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WO1996038566A1 - Fragment d'acide nucleique codant pour un enzyme implique dans la voie de biosynthese de l'acide abscissique (aba) chez les plantes - Google Patents

Fragment d'acide nucleique codant pour un enzyme implique dans la voie de biosynthese de l'acide abscissique (aba) chez les plantes Download PDF

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WO1996038566A1
WO1996038566A1 PCT/FR1996/000820 FR9600820W WO9638566A1 WO 1996038566 A1 WO1996038566 A1 WO 1996038566A1 FR 9600820 W FR9600820 W FR 9600820W WO 9638566 A1 WO9638566 A1 WO 9638566A1
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WO
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aba
sequence
plants
mutant
gene
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Application number
PCT/FR1996/000820
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English (en)
Inventor
Elena Marin
Annie Marion-Poll
Original Assignee
Institut National De La Recherche Agronomique
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Publication date
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Priority to AU62283/96A priority patent/AU6228396A/en
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8291—Hormone-influenced development
    • C12N15/8293—Abscisic acid [ABA]

Definitions

  • the present invention relates to the cloning of a gene involved in the abscissic acid (ABA) biosynthesis pathway in plants.
  • ABA abscissic acid
  • the present invention relates to an isolated nucleic acid fragment coding for an enzyme involved in the ABA biosynthesis pathway.
  • Abscissic acid is considered a plant "stress hormone" because it is accumulated when plants are subjected to various stresses such as saline soils, low temperatures, frost and drought. ABA induces responses in the host plant that increase stress tolerance. The water content of plant tissues and the functioning of stomata are regulated by the ABA (Tal and Nevo, 1973). ABA also controls the dormancy and germination aspects of seeds (Koornneef et al., 1982, 1989), and promotes normal embryogenesis and the formation of proteins stored in seeds (see Kermode, 1990).
  • the abil and abi3 genes were isolated by positional cloning also called the method of works on the chromosome (Leung et al., 1994; Meyer et al., 1994; Giraudat et al., 1992).
  • the abil gene codes for a calcium-regulated phosphatase, while abi3 codes for a protein homologous to VP1.
  • Viviparous mutants of vp-2 corn. vp-5. vp-7 and vp-9 are deficient in ABA and are blocked simultaneously in the early stages of carotenoid biosynthesis. Consequently, they present a photo-bleaching, due to the lack of protection of the photosynthetic devices by the carotenoids (Moore and Smith, 1985; Neil et al., 1986).
  • the aba mutant of Arabidopsis thaliana is deficient in the epoxidation of zeaxanthin (Duckham et al., 1991; Rock and Zeevaart, 1991) which is considered to be the first step in the biosynthesis of ABA (Taylor, 1991).
  • Several mutants isolated from tomatoes (flacca and sitiens).
  • the aim of the present invention is the isolation of a gene from the ABA biosynthetic pathway.
  • a gene from the ABA biosynthetic pathway can be used to control or modify the synthesis of ABA in transgenic plants.
  • the present invention provides for the first time the isolation and molecular characterization of a gene from the ABA biosynthetic pathway.
  • a new mutant deficient in ABA (called aba2) was isolated by insertion mutagenesis induced by a transposable element Ac in
  • Nicotiana plumbaginifolia The main advantage of this mutant is that the gene for the ABA biosynthetic pathway is labeled there because the mutation, which causes ABA deficiency, is due to the insertion of the Ac element. Analysis of the corresponding cDNA indicates that it codes for a zeaxanthin epoxidase. This epoxidase is original and the control of its expression is decisive because it probably catalyzes the first two stages of ABA biosynthesis. Gene labeling experiments, using mutation by insertion of transposable elements, whatever the species, are completely random and can take several years.
  • AFLP Among others, several genes have been cloned by this technique to date, while several hundred mutants have been identified in Arabidopsis. This is why, although the abscissic acid deficient mutant was isolated in 1982 from Arabidopsis, the corresponding gene has still not been cloned by this technique.
  • the present invention therefore relates to an isolated nucleic acid fragment encoding an enzyme involved in the biosynthesis pathway for abscissic acid (ABA) in plants.
  • the enzyme is an epoxidase involved in the first two stages of the ABA biosynthesis pathway. More particularly still, the enzyme exhibits an activity of epoxidation of zeaxanthin.
  • the subject of the present invention is an isolated nucleic acid fragment, characterized in that it comprises all or part of a nucleotide sequence as shown in the sequence identifier No. 1, or all or part of a sequence homologous to that shown in sequence identifier No. 1, or all or part of a sequence complementary to said sequence of sequence identifier No. 1 or of a homologous sequence.
  • nucleic acid fragment is meant here a nucleotide polymer which may be of DNA or RNA type. These terms are defined in all basic molecular biology works.
  • a nucleic acid fragment according to the invention is a double stranded DNA fragment.
  • part designates a fragment comprising a portion of at least 500, preferably at least 1000 nucleotides identical to a portion of equivalent length of the nucleotide sequence indicated in the sequence identifier (IDS No. 1) or of its complementary.
  • homologous refers to any nucleic acid exhibiting one or more sequence modification (s) with respect to all or part of the sequence shown in IDS No. 1, and coding for an enzyme having the activity mentioned above. -above. These modifications can be obtained by mutations, deletion and / or addition of one or more nucleotide (s) relative to the native sequence. They can be introduced in particular to improve the activity of the enzyme. In this context, a degree of homology of 70% with respect to the native sequence will be preferred, advantageously 80% and preferably 90%. A person skilled in the art knows where to carry out the modifications so as not to drastically alter the function of the enzyme and also knows the techniques making it possible to assess whether the generated homolog has enzymatic activity, for example by insertion upstream. a reporter gene whose expression is easily detectable ( ⁇ -galactosidase, cathechol-oxygenase, luciferase or even a gene conferring resistance to an antibiotic). But any other conventional technique can also be used.
  • IDS No. 1 The sequence of IDS No. 1 is a sequence isolated from the aba2 mutant described below. It is the cDNA sequence, that is to say devoid of introns.
  • the fragment according to the invention comprises all or part of the coding sequence ranging from nuciéotide n ° 41 to 2029, IDS / 41 N ° l, or its complement, or of a sequence homologous or complementary to said homologous sequence.
  • the fragment according to the invention additionally comprises the leader sequence going from nuciéotide n ° 1 to 40 of IDS N ° 1.
  • the fragment according to the invention advantageously comprises the termination sequence ranging from nuciéotide 2030 to 2400 from IDS No. 1.
  • it includes said termination sequence augmented by a poly A tail at its 3 ′ end.
  • the fragment according to the invention comprises the complete sequence of 2400 nucleotides as shown on IDS No. 1, a homologous sequence, a complementary sequence, or a sequence homologous to said complementary sequence.
