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WO1997041253A1 - Process for detecting micro-organisms in mixtures by modular pcr - Google Patents

Process for detecting micro-organisms in mixtures by modular pcr Download PDF

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WO1997041253A1
WO1997041253A1 PCT/EP1997/002179 EP9702179W WO9741253A1 WO 1997041253 A1 WO1997041253 A1 WO 1997041253A1 EP 9702179 W EP9702179 W EP 9702179W WO 9741253 A1 WO9741253 A1 WO 9741253A1
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WO
WIPO (PCT)
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hybridization
hybridization probe
amplification
detection
probes
Prior art date
Application number
PCT/EP1997/002179
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German (de)
French (fr)
Inventor
Robert-Matthias Leiser
Jens Sperveslage
Original Assignee
Mira Diagnostica Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mira Diagnostica Gmbh filed Critical Mira Diagnostica Gmbh
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Publication of WO1997041253A1 publication Critical patent/WO1997041253A1/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of one or more microorganisms in a sample which contains a large number of different microorganisms by means of molecular biological techniques, such as amplification reactions, and a compilation of components for carrying out the method.
  • the method according to the invention is referred to as a modular polymerase chain reaction (PCR).
  • Another disadvantage of known identification systems is that a large number of microorganisms remain undetected when examining complex samples because their culture requirements are unknown.
  • primers for diagnostic tasks are designed in order to directly detect organisms of interest to be able to.
  • sequence information obtained in this way primers for diagnostic tasks are designed in order to directly detect organisms of interest to be able to.
  • a molecular biological method for genome analysis is known as HLA typing. After amplification of the locus in question, the allelic state is characterized by hybridization with probes of selected specificity.
  • the technical problem on which the invention is based is to provide a method which permits a reliable determination of any microorganisms present in a sample, even if these are present in a mixture with various types of microorganisms.
  • the method should also be simple and inexpensive to carry out.
  • the HLA typing differs from the inventive method z. B. in that the former relates to eukaryotic gene sequences and the analysis of the gene sequence of an individual organism.
  • the method according to the invention is suitable for the detection of one or more microorganisms in a sample which contains a large number of different microorganisms. Molecular biological techniques such as amplification reactions are used.
  • At least one hybridization probe (A) which is able to display conserved nucleic acid sequences in the microorganism (s) of interest and at least one hybridization probe (B) which is able to display the less conserved nucleic acid sequences in the microorganism (s) of interest in is able to be added to the sample with the proviso that at least one hybridization probe of type (A) and type (B) must be present per microorganism of interest and the sample is in a state capable of hybridization.
  • the resulting hybridization pattern identifies the microorganism (s) of interest.
  • the method according to the invention is advantageous due to its modular structure.
  • a general PCR reaction which is identical for large groups of microorganisms, is linked to a subsequent detection by using taxon-specific sequences within the amplified DNA.
  • hybridization probes that correspond to microbial nucleic acid sequences of different degrees of conservation, the detection and identification of microorganisms that are in a mixed sample is made possible without a separation for the identification e.g. B. through single colony passages is necessary.
  • a combination of general germ determination based on highly conserved sequence sections and individually definable specification by less conserved sequence sections is carried out.
  • parts of the genetic information are preferably amplified in vitro using the hybridization probes as starter molecules (for example by PCR).
  • the hybridization probe (s) A are preferably used as starters for the amplification and the hybridization probe (s) B for detection.
  • the hybridization probe (s) B is also possible to use the hybridization probe (s) B as a starter for the amplification and the hybridization probe (s) A for the detection, the hybridization probe (s) A and B as a starter for the amplification and the hybridization probe (s) B for the detection or to use the hybridization probe (s) A and B as starter for the amplification and the hybridization probe (s) A for detection.
  • the advantage of this embodiment is that the desired combination of amplification and detection with the hybridization probes of narrower and broader specificity is achieved in this way.
  • Part of the method is advantageously carried out on a solid phase by binding part of the hybridization probes, the coupling of the corresponding hybridization probe (s) to the solid phase taking place after the amplification or that the coupling of the corresponding hybridization probe (s) to the solid phase before amplification and the amplification takes place at least partially on the solid phase.
  • the less conserved sequence (s), which corresponds to the hybridization probe (s) B are located between the conserved sequence regions, which correspond to the hybridization probe (s) (n) A corresponds (correspond) or the conserved sequence (s) corresponding to the hybridization probe (s) A is or are located between the less conserved sequence regions that the (the ) Hybridization probe (s) B corresponds (correspond). This is advantageous because an additional selection of the sequence-correct amplification is achieved.
  • the amplification according to the invention can be carried out simultaneously with a plurality of starter pairs on a plurality of target sequences simultaneously. This offers the advantage of simultaneously amplifying those microorganisms in a reaction for which there are no sufficiently matching hybridization probes as starters.
  • Ribosomal gene sequences have proven to be particularly suitable for use in the method according to the invention. Ribosomal gene sequences offer the advantage that they have highly conserved and less conserved sections in the preferred close neighborhood of interest here. Another advantage of using these gene sequences is that ribosomal genes exist in multiple copies per genome of microorganisms, resulting in a comparatively higher sensitivity of the assay according to the invention contributes.
  • Figure 1 illustrates the relationships described above in a schematic representation.
  • the AI and A2 probes hybridizing with highly conservative regions of a gene structure of rDNA hybridize with two different regions of a DNA structure of a prokaryote coding for 16S rRNA. These areas flank a region in which there are medium and low conserved areas, which in turn interact with the hybridization probes B1 and B2.
  • the amplification results in a detectable amount of analyzable substance which, in the event of a positive reaction, enables families and / or types of microorganisms to be distinguished.
  • the hybridization conditions can in each case be selected so stringently by temperature, ionic strength and other factors, in particular influencing the hydrogen bonding, that the specificity of the hybridization reaction (s) between the target sequence and the hybridization probes required for the statement of the method is ensured.
  • the person skilled in the art can determine how to select and set the stringency in detail using means known to him (cf. U. Wobus, "Isolation, Fractionation and Hybridization of Nucleic Acids", Akademie-Verlag, Berlin, 1981, 229 pages).
  • the hybridization probes are selected depending on the analytical task. Both general bacterial count determinations in combination with the detection of special species and the analysis and characterization of very complex samples are possible.
  • reaction vessels which contain various hybridization probes, preferably bound to a solid phase, which are combined in a modular manner in such a way that a large number of samples or different analytical questions on one or a few samples are examined in parallel and simultaneously.
  • a combination which contains components for carrying out the method according to the invention. These include, among other components, the hybridization probe (s) A and B.
  • a kit contains at least one hybridization probe A and / or B coupled to a carrier, e.g. B. a reaction vessel. These reaction vessels can be used as modules for similar analysis problems.
  • the combination according to the invention preferably also contains reagents for carrying out amplification reactions and / or components for the detection of amplificates.
  • reagents for carrying out amplification reactions and / or components for the detection of amplificates include reaction buffer, dNTP mix, water, enzymes, method descriptions, instructions for use, warnings and the like.
  • hybridization probes A with broadband specificity served for the amplification of all bacteria present in the test sample and corresponded to a highly conserved section of the ribosomal 16S rDNA according to Stackebrandt and Liesack (Handbook of New Bacterial Systematics, p 151-193, 1993):
  • the hybridization probes B with narrower specificity served as detection probes.
