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WO1997041250A1 - Procede pour produire une proteine morphogenetique osseuse de maturation - Google Patents

Procede pour produire une proteine morphogenetique osseuse de maturation Download PDF

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WO1997041250A1
WO1997041250A1 PCT/JP1997/001474 JP9701474W WO9741250A1 WO 1997041250 A1 WO1997041250 A1 WO 1997041250A1 JP 9701474 W JP9701474 W JP 9701474W WO 9741250 A1 WO9741250 A1 WO 9741250A1
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WO
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human
mature
ala
leu
gly
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PCT/JP1997/001474
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Inventor
Mikiko Takahashi
Fusao Makishima
Michio Kimura
Original Assignee
Hoechst Marion Roussel Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a mature osteoinductive factor. More specifically, the present invention relates to a method for producing a mature osteoinductive factor, which comprises causing a processing enzyme to act on an osteoinductive factor precursor.
  • BMP bone morphogenic protein
  • TGF- / 3 superfamily All of the proteins belonging to the TGF- / 3 superfamily are synthesized as precursors in vivo based on their gene structures, undergo various processes, and become mature (active) peptide dimers. It is thought to form the body. It is known that the mature form of human TGF- / 91 is a dimer of a peptide with 112 residues at the C-terminal side (Nature 316, 701-705, 1985). When BMP-2 or BMP-6 Vgr-1 is produced by introducing cDNA encoding a precursor into animal cells, the culture supernatant contains not only the matured peptide dimer but also the matured peptide dimer.
  • peptide dimers of higher molecular weight than various mature forms (dimers composed of monomers with large molecular weight, and heterodimers composed of monomers with large molecular weight and matured monomers) (Growth Factors 7, pp. 139-150. 1992, J. Biol. Chera. 126, P. 1595-1609, 1994) 0 Peptides with a higher molecular weight than these mature forms
  • a dimer represents a molecule that is undergoing processing from a precursor to a mature form. Conceivable.
  • the peptide dimer having a molecular weight larger than the mature form is hereinafter referred to as a precursor dimer.
  • it is technically necessary to selectively produce a large amount of a peptide dimer of a single molecular weight for example, only a mature dimer, or to efficiently separate them. It was very difficult and a solution was desired.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing a large amount of only a mature dimer having a single molecular weight in animal cells from precursor dimers of various molecular weights of an osteoinductive factor. Is to do.
  • the present inventors can efficiently produce a large amount of a mature dimer in animal cells without using a precursor dimer using recombinant DNA technology. It succeeded for the first time.
  • the mature osteoinductive factor is produced by allowing a processing enzyme to act on the osteoinductive factor precursor.
  • the action of the processing enzyme on the osteoinductive factor precursor is performed by introducing the expression vector of the osteoinductive factor precursor and the expression vector of the processing enzyme into an animal cell line, and culturing the cell line. Then, the mature osteoinductive factor is produced, and the mature osteoinductive factor is obtained by separating the mature osteoinductive factor from the culture solution.
  • the action of the processing enzyme on the osteoinductive factor precursor is also performed by adding a solution containing the processing enzyme to the solution containing the osteoinductive factor precursor, and By incubating, mature osteoinductive factors can be obtained.
  • an expression vector for a human MP52 precursor and an expression vector for a secretory furin mutant are introduced into an animal cell line, and the cell line is cultured to produce a mature bone inducing factor. It is produced by separating the mature osteoinductive factor from the culture solution.
  • the mature osteoinductive factor means an osteoinductive factor substantially consisting of an amino acid sequence homologous to the C-terminal 112 amino acid residues of activated human TGF-1. It is considered that the activity of the osteoinductive factor is in the amino acid sequence region homologous to the C-terminal 112 amino acid residues of this activated human TGF1 / 31, and the remaining amino acid sequence region is included as much as possible. Preferably not.
  • a processing enzyme a group of Kex2-like proteases, furin, PC-2, PC-3, PAC4, PC6 and the like are used.
  • furin is preferably used.
  • the cDNA encoding furin a DNA nucleotide sequence encoding the entire amino acid sequence of furin can be used, but preferably, it does not contain a transmembrane domain, and it is more specific for amino acid sequence cleavage.
  • Use a DNA base sequence that encodes the amino acid sequence that maintains the activity hereinafter referred to as secreted furin mutant).
  • the secreted furin mutant cDNA is The DNA fragment is cloned from the total RNA extracted from the human cell line HepG2 (ATCC HB8065) by the RT-PCR method using synthetic DNA primers.
  • the DNA base sequence of this secreted furin mutant cDNA is nucleotides 163 to 2014 in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • a secretory furin mutant expression vector is constructed by inserting this DNA fragment into an expression vector.
  • the expression vector used herein contains a restriction enzyme site for cloning the gene to be expressed and a poly (A) addition signal downstream of the eukaryotic promoter. Further, the expression vector may have a drug resistance marker which is advantageous for selecting a transformant.
  • Such expression vectors include, for example, the pRc / CMV gene containing the human cytomegalovirus promoter, the gene enhancer, the polylinker, the pesticidal growth hormone poly A-added signal, and the neomycin resistance marker. (Available from INVITR0GEN).
  • the present invention can be used for a method for producing a protein whose osteoinductive factor belongs to human TGF- ⁇ -perfamily.
  • it can be used for a method for producing an mature osteoinductive factor having a single molecular weight of MP52, BMP-2, BMP-4, BMP-6, or BMP-7.
  • an osteoinductive factor human MP52 having osteoinductive activity disclosed in PCT applications WO 93/1 6099 and WO 95/04819 is suitably used.
  • a human MP52 precursor expression vector is constructed by inserting cDNA encoding human MP52 precursor into an expression vector, and introduced into animal cells to form a precursor, and The purpose is to produce an animal cell line producing a mature MP52 dimer.
  • animal cells suitable as host cells are, for example, Chinese hamster ovary (CH0) cells, BHK cells, 293 cells, mouse L cells, etc., but CHO cells are preferable.
  • This human MP52-producing animal cell line (MC-2: Deposit No. FERM BP-5142) is further introduced with a secretory furin mutant expression vector to co-express both proteins. As a result, only the mature MP52 dimer can be produced in the culture supernatant.
  • the conversion of the precursor to the mature form is accomplished by mixing the solution containing the processing enzyme with the solution containing the precursor and heating overnight at 32 to 40 ° C, preferably 37 ° C. It can also be achieved.
  • the mature osteoinductive factor obtained by the method of the present invention can be used for treating bone, bone or tooth damage by mixing a pharmaceutically acceptable carrier substance, additive substance, diluent and / or excipient as necessary. Or it can be applied to prophylaxis and artificial roots.
  • osteoinductive factors such as intravenous, intramuscular and intraperitoneal injections, oral administration, parenteral administration, such as suppositories, or any other It can be administered systemically by the usual method.
  • parenteral administration such as suppositories, or any other
  • a matrix containing a mature osteoinductive factor into a region close to a fractured bone.
  • Suitable matrices are natural polymers such as collagen and fibrin glue and artificial polymers such as polylactic glycolic acid copolymer.
  • osteoinductive factors can be coated, for example, on the surface of the bone or tooth to be transplanted with collagen paste, fibrin glue and other adhesive materials.
  • collagen paste for example, collagen paste, fibrin glue and other adhesive materials.
  • fibrin glue for example, collagen glue, fibrin glue and other adhesive materials.
  • bone grafts it can be used for both natural and artificial bones.
  • the dosage of the mature osteoinductive factor is determined based on the purpose and method of application. Generally, for systemic administration, the dosage will be from 1 iz g to 100 z gZkg. When used for topical administration, the preferred dosage is 30 g to 30 mg mg site.
  • Figure 1 shows the expression vector pDfurpRC / CMV (7.2 kb) for the human secretory furin mutant. This is the plus map.
  • Figure 2 shows the plasmid map of human PM52 expression vector PMSS99 (5. Okb).
  • FIG. 3 is a photograph of a western blotting analysis of a cell-free cocultured cell line of a mature human MP52 dimer and a human secretory furin mutant under reducing conditions.
  • FIG. 4 shows that under the reducing conditions, various precursor human MP52 dimers are converted into mature MP52 by the action of a human secretory furin mutant. It is a photograph of a stern blotting analysis chart.
  • the human protein From the N-terminal side, the human protein has a domain structure such as signal peptide, subtilisin-like proteinase domain, transmembrane domain, and cytoplasmic domain.
