (Sambrook, J. r Fritsch,E.F. ^aniatis, T . ,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ) 等（こ詳述さ れている。
( 2) H D遺伝子
コリネ型細菌の H D遺伝子は、 本発明者らによリ取得されている (W095/23S64号国際公開パンフレッ ト） 。 ブレビパクテリゥム ' ラク ト フアーメンタム AJ12036株 （FERM BP-734) の H D遺伝子の塩基配列及び この配列から推定されるアミノ酸配列を、 配列表配列番号 3に示す。 さ らに、 アミノ酸配列を配列表配列番号 4に示す。 この配列と Peoplesら 報告したコリネパクテリゥ厶 · グルタミカムの H D遺伝子の配列
(Peoples, 0. P. et al. , Molecular Microbiology, 2(1), 63-72
(1988)) を比較したところ、 4ケ所に塩基の相違があり、 そのうち Ί ケ 所はァミノ酸レベルでの相違であった。 この相違点をコ リネパク亍リウ ム · グルタミカムの H D遺伝子の配列を基準として以下に示す。
① 531 G→ C (l48Gly-→148Ala)
② 1222G— C
③ 1318G— T
④ 1324C— G
コリネ型細菌の各野生株の H D退伝子の配列の間に認められるこのよ うな相違は、 H D活性に影譽するものではなく、 コリネパク亍リウム - グルタミカムの H D遺伝子の配列も上記のブレビパクテリゥム · ラク ト フアーメンタムの H D遺伝子の配列と同等のものとして扱うことができ る。 尚、 H D遺伝子においても、 開始コ ドンがコードするメチォニン残 基は除去されている可能性がある。
本願実施例に用いた H D遺伝子は、 コリネパク亍リウム · グルタミカ ムについて既知となっている配列 （Peoples, 0. P. et al; Molecular Microbiology, 2(1), 63-72 (1983) ) を基にして合成した才リゴヌク レ ォチド （配列番号 5及び配列番号 6 ) をプライマ一'と し、 ブレビパクテ リウム · ラク トフアーメンタム AJ12036株 (FERM BP- 734) の染色体 D N Aを錡型とする P C R法によって、 H D遺伝子を含む D N A断片を増幅 することによって取得されたものである。
P C R法に用いるプライマーは上記のものに限られず、 配列番号 3に 示す塩基配列を基に作製することができる。 プライマーと しては、 塩基 組成がランダムで G + C含量が 50 %付近であり、 特殊な 2次構造を形 成せず、 互いに相補的でない、 との条件を満たすものであればどのよう な配列でもよい。 長さは通常 20ないし 30塩基のものがよく用いられ る。 プライマーとしては、 H D遺伝子の少なく とも全コード領域を含む D N A二重鎖の両 3 ' 末端の塩基配列に相補的な塩基配列を有する 2本 のォリゴヌクレオチドが好ましい。
また、 コ リネ型細菌の染色体 D N Aライブラリーから、 配列番号 3に 示す塩基配列を基に合成したォリゴヌク レオチドをプローブを用いるハ イブリダイゼーションによっても、 H D遺伝子を含む D N A断片は取得 できる。
尚、 染色体 D N Aライブラリ一を、 E. coliを用いて作製した場合に は、 H Dの C末端側約 1 00アミノ酸残基に対応する領域の中からプ ローブに用いる配列を選択することが好ましい。 なぜなら、 E. coliの H D遺伝子は 2種類 （HD-1、 HD-2) 存在することが知られている (Zakin, M. M. et al; J. B.C., 258, 3028-3031 (1983) ) 力く、 これら はいずれもコリネバク亍リウム ' グルタ ミカム H Dの C末端側約 1 〇 0 ァミノ酸残基に対応する領域が存在しないので、 この領域の中からプ ローブに用いる配列を選択すると、 E. coli染色体上の H D遺伝子には ハイブリダイズしないからである。
増幅された D N A断片が H Dをコードする遺伝子の全長を含んでいな い場合には、 染色体 D N Aを上記染色体 D N Aライブラリーの作製に用 いたのと別の制限酵素で切断し、 再度染色体 D N Aライブラリーを作製 し、 再びハイブリダィゼーシヨンによる選択と制限酵素断片の解析を行 うことにより H D遺伝子の全長を含む D N A断片を取得することができ る。 この時、 プローブとして初めに取得した D N A断片を用いることに より、 ハイブリダィゼーシヨンをより容易に行うことができる。
オリゴヌクレオチドの合成や染色体 D N Aライブラリ一の調製は、— (1 ) と同様にして行うことができる。 (3 ) ひ 一 K G D H遺伝子
コリネ型細菌のひ一 KGD H遺伝子は、 本発明者らによリ取得されて いる （W095/34672号国際公開パンフレッ ト） 。 ブレビバク亍リウム - ラ ク トフアーメンタム A T C C 1 3869由来のひ一 K G D H遗伝子を 含む D N A断片の塩基配列を配列表配列番号フに示す。 この塩基配列か らオープン · リーディング . フレームを推定し、 その塩基配列より推定 される産物のアミノ酸配列を配列番号 8に示す。 なお、 蛋白質の N末端 にあるメチォニン残基は開始コ ドンである A T Gに由来するため蛋白質 本来の機能とは無関係であることが多く、 詡訳後べプチダ一ゼの働きに より除去されることがよく知られており、 上記ひ一 K G D H蛋白質の場 合にもメチォニン残基の除去が生じている可能性がある。
ひ 一 K G D H遺伝子を含むプラスミ ド p P K S— Xをブレビバク亍リ ゥム ' ラク トフアーメンタム Α」 Ί 1 060 (特公昭 59— 1 079
7号公報） に導入して得られた形質転換株は、 ブレビバクテリウム - ラ ク トフアーメンタム A J 1 2999と命名され、 平成 6年 6月 3日付 けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 305 曰本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号） に受託番号 F E RM P— 1 4349で寄託され、 平成 7年 6月 2曰にブダぺス ト条約に基づく国際 寄託に移管され、 受託番号 F E R B P— 51 23が付与されている。 — K G D H遺伝子を含む D N A断片は、 上記寄託菌株から p P K S— Xを回収し、 プラスミ ド D N Aを制限酵素 S a I I 及び X b a I で切断 することにより得られる。
大腸菌のひ一 K G D H複合体は、 E l ( a-ketoglutarate
dehydrogenase： EC 1.2.4.2) 、 c 2 ( dihydrolipoamide
succinyltrans f erase： EC 2.3.1.61) 、 c 3 (lipo amide
dehydrogenase : 1.6.4.3) の 3つのサブユニッ トで構成され、 E 1、 E 2遺伝子はオペロン構造を成し、 E 3はピルビン酸脱水素酵素
(pyruvate dehydrogenase： EC 1.2.4.1) と共有してしヽることが知られ ている。 大腸菌の E 1、 E 2遺伝子のヌクレオチ ド配列は明らかにされ 'ている (Eur. J. Biochem. , 141, 351 (1984)、 Eur. J. Biochem. , 141, 361 (1984) ) 0
また、 枯草菌についても同様に、 E 1、 E 2遺伝子のヌクレオチド配 1力 明らカヽにされてし、る （J. Bacteriol. , 171, 366フ （1989)、 Gene, 61, 217 (1987)等） 。
上記ブレビパクテリゥム ' ラク トフアーメンタム A T CC 1 386 9由来の α— K G D H遺伝子は、 大腸菌と枯草菌の E 1遺伝子の塩基配 列との相同性を利用して、 単離及びクローン化されたものである。 すな わち、 大腸菌と枯草菌のひ一 K G D H · E 1サブュニッ ト遗伝子間で相 同性の高い領域を選び、 配列表配列番号 9及び 1 0に示す合成オリゴヌ ク レオチドをプライマーとし、 ブレビバク亍リウム ' ラク トフアーメン タム A T C C 1 3 8 6 9株の染色体 D N Aを錶型とする P C R法に よって、 一 K G D H遺伝子を含む D N A断片を増幅した。
P C R法に いるプライマーは上記のものに限られず、 配列番号 7に 示す塩基配列を基に作製することができる。 プライマーと しては、 塩基 組成がランダムで G + C含量が 5 0 %付近であり、 特殊な 2次構造を形 成せず、 互いに相補的でない、 との条件を満たすものであればどのよう な配列でもよい。 長さは通常 2 0ないし 3 0塩基のものがよく用いられ る。 また、 プライマ一と しては、 ひ 一 K G D H遺伝子の少なく とも全 コード領域を含む D N A二重鎖の両 3 ' 末端の塩基配列に相補的な塩基 配列を有する 2本のォリゴヌクレオチ ドが好ましい p
また、 コリネ型細菌の染色体 D N Aライブラリ一から、 配列番号 7に 示す塩基配列を基に合成したォリゴヌク レオチドをプローブを用いるハ イブリダイゼーシヨンによっても、 一 K G D H遺伝子を含む D N A断 片は取得できる。
オリゴヌクレオチドの合成や染色体 D N Aライブラリ一の調製は、 ( 1 ) と同様にして行うことができる。
< 2 >温度感受性複製起点及びこれを含有するプラスミ ド
温度感受性複製起点は、 微生物細胞内で自律増殖可能であり薬剤耐性 を有するプラスミ ドを変異処理し、 そのプラスミ ドで微生物を形質転換 し、 薬剤を含む培地で低温では生育でき、 高温では生育できない形質転 換抹からプラスミ ドを回収することによって得られる。
プラスミ ドの変異処理は、 例えばプラスミ ドをインビ トロでヒ ドロキ シルアミン処理する方法 （G. ◦. H u m p h e r y s e t a I ： o I e c . g e n . G e n e t . 1 4 5 , 1 0 1 — 1 0 8 ( 1 9 7 6 ) などがある） が挙げられる。
ここでいう 「低温」 とは、 「高温」 に対する相対的な概念であり、 低 温と高温との境界は特に制限されるものではないが、 少なく とも 「低 温」 とは微生物を培養したときに微生物が增殖できる温度範囲であり、 また、 「高温」 とは微生物自体が死滅しない温度範囲である。 これら低 温と高温との境界は、 温度感受性プラスミ ドを保持する形質転換体を、 薬剤を含む培地で温度を変えて培養し、 生育できない温度の下限を調べ ることによって、 決定することができる。
コ リネ型細菌細胞内で機能する温度感受性複製起点を有するプラスミ ドと しては、 p H S 4、 p H S 2 2、 p H S 2 3が挙げられる。 これら は、 ェシエリ ヒア * コ リと、 コリネ型細菌の双方の菌体中で自律増殖可 能であり、 カナマイシン耐性を有するプラスミ ドベクター、 p H K 4を インビ トロでヒ ドロキシルァミン処理し、 ブレビパクテリゥム · ラク ト ファーメンタムを形質転換し、 カナマイシン 2 5 i g Zm l を含む M— C M 2 Gプレート上で低温 （ 2 0°C) で生育でき、 高温 （3 4°C) では 生育できない形質転換株から回収されたプラスミ ドである （特公平 7—
1 0 8 2 2 8号公報） 。 p H S 4を保持するェシェリ ヒア ' コリ A J 1 2 5 7 0は、 1 9 90年 1 0月 1 1 日に通商産業省工業技術院生命工学 工業技術研究所 （郵便番号 3 0 5 日本国茨城県つくぱ市東一丁目 1番 3号） に受託番号 F E R M P— 1 1 7 6 2として寄託され、 1 9 9 1 年 8月 2 6 日にブダペス ト条約に基づく国際寄託に移管され、 F E R M B P— 3 5 2 3としてに寄託されている。
また、 p H S 4、 p H S 2 2、 p H S 2 3から切り出したコリネ型細 菌由来の複製起点を含む各々の D N A断片を、 ェシエリ ヒア ' コリ用の ベクタ一である p H S G 3 9 8に接続して得られたプラスミ ド p H S C 4、 p H S C 2 2、 p H S C 2 3も、 同様に温度感受性プラスミ ドとし て本発明に使用することができる。 p H S C 4、 p H S C 2 2、 p H S C 2 3は、 コリネ型細菌、 及びェシエリ ヒア ' コリ中で自律増殖して、 宿主にク口ラムフエ二コール耐性を付与する （特公平 7 - 1 0 8 2 2 8 号公報参照） 。 p H S C 4を保持するェシェリヒア ' コ リ A J 1 2 5 7 1 は、 1 9 9 0年 1 ◦月 1 1 日に通商産業省工業技術院生命工学工業技 術研究所に受託番号 F E RM P— 1 1 7 6 3として寄託され、 1 9 9 1 年 8月 2 6曰にブダぺス ト条約に基づく国際寄託に移管され、 F E R M B P— 3 5 2 4の受託番号で寄託されている。 また、 p H S C 2 2 を保持するェシェリヒア ' コリ A J 1 2 6 1 5、 及び p H S C 2 3を保 持するェシエリヒア ' コ リ A J 1 2 6 1 6は、 1 9 9 1 年 4月 2 4日に, 各々順に F E RM P— 1 2 2 1 3、 F E R M P— 1 2 2 1 4の受託 番号で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 3 0 5 曰本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号） に寄託され、 1 9 9 1年 8月
2 6曰にブダぺス 卜条約に基づく国際寄託に移管され、 各々順に下 E R M B P— 3 5 3 0、 F E RM B P— 3 5 3 1 の受託番号が付与され ている。
これらの温度感受性プラスミ ドはコリネ型細菌細胞中において、 約 0〜 3 2 °Cでは自律増殖できるが、 約 3 4 °C以上では自律増殖できなし、。 温度感受性複製起点を有する D N A断片は、 例えば上記 p H S C 4を B a m H I と K p π I で切り出すことによって得られる。
尚、 各々のプラスミ ドの温度感受性複製起点を含む領域の塩基配列は、 特公平 7 - 1 0 8 2 2 8号公報に記載されている。
本発明に用いる温度感受性プラスミ ドは、 温度感受性複製起点と目的 物質の産生に不利に作用する遺伝子とを含むプラスミ ドである。 このよ うなプラスミ ドは、 温度感受性複製起点を含む D N A断片と、 前記遺伝 子を含む D N A断片とを、 T 4 D N Aリガーゼ等のリガーゼを用いて連 結することによって得られる。 また、 温度感受性プラスミ ドは、 これら の D N A断片に加えて、 E . coliで機能する複製開始点及び薬剤耐性遺 伝子等のマーカ一を含んでいると、 プラスミ ドの調製に便利である。 く 3 >宿主に用いる微生物
( 1 ) 遺伝子欠損株
本発明の微生物は、 上記のような目的物質の産生に不利に作用する遺 伝子が、 好ましくは前記プラスミ ド上のみに存在する微生物である。 か かる微生物は、 染色体 D N A上に機能可能な前記遺伝子を保持しない宿 主微生物を、 前記遺伝子を含む温度感受性プラスミ ドで形莨転換するこ とによって得られる。 染色体 D N A上に機能可能な前記遺伝子を保持し ない宿主微生物は、 染色体上に存在する各々の遺伝子を、 正常に機能し ないように変異させることによって得られる。 変異は、 遺伝子の転写又 は翻訳を妨げる変異であってもよいし、 機能しないタンパク莨を産生す るような変異であってもよい。 また、 遺伝子の一部または全部を欠失さ せる、 すなわち遺伝子を破壊するものであってもよい。 以下、 機能可能 な遺伝子を保持しない株を 「欠損株」 ともいう。
