WO1997047172A1

WO1997047172A1 - Proteine isoforme du recepteur de la vitamine d

Info

Publication number: WO1997047172A1
Application number: PCT/IB1997/000947
Authority: WO
Inventors: Shigeaki Kato; Kenju Ueno
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1996-06-10
Filing date: 1997-06-10
Publication date: 1997-12-18
Also published as: AU3555097A; JPH09327295A

Description

明細書

ビタミン Dレセプターアイソフォームタンパク質

技術分野

本発明は新規なビタミン Dレセプタ一アイソフォームタンパク質をコ一ドする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えべクタ一によって形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養することによって得られるビタミン Dレセプタ一ァイソフォームタンパク質、該タンパク質を認識する抗体、該タンパク質を用いた骨密度の診断方法、ならびに該タンパク質を用いたビタミン D様物質のスクリ一ニング法に関する..、

贿

1， 2 5—ジヒドロキシビタミン D₃ [ 1， 2 5 (OH) ₂D₃] は、カルシウム恒常性や細胞分化を制御するなどの生物活性を有するが、その生物活性のほとんどは核内ビタミン Dレセプタ一（VDR) によって媒介される遺伝子の発現によつて作用する (Darwisn ana Deし uca, Cri t. Rev. Eukaryoti c Gene express. , 3 :89-116, 1993) 一 V DRは、リガンド誘導可能な転写因子として機能する核内レセプタ一ス一ハーフアミリ一のメンバ一であることが知られている（Green and Chambon, Trends Genet. , 4:309-314, 1988; Parker, Curに Op in. Cell Biol. , 5:499-504， 1993) このファミリ一にはステロイドホルモン、甲状腺ホルモンおよびレチノイン酸に対する核内レセプタ一、ならびにォ一ファン ' レセブタ一と呼ばれるリガンド未知のレセプタ一が含まれる，構造や機能の類似性に基づくと、 V D Rは、レチノイン酸レセプタ一（RA R) 、 9—シスレチノイン酸レセプタ一（RX R) や甲状腺ホルモンレセプタ一（T R) と共に核内レセプタ一ス一バーファミリ一内でサブファミリ一を形成する。

R A Rや T Rと同様に、 V D Kは R X Rとへテロダイマ一を形成することが知られている，これらのへテ口ダイマ一は異なってはいるが類似の標的ェンハンサ —エレメントと結合するこの標的ェンハンサ一エレメントは 2つの反復するコ

差替え用紙（規則 26) ァ AGGTCAモチーフ（または関連の 6塩基からなるモチーフ）からなつている.： 2つのコアモチーフの間に存在するスぺ一サ一は R X R/V D Rへテ口ダイマ一の場合には 3 b p (D R 3) であり、 1¾ 1¾ノ丁1¾では4 （DR4) であり、 {¾乂 1 ノ1^ 1¾では2 （DR 2) および 5 b p (DR 5) である。このスベーサ一の違いにより、標的ェンハンサ一エレメントを認職するための核内レセプターを区別する（Umesono et al. , Cell 65:1255-1266, 1991; Rastineja d et al. , ature 375:203 - 211， 1995) 。

上述した RX Rと VDRとのへテロダイマ一形成に加えて、 VDRはいくつ力のビタミン Dレスポンスエレメント（VDRE) においてホモダイマーを形成し、これはビタミン Dに 2つのシグナル伝達経路の存在することを示唆する（Carber g et al . , ature 361： οο7-66ϋ, 1993； Towers et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6310-6311, 1993) 。

これらのレセプターの機能上および構造上の類似性にもかかわらず、現在までに V D Rタンバク質ではただ 1つのタイプが見いだされているのみである。一方、 RAR、 RXRや TRでは複数のサブタイプならびにこれによりコードされるタンパク質が変化した形のアイソフォームが見いだされている（Kastner et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2700-2704, 1990; Leroy et al. , E B0 J. 10: 59-69, 1991 ; Zelent et al. , EMB0 J. 10:71 - 81， 1991) - RARおよび T Rのアイソフォームは選択的スプライシングおよび Zまたは異なるプロモーターの制御により生じると考えられている. また、一過性発現アツセィを用いる機能的分析によると、レセプタ一アイソフォーム間では転写促進活性が異なることが示されている（Nagpal, et al. , Cell 70:1007-1019, 1992) , さらに、 RARおよび RX Rのレセプタ一アイソフ； j -一ムゃサブタイブを欠失するマウス系を用いる遗伝実験から、レチノイン酸シグナル経路に及ぼす各サブタイプやアイソフォームの組織特異的ならびに発生段階特異的な役割が明らかとなった（Kastner et al. , Cell 78:987-1003, 1994) , したがって、核內レセブターのサブタイプおよびァイソフォームはリガンドの生物学的作用を区別して調節しているように思われる， V D Rのインビトロでの機能的分析 (Nakajima et al. , Μυΐ. Endocrinol. 8:

差替え用紙（規則 26) 1 9-172, 1994) ならびに遺伝性 1， 25 (OH) ₂D₃耐性佝僂病（HVDRR) 患者に見られる遺伝的突然変異（Kristjansson et al. , J. Clin. Invest. 92 : 1 2-16, 1993) を用いることにより、ビタミン Dシグナル伝達経路にとっての VD Rの重要性が示されている ₃ また最近になって、ヒト VDR遺伝子（h VDR) の第 8イントロンにマッピングされる対立遺伝子の変異体が、ォステオカルシン (骨形成やその維持に関与するタンパク質）の循環と骨密度に密接に関連することが報告されている（Morrison et al. , ature 367:284-287, 1994) ₃ これらの知見 (こ基づき、彼らは h VDR遗伝子の対立遣伝子変異体を用いて骨密度を予測し、これを成人の骨折危険度予測に用いることを提案している。ヒト VDR遣伝子の対立遺伝子の相違が原因となるスプライシングの変化による mRN Aの 3，非翻訳領域（じ TR) の配列の変化によって、転写の半減期が異なる可能性を彼らは示唆しているが、対立遺伝子の変異がビタミン Dのシグナル経路にどのように影饗するかについての分子生物学的な研究はなされていない。

したがって、ビタミン Dの広範な効果や 1， 2 5 (OH) ₂D ₃の種々の代謝誘導体を考えると、ビタミン Dの作用に影饗する VDRタンパク質のサブタイプやアイソフォームが存在する可能性がある。

多くの核內レセプタ一において終止コドンを含むェキソンは他のェキソンに比ベて長さが長いことが知られている。この最終ェキソンおよびその前後のィン卜口ンの塩基配列には種々の遺伝的多型が知られているこの遣伝的多型は非コード領域に生じる力、あるいはコードされるアミノ酸は変化しない場合が多いが、多型による塩基の変異により mRN Aの安定性および発現量が変化することが知られている。塩基の変化による疾患と関連した異常なスプライシングに関しては、 1 ) ェキソン . スキッビング、 2) 隠れたスプライス都ィ iの活性化、 3) イントロン内における偽ェキソンの生成、 4) イントロンのェキソン化、の 4つが知られており、多くの疾患と関連している,. 特に長いェキソンの前後において異常なスプライシングが起きやすい

上述したように、核内レセブターにおける mRNAの多型については、 T R、 RA R、 R X Rなどでは遺伝子が異なる種々のサブタイプが存在し、さらに個々

差替え用紙（規則 26) の遺伝子から選択的スプライシングによる m R N Aの多型が生理的条件で生じることが知られている，また、これによりコードされるタンパク質が変化してアイソフォームが生成したり、 mRN Aの安定性が変化し、より精緻な遺伝子発現調節に寄与していると考えられる。