  • a human secreted furin mutant cDNA encoding the N-terminal side lacking the transmembrane domain was cloned by the RT-PCR method and used for expression.
  • RNA was extracted from human Hep G2 cells and used as type III upstream antisense primer-1 (positions 931 to 914 of the cDNA sequence of human furin shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing).
  • a reverse transcription reaction was performed with rTth RNA polymerase using the antisense primer 1-2 (2095 to 2071) on the downstream side.
  • sense primer 3 SEQ ID NO: 2
  • antisense primer 4 SEQ ID NO: 2 No. 3
  • a combination of sense primer 5 (SEQ ID NO: 4) and antisense primer 6 (SEQ ID NO: 5) in the PCR reaction and the two upstream and downstream cDNA fragments Obtained.
  • the human secretory furin mutant cDNA was excised by digestion with Hind m—Xba I, and inserted into the Hind HI—Xba I site of the pR cZCMV vector purchased from INVITR0G EN.
  • An expression vector pDfurpRCZCMV for the secretory furin mutant cDNA was prepared.
  • a DNA fragment containing the human MP52 gene was isolated by Hind Ifl digestion from pSK52s plasmid containing the human MP52 gene provided by Dr. Hoetten of Biopharra GmbH, and Dr. Zettlmeissl of Behringwerke AG was used. Was inserted into the Hind m site of the pABstop vector provided by the company, and the human MP52 expression vector PMSS99 shown in FIG. 2 was prepared. Its structure was confirmed by DNA sequencing and restriction enzyme digestion.
  • the human MP52 DNA base sequence of pMSS99 was a nucleotide from the 576th position to the 229th position shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
  • Production of human MP52 was assayed by Westin blotting analysis as described in (5). Furthermore, MTX was added to the culture medium of the human MP52-producing cell line, and the concentration was sequentially increased to select a cell line in which the MP52 gene was amplified.
  • a cell line MC-2 producing precursor human MP52 dimers of various molecular weights and mature human human MP52 dimers was obtained.
  • This cell strain MC-2 was deposited with the Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Institute of Biotechnology and Industrial Technology (1-1-3, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) on June 21, 1995, and was deposited with FE RM BP—5 1 4 Deposited as 2.
  • Human MP52 and the human secretory furin mutant were expressed by introducing the human secretory furin mutant expression vector into the human MP52-producing CHO cell line MC-2.
  • Establishment of expression cell line The CHO cell line MC-2, which produces various precursor human MP52 dimers and mature MP52 dimers, was added to a human secretion-free mutant expression vector pDfurpRCZCMV and calcium phosphate DNA.
  • Established a cell line co-expressing human MP52 and a human secretory fly mutant by selecting transformed cells in the presence of 333 xg / inl G418 and 40 OnM MTX by co-precipitation. did.
  • pDfurpRC / CMV Using 4.8 fig, a calcium phosphate DNA coprecipitate was prepared in the same manner as in Example 1 (2), layered on MC-2 cells in a 1 Ocm dish, and left at room temperature for 30 minutes. and. then ribonucleic and de O carboxymethyl ribonucleotide free MEM- ALPHA containing 10% FBS (MEM- ⁇ -) medium 8 ml was added to the cell layer, and 4-6 hours of culture in C0 2 incubator scratch.
  • This peptide was found to form a mature MP 52 dimer with a molecular weight of about 28 K when analyzed under non-reducing conditions.
  • MP 52 expressing cell line MC Approximately 3 to 8 times of 2 was approximately 8 / ml / 24 hours.
  • a cell line that produces only mature MP52 dimer in a larger amount than the conventional method has been established by using the co-expression system of human MP52 and human secretory furin mutant. For the first time.
  • amino acid sequence 1 is derived from Arg 354 of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing, and amino acid sequence 2 is derived from A1a 355, and the molar ratio is considered to be about 1: 1. I got it.
  • CHO-DKX-Bil cells provided by Dr. Zettlmeissl of Behringwerke were added to the human secretory furin mutant expression vector pDfurpRC shown in Example 1 (1).
  • / CMV was introduced by the calcium phosphate DNA coprecipitation method, and the transformed cells were selected in the presence of G418 to establish a human secretion-type furin mutant high-expressing strain.
  • a coprecipitate of pDfurpRCZCMV and calcium phosphate was prepared according to the method described in Example 1 (3), layered on CHO-DUKX-B11 cells in a 1-cm dish, and left at room temperature for 30 minutes.
  • MEM-AL PHA (MEM- ⁇ + ) medium containing ribo and deoxyribonucleotides containing 10% FBS was added to the cell layer, and the cells were cultured in a CO 2 incubator for 4 to 6 hours. After treating the cells with 10% glycerol at room temperature for 3 minutes, the cells were replated in MEM- ⁇ + medium containing 10% FBS and 400 UgZml G418 to select a transformant.
  • the cell line producing the human secretory furin mutant was assayed by the enzymatic activity measurement method described in Example 1 (6), and a cell line producing ⁇ / ⁇ time as the furin activity was obtained.
  • Serum-free culture of human MP52-producing CHO cell line MC-2 serum-free culture supernatant (including precursor and mature MP52 dimer) Supernatants (100 OUZml) were mixed at various ratios and heated at 37 ° C for one hour. After the reaction, the ⁇ ⁇ stamp lotting analysis described in Example 1 ⁇ 5) was performed under reducing conditions to examine the conversion of the precursor MP52 to the mature form. A photograph of the result is shown in FIG. In lanes 1 to 5, mixed solutions of the culture supernatant of MC-2 at 1 // 1 minute and various volumes of the culture supernatant of the cell line expressing the human secretory furin mutant are flown, respectively.
  • the final strain of the human secretory furin mutant is 0 UZni in Lane 1, 50 U / ml in Lane 2, 100 UZ ml in Lane 3, 200 U / ml in Lane 4, and 400 U Zml in Lane 5. .
  • the bands of the precursor MP52 monomer are indicated by arrows A and B, and the band of the mature MP52 monomer is indicated by arrows C.
  • Fig. 4 when the culture supernatant of the cell line expressing the human secretory furin mutant was added at a final activity concentration of 20 OUZml or more, MP All 5 2 had been converted to the mature form. As a result, the mature MP5 2 dimer increased about 3-fold.
  • mature osteoinductive factors have been obtained by separating from a mixture of dimers of various molecular weights of osteoinductive factors produced by animal cells. It has been difficult to obtain a mature osteoinductive factor because no technology has been developed to produce it in large quantities or to efficiently separate mature osteoinductive factors from the above mixture.
  • a mature osteoinductive factor can be produced from an osteoinductive factor precursor, so that it is easy to obtain a large amount of a mature osteoinductive factor.
  • the mature osteoinductive factor obtained by the method of the present invention is a substance having a high purity consisting of a peptide having substantially a single molecular weight, and is particularly suitable for use as a medicament.