遺伝子欠損株は、 野生型遗伝子を生産する微生物を紫外線照射または 化学薬剤による処理を行い、 実質的に機能を持つその遺伝子産物を産生 しない株を選択することによつても得られる。 また、 遺伝子欠損株は遗 伝子組換えによる育種方法でも取得可能である。 特に、 S伝子の取得が なされている場合は、 遺伝子組換え法を用い相同組換え法により当該遗 伝子の破壊が容易に実現される。 相同組換えによる遺伝子破壊は既に確 立しておリ直鎖 D N Aを用いる方法や温度感受性プラスミ ドを用いる方 法などが利用できる。 具体的には、 部位特異的変異法 （Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987) ) や次亜硫酸ナ 卜リウム、 ヒ ドロキシルァミン等の化学薬剤による処理 （shortle, D. and Nathans,D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270(1978) ) によって、 欠損 させようとする遺伝子のコ一ディング領域またはプロモータ一領域の塩 基配列の中に 1 つまたは複数個の塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加または 逆位を起こさせ、 このようにして改変または破壊した遺伝子を染色体上 の正常な遺伝子と置換することによりその遺伝子産物の活性を低下ない し消失させるかその遺伝子の転写を低下ないし消失させることができる。 部位特異的変異法は、 合成オリゴヌク レオチドを用いる方法であり、 任意の限定された塩基対だけに、 任意の置換、 欠失、 挿入、 付加または 逆位を導入できる手法である。 この方法を利用するには、 まず、 クロー ン化され、 D N A塩基配列が決定されている目的遺伝子を持つプラスミ ドを変性させて一本鎖を調製する。 次に、 変異を起こさせたい部分に相 補的な合成オリゴヌクレオチドを合成するが、 この時合成オリゴヌクレ ォチ ドを完全に相補的な配列にせず、 任意の塩基置換、 欠失、 挿入、 付 加または逆位を持つようにしておく。 この後一本鎖 D N Aと任意の塩基 置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を持つ合成オリゴヌク レオチドをァ ニールさせ、 さらに D N Aポリメラーゼ I のクレノウフラグメンドと T 4リガーゼを用いて完全な 2本鎖プラスミ ドを合成し、 これをェシエリ ヒア · コ リのコンビテントセルに導入する。 このようにして得られた形 質転換体の幾つかは、 任意の塩基置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位が 固定された遺伝子を含むプラスミ ドを持っている。 遺伝子の変異を導入 し、 改変または破壊することができる同様な手法には、 リコンビナント P C R法 (PCR Technology, Stockton press (1989) ) カヽ'ある。
また、 化学薬剤処理を用いる方まは、 目的の遺伝子を含む D N A断片 を直接次亜硫酸ナトリウム、 ヒ ドロキシルァミン等で処理することによ リ D N A断片中にランダムに塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位 を持つ変異を導入する方法である。
このようにして取得した変異が導入されて改変または破壊された遺伝 子をコリネ型細菌等の微生物の染色体上の正常な遺伝子と S换する方法 としては、 相同性組換えを利用した方法 （Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972)； Matsuyama, S. and Mizushima, S-, J. Bacteriol - , 162, 1196 (1985) ) がある。 相 同性組換えは、 染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラスミ ド 等が菌体内に導入されると、 ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組 換えを起こし、 導入されたプラスミ ド全体を染色体上に組み込む。 この 後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、 再 びプラスミ ドが染色体上から抜け落ちるが、 この時組換えを起こす位 S により変異が導入された遺伝子の方が染色体上に固定され、 元の正常な 遺伝子がプラスミ ドと一緒に染色体上から抜け落ちることもある。 この ような菌株を選択することにより、 塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加また は逆位を持つ変異が導入されて改変または破壊された遺伝子が染色体上 の正常な遺伝子と置換された菌株を取得することができる。
相同組換えによる遺伝子破壊の方法を、 コリネ型細菌のひ一 K G D H 遺伝子破壊株を例にとって具体的に説明する （図 1 ) 。
プラスミ ドベクターにブレビパク亍リウム ' ラク トフアーメンタム由 来の温度感受性複製起点と変異型 α— K G D Η遺伝子とクロラムフエ二 コール等の薬剤に耐性を示すマーカ一遺伝子とを挿入して組換え D N A を調製し、 この組換え D N Aでコリネ型細菌を形質転換し、 温度感受性 複製起点が機能しない温度で形質転換株を培養し、 続いてこれを薬剤を 含む培地で培養することにより、 組換え D N Aが染色体 D N Aに組み込 まれた形質転換株が得られる。
こう して染色体に組換え D N Aが組み込まれた株は、 染色体上にもと もと存在するひ一 K G D H遺伝子配列との組換えを起こし、 染色体 一 K G D H遺伝子と変異型ひ一 K G D H遺伝子との融合遺伝子 2個が組換 え D N Aの他の部分 （ベクター部分、 温度感受性複製起点及び薬剤耐性 マーカー） を挟んだ状態で染色体に挿入されている。 したがって、 この 状態では野生型 一 K G D Hが優性であるので、 野生株と同等の生育を 示す。
次に、 染色体 D N A上に変異型 一 K G D H遺伝子のみを残すために、 2個の 一 K G D H遺伝子の組換えによリ 1 コピーの α— K G D Η遺伝 子を、 ベクター部分 （温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカーを含 む） とともに脱落させる。 例えば、 染色体組込み株を培養し、 培養菌体 を薬剤を含まない平板培地にまいて培養する。 生育したコロニーを、 薬 剤を含む平板培地にレプリカして培養し、 薬剤感受性株を取得する。 得 られた薬剤感受性株の染色体からベクター部分が脱落していることを、 サザン · ハイブリダイゼ一ションによリ確認し、 さらに正常な α— K G D Ηを発現しないことを確認する。
上記の変異型な一 K G D Η ¾伝子として、 ひ一 K G D Hの一部をコー ドする 一 K G D H遺伝子、 すなわち一部を欠失した 一 KGD H遗伝 子を用いて遺伝子 換を行うと、 染色体 一 KG D ΗΓ遺伝子が一部を欠 失した 一 K G D H遺伝子に S換されたひ一 K G D H遺伝子破壊株が得 られる。
上記と同様にして、 d t s R遺伝子欠損株及び H D遺伝子欠損株を取 得することができる。 尚、 H D遺伝子破壊株の作製に当たっては、 H D は N末端側の領域が活性に関与していると予想されているので、 H D遺 伝子のうち欠失させる部位としては、 N末端側の領域、 例えば N末端か ら 350アミノ酸以内の領域、 例えば 1 00〜200番目、 あるいは 2 50〜 3 50番目のアミノ酸の領域が挙げられる。 尚、 H D遺伝子は、 その下流に存在するホモセリンキナーゼと同一オペロン内にあるので、 ホモセリンキナーゼの発現を阻害しないように H D遺伝子のプロモー ター部位は欠失させないことが好ましい。
組換え D N Aをコリネ型細菌の細胞内に導入するには、 E. coli K - 12 について報告されている様に受容菌細胞を塩化カルシウムで処理して D Aの透過性を増す方法 (Mandel/M.and Higa, A. , J.Mol . , Biol . , 53, 159 (1970)、 またはバチルス ' ズブチリスについて報告されている様に細胞 が D Ν Αを取り込み得る様に増殖段階 （いわゆるコンビテントセル） に 入"？ る方;ま ( Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E . , Gene, 1, 153 ( 1 977) ) により可能である。 あるいは、 バチルス ' ズブチリス、 放線菌類 および酵母について知られている様に （Chang, S. and
Choen,S.N. , Molec. Gen. Genet . , 168. Ill (1979)； Bibb, M.J. , Ward, J.M.and
Hopwood , 0. A . , Natur e , 274, 398 (1978)； Hinnen, A. , Hicks , J . B . and
Fink, G .R. , Proc .Natl .Acad.Sci .USA, 75, 1929(1978) ) 、 DNA 受容菌を、 組換え D N Aを容易に取り込むプロ トプラス トまたはスフエロプラス ト にして組換え D N A受容菌に導入することも可能である。
プロ トプラス 卜法では上記のバチルス · ズブチリスにおいて使用され ている方法でも充分高い頻度を得ることができるし、 特開昭
5フ - 183799に記載されたコリネパクテリゥム属またはブレビパク亍リゥ ム属のプロ トプラス 卜にポリエチレングリコールまたはポリビニルアル コールと二価金属イオンとの存在下に D N Aをとリ込ませる方法も当然 利用できる。 ポリェチレングリコールまたはポリビニルアルコールの代 りに、 カルボキシメチルセルロース、 デキス トラン、 フイコール、 ブル 口ニック F 68 (セルバ社） などの添加によって D N Aのとり込みを促 進させる方法でも同等の結果が得られる。 さらには、 電気パルス法 （杉本ら，特開平 2-207791号公報） によって も、 組換え D N Aをブレビパクテリゥム属またはコリネパク亍リゥム属 細菌に属する受容菌へ導入できる。
本発明に用いることができる遺伝子破壊株として、 例えばブレビパク テリゥム ' ラク トフアーメ ンタム AJ12036株 (ΕΈΡΜ BP- 734) に由来す る H D破壊株は、 ブレビパクテリゥム · ラク トフアーメンタム
AJ12846と命名され、 1 994年 3月 Ί 曰に通商産業省工業技術院生命 工学工業技術研究所 （郵便番号 305 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号） に受託番号 FERM P-14197と して寄託され、 1 995年 2月 9 日にブダペス ト条約に基づく国際寄託に移管され、 8?-4995の受託 番号で寄託されている。
温度感受性プラスミ ドを導入する宿主微生物は、 r e c A- 変異株で あることが好ましい。 温度感受性プラスミ ドを保持する株を低温で培養 すると、 プラスミ ドに含まれる正常な遺伝子と染色体 D N A上の変異型 遺伝子との相同組換えを起こし、 正常遺伝子が染色体へ組み込まれる可 能性があるが、 該組込みが起こると高温で培養してプラスミ ドを宿主細 胞から脱落させても染色体上にプラスミ ド D N Aとともに問題の正常な 遺伝子が残留する。 このような相同組換えを防ぐためには、 r e c A- 変異株を用いるとよい。
コ リネ型細菌の r e c A遺伝子はすでに単離され、 塩基配列が知られ ており （特開平 7— 322879号公報、 ） 、 データベースにも登録さ れている （EMB Lァクセシヨンナンパ一 ： X 77384) 。 この配列 をもとにプライマーを作製し、 P C R法により r e c A遺伝子を単離す ることができる。 さらに、 得られた r e c A遺伝子を用いて上記と同様 にして r e c A遺伝子破壊株を取得すれば、 r e c A- 株が得られる。 得られた株が r e c A- 株であることは、 例えばマイ トマイシン C、 メ チルメタンスルホネート等の D N Aに障害を与える薬剤や U V照射に対 する感受性、 又は相同組換え能を調べることによって支持される。 r e c A- 株は、 r e c A+ 株に比べて前記薬剤や U V照射に対する感受性 が増加し、 相同組換え能が低下する。 P C R法により増幅した r e c A 遺伝子の内部配列を用いた r e c A遺伝子破壊株の創製については、 R. Fitzpatrick et al., Appl . Microbiol - Biotechnol . (1994) 42, 5"75-580に詳しく記載されている。
尚、 宿主に r e c A+ 株を用いた場合、 問題の遺伝子が染色体 D N A に組み込まれた細胞が出現しても、 培養中にプラスミ ド D N Aの組込が 起こらない細胞が大勢を占めていれば差し支えない。 そのような場合は、 問題の遺伝子が染色体 D N Aに組み込まれていない細胞のシングルコ口 ニーアイ ソ レーショ ンを行い、 これを目的物質の製造に用いるとよい。 - また、 宿主微生物の染色体 D N A上に目的物質の産生に不利に作用する 遺伝子と相同な箇所がない場合には、 r e c A+ 株を用いても上記の組 込みの問題は生じない。
( 2 ) 目的物莨産生に適した微生物
遺伝子欠損株の取得に用いる微生物には、 目的物質を産生する能力を 有する微生物を用いる。 以下に、 目的物質を産生する微生物の具体的な 例と して、 コ リネ型細菌の各種 L—アミノ酸生産菌を示す。
( i ) し一リジン生産菌
コ リネ型細菌の L一リジン生産菌として、 従来より種々の人工変異株 が用いられている。 このような人工変異株としては次のようなものがあ る。 S— （ 2—アミノエチル） 一システィン （以下、 「A E C」 と略記 する） 耐性変異株、 その生育に L—ホモセリ ンのようなアミノ酸を必要 とする変異株 （特公昭 4 8— 2 8 0 7 8号、 特公昭 5 6— 6 4 9 9号） 、 A E Cに耐性を示し、 更に L—ロイシン、 L—ホモセリン、 L—プロリ ン、 L—セリ ン、 L一アルギニン、 Lーァラニン、 Lーバリ ン等のアミ ノ酸を要求する変異株 （米国特許第 3 7 0 8 3 9 5号及び第 3 8 2 5 4 フ 2号） 、 D L— α—ァミノ一ど力プロラクタム、 一アミノーラウリ ルラクタム、 ァスパラギン酸アナログ、 サルファ剤、 キノィ ド、 Ν—ラ ゥロイルロイシンに耐性を示す L—リジン生産変異株、 ォキザ口酢酸脱 炭酸酵素または呼吸系酵素阻害剤に耐性を示す L一リジン生産変異抹 (特開昭 5 0— 5 3 5 8 8号、 特開昭 5 0— 3 1 0 9 3号、 特開昭 5 2 一 1 0 2 4 9 8号、 特開昭 5 3— 9 3 9 4号、 特開昭 5 3— 8 6 0 8 9 号、 特開昭 5 5— 9 7 8 3号、 特開昭 5 5— 9 7 5 9号、 特開昭 5 6— 3 2 9 9 5号、 特開昭 5 6— 3 9 7 7 8号、 特公昭 5 3— 4 3 5 9 1号. 特公昭 5 3— 1 8 3 3号） 、 イノシトールまたは酢酸を要求するし一リ ジン生産変異株 （特開昭 5 5 - 9 7 8 4号、 特開昭 5 6 - 8 6 9 2号） . フルォロピルビン酸または 3 4 °C以上の温度に対して感受性を示す L一 リ ジン生産変異株 （特開昭 5 5— 9 7 8 3号、 特開昭 5 3— 8 6 0 9 0 号） 、 エチレングリコールに耐性を示し、 L一リジンを生産するブレビ バク亍リウムまたはコ リネパクテリゥムの変異抹 （米国特許第 4 4 Λ 1 9 9 7号参照） 等。
具体的には、 以下のような抹を例示することができる。 ブレビパク亍リウム ' ラク トフアーメンタム A J 1 2 0 3 1 ( F E R M B P— 2 7 フ、 特開昭 6 0— 6 2 9 9 4号公報)- - ブレビバク亍リウム ' ラク トフアーメンタム A T C C 3 9 1 3 4 .(特開昭 6 0— 6 2 9 9 4号公報）
コリネパクテリゥム . グルタミカム A J 3 4 6 3 ( F E R M P - 1 9 8 7、 特公昭 5 1 — 3 4 4 7 7号公報）
ブレビバク亍リウム ' ラク トフアーメンタム A J 1 2 4 3 5 ( F E R M B P— 2 2 9 4、 米国特許第 5, 304, 476号）
ブレビパクテリゥム ' ラク トフアーメンタム A J 1 2 5 9 2 ( F E R M B P— 3 2 3 9、 米国特許第 5, 304, 476号）