しかしながら、ビタミン Dレセプタ一（VDR) ではこのような現象はまだ知られていないしたがって、本発明の目的は、 VD Rの選択的スプライシングにより生じるァイソフォームの有無を検討し、併せてその機能を研究することにある発明の開示

上記目的を達成するために、本発明者らは正規の（canonical) ラット VDR (以下において r VDR 0という）の種々の領域をコ一ドする DNA断片および DN A結合ドメイン中の Pボックスのオリゴヌクレオチド（Parker, Curr. Opin. Cell Biol. 5:499-504, 1993) を用いて、各種ネズミおよび鳥類組織由来の c D N Aライブラリーをスクリーニングすることにより、新規な VDRァイソフォームをコ一ドする遺伝子を単離し、その構造を決定することができた。

また、この遺伝子を適当なベクターに揷入した後、この発現べクタ一により形質転換された形質転換体を培養し、産生された目的タンパク質を分離、精製することにより新規な VD Rアイソフォームタンパク質を得ることができたビタミン Dレセプターでこのようなアイソフォームが同定されたのはこれが最初の例である _υ

併せて、上記新規な VD Rァイソフォームタンパク質の機能を検討し、これがビタミン Dのシグナル伝達経路をネガティブに調節することを確認した

したがって、本発明は、 VDRァイソフォームタンパク質をコードする遣伝子を提供する- 本発明の好ましい遺伝子は、配列番号 1に示すアミノ酸配列をコ一ドするヌクレオチド配列、または配列番号 1に示すァミノ酸配列の一部を置換、欠失もしくは付加したァミノ酸配列であってビタミン Γ)レセプタ一アイソフォ一ムタンパク質活性を有すろタンパク質をコ一ドするヌクレオチド配列、あるいは

差替え用紙（規則 26) これらにハイプリダイズするヌクレオチド配列を含む DN Aであり、二の遣伝子はラッ卜に由来する。このようなラッ卜由来の好ましい遗伝子は配列番号 2に示すものである本発明の好ましい遺伝子はまた、配列番号 3に示すヌクレオチド配列、またはこれを一部置換、欠失もしくは付加したヌクレオチド配列、あるいはこれらにハイブリダィズするヌクレオチド配列を含む DN Aであり、この遺伝子はヒ卜に由来する。

本発明はまた、 VDRァイソフォームタンパク質をコ一ドする遺伝子を含む組換えべクタ—を提供する本発明はさらに、 VDRァイソフォームタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換された原核もしくは真核宿主細胞を提供する：本発明はさらに、 VDRアイソフォームタンパク質をコ一ドする遺伝子を含む組換えべクタ一によって形質転換して得られた形質転換体を培養することによつて得られる VD Rアイソフォームタンパク質を提供する。

本発明はさらに、 VDRアイソフォームタンパク質を認識する抗体を提供する本発明はさらに、 VDRアイソフォームタンパク質を用いた骨密度の診断方法を提供する。

本発明はさらに、 VDRアイソフォームタンパク質を用いたビタミン D様物質のスクリーニング法を提供する-

図面の簡単な説明

図 1は、 r VDR 0およびラット腎臓 c DNAライブラリ一から単離された r VD R 1の c DNAのヌクレオチドおよびァミノ酸配列を示す。

図 2は、ェキソン 7〜9近傍のラット VD Rゲノム領域および選択的スブライシングによって生じた 2つの r VDRァイソフォーム（ r VD R Oおよび r VD R 1 ) のタンハク質の構造を示す。 r V【）Rの Λ〜Ε領域およびそのアミノ酸残基を模式的に示すラット VDRゲノム領域の制限酵素部位の Sは S ma I を、【Iは H i n d HIを、 Kは K p n I を、 Pは P s t 1 を表す,，

図 3は、 r V D R 0および r V D R 1転写物の発現を、ラット腸および腎臓か

差替え用紙（規則 26) らのポリ A ( + ) mRN Aを用いてノーザンプロットで分析した図（電気泳動の写真）である。

図 4は、 CATアツセィを用いた、 r VDROの r VDR 1に対するドミナントネガティブ活性試験の結果を示す。

図 5は、 CATアツセィを用いた、 r VDR 1の用量依存的活性試験の結果を示す。

図 6は、 CATアツセィを用いた、 r VDR 1の甲状腺ホルモンおよびレチノィン酸シグナリング経路に及ぼす試験の結果を示す。

図 7は、 r VD R 1のドミナントネガティブ活性が配列特異的であることを示すグラフである，

図 8は、大腸菌中で r V D R 0および r V D R 1を G S T融合タンパク質として発現させた試料（G ST_ r VDR Oおよび G ST— r VDR l ) 、ならびに卜ロンビンで消化し、精製して得た r VDROおよび r VDR 1試料を用いて、ポリアクリルアミド—SDSゲルで測定した分子量を示す（電気泳動の写真）。図 9は、 DR 3丁をプローブとして用い、種々の量の精製マウス RX Rひ (R X R) 、精製 r VDR 0および r VD R 1で行ったゲルシフトアツセィの結果を示す（電気泳動の写真）。

図 1 0は、 DR 4および D R 5をブローブとして用い、種々の量の精製 r V D R 1、ニヮトリ T Ra (T R) およびマウス R A Rひ（RAR) で行ったゲルシフトアツセィの結果を示す（電気泳動の写真）。

図 1 1は、大腸菌にて合成した組換え r VD Rタンパク質（ r VDR Oまたは r V D R 1 ) と、 [³H] でラベルした 1 , 2 5 ( O H ) , Dn 1 n Mと、ラベルしていない 1， 2 5 (OH) をいろいろな濃度で加え、 4'⁵C、 1 6時間インキュべ一卜し、結合しなかったビタミン Dを遠心分離にて除き、組換え r VD Rタ質に結合したリガンドの放射活性を測定した結果を示す発明を実施すろための最良の形態

本発明では V D Rァインフォームタンパク質をコ一ドする遺伝子を以下の手順

差替え用紙（規則 26) によって得ることができた。しカゝし、本発明の遺伝子を得るには、これに限定されず、後述するように本発明の遺伝子を発現する組織、細胞などから当業者に公知の方法を用いて c D N Aを調製することができる。

このようにして、クローン化された V D Rアイソフォームタンパク質をコ一ドする遺伝子は適当なベクター D N Aに組み込むことにより、他の原核細胞または真核細胞の宿主細胞を形質転換させることができる。

さらに、これらのベクターに適当なプロモータ一および形質発現に係わる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現することができる：また、目的とする遺伝子の他にポリペプチドをコードする遣伝子を連結して、融合タンパク質として発現させ、精製を容易にしたり、発現量を上げ、精製工程中で適当な処理を施すことにより、目的のタンパク質を切り出すことも可能である。後述する実施例では G S T融合タンパク質として発現させ、精製した後、 G S Tを除去して V D Rアイソフォームタンパク質を単離した。

一般に、真核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遗伝子等で知られているように、多型現象を示すと考えられ（例えば、 N i shi等、 J. Biochem. 97 15 198 5)、この多形現象によって 1個またはそれ以上のァミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列の変化はあってもァミノ酸は全く変わらない場合もある。

また、配列番号 1のァミノ酸配列の中の 1個またはそれ以上のァミノ酸を欠くかまたは付加したボリぺブチドあるレ、はァミノ酸が 1個もしくはそれ以上のァミノ酸で置換されたポリベプチドでも V D Rアイソフォームタンパク質の活性を有することがある。例えば、ヒトインタ一ロイキン 2 ( I L— 2 ) 遺伝子のシスティンに相当するヌクレオチド配列をセリンに相当する配列に変換して得られたポリペプチドが〖し一 2活性を保持することも既に公知となっていろ（Wang等、 Sc ience, 224 1431 1984) ■