  • Escherichia coli AAC GUC GCA AGA CCA AAG Seq. ID # 3
  • Bacillus subtilis GGT TGT TTG AAC CGC ATG GTT Seq. ID # 4
  • the probes were biotinylated at the 5 'end for detection using an ELISA reader. As a result, a color change could be detected after adding a streptavidin-conjugated peroxidase (Soumet et al., BioTechniques 19: 792-796 (1995)).
  • the germs were first grown in buffered peptone water and then the DNA of all organisms was isolated from this mixture sample using a DNA isolation kit.
  • a primer (530r, see above) was covalently bound to the cavity of the CovaLink TM plate according to the instructions of the company Nunc.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropylcarbodiimide
  • the wells were sucked dry and washed twice with 0.2 M NaOH, each with a 5-minute incubation.
  • the mixture was then washed twice with hybridization solution (6x standard saline citrate [SSC], 5x Denhardt's solution, 100 ⁇ g / ml sheared and denatured herring sperm DNA).
  • SSC standard saline citrate
  • 5x Denhardt's solution 100 ⁇ g / ml sheared and denatured herring sperm DNA.
  • the biotinylated hybridization probes were adjusted to a concentration of 0.1 nmol / L in hybridization solution and filled into the cavities in 100 ⁇ l aliquots.
  • the hybridization reaction ran at 37 ° C for 3 h.
  • three washing steps were carried out at 37 ° C. The first time with 2x SSC, 0.1% Tween 20 for 20 minutes.
  • the strepavidin-conjugated peroxidase was then added.
  • the peroxidase (Sigma Chemica, St. Louis. MO, USA) was diluted 1: 1000 in SPO solution (100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.05% Tween 20). 100 ul of this dilution was added to each well. The plate was incubated at 37 ° C for 30 minutes. It was then washed three times with SPO solution.
  • TMB solution 1.5 mg / ml tetramethylbenzidine; Sigma Chemica
  • 25 mM citric acid 50 mM NaH 2 PO 4 , 0.03% H 2 0 2 , 10% dimethyl sulfoxide [DMSO] were used as the substrate. , pH 5.0) dissolved and added. After 45 minutes at 37 ° C, the reaction was stopped with 25 ul 2M H 2 S0 4 and measured at 450 nm on an ELISA reader.
  • the color changes to be observed in the individual cavities were the indicator for the presence in the test sample of the type of bacteria that corresponded to the added detection probe.
  • Example 2 Water samples and suspensions of industrial skimmed milk powders are checked for the presence of Staphylococcus s ⁇ p., Salmonella ssp. and Escherichia ssp. examined.
  • oligonucleotides with the following sequence were selected as hybridization probes A with broadband specificity:
  • amplicons with a length of approximately 460 bp are obtained in the prokaryotes analyzed.
  • the oligonucleotide 16SA2 was selected for coupling to the CovaLink TM plate and was used in the reaction mixture at a concentration of 0.06 ⁇ M, while the oligonucleotide 16SA1 was used in the reaction mixture at a concentration of 0.5 ⁇ M.
  • the following oligonucleotides served as hybridization probes B with narrower specificity for the detection:
  • Staphylococcus 5 - TGT GCA CAT CTT GAC GGT - 3 Seq. ID # 7 Salmonella: 5 - CTG GCA GGC TTG AGT CTT - 3 Seq. ID # 8 Escherichia: 5 - CTC ATT GAC GTT ACC CGC - 3 Seq. ID # 9
  • Example 2 The experimental conditions were identical to those of Example 1, except for the hybridization and washing temperatures in the detection. Here, hybridization and washing were carried out at 52 ° C. For this purpose, the bacteria were added to the samples both individually and in a mixture in different concentrations and concentration ratios (10 3 or 10 fi germs / ml). Table 2 below summarizes the approaches and results in a semi-quantitative form.

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Abstract

A process is disclosed for detecting and identifying micro-organisms in a mixed sample without having to separate the germs, for example by passing them into individual colonies, in order to identify them. This process uses molecular biology techniques. By hybridising with probes which can recognise differently preserved sections of the genetic information of the micro-organisms of interest, detection and differentiation of the micro-organisms in the mixture is achieved. For this purpose, a general germ determination based on highly preserved sequence sections is combined with an individually defined specification based on less well preserved sequence sections. To ensure a sufficiently sensitive detection, an amplification of the nucleic acid section, for example by PCR, is preferably carried out.

Description

Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in Gemischen durch modulare PCR Method for the detection of microorganisms in mixtures by modular PCR
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von einem Mikroorganismus oder mehreren Mikroorganismen in einer Probe, die eine Vielzahl von verschiedenen Mikroorganismen enthält, mittels molekularbiologischer Techniken, wie Am- plifikationsreaktionen sowie eine Zusammenstellung von Komponenten zur Durchführung des Verfahrens. Das erfindungs- gemäße Verfahren wird als modulare Polymerasekettenreaktion (PCR) bezeichnet.The invention relates to a method for the detection of one or more microorganisms in a sample which contains a large number of different microorganisms by means of molecular biological techniques, such as amplification reactions, and a compilation of components for carrying out the method. The method according to the invention is referred to as a modular polymerase chain reaction (PCR).
Die Identifikation von Mikroorganismen aus komplexen Proben (die mehrere unterschiedliche Keime im Gemisch enthalten) ist eine wichtige und schwierige Aufgabe z. B. bei Hygiene¬ untersuchungen und anderen Vorhaben.The identification of microorganisms from complex samples (which contain several different germs in the mixture) is an important and difficult task e.g. B. in Hygiene¬ examinations and other projects.
Stand der Technik ist hier die Kultivierung der Mikro¬ organismen, ihre Selektivanreicherung auf speziellen Nähr¬ medien, die Einzelkoloniepassage und schließlich die taxonomische Identifikation unter Analyse verschiedener phänotypischer Parameter (Gram-Färbung, Begeißelung, Stoff¬ wechsel-physiologische Leistungen etc.). Besondere Aner¬ kennung und Bedeutung hat die Fettsäureanalyse gewonnen. Die typischen Profile der gaschromatographischen Trennung der Fettsäuren der Mikroorganismen gestatten in der Regel eine Art- oder sogar Pathovarietäten- und Serotypen-Identifi¬ kation. Der hierfür nötige apparative Aufwand ist allerdings sehr hoch und nur für große Laboratorien realisierbar. Außerdem verlangt die notwendige Reinanzucht der Einzel- kolonien einen erheblichen Zeit- und Materialaufwand.State of the art here is the cultivation of the microorganisms, their selective enrichment on special nutrient media, the single colony passage and finally the taxonomic identification under analysis of various phenotypic parameters (Gram staining, flagellation, metabolism-physiological performance etc.). The fatty acid analysis has gained special recognition and importance. The typical profiles of the gas-chromatographic separation of the fatty acids of the microorganisms generally permit a type or even pathovariety and serotype identification. The equipment required for this is very high and can only be realized for large laboratories. In addition, the necessary pure cultivation of the individual colonies requires a considerable amount of time and material.