  • the invention also includes any sequence capable of hybridizing under stringent conditions with one of these sequences and coding for the same enzymatic activity involved in the ABA biosynthesis pathway, in particular in the first two steps.
  • the subject of the present invention is a cloning vector characterized in that it comprises a nucleic acid fragment according to the present invention.
  • a cloning vector comprises a complete coding sequence of 2400 nucleotides as shown in IDS No. 1.
  • the invention also relates to any equivalent DNA sequence, that is to say that differs from the sequences mentioned above only by one or more neutral mutations, that is to say whose change or substitution of nucleotides involved does not affect the primary sequence of the resulting protein.
  • cloning vector comprising the fragment, of the vectors comprising a DNA sequence containing at least one origin of replication such as plasmids, cosmids, bacteriophages, viruses etc.
  • origin of replication such as plasmids, cosmids, bacteriophages, viruses etc.
  • plasmids will be used.
  • the DNA fragment according to the invention will be associated with a regulatory sequence suitable for its transcription and translation (hereinafter regulon) such as promoters, including start and stop codons, "enhancers", operators .
  • regulon a regulatory sequence suitable for its transcription and translation
  • the means and methods for identifying and selecting these promoters are well known to those skilled in the art.
  • the DNA fragments according to the invention can be introduced into plant cells according to known mechanisms such as through the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. or by direct transfer of genes such as by the electroporation method. In this case, but not necessarily, the regulon constituting the corresponding gene can be advantageously used.
  • the DNA fragments according to the invention can be used to transform microorganisms or eukaryotic cells to clone and produce the corresponding Epoxidase enzyme.
  • the present invention finally makes it possible to improve the stress resistance of plants, by introducing into the cells of said plants a DNA fragment coding according to the invention, under conditions allowing its replication and its expression.
  • the expression of the gene can be blocked by hybridization of the mRNA transcribed by said gene with an RNA fragment complementary to at least part of the mRNA transcribed by one of said genes.
  • Said fragment of RNA complementary to at least part of the mRNA transcribed by one of said genes can be introduced as it is into the cells of plants to be transformed or in the form of a DNA fragment placed under the control of a transcriptional promoter, so that the transcription of said DNA fragment provides an RNA sequence complementary to at least part of the mRNA transcribed by the gene.
  • a plasmid containing an exogenous DNA fragment placed under the control of a transcriptional promoter, so that the transcription of said DNA fragment provides an RNA sequence complementary to at least minus part of the endogenous mRNA transcribed by the gene.
  • said exogenous DNA fragment codes for an RNA sequence complementary to part of the mRNA transcribed by the gene comprising the ribosome binding site and / or the translation initiation site.
  • the exogenous gene is generally a heterologous gene, that is to say which comes from a plant, from a species different from the host cell, the gene coding for the enzyme ordinarily not produced by the plant in the genome. from which it is introduced.
  • the exogenous gene introduced into the genome of the plant can also be a gene homologous to the endogenous gene, that is to say the expression of which produces the enzyme ordinarily produced by the plant.
  • said exogenous DNA fragment codes for an RNA sequence complementary to more than 80% of the mRNA by one of the abovementioned genes.
  • Said exogenous DNA fragment may be a fragment of one of the functional genes coding for an abovementioned enzyme, this fragment being placed opposite to the endogenous gene with respect to the promoter, so that transcription of said reverse gene fragment occurs in a direction opposite to the direction of transcription of the gene to hybridize to the endogenous mRNA of said gene and block its expression.
  • the term "functional gene coding for the enzyme” means a DNA sequence which can therefore be shorter or longer than the total coding sequence, of the complete gene of the enzyme.
  • the enzyme means a DNA sequence which can therefore be shorter or longer than the total coding sequence, of the complete gene of the enzyme.
  • “functional gene” could correspond to a coding sequence devoid of introns. It is also possible, to introduce a fragment of mRNA or of DNA into the plant, to implement first of all the methods of direct transfer of genes known to those skilled in the art, such as direct micro-injection into embryo cells or direct precipitation by means of EPG or bombardment by particle cannon or by infection with a bacterial strain into which the nucleic acid fragment has been introduced.
  • the plant can also be infected with a bacterial strain, in particular Agrobacterium tumefaciens according to a proven method (Schell and van Montagu, 1983) or Agrobacterium rhizogenes. especially for species recalcitrant during processing (Chilton et al., 1982).
  • the bacterial strain will comprise said DNA fragment coding for the enzyme under the control of elements ensuring transcription into mRNA of said gene.
  • the strain can be transformed by a vector into which is inserted the gene encoding the enzyme under the control of elements ensuring the transcription of said gene.
  • This gene will be inserted, for example, into a binary vector such as pBINI19 (Bevan, 1984) or pMON 505 (Horsch and Klee, 1986) or any other binary vector derived from the plasmids Tl and Ri. It can also be usefully introduced by homologous recombination into a disarmed Tl or Ri plasmid, such as pGV 3850 (Zambryski et al., 1983) before the transformation of the plant.
  • FIG. 1 represents the effect of the desiccation on the weight of loose leaves of the wild type and of the mutant AA67 (aba2) of Nicotiana Plumbaginifolia. The leaves were harvested, gently dried on absorbent paper and weighed every 5 min. in the drying atmosphere of a laminar flow hood. The mean and standard error of six independent experiments are shown.
  • FIG. 2 represents the carotenoid profile of wild type leaves and of the AA67 mutant (aba2).
  • FIG. 3 represents the biosynthetic scheme of ABA from zeaxanthin. Adapted from the synthetic route proposed by Li and Walton (1 90) and Parry et al. (1990).
  • FIG. 4 represents the Southern analysis of the DNA of the mutant and wild progeny of the mutant plant AA67 (aba 2). carrying a trAc element.
  • the DNA digested with EcoRI was hybridized to the probe A (on the 5 ′ edge of Ac).
  • Ro indicates the primary transformant; R j, the parental AA67 plant; Ml to M3, mutant progeny R 2 ; NI to N5, plants R 2 having a wild phenotype; p indicates the proportion of mutants in the offspring of each plant.
  • FIG. 5 represents the partial restriction map of the locus mutated by the insertion of Ac.
  • the positions of the probes corresponding to Ac and the adjacent DNA are indicated by bars A, B and C.
  • FIG. 6 represents the northern analysis of the RNA of wild type leaves and of the mutant aba2 hybridized with the C probe (FIG. 3B) and with the ⁇ ATPase probe.
  • FIG. 7 represents the Southern analysis of the DNA of revertant plants in the progeny of a homozygous mutant plant. Digestion was carried out by EcoRV and hybridization with probe C
  • the tracks are as follows: WT, wild type; Ri, parental AA67 plant; R 2 , a heterozygous R 2 plant; lines 1 to 5 are the reverting plants of the R 3 progeny of a homozygous mutant R 2 plant; M4 and M5, two mutant R 2 homozygous plants.