コリネバク亍リウム ' グルタミカム A J 1 2 5 9 6 ( F E R M B P - 3 2 4 2. 米国特許第 5, 304, 476号）
ブレビバク亍リウム ' ラク トフアーメンタム A J 1 1 4 4 6 ( F E R M P— 5 1 6 3、 特開平 2— 2 0 7 7 9 1号公報）
また、 L—リジン生産性の E. coliと しては、 L—リジンアナログに 耐性を有する変異株が例示できる。 この L—リジンアナログは、 ェシェ リ ヒア属細菌の増殖を阻害するようなものであるが、 その抑制は Lーリ ジンが培地中に共存すれば、 全体的または部分的に解除されるようなも のである。 例えば、 ォキサリジン、 リジンハイ ドロキサメート、 A E C、 r—メチルリジン、 一クロロカプロラクタム等がある。 これらのリジ ンアナ口ゲに耐性を有する変異株は、 通常の人工変異操作をェシ Iリ ヒ ァ属の微生物に施すことにより得られる。 L—リジン製造に用いる菌株 として、 具体的には、 ェシエリヒア ' コ リ A J 1 1 4 4 2 ( F E R M B P— 1 5 4 3、 N R R L B— 1 2 1 8 5 ; 特開昭 5 6 — 1 8 5 9 6 号及び米国特許第 4 3 4 6 1 7 0号参照） が挙げられる。 A J 1 1 4 4 2株は、 1 9 8 1年 5月 1 日に、 通商産業省工業技術院生命工学工業技 術研究所 （郵便番号 3 0 5 曰本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号） に、 受託番号 FERM P-5084として寄託されておリ、 1 9 8 7年 1 0月 2 9日に、 この原寄託からブダぺス ト条約に基づく国際寄託へ移管され、 FEBM BP - 1543として寄託されている。 以上の微生物のァスバルトキナー ゼは、 L一リジンによるフィードパック阻害が解除されている。
その他にも、 たとえば Lースレオニン生産菌が挙げられる。 Lースレ ォニン生産菌も、 一般的にはそのァスバルトキナーゼの L一リジンによ る阻害が解除されているからである。 E. coliの L—スレオニン生産菌 としては、 VKPM B-3996株が現在知られている内で最も高い生産能を 持っている。 VKFM B - 3996株は、 1 987年 1 1 月 1 9日に USSR オール ■ ユニオン · サイェンティフィック · センタ一 'ォプ' アンチバイオ テイクス (All -Union Scientific Center of Antibiotics)
- (Nagatinskaya Street 3— A, 113105 Moscow, Russian Federation) (二、 登錄番号 R I A 1 86 7のもとに寄託されている。
上記の Lーリジン生産菌において、 Lーリジン生合成系遺伝子の増幅 の Lーリジン生合成系遺伝子を強化してもよい。 そのような遺伝子と し ては、 例えば、 ァスパラギン酸によるフィードパック阻害を解除する変 異を有するホスホェノールピルビン酸カルボキシラ一ゼをコ一ドする遺 伝子 （特公平 7— 837 1 4号公報参照） が挙げられる。
(ii) L一グルタミン酸生産菌
L一グルタミン酸生産能を有するコ リネ型細菌と しては、 コリネ型細 菌のグルタミン酸生産性野生株またはこれから誘導された変異株が挙げ られる。 このような変異株としては、 例えば、
ブレビパクテリゥム ' ラク トフアーメンタム A J 1 24フ 5 ( F E R M B P— 2922、 米国特許第 5, 272, 067号公報）
ブレビバク亍リウム ' ラク トフアーメンタム A J 1 2476 ( F E R B P— 2923、 米国特許第 5, 272, 067号公報）
ブレビバク亍リウム - フラパム A J 1 2477 ( F E RM B P— 2924、 米国特許第 5, 272, 067号公報）
コ リネバク亍リウム ' グルタミカム A J 1 2478 ( F E RM B P— 2925、 米国特許第 5, 272,067号公報）
コ リネパクテリゥム ■ グルタミカム A T C C 21 492
等がある。
また、 ェシエリヒア ' コリのし一グルタ ミン酸生産菌と しては、 ェシエリヒア . コリ A J 1 2628 (F E RM B P— 3854) ェシエリヒア ' コリ A J 1 2624 (F E RM B P— 3853、 フランス特許出願公開第 2, 680, 178号参照）
ェシエリヒア - コリ A J 1 2949 (F E RM B P— 488 1欧 州特許出願公開第 0,670, 370号参照）
等が挙げられる。
なお、 L—グルタミン酸生産性を向上させるために、 上記のグルタ ミ ン酸生産菌のグルタミン酸生合成系遺伝子を強化してもよい。 グルタ ミ ン酸生合成系遺伝子を強化した例としては、 解耱系のホスフォフルク 卜 キナーゼ （ P F K、 特開昭 63— 1 02692号） 、 アナプレロティッ ク経路のホスホェノールピルビン酸カルポキシラーゼ （P E PC、 特公 平フ一 837 1 4号、 特開昭 62— 55089号） 、 T C A回路のクェ ン酸合成酵素 （C S、 特開昭 62— 20 1 585号、 特開昭 63 - 1 1 968 8号） 、 アコニッ ト酸ヒ ドラターゼ （ACO、 特開昭 62— 29 4086号） 、 ィソクェン酸亍ヒ ドロゲナーゼ （ I C D H、 特開昭 62 一 1 6 6 8 90号、 特開昭 63— 2 1 41 89号） 、 ァミノ化反応と し てはゲルタ ミン酸デヒ ドロゲナ一ゼ （G D H、 特開昭 6 1 - 268 1 8 5号） 等がある。 （iii) し一フエ二ルァラニン生産菌
コリネホルム細菌の L—フエ二ルァラニン生産菌としては、 ブレビバ クテリ ウム ' ラク トフアーメ ンタム AJ12637 (FERM BP - 4160) (フランス 特許出願公開第 2, 686, 898号参照） 力 ェシエリヒア . コ リのし一フエ 二ルァラニン生産菌と しては、 ェシエリ ヒア ' コリ AJ 12604 (FERM BP-3579) (欧州特許出願公開第 488, 424号参照） が挙げられる。 AJ 12604株は、 t y Γ A-の宿主 E. coliに、 変異型 aroG遺伝子を含むブラ スミ ドと変異型 pheA遺伝子を含むプラスミ ドが各々導入されて得られた 形質転換株である （特開平 5— 3448 8 1号公報参照） 。 AJI C 株 は、 平成 3年 Ί 月 28日に、 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研 究所 （郵便番号 305 日本国茨城県つくば市東一丁目 Ί番 3号） に、 受託番号 FERM P- 11975として寄託されており、 平成 3年 9月 26日に、 この原寄託からブダペス ト条約に基づく国際寄託へ移管され、 ΕΈΒΜ BP-3579と して寄託されている。 実施例 以下に、 本発明の実施例を、 本発明に好適に用いられる遺伝子及び宿 主微生物の調製例と共に示して、 本発明をさらに具体的に説明する。
(実施例 1 ) d t s R遺伝子を利用した L一グルタ ミン酸生産菌 の創製及びそれを用いた L一グルタ ミン酸の製造
< 1 > d t s R遺伝子を含む温度感受性プラスミ ドの作製
ブレビパク亍リウム ' ラク トフアーメ ンタム A T C C 1 3869株 由来の d t s R遺伝子を含むプラスミ ド p D T R 6 (W095/34672号国際 公開パンフレッ ト） を保持するェシェリ ヒア ' コリ J M 1 09/p D T R 6 (プライベートナンバー A J 1 2967 ； 受託番号 F E RM B P - 4994 ) から、 前記プラスミ ドを回収した。 尚、 p D T R 6は、 ェシエリ ヒア ' コリとコリネパク亍リゥム属細菌の双方の菌体内で自律 複製可能なプラスミ ド P S A C 4をベクターとする組換えプラスミ ドで あり、 クロラムフエ二コール耐性マ一力一を有している。 また、 p D T R 6を、 界面活性剤に対する感受性が上昇したコ リネ型細菌変異株ブレ ビバク亍リウム ' ラク トフアーメンタム A J 1 1 060株に導入して得 られた形質転換株は、 界面活性剤 （ポリオキシエチレンソルビタンモノ パルミテート） に対する耐性が上昇した。
p D T R 6を制限酵素 K p n I 及び X b a I で切断し、 d t s R遺伝 子を含む D N A断片を取得した。 この D N A断片と、 K p n l 及び X b a I で切断したプラスミ ド p H S G 3 9 8 (宝酒造 （株） 製） とを、 T 4 D N Aリガーゼを用いて連結し、 p H S G X— Kを作製した。 p H S GX— Kは、 ェシエリ ヒア ' コリの菌体内で自律複製可能である。
上記のようにして得られた p H S GX— Kの K p n I 部位に、 コリネ 型細菌由来の温度感受性複製起点 （以下、 「TSori」 という） を導入し た。 禳 Soriを含む D N A断片は、 TSoriを有するプラスミ ド p H S C 4 を B a mH I 及び K p n l で切断し、 得られた D N Α断片の両末端を宝 酒造 （株） 製 Blunting kitを用い平滑化し、 Κ ρ π I リンカー （宝酒 造社製） を結合させた後自己結合させて得たプラスミ ド p K C T 4を K P n I で切断することによつた得た。 この D N A断片を p H S G X— K の K p n I 部位に挿入して、 p K C T X— Kを得た。 p H S C 4を B a mH I 及び K p π I で切断し、 得られた D N A断片の両末端を平滑化し た後、 K p n l 部位を付加したものを、 直接 p H S G X— Kの K p n I 部位に挿入することによつても、 p K C T X— Kと同じ構造を有するプ ラスミ ドカ得られる。
< 2 > d t s R遺伝子破壊株の作製
d t s R遺伝子破壊株は、 温度感受性プラスミ ドを用いた相同組換え 法によリ取得した。
まず、 遺伝子破壊に用いる欠失型 d t s R遺伝子を作製した。 d t s R遺伝子内には配列表配列番号 1 の 7 6 6番目と 1 3 6 6番目の 2箇所 に Eco52 I で消化される部位が存在する。 そこで、 p H S G X— Kを Eco52 I で完全消化した後自己結合させ、 Eco52 I 断片の 6 00塩基対を 欠失した d t s R遺伝子を含むプラスミ ド p H S G X— ΚΔΕを作製し だ。 すなわち、 p H S G X— K厶 E上の d t s R¾伝子は中央部分をィ ンフレームで欠失した構造になっている。
p H S G X— ΚΔΕに含まれる d t s R遺伝子が機能しないことは、 次のようにして確認した。 コリネ型細菌内で自律複製可能なプラスミ ド p H M 1 5 1 9 (K. Miwa et.al . , Agric. Biol. Chem. , 48,
2901-2903(1984) ) 由来の複製起点 （特公平 7— 1 08 228号公報） を p H S G X— ΚΔ E上にただ一つ存在する K p n I 切断部位に導入し た。 具体的には、 p H M 1 51 9を制限酵素 B a mH I 及び Κ ρ π I で 消化し、 複製起点を含む遺伝子断片を取得し、 得られた断片を宝酒造 (株） 製 Blunting kitを用い平滑末端化した後、 Kpn I リンカ一 （宝酒 造 （株） 製） を用いて p H S G X— ΚΔ Eの Κρη I部位に挿入し、 p K C X— ΚΔΕを取得した。 また、 対照と して p H S G 399
(Takeshita, S. et al .； Gene (1987) , 61, 63-74 L 宝ミ酉造 （株） カヽら 購入できる） を用い、 その S a I I部位に同様に S a I I リンカ一 （宝 酒造 （株） 製） を用い p H M 1 51 9の複製起点を挿入した p S A C 4 も作製した。 p KC X— K厶 Eと p S A C 4とを上記の電気パルス法を 用いてそれぞれ、 界面活性剤に対する感受性が上昇したコ リネ型細菌変 異株ブレビパクテリゥム ' ラク トフアーメンタム A J 1 1 060株に導 入し、 界面活性剤に対する耐性度をそれぞれ調べた。 方法としては、 M - C M 2 G液体培地にポリォキシエチレンソルビタンモノパルミ亍ート を 0〜 1 Omg/d I 添加しそれぞれの生育度を調べた。 その結果、 こ の欠失型 d t s R遺伝子は界面活性剤に対する耐性を付与する機能を 失っていた。
次に、 p H S G X— ΚΔ Eの K p n I 切断部位に、 p K C T 4を K p π I で切断して得られる TSoriを含む D N A断片を挿入し、 プラスミ ド p K T C X— ΚΔΕを作製した。 この p K T C X— ΚΔΕを野生株であ るブレビバク亍リウム ' ラク トフアーメンタム AT C C 1 3869に 電気パルス法を用いて導入し、 特公平 7— 1 08228号公報記載の方 法で染色体上の d t s R遺伝子を欠損型に置換した。 具体的には A T C C 1 3 86 9/ p K T C X— ΚΔΕを 50 / g/m l のォレイン酸を含 む M— C M 2 G液体培地で 25°Cにて 6時間振とう培養した後、 5 μ g ノ m I のク口ラムフエニコ一ル及び 50 u g/m Iのォレイン酸を含む M- C M 2 G培地上に撒き、 34°Cでコロニ一を形成した株をプラスミ ド組み込み株として取得した。 次にこの株から 34°Cでクロラムフエ二 コールに対して感受性になった株をレプリ力法によリ取得した。 この感 受性株の染色体を常法により取得し、 サザンハイブリダィゼーシヨン法 によリ染色体上の d t s R遺伝子の構造を調べ、 d t s R遺伝子が欠失 型に S換されていることを確認し ΔΕ株と命名した。 d t s R遺伝子の 取得及び d t S R遠伝子破壊株の作製については、 W095/23224号国際公 開パンフレッ 卜に詳述されている。
厶 E株は、 高い L一グルタミン酸生産能を示した力ぐ、 ォレイン酸要求 性を示し、 才レイン酸を含まない培地では生育できなかった。
< 3 > d t s R遺伝子を含む温度感受性プラスミ ドを保持する d t s R 遺伝子破壊株の作製
△ E株に、 完全長の d t s R遺伝子を含む温度感受性プラスミ ド p K C T X— Kを、 電気パルス法により導入し、 Δ ΕΖ ρ Κ〇 Τ Χ— Κ株を 得た。 その際、 培養は、 p K C Τ X— Κが細胞中に保持されるように、
2 5°Cで行った。
く 4〉 L一グルタミン酸の製造
次に、 厶 E株及び Δ Ε p K C T X— K株の生育及び L一グルタミン 酸生産性を比較した。 種培養及び本培養は、 5 0 0 m l 容ガラス製 ジャーファーメンタ一に 3 0 Om I づっ分注し、 加熱殺菌した培地を用 いた。 培地の成分を表 1 に示す。 培地の p Hをアンモニアガスを用いて 7. 3に維持した。 通気量は、 2/ "！ 〜 1 Z 1 V V Mと し、 8 0 0〜1
3 0 0 r p mで撹拌した。 種培養は表 2に示す培養温度で Ί 3〜1 4時 間、 本培養は表 3に示す培養温度で 3 5時間行った。 本培養中は、 5 0 g/ Lのグルコース水溶液を 5 0 ~ 1 0 0 m l フィードした。 また、 Δ E株の培養には、 ォレイン酸誘導体と して T w e e n 8 0 (ポリオキシ エチレンソルビタンモノゾくルミテート） を 1 m g/m l 添加した。 培養後の培養液を 5 1倍希釈した液の 6 2 0 n mでの吸光度
(OD620) 、 L—グルタミン酸 （glu) の蓄積量 （溏度 （g/dl) ) 及び培 養時間を表 2及び表 3に示す。
表 1
Figure imgf000032_0001
) ： 大豆蛋白酸加水分解物（総窒素 3.49g OOmLのものを使用 表 2
Figure imgf000032_0002
+1) ： T w e e n 80 (l mg/ml) の添加の有無を示す
*2) ： 25。Cで 1 0時間培養後に 34 °Cに温度シフ 卜した を示す •3) ： 生育しなかったことを示す 表 3
Figure imgf000033_0001
÷1) ： T w e e n 80 (1 mg/ml) の添加の有無を示す