Daneben gibt es Systeme, die eine ähnlich genaue Differen¬ zierung und Identifikation von Mikroorganismen auf der Basis von StoffWechselleistungen der Zellen versprechen. Abgesehen von häufigen Fehlinterpretationen ist dieses Verfahren wiederum mit dem schwerwiegenden Nachteil belastet, daß es nur an Reinkulturen zu verwertbaren Aussagen führt. Dies ist jedoch, wie erwähnt, eine aufwendige, langwierige und kosten¬ intensive Aufgabe.In addition, there are systems which promise a similarly precise differentiation and identification of microorganisms based on the metabolic effects of the cells. Apart from frequent misinterpretations, this method is again burdened with the serious disadvantage that it only leads to usable statements on pure cultures. However, as mentioned, this is a complex, lengthy and costly task.
Ein weiterer Nachteil bekannter Identifikationssysteme besteht darin, daß bei der Untersuchung komplexer Proben eine Vielzahl von Mikroorganismen unerkannt bleibt, weil ihre Kulturansprüche unbekannt sind.Another disadvantage of known identification systems is that a large number of microorganisms remain undetected when examining complex samples because their culture requirements are unknown.
Die Aufklärung von konservierten Sequenzabschnitten im Bereich der ribosomalen Gene bei Prokaryonten und ihre Nutzung für molekularbiologische Nachweistechniken (Hybridisierung bzw. Amplifikationsmethoden wie PCR) hat in den letzten fünf Jahren phylogenetische Zusammenhänge auf¬ decken können, die die Bakterientaxonomie entscheidend vorangebracht haben. Der Wert dieser Methode für diagnostische Aufgabenstellungen in der Bakteriologie ist heute bereits unbestritten.In the past five years, the elucidation of conserved sequence sections in the area of the ribosomal genes in prokaryotes and their use for molecular biological detection techniques (hybridization or amplification methods such as PCR) has been able to uncover phylogenetic relationships that have decisively advanced bacterial taxonomy. The value of this method for diagnostic tasks in bacteriology is already undisputed.
Genutzt wird diese Technik gegenwärtig einerseits für taxonomische Fragestellungen. Hierbei werden vorrangig nach Amplifikation, unter Nutzung hochkonservierter Primer- sequenzen, die entstandenen Amplicons kloniert, sequenziert und ihre Homologie zu bekannten Sequenzen für die taxonomische Identifikation bzw. Einordnung eingeschätzt.This technique is currently used on the one hand for taxonomic questions. Here, primarily after amplification, using highly conserved primer sequences, the resulting amplicons are cloned, sequenced and their homology to known sequences is assessed for taxonomic identification or classification.
Andererseits werden auf der Basis derart gewonnener Sequenz- Informationen Primer für diagnostische Aufgabenstellungen entworfen, um interessierende Organismen direkt nachweisen zu können. Es existieren mittlerweile vielfältige Protokolle für den Nachweis der unterschiedlichsten Mikroorganismen- Arten und Subtypen.On the other hand, on the basis of sequence information obtained in this way, primers for diagnostic tasks are designed in order to directly detect organisms of interest to be able to. There are now various protocols for the detection of the most diverse types of microorganisms and subtypes.
Der Nachteil dieses Standes der Technik besteht darin, daß entweder für jede diagnostische Aufgabenstellung eine indi¬ viduelle Analyse oder aber bei der Charakterisierung von komplexen Gemischen aufwendige Einzelkoloniepassagen oder Genklonierungen durchgeführt werden müssen.The disadvantage of this prior art is that either for each diagnostic task an individual analysis or in the characterization of complex mixtures, complex individual colony passages or gene clonings have to be carried out.
Unter Nutzung hochkonservierter Primersequenzen werden in komplexen Proben ■ durch alternative Verfahren Teile der Erbinformation der vorhandenen Mikroorganismen amplifiziert und die Einschätzung der Probenkomplexität sowie die taxonomische Identifikation ihrer Bestandteile durch an¬ schließende Analyse von Restriktionslängen-Polymorphismen vorgenommen. Dieser Auswertemodus ist als sehr aufwendig und wenig routinegeeignet einzuschätzen.Using highly conserved primer sequences of the genetic information of the microorganisms present are amplified in complex samples ■ by alternative methods parts and the evaluation of the sample complexity and taxonomic identification of its components made by an¬ closing analysis of restriction length polymorphisms. This evaluation mode can be assessed as very complex and unsuitable for routine use.
Eine molekularbiologische Methode zur Genomanalyse ist unter der Bezeichnung HLA-Typing bekannt. Hierbei wird der allele Zustand, nach Amplifikation des betreffenden Locus, durch Hybridisierung mit Sonden ausgewählter Spezifität charak¬ terisiert.A molecular biological method for genome analysis is known as HLA typing. After amplification of the locus in question, the allelic state is characterized by hybridization with probes of selected specificity.
Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, das eine sichere Bestimmung etwaiger in einer Probe befindlicher Mikro¬ organismen zuläßt, selbst wenn diese in einer Mischung mit Mikroorganismen verschiedenster Art vorliegen. Dabei soll das Verfahren neben hoher Sicherheit in der Bestimmung der Mikroorganismen auch einfach und kostengünstig durchzuführen sein.The technical problem on which the invention is based is to provide a method which permits a reliable determination of any microorganisms present in a sample, even if these are present in a mixture with various types of microorganisms. In addition to high reliability in the determination of the microorganisms, the method should also be simple and inexpensive to carry out.
Dieses Problem wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Das HLA-Typing unterscheidet sich vom erfindungsgemaßen Verfahren z. B. dadurch, daß ersteres eukaryontische Gen¬ sequenzen und die Analyse der Gensequenz eines individuellen Organismus betrifft. Das erfindungsgemäße Verfahren ist im Unterschied zum HLA-Typing zum Nachweis von einem Mikro¬ organismus oder mehrerer Mikroorganismen in einer Probe, die eine Vielzahl von verschiedenen Mikroorganismen enthält, geeignet. Dabei werden molekularbiologische Techniken, wie Amplifikationsreaktionen eingesetzt. Erfindungsgemäßwerden mindestens eine Hybridisierungssonde (A) , die konservierte Nucleinsäuresequenzen in dem oder den interessierenden Mikroorganismus(men) anzuzeigen in der Lage ist und minde¬ stens eine Hybridisierungssonde (B) , die weniger konservierte Nucleinsäuresequenzen in dem oder den interessierenden Mikroorganismus(men) anzuzeigen in der Lage ist, zu der Probe gegeben mit der Maßgabe, daß pro interessierendem Mikro¬ organismus mindestens eine Hybridisierungssonde des Typs (A) und des Typs (B) vorhanden sein muß und die Probe sich in einem hybridisierungsfähigen Zustand befindet. Durch ein entstehendes Hybridisierungsmuster erfolgt eine Identifi¬ kation des oder der interessierenden Mikroorganismen.This problem is solved by a method with the features of claim 1. The HLA typing differs from the inventive method z. B. in that the former relates to eukaryotic gene sequences and the analysis of the gene sequence of an individual organism. In contrast to HLA typing, the method according to the invention is suitable for the detection of one or more microorganisms in a sample which contains a large number of different microorganisms. Molecular biological techniques such as amplification reactions are used. According to the invention, at least one hybridization probe (A) which is able to display conserved nucleic acid sequences in the microorganism (s) of interest and at least one hybridization probe (B) which is able to display the less conserved nucleic acid sequences in the microorganism (s) of interest in is able to be added to the sample with the proviso that at least one hybridization probe of type (A) and type (B) must be present per microorganism of interest and the sample is in a state capable of hybridization. The resulting hybridization pattern identifies the microorganism (s) of interest.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist durch seinen modularen Aufbau vorteilhaft. Dabei wird eine allgemeine PCR-Reaktion, die für umfangreiche Gruppen von Mikroorganismen identisch ist mit einer nachfolgenden Detektion, durch Nutzung taxon- spezifischer Sequenzen innerhalb der amplifizierten DNA, verknüpft. Durch die Verwendung von Hybridisierungssonden, die mikrobiellen Nucleinsäuresequenzen unterschiedlichen Konservierungsgrades entsprechen, wird der Nachweis und die Identifikation von Mikroorganismen ermöglicht, die sich in einer Mischprobe befinden, ohne daß für die Identifikation eine Trennung z. B. durch Einzelkolonie-Passagen notwendig ist. Hierbei wird eine Kombination aus allgemeiner Keimbe¬ stimmung auf Basis hochkonservierter Sequenzabschnitte und individuell definierbarer Spezifizierung durch weniger konservierte Sequenzabschnitte vorgenommen. Vorzugsweise werden zur Gewährleistung einer ausreichenden Sensitivität des Tests, unter Nutzung der Hybridisierungs- sonden als Startermoleküle, Teile der Erbinformation in vitro amplifiziert (z.B. durch PCR).The method according to the invention is advantageous due to its modular structure. A general PCR reaction, which is identical for large groups of microorganisms, is linked to a subsequent detection by using taxon-specific sequences within the amplified DNA. Through the use of hybridization probes that correspond to microbial nucleic acid sequences of different degrees of conservation, the detection and identification of microorganisms that are in a mixed sample is made possible without a separation for the identification e.g. B. through single colony passages is necessary. A combination of general germ determination based on highly conserved sequence sections and individually definable specification by less conserved sequence sections is carried out. To ensure sufficient sensitivity of the test, parts of the genetic information are preferably amplified in vitro using the hybridization probes as starter molecules (for example by PCR).