  • FIG. 8 shows the complete cDNA sequence with the deduced amino acid sequence for the largest ORF starting with a methionine. The first initiation codon and the stop codon are indicated in bold. The 8 bp sequence duplicated in the genomic locus after the insertion of Ac is framed.
  • FIG. 9 represents the three domains of significant homology of the protein are represented. The motif of binding to ADP (a), the central motif of unknown function (b) and the motif of binding to FAD (c). Amino acid positions are shown in parentheses.
  • FIG. 10 represents the studies of import into the chloroplasts of the translation products of cDNA.
  • Lane 1 is loaded with molecular weight markers
  • T is loaded with a microliter of translation mixture
  • C is loaded with the import reaction (corresponding to 1/4 of the total of the import reaction)
  • P is loaded with the import reaction after protease treatment (corresponding to 1/4 of the import reaction).
  • ABA abscissic acid
  • ABA-GE ester of ABA-glucose
  • bp base pairs
  • DW dry weight
  • FW fresh weight
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • nt for nuciéotide (s); "ORF” for open reading frame.
  • transposable element of Aç maize inserted into the sequence of a kanamycin resistance marker (Baker et al., 1987) was introduced via a transformation by Agrobacterium in N. plumbaginifolia. giving rise to primary transformants Ro (Marion-Poll et al.,
  • Transgenic plants of Nicotiana plumbaginifolia cv. viviani were obtained by transformation with the construction pGV 3850 Hygro: pKU 3Ti (Baker et al., 1987) and characterized as previously described (Marion-Poll et al., 1993).
  • the screening of the mutant phenotypes was carried out using seeds sterilized on the surface, spread on a BNO 3 medium (Gabard et al., 1987). To promote uniform germination, the seeds were placed for 10 to 20 days in a germination chamber having a significant difference in terms of day / night temperatures (25V17 ° C) and short days (8 hrs / 16 hrs). The boxes containing young seedlings were transferred to a growth chamber (16 h day / 8 h night and 25 ° C) to allow faster growth. 6 week old seedlings were transferred to the soil.
  • the seedlings of the mutant aba2 were unable to grow under standard greenhouse conditions and were grown under a plastic film in the greenhouse (with an atmosphere saturated with water) or in a growth chamber (90% humidity relative, 16 h of day / 8 h of night and 25V17 ° C). All molecular and biochemical analyzes were carried out on non-stressed leaves harvested before the flowering period. The water stress protocol used was described by Parry et al., (1991).
  • the transposition of Aç was monitored in the progeny (Ri) of the primary transformants using the excision marker for kanamycin resistance. This allowed the selection of 1000 Ri plants resistant to kanamycin which were cultivated until maturity, and whose offspring were put to germinate in vitro. One of them (AA67) showed segregation for an early germination phenotype. Freshly harvested AA67 mutant seeds germinated in 4 to 7 days, while wild type seeds took 10 to 15 days. This phenotype presented a Mendelian type segregation characteristic of a recessive and monogenic mutation. The young mutant seedlings were extremely sensitive to water stress, probably because they did not close their stomata.
  • the mutant leaves lost 48% of their fresh weight (FW) in 60 min in a draft while, during the same period, the wild type leaves lost only 11% of FW ( Figure 1). This required putting the plants to grow in 90 to 100% relative humidity.
  • the young mutant plants treated with a daily spray of ABA at 40 ⁇ M for two weeks recovered the rate of transpiration of the wild type when loose leaves were tested (data not shown).
  • the grafting of mutant plants onto wild type tobacco stems also allowed the restoration of the wild phenotype.
  • the AA67 mutant was crossed with the aba 1 mutant. previously isolated from N. plumbaginifolia (Bitoun et al, 1989, Rousselin et al., 1992). The complementation between these two mutants has shown that they are mutated on different genes. As a result, the AA67 mutant was called aba2.
  • Genomic DNA was extracted from 2 g of leaf material as described by Dellaporta et al. (1983), and purified on a cesium chloride gradient. Ten ⁇ g of DNA were digested with the appropriate restriction enzymes, separated on 0.8% agarose gels and transferred to a nylon membrane (Hybond-N, Amersham). Hybridization of the membranes was carried out under stringent conditions using probes A (a 0.7 kb AccI-HindIII fragment from the 5 'end of Aç), B (a 0.8 Hind HindIII-AccI fragment kb from edge 3 'of Aç) and C (an IPCR probe described below), as shown in Figure 5.
  • A a 0.7 kb AccI-HindIII fragment from the 5 'end of Aç
  • B a 0.8 Hind HindIII-AccI fragment kb from edge 3 'of Aç
  • C an IPCR probe described below
  • Total leaf RNA was extracted according to Verwoerd et al. (1989) and 8 ⁇ g were loaded onto a 1.2% agarose gel containing formaldehyde (Maniatis et al., 1982). The hybridizations were carried out under stringent conditions using the C probe (FIG. 5) and the 1.6 kb EcoRI-SalI cDNA fragment of the ⁇ subunit, encoded by the nucleus, from the mitochondrial ATPase originating from from N. plumbaginifolia (Boutry and Chua, 1985).
  • the IPCR amplification of the sequences adjacent to Aç . was performed as described by Earp et al. ( 1990).
  • the genomic DNA was digested with Kpn1 and ligated using the DNA ligase from phage T4.
  • the PCR reaction was carried out with oligonucleotides # 2 (5 'CGATAACGGTCGGTACGGGA-3') and # 6 (5 '-
  • Oligonucleotide # 2 hybridizes to 44 bp located downstream of the 5 'edge of Ace.
  • the oligonucleotide # 6 hybridizes at 1 15 bp located upstream of the 3 'edge of Ace.
  • the PCR reactions used the following conditions: 30 cycles of denaturation of 45 sec at 94 ° C, 30 sec of hybridization at 60 ° C, 2 min extension at 72 ° C with a single final extension of 10 min at 72 ° C.
  • the amplified 2 kb fragment was cloned and partially sequenced by standard procedures. This fragment was used as probe C ( Figure 5) to hybridize to northern and Southern blots and to screen a cDNA library.
  • the heterozygous mutant without the 4.5 kb band could be due to an imprecise excision event that does not restore the functionality of the gene.
  • a Kpn I fragment (FIG. 5) was cloned and sequenced after IPCR amplification. Oligonucleotides were synthesized on each side of the Ace insertion. The corresponding DNA was amplified and sequenced in the wild and the heterozygous mutant.
  • a 7bp excision imprint left by the excision of A c is probably responsible for the phenotype. Indeed, the partial sequence of the Knp I fragment indicates that the insertion of A c has occurred in a coding sequence.