  • Organism name Hoku (homo sapiens)
  • Tissue type Human hepatocellular carcinoma
  • ATC CAC ATC TAC AGT GCC AGC TGG GGC CCC GAG GAT GAC GGC AAG ACA 1002 He His lie Tyr Ser Ala Ser Trp Gly Pro Glu Asp Asp Gly Lys Thr
  • Ala Gly lie lie Ala Leu Thr Leu Glu Ala Asn Lys Asn Leu Thr Trp
  • TTTCCCATCC TACCCTCGGG CCCACCTGGC CACCTGAGGT GGGCCCAGGA CCAGCTGGGG 2784
  • AAAGCAATAA TGGTCCCATC CAGGCAGTCG GGGGCTGGCC TAGGAGATAT CTGAGGGAGG 3024
  • GGCTCGCCAT GCCGGGGGTT CATAGGTCAC TGGCTCTCCA AGTGCCAGAG GTGGGCAGGT 3804
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Hoku (homo sapiens)
  • Tissue type human fetus

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Description

明 細 害
成熟型骨誘導因子の製造方法
技 術 分 野 一
本発明は、 成熟型骨誘導因子の製造方法に関する。 さらに詳しくは、 本 発明は、 骨誘導因子前駆体にプロセシング酵素を作用させることを特徴と する成熟型骨誘導因子の製造方法に関する。
背 景 技 術
骨基質に蛋白性の骨誘導因子が存在することが Uristらにより発見され (Science 150, pp.893- 899, 1965)、 bone morphogenic protein (以下 BMP と略す） と命名された。 近年、 複数の BMP関連遺伝子がクロ一ニングさ れ、 いずれも トランスフォーミ ング成長因子一 ^ (以下 TGF— ^と略す） スーパーファミ リーに属していることが知られている。 これらのうち、 い くつかは組換体が生産され、 それを用いて骨誘導活性が確認され、 骨疾患 の治療への応用が期待されている。
これらの TG F— /3スーパーファミ リーに属する蛋白質は、 その遺伝子 構造から生体内では、 いずれも前駆体として合成された後、 種々のプロセ シングを受け、 成熟型 （活性型） のペプチド二量体を形成すると考えられ ている。 ヒ ト TG F— /9 1の成熟型は C末端側 112残基のぺプチドのニ量 体であることが知られている （Nature 316, 701-705, 1985)。 実際に動物 細胞において、 前駆体をコードする c DNAを導入することにより BMP — 2、 あるいは BMP— 6 Vgr— 1を生産させると、 培養上清中には、 成熟 型のぺプチドニ量体のほかに、 種々の成熟型よりも大きな分子量のぺプチ ドニ量体 （分子量の大きな単量体から成る二量体、 および分子量の大きな 単量体と成熟型の単量体から成るヘテロ二量体） が多く含まれることが知 られている （Growth Factors 7， pp.139-150. 1992, J. Biol. Chera. 126, P.1595-1609, 1994)0 これらの成熟型よりも大きな分子量のペプチド二 量体は、 前駆体から成熟型へのプロセシング途中にある分子に相当すると 考えられる。 この成熟型より大きな分子量のぺプチドニ量体を以下前駆体 二量体と呼ぶ。 これら種々の二量体のうち、 ある単一の分子量のペプチド 二量体、 たとえば成熟型二量体のみを選択的に大量に産生させたり、 ある いは効率よく分離することは、 技術的に非常に困難であり、 その解決が渴 望されていた。
発 明 の 開 示
本発明の目的は、 骨誘導因子の種々の分子量の前駆体二量体の中から、 単一の分子量からなる成熟型二量体のみを、 動物細胞において、 効率よく 大量に生産する方法を提供することにある。
近年、 高等動物における蛋白質の前駆体からのプロセシング酵素として、 —群の K e X 2様プロテアーゼ、 フ リ ン （furin) 、 P C— 2、 P C— 3、 P A C E 4、 P C 6等が同定された （Biochem. J . 299, pp. 1-18, 1994)。 このうち、 フ リ ンは C末端に疎水性の膜貫通領域を持ち、 細胞内のゴルジ 膜に局在する。 ヒ トフ リ ンをコ一ドする c D N A配列は van den Ouweland らにより既に報告されている （Nucleic Acids Res. 18, PP. 664, 1990)。 フリ ンはその切断部位の上流 4ァミ ノ酸の配列として Arg— X !—X g— Arg ( X ,は任意のァミノ酸、 X 2は任意のァミ ノ酸のうち主に Ly sあるいは A rg を示す） を認識するがことが明らかにされた （J . Biol. Chem. 266, pp. 12127-12130, 1991)。 さらに、 フリ ンは膜貫通ドメイン以降を欠いた N末 端側だけを動物細胞で発現させると細胞外に分泌され、 その分泌部位のみ でもアミノ酸配列特異的な切断活性を維持していることが報告されている (J. Biol. Chem. 269, pp. 25830-25837, 1994)。
本発明者らは、 このフリ ンを用いることにより、 動物細胞において、 前 駆体二量体を含むことなく、 成熟型二量体のみを、 組換え D N A技術を用 いて効率よく大量に産生させることに初めて成功した。
本発明によれば、 成熟型骨誘導因子は骨誘導因子前駆体にプロセシング 酵素を作用させることにより製造される。 本発明によれば、 骨誘導因子前駆体へのプロセシング酵素の作用は、 骨 誘導因子前駆体の発現ベクターおよびプロセシング酵素の発現ベクターを 動物細胞株に導入することにより行われ、 該細胞株を培養して成熟型骨誘 導因子を産生せしめ、 培養液から成熟型骨誘導因子を分離することにより 成熟型骨誘導因子が得られる。
さらに本発明によれば、 骨誘導因子前駆体へのプロセシング酵素の作用 は、 骨誘導因子前駆体を含有する溶液にプロセシング酵素を含有する溶液 を加えることによつても行われ、 該混合溶液をィンキュペートすることに より成熟型骨誘導因子が得られる。
好適には、 ヒ ト M P 5 2前駆体の発現ベクターおよび分泌型フリ ン変異 体の発現べクターを動物細胞株に導入し、 該細胞株を培養して成熟型骨誘 導因子を産生せしめ、 培養液から成熟型骨誘導因子を分離することにより 製造される。
本発明において、 成熟型骨誘導因子とは、 活性型ヒ ト T G F— 1の C 末端側 1 1 2アミノ酸残基と相同性のあるアミノ酸配列から実質的に構成 される骨誘導因子を意味する。 骨誘導因子の活性はこの活性型ヒ ト T G F 一 /3 1の C末端側 1 1 2アミノ酸残基と相同性のあるアミノ酸配列領域に あると考えられ、 それ以外のァミノ酸配列領域はできるだけ含まないのが 望ましい。
本発明において、 プロセシング酵素としては、 一群の K e x 2様プロテ ァーゼ、 フ リ ン、 P C— 2、 P C— 3、 P A C E 4、 P C 6などが使用さ れる力 特にフリンが好適に使用される。 フリンをコードする c D N Aと しては、 フリ ンの全ァミノ酸配列をコードする D N A塩基配列を用いるこ とができるが、 好ましくは、 膜貫通ドメインを含まず、 しかもアミノ酸配 列特異的な切断活性を維持しているアミノ酸配列部分 （以下、 分泌型フリ ン変異体という） をコードする D N A塩基配列を用いる。
本発明の好ましい実施態様においては、 分泌型フリン変異体 c D N Aを 含む DN A断片を、 ヒ ト細胞株 H e p G 2 (ATCC HB8065) から抽出した トータル RNAから、 合成 DNAプライマーを用いた RT— P CR法によ りクローニングする。 この分泌型フリン変異体 c DNAのDNA塩基配列 は、 配列表の配列番号 1の 163番目から 201 4番目のヌクレオチドで ある。 さらにこの DNA断片を、 発現用ベクターに挿入することにより分 泌型フリ ン変異体発現ベクターを構築する。 ここで用いる発現用ベクター は、 真核細胞プロモーターの下流に、 発現させる遺伝子をクローニングす る制限酵素サイ ト、 ポリ A付加シグナルを含む。 更に、 この発現用べクタ 一は形質車云換体の選別に有利な薬剤耐性マーカーを有していても良い。 こ のような発現用べクタ一として、 例えば、 ヒ トサイ 卜メガロウィルスプロ モータ一 . ェンハンサ一、 ポリ リ ンカ一、 ゥシ成長ホルモンボリ A付加シ グナル及びネオマイシン耐性マーカーを含む p R c /CMV (INVITR0GEN 社より入手可能） などを用いることができる。