Erfindungsgemäß werden vorzugsweise die Hybridisierungs¬ sonde(n) A als Starter für die Amplifikation und die Hybri¬ disierungssonde(n) B zur Detektion genutzt. Es ist aber ebenfalls möglich, die Hybridisierungssonde(n) B als Starter für die Amplifikation und die Hybridisierungssonde(n) A zur Detektion, die Hybridisierungssonde(n) A und B als Starter für die Amplifikation und die Hybridisierungssonde(n) B zur Detektion oder die Hybridisierungssonde(n) A und B als Starter für die Amplifikation und die Hybridisierungssonde(n) A zur Detektion zu nutzen.According to the invention, the hybridization probe (s) A are preferably used as starters for the amplification and the hybridization probe (s) B for detection. However, it is also possible to use the hybridization probe (s) B as a starter for the amplification and the hybridization probe (s) A for the detection, the hybridization probe (s) A and B as a starter for the amplification and the hybridization probe (s) B for the detection or to use the hybridization probe (s) A and B as starter for the amplification and the hybridization probe (s) A for detection.
Diese Starter-Hybridisierungssonden (Primer) entsprechen entweder denjenigen hohen Konservierungsgrades oder aber denjenigen hoher Spezifität, während für die Detektion Hybridisierungssonden des jeweilig entgegengesetzten Kon¬ servierungsgrades verwendet werden.These starter hybridization probes (primers) correspond either to those high degrees of preservation or to those with high specificity, while hybridization probes of the respective opposite degree of conservation are used for the detection.
Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, daß auf diese Weise die gewünschte Verknüpfung von Amplifikation und Detektion mit den Hybridisierungssonden engerer und breiterer Spezifität realisiert wird.The advantage of this embodiment is that the desired combination of amplification and detection with the hybridization probes of narrower and broader specificity is achieved in this way.
Vorteilhafterweise erfolgt ein Teil des Verfahrens an einer festen Phase durch Bindung eines Teils der Hybridisierungs¬ sonden, wobei die Kopplung der entsprechenden Hybridi¬ sierungssonde(n) an die feste Phase nach der Amplifikation erfolgt oder daß die Kopplung der entsprechenden Hybridi¬ sierungssonde(n) an die feste Phase vor der Amplifikation erfolgt und die Amplifikation zumindest teilweise an der festen Phase verläuft. Dies hat den Vorteil, daß auf einfache Weise die gebildeten Komplexe aus Amplifikat und Detektions- sonde von sonstigen Komponenten vorangegangener Reaktions- stufen getrennt werden können.Part of the method is advantageously carried out on a solid phase by binding part of the hybridization probes, the coupling of the corresponding hybridization probe (s) to the solid phase taking place after the amplification or that the coupling of the corresponding hybridization probe (s) to the solid phase before amplification and the amplification takes place at least partially on the solid phase. This has the advantage that the complexes formed from amplificate and detection can be separated from other components of previous reaction stages.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens befindet oder befinden sich die weniger konser¬ vierte(n) Sequenz(en), die der (den) Hybridisierungssonde(n) B entspricht (entsprechen) , zwischen den konservierten Sequenzbereichen, die der (den) Hybridisierungssonde(n) A entspricht (entsprechen) oder die konservierte (n) Sequenz(en), die der (den) Hybridisierungssonde(n) A ent¬ spricht (entsprechen) , befindet oder befinden sich zwischen den weniger konservierten Sequenzbereichen, die der (den) Hybridisierungssonde(n) B entspricht (entsprechen) . Vor¬ teilhaft ist dies, weil eine zusätzliche Selektion der sequenzrichtigen Amplifikation erreicht wird.In an advantageous embodiment of the method according to the invention, the less conserved sequence (s), which corresponds to the hybridization probe (s) B, are located between the conserved sequence regions, which correspond to the hybridization probe (s) (n) A corresponds (correspond) or the conserved sequence (s) corresponding to the hybridization probe (s) A is or are located between the less conserved sequence regions that the (the ) Hybridization probe (s) B corresponds (correspond). This is advantageous because an additional selection of the sequence-correct amplification is achieved.
Insbesondere kann erfindungsgemäß-die Amplifikation simultan mit mehreren Starterpaaren auf gleichzeitig mehreren Target- Sequenzen durchgeführt werden. Dieses bietet den Vorteil, in einer Reaktion auch solche Mikroorganismen gleichzeitig zu amplifizieren, für die keine hinreichend übereinstimmenden Hybridisierungssonden als Starter existieren.In particular, the amplification according to the invention can be carried out simultaneously with a plurality of starter pairs on a plurality of target sequences simultaneously. This offers the advantage of simultaneously amplifying those microorganisms in a reaction for which there are no sufficiently matching hybridization probes as starters.
Es ist erfindungsgemäß ebenfalls möglich, die Detektion simultan mit mehreren verschiedenen Sonden durchzuführen, um vorteilhafterweise, entsprechend der analytischen Auf¬ gabenstellung, Gruppen von Mikroorganismen detektieren zu können, ohne daß entsprechende Hybridisierungssonden dieser Gruppenspezifität zur Verfügung stehen müssen. Ribosomale Gensequenzen haben sich als besonders geeignet erwiesen, im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt zu werden. Ribosomale Gensequenzen bieten den Vorteil, daß sie hochkonservierte und weniger konservierte Abschnitte in der hier interessierenden bevorzugten engen Nachbarschaft auf weisen. Ein weiterer Vorteil der Verwendung dieser Gen¬ sequenzen besteht darin, daß ribosomale Gene in mehreren Kopien je Genom von Mikroorganismen existieren, was zu einer vergleichsweise höheren Sensitivitat des erfindungsgemäßen Assays beiträgt.It is also possible according to the invention to carry out the detection simultaneously with several different probes, in order to be able to advantageously detect groups of microorganisms in accordance with the analytical task, without corresponding hybridization probes of this group specificity having to be available. Ribosomal gene sequences have proven to be particularly suitable for use in the method according to the invention. Ribosomal gene sequences offer the advantage that they have highly conserved and less conserved sections in the preferred close neighborhood of interest here. Another advantage of using these gene sequences is that ribosomal genes exist in multiple copies per genome of microorganisms, resulting in a comparatively higher sensitivity of the assay according to the invention contributes.