  • the excision of A c caused the introduction of a TGA stop codon in phase in the additional 7 bp and the stable mutant was called aba 2-sl.
  • Five revertant plants (found among approximately 5000 seeds) were analyzed at the molecular level ( Figure 7). When hybridized with probe C, Southern blots of the mutant plants presented a 10 kb EcoRV fragment, also hybridizing to the Ace probes. A 2.8 kb EcoRV band was also revealed and corresponds to a genomic fragment located downstream of the insertion point of A.
  • leaves were frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C.
  • Leaf samples 100 mg fresh weight
  • the extracts were centrifuged for 5 min at 12,000 g and the supernatant stored in ice.
  • the pellet was resuspended in the above solvent and centrifuged again. This process was repeated until the supernatant was colorless.
  • the final supernatants were passed through 0.5 ⁇ m filters and then evaporated.
  • the dry extracts were stored at -20 ° C in the dark under argon. Carotenoid pigments were separated by non-aqueous reverse phase HPLC as described by Gilmore and Yamamoto (1991). 3.2. Results
  • the carotenoid composition is modified in the mutant aba2-sl.
  • the poly (A) + fraction was selected on oligo dT columns (Pharmacia).
  • Double-stranded cDNA was synthesized using a cDNA synthesis kit (Promega) and an adapter-primer-NotI-oligo (dT). After ligation of EcoRI adapters (Pharmacia), the cDNA was digested with NotI and cloned directionally into the vector ⁇ gtll Sfi-Not (Promega). About 1.5 x 10 6 independent recombinants were obtained after phage packaging (Stratagene) and infection in the strain LE 392 (Promega).
  • the ⁇ gtll cDNA library was amplified in the RY 1090 strain of Escherichia coli. Hybridization of phage plaques, using probe C, was carried out according to standard procedures (Maniatis et al., 1982). Washes were carried out under conditions of low stringency in 2 ⁇ SCC, 0.5% sarkosyl at 65 ° C. The DNA inserts of the positive recombinant phages were subsequently cloned into - the EcoRI-Notl sites of a pBS-SK + vector (Stratagene) and into the Eco-Rl-Sacl sites of a pGEM-7Z vector (Promega ).
  • the radioactive C probe was used to screen 3 x 10 5 plates from the ⁇ gtll library. A positive clone showed a 2.4 kb insert. This was the expected size for the transcript ( Figure 6). After cloning into a pBluescript vector, and subcloning into a pGEM vector, the insert was completely sequenced on both strands. The full cDNA sequence (2400 nucleotides long) and the largest open reading frame (ORF) starting with a methionine are shown in Figure 8. This ORF consists of 1989 bp, corresponding to a polypeptide of 663 residues amino acids (aa), with a predicted molecular weight of 72.54 kDa.
  • a stop codon in phase located upstream of this ORF at the nucleotide position -20 confirms that the ORF presented in FIG. 6A is the entire coding region of the corresponding gene. If the ATG at the level of nuciéotide 1 is the initiation codon, the cDNA has a 5 'untranslated sequence of 40 bp, a coding region of 1989 bp, and a 3' untranslated sequence of 310 bp, followed by a poly (A) tail (58 bp long). The 3 'untranslated sequence contains three supposed poly (A) addition signals (ATAAA) at nucleotides 2015, 2109 and 2276 (Joshi, 1987).
  • ATAAA addition signals
  • This glycine-rich motif common to enzymes that bind to the cofactor, makes it possible to predict whether a particular amino acid sequence can fold into ⁇ with properties of binding to the ADP part of NAD (P) or FAD. Thus, a suspected FAD binding site was found.
  • the amino acid sequence MQHGRLFLAGD is involved in the binding to FAD of PHBH (Wijnands et al., 1986).
  • Amino acid residues 359 to 372 show 9 identical residues with this sequence, enough to guarantee the conformation that is necessary for binding to FAD.
  • amino acids 379 and 382 of our supposed epoxidase are present in the sequences of PHBH and salicylate-1-hydroxylase and have been described as having structural and functional importance in these enzymes (You et al., 1991).
  • a third fragment of homology is included between the amino acid residues 230 and 249 of the ORF. This segment of homology has not yet been described until now, but is present in all the protein sequences having a certain homology with the sequence in question. 5.
  • the ABA2 protein is imported into the chloroplasts
  • the cDNA cloned into a pBS-SK + vector was translated from the T3 RNA polymerase promoter.
  • the construction PsaD coding for a photosystem protein I located in the chloroplasts (Kjaruff and Okkels, 1993), was used as a positive control for the import reactions.
  • In vitro transcription / translation was carried out with 1 ⁇ g of each plasmid and with methionine labeled with S 35 using the Reticulocyte Lysate System coupled to TNT (Promega Corporation, Madison, WI). Chloroplasts were isolated from leaves from two-week-old pea plants according to Cline et al. (1985). The import tests were carried out as described by Hoff et al. (1995). The samples were analyzed on polyacrylamide-SDS gels (12% for the PsaD import reaction and 5% for our construction) according to Laemmli (1970), followed by fluorography (Skinner and Griswold, 1983).
  • the cloned cDNA complements the aba2-s l mutation.
  • the plant transformation vector pKYLX71-35S 2 was used to clone the cDNA between a 35S promoter having a duplicated activator domain B and a 3 'rbcS region (Maiti et al. 1993).
  • the resulting plasmid, as well as a control plasmid without the cDNA insert, were introduced by triparental conjugation into a disarmed LBA4404 strain of Agrobacterium tumefaciens, as described by Koncz and Schell (1986).
  • the transformation of leaf discs was carried out as described previously (Marion-Poll et al., 1993). Sheets of homozygous aba2-sl mutants from plants cultivated in vitro were used.
  • Agrobacterium by a construct comprising the epoxidase cDNA under the control of the 35S promoter or by a control plasmid without insert.
  • the regenerated transformants growing on a selective medium have been tested for their carotenoid composition.
  • Regenerants transformed by a control plasmid showed an absence of antheroxanthin, neoxanthin and violaxanthin, and an accumulation of zeaxanthin like the unprocessed witness.
  • the regenerants obtained after transformation by the construction containing the cDNA exhibited a composition of wild type carotenoids.
  • the cloned cDNA was able to restore the wild-type phenotype when it is reintroduced into the mutant genetic environment, providing an additional argument for labeling the epoxidase gene.
  • the PCR screening of the YAC CIC bank was carried out on batches of three-dimensional YACS.
  • the oligonucleotides used allowed the amplification of a 230 bp fragment of the EST sequence (T45502).
  • Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature, 295, 432-434.
  • the promoter of the TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector Mol. Gen. Broom. 204, 383-396.