また、真核細胞で発現させた場合その多くは糖鎖が付加されるが、アミノ酸を 1ないしそれ以上変換することにより糖鎖付加を調節することができるがこの場合、 V D Rアイソフォームタンパク質の活性を有することがあろ,，

さらに、得られたポリベプチドカ； V D Rアイソフォームタンパク質活性を有し、

差替え用紙（規則 26) 配列番号 1に示されたアミノ酸配列を含むボリべプチドをコ一ドする遺伝子または配列番号 2または 3に示すヌクレオチド配列とハイブリダイズする遗伝子も本発明に含まれる：なお、ハイブリダィゼ一シヨン条件は、通常行われているプロ —ブハイプリダイゼ一ションの条件を適用することもできる（例えば Molecular Cloning ： A し aboratory Manual, SaniDrook ら、し old spring Habor し aboratorv Press, 1989) 。

本発明の発現ベクターは、複製起源、選択マ一カー、発現させようとする遺伝子の前に位置するプロモータ一、 RN Aスブライス部位、ポリアデニル化シグナルなどを含んでいる。

本発明の発現系に用いる宿主のうち原核生物宿主細胞としては、例えば、大腸菌 (Escherichia col i) 、ノヽシノレス · ズ'ノ、'チリス (Baci 1 us subtil i s) 、ノくシルス 'サ一モフィルス (Bacillus thermophi lus) 等が挙げられる。また真核生物のうち、真核微生物の宿主細胞としては、例えばサッカロミセス ·セレビシエー (Saccharomvces cerevisiae) 等が挙げられ、哺乳動物由来の宿主細胞としては、例えば CO S細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO) 細胞、 C 1 2 7細胞、 3 T 3細胞、 H e 1 a細胞、 B HK細胞、ナバルバ細胞などが挙げられるなお、本発明の形質転換体の培養は、宿主細胞に適した培養条件を適宜選択して行えばよいつ

以上のようにして目的とする VD Rアイソフォームタンパク質をコードする遗伝子で形質転換した形質転換体を培養し、産生した VDRァイソフォームタンパク質は、細胞内または細胞外から分離し均一にまで精製することができる。

なお、本発明の目的タンパク質である VDRアイソフォームタンパク質の分離 •精製は、通常の蛋白質で用いられる分離 ·精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない例えば各種クロマトグラフィー、限外據過、塩折、透析等を適宜選択、組合せれて用いることができる.，

VD Rアイソフォームタンパク質の活性を測定するには、例えば以下に記載する、 C AT (クロラムフエニコ一ルァセチル卜ランスフェラ一ゼ）遺伝子をレポ —ター遺伝子として用いろ遺伝子転写活性測定法であろ一過性発現ァッセィ（C

差替え用紙（規貝リ26) ATアツセィ）を用いて評価することができる。

H e L a細胞をダルベッコの改変イーグル培地（フエノールレッド不含、 5 % デキストランコ一ティングチヤコール処理をしたゥシ胎児血清補充）中に維持する。リン酸カルシウム法により全量 2 0 μ gの DNAを用いて 9 c mのぺトリ皿で 4 0— 5 0%コンフルェントの細胞に形質転換する。用いる DN Aは CATレポ一タ一プラスミド 2 μ gとレセプタ一発現ベクター 5 00 n gを、さらに形質転換の効率によるバラツキを正規化するための内部対照として用いる —ガラクトシダーゼ発現べクタ一である p CH 1 0 0 (Pharmacia) 3 / gも加え、 DNA の全量を合わせるためのキヤリアとして B l u e s c r i b e M 1 3 - (Stra tagene) を使用する。

形質転換の 1時間後および各培地交換時に、培地中にリガンド（オール卜ランスレチノィン酸 1 μ Μあるいは甲状腺ホルモン 0. 1 μ Μあるいはビタミン D 0. 1 Μ ) を加える。リン酸カルシウム沈殿化 DN Αとともに 2 0時間インキュべ —卜した後、細胞を新しい培地で洗浄し、さらに 2 0〜 2 4時間インキュべ一卜する。凍結乾燥により細胞抽出物を調製し、文献（Sasaki et al. , Biochemistr y 34:370-377, 1995) 記載の方法で一ガラクトシダ一ゼ活性を正規化した後、 C A Tをァッセィする。

本発明の VD Rアイソフォ一ムタンパク質を認識する抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい，ホリクローナル抗体の作製にあたっては、常法（例えば、新生化学実験講座 1、タンパク質 I 、 p 3 8 9〜 3 9 7、 1 9 9 2参照）に従い、抗原（V D Rァイソフォームタンパク質）をゥサギ、ラット、ャギ、ヒッジ、マウスなどの動物に免役し、生体内に産生される抗体を採取することにより得ることができる。得られた抗体の力価は当業界で公知の方法により測定できる。モノクローナル抗体の作製も常法（例えば、 Kohler et al. , ature 256:496, 1 75; Kohlcr et al. , Eur. J. Immunol. 6:511, 19 76) に従って行うことができろ.，すなわち、上述したように動物を免疫して抗体分泌体細胞を得て、これを骨髄腫細胞系と融合し、抗体を産生するハイプリド一マを選択する二とにより行う。

差替え用紙（規則 26) また、このようなモノク口一ナル抗体およびボリク口一ナル抗体の結合性断片、例えば、 F a b、 F ( a b ' ) F ν断片も本発明の抗体として使用できる，抗体断片は完全な抗体をパパインまたはペプシンなどで消化して常法により得ることができる。

本発明を以下において具体的に説明する。

VD Rアイソフォームタンパク誓をコ一ドする i音伝子の単離

正規の（canonical) ラット V D R ( r VD R O) のリガンド結合ドメイン（S asaki et al. , Biochemistry 34:370-377, 1995) を用いて、 r VD R O c D N Aと密接に関連する 1 0個の陽性クローンを単離した。次いで r VD R Oタンパク質 (Burmester et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1005-1009, 1988) をコ一ドするェキソンに対応するプライマー対を用いるポリメラーゼチヱインリアクシヨン（P C R) によってこれらのクローンを分析し、同じアイソフォーム (以下において r V D R 1 という）をコ一ドする 2つのクローンを見いだした。 r VD R Oと r VD R l の配列決定を行い、 r V D R 1に特異的な 2 8 5ヌクレオチドを同定した（図 1 ) 。 r VD R 1では r V D R 0のリガンド結合ドメィンに 1 1 3 4 b pが揷入されていたが、 r V D R 1のその他の配列は r VD R 0 のオープンリーディングフレームと同一であった（図 1 )

r VD R遣伝子のゲノム構造と配列とを分析することにより、この挿入された配列がェキソン 8と 9の間にあるイントロンに由来すること（図 2 ) 、ならびにこのェキソンーィントロンの間の配列が C h a m b o nの一般則（イントロンの両側の 5 ' 側が GT、 3 ' 側が AGとなる）に合致し、したがつてこのアイソフオームが選択的スプライシングによる一次転写物により生じたことを示唆する遺伝子座の f V D R lのェキソンとしてイントロン 8を保持することは、遣伝子座の最も下流領域に位置する比較的大きなェキソンを生じろことになるラット V D Rのこの遺伝子構造は、大きな最終ェキソンをもつこのレセブタ一スーパ一ファミリーの他のメンバ一の構造とよく似ている (Gronemeyer, Annu. Rev. Gen el. 25:89-123, 1991) .,