Die Figur 1 veranschaulicht in schematischer Darstellung die oben beschriebenen Zusammenhänge. Die mit hochkonservativen Bereichen einer Genstruktur von rDNA hybridisierenden Sonden AI und A2 hybridisieren mit zwei verschiedenen Bereichen einer für 16S rRNA kodierenden DNA-Struktur eines Pro- karyonten. Diese Bereiche flankieren eine Region, in der sich mittel und niedrig konservierte Bereiche befinden, die ihrerseits mit den Hybridierungssonden Bl und B2 in hybridi¬ sierende Wechselwirkung treten. Die Amplifikation ergibt eine detektierbare Menge an analysierbarer Substanz, die bei positiver Reaktion eine Unterscheidung von Familien und/oder Arten von Mikroorganismen ermöglicht.Figure 1 illustrates the relationships described above in a schematic representation. The AI and A2 probes hybridizing with highly conservative regions of a gene structure of rDNA hybridize with two different regions of a DNA structure of a prokaryote coding for 16S rRNA. These areas flank a region in which there are medium and low conserved areas, which in turn interact with the hybridization probes B1 and B2. The amplification results in a detectable amount of analyzable substance which, in the event of a positive reaction, enables families and / or types of microorganisms to be distinguished.
Durch Temperatur, Ionenstärke und andere, insbesondere die Wasserstoffbrückenbildung beeinflussende Faktoren, können die Hybridisierungsbedingungen jeweils so stringent gewählt werden, daß die für die Aussage des Verfahrens erforderliche Spezifität der Hybridisierungsreaktion(en) zwischen Target¬ sequenz und den Hybridisierungssonden gewährleistet wird. Wie die Stringenz im einzelnen zu wählen und einzustellen ist, kann der Fachmann mit ihm bekannten Mitteln festlegen (vergl. U. Wobus, "Isolierung, Fraktionierung und Hybri¬ disierung von Nucleinsäuren", Akademie-Verlag, Berlin, 1981, 229 Seiten) .The hybridization conditions can in each case be selected so stringently by temperature, ionic strength and other factors, in particular influencing the hydrogen bonding, that the specificity of the hybridization reaction (s) between the target sequence and the hybridization probes required for the statement of the method is ensured. The person skilled in the art can determine how to select and set the stringency in detail using means known to him (cf. U. Wobus, "Isolation, Fractionation and Hybridization of Nucleic Acids", Akademie-Verlag, Berlin, 1981, 229 pages).
Die Auswahl der Hybridisierungssonden erfolgt in Abhängigkeit von der analytischen Aufgabenstellung. Es sind sowohl all¬ gemeine Keimzahlbestimmungen in Kombination mit der Detektion spezieller Arten als auch die Analyse und Charakterisierung sehr komplex zusammengesetzter Proben möglich.The hybridization probes are selected depending on the analytical task. Both general bacterial count determinations in combination with the detection of special species and the analysis and characterization of very complex samples are possible.
Der Anwender kann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens in Abhängigkeit von der analytischen Aufgabenstellung die Analyse so durchführen, daß er Reaktionsgefäße, die unter- schiedliche, vorzugsweise an fester Phase gebundene Hybridi¬ sierungssonden enthalten, in modularer Weise so zusammenfügt, daß eine Vielzahl von Proben oder verschiedene analytische Fragestellungen an einer oder wenigen Proben parallel und gleichzeitig untersucht werden.Depending on the analytical task, the user can carry out the analysis by means of the method according to the invention in such a way that he can use reaction vessels which contain various hybridization probes, preferably bound to a solid phase, which are combined in a modular manner in such a way that a large number of samples or different analytical questions on one or a few samples are examined in parallel and simultaneously.
Erfindungsgemäß wird bevorzugt eine Zusammenstellung einge¬ setzt, die Komponenten zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält. Dazu gehören neben anderen Bestandteilen die Hybridisierungssonde(n) A und B. In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zusammenstellung enthält ein Kit mindestens eine Hybridisierungssonde A und/oder B gekoppelt an einen Träger, z. B. ein Reaktions¬ gefäß. Diese Reaktionsgefäße- können als Module für jeweils ähnlich gelagerte Analysenprobleme verwendet werden.According to the invention, a combination is preferably used which contains components for carrying out the method according to the invention. These include, among other components, the hybridization probe (s) A and B. In a preferred embodiment of the combination according to the invention, a kit contains at least one hybridization probe A and / or B coupled to a carrier, e.g. B. a reaction vessel. These reaction vessels can be used as modules for similar analysis problems.
Die erfindunsgemäße Zusammenstellung enthält vorzugsweise auch Reagenzien für die Durchführung von Amplifikations¬ reaktionen und/oder Komponenten für die Detektion von Amplifikaten. Dazu gehören Reaktionspuffer, dNTP-Mix, Wasser, Enzyme, Methodenbeschreibungen, Gebrauchsanweisungen, Warn¬ hinweise und ähnliches.The combination according to the invention preferably also contains reagents for carrying out amplification reactions and / or components for the detection of amplificates. These include reaction buffer, dNTP mix, water, enzymes, method descriptions, instructions for use, warnings and the like.
Die Erfindung wird an den folgenden Beispielen näher er¬ läutert.The invention is explained in more detail in the following examples.
Beispiel 1example 1
Das Vorgehen gliederte sich in folgende Etappen:The procedure was divided into the following stages:
1. Auswahl der Sequenzen für die Sonden1. Selection of the sequences for the probes
2. Probenvorbereitung2. Sample preparation
3. PCR-Amplifikation3. PCR amplification
4. Detektion4. Detection
1. Auswahl der Sequenzen für die Sonden Hybridisierungssonden A:1. Selection of the sequences for the probes Hybridization probes A:
Die Hybridisierungssonden A mit Breitband-Spezifitat dienten zur Amplifikation aller in der Untersuchungsprobe vorhandenen Bakterien und entsprachen einem hochkonservierten Abschnitt der ribosomalen 16S rDNA nach Stackebrandt und Liesack (Handbook of New Bacterial Systematics, p 151-193, 1993) :The hybridization probes A with broadband specificity served for the amplification of all bacteria present in the test sample and corresponded to a highly conserved section of the ribosomal 16S rDNA according to Stackebrandt and Liesack (Handbook of New Bacterial Systematics, p 151-193, 1993):
l6S-rDNA Primer zur Amplifikation16S rDNA primer for amplification
10-30f: GAG TTT GAT CCT GGC TCA G Seq. ID # 110-30f: GAG TTT GAT CCT GGC TCA G Seq. ID # 1
530r: GTA TTA CCG CGG CTG CTG Seq. ID # 2530r: GTA TTA CCG CGG CTG CTG Seq. ID # 2
Hybridisierungssonden B:Hybridization probes B:
Die Hybridisierungssonden B mit engerer Spezifität dienten als Detektionssonden.The hybridization probes B with narrower specificity served as detection probes.