  • Arabidopsis ABA response gene ABA1 Features of a calcium-modulated protein phosphatase. Science, 264, 1448-1452.
  • Violaxanthin is an abscisic acid precursor in water-stressed dark-grown bean leaves. Plant Physiol. 92, 551-559.
  • AAA TTT CCT CCA AAA ACT GCT GCA AAA GAA GAG CGT CAA GCA GTG GGG 2023 Lys Phe Pro Pro Lys Thr Ala Ala Lys Glu Glu Arg Gin Ala Val Gly 650 655 660
  • GAACATGGTA CCTGGATTAC GGATAACGAA GGCAGAAGAT ACCGAGCATC TCCAAACTTC 1860

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Abstract

La présente invention concerne un fragment d'acide nucléique codant pour un enzyme impliqué dans la voie de biosynthèse de l'acide abscissique (ABA) chez les plantes.

Description

"FRAGMENT D'ACIDE NUCLEIQUE CODANT POUR UN ENZYME
IMPLIQUE DANS LA VOIE DE BIOSYNTHESE DE L'ACIDE
ABSCISSIQUE (ABA) CHEZ LES PLANTES"
La présente invention concerne le clonage d'un gène impliqué dans la voie de biosynthèse de l'acide abscissique (ABA) dans les plantes.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un fragment d'acide nucléique isolé codant pour une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de l'ABA.
L'acide abscissique (ABA) est considéré comme une "hormone de stress" végétale parce qu'il est accumulé lorsque les plantes sont soumises à des stress divers tels que sols salins, faibles températures, gel et sécheresse. L'ABA induit des réponses au niveau de la plante hôte qui augmentent la tolérance au stress. La teneur en eau des tissus végétaux et le fonctionnement des stomates sont régulées par l'ABA (Tal et Nevo, 1973). L'ABA commande également les aspects de dormance et de germination des graines (Koornneef et al., 1982, 1989), et favorise une embryogenèse normale et une formation de protéines stockées dans les graines (se reporter à Kermode, 1990) .
Malgré son importance capitale pour les plantes, la physiologie de l'ABA est encore mal comprise. La majorité des informations concernant la physiologie de l'ABA et son rôle a été fournie par l 'analyse de mutants affectés dans la synthèse ou dans la réponse induite par l'ABA (Zeevaart et
Creelman, 1988). Les données moléculaires obtenues jusqu'ici concernent seulement des gènes impliqués dans le signal de transduction de l'ABA. Des mutants au niveau du locus viviparous-1 du maïs (vpl) présentent une sensibilité réduite à l'ABA (Robichaud et al., 1980). Le gène vp_l, clone par étiquetage par un transposon (McCarty et al., 1989), code pour un activateur transcriptionnel VP1. Les mutants d'Arabidopsis insensibles à l'ABA (abi) ont été sélectionnés grâce à leur capacité à germer sur de fortes concentrations d'ABA (Koornneef et al., 1984). Les gènes abil et abi3 ont été isolés par un clonage positionnel encore appelé méthode de marche sur le chromosome (Leung et al., 1994; Meyer et al., 1994; Giraudat et al., 1992). Le gène abil code pour une phosphatase régulée par le calcium, alors qu'abi3 code pour une protéine homologue à VP1 .
Des études biochimiques de mutants déficients en ABA ont permis l'élucidation de la voie de biosynthèse de l'ABA. La biosynthèse de l'ABA chez les plantes supérieures se réalise via une voie de synthèse C40, dénommée "indirecte", voie de synthèse qui dérive des caroténoïdes (Zeevaart et Creelman, 1988; Gage et al., 1989). Une preuve récente indique que le précurseur de type xanthophylle de l'ABA est la 9'-cis-néoxanthine, qui est formée à partir de la trans-violaxanthine (Li et Walton, 1989; Parry et al., 1990). Des mutants présentant des taux d'ABA réduits ont été sélectionnés sur la base de leur dormance de graine réduite ou de leur phénotype de flétrissement. Les mutants viviparous du maïs vp-2. vp-5. vp-7 et vp-9 sont déficients en ABA et sont bloqués de manière simultanée dans les stades précoces de la biosynthèse des caroténoïdes. En conséquence, ils présentent un photo-blanchiment, dû au manque de protection des appareils photosynthétiques par les caroténoïdes (Moore et Smith, 1985; Neil et al., 1986). Le mutant aba d'Arabidopsis thaliana présente une déficience au niveau de l'époxydation de la zéaxanthine (Duckham et al., 1991; Rock et Zeevaart, 1991) qui est considérée comme la première étape de la biosynthèse de l'ABA (Taylor, 1991 ). Plusieurs mutants isolés chez la tomate (flacca et sitiens). la pomme de terre (droopy). l'orge ( n a r 2 §-) ou chez Nicotiana plumbaginifolia (abal) présentent une déficience au niveau de la dernière étape de la voie de synthèse (pour revue voir Taylor, 1991) : l'oxydation de l 'aldéhyde-ABA en ABA (Linforth et al., 1987). Finalement, le mutant wiltv du pois (Duckham et al., 1989) et le mutant notabilis de la tomate (Taylor et al., 1988) sont probablement affectés dans une des autres étapes de la voie de biosynthèse (Taylor, 1991). Malgré un progrès considérable dans l'élucidation des étapes biochimiques de la voie de biosynthèse de l'ABA, aucun gène de cette voie de synthèse n'a pu être clone jusqu'à maintenant.
Le but de la présente invention est l'isolement d'un gène de la voie de biosynthèse de l'ABA. Compte-tenu du rôle physiologique de l'ABA au niveau du développement, de la tolérance des plantes au stress, de la dormance ou de la maturation des graines, un gène de la voie de biosynthèse de l'ABA peut être utilisé pour contrôler ou modifier la synthèse de l'ABA dans des plantes transgéniques.
Comme la productivité des plantes est fortement affectée par les stress environnementaux, l'amélioration génétique d'une tolérance au stress est une des tâches les plus importantes en agriculture. Une surproduction d'ABA, à l'aide d'un promoteur inductible, peut accélérer la réponse d'une plante vis-àvis d'un stress environnemental. Par exemple, la transformation de certaines plantes tropicales avec un gène de la biosynthèse de l'ABA sous la commande d'un promoteur pouvant être induit par le froid peut aboutir à une meilleure adaptation à des climats froids. Une autre application importante de la modification génétique de la biosynthèse de l'ABA est la création de plantes transgéniques ayant une dormance de graine réduite par diminution des niveaux en ABA dans les graines matures. Ceci peut être réalisé par l'introduction d'un gène anti-sens de la biosynthèse de l 'ABA, sous la commande d'un promoteur spécifique aux graines. Dans cette stratégie, il est essentiel d'assurer un stockage protéique et lipidique correct dans les graines, pour garantir un _ bon développement des futures plantes.