したがって、本発明の V D Rァイソフォームタンパク質（ r V D R l ) をコー

差替え用紙（規則 26) ドする遺伝子は配列番号 2に示すヌクレオチド配列、ならびに配列番号 1 に示すアミノ酸配列をもつ。 r VD R 1の推定アミノ酸配列は r VD R 0と比べて、 C 末端の 8 6アミノ酸を欠失し、 1 9アミノ酸を余分にもつ：これは、ェキソン 8 とェキソン 9の間に存在するイントロンの 1 1 34 b pに位置するストップコドンによって翻訳が停止したためであると考えられる（図 1および図 2参照）。次いで、 r VD R 1のこのェキソンをノーザンブロッ卜の特異的プローブとして用いて r VDR l転写物（Sasaki et al.， Biochemistry 34:370-377, 1995) の存在を検出した。その結果、この転写物は r VD R 0が発現している賢臓と腸で検出された（図 3 ) ： —方、ェキソン 6と 7の間にあるィントロン 6の 1 04 2 b pを含む非特異的プローブを用いると特異的転写物は検出できなかった。特異的バンドをデンシトメータ一で分析したところ、 r VDR 1転写物の量は r V DR 0の量の 1 1 5〜 1 Z20であった。また、各種組織由来のボリ（A) ⁺m RN Aを逆転写酵素を用いて c DN Aとした後、 PCRで增幅し、細胞質ゾルの mRNA分画中の r VDR 1転写物を検出し、 r VDR 1転写物の存在を確認した _ύ したがって、 r VDR 1転写物は転写のための成熟 mRN Αとして細胞質ゾル中に局在していることが示唆された。

r VDR ΐ の機能的役割

ヒト VDRの C末端にあるリガンド結合ドメインの正確な位置は 40 3〜4 2 7ァミノ酸残基（ r V D R 0では 39 9〜 4 2 3アミノ酸）にマッピングされるという最近の報告（!Nakajima et al.， Mol. Endocrinol. , 8:159 - 172， 1994) と合致して、インビトロ合成した r VD R 1タンパク質はリガンド結合を示さなかつた（図 1 1 )

R X Rとのへテ口ダイマ一形成に必要とされる 2つのドメインのうちの 1つ (h e p t a d 9 : r VD R ()では 3 99〜 40 7アミノ酸）は r VD R lにはなかったが、特異的 DNA結合に関与するもう一方の領域（h e p t a d 4 ： r VD R Oでは 32 1〜32 8アミノ酸）は r VD R 1に存在していたつ

そこで、一過'性発現アツセィ（CATアツセィ）（Sasaki et al. , Biochemis try 31:370-377, 1995) を用いて、 r V D R 1の転写促進活性を評価した r V

差替え用紙（規則 26) DR O、 r V D R 1およびラット RX R αを発現するべクタ一、ならびにコンセンサスなビタミン Dレスポンスエレメント（VDRE) を含む CATレポ一ターブラスミドを調製したこのコンセンサスなビタミン Dレスポンスエレメントは上述した 3 b pのスぺ一サ一（DR3 T) を介して 2つの AGTTCAモチーフが直接連結したものである。このモチーフは AGGTC Aよりも強い VDRの結合モチーフであると言われている（Freedman et al.， Mo]. Endcrinol. , 8:265- 273, 1994) 。その結果、 r VDR 1 自体は転写促進活性を有していなかった。しかし、 r VDR O (0. 5 μ g) と r VDR l ( 2 μ g ) とをコトランスフエクシヨンした場合には、試験したすべての細胞（以下の実施例では代表例として H e L a細胞について示す）において、 r VDR 0によるリガンド誘導の転写促進活性を阻害した（図 4参照）。また、 r VDR Oの存在下（発現べクタ一 0. 5 μ g) に r VD R 1発現べクタ一の添加量を増加すろと、 r VDR lの阻害活性はより顕著になった（図 5参照）。 r VDR 0発現べクタ一を 5 μ g添加したときにもリガンド誘導の転写促進活性は抑制されなかったので（図 5) 、この阻害作用は限られた核内ファクターに対する 2つのアイゾフォーム間の単なる拮抗

(Tasset et al. , Cell 62:1177-1187， 1990) によるものではない。さらに、本明細書ではデータを記載していないが、 R X Rの 3つのサブタイプ（ α、 β、 γ ) 間では明瞭な差は観察されなかった：

r V D R 1のドミナントネガティブ活性は配列特異的であろ

r VDR 0に対する r VDR】の阻害程度は配列特異的であり、これはヒト · ォステオカルシン VDREよりもマウス . ォステオポンチンについての方が顕著であった：これは VDRホモダイマーがマウス · ォステオホンチンの標的 V D R Eとの結合をより好むためであるとされている（Cheskis et al. , Mole Cell. Biol. 11:3329-3338, 1 94) , A G T T C Aモチーフの方が A G G T C Aモチ一フよりも VDRの結合コアとして優れているという考えは、 D R 3 Tが DR 3 G よりも VDR ['：としてより活性であるという事実からも支持される（図 7参照）

—方、 r V D R 1は同種のレセブターが存在するときには、レチノイン酸のコンセンサスレスポンスエレメント（D R 5) や甲状腺ホルモンのコンセンサスレ

差替え用紙（規則 26) スポンスエレメント（DR4) のリガンド誘導の転写促進活性を抑制しなかった (図 6参照）。同種のレスポンスエレメントが存在するときに、 r VD R lはその他のレチノイン酸レスポンスエレメント（DR l T DR 2) やエス卜ロゲンレスポンスエレメント（コンセンサス E RE) に明瞭な効果を及ぼざなかった。したがって、これらの結果は r VD R 1ァイソフォームが r V D R 0に対するドミナン卜ネガティブレセプターとして作用することを示唆する。

r VP R 1はホモダイマーとして VDREと結合する力；、 RXRとはへテロダイマー榨合体形成しない

r VDR 1のドミナン卜ネガティブ活性についての分子メ力二ズムを検討するため、コンセンサス VDRE (DR 3丁）との結合活性を試験し、 r VDR Oの結合活性と比較した。

このため、遺伝子組換え法により r V D R 0タンパク質と r V D R 1タンパク質とを生産した： r VDR Oおよび r VDR lの c DN Aのオープンリ一ディンダフレームからは、それぞれ 48 KD aおよび 40 KD aのタンパク質であることが予測された：精製した r VD R 0および r V D R 1タンパク質は S D S— P AGEゲル上で予測された分子量の位置に移動した（図 8) 。

DR 3 Tとの結合試験の結果、精製組換え r VDROタンパク質は、文献（Fr eedman et al. , Viol. Endocrinol. 8:265-273, 1994) に記載するように、 RX R がなくてもホモダイマ一として D R 3丁と結合した（図 9) r VDR lホモダイマ一もこれと同程度に D R 3 Tと結合した。次いで、マウス RX R aを r VD R0に加えると、ヘテロダイマー形成によって DN Λ結合が顕著に增加し、 RX R αに対する特異的モノク口一ナル抗体がこの D Ν Α—へテ口ダイマ一を認識し結合することにより、電気泳動のバンドがシフトした，これによつて複合体中に R X Rが存在することが確認された.，しかしながら、 r VD R lは r RXR ctとヘテロダイマ一を形成する二とができず、二れはヒト VD R ( h VD ) の C末端をもたない突然変異体 (Nakajima ct al. , Moし Endocrinol. 8: 159-172, 199 ■1) と同様に、ヘテロダイマ一形成に必要な C末端ドメインをもたないためであろと思われる。差替え用紙（規則 26) r VDR lは、コンセンサス甲状腺レスポンスエレメント（DR 4) およびレチノイン酸レスポンスエレメント（DR 5) とは特異的結合をせず（図 1 0) 、これは標的ェンハンサーエレメントに対する r VDR 1の特異性が r VDR 0と同じであることを示唆する。