-2) ： 表 2に示す種培養で得られた菌体を用いたことを示す 以上の結果から、 △ EZ p K C T X— K株は Δ E株に比べて、 種培養 では L—グルタミン酸の生成量は少ないが生育がよく、 本培養では L— グルタ ミン酸生成量が多いことが明らかである。 つまり、 Δ Ε/p KC T X— Kは、 低温培養条件下ではプラスミ ド上の d t s R遺伝子が機能 するために生育がよく、 高温培養条件下では d t s R遺伝子が脱落する ので L一グルタミン酸が効率よく生成される。
(実施例 2) H D遺伝子を利用した L一リジン生産菌の創製及び それを用いた L一りジンの製造
< 1 > H D遺伝子を含む温度感受性プラスミ ドの作製
( 1 ) コ リネ型細菌の H D遺伝子の単離
ブレビバク亍リウム ' ラク トフアーメンタム AJ12036株 （FERM BP-734) から、 次のようにして H D遺伝子を単離した。
H D遺伝子の塩基配列は、 コリネパクテリゥム · グルタ ミカムにおい て報告されており (Peoples, 0. P. et al; Molecular Microbiology 2(1) 63-72 (1988) ) 、 ブレビパク亍リウム ■ ラク トフアーメンタムと コリネパクテリゥム · グルタミカムの各々の H D遺伝子の配列は類似性 が高いことが予想されたので、 コリネパクテリウム · グルタミカムの配 列を基に P C R法に用いる合成プライマー D N Aを作製した。
ブレビパク亍リウ厶 . ラク トフアーメンタム AJ12036株から染色体 D N Aを調製した。 この染色体 D N Aから H D遗伝子を含む約 1500bpの D N A断片を P CR法によリ增幅するために、 A B I 社製 D N A合成機 model381A型を用いて、 5 ' 側プライマ一 H I
(841) 5'-CTGGGAAGGTGAATCGAATT-3' (860) ： 配列表配列番号 5 ) 及び 3 ' 側プライマー H 2 ( (2410) 5'-TCCGAGGTTTGCAGAAGATC-3' (2391) ： 配列表 配列番号 6 ) の 2種類のプライマ一を合成した。 尚、 かっこ内の数字は Peoplesらカ《発表した塩基配列 （Peoples, 0. P. et al. , Molecular Microbiology 2(1) 63-72 (1988) ) における位 Sを示す。 得られた合成 プライマ一は、 逆相 H P L Cにて精製した。
P C R反応は、 P C R増幅装置 （D N Aサ一マルサイクラー PJ2000 ： 宝酒造 （株） ） 及び P C Rキッ ト （Takara GeneAmpTM kit： 宝酒造 (株） ） を用い、 表 4に示す組成で行った。 表 4
Figure imgf000034_0001
P C R反応における D N Aの変性、 D N Aのアニーリング、 及びポリ メラーゼ反応の条件は、 各々 94°C、 1分、 37で、 2分、 75°C、 3分とし、 各温度間の遷移は 1秒で行った。 この反応サイクルを 25サイクル緣返す ことにより D N Aの増幅を行った。 こう して得られた増幅反応生成物の 大きさをァガロースゲル電気泳動により確認した結果、 約 1.4Kbpの D N A断片の増幅が認められた。
こう して得られた増幅断片を K p n I で切断して得られる D N A断片 を、 ベクタープラスミ ト *pHSG399 (Takeshita, S. et al . ; Gene (1987) , 6 1,63 - 74参照、 宝酒造 （株） 製から購入できる） の Kpnl部位に挿入して 組換えプラスミ ドを pHDWと命名し、 このプラスミ ドを E. coli JM109株 に導入して形質転換体を得た。 ― - こう して得られたブレビバクテリウム ' ラク トフアーメンタム
AJ12036株の H D遺伝子断片の塩基配列の決定をダイデォキシ法により 行った。 決定された塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を配列表配列 番号 3及び 4に示す。
(2) H D遺伝子の温度感受性プラスミ ドへの導入
H D遺伝子を含むプラスミ ド pHDWを K p π I で消化して H D遺伝子断 片を切リ出し、 これを K p n Iで消化した p H S G 399 (宝酒造 (株） 製） に T 4 D N Aリガーゼを用いて連結し、 プラスミ ド p H DW を得た。
上記のようにして得られた P H DWの B a mH I 部位に、 TSoriを導 入した。 TSoriを含む D N A断片は、 p H S C 4を B a mH I 及び K p n I で切断することによって得た。 この D N A断片の両末端を平滑末端 化した後、 B a mH I 部位を付加したものを、 p H DWの B amH I部 位に挿入し、 p T S H Dを得た。
< 2 > H D遺伝子破壊株の作製
H D遺伝子破壊株を、 温度感受性プラスミ ドを用いた相同組換え法に より取得した。
まず、 遺伝子破壊に用いる欠失型 H D遺伝子を作製した。 野生型 H D 遺伝子を有するプラスミ ド pHDWを Aatllで切断した後自己連結し、 H D遺伝子内に存在する 2つの Aatll 部位 （配列番号 3において塩基番 号 716〜721、 1082-1087) 間を欠失させることによリー部を欠失した H D遺伝子 （HD-△遺伝子） を含むプラスミ ドを作製した。 このプラスミ ドを Κ ρ π I で切断して HD- Δ遺伝子断片を得、 これを pHSG398 の K p n I 部位に挿入し、 さらに TSoriを有する D N A断片を B a mH I 部位に挿入することにより、 HD-Δ遺伝子置換用プラスミ ド pTSHDAを 構築した。 TSoriを有する D NA断片は、 p H S C 4を制限酵素 K p n I にて切断して得られる D N A断片の両末端を DMA Blunting kit (宝酒 造 （株） 製） で平滑末端化した後、 B a mH I リンカ一 （宝酒造 （抹） 製） を接続することにより、 B a mH I のみによる切断によって切り出 される様改変したプラスミ ドから調製した。
上記で得られた欠失型 H D遺伝子 S換用プラスミ ド pTSHDAを用いて、 ブレビパクテリゥ厶 · ラク トフアーメンタム AJ11446株の形質耘換を、 踅気パルス法 （杉本ら，特開平 2-20フフ91号公報） によって行った。 尚、 AJ11446株は、 特公昭 62— 24073に記載される Lーリジン生産菌 であり、 1 979年 8月 23日より通商産業省工業技術院生命工学工業 技術研究所 （郵便番号 305 曰本国茨城県つくば市東一丁目 Ί番 3 号） に F E RM P— 5 1 63の受託番号で寄託されている。
得られた形質転換株を、 M- CM2G培地を用いて 25°Cにてフルグロ一ス (約 l〜2X109/ml) になるまで培養した。 培養菌体を、 プレート 1枚あ たり 105細胞となるよう希釈し、 クロラムフエニコ一ル （ 5 ig/mL) を 含む M-CM2G平板培地にまき、 34°Cにて 2〜7日培養してコロニ一を取得し た。 得られたコロニーについて、 細胞中にプラスミ ドが含まれていない ことを確認し、 さらに直鎖状の pHSG398をプローブに用いたサザン · ハ イブリダィゼーシヨン解析により、 遺伝子置換用プラスミ ドの染色体へ の組込みを確認した。
次に、 欠失型 H D遺伝子のみを染色体に残すために、 野生型 H D遺伝 子及びべクタ一を染色体 D N Aから脱落させて、 変異型 H D遺伝子置換 株及び欠失型 H D遺伝子置換株を得た。 野生型 H D遺伝子及びベクター の脱落は次のようにして行った。
各組込み株を、 クロラムフ I二コール （lO g/mL) を含む M-CM2G培地 で 34°Cにてフルグロース （1~2 X 109/πιΙ) になるまで培養した。 培養菌 体を、 ク口ラムフエ二コールを含まない M-CM2G平板培地に 1枚あたリ 50〜200 コロニーとなるようにまき、 34°Cにて培養した。 生育したコロ ニーを、 クロラムフエ二コール （5 g/mL) を含む M- CM2G平板培地にレ プリカし、 34°Cにて培養してク口ラムフエ二コール感受性株を取得した 得られたク口ラムフエ二コール感受性株の染色体からベクターが脱落し ていることを、 サザン · ハイブリダイゼーションによリ確認し、 さらに 欠失型 H Dを発現していることを確認した。 また、 得られた株がメチォ ニン要求性及びスレオニン要求性を示すことを確認した。 こう して得ら れた遺伝子破壊株を H D A株と命名した。 H D Δ株の染色体 D N Aの塩 基配列決定によリ、 遺伝子が欠失型であることを確認した。
< 3 > H D遺伝子を含む温度感受性プラスミ ドを保持する H D遺伝子破 壊株の作製
H D A株に、 完全長の H D遺伝子を含む温度感受性プラスミ ド p T S H Dを、 電気パルス法により導入し、 H D ΔΖ p T S H D株を得た。 そ の際、 培養は、 p T S H Dが細胞中に保持されるように、 25°Cで行つ < 4〉 L一リジンの製造 次に、 H D△株及び H D Δ/ p T S H D株の生育及び L—リジン生産 性を比較した。 種培養及び本培養は、 500m l容ガラス製ジャー フアーメンターに 300m I づっ分注し、 加熱殺菌した培地を用いた。 培地の成分を表 5に示す。 培地の p Hをアンモニアガスを用いて 7. 3 に維持した。 通気置は、 2 1 ~ 1 Z1 V VMとし、 800〜 "！ 300 r p mで授拌した。 種培養は表 5に示す培養温度で 1 5〜 25時間、 本 培養は表 6に示す培養温度で 30時間行った。 また、 H D厶株の培養に L一メチ才ニン及びしースレオニンを添加する場合には、 各々 70 m g / d I 添加した。 比較のため、 親株である AJ11446についても同様に培 養を行った。
培養後の培養液を 51倍希釈した液の 620 n mでの吸光度
(OD620) 、 L一リジン （lys) の蓄積量 度 (g/dl) ) 及び培養時間 を表 6及び表 7に示す。 表 5
Figure imgf000037_0001
■1) ： 大豆蛋白酸加水分解物（総窒素 3.49g/100mLのものを使用） 表 6
Figure imgf000038_0001
*1) ： L-メチォニン及び L-スレオニン （フ01^/1111づっ） の添加の有無を 示す
*2) ： 2 5°Cで 1 0時間培養後に 3 4 °Cに温度シフ トしたことを示す *3) ： 生育しなかったことを示す
7
Figure imgf000038_0002
*1) ： L-メチォニン及び L-スレオニン （70nig/mlつつ） の
添加の有無を示す
*2) ： 表 2に示す種培養で得られた菌体を用いたことを示す 以上の結果から、 H D Δ/ p T S H D株は H D△株に比べて、 種培養 では L一リジンの生成 *は少ないが生育がよく、 本 ½養では L一リジン 生成量が多いことが明らかである。
(実施例 3) 一 K G D H遺伝子を利用した L—グルタミン酸生 産菌の創製及びそれを用いた L—グルタミン酸の製造
< 1 > ひ一 KGD H遺伝子を含む温度感受性プラスミ ドの作製
( 1 ) ひ一 KGD H遺伝子の単離
( i ) プローブの調製
大腸菌と枯草菌のひ一 KGD H ■ E 1サブュニッ ト遺伝子間で相同性 の高い領域を選び、 配列表配列番号 9及び 1 0に示すオリゴヌクレオチ ドをホスホアミダイ ド法により D N A合成装 (アプライ ドバイオシス テム社製モデル 394 ) を用いて合成した。
プライマーとして該オリゴヌクレオチド 0. 25 mo I e、 錶型と して常法によって調製したバチルス ズブチリス N A 64 (同株はバ チルス · ジェネティック ， ストック ， センター （米国オハイオ州立大 学） よリ入手した） の染色体 D N A 0. 1 g及びタック D N Aポリメ ラ一ゼ （宝酒造社製） 2. 5ユニッ トを d AT P、 d C T P、 d GT P、 丁丁 各200 1\1、 塩化カリウム 50mM、 塩化マグネシウム 1. 5 1\1及びゼラチン0. 0001 %を含有する 1 OmMトリス一塩酸緩 衝液 （ p H 8 , 3 ) 0. 1 m lに添加し、 94°Cを 1分、 55°Cを 2分、 72 °Cを 3分のサイクルを 30回繰り返す P C R法を行った。 反応液を ァガロースゲル電気泳動に供し、 目的とする D N A断片をグラスバウ ダー （宝酒造社製） を用いて回収した。 この D N A断片をクレノウフラ グメント （アマシャム社製） と [ひ一 32P] d CT P (アマシャム社製） を用いたラベル化の常法に従って摞識し、 プローブとして用いた。
(ii) ブレビバク亍リゥム ' ラク 卜フアーメンタム A T CC 1 386 9の染色体 D N A断片の調製
パク ト · 卜リプトン （ディフコ社製） 1 %、 パク ト ■ ィース卜エキス トラク ト （ディフコ社製） 0. 5%及び塩化ナトリウム 0. 5%から成 る T一 Y培地 （p H 7. 2) 500m l に、 ブレビパクテリゥム · ラク トフアーメンタム A T C C 1 3869を接種し、 31. 5°Cで 6時間 培養し培養物を得た。 この培養物を 5, 000 r pmで 1 0分間遠心分 離処理し沈濺物として湿菌体 2 gを得た。
該菌体から斉藤、 三浦の方法 (Biochem. Biophys . Acta., 72, 619, (1963)) により染色体 D NAを抽出した。 この染色体 D N A 2 s及び 制限酵素 E c o R I 200ュニッ トを 1 OmM塩化マグネシウム、 Ί 0 OmM塩化ナトリウム及び 1 mMジチオスレィ トールを含有する 50m M卜リス一塩酸緩衝液 （ p H 7. 5) におのおの混合し、 温度 37°Cで 1 5時間反応させた。 反応終了液を常法によリフエノール抽出処理し、 エタノール沈濺処理して E c 0 R Iで消化されたブレビパクテリゥム - ラク トフアーメンタム A T CC 1 386 9の染色体 D N A断片を得た。
(iii) ブレビパクテリゥム ■ ラク トフアーメンタム . A T C C 1 38 69の 一 KGD H遺伝子の単離
プラスミ ドベクター p U C I 8 (宝酒造社製） 1 μ g及び制限酵素 Ε c o R I 20ユニッ トを 1 OmM塩化マグネシウム、 Ί 0 OmM塩化ナ トリウム及び 1 mMジチオスレィ トールを含有する 50mMトリス一塩 酸緩衝液 （ p H 7. 5 ) に混合し、 温度 37eCで 2時間反応させて消化 液を得、 該液を常法によリフヱノール抽出及びエタノール沈激した。 こ の後、 プラスミ ドベクター由来の D N A断片が再結合するのを防止する ァこめ、 Molecular Cloning 2nd edition (J. Sambrook, E . F, Fritsch and T . Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, pi .60 (1989) ) の方法でバク亍リアル · アル力リフォスファターゼ処理によリ D N A断片の脱リン酸化を行い、 常法によりフ： cノール抽出処理し、 ェ タノール沈澱を行なった。
この E c o R Iで消化された p U C 1 8を 0. 1 g、 （ii) で得ら れた E c o R Iで消化されたブレビパクテリゥム， ラク トフアーメンタ ム A T C C 1 386 9の染色体 D N A断片 1 g及び T 4 D N Aリ ガーゼ 1ユニッ ト （宝酒造社製） を 6. 6 mM塩化マグネシウム、 1 0 mMジチオスレィ トール及び 1 OmMアデノシン三リン酸を含有する 6 6 mM トリスー塩酸緩衝液 （ p H 7. 5 ) に添加し、 温度 1 6 で 8時 間反応し、 D N Aを連結させた。 次いで該 D N A混合物で、 常法により ェシェリ ヒァ · コ リ J M l 09 (宝酒造社製） を形質転換し、 これを 1 00 / g/m I のアンピシリンを含む L寒天培地上にまき、 約 1 0, 000個の形質転換体を得た。
得られた形 転換体から、 Molecular Cloning 2nd edition (J.
Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, pi.90 (1989) ) の方法により、 ( i ) で得られたプ ローブ D N Aとハイブリダイズする形質転換体を選択した。
(iv) ブレビパク亍リウム - ラク トフアーメンタム A T CC 1 386 9のひ一 KGD H遺伝子の塩基配列の決定 (iii) により得られた形 g車云換体力ヽら Molecular Cloning 2nd edition (J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, pi.25(1989) ) S己載のァ レ力リ溶菌法 Iこよ リプラスミ ド D N Aを調製した。 該プラスミ ド D N Aはブレビパクテリ ゥム ' ラク トフアーメンタム A T C C 1 3869の染色体 D N A由来 の約 6キロベースの D N A断片を含んでいた。 該プラスミ ドを （iii) の反応組成で制限酵素 E c o R I及び X h o I で切断し、 常法に従いァ ガロースゲル電気泳動を行い （iii) と同様にしてサザンハイブリダィ ゼーシヨンを行いプローブ D N Aとハイブリダィズする断片を同定した。 その結果、 E c o R I及び X h o I に切断された約 3キロべ一スの切断 断片がハイブリダィズすることが判明した。 該 D N A断片を （iii) で 行ったように E c o R I及び X h 0 I で切断したプラスミ ドベクター p H S G 397 (宝酒造社製） に連結しクローン化した。 得られたプラス ミ ド D N Aを用いて該 D N A断片の塩基配列の決定を行った。 塩基配列 の決疋は、 Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (ァプフィ ドバイォケミカル社製） を用い Sangerの方法 （J. Mol. Biol., 143, 161 (1980) ) に従って行った。
得られたり N A断片は完全なオープン ■ リーディング · フレームを含 んでいなかつたため、 （iii) で行ったようにブレビバクテリウム · ラ ク トフアーメンタム A T C C 1 386 9の染色体 D N を X h 0 I で 切断し P H S G397に連結した組換え体プラスミ ドで形質転換を行い、
(ii) で得られたブレビパクテリゥム · ラク トフアーメンタム A T C C 1 386 9の染色体 D N A由来の約 3キロベースの E c o R I 、 X h
0 I 切断断片を （ i ) の方法に従いラベル化したものをプローブとして ハイブリダィズする形質転換体を選択した。 得られた形質転換体の有す るプラスミ ドは約 9キロベースの D N A断片を含んでいた。 この D N A 断片を含む遺伝子の制限酵素地図を図 2に示した。 該プラスミ ドを
(iii) の反応組成で制限酵素 S a I I 及び X h o 1 で切断し、 常法に 従いァガロースゲル電気泳動を行い （iii) の方法によリハイブリダィ ズする断片を同定した結果、 約 4. 4キロベースの断片であることが判 明した。 該 D N A断片を （iii) で行ったように S a I I 及び X h o I で切断したプラスミ ドベクター P H SG 397に連結しクローン化した。 このプラスミ ドを p H S GS— Xと命名した。 該プラスミ ドが含む S a
1 I及び X h o I切断断片中 S a I I切断点から E c o R I 切断点まで の約 Ί . 4キロベースの D N A断片の塩基配列の決定を上記と同様にし て行った。
こう して得られた S a 1 I 及び X h o I 切断遗伝子断片の塩基配列は 配列表配列番号 7に示す通りである。 オープン · リーディング · フレー ムを推定し、 その塩基配列より推定される産物のァミノ酸配列を配列表 配列番号 7及び配列番号 8に示した。 すなわち、 配列表配列番号 8示さ れるアミノ酸配列から成る蛋白質をコ一ドする遗伝子が、 ブレビパクテ リウム ' ラク トフアーメンタム A T C C 1 3 8 6 9のひ一 K G D H遺 伝子である。 なお、 蛋白質の N末端にあるメチォニン残基は開始コ ドン である A T Gに由来するため蛋白質本来の機能とは無関係であることが 多く、 詡訳後べプチダーゼの働きにより除去されることがよく知られて おり、 上記蛋白質の場合にもメチォニン残基の除去が生じている可能性 がある。
塩基配列、 アミノ酸配列おのおのについて既知の配列との相同性比較 を行った。 用いたデータベースは E M B L及び SW I S S— P R O Tで ある。 その結果、 配列表配列番号 7に示される D N A及びそれにコード される蛋白質は、 既に報告済みの大腸菌及び枯草菌の or— K G D H · E 1サブュニッ ト遺伝子等と相同性を持つ蛋白質であることが判明した。 本遺伝子のコ一ドする蛋白質は、 N末端のメチォニン残基を含めて 1 , 2 5 7個のアミノ酸から成り、 既に報告のあるひ一 K G D Hとは大きく 異なる特徴を有していた。 すなわち、 C末端側の約 90 0アミノ酸は 種々の E 1 サブュニッ 卜と高い相同性を示したが、 N末端側の 3 0 0ァ ミノ酸は他種 一 K G D Hには見られないものであり、 本蛋白質が特殊 な機能を持つことを示唆するものである。 この N末端側 3 0 0アミノ酸 部分を既知の配列との相同性比較を行うと大腸菌ゃァゾトパクター属細 菌の E 2サブユニッ トとの相同性が認められた。 これは、 本蛋白質が他 種ひ一 K G D Hとは異なり、 E 1、 E 2両方の活性を持つ可能性を示唆 するものである。
また、 本遺伝子オープン · リーディング ' フレーム上流には大腸菌に 見られるプロモーター共通配列に類似した配列 （281-286及び 307-312) 及びコ リネ型細菌のリボゾーム結合配列と類似した配列 （422-428) が 見いだされた。 本遺伝子オープン■ リ一ディング ' フレーム下流には、 転写の終結シグナルと類似したス亍ム&ループ構造 （4243-4281) がみ られた。 これらの配列は本遗伝子が独立して転写、 翻訳を受けており、 他種ひ一 K G D Hとは異なった遗伝子構造を持っていることを示唆する ものである。 (2 ) ひ一 K G D H遗伝子の温度感受性プラスミ ドへの導入
上記のようにして得られた p H S G S— Xを制限酵素 B a mH I及び S a I I で切断し、 ひ一 K G D H遺伝子を含む D N A断片を得た。 この D N A断片と、 B amH I 及び S a l 1 で切断したプラスミ ド p H S G 299 (宝酒造 （株） 製） とを T 4 D N Aリガーゼを用いて連結し、 p H S G S - X ' を作製した。
p H S GS— X ' の B amH I部位に、 コリネ型細菌由来の TSoriを 導入した。 TSoriを含む D N A断片は、 p H S C 4を B a mH I及び K P n I で切断し、 得られた D N A断片の両末端を平滑末端化した後、 B a mH I リンカーを結合させて得たプラスミ ド p T BC T 4を B amH I で切断することによって得た。 この D N A断片を p H S G S— X ' の B a mH I 部位に挿入してプラスミ ド p B K T S— Xを得た。
< 2 >ひ一 K GD H遺伝子欠損株の作製
ひ一 KG D H遺伝子破壊株は、 温度感受性プラスミ ドを用いた相同組 換え法により取得した。 具体的には、 一 K G D H遺伝子内には配列表 配列番号 7の 1340番目と 3266番目の 2箇所に K p n I で消化される部位 が存在する。 そこで、 上記で得られた p H S GS— Xを K p ηιで部分 消化したのち自己結合させ、 K p ηι新片の 1926塩基対を欠失したブラ スミ ド p H SGS— ΧΔΚを作製した。 p H 563—乂厶1 上のひー GD H遺伝子は中央部分を欠失した構造になっている。 次に p H S GS 一 ΧΔ Kの B a mH I 認識部位に、 Tsoriを導入し、 プラスミ ド p B T S - X Δ Kを作製した。 具体的には、 p H S C 4を制限酵素 K p n I で 消化し、 D N A平滑末端化キッ ト （宝酒造社製、 Blunting kit) を用い 平滑末端化した後、 B a mH I リンカ一 （宝酒造社製） を結合させた後 自己結合させて得たプラスミ ドを制限酵素 B a mH ！ で消化し、
TSoriを含む遺伝子断片を取得し、 これを p H SG S— ΧΔΚの B a m H I 部位に挿入しプラスミ ド p B T S— X Δ Kを取得した。
このプラスミ ドをコリネ型 Lーグルタ ミン酸生産菌の野生株であるブ レビパクテリゥム■ ラク トフアーメンタム AT C C 1 3869に電気 パルス法 （特開平 2— 207791号） を用いて導入し、 染色体上の -K G D H遺伝子を欠失型に S換した。
具体的には、 プラスミ ドが導入された A T C C 1 3869/p BT S 一 Χ Δ Κを CM2 G (ポリペプトン 1 %、 酵母エキス 1 %、 塩化ナトリ ゥム 0. 5%、 グルコース 0. 5%、 ρ Η 7. 2) 液体培地で 25 °Cに て 6時間振とう培養した後、 5 gZm I のクロラムフエ二コールを含 む CM 2 G寒天培地上に撒き、 34 °Cで培養して形成したコロニ一をプ ラスミ ド組み込み株と して取得した。 次に、 この株から 34 °Cでクロラ ムフエニコ一ルに対して感受性になった株をレプリカ法によリ取得した。 この感受性株から染色体上のひ一 K G D H遣伝子の塩基配列を調べ、 ひ — KG D H遺伝子が欠失型に S換されていることを確認し、 これを A S 株と命名した。 A S株のひ- KGD H活性を測定したところ、 活性は全 く検出されなかった。
<3 > Qf - KGD H遺伝子を含む温度感受性プラスミ ドを保持する -
KGD H遺伝子破壊株の作製
A S株に、 完全長のひ 一 KG D H遺伝子を含む温度感受性プラスミ ド p B K T S - Xを電気パルス法によリ導入し、 A SZp B K T S— X株 を得た。 その際、 培養は、 p B K T S— Xが細胞中に保持されるように、
25 °Cで行った。
< 4 > Lーグルタミン酸の製造
A S株と A SZp B K T S— X株の生育及びし一グルタミン酸生産性 を比較しした。 種培養及び本培養は、 坂ロフラス =]に 2 Om I づっ分注 し、 加熱殺菌した培地を用いた。 培地の成分を表 8に示す。 種培養は表
9に示す培養温度で残糖がなくなるまで、 本培養は表 9に示す培養温度 で 23時間、 振盪して行った。
培養後の培養液を 5 1倍希釈した液の 620 nmでの吸光度
(OD620) 、 L—グルタミン酸 （glia) の蓄積量 （漉度 （g/dl) ) 、 残糖 量 （cr/dl) を表 9に示す。
表 8
Figure imgf000045_0001
1) ： 大豆蛋白酸加水分解物（総窒素 3.49g八 OOmLのものを使用: 表 9
Figure imgf000045_0002
*1) ： 25。Cで 7時間培養後に 35 °Cに温度シフ トしたことを示す 以上の結果から、 厶 p B K T S— X株は厶 S株に比べて、 25°C での生育が非常によく、 本培養では、 L グルタミン酸生成量が多いこ とが明らかである。 つまり、 △ S Z p B K T S— X株は、 低温培餐条件 では、 プラスミ ド上の 一 K G D H遺伝子遺伝子が機能するために生育 がよく、 高温条件下ではひ一 K G D H欠損株となり、 L一グルタミン酸 が効率よく生成される。 産業上の利用可能性
本発明の微生物は、 目的物莨の産生に不利に作用する遺伝子であって、 特に微生物の生育にとっては有利に作用する遺伝子の、 染色体外での保 持及び脱落を制御することができる。 本発明の微生物を目的物質の発酵 生産に用いることによって、 目的物莨を効率よく製造することができる。 配列表
出願人氏名又は名称 ： 味の素株式会社、 桑原陽子、 木村英一郎、 河原義 雄、 中松亘
発明の名称 ：発酵法による目的物質の製造法
整理番号 ： B— 3 1 8
出願日 ： 平成 9年 6月 4日
優先権番号：特許願平成 8年 1 5 5 5 7 5号
優先日 ： 平成 8年 6月 "！ 7曰
配列の数 ： 1 0 配列番号 ： 1
配列の長さ ： 2855
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： GenomicDNA
配列の特徴
特徴を表わす記号： CDS
存在位 S： 359 . . 1987
配列
GATCTTGGAA CTCGACAGTT TTCACCGTCC AGTTTGGAGC GCCTGAGCTT GCAAGCTCCA. 60 GCAAGTCAGC AT AG GGAG CCTGTCA rT TTTCGE¾AAT GACCTGGCCA AAGTCACCG 120 TTTGGAGZAA TT TTCCTTC AGGAGCTCAA CGTTTAGCGG CTCTCTGGAT CGTGRAATGT 180 CAACGTTC¾T GGAAGCCAAT GTAGTGGGGT CGCGTCGAAA AGCGCGCTTT AAGGG03 L 240 CGCCCAAAAA. GTTTTACCTT TAAAAACTA CCGCACGCAG CACGAACCTG TTCAGTGATG 300 TAAATCACCG CGGAAA ATT GTGGA GTTA CCCCCGCCTA CCGCTACGAT TTCAAAAC 358 ATG ACC ATT TCC TCA CCT TTG ATT GAC GTC GCC AAC CTT CCA. GAC MC 406 Met Thr lie Ser Ser Pro Leu lie Asp Val Ala Asn Leu Pro Asp lie
1 5 10 15
AAC ACC ACT GCC GGC AAG ATC GCC GAC CTT AAG GCT CGC CGC GCG GAA 454 Asn Thr Thr Ala Gly Lys lie Ala Asp Leu Lys Ala Arg Arg Ala Glu
20 25 30
GCC CAT TTC . CCC ATG GGT GAA AAG GCA. GTA GAG AAG GTC CAC GCT GCT 502 Ala His Phe Pro Met Gly Glu Lys Ala Val Glu Lys Val His Ala Ala
35 40 45
GGA. CGC CTC ACT GCC CGT GAG CGC TTG GAT TAC TTA CTC GAT GAG GGC 550 Gly Arg Leu Thr Ala Arg Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Gly
50 55 60
TCC TTC ATC GAG ACC GAT CAG CTG GCT CGC CAC CGC NZC ACC GCT TTC 598 Ser Phe. lie Glu Thr Asp Gin Leu Ala Arg His Arg Thr Thr Ala Phe
65 70 75 80
GGC CTG GGC GCT AAG CGT CCT GCA GAC GGC ATC GTG NZC GGC TGG 646 Gly Leu Gly a Lys Arg Pro Ala Thr Asp Gly lie Val Thr Gly Trp
85 90 95
GGC ACC ATT GAT GGA CGC GAA. GTC TGC ATC TTC TCG CAG GAC GGC ¾CC 694 Gly Thr lie Asp Gly Arg Glu Val Cys He Phe Ser Gin Asp Gly Thr
100 105 110
GTA TTC GGT GGC GCG CTT GGT GAG GTG TAG GGC GAA. AAG ATG ATC AAG 742 Val Phe Gly Gly Ala Leu Gly Glu Val Tyr Gly Glu Lys Met lie Lys
115 120 125
ATC ATG GAG CTG GCA ATC GAC ACC GGC CGC CCA TTG ATC GGT CTT ΤΆ0 790 lie Met Glu Leu Ala lie Asp Thr Gly Arg Pro Leu lie Gly Leu Tyr
130 135 140
GAA GGC GCT GGC GCT CGC MT CAG GAC GGC GCT GTC TCC CTG GAC TTC 838 Glu Gly Ala Gly Ala Arg lie Gin Asp Gly Ala Val Ser Leu Asp Phe
145 150 155 160
ATT TCC CAG ACC TTC TAC CAA AAC ATT CAG GCT TCT GGC GTT ATC CCA. 886 lie Ser Gin Thr Phe Tyr Gin Asn lie GLn Ala Ser Gly Val lie Pro
165 170 175 CAG ATC TCC GTC ATC ATG GGC GCA TGT GCA GGT GGC AAC GCT TAC GGC 934 Gin lie Ser Val He Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Asn Ala Tyr Gly
180 185 190
CCA GCC CTG ACC G¾C TTC GTG GTC ATG GTG GAC AAG ACC TCC AAG ATG 982 Pro Ala Leu Thr Asp Phe Val Val Met Val Asp Lys Thr Ser Lys Met
195 200 205
TTC GTT ACC GGC CCA. GAC GTG ATC AAG ACC' GTC ACC GGC GAG GAA ATC 1030 Phe Val Thr Gly Pro Asp Val lie Lys Thr Val Thr Gly Glu Glu lie
210 215 220
?£C CAG GAA GAG CTT GGC GGA. GCA. ACC ACC CAC ATG GTG NZC GCT GGC 1078 Thr Gin Glu Glu Leu Gly Gly Ala Thr Thr His Met Val Thr Ala Gly
225 230 235 240
AAC TCC CAC TAC ACC GCT GCG ACC GAT GAG GAA GCA. CTG GAT TGG G A 1126 Asn Ser His Tyr Thr Ala Ala Thr Asp Glu Glu Ala Leu Asp Trp Val
245 250 255
CAG GAC. CTG GTG TCC TTC CTC CCA. TCC AAC AAT CGC TCT TAC ACA CCA 1174 Gin Asp Leu Val Ser Phe Leu Pro Ser Asn Asii Arg Ser Tyr Thr Pro
260 265 270
CTG GAA. GAC TTC GAC GAG GAA GSA GGC GGC GTT GAA GAA AAC ATC PCC 1222 Leu Glu Asp Phe Asp Glu Glu Glu Gly Gly Val Glu Glu Asn lie Thr
275 280 285
GCT GAC GAT CTG AAG CTC GAC G?£ ATC ATC CCA. GAT TCC GCG ACC GTT 1270 Ala Asp Asp Leu Lys Leu Asp Glu lie lie Pro Asp Ser Ala Thr Val
290 295 300
CCT TAC GAC GTC CGC GAT GTC ATC GAA TGC CTC ACC GAC GAT GGC GAA. 1318 Pro Tyr Asp Val Arg Asp Val lie Glu Cys Leu Thr Asp Asp Gly Glu
305 310 315 320
TAC CTG GAA. ATC CAG GCA GAC CGC GCA. GAA AAC GTT GTT ATT GCA. TTC 1366 Tyr Leu Glu lie Gin Ala Asp Arg Ala Glu Asn Val Val lie Ala Phe
325 330 335
GGC CGC ATC GAA GGC CAG TCC GTT GGA. TTT GTT GCC MC CAG CCA PCC 1414 Gly Arg lie Glu Gly Gin Ser Val Gly Phe Val Ala Asn Gin Pro Thr
340 345 350