本発明は、 骨誘導因子がヒ ト TG F一 β ーパーつァミ リ一に属する蛋 白質の製造方法に用いることができる。 例えば、 MP 52、 BMP— 2、 BMP— 4、 BMP— 6、 あるいは BMP— 7の単一な分子量からなる成 熟型骨誘導因子の製造方法に用いることができる。 特に骨誘導因子として、 P C T出願 WO 93/1 6099および WO 95/048 1 9に開示され ている骨誘導活性を有するヒ ト MP 52が好適に用いられる。 好ましい実 施態様は、 ヒ ト MP 52前駆体をコードする c DN Aを発現用ベクターに 挿入してヒ 卜 MP 52前駆体発現ベクターを構築し、 動物細胞に導入する ことにより、 前駆体、 および成熟型 MP 52二量体を産生している動物細 胞株を作製することである。 ここで宿主細胞として適した動物細胞は、 例 えばチャイニーズハムスターォバリー （CH0) 細胞、 BHK細胞、 293 細胞、 マウス L細胞などであるが、 CHO細胞が好適である。 このヒ ト MP 52産生動物細胞株 （MC— 2 ：寄託番号 FERM BP- 5142) に、 分泌型 フリン変異体発現べクタ一をさらに導入し、 両蛋白質を共発現させること により、 その培養上清中に、 成熟型 M P 5 2二量体のみを生産させること ができる。
さらに、 前駆体からの成熟型への変換は、 プロセシング酵素を含む溶液 を前駆体を含む溶液と混合し、 3 2〜4 0 °C、 好ましくは 3 7 °Cで一晩加 温することにより達成することもできる。
本発明の方法によって得られる成熟型骨誘導因子は医薬品で許容されう る担体物質、 添加物質、 希釈剤および （または） 賦形剤を必要により配合 して骨、 钦骨または歯の損傷の治療または予防、 人工歯根に適用すること ができる。
骨代謝異常に因る骨疾患の治療のためには、 成熟型骨誘導因子を注射、 例えば静脈注射、 筋肉内注射および腹腔内注射、 経口投与、 非経口投与、 例えば座剤、 また他のいずれかの常法により全身投与する事ができる。 骨折の治療のためには、 これらのものは注射、 経口および非経口投与に より全身または局所投与することができる。 また、 成熟型骨誘導因子を含 むマトリ ックスを骨折した骨に近い領域に移植するのが好ましい。 適当な マトリ ックスは、 天然重合体例えばコラーゲンおよびフイブリン接着剤お よび人工重合体例えばボリ乳酸グリコール酸共重合体である。
整形外科的再構築、 骨移植および人工歯根の場合、 成熟型骨誘導因子を 例えば移植すべき骨または歯の表面にコラーゲン ·ペースト、 フイブリン 接着剤およびその他の接着物質によって被覆することができる。 骨移植の 場合、 このものは天然および人工骨双方に使用することができる。
成熟型骨誘導因子の投与量は、 目的および適用方法に基づいて定めら れる。 一般に、 全身投与の時は、 投与量は 1 iz g〜l 0 0 z gZkgである。 局所投与に使用するときは、 好適な投与量は 3 0 g〜3 O mgZ部位であ る。
図面の簡単な説明
図 1はヒ ト分泌型フリ ン変異体の発現ベクター pDfurpRC/CMV ( 7. 2kb) のプラスミ ドマップである。
図 2はヒ ト M P 5 2発現べクタ一 PMSS99 (5. Okb) のプラスミ ドマップ でめる（
図 3は成熟型ヒ ト M P 5 2二量体とヒ ト分泌型フリ ン変異体の共発現細 胞株の無血潸培養上清の還元条件下でのウエスタンプロッティ ング分析図 の写真である。
図 4は種々の前駆体ヒ ト M P 5 2二量体が、 ヒ ト分泌型フリ ン変異体を 作用させることにより、 成熟型 M P 5 2に変換されることを示す還元条件 下でのゥヱスタンブロッティ ング分析図の写真である。
発明を実施するための最良の形態
次に、 実施例を示して本発明の効果を具体的に説明する。
実施例 1
ヒ ト分泌型フリ ン変異体およびヒ ト M P 5 2を共発現する C H O細胞株に よる成熟型ヒ ト M P 5 2二量体の産生
(1) ヒ ト分泌型フリ ン変異体 cDNAのクローニングおよび発現べクタ一の構 築
ヒ トフリ ン蛋白質は N末端側より、 シグナルペプチド、 ズブチリシン様 プロテア一ゼドメィン、 膜貫通ドメィン、 細胞質側ドメィンなどのドメィ ン構造をとる。 本発明では膜貫通ドメィンを欠いた N末端側をコ一ドする ヒ ト分泌型フリン変異体 c D N Aを R T— P C R法にクローニングし発現 に用いた。
ヒ ト H e p G 2細胞より トータル R N Aを抽出し、 それを銬型として上 流側のアンチセンスプライマ— 1 (配列表配列番号 1に示したヒ トフリ ン の cDNA配列の 931番目から 914番目） および下流側のアンチセンスプライマ 一 2 (2095番目から 2071番目） を用いて r T t h R N Aポリメラーゼに より逆転写反応を行った。 続いて、 それぞれの産物についてセンスプライ マー 3 (配列表配列番号 2 ) とアンチセンスプライマー 4 (配列表配列番 号 3) 、 およびセンスプライマー 5 (配列表配列番号 4) とアンチセンス プライマー 6 (配列表配列番号 5) の組み合わせで P C R反応を行い、 上 流側と下流側の 2つの c DN Aフラグメン卜を得た。 これらのフラグメン 卜を連結しプラスミ ド p U C 1 1 9 (宝酒造より入手） の Hind ffl-Sal I サイ トに揷入し、 59 5アミ ノ酸をコードするヒ ト分泌型フ リ ン変異体 c DN Aを得た。 得られた c DN Aを制限酵素消化および DN A塩基配列 決定により確認した。 ヒ ト分泌型フリン変異体 c DNAの DNA塩基配列 は配列表の配列番号 1に示した 1 6 3番目から 2 0 1 4番目のヌクレオチ ドであった。 このヒ ト分泌型フリ ン変異体 c DNAの DNA配列が、 van den Ouwelandらに報告された DNA配列と比較して異なる点は、 1 6 5番 目の塩基がアデ二ンであることにより翻訳に悪影響を及ぼす可能性のある 不要な開始コ ドンが消去され、 また、 2 00 4番目の塩基がアデニンであ ることによりストップコ ドンが形成されている点である。 次に、 ヒ ト分泌 型フリ ン変異体 c DN Aを Hind m— Xba I消化により切り出し、 INVITR0G EN社から購入した p R cZCMVベクターの Hind HI—Xba I部位に挿入し、 図 1に示すヒ ト分泌型フリン変異体 c DN A発現ベクター pDfurpRCZCMV を作製した。
(2) ヒ ト MP 5 2の発現ベクターの構築
Biopharra GmbHの Dr. Hoettenから提供されたヒ 卜 MP 5 2遺伝子を含む p S K 5 2 sプラスミ ドから、 Hind Ifl消化によりヒ ト MP 52遺伝子を 含む DNA断片を単離し、 Behringwerke AGの Dr. Zettlmeisslから提供さ れた pABstopベクターの Hind m部位に挿入し、 図 2に示すヒ 卜 MP 5 2発 現べクタ一 PMSS99を作製した。 その構造を DN A塩基配列決定および制限 酵素消化により確認した。 p MS S 99のヒ ト MP 5 2 DNA塩基配列 は、 配列表の配列番号 6に示した 5 76番目から 2 2 7 9番目までのヌク レオチドであった。
(3) 種々の前駆体ヒ ト MP 5 2二量体を産生するチャイニーズハムスター ォバリー （CH0) 細胞株 MC— 2の樹立
Behringwerke AG の Dr. Zettlmeissl カヽら提供された CH0—讓 X — B11細胞、 すなわち CHO細胞の突然変異株に、 pMS S 9 9および Dr. Zettlmeisslから提供された pSVOAdhfrをリン酸カルシウム D N A共沈法 により導入した。 次に、 ヒ ト MP 5 2の高産生細胞株をメソ 卜レキセ一ト (MTX) を用いる遗伝子増幅法により樹立した。
pMS S 9 9 (10 /g) および pSVOAdhfr (2 jt/g) を 2 5mM HEPES、 1 4 OmM NaCl、 0. 75mM Na2HP04 (pH 7.05) 1mlに溶解し、 続いて 5 0〃1の 2. 5M CaCl2と混合した。 得られた沈澱を 1 Ocmディ ッシュ中 の CH0— DUKX— B11細胞に重層し、 室温で 3 0分放置した。 次に 1 0 %ゥシ 胎児血清 （FBS) を含むリボおよびデォキシリボヌクレオチド含有 MEM— ALPHA (MEM- α+) 培地 8 mlを細胞層に加え、 C 02インキュベータ一中で 4〜6時間培養した。 細胞を 1 0%グリセロールで室温 3分間処理した後、 1 0 % ? 83を含む1^451^— « +培地で2曰間培養した。 次に 1 0 %透析 F B Sを含むリボおよびデォキシリボヌク レオチ ド不含 M E M— A LP H Λ (MEM- a -) 培地中にまき直して形質転換株を選択した。 ヒ ト MP 5 2の 産生は（5)で記述するウェス夕ンブロッティ ング分析により検定した。 さらに、 ヒ ト MP 5 2産生細胞株の培地中に MTXを加え、 その濃度を 順次上げることにより、 M P 5 2遣伝子が増幅した細胞株を選択した。
MTX濃度 4 0 OnMで、 種々の分子量の前駆体ヒ ト MP 5 2二量体および 成熟型ヒ ト MP 5 2二量体を産生する細胞株 MC— 2が得られた。 この細 胞株 MC— 2は 1995年 6月 21日付けで通商産業省工業技術院生命工学 工業技術研究所 （茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号） に寄託番号 F E RM B P— 5 1 4 2として寄託された。
(4) ヒ ト分泌型フリ ン変異体発現ベクターを、 ヒ ト MP 52産生 C HO細 胞株 MC— 2へ導入することよる、 ヒ ト MP 5 2とヒ ト分泌型フリ ン 変異体の共発現細胞株の樹立 種々の前駆体ヒ ト MP 52二量体および成熟型 MP 52二量体を産生し ている CHO細胞株 MC— 2に、 ヒ ト分泌型フ リ ン変異体発現ベクター pDf urpRCZCMVをリン酸カルシゥム D N A共沈法により導入し、 形質転換 細胞を 333 xg/inl G 418および 40 OnM MTX存在下で選択する ことにより、 ヒ ト MP 52およびヒ ト分泌型フ リ ン変異体の共発現細胞株 を樹立した。