VDRでは、 RAR、 1^ 1¾ゃ丁と同様に、 D N Λ結合ドメイン間に形成されるダイマー境界面がその同種のレスポンスエレメントとのレセプターダイマーの結合認識を特定するという従来の観察（例えば、 Rastinejad et al. , Nature 375:203-211, 1995) と今回の結果はよく一致する。

転写促進活性アツセィの結果をまとめると、 r VDR lが、ホモダイマ一として標的 VDRE (ビタミン Dレスポンスエレメント）と競合的に結合することによって、ビタミン Dシグナル伝達経路においてドミナン卜ネガティブレセプターとして作用することを示している。

本発明で得られた新規ラッ卜 VDRァイソフォーム（ r VDR l ) は選択的スプライシングによって生じた一次 r VDR耘写物であるが、 r VDR 1は r VD R 0ではイントロン 8に存在する余分のェキソンをもつ。この新しいェキソン

( r VD R 0中のィントロン 8) のストップコドンは C末端にあるリガンド結合ドメイン（86アミノ酸）の一部を失わせるが、 1 9アミノ酸を付加する。

ヒト V D Rアイソフォームの単離

既知のヒ卜 VD Kイントロン 8の酉己歹 lj (W094— 036 3 3号）よりイン卜ロン 8を特異的に增幅するプライマ一をデザインし、ヒトゲノム DNAよりイントロン 8を增幅した。このイントロン 8をランダムプライマ一により ³² P— d C T Pを取り込ませたプロ一ブとして用い、ヒト白血球 c DN Λライブラリ一（C1 oruech社）をスクリ一二ングし、ヒト VD Rイン卜ロン 7、ェキソン 8、イン卜ロン 8を含む c DNA断片を得た. ヒトの場合には、アミノ酸への翻訳の際にィントロン 7全長のフレームが合ってェキソン 8と連結するためにラッ卜の場合と異なり、イントロン 7も保持したアイソフォーム c ΟΝΛの断片をクローニングすろことができた..，

得られたし' DN Λ断片のヌクレオチド配列を決定し、配列番号： iに示すヌクレ

差替え用紙（規則 26) ォチド配列を有することを確認した。

ヒ卜の場合、イントロン 7も保持したクローンが得られたことから、他のアイソフォーム（例えば、イントロン 7のみをもつアイソフォーム、イントロン 7と 8をもつアイソフォーム、イントロン 8のみをもつアイソフォームなど）の存在が示唆される-, なお、ヒト VDRァイソフォームにおけるイントロン 7のヌクレォチド配列を配列表の配列番号 4に、またイントロン 8のヌクレオチド配列を配列番号 5に示す。

VD Rアイソフォームの機能とその利用

構造と機能の類似性から、 VDI^tRAR、 RX Rおよび TRとともに核内レセプターフ―パ—ファミリ—の中でサブファミリ—を形成する。しかしながら、

RAR、尺ゃ丁！^のァィソフォームタンパク質は選択的スプライシングおよびまたは異なるプロモータ一の使用によって組合わされる種々のェキソンからなっているので、 VDRはこのサブファミリ一中では特異なものであるといえるこいくつかの遺伝子では、イントロンをェキソンとして保持すると機能的に異なるァイソフォームタンパク質を生じることが既に知られている（Nakamura et al., Science 257:1138-1142, 1992) 力；、核內レセプタ一遺伝子ス一パ一ファミリ一のレセプタ一ァイソフォームとしてはこれが最初の例である,」このために、 RA R、 RX Rや T Rとは異なり、 V D Rァイソフォームはその c DN Aクロ一ニングがなされたにも拘わらず、その後も長く発見されなかったともの思われる _ 本発明の VD Rアイソフォームタンパク質はビタミン Dシグナル伝達経路においてドミナントネガティブレセプターとして作用する最近の報告（Morrison e t al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6665-6669, 1994) によると、ヒ卜 V DR遺伝子における対立遺伝子の変化が血中ォステオカルシンの濃度と骨密度に密接に関連する。骨密度は骨粗鬆症による骨折の危険性を予測する基準となりうるものであるこの報告によると、骨密度を予測するヒト VDR遺伝子の対立遗伝子変化はイントロン 8に位置するという.. したがって、本発明において得られた r V D R 1がラット V D R遣伝子のィントロン 8を保持することによって生じたものであることは極めて興味深い。本発明の VD Rアイソフォームタンパク質

差替え用紙（規則 26) を用いることによりビタミン Dシグナル伝達経路の調節メカニズムを解明し、また骨密度の改善などに使用することが期待できる。さらに、本発明の VDRアイソフォームタンパク質を用いて骨密度の診断を行うことも可能である：

また、本発明の VDRアイソフォームの発現量が種々の疾患と関係していると考えられる，疾患としては、骨粗鬆症、骨折、二次性甲状腺機能亢進症、免疫疾患、皮瘠疾患など VDRが関係していると考えられるすべての疾患におレ、て本発明のアイソフォームの発現の大小が発病と関連のある可能性がある。したがって、本発明の VDRァイソフォームの単離、性状決定はこれらの疾患の解明、治療に大きな意味を有する。

さらには、本発明の VD Rァイソフォームタンパク質を用いて、ビタミン D様物質のスクリーニングを行うことができる。例えば、本発明の VDRタンパク質をコードする遺伝子を適当な細胞にトランスフニク卜し、該細胞を用いてビタミン D様の作用（例えばカルシウム ·骨代謝作用、分化誘導作用、免疫抑制作用、抗腫瘍作用、脂肪 ·脂質代謝抑制作用）の少なくとも 1つをもつ物質（例えばステロイド、レチノイン酸）をスクリーニングすることができるつ

本スクリ一ニング系に本発明の VD Rアイソフォームタンパク質の遺伝子を用いれば，より生理的条件下に近い系を構築できる（実際に緊臓などではアイソフオームは既存の VDRの 1 0分の 1量ほど発現している）ため、既存の VDR遗伝子を用いたスクリ一ユング系よりも精度が上がると考えられる

本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。実施例

実施例 1 ： c DN Aおよびゲノム DN Aのクローニング

c DNAのクロ一ニング

r VDR Oのリガンド結合ドメインを含む X h o I — P s t 【制限酵素断片を放射性標識し、ラット胬臓 c D N Λライブラリ一（Clontech) をスクリーニングするプローブとして用いた. ハイブリダィゼーシヨン混合物には、 50%ホルム

差替え用紙（規則 26) アミド、 1 x D e n h a r d s溶液、 5 x S S P E、 1 00 μ g / m 1変性サケ精子 DNAおよび】 0⁶c p mの³² P—標識プローブ D N Aを含んでいた.. 二トロセルロース膜を 4 2 °C、 1 6時間ハイブリダィズさせ、 2 x S S C、 0. 1 %S DS中、 5 5°C、 30分、 2回洗浄した。膜を增感スクリーンを用いて一 8 0°Cで 1 6時間露光した _ς

r VDR0タンノク質 (Burmester et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA 85: 1005-1009, 1988) をコードするェキソンに対応するプライマ一を用いるポリメラ —ゼチェインリアクション（PCR) によってこれらのクロ一ンを分析し、 1 0 ⁶個のプラークから、】 0個の陽性クロ一ンを選択したこの中から同じアイソフオームである r VDR 1をコードする 2個のクローンをさらに選択した。すなわち、ヌクレオチド配列の決定を行ったところ、 1 0個の陽性クロ一ンのうち、 8 個が r VDROであり、 2個が r V D R 1であることが判明した。