Zur Auswahl der geeigneten Detektionssonden wurden Daten¬ bankrecherchen durchgeführt. Auf diese Weise konnte unter anderem gezeigt werden, daß die ausgewählten Sonden spezifisch für den jeweiligen Organismus sind. Dabei ergaben sich folgende Sequenzen:Database searches were carried out to select the suitable detection probes. In this way it could be shown, among other things, that the selected probes are specific for the respective organism. The following sequences resulted:
Escherichia coli: AAC GUC GCA AGA CCA AAG Seq. ID # 3 Bacillus subtilis: GGT TGT TTG AAC CGC ATG GTT Seq. ID # 4Escherichia coli: AAC GUC GCA AGA CCA AAG Seq. ID # 3 Bacillus subtilis: GGT TGT TTG AAC CGC ATG GTT Seq. ID # 4
Die Sonden wurden zur Detektion mittels ELISA-Reader am 5' - Ende biotinyliert. Dadurch konnte nach Zugabe einer Streptavidin-konjugierten Peroxidase ein Farbumschlag detektiert werden (Soumet et al. , BioTechniques 19: 792 - 796 (1995) ) .The probes were biotinylated at the 5 'end for detection using an ELISA reader. As a result, a color change could be detected after adding a streptavidin-conjugated peroxidase (Soumet et al., BioTechniques 19: 792-796 (1995)).
Beide Sonden wurden in 5 getrennten Versuchen auf ihre Spezifität hin überprüft, indem jeder Organismus mit den eigenen sowie den für den anderen Organismus spezifischen Sonden kontrolliert wurde. Außerdem wurden die Sonden an vier weiteren Mikroorganismen getestet. Dabei ergaben sich keine Kreuzreaktionen.Both probes were checked for their specificity in 5 separate experiments, by checking each organism with its own and with the probes specific for the other organism. The probes were also tested on four other microorganisms. There were no cross-reactions.
2. Probenvorbereitung2. Sample preparation
Zunächst wurden in gepuffertem Peptonwasser die Keime ange¬ züchtet und anschließend aus dieser Gemischprobe die DNA aller Organismen mittels eines DNA-Isolierungskits isoliert.The germs were first grown in buffered peptone water and then the DNA of all organisms was isolated from this mixture sample using a DNA isolation kit.
3. PCR-Amplifikation3. PCR amplification
Für die PCR-Amplifikation wurde ein Primer (530r, s.o.) nach Anweisung der Firma Nunc kovalent an die Kavität der CovaLink™-Platte gebunden.For PCR amplification, a primer (530r, see above) was covalently bound to the cavity of the CovaLink ™ plate according to the instructions of the company Nunc.
Dazu wurde in jede Kavität ein Gemisch aus 100 ng des zuvor am 5' -Ende phosphorylierten 530r-Primers, gelöst in 75 μl 13 mM 1-Methyl-imidazol, gegeben. Hinzugefügt wurden 25 μl frisch angesetzte 40 mM l-Ethyl-3- (3-di-methylaminopropyl- carbodiimide (EDC) ) . Die Platte wurde dann bei 50°C für 5 Stunden inkubiert und dreimal bei 50°C mit 0,4 N NaOH, 0,25% Tween 20 gewaschen. Es folgte eine 5-minütige Inkubation mit der Waschlösung, woran sich weitere drei Waschungen an¬ schlössen. Als letzte Waschlösung wurde deionisiertes Wasser eingesetzt.For this purpose, a mixture of 100 ng of the 530r primer phosphorylated at the 5 'end, dissolved in 75 μl of 13 mM 1-methylimidazole, was added to each cavity. 25 μl of freshly prepared 40 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropylcarbodiimide (EDC)) were added. The plate was then incubated at 50 ° C for 5 hours and washed three times at 50 ° C with 0.4N NaOH, 0.25% Tween 20. This was followed by a 5-minute incubation with the washing solution, which was followed by a further three washes. Deionized water was used as the last washing solution.
Zur Amplifizierung der 16S-rDNA wurde die Methode nach Stackebrandt und Liesack (Handbook of New Bacterial Systematics, p 151-193, 1993) leicht modifiziert. Folgende PCR-Bedingungen wurden in der PCR eingesetzt (Tab. 1) : Tabelle 1The method according to Stackebrandt and Liesack (Handbook of New Bacterial Systematics, p 151-193, 1993) was slightly modified to amplify the 16S rDNA. The following PCR conditions were used in the PCR (Tab. 1): Table 1
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0001
4. Detektion4. Detection
Nach Beendigung der PCR wurde nach dem Protokoll der Firma Nunc weiterverfahren und die Hybridisierung der Detektionssonden durchgeführt .After the PCR had ended, the procedure according to the Nunc protocol was followed and the detection probes were hybridized.
Nach der Amplifikation wurden die Kavitäten trockengesaugt und zweifach mit 0,2 M NaOH, jeweils mit 5-minütiger Inkubation, gewaschen. Anschließend wurde zweifach mit Hybridisierungs- lösung (6x Standard saline citrate [SSC] , 5x Denhardt's Lösung, 100 μg/ml gescherter und denaturierter Heringssperma-DNA) gewaschen. Für die Hybridisierung wurden die biotinylierten Hybridisierungssonden auf eine Konzentration von 0,1 nmol/L in Hybridisierungslösung eingestellt und in 100 μl-Aliquots in die Kavitäten gefüllt. Die Hybridisierungsreaktion lief bei 37°C für 3h. Danach wurden drei Waschschritte bei 37°C durch¬ geführt. Das erste Mal mit 2x SSC, 0,1% Tween 20 für 20 Minuten. Die beiden anderen Male mit 0,lx SSC, 0,1% Tween 20 für jeweils 20 Minuten.After amplification, the wells were sucked dry and washed twice with 0.2 M NaOH, each with a 5-minute incubation. The mixture was then washed twice with hybridization solution (6x standard saline citrate [SSC], 5x Denhardt's solution, 100 μg / ml sheared and denatured herring sperm DNA). For hybridization, the biotinylated hybridization probes were adjusted to a concentration of 0.1 nmol / L in hybridization solution and filled into the cavities in 100 μl aliquots. The hybridization reaction ran at 37 ° C for 3 h. Then three washing steps were carried out at 37 ° C. The first time with 2x SSC, 0.1% Tween 20 for 20 minutes. The other two times with 0.1x SSC, 0.1% Tween 20 for 20 minutes each.