La présente invention fournit pour la première fois l'isolement et la caractérisation moléculaire d'un gène de la voie de biosynthèse de l'ABA. Un nouveau mutant déficient en ABA (appelé aba2) a été isolé par une mutagenèse d'insertion induite par un élément transposable Ac dans
Nicotiana plumbaginifolia. L'intérêt essentiel de ce mutant est que le gène de la voie de biosynthèse de l'ABA y est étiqueté car la mutation, cause de déficience en ABA est due à l'insertion de l'élément Ac. L'analyse de l'ADNc correspondant indique que celui-ci code pour une époxydase de la zéaxanthine. Cette époxydase est originale et le contrôle de son expression est déterminant car elle catalyse vraisemblablement les deux premières étapes de la biosynthèse de l 'ABA. Les expériences d'étiquetage de gène, à l'aide de mutation par insertion d'éléments transposables, quelle que soit l'espèce, sont totalement aléatoires et peuvent prendre plusieurs années. En effet, il faut obtenir des transformants primaires (2 à 6 mois selon les espèces), puis obtenir leurs descendants jusqu'à la quatrième génération pour obtenir éventuellement un mutant et le caractériser génétiquement. Le temps de génération varie selon les espèces de 6 semaines chez Arabidopsis à 4 mois chez Nicotiana plumbaginifolia.
Par ailleurs, ces expériences doivent être menées sur une grande quantité de plantes pour espérer isoler un mutant donné. Le génome d'Arabidopsis est estimé à 100 Mégabases, celui de N. plumbaginifolia est estimé à 1000 Mégabases. La séquence transcrite du gène isolé mesure environ 2 Kilobases. Les insertions dans les introns ne donnent en général pas de mutation détectable. On peut donc estimer qu'il serait nécessaire de tester la descendance d'environ 50 000 plantes pour Arabidopsis et 500 000 plantes chez N. plumbaginifolia. ayant subi un événement de transposition. Ceci représente un travail et une surface de serre impossibles à réaliser de façon systématique.
Il était connu un mutant d'Arabidopsis thaliana déficient en ABA mais le gène n'était pas étiqueté de sorte qu'il n'avait jamais pu être isolé.
La méthode dite de clonage positionnel ou encore de marche sur le chromosome ne pouvait permettre d'isoler de façon évidente un tel gène à partir du mutant de biosynthèse de l'ABA chez cette espèce. La marche sur le chromosome nécessite en effet, de disposer de marqueurs (RAPD,
AFLP...) à proximité (environ 200 Kilobases) du gène à cloner et d'une banque de YACS ou de cosmides. Une fois le gène localisé sur un cosmide ou un YAC, il s'agit de transformer le mutant avec des fragments de ce clone jusqu'à trouver le gène correspondant. L'ensemble de ces expériences nécessite plusieurs années de travail. Seulement quelques gènes ont été clones par cette technique à ce jour, alors que plusieurs centaines de mutants ont été identifiés chez Arabidopsis. C'est pourquoi, bien que le mutant déficient en acide abscissique ait été isolé en 1982 chez Arabidopsis le gène correspondant n'a toujours pas été clone par cette technique. La présente invention a donc pour objet un fragment d'acide nucléique isolé codant pour un enzyme impliqué dans la voie de biosynthèse de l'acide abscissique (ABA) chez les plantes.
Plus particulièrement, l'enzyme est une époxydase impliquée dans les deux premières étapes de la voie de biosynthèse de l'ABA. Plus particulièrement encore, l'enzyme présente une activité d'époxy dation de la zéaxanthine.
Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention a pour objet un fragment d'acide nucléique isolé, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence de nucléotides telle que montrée dans l'identificateur de séquence N° 1, ou tout ou partie d'une séquence homologue à celle montrée dans l'identificateur de séquence N° 1, ou tout ou partie d'une séquence complémentaire de ladite séquence de l'identificateur de séquence N° 1 ou d'une séquence homologue.
Par "fragment d'acide nucléique", on entend ici un polymère de nucléotides pouvant être de type ADN ou ARN. Ces termes sont définis dans tous les ouvrages de base de biologie moléculaire. Préférenϋellement, un fragment d'acide nucléique selon l'invention est un fragment d'ADN double brin.
Le terme "partie" désigne un fragment comportant une portion d'au moins 500 de préférence au moins 1000 nucléotides identiques à une portion d'une longueur équivalente de la séquence nucléotidique indiquée dans l'identificateur de séquence (IDS N° 1) ou de son complémentaire.
Le terme "homologue" fait référence à tout acide nucléique présentant une ou plusieurs modification(s) de séquence par rapport à tout ou partie de la séquence montrée dans l'IDS N° 1, et codant pour un enzyme ayant l'activité mentionnée ci-dessus. Ces modifications peuvent être obtenues par mutations, délétion et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotide(s) par rapport à la séquence native. Elles peuvent être introduites notamment pour améliorer l'activité de l'enzyme. Dans ce contexte, on préférera un degré d'homologie de 70 % par rapport à la séquence native, avantageusement de 80 % et, de préférence, de 90 %. L'homme du métier sait où effectuer les modifications afin de ne pas altérer de manière drastique la fonction de l'enzyme et connaît également les techniques permettant d'évaluer si l'homologue généré a l'activité enzymatique, par exemple par insertion en amont d'un gène reporter dont l'expression est facilement détectable ( β-galactosidase, cathéchol-oxygénase, luciférase ou encore un gène conférant la résistance à un antibiotique). Mais tout autre technique conventionnelle peut également être employée.
La séquence de l'IDS N° 1 est une séquence isolée du mutant aba2 décrit ci-après. Il s'agit de la séquence d'ADNc c'est-à-dire dépourvue des introns.
De préférence, le fragment selon l'invention comprend tout ou partie de la séquence codante allant du nuciéotide n° 41 à 2029, de l'IDS/41 N° l , ou son complémentaire, ou d'une séquence homologue ou complémentaire de ladite séquence homologue.
De façon avantageuse, le fragment selon l'invention comporte en outre la séquence leader allant du nuciéotide n° 1 à 40 de l'IDS N° 1.
De même, le fragment selon l'invention comporte de façon avantageuse, la séquence de terminaison allant du nuciéotide 2030 à 2400 de l'IDS N° 1.
De façon classique, il comporte ladite séquence de terminaison augmentée d'une queue poly A à son extrémité 3'.
Selon une variante encore préférée, le fragment selon l'invention comprend la séquence complète de 2400 nucléotides telle que montrée sur l'IDS N° 1, une séquence homologue, une séquence complémentaire, ou une séquence homologue à ladite séquence complémentaire. L'invention inclut également toute séquence capable de s'hybrider dans des conditions stringentes avec une de ces séquences et codant pour une même activité enzymatique impliquée dans la voie de biosynthèse de l'ABA, notamment dans les deux premières étapes.