CAG TTC GCT GGC TGC CTG GAC ATC GAC TCC TCT GAG AAG GCA GCT CGC 1462 Gin Phe Ala Gly Cys Leu Asp lie Asp Ser Ser Glu Lys Ala Ala Arg 355 360 365
TTC GTC CGC ACC TGC GAC GCG ΤΊΤ ΆΝΖ ATC CCA. ATC GTC ATG CTT GTC 1510 Phe Val Arg Thr Cys Asp Ala Phe Asn He Pro lie Val Met Leu Val
- 370 375 380
GAC GTC CCC GGC TTC CTT CCA GGC GCA GGC CAG GAG TAT GGT GGC ATC 1558 Asp Val Pro Gly Phe Leu Pro Gly Ma Gly Gin Glu Tyr Gly Gly lie
385 390 395 400
CTG CGT CGT GGC GCA ΆΆΟ CTG CTC TAC GCA TAG GGC GPA GCA？ £C GTT 1606 Leu Arg Arg Gly Ala Lys Leu Leu Tyr Ala Tyr Gly Glu Ala Thr Val
405 410 415
CCA. AAG ATT？ CC GTC PCC ATG CGT RP£ GCT TAC GGC GGA GCG TAC TGC 1654 Pro Lys He Thr Val Thr Met Arg Lys Ala Tyr Gly Gly Ala Tyr Cys
420 425 430
GTG ATG GGT TCC ΆΝ3 GGC TTG GGC TCT GAC ATC CTT GCA TGG CCA 1702 Val Met Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ser Asp He Asn Leu Ma Trp Pro
435 440 445
ACC GCA CAG ATC GCC GTC ATG GGC GCT GCT GGC GCA GTC GGA TTC ATC 1750 Thr Ala Gin lie Ala Val Met Gly Ala Ala Gly Ala Val Gly Phe lie
450 455 460
TAC CGC AAG GAG CTC ATG GCA GCT GAT GCC AAG GGC CTC GAT ACC GIA 98 Tyr Arg Lys Glu Leu Met Ma Ala Asp Ala Lys Gly Leu Asp Thr Val
465 470 475 480
GCT CTG GCT RAG TCC TTC GAG CGC GAG TAC GAA. GAC CAC ATG CTC ΆΆΩ 1846 Ala Leu Ala Lys Ser Phe Glu Arg Glu Tyr Glu Asp His Met Leu Asn
485 490 495
CCG TAC CAC GCT GCA. GAA. CGT GGC CTG JYTC GAC GGC GTG ATC CTG CCA 1894 Pro Tyr His Ala Ala Glu Arg Gly Leu He Asp a Val lie Leu Pro
500 505 510
AGC GAA ACC CGC GGA CAG ATT TCC CGC AAC CTT CGC CTG CTC MG CAC 1942 Ser Glu Thr Arg Gly Gin lie Ser Arg Asn Leu Arg Leu Leu Lys His
515 520 525
AAG C GTC ACT CGC CCT GCT CGC AAG CAC GGC AAC ATG CCA CTG 1987 Lys Asn Val Thr Arg Pro Ala Arg Lys His Gly Asn Met Pro Leu
530 535 540
TAAA CGGCG AATCCATAAA GGTTCAAAAG ΑΜΊΟΆΆΧΆΆ GGATTCGAIA AGGGTTCGA 2047 AAGGGTTCGPs. TAAGGGCCGA. CTTAAATGAT TGGATGTA GAAA1ACCAA TO¾ftAATTGG 2107 CAACTCTTTA CACCCAATCT TTAAGACATG GGGGGTGGCG CTGGGCTAAT ' AIAACCGGTT 2167 AGCGAAACGA. TTAGTCCCTT GTTAGGGGGA. TTAACCCTCG AAGTGGGTCG TATTTTGGCG 222フ - TTTGTATGTT Q O¾AGAA CCCTGCACAA CGCCTTCAAA GTACGTCGAC CACGACCAAG 2287 CGCATTATTC ACTCTQ CC TTCAGGATTT AGACTAAGAA TATGACTG C¾GCACAG 2347 CAAACCTGAC CTCACCACCA CGGCTGGAAA. GCTGTCCGAT CTTCGCTCCC GTCTTGCAGA. 2407 AGCTCAAGCT CCAATGGGCG AAGCAACTGT A3AAAAAGTG CACGCTGCTG GCAGGAAG C 2467 TGCCCGCG?A CGTMCGAGT ATTTGCTCGA TGAGGGCTCT TTCGTAGRGA TCGATGCTCT 2527 TGCTCGTCAC CGTTCCAAGA J TCGGCCT GGATGCCAAG CGTCCAGCTA CTGACGGTGT 2587 TGTGACTGGT TACGGCACCA TCGATGGCCG TAAGGTCTGT GTGTTCTCCC AGGACGGCGC 2647 TG雷 TCGGT GGCGCTTTGG GTGAAGTTm TGGTGAAAAG ATCGTTAAGG TTATGGATCT 2707 TGCGATCAAG ACCGGTGTGC CTTTGATCGG AATCAATGAG GGTGCTGGTG CGCGTATCCA. 2767 GGAAGGTGTT GTGTCTCTGG GTCTGTACTC ACAGATTTTC TACCGCAACA CCCAGGCGTC 2827 TGGCGTTATC CCAC¾3ATCT CTTTGATC 2855 配列番号 ： 2
配列の長さ ： 543
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： タンパク質
配列
Met Thr He Ser Ser Pro Leu lie Asp Val Ala Asn Leu Pro Asp lie
1 5 10 15
Asn Thr Thr Ala Gly Lys He Ala Asp Leu Lys Ala Arg Arg Ala Glu
20 25 30
Ala His Phe Pro Met Gly Glu Lys Ma Val Glu Lys Val His Ala Ala
35 40 45
Gly Arg Leu Thr Ala Arg Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Gly
50 55 60
Ser Phe lie Glu Thr Asp Gin Leu Ala Arg His Arg Thr Thr Ma Phe
65 70 75 80
Gly Leu Gly Ala Lys Arg Pro Ala Thr Asp Gly He Val Thr Gly Trp
85 90 95
Gly Thr lie Asp Gly Arg - Glu Val Cys lie Phe Ser Gin Asp Gly Thr
100 105 110 Val Phe Gly Gly Ala Leu Gly Glu Val Tyr Gly Glu Lys Met lie Lys
115 120 125 ' " lie Met Glu Leu Ala He Asp Thr Gly Arg Pro Leu lie Gly Leu Tyr 130 135 140
Glu Gly Ala Gly Ala Arg lie Gin Asp Gly Ala Val Ser Leu Asp Phe 145 150 155 160 lie Ser Gin Thr Phe Tyr Gin Asn lie Gin Ala Ser Gly Val lie Pro
165 170 1フ 5
Gin He Ser Val lie Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Asn Ala Tyr Gly
180 185 190
Pro Ala Leu Thr Asp Phe Val Val Met Val Asp Lys Thr Ser Lys Met
195 2C0 205
Phe Val Thr Gly Pro Asp Val lie Lys Thr Val Thr Gly Glu Glu He 210 215 220
Thr Gin Glu Glu Leu Gly Gly Ala Thr Thr His Met Val Thr Ala Gly 225 230 235 240
Asn Ser His Tyr Thr Ala Ala Thr Asp Glu Glu Ala Leu Asp Trp Val
245 250 255
Gin Asp Leu Val Ser Phe Leu Pro Ser Asn Asn Arg Ser Tyr Thr Pro
260 265 270
Leu Glu Asp Phe Asp Glu Glu Glu Gly Gly Val Glu Glu Asn He Thr
275 280 285
Ala Asp Asp Leu Lys Leu Asp Giu lie lie Pro Asp Ser Ala Thr Val 290 295 300
Pro Tyr Asp Val Arg Asp Val He Glu Cys Leu Thr Asp Asp Gly Glu 305 310 315 320
Tyr Leu Glu lie Gin Ala Asp Arg Ala Glu Asn Val Val He a Phe
325 330 335
Gly Arg lie Glu Gly Gin Ser Val Gly Phe Val Ala Asn Gin Pro Thr
340 345 350
Gin Phe Ala Gly Cys Leu Asp lie Asp Ser Ser Glu Lys Ala Ala Arg
355 360 365
Phe Val Arg Thr Cys Asp Ala Phe Asn lie Pro lie Val Met Leu Val 370 375 380
Asp Val Pro Gly Phe Leu Pro Gly Ala Gly Gin Glu Tyr Gly Gly lie 385 390 395 400
Leu Arg Arg Gly Ala Lys Leu Leu Tyr Ala Tyr Gly Glu "Ala Thr Val
405 410 415
- Pro Lys lie Thr Val Thr Met Arg Lys Ala Tyr Gly Gly Ala Tyr Cys
420 425 430
Val Met Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ser Asp He Asn Leu Ala Trp Pro
435 440 445
Thr Ala Gin lie Ala Val Met Gly Ala Ala Gly Ala Val Gly Phe He
450 455 460
Tyr Arg Lys Glu Leu Met Ala Ala Asp Ala Lys Gly Leu Asp Thr Val
465 470 475 480
Ala Leu Ala Lys Ser Phe Glu Arg Glu Tyr Glu Asp His Met Leu Asn
485 490 495
Pro Tyr His Ala Ala Glu Arg Gly Leu lie Asp Ala Val He Leu Pro
500 505 510
Ser Glu. Thr Arg Gly Gin lie Ser Arg Asn Leu Arg Leu Leu Lys His
515 520 525
Lys Asn Val Thr Arg Pro Ala Arg Lys His Gly Asn Met Pro Leu
530 535 540 配列番号 ： 3
配列の長さ ： 1478
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： genomic D A
起源
生物名 ： ブレビパクテリゥム ' ラク トフアーメンタム
株名 ： AJ12036
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位 S： 89. . 1423
特徴を決定した方法 ： S
配列
GGTACCCTTT TTGTTTTGGA. CACATGTAGG GTGGCCGAAA CAAAGTAATA. GGACAACAAC 60 GCTCGACCGC GATTATTTTT GGAGAATC ATG？ £C TCA GCA. TCT GCC CCA AGC 112
Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser
1 5
- TTT AAC CCC GGC Ρββ GGT CCC GGC TCA GCA. GTC GGA. ATT GCC CTT TTA 160 Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly Ser Ala Val Gly lie Ala Leu Leu
10 15 20
GGA TTC GGA ACA GTC GGC ACT GAG GTG ATG CGT CTG ATG？ £C GAG TAC 208 Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr
25 30 35 40
GGT GAT GAA CTT GCG CAC CGC MT GGT GGC CCA CTG GAG GTT CGT GGC 256 Gly Asp Glu Leu Ala His Arg lie Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly
45 50 55
ATT GCT GTT TCT GAT ATC TCA. J¾G CCA. CGT GAA. GGC GTT GCA CCT GAG 304 lie Ala Val Ser Asp lie Ser Lys Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu
60 65 70
CTG CTC ACT GAG GAC GCT TTT GCA CTC ATC GAG CGC GAG GAT GTT GKl 352 Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala Leu lie Glu Arg Glu Asp Val Asp
75 80 85
ATC GTC GTT GAG GTT ATC GGC GGC ATT GAG TAC CCA. CGT GAG GT . GTT 400 lie Val Val Glu Val lie Gly Gly lie Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val
90 95 100
CTC GCA GCT CTG AAG GCC GGC A¾3 TCT GTT GTT ACC GCC 房 AAG GCT 448 Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala
105 110 115 120
CTT GTT GCA GCT CAC TCT GCT G¾3 CTT GCT (3ΥΓ GCA. GCG GAA GCC GCA 496 Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala
125 130 135
AAC GTT GAC CTG TAC TTC GAG GCT GCT GTT GCA GCC GCA ATT CCA CTG 544 Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala Ala Val Ala Ala Ala lie Pro Val
140 145 150
GTT GGC CCA CTG CGT CGC TCC CTG GCT GGC GAT CAG ATC CAG TCT GTG 592 Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu Ala Gly Asp Gin lie Gin Ser Val
155 160 165
i TG GGC ATC GTT AAC GGC ACC？ ΩΖ AAC TTC ATC TTG GAC GCC ATG GAT 640 Met Gly lie Val Asn Gly Thr Thr Asn Phe lie Leu Asp Ala Met Asp 170 175 180
TCC ACC GGC GCT GAC TAT GCA. GAT TCT TTG GCT GAG GCA'ACT CGT TTG 688 Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu
185 190 195 200
GGT TAC GCC GAA GCT GAT CCA ACT GCA GAC GTC GAA GGC CAT GAC GCC 736 Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr Ma Asp Val Glu Gly His Asp Ala
205 210 215
GCA TCC AAG GCT GCA ATT TTG GCA TCC ATC GCT TTC CAC ACC CGT GTT 784 Ala Ser Lys Ala Ala lie Leu Ala Ser lie Ala Phe His Thr Arg Val
220 225 230
ACC GCG GAT GAT GTG TAC TGC G A GGT ATC AGC AAC ATC AGC GCT GCC 832 Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu Gly lie Ser Asn lie Ser Ala Ala
235 240 245
GAC ATT GAG GOV GCA CAG CAG GCA GGC CAC ACC ATC AAG TTG TTG GCC 880 Asp ' lie Glu Ala Ala Gin Gin Ala Gly His Thr lie Lys Leu Leu Ala
250 255 260
ATC TGT GAG AAG TTC ACC AAC AAG GAA GGA. AAG TCG GCT ΑΓΤ TCT GCT 928 lie Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys Glu Gly Lys Ser Ala He Ser Ma
265 270 275 280
CGC GTG CAC CCG ACT C A. TTA. CCT GTG TCC CAC CCA CTG GCG TCG GTA. 976 Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val
285 290 295
AAC AAG TCC TTT AAT GCA. ATC TTT GTT GAA. GCA GPA GCA GCT GGT CGC 1024 Asn Lys Ser Phe Asn Ma lie Phe Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg
300 305 310
CTG A G TTC TAC GGA AAC GGT GCA. GGT GGC GCG CCA ACC GCG TCT GCT 1072 Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala
315 320 325
GTG CTT GGC GAC GTC GTT GGT GCC GCA CGA AAC AAG GTG CAC GGT GGC 1120 Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly
330 335 340
CGT GCT CCA GGT GAG TCC NZC TAC GCT AAC CTG CCG ATC GCT GAT TTC 1168 Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asn Leu Pro lie Ala Asp Phe
345 350 355 360
GGT GAG ACC ACC ACT CGT TAC CAC CTC GAC ATG GAT GTG GAA GAT CGC 1216 Gly Glu Thr .Thr Thr Arg Tyr His Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg
365 370 375