ゲノム DNAのクローニング

r VD R 1 c DN Aの S ma 1 — K p n I断片をプローブとして用いて、ラットゲノムライブラリ一（C]ontech) 由来の B a mH I部位をもつ約 2 0 k bのゲノム断片をクローニングした。イントロン 8を含む P s t I部位をもつ 3. 5 k bの DNA断片をサブクローニングし、配列決定した。

得られた r VD R 1のヌクレオチド配列を配列番号 2に、推定ァミノ酸配列を配列番号 1に示す：また、 r VDR 0と比較した配列を図 ] に、 VDRゲノムの関連領域と選択的スプライシングによって生じる r VDR 1のマッピングを r V D R 0と比較して図 2に示す。実施例 2 ：ノーザンブロット分析

r VDR 0および r VDR 1転写物の発現を、ラット腸および ¾臓由来のポリ A ） mRNA 3 gを用いて、ノーザンブロッ卜分析により試験したプロ一ブとして r VDR 1のェキソン 8を用いた得られた結果を図 3に示す: r VD R 1転写物は r V D K ()が発現している腸と臓で発現していた. r V D「転写物の相対量は、特異的バンドをデンシトメ一ターでスキャニングして計算した

差替え用紙（規則 26) 3つ以上の試料の平均を求めたところ、 r V D R 1転写物の量は r VD R ()の量の 1ノ 1 5〜： 1 2 0であった実施例 3 ：プラスミドの構築

H i n d I I 1および X b a I制限部位をもつ合成ォリゴヌクレオチドをプラスミド p G CAT (Kato et al.， Cell 68:731-742, 1992) の対応する制限部位に揷入して CATレポ一タ一遺伝子を構築した。 CATレポ一タ一遺伝子およびゲルシフトアツセィでプローブとして用いたオリゴヌクレオチド配列は以下の通りである：

DR3G： 5' -AGCTTCAGGTCAGGAAGGTCAGT-3' ；

DR3T： 5' -AGCTTCAGTTCGGAAGTTCAGT-3' ；

DR4： 5' -AGCTTCAGGTCACGGAAGGTCAGT-3' ；

DR5： 5' -AGCTTCAGGTCACCGGAAGGTCAGT-3' ；

ヒ卜ォステオカルシン VD R E (OC) ：

5' -AGCTTGCTCGGGTAGGGGTGACTCACCGGGTGAACGGGGGCATCTCGACTCGT-3' マウスォステオボンチン VDR E (O PN) ：

5' -AGCTTGCTCGGGTAGGGTTCACGAGGTTCACTCGACTCGT-3'

また、 r V D R 0の S a c I — B a mil I断片を、 P C Rで増幅した r VD R 1断片（図 1中の 9 1 1〜 1 0 7 1 b p ) で置換することにより r V D R 1発現べクターを構築した。実施例 4 ：組換え VD Rタンパク質の発現と精製

r V D R ()および r V D R 1をコードする c D N Λを、 B a m H Iおよび E c o R 1制限部位を用レ、る P C Rにより增幅し、プラスミド p G E X— 2 T (Phar macia) の対応する部位に挿入した，これらのベクターを用いて大腸菌（ D H 5 α ) を形質転換し、 1 PT G ( 0. 1 mM) で誘導した

得られろ G S T融合タンパク質をグルタチオン 'セファロース 4 Bで精製した，各 G S T融合タンパク質 5 0 0 /i _gをトロンビン（ 5じ）で消化した後、グルタ

差替え用紙（規則 26) I 9

チオン 'セファロースに通してトロンビンと G S Tを除去した，フロースル一分画をさらに、 1 M N a C l、 .1 mM DTT、 1 0 %グリセロールを含む 5 () mM T r i s — H C Iバッファ一（pH 8. 0) で平衡化したセフアデックス G 2 00カラムにかけた- これらのタンパク質の純度は SD S— PAGEで 9 5 %以上であった。実施例 5 ： CATアツセィによる r VDR lの作用

r VDR 0に対する r VDR 1のドミナントネガティブ活性を試験した _c 3 b p (DR 3 T) のスへ一サ一を介して 2つの 5 ' — AGTTCAモチーフを含む CATレポ一タ一プラスミド、ならびにマウス RX R a (0. 5 μ g) 、 r VDR 0 (0. 5 u g ) および r VDR l ( 2 μ g) を発現するベクターで H e L a細胞を形質転換した：形質転換した細胞を 1 , 2 5— (OH) ₂D ( 1 0 nM) の存在下（丄）または不在下（一）に 44時間維持し、 p CH l 1 0内部対照べクタ一によって発現する β—力'ラクトシダ一ゼ活性によって CAT活性を正規化し、少なくとも 3つの独立した試験から得られる平均値 ±標準偏差で示したつ得られた結果を図 4に示す _c

図から明らかなように、 r VD R 1 自体は転写促進活性を有していなかった。し力し、 r VDR 0と r VDR 1 とをコトランスフエクシヨンした場合には、 H eし a細胞において、 r VDR0によるリガンド誘導の転写促進活性を阻害した, 実施例 6 ： r V D R 1の用量依存的活性

細胞を r VD R 0発現べクタ一 0. 5 jii g、ならびに 1， 2 5— (OH) 2D. ( 1 0 nM) の存在下に、図 5に示す量の V D R発現ベクター（ r VDR 0または r VDR l ) で形質転換した. CAT活性は実施例 5と同様の方法で計算した図 5から明らかなように、 r VDR0の存在下に r VD R 1発現べクタ一の添加量を増加すると、 r V D K 1 の阻害活性はより顕著になった。 r VD R O発現べクタ一を 5 μ g添加したときにもリガンド誘導の転写促進活性は抑制されなかつた,，差替え用紙（規則 26) 実施例 7 ：甲状腺ホルモンおよびレチノィン酸シグナル伝達経路に及ぼす r V D R 1の効果

4 b p (DR4 ：コンセンサス甲状腺ホルモンレスポンスエレメント）または 5 b p (D R 5 ：コンセンサスレチノィン酸レスポンスエレメント）のスぺ一サ一を介して 2つの 5，一 AGTTC Aモチーフを含む C ATレポータープラスミド、ならびにマウス RXR αおよびニヮトリ T R a (DR4用）あるいは RXR αおよびマウス RARa (DR 5用）を発現するベクターで、同種のリガンド [ 1 0 n M甲状腺ホルモン（丁³) 、 1 μ Μオールトランスレチノィン酸] の存在下または不在下に、細胞を形質転換した。 r VDR l発現ベクター（2 / g) でコトランスフエクションすることにより r VD R 1 の効果を試験した, CAT活性は実施例 5と同様の方法で計算した。

得られた結果を図 6に示す。 r VDR 1は同種のレセプターが存在するときには、レチノイン酸のコンセンサスレスポンスエレメント（DR 5) や甲状腺ホルモンのコンセンサスレスポンスエレメント（DR4) のリガンド誘導の転写促進活性を抑制しないことが判明した。実施例 8 ： r V D R 0に対する r V D R 1 の阻害活性の配列特異性

DR 3 G、 DR 3丁、ヒトォステオカルシン V D R E (OC) およびマウスォステオボンチン VDRE (OPN) を含む CATレボータ一プラスミド、ならびに RXRおよび VDR ( r VDROまたは r VDR 1 ) の発現ベクターを用いて、

1， 2 5 - (OH) ₂D₃ ( Ι Ο ηΜ) の存在下または不在下に、ト1 e L a細胞を形質転換した。 CAT活性は実施例 5と同様の方法で計算した _υ