La présente invention a pour objet un vecteur de clonage caractérisé en ce qu'il comporte un fragment d'acide nucléique selon la présente invention.
Dans un mode de réalisation, un vecteur de clonage comporte une séquence codante complète de 2400 nucléotides telle que représentée dans l'IDS N° 1.
Il doit être bien entendu que l'invention a également pour objet toute séquence d'ADN équivalente, c'est-à-dire qui diffère des séquences mentionnées ci-dessus seulement par une ou plusieurs mutations neutres, c'est-à-dire dont le changement ou la substitution de nucléotides en cause n'affecte pas la séquence primaire de la protéine résultante.
A titre de vecteur de clonage comprenant le fragment, on peut citer les vecteurs comprenant une séquence d'ADN contenant au moins une origine de réplication telle que des plasmides, des cosmides, des bactériophages, des virus etc. On utilisera de préférence toutefois, des plasmides.
De préférence le fragment d'ADN selon l'invention sera associé à une séquence régulatrice appropriée pour sa transcription et sa traduction (ci-après régulon) tels que des promoteurs, y compris des codons start et stop, des "enhancer", des opérateurs. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner ces promoteurs sont bien connus de l'homme du métier. Les fragments d'ADN selon l'invention peuvent être introduits dans des cellules de plantes selon des mécanismes connus tels que par l'intermédiaire du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens. ou par transferts directs de gènes tels que par la méthode d'électroporation. On pourra utiliser avantageusement dans ce cas, mais non obligatoirement, le régulon constitutif du gène correspondant.
Alternativement, les fragments d'ADN selon l'invention peuvent être utilisés pour transformer des micro organismes ou des cellules eukaryotiques pour cloner et produire l'enzyme Epoxydase correspondant.
La présente invention permet enfin d'améliorer la résistance au stress des plantes, en introduisant dans les cellules desdites plantes un fragment d'ADN codant selon l'invention, dans des conditions permettant sa réplication et son expression.
Les procédés de génie génétique qui permettent de bloquer l'expression d'un gène dans une plante, sont connus.
Ainsi, l'expression du gène peut être bloquée par hybridation de l'ARNm transcrit par ledit gène avec un fragment d'ARN complémentaire d'au moins une partie de l'ARNm transcrit par l'un desdits gènes.
Ledit fragment d'ARN complémentaire d'au moins une partie de l'ARNm transcrit par l'un desdits gènes peut être introduit tel quel dans les cellules de plantes à transformer ou sous forme d'un fragment d'ADN placé sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel, de sorte que la transcription dudit fragment d'ADN fournisse une séquence d'ARN complémentaire d'au moins une partie de l'ARNm transcrit par le gène.
On peut introduire dans les cellules d'une plante, un plasmide contenant un fragment d'ADN exogène placé sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel, de sorte que la transcription dudit fragment d'ADN fournisse une séquence d'ARN complémentaire d'au moins une partie de l'ARNm endogène transcrit par le gène. On peut aussi se contenter d'agir sur la régulation du gène endogène de l'enzyme en modifiant les gènes de régulation qui contribuent à son expression de manière à ce qu'ils induisent un blocage de l'expression de l'enzyme endogène du fait de ces modifications.
De façon appropriée, ledit fragment d'ADN exogène code pour une séquence d'ARN complémentaire d'une partie de l'ARNm transcrit par le gène comportant le site de liaison au ribosome et/ou le site d'initiation de la traduction.
Le gène exogène est en général un gène hétérologue, c'est-à-dire qui provient d'une plante, d'une espèce différente de la cellule hôte, le gène codant pour l'enzyme ordinairement non produit par la plante dans le génome de laquelle il est introduit.
Le gène exogène introduit dans le génome de la plante peut aussi être un gène homologue au gène endogène, c'est-à-dire dont l'expression produit l'enzyme ordinairement produite par la plante.
De façon appropriée, ledit fragment d'ADN exogène code pour une séquence d'ARN complémentaire de plus de 80 % de l'ARNm par l'un des gènes précités.
Ledit fragment d'ADN exogène peut être un fragment d'un des gènes fonctionnels codant pour une enzyme précitée, ce fragment étant placé en sens inverse du gène endogène par rapport au promoteur, de sorte que la transcription dudit fragment de gène inversé se produit dans un sens inverse au sens de transcription du gène pour s'hybrider à l'ARNm endogène dudit gène et en bloquer l'expression.
On entend par "gène fonctionnel codant pour l'enzyme" une séquence d'ADN qui peut donc être plus courte ou plus longue que la séquence codante totale, du gène complet de l'enzyme. En particulier, le
"gène fonctionnel" pourra correspondre à une séquence codante dépourvue des introns. On peut aussi pour introduire un fragment d'ARNm ou d'ADN dans la plante, mettre en oeuvre tout d'abord les méthodes de transfert direct de gènes connues de l'homme de l'art, telles que la micro-injection directe dans des cellules d'embryon ou encore la précipitation directe au moyen de EPG ou le bombardement par canon de particules ou par infection avec une souche bactérienne dans laquelle le fragment d'acides nucléiques a été introduit.
On peut aussi infecter la plante par une souche bactérienne, notamment d'Agrobacterium tumefaciens selon une méthode éprouvée (Schell et van Montagu, 1983) ou d'Agrobacterium rhizogenes. notamment pour les espèces récalcitrantes à la transformation (Chilton et al., 1982). La souche bactérienne comportera ledit fragment d'ADN codant pour l'enzyme sous le contrôle d'éléments assurant la transcription en ARNm dudit gène. La souche pourra être transformée par un vecteur dans lequel est inséré le gène codant l'enzyme sous le contrôle d'éléments assurant la transcription dudit gène. Ce gène sera inséré par exemple dans un vecteur binaire tel que pBINI19 (Bevan, 1984) ou pMON 505 (Horsch et Klee, 1986) ou tout autre vecteur binaire dérivé des plasmides Tl et Ri. Il pourra aussi être utilement introduit par recombination homologue dans un plasmide Tl ou Ri désarmé, tel que pGV 3850 (Zambryski et al., 1983) avant la transformation de la plante.
D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre faite en référence aux figures dans lesquelles :
La figure 1 représente l'effet de la dessiccation sur le poids de feuilles détachées de type sauvage et du mutant AA67 (aba2) de Nicotiana Plumbaginifolia. Les feuilles ont été récoltées, séchées doucement sur un papier de type absorbant et pesées toutes les 5 min. dans l'atmosphère desséchante d'une hotte à flux laminaire. La moyenne et l'erreur standard de six expériences indépendantes sont indiquées. La figure 2 représente le profil en caroténoïdes de feuilles de type sauvage et du mutant AA67 (aba2).