pDfurpRC/CMV (4.8 fig を用いて、 実施例 1 (2)と同様の方法でリン 酸カルシウム DNA共沈澱を作製し、 1 Ocmディ ッシュ中の MC— 2細胞 に重層し、 室温で 30分放置した。 次に 10%F B Sを含むリボおよびデ ォキシリボヌクレオチド不含 MEM— ALPHA (MEM— α—)培地 8 mlを細胞層 に加え、 C02インキュベータ一中で 4 ~ 6時間培養した。 細胞を 1 0% グリセロールで室温 3分間処理した後、 10%F B Sを含む MEM— α— 培地で 2日間培養した。 次に、 1 0%F B S、 400 nM MTXおよび 333 ^ g/ml G418を含む ME M—ひ-培地中に細胞をまき直して形 質転換株を選択した。 ヒ ト MP 52の産生は次の（5)で記述したゥエスタ ンブロッテイング分析により検定した。 また、 ヒ 卜分泌型フ リ ン変異体の 産生は（6)で記述する酵素活性測定法により検定した。 得られたヒ ト MP 52とヒ ト分泌型フリン変異体の共発現細胞株の 1つの無血清培養上清を 毎日培地交換を行い回収された培養上清を還元条件下で S D S—ポリアク リルアミ ド電気泳動し、 ゥヱスタンプロッテイ ング分析を行った結果の写 真を図 3に示す。 各レーンに培養上清 0.5〃1分が流されている。 レーン 1は 1曰目、 レーン 2は 2日目、 レーン 3は 3日目の培養上清である。 成 熟型 MP 52単量体のバンドを矢印で示す。 培養上清中で分子量の大きな 前駆体 MP 52は検出されず、 すべての MP 52は分子量約 15 Kのぺプ チドで、 それは成熟型 MP 52の単量体に相当していた。 このペプチドは 非還元条件下での分析で、 分子量約 28 Kの成熟型 MP 52二量体を形成 していた。 また、 生産量は、 共発現細胞株では MP 52発現細胞株 MC— 2の約 3〜8倍で約 8 /ml/24時間であった。 以上より、 ヒ ト MP 52とヒ ト分泌型フリン変異体の共発現系を用いることにより、 成熟型 M P 52二量体のみを、 これま—での方法よりも大量に産生する細胞株を樹立 することに初めて成功した。
(5) 培養上清中のヒ ト MP 52のゥヱスタンプロッテイ ングによる検出 培養上清液を S D S _ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 （15~25%ポリ アクリルアミ ド勾配ゲル、 第一化学） により分離し、 次に蛋白質を PVD F膜 （Clear Blot Membrane- P, ATTO) に転写した。 膜を Block Ace (大 日本製薬） で 1時間プロックし、 トリス緩衝食塩水 （TBS) ですすぎ、 次 にヒ ト MP 52に対するニヮ トリ抗体 10 8 1111で1晚処理した。 膜を 0. 1 %Tween 20を含む TB S (TTBS) で洗った後、 アルカリ性フォス ファターゼーゥサギ抗ニヮ トリ I gG複合体 （Sigma A9171) で処理した。 膜を TTB Sで洗い、 アル力リ性フォスファターゼ基質キッ ト（B10— RAD) により MP 52に相当するバンドを可視化した。
(6) 培養上清中のヒ 卜分泌型フリ ン変異体の活性の検出
培養上清液 20 1に 30 1の精製水と 200 1の蛍光基質溶液、 す なわち 100 Boc-Arg-Arg-Val-Arg-MCA (蛋白工学研究所より購 入） と 1. 25mM CaCl2を含む 125mM ES/NaOH (pH 7.0) を加え 37 °Cで 10分間加温し、 遊離されてきた蛍光物質 AM Cを励起波長 38 Onm 蛍光波長 45 Onmにより測定した。 フリ ンの活性の単位として、 1分間に lpmolの AMCを遊離する活性を 1ュニッ ト（U)と定義した。
(7) ヒ ト分泌型フリ ン変異体と共発現することにより産生された成熟型 MP 52の精製および N末端ァミノ酸配列分析
ヒ ト MP 52とヒ ト分泌型フリ ン変異体の共発現細胞株の無血清培養上 清に 10分の 1容の 0. 2Mリ ン酸ナトリウム緩衝液 （PH 6.0) を混和し、 5 Om NaClを含む 20 railリ ン酸ナトリゥム緩衝液 （pH 6.0) で平衡化し た Hi Trap SF (1ml, Pharmacia) にかけ、 同緩衝液で洗浄後、 蛋白質を 6 Mグァニジン塩酸を含む 0. 1Mリン酸ナトリウム緩衝液 （pH 6.0) で 溶出した。 溶出液を逆相 HP L Cカラム R e s o u r c e R P C (3ml, Pharmacia) にかけ、 蛋白質.を 25〜 55 %ァセトニトリルで溶出した。 溶出された成熟型 MP 52を含むフラクションは、 パルス液ガス相シーク ェンサ一 （Applied Biosystems model 476) による N末端アミノ酸配列分 祈にかけた。 結果を表 1に示す。 表 1
サイクル ァミノ酸配列 1 (pmol) ァミノ酸配列 2 (pmol)
1 Arg 11.95 Ala 25.51
2 Ala 28.75 Pro 14.75
3 Pro 17.55 Leu 18.07
4 Leu 16.47 Ala 14.46
5 Ala 16.99 Thr 5.02
6 Thr 7.15 Arg 7.38
7 Arg 9.21 Gin 9.08
8 Gin 9.54 Gly 13.23
9 Gly 11.29 Lys 5.29
10 し ys 8.04 Arg 6.52 表 1より、 アミノ酸配列 1は配列表の配列番号 6の A r g 354から、 ァミノ酸配列 2は A 1 a 355からに由来し、 そのモル比は約 1 ： 1と考 えられた。
実施例 2
ヒ ト分泌型フリン変異体によるヒ ト MP 52の前駆体二量体から成熟型二 量体への変換
(1) ヒ ト分泌型フ リ ン変異体を産生する C HO細胞株の樹立
Behringwerke社の Dr. Zettlmeisslから提供された CHO— D KX— Bil細胞 に、 実施例 1 (1)で示したヒ ト分泌型フリン変異体発現べクタ一 pDfurpRC /CMVをリ ン酸カルシウム DN A共沈法により導入し、 形質転換細胞を G 418存在下で選択し、 ヒ ト分泌型フリ ン変異体高発現株を榭立した。 実施例 1 (3)に述べた方法に従い pDfurpRCZCMVとリ ン酸カルシウムの共 沈澱を作製し、 1 Ocmディ ッシュ中の CHO— DUKX— B11細胞に重層し、 室温 で 30分放置した。 次に 10%F B Sを含むリボおよびデォキシリボヌク レオチド含有 MEM— AL PHA (MEM— α +)培地 8 mlを細胞層に加え、 C O2インキュベータ一中で 4〜 6時間培養した。 細胞を 10 %グリセ ロールで室温 3分間処理した後、 10% F B Sおよび 400 UgZml G 4 18を含む MEM— α+培地中に細胞をまき直して形質転換株を選択し た。 ヒ ト分泌型フ リ ン変異体を産生する細胞株は実施例 1 (6)で記述した 酵素活性測定法により検定し、 フリ ン活性として δΟΟ ΙΟΟθυ/ηιΙΖΖΙ時 間産生する細胞株を得た。
(2) ヒ ト分泌型フリ ン変異体によるヒ 卜前 Ϊ区体 ΜΡ52二量体の成熟型への変 換
ヒ ト MP 52産生 CHO細胞株 MC— 2の無血清培養上清 （前駆体およ び成熟型 MP 52二量体を含む） に、 ヒ ト分泌型フリ ン変異体発現細胞株 の無血清培養上清 （100 OUZml) を種々の割合で混合し、 37°Cで一 晚加温した。 反応後、 実施例 1〈5)に記述したゥヱスタンプロッティ ング 分析を還元条件下で行い、 前駆体 MP 52の成熟型への変換を検定した。 この結果の写真を図 4に示す。 レーン 1〜5には、 MC— 2の培養上清 1 //1分と種々の容量のヒ ト分泌型フリ ン変異体発現細胞株の培養上清の混 合液がそれぞれ流されている。 ヒ 卜分泌型フリン変異体の最終漉度はそれ ぞれレーン 1は 0 UZni レーン 2は 50 U/ml、 レーン 3は 100UZ ml、 レーン 4は 200 U/ml、 レーン 5は 400 U Zmlである。 前駆体 MP 52単量体のバンドを矢印 Aおよび Bで、 成熟型 MP 52単量体のバ ンドを矢印 Cで示す。 図 4に示すように、 ヒ ト分泌型フリ ン変異体発現細 胞株の培養上清を、 最終活性濃度として 20 OUZml以上加えると、 MP 5 2はすべて成熟型に変換されていた。 その結果、 成熟型 M P 5 2二量体 が約 3倍に増加していた。
産業上の利用可能性 一
従来、 成熟型骨誘導因子は、 動物細胞により生成された骨誘導因子の種 々な分子量の二量体の混合物から分離することにより得られていたが、 成 熟型骨誘導因子を選択的に大量に産生させたり、 上記混合物から効率よく 成熟型骨誘導因子を分離する技術が開発されていないため、 成熟型骨誘導 因子を得ることは困難であった。 しかるに本発明の方法によれば、 骨誘導 因子前駆体から成熟型骨誘導因子を製造することができるので、 成熟型骨 誘導因子を大量に得ることが容易である。 さらに、 本発明の方法によって 得られる成熟型骨誘導因子は、 実質的に単一な分子量のぺプチドからなる 純度の高い物質であるので、 特に医薬として用いるのに適している。
配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 4180
配列の型：アミノ酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：ぺプチド