得られた結果を図 7に示す r VD R 0に対する r V D R 1 の阻害程度は配列特異的であり、これはヒト · ォステオカルシン VD REよりもマウス · ォステオボンチンについての方が顕著であったまた、 D R 3丁は D R 3 Gよりも V D R

Eとしてより活性であることが観察された。

差替え用紙（規則 26) 実施例 9 ： r VDR 1のホモダイマーおよびへテロダイマ一形成ならびにその D N A結合性

(A) r V D R 1の分子量

実施例 4の方法により大腸菌中で r VD R 0および r VD R 1を G S T融合タンパク質として発現させ、ダルタチオン ' セファロ一ス 4 Bで精製した後トロンビンで消化した。消化した試料をセフアデックス G— 1 00カラムにかけてさらに r VDR Oと r VDR lタンパク質を精製したつ G S T融合タンパク質（図 8 中、 GST— r VDR Oまたは G ST— r VDR 1として示す）および精製 r V DRタンパク質（図 8中、 r VDR Oまたは r VDR 1 として示す）を 5%ポリアクリルアミド一 SDSゲルで電気泳動を行い、分子量マ一カーから分子量を測定した： r VD R 0および r VD R 1のオープンリ一ディングフレームから予期されたそれぞれの分子量（ r VD R 0では 48 KD a ； 1~ 01¾ 1では401 0 a) の位置にバンドが観察された。

(B) ゲルシフトアツセィ

文献 (Sasaki et al. , Biochemistry 34:370-377, 1995) 記載の方法を用いて、電気泳動移動シフトアツセィ（EMSA) および抗体スーパーシフトを行った：このアツセィには以下の精製レセプターも使用した：

R A ：大腸菌中で生成した AB領域を欠く部分精製マウス RAR ct

(mR A R αΔΛΒ) ；

RX R ：大腸菌中で生成した ΛΒ領域を欠く部分精製マウス RXR _α

(mRX RaAAB) ；

T ：大腸菌中で生成した部分精製ニヮトリ T R α _

杭体スーパ一シフトにはモノクローナル抗体 4 R X (RX R用）を用いた。レセブタ一および [³² Ρ] — 5—末端標識合成オリゴヌクレオチド（DR 3丁、 DR 3G、 01 4ぉょび131^ 5) を含む結合反応混合物、ならびにボリ（d i d C) (Pharmacia, 2 M g ) を、結合バッファ一 [ 1 0 mM T r i s - H C I ( p H 7. 5) 、 i mMジチオスレィ卜一ル、 1 mM EDT八、 l O O mM KC I 、 1 0%グリセ口一ル] 中、 2 5"Cで 1 5分インキュベートしたインキ

差替え用紙（規則 26) ュべ一シヨン開始時に抗体を添加した、文献（Sasaki et al. , Biochemistry 34 :370-377, 1995) 記載の方法により、得られた生成物を 5%ポリアクリルアミドゲルに溶解した。

をプローブとして用い、図 9に示す種々の量の精製マウス RX Ret (RXR) 、精製 r VDR 0および r VDR 1でゲルシフトアツセィを行った。得られた結果を図 9に示す。モノクローナル抗体（マウス RX Rct用の 4 RX) を用いるスーパ一シフト試験によって DR 3 T— RXR— VDR複合体の存在が確認された。図 9中、レーン 6のバンドは抗 RX R抗体でスーパ一シフトした複合体の位置を示す：これより r VDR 1ホモダイマーがコンセンサス VDRE (DR 3 T) と結合することが示された。

次に、 D R 4および D R 5をブローブとして用い、図 1 0に示す種々の量の精製 r VDR l、ニヮトリ TRct (TR) およびマウス RAR ct (RAR) でゲルシフトアツセィを行った。得られた結果を図 1 0に示す _c r VDR 1ホモダイマ —はコンセンサス甲状腺ホルモンレスポンスエレメントまたはレチノィン酸レスポンスエレメント（DR4および DR 5) と結合しなかったつ実施例 1 0 ：ヒト VDRアイソフォームの単離

ヒトゲノム DNAより VDRイントロン 8を特異的に P C R法により增幅し、ランダムプライム法にて放射性標識し、ヒト白血球 c DNAライブラリ一（Ciori tech社）をスクリーニングするプローブとした。ハイプリダイゼ一ション混合液には 50%ホルムアミド、 5 x D e n h a r d t ' s溶液、 5 x S S C、 0. 1 %S D S、 200 μ g/m I変性サケ精子 DNAおよび I 0 ^β c p mの³² P—標識ァローブ D N Λを含んでいた.」ニトロセルロース膜を 42。し'、 1 6時間ハイブリダイズさせ、 4 X S S C、 0. 1 % S D S中で 1回、 2 X S S C、 0. 1 % S D S中で 1回、 l x S S C、 0. 1 %S DS中で 1回それぞれ室温 1 0分間洗浄した，膜を增感スクリーンを用いて一 y o cで 1 e時間露光した- 4 x 1 ()。クロ一ンより約 1 . 4 k bのィンサ一トをもつ I個の陽性ク口一ンを得た，

得られたクローンのヌクレオチド配列を決定し、配列番号： 5のヌクレオチド酉己

差替え用紙（規則 26) 列を得た，このヌクレオチド配列には、ヒト V D Rイントロン 7、ェキソン 8、イン卜ロン 8を含むヒ卜 V D Rアイソフォームにおけるィントロン 7のヌクレォチド配列を配列表の配列番号 4に、またイントロン 8のヌクレオチド配列を配列番号 5に示す。

差替え用紙 (規則 26)

Μ

OZ 3VD3V30303 V iX 'J丄 0：)丄 V )i)V丄 VOLV ^VD'JVDVVDV V'JVVOIDIVI OOVVDDD'JOV 09S OIOIOVOVO!) VV011 309V VVOOVOVVV V'JV'JVV'J丄 VV IVOIVOVO'JO V0VV10D0V3 OOS VIOOVOOVOI VOVDVOIDDI VDII'JVO'JVV OIV'JIVDOOD IVOVOOiOlD 1303VVV31D Ol^ 1)33 0丄：) VCOOL VDV'J OO'JOOVVDVO i)VVCX)V:)丄 V3 3：)：)'：)丄丄 V VS 3丄 VV3丄丄: )0：) 081 lOlODVDlI'J 丄 iJVV i) ：) 'JVV 丄 DD 'JVDllD 11100VVV00 IDDOVVDl'Jl 0 - 1 33V01VI301 VV311DV331 1300V3V3D0 V033V0V001 'JIOIOV'J IO 1D1V003330 09 0103VV0030 V01113V010 OI30DV033D 013D01DDVD OVDDOOD'JVD VVDOOVOOIV