GTG GGC GTT TTG GCT GAA TTG GCT AGC CTG TTC TCT GAG CAA GGA. ATC 1264 ■ Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala Ser Leu Phe Ser Glu Gin Gly lie
380 385 390
TCC CTG CGT？ £A ATC CGA. CAG G?A GAG CGC GAT GAT GAT GCA CGT CTG 1312 Ser Leu Arg Thr He Arg Gin Glu Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu
395 400 405
A C GTT GTC PCG CAC TCT GCG CTG GAA. TCT GAT CTT TCC CGC NZC GTT 1360 lie Val Val Thr His Ser Ala Leu Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val
410 415 420
GAA CTG CTG AAG GCT AAG CCT GTT GTT MG GCA ATC AAC AGT GTG ATC 1408 Glu Leu Leu Lys Ma Lys Pro Val Val Lys Ala lie Asn Ser Val lie
425 430 435 440
CGC CTC GAA AGG GAC TAATTTTACT GACATGGCAA T GAACTGAA CGTCGGTCGT 1463 Arg Leu. Glu Arg Asp
445
MGGTTACCG TCACG 1478 配列番号 ： 4
配列の長さ ： 445
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： タンパク質
配列
Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly
1 5 10 15
Ser Ala Val Gly lie Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu
20 25 30
Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg lie
35 40 45
Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly He Ala Val Ser Asp lie Ser Lys
50 55 60
Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala
65 70 75 80 Leu lie Glu Arg Glu Asp Val Asp lie Val Val Glu Val lie Gly Gly
85 90 ' 95
He Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ma a Leu Lys Ala Gly Lys
100 105 110
Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu
115 120 125
Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala
130 135 140
Ala Val Ala Ala Ala lie Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu 145 150 155 160
Ala Gly Asp Gin lie Gin Ser Val Met Gly lie Val Asn Gly Thr Thr
165 170 175
Asn Phe lie Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp
180 185 190
Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr
195 200 205
a Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala lie Leu Ala
210 215 220
Ser lie Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu 225 230 235 240
Gly lie Ser Asn lie Ser Ala Ala Asp He Glu Ala Ma Gin Gin Ala
245 250 255
Gly His Thr lie Lys Leu Leu Ala He Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys
260 265 270
Glu Gly Lys Ser Ala lie Ser Ma Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro
275 280 285
Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala lie Phe
290 295 300
Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala 305 310 315 320
Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala
325 330 335
Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr
340 345 350
Ala Asn Leu Pro lie Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His 355 360 365
Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala' Glu Leu Ala 3フ0 375 380
Ser Leu Phe Ser Glu Gin Gly lie Ser Leu Arg Thr lie Arg Gin Glu 385 390 395 400
Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu He Val Val Thr His Ser Ala Leu
405 410 415
Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val
420 425 430
Val Lys Ala lie n Ser Val lie Arg Leu Glu Arg Asp
435 440 445 配列番号 ： 5
配列の長さ ： 20
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 DNA
アンチセンス ： NO
配列
CTGGGAAGGT GAA.TCGAATT 配列番号 ： 6
配列の長さ ： 20
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：合成 D A
アンチセンス ： YES
配列
TCCGAGGTTT GCAGAAGATC 20 配列番号 ： フ
配列の長さ ： 4394
配列の型 ： 核酸 鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： Genomic DNA
起源
生物名 ： ブレビバク亍リウム ' ラク トフアーメンタム
株名 ： ATCC13869
配列の特徴
特徴を表す記号： C D S
存在位置 ： 43 . . 4213
特徴を決定した方法 ： E
特徴を表す δ己号 ■ -35 s ignal
存在位置 ： 281 . . 28フ
特徴を決定した方法： P
特徴を表す記号： - 10 signal
存在位置 ： 307 . . 312
特徴を決定した方法 ： S
特徴を表す記号： RBS
存在位置 ： 421 . . 428
特徴を決定した方法 ： S
特徴を表す記号： terminator
存在位置 ： 4243 . . 4281
特徴を決定した方法 ： S
配列
GTCGACAAGC AAAATCGAAG CGGCftX¾3G CCGCGTCGGA GCCTTAAACG CCATCGCCGC 60 CATCCCTGAT GGTTTCAA C ATCAAGTCGG TCSACGCGGG CGCAACCTGT CATCCGGACA 120 GCGCCAACTG ATCGCGCTGG CGCGCGCCGA J OVTCGAG CCTTCCATCA TGCTTCTCGA 180 CGAAGCC¾CC TCCACCCTCG ACCCCGCCAC CSAGCCGTT ATCCTCAACG CCTCCGATCG 240 AGTC¾CT¾AG GGACGCACCA. GCA CATCGT CGCGCACCGC TTGGCAACCG CTAAAAGGGC 300 CGACCGTA T CTTGTTGTTG AACAAGSCG TA CATTGAG GACGGATCTC ACGACGCGTT 360 GTTGTCTGCT AACGGCACCT ACGCCCGCAT GTGGCATTTA ATGGCCTGAC JCGTTATTTT 420 TAGGAGAACT GTCAACAAAT TA ATG CTA C?A CTG GGG CTT AGG CAT AAT CAG 472
Met Leu Gin Leu Gly Leu Arg His Asn Gin
1 5 10
CCA. ACG？ CC AAC GTT ACA GTG ΘΤ AAA. ΜΆ AAG CTC AAT A A CCC TCA 520 Pro Thr Thr Asn Val Thr Val Asp Lys lie Lys Leu Asn Lys Pro Ser 15 20 25
AGA AGC AAG GAA AGG CGA GTA CCT GCC GTG AGC AGC "GCT ACT ACT 568 Arg Ser Lys Glu Lys Arg Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr
30 35 40
TTC GGC CAG 丽 GCG TGG CTG GTA GAC GAG ATG TTC CAG CAG TTC CAG 616 Phe Gly Gin Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu Met Phe Gin Gin Phe Gin
45 50 55
AAG GAC CCC AAG TCC GTG GAC AAG GAA TGG AGA. GAA CTC ΊΤΤ GAG GCG 664 Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala
60 65 70
CAG GGG GGA CCA. MT GCT ACC CCC GCT RCA？ CA GAA GCA CAG CCT TCA 712 Gin Gly Gly Pro Asn Ala Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gin Pro Ser フ 5 80 85 90
GCG CCC AAG GAG TCT GCG AAA CCA GCA. CCA AAG GCT GCC CCT GCA. GCC 760 Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala
95 100 105
AAG GCA GCA CCG CGC GTA GAA ?£C CCG GCC GCC AAG ACC GCC CCT 808 Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro Ala a Lys Thr Ala Pro
110 115 120
AAG GCC AAG GAG TCC TCA. GTG CCA CAG CAA CCT AAG CTT CCG GAG CCA 856 Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gin Gin Pro Lys Leu Pro Glu Pro
125 130 135
GGA CPA ACC CCA ATC AGG GGT MT TTC AAG TCC ATC GCG AAG AAC ATG 904 Gly Gin Thr Pro lie Arg Gly lie Phe Lys Ser lie Ala Lys Asn Met
140 145 150
GAT ATC TCC CTG GAA ATC CCA ACC GCA ACC TCG GTT CGC GAT KTG CCA 952 Asp lie Ser Leu Glu lie Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro
155 160 165 1フ 0
GCT CGC CTC ATG TTC GAA MC CGC GCG ATG GTC MC GAT CAG CTC AAG 1000 Ala Arg Leu Met Phe Glu Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gin Leu Lys
175 180 185
CGC ACC CGC GGT GGC AAG ATC TCC TTC ACC CAC ATC ATT GGC TAC GCC 1048 Arg Thr Arg Gly Gly Lys lie Ser Phe Thr His lie lie Gly Tyr Ala
190 195 200
ATG GTG ΆΆΩ GCA GTC ATG GCT CAC CCG GAC ATG AAC AAC TCC TAC GAC 1096 Met Val Lys Ala Val Met Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp
205 210 215 - -
GTC ATC GAC GGC AAG CCA ACC CTG ATC GTG CCT GAG CAC ATC AAC CTG 1144 Val lie Asp Gly Lys Pro Thr Leu lie Val Pro Glu His lie Asn Leu
220 225 230
GGC CTT GCC ATC GAC CTT CCT CAG AAG GAC GGC TCC CGC GCA CTT GTC 1192 Gly Leu Ala lie Asp Leu Pro Gin Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val
235 240 245 250
GTA. GCA GCC ATC GAA NZC G¾3 AAG ATG AAC TTC TCC GAG TTC CTC 1240 Val Ala Ala lie Lys Glu Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu
255 260 265
GCA GOV TAG GAA GAC ATC GTG P£A CGC TCC CGC AAG GGC AAG CTC ACC 1288 Ala Ala Tyr Glu Asp He Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr
270 275 280
MG GAT GAC TAC CAG GGC GTT ΆΩΖ G TCC TTG P£C MC CCA GGT GGC 1336 Met Asp Asp Tyr Gin Gly Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly
285 290 295
ATC GGT ACC CGC CAC TCT GTC CCA CCT CTG ACC AAG GGC CAG GGC ACC 1384 lie Gly Thr Arg His Ser Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Glxi Gly Thr
300 305 310
ATC ATC GGT GTC GGT TCC ATG G ΊΝΖ CCA GCA GAG TTC CAG GGC GCT 1432 lie lie Gly Val Gly Ser Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Glxi Gly Ala
315 320 325 330
TCC GPA GAC CGC CTT GCA. GAG CTC GGC GTT GGA. AAG CTT GTC ACC ATC 1480 Ser Glu Asp Arg Leu Ala Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr lie
335 340 345
NZC TCC NZC TftC GAT CAC CGC GTG ATC CAG GGT GCT GTG TCC GGT C¾A. 1528 Thr Ser Thr Tvr Asp His Arg Val lie Gin Gly Ala Val Ser Gly Glu
350 355 360
TTC CTG CGT ACC ATG TCT CGC CTG CTC ACC GAT GAT TCC TTC TGG GAT 1576 Phe Leu Arg Thr Met Ser Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp
365 370 375
GAG ATC TTC GAC GCA. ATG AAC GTT CCT T C？ CC CCA ATG CGT TGG GCA 1624 Glu He Phe Asp Ala Met Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala
380 385 390 Π9Ί
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590 595 600
GGC CAA ATG GAG C¾G GGC CAG ATC GGT GGC TCC GGT GAC GTG AAG TAC 2296 Gly Gin Met Glu Gin Gly Gin lie Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr
605 610 615
CAC CTC GGT TCC GAA GGC CAG C?£ CTG CAG ATG TTC GGC GAC GGC GAG 2344 His Leu Gly Ser Glu Gly Gin His Leu Glu Met Phe Gly Asp Gly Glu
620 625 630
ATC AAG GTC TCC CTG ACT GCT ASC CCG TCC CAC CTG GAA. GCT GTT RPC 2392 lie Lys Val Ser Leu Thr Ala？ jsn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn
635 640 645 650
CCA GTG ATG GAA GGT ATC GTC CGC GCA AAG CAG GAC TAC CTG GAC AAG 2440 Pro Val Met Glu Gly lie Val Arg Ala Lys Gin Asp Tyr Leu Asp Lys
655 660 665
GGC GTA. GAC GGC AAG ACT GTT GTG CCS. CTG CTG CTC CAC GGT GAC GCT 2488 Gly Val Asp Gly Lys Thr Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala
670 675 680
GCA. TTC GCA GGC CTG GGC ATC GTG CCA GAA PCC ATC AAC CTG GCT ¾\G 2536 Ala Phe Ala Gly Leu Gly lie Val Pro Glu Thr lie Asn Leu Ala Lys
685 690 695
CTG CGT GGC TAC GTC GGA. GGC ACC ATC CAC ATC GTG GTG AAC AAC 2584 Leu Arg Gly Tyr Asp Val Gly Gly Thr lie His lie Val Val Asn Asn
700 705 710
CAG ATC GGC TTC ACC ACC？ CC CCA GAC TCC AGC CGC TCC ATG CAC TAC 2632 Gin lie Gly Phe Thr Thr Thr Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr
715 720 725 730
GCA ACC GAC TAC GCC AAG GCA TTC GGC TGC CCA GTC TTC CAC GTC AAT 2680 Ala Thr Asp Tyr ALa Lys Ala Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn
735 740 745
GGT GAT GAC CCA GAG GCA GTT GTC TGG GTT GGC CAG CTG GCA. ACC GAG 2728 Gly Asp Asp Pro Glu Ala Val Val Trp Val Gly Gin Leu ALa Thr Glu
. 750 755 760
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79
988I0 Mf ALDd 068t £6 OAV 1135 1140 1145
GGC MG CTG T?£ TAG GAA. TTG GCA AAG CGC AAG GAG AAG GAC GGA. CGC 3928 Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Leu Ala Lys Arg Lys Glu Lys Asp Gly Arg
1150 1155 1160
GAC GAC ATC GCG ATC GTT CGT ATC GAA K∑G CTC CAC CCA. ATT CCG TTC 3976 Asp Asp lie Ala He Val Arg lie Glu Met Leu His Pro lie Pro Phe
1165 1170 1175
AAC CGC ATC TCC GAG GCT CTT GCC GGC TAG CCT AAC GCT GAG GAA. GTC 4024 Asn Arg lie Ser Glu Ala Leu Ma Gly Tyr Pro Asn Ala Glu Glu Val
1180 1185 1190
CTC TTC GTT CAG GAT GAG CCA. GCA AAC CAG GGC CCA TGG CCG TTC AC 4072 Leu Phe Val Gin Asp Glu Pro Ala Asn Gin Gly Pro Trp Pro Phe Tyr
1195 1200 1205 1210
CAG GAG CAC CTC CCA GAG CTG ATC CCG AAC ATG CCA MG ATG CGC CGC 4120 Gin Glu His Leu Pro Glu Leu He Pro Asn Met Pro Lys Met Arg Arg
1215 1220 1225
GTT TCC CGC CGC GCT CAG TCC TCC ACC GCA. ACT GGT GTT GCT AAG GTG 4168 Val Ser Arg Arg Ala Gin Ser Ser Thr Ala Thr Gly Val Ala Lys Val
1230 1235 1240
CAC CAG CTG GAG GAG AAG CAG CTT ATC GAC GAG GCT TTC GAG GCT 4213 His Gin Leu Glu Glu Lys Glxi Leu lie Asp Glu Ala Phe Glu Ala
1245 1250 1255
TAAGTCTTTA TAGTCCTGCA. CTAGCCTftGA. GGGCCTTATG CAGTG GAAT CACACAGCRT 4273 AAGGCCCTTT TTGCTGCCGT GGTTGCCTAA GGTGGAAGGC ATGAAACGAA TCTGTGCGGT 4333 CACGA CTCT TCAGTACTTT TGCTAAGTTGG CTGCTCCTCC ACTTCCACOV CGCAGCTCGA. 4393 G 4394 配列番号 ： 8
配列の長さ ： 1257
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： タンパク質
配列
Met Leu Gin Leu Gly Leu Arg His Asn Gin Pro Thr Thr Asn Val Thr
1 5 10 15 Val Asp Lys lie Lys Leu Asn Lys Pro Ser Arg Ser Lys Glu Lys Arg
20 25 30 ■
Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr Phe Gly Gin Asn Ala Trp
35 40 45
Leu Val Asp Glu Met Phe Gin Gin Phe Gin Lys Asp Pro Lys Ser Val 50 55 60
Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala Gin Gly Gly Pro Asn Ala 65 フ0 75 80
Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gin Pro Ser Ala Pro Lys Glu Ser Ala
85 90 95
Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Ala Pro Arg Val
100 105 110
Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro Lys Ala Lys Glu Ser Ser
115 120 125
Val Pro Gin Gin Pro Lys Leu Pro Glu Pro Gly Gin Thr Pro lie Arg 130 135 140
Gly He Phe Lys Ser lie Ala Lys Asn Met Asp lie Ser Leu Glu lie 145 150 155 160
Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro Ala Arg Leu Met Phe Glu
165 170 175
Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gin Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys
180 185 190
He Ser Phe Thr His He lie Gly Tyr Ala Met Val Lys Ala Val Met
195 200 205
Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp Val lie Asp Gly Lys Pro 210 215 220
Thr Leu He Val Pro Glu His lie Asn Leu Gly Leu Ala lie Asp Leu 225 230 235 240
Pro Gin Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val Val Ala Ala lie Lys Glu
245 250 255
Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu Ala Ala Tyr Glu Asp lie
260 265 270
Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr Met Asp Asp Tyr Gin Gly
275 280 285
Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly lie Gly Thr Arg His Ser 290 295 300
Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gin Gly Thr lie lie Gly Val Gly Ser 305 310 315 320
Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gin Gly Ala Ser Glu Asp Arg Leu Ala
325 330 335
Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr lie Thr Ser Thr Tyr Asp His
340 345 350
Arg Val lie Gin Gly Ala Val Ser Gly Glu Phe Leu Arg Thr Met Ser
355 360 365
Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp Glu lie Phe Asp Ala Met 3フ 0 375 380
Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala Gin Asp Val Pro Asn Thr 385 390 395 400
Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gin Leu lie Glu Ala Tyr Arg
405 410 415
Ser Arg Gly His Leu lie Ala Asp Thr Asn Pro Leu Ser Trp Val Gin
420 425 430
Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp Leu Asp lie Glu Thr His
435 440 445
Ser Leu Thr lie Trp Asp Leu Asp Arg Thr Phe Ser Val Gly Gly Phe 450 455 460
Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu Val Leu Ser Arg Leu Arg 465 470 475 480
Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu Tyr Thr His He Leu Asp
485 490 495
Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gin Asp Arg Leu Glu Ala Gly Met Pro
500 505 510
Lys Pro Thr Gin Ala Glu Gin Lys Tyr lie Leu Gin Lys Leu Asn Ala
515 520 525
Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gin Thr Lys Tyr Val Gly Gin Lys 530 535 540
Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu lie Pro Leu Met Asp Ser 545 550 555 560
Ala lie Asp Thr Ala Ala Gly Gin Gly Leu Asp Glu Val Val lie Gly
565 570 575 Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Phe Asn lie Val Gly Lys
580 585 590 '
Pro Leu Ala Ser lie Phe Asn Glu Phe Glu Gly Gin Met Glu Gin Gly
595 600 605
Gin lie Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr His Leu Gly Ser Glu Gly 610 615 620
Gin His Leu Gin Met Phe Gly Asp Gly Glu lie Lys Val Ser Leu Thr 625 630 635 640
Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn Pro Val Met Glu Gly He
645 650 655
Val Arg Ala Lys Gin Asp Tyr Leu Asp Lys Gly Val Asp Gly Lys Thr
660 665 670
Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala Ala Phe Ala Gly Leu Gly
675 680 685
lie Val Pro Glu Thr lie Asn Leu Ala Lys Leu Arg Gly Tyr Asp Val 690 695 700
Gly Gly Thr lie His He Val Val Asn Asn Gin lie Gly Phe Thr Thr フ 05 710 715 720
Thr Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Lys
725 730 735 a Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val ¾sn Gly Asp Asp Pro Glu Ala
740 745 750
Val Val Trp Val Gly Gin Leu Ala Thr Glu Tyr Arg Arg Arg Phe Gly
755 フ 60 765
Lys Asp Val Phe lie Asp Leu Val Cys Tyr Arg Leu Arg Gly His Asn 770 775 780
Glu Ala Asp Asp Pro Ser Met Thr Gin Pro Lys Met Tyr Glu Leu lie 785 790 795 800
Thr Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gin Tyr Thr Glu Asp Leu Leu Gly
805 810 815
Arg Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu Ala Val Val Arg Asp Phe
820 825 830
His Asp Gin Met Glu Ser Val Phe Asn Glu Val Lys Glu Gly Gly Lys
835 840 845
Lys Gin Ala Glu Ala Gin Thr Gly lie Thr Gly Ser Gin Lys Leu Pro 850 855 860
His Gly Leu Glu Thr Asn lie Ser Arg Glu Glu Leu Leu- Glu Leu Gly 865 870 875 880
Gin Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe Asn Tyr His Pro Arg Val
885 890 895
Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser Val Thr Glu Gly Gly lie
900 905 910
Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly Ser Leu Ala Asn Ser
915 920 925
Gly Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser Arg Arg Gly Thr Phe 930 935 940
Thr Gin Arg His Ala Val Ala lie Asp Pro Ala Thr Ala Glu Glu Phe 945 950 955 960
Asn Pro Leu His Glu Leu Ala Gin Ser Lys Gly Asn Asn Gly Lys Phe
965 970 975
Leu Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala Gly Met Gly Phe Glu
980 985 990
Tyr Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser Val Val Ala Trp Glu Ala
995 1000 1005
Gin Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly a Gin Thr lie He Asp Glu Tyr 1010 1015 1020
Val Ser Ser Gly Glu Ma Lys Trp Gly Gin Thr Ser Lys Leu lie Leu 025 1030 1035 1040
Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly Gin Gly Pro Asp His Ser Ser Ala
1045 1050 1055
Arg lie Glu Arg Phe Leu Gin Leu Cys Ala Glu Gly Ser Met Thr Val
1060 1065 1070
Ala Gin Pro Ser Thr Pro Ala Asn His Phe His Leu Leu Arg Arg His 1075 1080 1085
Ala Leu Ser Asp Leu Lys Arg Pro Leu Val lie Phe Thr Pro Lys Ser 1090 1095 1100
Met Leu Arg Asn Lys Ala Ala Ala Ser Ala Pro Glu Asp Phe Thr Glu 105 1110 1115 1120
Val Thr Lys Phe Gin Ser Val lie Asp Asp Pro Asn Val Ala Asp Ala
1125 1130 1135 Ala Lys Val Lys Lys Val Met Leu Val Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu
1140 1145 1-150
Leu Ala Lys Arg Lys Glu Lys Asp Gly Arg Asp Asp lie Ala lie Val 1155 1160 1165
Arg lie Glu Met Leu His Pro lie Pro Phe Asn Arg lie Ser Glu Ala 1170 1175 1180
Leu Ala Gly Tyr Pro Asn Ala Glu Glu Val Leu Phe Val Gin Asp Glu 185 1190 1195 1200
Pro Ala Asn Gin Gly Pro Trp Pro Phe Tyr Gin Glu His Leu Pro Glu
1205 1210 1215
Leu lie Pro Asn Met Pro Lys Met Arg Arg Val Ser Arg Arg Ala Gin
1220 1225 1230
Ser Ser Thr Ala Thr Gly Val Ma Lys Val His Gin Leu Glu Glu Lys 1235 1240 1245
Gin Leu lie Asp Glu Ala Phe Glu Ala
1250 1255 配列番号 ： 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
アンチセンス ： NO
配列
CTGTCTGAAG GATCGGTTCT 20
配列番号 ： 1 0
配列の長さ ： 2 9
配列の型 ：核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
アンチセンス ： YES
配列
GAGTGCTCAG GCCCCTGTCC CTCGTAACC 29

Claims

請求の範囲
1 . 目的物質の産生に不利に作用する遗伝子と、 温度感受性複製起点 とを含むプラスミ ドを保持する微生物。
2 . 機能可能な前記遺伝子が前記プラスミ ド上のみに存在する請求項 1 記載の微生物。
3 . 前記遺伝子が、 目的物質の生合成系路から分岐する他の経路に属 する酵素をコードする遺伝子である請求項 1記載の微生物。
4 . 前記遺伝子が、 微生物の生育にとって有利に作用する遺伝子であ る請求項 1記載の微生物。
5 . 目的物質がアミノ酸である請求項 1記載の微生物。
6 . 目的物質が L一グルタミン酸であり、 前記遺伝子が d t s R遣伝 子である請求項 5記載の微生物。
7 . 目的物質が L一グルタミン酸であり、 前記遺伝子がひーケトグル タル酸デヒ ドロゲナーゼ遺伝子である請求項 5記載の微生物。
8 . 目的物質が L一リジンであり、 前記遺伝子がホモセリンデヒ ドロ ゲナ一ゼ遺伝子である請求項 5記載の微生物。
9 . 微生物がコリネ型細菌である請求項 1 〜 8のいずれか一項に記載 の微生物。
1 0 . 微生物が r e c A -である請求項 1 〜 9のいずれか一項に記載の 微生物。
1 1 . 請求項 1 ~ 1 0のいずれか一項に記載の微生物を、 前記プラスミ ドが複製可能な温度で培養して増殖させる工程と、 前記プラスミ ドが複 製不能な温度で培養してプラスミ ドを細胞から脱落させ、 目的物貧を産 生させる工程とを含む、 発酵法による目的物質の製造法。
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