フラグメント型：
起源：
生物名： ヒ卜 (homo sapiens)
組織の種類： ヒト肝細胞ガン
配列の特徴：
存在位置：
他の情報：プロセッシング酵素フリン
配列：
GCGGGGAAGC AGCAGCGGCC AGGATGAATC CCAGGTGCTC TGGAGCTGGA TGGTGAAGGT 60 CGGCACTCTT CACCCTCCCG AGCCCTGCCC GTCTCGGCCC CATGCCCCCA CCAGTCAGCC 120 CCGGGCCACA GGCAGTGAGC AGGCACCTGG GAGCCGAGGC CCTAAGACCA GGCCAAGGAG 180 ACGGGCGCTC CAGGGTCCCA GCCACCTGTC CCCCCC ATG GAG CTG AGG CCC TGG 234
Met Glu Leu Arg Pro Trp
1 5
TTG CTA TGG GTG GTA GCA GCA ACA GGA ACC TTG GTC CTG CTA GCA GCT 282 Leu Leu Trp Val Val Ala Ala Thr Gly Thr Leu Val Leu Leu Ala Ala
10 15 20
GAT GCT CAG GGC CAG AAG GTC TTC ACC AAC ACG TGG GCT GTG CGC ATC 330 Asp Ala Gin Gly Gin Lys Val Phe Thr Asn Thr Trp Ala Val Arg lie
25 30 35
CCT GGA GGC CCA GCG GTG GCC AAC AGT GTG GCA CGG AAG CAT GGG TTC 378 Pro Gly Gly Pro Ala Val Ala Asn Ser Val Ala Arg Lys His Gly Phe
40 45 50 CTC AAC CTG GGC CAG ATC TTC GGG GAC ΤΛΤ TAC CAC TTC TGG CAT CGA 426 Leu Asn Leu Gly Gin lie Phe Gly Asp Tyr Tyr His Phe Trp His Arg
55 60 65 70
GGA GTG ACG AAG CGG TCC CTG TCG CCT CAC CGC CCG CGG CAC AGC CGG 474 Gly Val Thr Lys Arg Ser Leu Ser Pro His Arg Pro Arg His Ser Arg
75 80 85
CTG CAG AGG GAG CCT CAA GTA CAG TGG CTG GAA CAG CAG GTG GCA AAG 522 Leu Gin Arg Glu Pro Gin Val Gin Trp Leu Glu Gin Gin Val Ala Lys
90 95 100
CGA CGG ACT AAA CGG GAC GTG TAC CAG GAG CCC ACA GAC CCC AAG TTT 570 Arg Arg Thr Lys Arg Asp Val Tyr Gin Glu Pro Thr Asp Pro Lys Phe
105 110 115
CCT CAG CAG TGG TAC CTG TCT GGT GTC ACT CAG CGG GAC CTG AAT GTG 618 Pro Gin Gin Trp Tyr Leu Ser Gly Val Thr Gin Arg Asp Leu Asn Val
120 125 130
AAG GCG GCC TGG GCG CAG GGC TAC ACA GGG CAC GGC ATT GTG GTC TCC 666 Lys Ala Ala Trp Ala Gin Gly Tyr Thr Gly His Gly lie Val Val Ser
135 140 145 150
ATT CTG GAC GAT GGC ATC GAG AAG AAC CAC CCG GAC TTG GCA GGC AAT 714 l ie Leu Asp Asp Gly lie Glu Lys Asn His Pro Asp Leu Ala Gly Asn
155 160 165
TAT GAT CCT GGG GCC AGT TTT GAT GTC AAT GAC CAG GAC CCT GAC CCC 762 Tyr Asp Pro Gly Ala Ser Phe Asp Val Asn Asp Gin Asp Pro Asp Pro
170 175 180
CAG CCT CGG TAC ACA CAG ATG AAT GAC AAC AGG CAC GGC ACA CGG TGT 810 Gin Pro Arg Tyr Thr Gin Met Asn Asp Asn Arg His Gly Thr Arg Cys
185 190 195
GCG GGG GAA GTG GCT GCG GTG GCC AAC AAC GGT GTC TGT GGT GTA GGT 858 Ala Gly Glu Val Ala Ala Val Ala Asn Asn Gly Val Cys Gly Val Gly
200 205 210 GTG GCC TAC AAC GCC CGC ATT GGA GGG GTG CGC ATG CTG GAT GGC GAG 906 Val Ala Tyr Asn Ala Arg lie Gly Gly Val Arg Met Leu Asp Gly Glu
215 220 225 230 '
GTG ACA GAT GCA GTG GAG GCA CGC TCG CTG GGC CTG AAC CCC AAC CAC 954 Val Thr Asp Ala Val Glu Ala Arg Ser Leu Gly Leu Asn Pro Asn His
235 240 245
ATC CAC ATC TAC AGT GCC AGC TGG GGC CCC GAG GAT GAC GGC AAG ACA 1002 He His lie Tyr Ser Ala Ser Trp Gly Pro Glu Asp Asp Gly Lys Thr
250 255 260
GTG GAT GGG CCA GCC CGC CTC GCC GAG GAG GCC TTC TTC CGT GGG GTT 1050 Val Asp Gly Pro Ala Arg Leu Ala Glu Glu Ala Phe Phe Arg Gly Val
265 270 275
AGC CAG GGC CGA GGG GGG CTG GGC TCC ATC TTT GTC TGG GCC TCG GGG 1098 Ser Gin Gly Arg Gly Gly Leu Gly Ser lie Phe Val Trp Ala Ser Gly
280 285 290
AAC GGG GGC CGG GAA CAT GAC AGC TGC AAC TGC GAC GGC TAC ACC AAC 1146 Asn Gly Gly Arg Glu His Asp Ser Cys Asn Cys Asp Gly Tyr Thr Asn
295 300 305 310
AGT ATC TAC ACG CTG TCC ATC AGC AGC GCC ACG CAG TTT GGC AAC GTG 1194 Ser lie Tyr Thr Leu Ser lie Ser Ser Ala Thr Gin Phe Gly Asn Val
315 320 325
CCG TGG TAC AGC GAG GCC TGC TCG TCC ACA CTG GCC ACG ACC TAC AGC 1242 Pro Trp Tyr Ser Glu Ala Cys Ser Ser Thr Leu Ala Thr Thr Tyr Ser
330 335 340
AGT GGC AAC CAG AAT GAG AAG CAG ATC GTG ACG ACT GAC TTG CGG CAG 1290 Ser Gly Asn Gin Asn Glu Lys Gin lie Val Thr Thr Asp Leu Arg Gin
345 350 355
AAG TGC ACG GAG TCT CAC ACG GGC ACC TCA GCC TCT GCC CCC TTA GCA 1338 Lys Cys Thr Glu Ser His Thr Gly Thr Ser Ala Ser Ala Pro Leu Ala
360 365 370 GCC GGC ATC ATT GCT CTC ACC CTG GAG GCC AAT AAG AAC CTC ACA TGG 1386
Ala Gly lie lie Ala Leu Thr Leu Glu Ala Asn Lys Asn Leu Thr Trp
375 380 385 390
CGG GAC ATG CAA CAC CTG GTG GTA CAG ACC TCG AAG CCA GCC CAC CTC 1434
Arg Asp Met Gin His Leu Val Val Gin Thr Ser Lys Pro Ala His Leu
395 400 405
AAT GCC AAC GAC TGG GCC ACC AAT GGT GTG GGC CGG AAA GTG AGC CAC 1482
Asn Ala Asn Asp Trp Ala Thr Asn Gly Val Gly Arg Lys Val Ser His
410 415 420
TCA TAT GGC TAC GGG CTT TTG GAC GCA GGC GCC ATG GTG GCC CTG GCC 1530
Ser Tyr Gl y Tyr Gly Leu Leu Asp Ala Gly Ala Met Val Ala Leu Ala