本二：璨^餺 mm - fS >½3i ΐ z o I ：

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Z

Lt600IL6SUXDd ZL\L lL6 OAV AAGACCTATG ACCCCACCTA CGCTGACTTC AGGGACTTCC GGCCTCCACT TCGTATGGAC 480

GGAAGTACAG GGAGCTATTC TCCAAGGCCC ACACTCAGCT TCTCCGGGAA CTCCTCCTCC 540

TCCAGCTCTG ACCTGTACAC CACCTCACTA GACATGATGG AACCATCCGG CTTTTCCAAC 600

CTGGATCTGA ACGGAGAGGA TTCTGATGAC CCGTCTGTGA CTCTGGACCT GTCTCCTCTC 660

TCCATGCTGC CCCACCTGGC TGACCTTGTC AGTTACAGCA TCCAAAAGGT CATCGGCTTT 720

GCCAAGATGA TCCCAGGATT CAGGGATCTC ACCTCCGATG ACCAGATTGT CCTGCTTAAG 780

TCAAGCGCCA TTGAGGTGAT CATGTTACGC TCCAACCAGT CTTTCACCAT GGATGATATG 840

TCCTGGGACT GTGGCAGCCA GGACTACAAG TACGACGTCA CCGATGTCTC CAAAGCTGGG 900

CACACCCTGG AGCTGATCGA GCCCCTCATA AAGTTCCAGG TGGGGCTGAA GAAGCTGAAC 960

TTACATGAGG AAGAGCATGT CCTTCTCATG GCCATCTGCA TTGTCTCCCC GGGTACGGAG 1020

CCTGGCAGGG AGGAGCTGAG GGACCTGGGA CACGTTGGGG ACTGTGAATG A 1071 配列番号： 3

配列の長さ： 1 4 0 4

配列の型：核酸

鎖の数：二本

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c D N A

配列

ATGGAGGCAA TGGCGGCCAG CACTTCCCTG CCTGACCCTG GAGACTTTGA CCGGAACGTG 60

CCCCGGATCT GTGGGGTGTG TGGAGACCGA GCCACTGGCT TTCACTTCAA TGCTATGACC 120

TGTGAAGGCT GCAAAGGCTT CTTCAGGCGA AGCATGAAGC GGAAGGCACT ATTCACCTGC 180

CCCTTCAACG GGGACTGCCG CATCACCAAG GACAACCGAC GCCACTGCCA GGCCTGCCGG 240

CTCAAACGCT GTGTGGACAT CGGCATGATG AAGGAGTTCA TTCTGACAGA TGAGGAAGTG 300

CAGAGGAAGC GGGAGATGAT CCTGAAGCGG AAGGAGGAGG AGGCCTTGAA GGACAGTCTG 360

CGGCCCAAGC TGTCTGAGGA GCAGCAGCGC ATCATTGCCA TACTGCTGGA CGCCCACCAT 420

AAGACCTACG ACCCCACCTA CTCCGACTTC TGCCACTTCC GGCCTCCAGT TCCTGTGAAT 480

GATGGTGGAG GGAGCCATCC TTCCAGGCCC AACTCCAGAC ACACTCCCAG CTTCTCTGGG 540

差替え用紙 (規則 26) GACTCCTCCT CCTCCTGCTC AGATCACTGT ATCACCTCTT CAGACATGAT GGACTCGTCC 600

AGCTTCTCCA ATCTGGATCT GAGTGAAGAA GATTCAGATG ACCCTTCTGT GACCCTAGAG 660

CTGTCCCAGC TCTCCATGCT GCCCCACCTG GCTGACCTGG TCAGTTACAG CATCCAAAAC 720

GTCATTGGCT TTGCTAAGAT GATACCAGGA TTCAGAGACC TCACCTCTGA GGACCAGATC 780

GTACTGCTGA AGTCAAGTGC CATTGAGGTC ATCATGTTGC GCTCCAATGA GTCCTTCACC 840

ATGGACGACA TGTCCTGGAC CTGTGGCAAC CAAGACTACA AGTACCGCGT CAGTGACGTG 900

ACCAAAGGTA TGCCTAGNNN NCACCTCCTG GGGAGTCTTT TTCAGCTCCC AGATTCTGGC 960

TCCACCCGTC CTGGGGTTTG GCTCCAATCA GATACATGGG AGGGAGTTAG GCACCAACAG 1020

GCAGAGAAGG GCGAGGGTCA GACCCATGGG GTTGGAGGTG GGTGGGCGGC TCCTCAGCTC 1080

TTGCCCGCAG TACCTCCCCA TTGTCTCTCA CAGGCCGGAC ACAGCCTGGA GCTGATTGAG 1 140

CCCCTCATCA AGTTCCAGGT GGGACTGAAG AAGCTGAACT TGCATGAGGA GGAGCATGTC 1200

CTGCTCATGG CCATCTGCAT CGTCTCCCCA GGTATGGGGC CAGGCAGGGA GGAGCTCAGG 1260

GACCTGGGGA GCGGGGAGTA TGAAGGACAA AGACCTGCTG AGGGCCAGCT GGGCAACCTG 1320

AAGGGAGACG TAGCAAAAGG AGACACAGAT AAGGAAATAC CTACTTTGCT GGTTTGCAGA 1380

GCCCCTGTGG TGTGTGGACG CTGA 1404 配列番号： 4

配列の長さ： 2 1 0

配列の型：核酸

鎖の数：二本

トボロン一：直鎖状

配列の種類： c D N A

配列

GGTATGCCTA GNNNNCACCT CCTGGGGAGT CTTTTTCAGC TCCCAGATTC TGGCTCCACC 60

CGTCCTGGGG TTTGGCTCCA ATCAGATACA TGGGAGGGAG TTAGGCACCA ACAGGCAGAG 120

AAGGGCGAGG GTCAGACCCA TGGGGTTGGA GGTGGGTGGG CGGCTCCTCA GCTCTTGCCC 180

GCAGTACCTC CCCATTGTCT CTCACAGGCC 210

差替え用紙（規貝 IJ26) 配列番号： 5

配列の長さ： 1 7 3

配列の型：核酸

鎖の数二本

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c D N A

配列

GTATGGGGCC AGGCAGGGAG GAGCTCAGGG ACCTGGGGAG CGGGGAGTAT GAAGGACAAA 60 GACCTGCTGA GGGCCAGCTG GGCAACCTGA AGGGAGACGT AGCAAAAGGA GACACAGATA 120 AGGAAATACC TACTTTGCTG GTTTGCAGAG CCCCTGTGGT GTGTGGACGC TGA 173

差替え用紙（規則 26)

Claims

請求の範囲

1 . ビタミン Dレセプターアイソフォームタンパク質をコ一ドする遺伝子。 2 . ビタミン Dレセプタ一アイソフ； rームタンハク質をコードする遺伝子がラット由来である請求項 1記載の遺伝子。

3 . 配列番号 1に示すァミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、または配列番号 1に示すァミノ酸配列の一部を置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列であってビタミン Dレセブターアイソフォームタンパク質活性を有するタンパク質をコ一ドするヌクレオチド配列、あるいはこれらにハイブリダイズするヌクレォチド配列を含む D N Aである請求項 1または 2記載の遺伝子。

4 . 配列番号 2に示すヌクレオチド配列を有する請求項 3記載の遺伝子。 δ . ビタミン Dレセプターアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子がヒト由来である請求項 1記載の遺伝子。

6 . 配列番号 4および/または配列番号 5に示すヌクレオチド配列を含む請求項 5記載の遺伝子。

7 . 配列番号 3に示すヌクレオチド配列、またはこれを一部置換、欠失もしくは付加したヌクレオチド配列、あるいはこれらにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む D Ν Αである請求項 5または 6記載の遺伝子。

8 . 請求項 1記載の遺伝子を含む組換えべクタ一 _

9 . 請求項 8記載の組換えベクターにより形質転換された原核もしくは真核宿主細胞，

1 0 . 請求項 9記載の宿主細胞を培赛することによって得られるビタミン Dレセプタ一アイソフォームタンパク質，

1 . 請求項 1 0記載のビタミン Γ)レセブタ一アイソフォームンパク質を認識する抗体

1 2 . 請求項 1 0記載のビタミン Dレセブタ一アイソフォームタンパク質を用いた骨密度の診断方法

1 3 . 請求項 1 ()記載のビタミン Dレセブターアイソフォームタンパク質を用い

差替え用紙（規則 26) たビタミン D様物質のスクリ一二ング法.:

差替え用紙（規則 26)