Anschließend wurde die Strepavidin konjugierte Peroxidase dazugegeben. Die Peroxidase (Sigma Chemica, St. Louis. MO, USA) wurde in SPO-Lösung (100 mM Tris-HCL, pH 7,5, 50 mM NaCI, 0,05% Tween 20) 1 : 1000 verdünnt. 100 μl dieser Verdünnung wurden in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurde dreimal mit SPO-Lösung gewaschen. Als Substrat wurden 100 μl TMB-Lösung (1,5 mg/ml Tetramethyl- benzidine; Sigma Chemica) in 25 mM Citronensäure, 50 mM NaH2P04, 0,03% H202, 10% Dimethyl Sulfoxid [DMSO] , pH 5,0) gelöst und dazugegeben. Nach 45 Minuten bei 37°C wurde die Reaktion mit 25 μl 2M H2S04 gestoppt und bei 450 nm am ELISA-Reader gemessen.The strepavidin-conjugated peroxidase was then added. The peroxidase (Sigma Chemica, St. Louis. MO, USA) was diluted 1: 1000 in SPO solution (100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.05% Tween 20). 100 ul of this dilution was added to each well. The plate was incubated at 37 ° C for 30 minutes. It was then washed three times with SPO solution. 100 μl of TMB solution (1.5 mg / ml tetramethylbenzidine; Sigma Chemica) in 25 mM citric acid, 50 mM NaH 2 PO 4 , 0.03% H 2 0 2 , 10% dimethyl sulfoxide [DMSO] were used as the substrate. , pH 5.0) dissolved and added. After 45 minutes at 37 ° C, the reaction was stopped with 25 ul 2M H 2 S0 4 and measured at 450 nm on an ELISA reader.
Die zu beobachtenden Farbveränderungen in den einzelnen Kavi¬ täten waren der Indikator für das Vorhandensein derjenigen Bakterienart in der Untersuchungsprobe, der die zugesetzte Detektionssonde entsprach.The color changes to be observed in the individual cavities were the indicator for the presence in the test sample of the type of bacteria that corresponded to the added detection probe.
Es konnte so gezeigt werden, daß sich aus einem Gemisch von verschiedenen Mikroorganismen ohne Herstellung einer Reinkultur individuelle Arten eindeutig nachweisen lassen.It could be shown that individual species can be clearly identified from a mixture of different microorganisms without producing a pure culture.
Beispiel 2Example 2
Es wird analog nach Beispiel 1 verfahren. Wasserproben und Auf¬ schwemmungen von industriellen Magermilchpulvern werden auf die Anwesenheit von Staphylococcus sεp., Salmonella ssp. und Escherichia ssp. untersucht.The procedure is analogous to Example 1. Water samples and suspensions of industrial skimmed milk powders are checked for the presence of Staphylococcus sεp., Salmonella ssp. and Escherichia ssp. examined.
Dazu wurden Oligonucleotide mit folgender Sequenz als Hybridi¬ sierungssonden A mit Breitbandspezifität gewählt:For this, oligonucleotides with the following sequence were selected as hybridization probes A with broadband specificity:
16SA1: 5 - TAC GGG AGG CAG CAG - 3 Seq. ID # 516SA1: 5 - TAC GGG AGG CAG CAG - 3 Seq. ID # 5
16SA2: 5 - TAC CAG GGT ATC TAA TCC - 3 Seq. ID # 616SA2: 5 - TAC CAG GGT ATC TAA TCC - 3 Seq. ID # 6
Bei Verwendung dieser Oligonucleotide als Startermoleküle für die PCR-Amplifikation werden bei den analysierten Prokaryonten Amplifikate mit einer Länge von etwa 460 bp gewonnen.When using these oligonucleotides as starter molecules for the PCR amplification, amplicons with a length of approximately 460 bp are obtained in the prokaryotes analyzed.
Das Oligonucleotid 16SA2 wurde für die Koppelung an die CovaLink™-Platte ausgewählt und wurde im Reaktionsansatz in einer Konzentration von 0,06 μM benutzt, während das Oligo¬ nucleotid 16SA1 im Reaktionsansatz mit einer Konzentration von 0,5 μM verwendet wurde. Als Hybridisierungssonden B mit engerer Spezifität für die Detektion dienten folgende Oligonucleotide:The oligonucleotide 16SA2 was selected for coupling to the CovaLink ™ plate and was used in the reaction mixture at a concentration of 0.06 μM, while the oligonucleotide 16SA1 was used in the reaction mixture at a concentration of 0.5 μM. The following oligonucleotides served as hybridization probes B with narrower specificity for the detection:
Staphylococcus: 5 - TGT GCA CAT CTT GAC GGT - 3 Seq. ID # 7 Salmonella: 5 - CTG GCA GGC TTG AGT CTT - 3 Seq. ID # 8 Escherichia: 5 - CTC ATT GAC GTT ACC CGC - 3 Seq. ID # 9Staphylococcus: 5 - TGT GCA CAT CTT GAC GGT - 3 Seq. ID # 7 Salmonella: 5 - CTG GCA GGC TTG AGT CTT - 3 Seq. ID # 8 Escherichia: 5 - CTC ATT GAC GTT ACC CGC - 3 Seq. ID # 9
Die Versuchsbedindungen waren mit denen von Beispiel 1 identisch, außer der Hybridisierungs- und Waschtemperaturen bei der Detektion. Hier wurde bei 52°C sowohl hybridisiert als auch gewaschen. Den Proben wurden hierfür die Bakterien sowohl einzeln als auch im Gemisch in unterschiedlichen Konzen¬ trationen und Konzentrationsverhältnissen (103 oder 10fi Keimen/ml) zugesetzt. Die nachfolgende Tabelle 2 faßt die Ansätze sowie Ergebnisse in semiquantitativer Form zusammen.The experimental conditions were identical to those of Example 1, except for the hybridization and washing temperatures in the detection. Here, hybridization and washing were carried out at 52 ° C. For this purpose, the bacteria were added to the samples both individually and in a mixture in different concentrations and concentration ratios (10 3 or 10 fi germs / ml). Table 2 below summarizes the approaches and results in a semi-quantitative form.
Tabelle 2Table 2
Figure imgf000015_0001
Es zeigte sich, daß die Wahl der Hybridisierungstemperatur beim Detektionsschritt für die Differenzierung zwischen Salmonella und Escherichia kritisch ist. Nach entsprechender Wahl der HybridiΞierungsbedingungen ist der spezifische Nachweis von Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium und Escherichia coli in aussagekräftiger Weise möglich.
Figure imgf000015_0001
It was shown that the selection of the hybridization temperature in the detection step is critical for the differentiation between Salmonella and Escherichia. After appropriate selection of the hybridization conditions, the specific detection of Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium and Escherichia coli is possible in a meaningful way.