425 430 435
CAG AAT TGG ACC ACA GTG GCC CCC CAG CGG AAG TGC ATC ATC GAC ATC 1578
Gin Asn Trp Thr Thr Val Ala Pro Gin Arg Lys Cys lie lie Asp lie
440 445 450
CTC ACC GAG CCC AAA GAC ATC GGG AAA CGG CTC GAG GTG CGG AAG ACC 1626
Leu Thr Glu Pro Lys Asp lie Gly Lys Arg Leu Glu Val Arg Lys Thr
455 460 465 470
GTG ACC GCG TGC CTG GGC GAG CCC AAC CAC ATC ACT CGG CTG GAG CAC 1674
Val Thr Ala Cys Leu Gly Glu Pro Asn His lie Thr Arg Leu Glu His
475 480 485
GCT CAG GCG CGG CTC ACC CTG TCC TAT AAT CGC CGT GGC GAC CTG GCC 1722
Ala Gin Ala Arg Leu Thr Leu Ser Tyr Asn Arg Arg Gly Asp Leu Ala
490 495 500
ATC CAC CTG GTC AGC CCC ATG GGC ACC CGC TCC ACC CTG CTG GCA GCC 1770 lie His Leu Val Ser Pro Met Gly Thr Arg Ser Thr Leu Leu Ala Ala
505 510 515
AGG CCA CAT GAC TAC TCC GCA GAT GGG TTT AAT GAC TGG GCC TTC ATG 1818
Arg Pro His Asp Tyr Ser Ala Asp Gly Phe Asn Asp Trp Ala Phe Met
520 525 530 ACA ACT CAT TCC TGG GAT GAG GAT CCC TCT GGC GAG TGG GTC CTA GAG 1866 Thr Thr His Ser Trp Asp Glu Asp Pro Ser Gly Glu Trp Val Leu Glu
535 540 545 550 "
ATT GAA AAC ACC AGC GAA GCC AAC AAC TAT GGG ACG CTG ACC AAG TTC 1914 lie Glu Asn Thr Ser Glu Ala Asn Asn Tyr Gly Thr Leu Thr Lys Phe
555 560 565
ACC CTC GTA CTC TAT GGC ACC GCC CCT GAG GGG CTG CCC GTA CCT CCA 1962 Thr Leu Val Leu Tyr Gly Thr Ala Pro Glu Gl y Leu Pro Val Pro Pro
570 575 580
GAA AGC AGT GGC TGC AAG ACC CTC ACG TCC AGT CAG GCC TGA 2004 Glu Ser Ser Gly Cys Lys Thr Leu Thr Ser Ser Gin Ala 木
585 590 595
GTGGTGTGCG AGGAAGGCTT CTCCCTGCAC CAGAAGAGCT GTGTCCAGCA CTGCCCTCCA 2064
GGCTTCGCCC CCCAAGTCCT CGATACGCAC TATAGCACCG AGAATGACGT GGAGACCATC 2124
CGGGCCAGCG TCTGCGCCCC CTGCCACGCC TCATGTGCCA CATGCCAGGG GCCGGCCCTG 2184
ACAGACTGCC TCAGCTGCCC CAGCCACGCC TCCTTGGACC CTGTGGAGCA GACTTGCTCC 2244
CGGCAAAGCC AGAGCAGCCG AGAGTCCCCG CCACAGCAGC AGCCACCTCG GCTGCCCCCG 2304
GAGGTGGAGG CGGGGCAACG GCTGCGGGCA GGGCTGCTGC CCTCACACCT GCCTGAGGTG 2364
GTGGCCGGCC TCAGCTGCGC CTTCATCGTG CTGGTCTTCG TCACTGTCTT CCTGGTCCTG 2424
CAGCTGCGCT CTGGCTTTAG TTTTCGGGGG'GTGAAGGTGT ACACCATGGA CCGTGGCCTC 2484
ATCTCCTACA AGGGGCTGCC CCCTGAAGCC TGGCAGGAGG AGTGCCCGTC TGACTCAGAA 2544
GAGGACGAGG GCCGGGGCGA GAGGACCGCC TTTATCAAAG ACCAGAGCGC CCTCTGATGA 2604
GCCCACTGCC CACCCCCTCA AGCCAATCCC CTCCTTGGGC ACTTTTTAAT TCACCAAAGT 2664
ATTTTTTTAT CTTGGGACTG GGTTTGGACC CCAGCTGGGA GGCAAGAGGG GTGGAGACTG 2724
TTTCCCATCC TACCCTCGGG CCCACCTGGC CACCTGAGGT GGGCCCAGGA CCAGCTGGGG 2784
CGTGGGGAGG GCCGTACCCC ACCCTCAGCA CCCCTTCCAT GTGGAGAAAG GAGTGAAACC 2844
TTTAGGGCAG CTTGCCCCGG CCCCGGCCCC AGCCAGAGTT CCTGCGGAGT GAAGAGGGGC 2904
AGCCCTTGCT TGTTGGGATT CCTGACCCAG GCCGCAGCTC TTGCCCTTCC CTGTCCCTCT 2964
AAAGCAATAA TGGTCCCATC CAGGCAGTCG GGGGCTGGCC TAGGAGATAT CTGAGGGAGG 3024
AGGCCACCTC TCCAAGGGCT TCTGCACCCT CCACCCTGTC CCCCAGCTCT GGTGAGTCTT 3084 GGCGGCAGCA GCCATCATAG GAAGGGACCA AGGCAAGGCA GGTGCCTCCA GGTGTGCACG 3144
TGGCATGTGG CCTGTGGCCT GTGTCCCATG ACCCACCCCT GTGCTCCGTG CCTCCACCAC 3204
CACTGGCCAC CAGGCTGGCG CAGCCAAGGC CGAAGCTCTG GCTGAACCCT GTGCTGGTGT 3264
CCTGACCACC CTCCCCTCTC TTGCACCCGC CTCTCCCGTC AGGGCCCAAG TCCCTGTTTT 3324
CTGAGCCCGG GCTGCCTGGG CTGTTGGCAC TCACAGACCT GGAGCCCCTG GGTGGGTGGT 3384
GGGGAGGGGC GCTGGCCCAG CCGGCCTCTC TGGCCTCCCA CCCGATGCTG CTTTCCCCTG 3444
TGGGGATCTC AGGGGCTGTT TGAGGATATA TTTTCACTTT GTGATTATTT CACTTTAGAT 3504
GCTGATGATT TGTTTTTGTA TTTTTAATGG GGGTAGCAGC TGGACTACCC ACGTTCTCAC 3564
ACCCACCGTC CGCCCTGCTC CTCCCTGGCT GCCCTGGCCC TGAGGTGTGG GGGCTGCAGC 3624
ATGTTGCTGA GGAGTGAGGA ATAGTTGAGC CCCAAGTCCT GAAGAGGCGG GCCAGCCAGG 3684
CGGGCTCAAG GAAAGGGGGT CCCAGTGGGA GGGGCAGGCT GACATCTGTG TTTCAACTGG 374Ί
GGCTCGCCAT GCCGGGGGTT CATAGGTCAC TGGCTCTCCA AGTGCCAGAG GTGGGCAGGT 3804
GGTGGCACTG AGCCCCCCCA ACACTGTGCC CTGGTGGAGA AAGCACTGAC CTGTCATGCC 3864
CCCCTCAAAC CTCCTCTTCT GACGTGCCTT TTGCACCCCT CCCATTAGGA CAATCAGTCC 3924
CCTCCCATCT GGGAGTCCCC TTTTCTTTTC TACCCTAGCC ATTCCTGGTA CCCAGCCATC 3984
TGCCCAGGGG TGCCCCCTCC TCTCCCATCC CCCTGCCCTC GTGGCCAGCC CGGCTGGTTT 4044
TGTAAGATAC TGGGTTGGTG CACAGTGATT TTTTTCTTGT AATTTAAACA GGCCCAGCAT 4104
TGCTGGTTCT ATTTAATGGA CATGAGATAA TGTTAGAGGT TTTAAAGTGA TTAAACGTGC 4164
AGACTATGCA AACCAG 4180 配列番号： 2
配列の長さ： 2 9
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
起源：なし
生物名：なし
株名：なし
配列の特徴： フリンのセンスプライマー 3 配列：
GCGAAGCTTA AGACCAGGCC AAGGAGACG 29 配列番号： 3
配列の長さ ： 2 6
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
起源：なし
生物名：なし
株名：なし
配列の特徴： フリンのアンチセンスプライマー 4
配列：