SEQUENZPROTOKOLLSEQUENCE LOG
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:(1. GENERAL INFORMATION:
(i) ANMELDER:(i) APPLICANT:
(A) NAME: NewLab Diagnostic Systems GmbH(A) NAME: NewLab Diagnostic Systems GmbH
(B) STRASSE: Max-Planck-Str. 15A(B) STREET: Max-Planck-Str. 15A
(C) ORT: Erkrath(C) LOCATION: Erkrath
(E) LAND: Deutschland(E) COUNTRY: Germany
(F) POSTLEITZAHL: 40699(F) POSTAL NUMBER: 40699
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in Gemischen durch modulare PCR(ii) DESCRIPTION OF THE INVENTION: Method for the detection of microorganisms in mixtures by modular PCR
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 9(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 9
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:(iv) COMPUTER READABLE VERSION:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk(A) DISK: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)(D) SOFTWARE: Patentin Release # 1.0, Version # 1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare(A) LENGTH: 19 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
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(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer"(ii) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "primer"
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(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 2:
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(A) LÄNGE: 18 Basenpaare(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
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(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer"(ii) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "primer"
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(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2: GTATTACCGC GGCTGCTG (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2: GTATTACCGC GGCTGCTG (2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
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(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 4:
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(iii) HYPOTHETISCH: NEIN(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTISENSE: NEIN(iv) ANTISENSE: NO
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(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 5:
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(A) LÄNGE: 15 Basenpaare(A) LENGTH: 15 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
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(iii) HYPOTHETISCH: NEIN(iii) HYPOTHETICAL: NO
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(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5: TACGGGAGGC AGCAG 15 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5: TACGGGAGGC AGCAG 15 (2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare(A) LENGTH: 18 base pairs
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(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer"(ii) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "primer"
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(iv) ANTISENSE: NEIN(iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6: TACCAGGGTA TCTAATCC 18(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6: TACCAGGGTA TCTAATCC 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: nicht bekannt(C) STRANDFORM: not known
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer"(ii) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "primer"
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(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7: TGTGCACATC TTGACGGT (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7: TGTGCACATC TTGACGGT (2) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
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(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare(A) LENGTH: 18 base pairs
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(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9: CTCATTGACG TTACCCGC 18 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9: CTCATTGACG TTACCCGC 18

Claims

A n s p r ü c h e Expectations
1. Verfahren zum Nachweis von einem Mikroorganismus oder mehreren Mikroorganismen in einer Probe, die eine Viel¬ zahl von verschiedenen Mikroorganismen enthält, mittels molekularbiologischer Techniken, wie Amplifikations¬ reaktionen,1. Method for the detection of one or more microorganisms in a sample which contains a large number of different microorganisms by means of molecular biological techniques, such as amplification reactions,
wobeiin which
mindestens eine Hybridisierungssonde (A) die konser¬ vierten Nucleinsäuresequenzen in dem oder den interessierenden Mikroorganismus (men) anzuzeigen in der Lage ist undat least one hybridization probe (A) is able to display the conserved nucleic acid sequences in the microorganism (s) of interest and
mindestens eine Hybridisierungssonde (B) , die weniger konservierten Nucleinsäuresequenzen in dem oder den interessierenden Mikroorganismus(men) anzuzeigen in der Lage ist,at least one hybridization probe (B) which is able to display less conserved nucleic acid sequences in the microorganism (s) of interest,
zu der Probe gegeben werden mit der Maßgabe, daß pro interessierendem Mikroorganismus mindestens eine Hybri¬ disierungssonde des Typs (A) und des Typs (B) vorhanden sein muß, sich die Probe in einem hybridisierungsfähigen Zustand befindet. und durch ein entstehendes Hybridi- sierungsmuster eine Identifikation des oder der interessierenden Mikroorganismen erfolgt.are added to the sample with the proviso that at least one hybridization probe of type (A) and type (B) must be present for each microorganism of interest, the sample is in a state capable of hybridization. and the resulting hybridization pattern is used to identify the microorganism (s) of interest.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für ausreichende Sensitivitat Teile der Erbinformation in vitro amplifiziert werden.2. The method according to claim 1, characterized in that parts of the genetic information are amplified in vitro for sufficient sensitivity.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die Hybridisierungssonde(n) A und/oder B als Starter für die Amplifikation und die Hybridisie¬ rungssonde(n) B oder A zur Detektion genutzt werden. 3. The method according to claim 1 and / or 2, characterized gekenn¬ characterized in that the hybridization probe (s) A and / or B are used as starters for the amplification and the hybridization probe (s) B or A for detection.
4. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sich die weniger konser¬ vierte(n) Sequenz(en), die der (den) Hybridisierungs¬ sonde(n) B entspricht (entsprechen), zwischen den kon¬ servierten Sequenzbereichen, die der (den) Hybridi¬ sierungssonde(n) A entspricht (entsprechen), befindet.4. The method according to at least one of claims 1 to 3, characterized in that the less conserved sequence (s) corresponding to the hybridization probe (s) B correspond (correspond) between the con ¬ served sequence areas, which corresponds to the hybridization probe (s) A.
5. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sich die konservierte(n) Sequenz (en) , die der (den) Hybridisierungssonde(n) A entspricht (entsprechen) , zwischen den weniger konser¬ vierten Sequenzbereichen, die der (den) Hybridi¬ sierungssonde(n) B entspricht (entsprechen), befindet.5. The method according to at least one of claims 1 to 3, characterized in that the conserved sequence (s) corresponding to the hybridization probe (s) A correspond (correspond) between the less conserved sequence regions, which corresponds to the hybridization probe (s) B.
6. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Hybri¬ disierungssonden an einer festen Phase gekoppelt ist.6. The method according to at least one of claims 1 to 5, characterized in that at least one of the Hybri¬ disierungssonden is coupled to a solid phase.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplung der entsprechenden Hybridisierungssonde(n) an die feste Phase nach der Amplifikation erfolgt.7. The method according to claim 6, characterized in that the coupling of the corresponding hybridization probe (s) to the solid phase takes place after the amplification.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplung der entsprechenden Hybridisierungssonde(n) an die feste Phase vor der Amplifikation erfolgt und die Amplifikation zumindest teilweise an der festen Phase verläuft.8. The method according to claim 7, characterized in that the coupling of the corresponding hybridization probe (s) to the solid phase takes place before the amplification and the amplification runs at least partially on the solid phase.
9. Verfahren gern?" mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch geken eichnet, daß die Amplifikation ε-.multan mit mehreren Starterpaaren auf gleichzeitig r nreren Targetsequenzen durchgeführt wird.9. Method like? "At least one of claims 1 to 8, characterized in that the amplification is carried out ε-simultaneously with a plurality of starter pairs on simultaneously target sequences.
10. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion simultan mit mehreren verschiedenen Sonden erfolgt. 10. The method according to at least one of claims 1 to 8, characterized in that the detection is carried out simultaneously with several different probes.
11. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierungssonden Teile von ribosomalen Gensequenzen sind.11. The method according to at least one of claims 1 to 10, characterized in that the hybridization probes are parts of ribosomal gene sequences.
12. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierungsbedingungen durch Temperatur, Ionen¬ stärke und andere die Wasserstoffbrückenbildung beein¬ flussende Faktoren jeweils so stringent gewählt werden, daß die für die Aussage des Verfahrens erforderliche Spezifität der Hybridisierungsreaktion(en) zwischen Targetsequenz und den Hybridisierungssonden gewähr¬ leistet wird.12. The method according to claim 1, characterized in that the hybridization conditions by temperature, ionic strength and other factors influencing the hydrogen bonding are selected so stringently that the specificity of the hybridization reaction (s) between target sequence and required for the statement of the method the hybridization probes is guaranteed.
13. Zusammenstellung enthaltend Komponenten zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12.13. Compilation containing components for performing the method according to one of claims 1 to 12.
14. Zusammenstellung gemäß Anεpruch 13, enthaltend Hybridi¬ sierungssonde(n) A und B.14. Compilation according to claim 13, containing hybridization probe (s) A and B.
15. Zusammenstellung gemäß Anspruch 13 und/oder 14, wobei mindestens eine Hybridisierungssonde A und/oder B an einen Träger, wie ein Reaktionsgefäß, gekoppelt ist.15. Compilation according to claim 13 and / or 14, wherein at least one hybridization probe A and / or B is coupled to a carrier, such as a reaction vessel.
16. Zusammenstellung gemäß mindestens einem der Ansprüche 13 bis 15, enthaltend Reagenzien für die Durchführung von Amplifikationsreaktionen und/oder Komponenten für die Detektion von Amplifikaten. 16. Compilation according to at least one of claims 13 to 15, containing reagents for carrying out amplification reactions and / or components for the detection of amplificates.
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