CCTCGCCA TC CAGCATGCGC ACCCCT 26 配列番号： 4
配列の長さ ： 2 6
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
起源：なし
生物名：なし
株名：なし
配列の特徴：フリンのセンスプライマー 5
配列：
TGGAGGGGTG CGCATGCTGG ATGGCG 26 配列番号： 5 配列の長さ ： 3 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
起源：なし
生物名：なし
株名：なし
配列の特徴： フリンのアンチセンスプライマー 6
配列：
GGCGTCGACG CACACCACTC AGGCCTGACT 30 配列番号： 6
配列の長さ ： 2703
配列の型：アミノ酸
銷の数：二本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：ぺプチド
フラグメント型：
起源：
生物名： ヒ卜 (homo sapiens)
組織の種類： ヒト胎児
配列の特徴：
存在位置：
他の情報：骨誘導因子 M P 5 2
配列：
CCATGGCCTC GAAAGGGCAG CGGTGATTTT TTTCACATAA ATATATCGCA CTTAAATGAG 60 TTTAGACAGC ATGACATCAG AGAGTAATTA AATTGGTTTG GGTTGGAATT CCGTTTCCAA 120 TTCCTGAGTT CAGGTTTGTA AAAGATTTTT CTGAGCACCT GCAGGCCTGT GAGTGTGTGT 180 GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGA AGTATTTTCA CTGGAAAGGA TTCAAAACTA 240 zz
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255 260 265
TTC GAC ATC TGG AAG CTC TTC CGA AAC TTT AAG AAC TCG GCC CAG CTG 1566 Phe Asp lie Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys Asn Ser Ala Gin Leu
270 275 280
TGC CTG GAG CTG GAG GCC TGG GAA CGG GGC AGG GCC GTG GAC CTC CGT 1614 Cys Leu Glu Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Arg Ala Val Asp Leu Arg
285 290 295
GGC CTG GGC TTC GAC CGC GCC GCC CGG CAG GTC CAC GAG AAG GCC CTG 1662 Gly Leu Gly Phe Asp Arg Ala Ala Arg Gin Val His Glu Lys Ala Leu
300 305 310
TTC CTG GTG TTT GGC CGC ACC AAG AAA CGG GAC CTG TTC TTT AAT GAG 1710 Phe Leu Val Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp Leu Phe Phe Asn Glu
315 320 325 330
ATT AAG GCC CGC TCT GGC CAG GAC GAT AAG ACC GTG TAT GAG TAC CTG 1758 lie Lys Ala Arg Ser Gly Gin Asp Asp Lys Thr Val Tyr Glu Tyr Leu
335 340 345
TTC AGC CAG CGG CGA AAA CGG CGG GCC CCA CTG GCC ACT CGC CAG GGC 1806 Phe Ser Gin Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gin Gly
350 355 360
AAG CGA CCC AGC AAG AAC CTT AAG GCT CGC TGC AGT CGG AAG GCA CTG 1854 Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu し ys Ala Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu
365 370 375
CAT GTC AAC TTC AAG GAC ATG GGC TGG GAC GAC TGG ATC ATC GCA CCC 1902 His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp Asp Trp He lie Ala Pro
380 385 390
CTT GAG TAC GAG GCT TTC CAC TGC GAG GGG CTG TGC GAG TTC CCA TTG 1950 Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu
395 400 405 410 CGC TCC CAC CTG GAG CCC ACG AAT CAT GCA GTC ATC CAG ACC CTG ATG 1998 Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Val lie Gin Thr Leu Met
415 420 425
AAC TCC ATG GAC CCC GAG TCC ACA CCA CCC ACC TGC TGT GTG CCC ACG 2046 Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr
430 435 440
CGG CTG AGT CCC ATC AGC ATC CTC TTC ATT GAC TCT GCC AAC AAC GTG 2094 Arg Leu Ser Pro lie Ser lie Leu Phe lie Asp Ser Ala Asn Asn Val
445 450 455
GTG TAT AAG CAG TAT GAG GAC ATG GTC GTG GAG TCG TGT GGC TGC AGG 2142 Val Tyr Lys Gin Tyr Glu Asp Met Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg
460 465 470
TAG CAGCACTGGC CCTCTGTCTT CCTGGGTGGC ACATCCCAAG AGCCCCTTCC 2195 ***
475
TGCACTCCTG GAATCACAGA GGGGTCAGGA AGCTGTGGCA GGAGCATCTA CACAGCTTGG 2255 GTGAAAGGGG ATTCCAATAA GCTTGCTCGC TCTCTGAGTG TGACTTGGGC TAAAGGCCCC 2315 CTTTTATCCA CAAGTTCCCC TGGCTGAGGA TTGCTGCCCG TCTGCTGATG TGACCAGTGG 2375 CAGGCACAGG TCCAGGGAGA CAGACTCTGA ATGGGACTGA GTCCCAGGAA ACAGTGCTTT 2435 CCGATGAGAC TCAGCCCACC ATTTCTCCTC ACCTGGGCCT TCTCAGCCTC TGGACTCTCC 2495 TAAGCACCTC TCAGGAGAGC CACAGGTGCC ACTGCCTCCT CAAATCACAT TTGTGCCTGG 2555 TGACTTCCTG TCCCTGGGAC AGTTGAGAAG CTGACTGGGC AAGAGTGGGA GAGAAGAGGA 2615 GAGGGCTTGG ATAGAGTTGA GGAGTGTGAG GCTGTTAGAC TGTTAGATTT AAATGTATAT 2675 TGATGAGATA AAAAGCAAAA CTGTGCCT 2703

Claims

請 求 の 範 囲
1. 骨誘導因子前駆体にプロセシング酵素を作用させることを特徴とする 成熟型骨誘導因子の製造方法。
2. 骨誘導因子前駆体の発現ベクターおよびプロセシング酵素の発現べク ターを動物細胞株に導入し、 該細胞株を培養して成熟型骨誘導因子を産 生せしめ、 培養液から成熟型骨誘導因子を分離することを特徴とする成 熟型骨誘導因子の製造方法。
3. 成熟型骨誘導因子が成熟型の MP 52、 BMP - 2. BMP— 4、 BMP— 6または BMP— 7である請求項 1記載の製造方法。
4. プロセシング酵素がフリ ンである請求項 1ないし請求項 3のいずれか の項に記載の製造方法。
5. プロセシング酵素がフリンの全ァミノ酸配列を有するものである請求 項 1ないし請求項 4のいずれかの項に記載の製造方法。
6. プロセシング酵素が分泌型フリン変異体である請求項 1ないし請求項 4のいずれかの項に記載の製造方法。
7. ヒ ト MP 52前駆体の発現ベクターおよび分泌型フリン変異体の発現 ベクターを動物細胞株に導入し、 該細胞株を培養して成熟型骨誘導因子 を産生せしめ、 培養液から成熟型骨誘導因子を分離することを特徴とす る請求項 1ないし請求項 5に記載の製造方法。
8. 骨誘導因子前駆体を含有する溶液にプロセシング酵素を含有する溶液 を加え、 インキュベー卜することを特徴とする成熟型骨誘導因子の製造 方法。
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