La figure 3 représente le schéma de biosynthèse de l'ABA à partir de la zéaxanthine. Adaptée à partir de la voie de synthèse proposée par Li et Walton (1 90) et Parry et al. (1990).
La figure 4 représente l'analyse de Southern de l'ADN de la descendance mutante et sauvage de la plante mutante AA67 (aba 2). portant un élément trAc. L'ADN digéré par EcoRI a été hybride à la sonde A (sur le bord 5' de Ac ). Ro indique le transformant primaire; R j, la plante AA67 parentale; Ml à M3, la descendance mutante R2; NI à N5, les plantes R2 ayant un phénotype sauvage; p indique la proportion de mutants dans la descendance de chaque plante.
La figure 5 représente la carte de restriction partielle du locus muté par l'insertion de Ac. Les positions des sondes correspondant à Ac et à l'ADN adjacent sont indiquées par des barres A, B et C.
La figure 6 représente l'analyse de northern de l'ARN de feuilles de type sauvage et du mutant aba2 hybride avec la sonde C (figure 3B) et avec la sonde βATPase.
La figure 7 représente l'analyse de Southern de l'ADN de plantes révertantes dans la descendance d'une plante mutante homozygote. La digestion a été réalisée par EcoRV et l'hybridation avec la sonde C
(figure 5). Les pistes sont les suivantes : WT, type sauvage; Ri, plante AA67 parentale; R2, une plante R2 hétérozygote; lignes 1 à 5 sont les plantes révertantes de la descendance R3 d'une plante mutante R2 homozygote; M4 et M5, deux plantes mutantes R2 homozygotes.
La figure 8 représente la séquence de l'ADNc complet avec la séquence d'acides aminés déduite pour le plus grand ORF démarrant par une méthionine. Le premier codon d'initiation et le codon stop sont indiqués en caractères gras. La séquence de 8 pb dupliquée dans le locus génomique après l'insertion de Ac est encadrée. La figure 9 représente les trois domaines d'homologie significative de la protéine sont représentés. Le motif de liaison à l'ADP (a), le motif central de fonction inconnue (b) et le motif de liaison au FAD (c). Les positions des acides aminés sont indiquées entre parenthèses. Abréviations: (-) n'importe quel résidu; (w) Y, W, F (acides aminés ayant un groupe aromatique); (x) K, R, H, S, T, Q, N (acides aminés basiques ou hydrophiles); (y) A, I, L, V, M, C (acides aminés petits et hydrophobes); (z) D, E (acides aminés acides); (#) inégalités de la séquence de l'époxydase; (Epox.) époxydase supposée de la zéaxanthine de Nicotiana plumbaginifolia.
La Figure 10 représente les études d'import dans les chloroplastes des produits de traduction du cDNA. La piste 1 est chargée des marqueurs de poids moléculaire, T est chargé avec un microlitre de mélange de traduction, C est chargé avec la réaction d'import (correspondant à 1/4 du total de la réaction de l'import), P est chargé avec la réaction de l'import après traitement protéasique (correspondant à 1/4 de la réaction de l'import).
Les abréviations suivantes sont utilisées ci-après
"ABA" pour acide abscissique ; "ABA-GE" pour ester de l'ABA-glucose ; "pb" pour paires de bases ; "DW" pour poids sec ; "FW" pour poids frais ; "HPLC" pour chromatographie liquide haute-pression ; "nt" pour nuciéotide (s) ; "ORF" pour cadre de lecture ouvert.
1. Isolement d'un mutant déficient en ABA dans une lignée de Nicotiana plumbaginifolia portant un élément transposable Aç.
L'élément transposable du maïs Aç, inséré dans la séquence d'un marqueur de résistance à la kanamycine (Baker et al., 1987) a été introduit via une transformation par Agrobacterium dans N. plumbaginifolia. donnant naissance à des transformants primaires Ro (Marion-Poll et al.,
1993). 1.1. Matériel et méthode
Des plantes transgéniques de Nicotiana plumbaginifolia cv. viviani ont été obtenues par transformation avec la construction pGV 3850 Hygro:pKU 3Ti (Baker et al., 1987) et caractérisées comme précédemment décrit (Marion-Poll et al., 1993).
Le criblage des phénotypes mutants a été réalisé en utilisant des graines stérilisées en surface, étalées sur un milieu BNO3 (Gabard et al., 1987). Pour favoriser une germination uniforme, les graines ont été placées pendant 10 à 20 jours dans une chambre de germination ayant une différence importante au niveau des températures jour/nuit (25V17°C) et des jours courts (8 h/16 h). Les boîtes contenant de jeunes plantules ont été transférées dans une chambre de croissance ( 16 h de jour/8 h de nuit et 25°C) pour permettre une croissance plus rapide. Des plantules âgées de 6 semaines ont été transférées en sol. Les plantules du mutant aba2 ont été incapables de croître dans des conditions de serre standards et ont été mises à pousser sous un film de plastique dans la serre (avec une atmosphère saturée en eau) ou dans une chambre de croissance (90 % d'humidité relative, 16 h de jour/8 h de nuit et de 25V17°C). Toutes les analyses moléculaires et biochimiques ont été réalisées sur des feuilles non-stressées récoltées avant la période de floraison. Le protocole de stress hydrique utilisé a été décrit par Parry et al., ( 1991 ).
1.2. Résultats
La transposition de Aç a été contrôlée dans la descendance (Ri) des transformants primaires en utilisant le marqueur d'excision de la résistance à la kanamycine. Ceci a permis la sélection de 1000 plantes Ri résistantes à la kanamycine qui ont été cultivées jusqu'à maturité, et dont la descendance a été mise à germer in vitro. L'une d'entre elles (AA67) a montré une ségrégation pour un phénotype de germination précoce. Des graines du mutant AA67 fraîchement récoltées ont germé en 4 à 7 jours, alors que les graines de type sauvage ont nécessité 10 à 15 jours. Ce phénotype présentait une ségrégation de type mendélien caractéristique d'une mutation récessive et monogénique. Les jeunes plantules mutantes étaient extrêmement sensibles au stress hydrique probablement parce qu'elles n'assuraient pas la fermeture de leurs stomates. Les feuilles mutantes ont perdu 48% de leur poids frais (FW) en 60 min dans un courant d'air alors que pendant la même période, les feuilles de type sauvage ont perdu seulement 11% de FW (figure 1 ). Ceci a imposé de mettre les plantes à pousser dans 90 à 100 % d'humidité relative. Les jeunes plantes mutantes traitées par une pulvérisation journalière d'ABA à 40 μM pendant deux semaines ont récupéré la vitesse de transpiration du type sauvage lorsque des feuilles détachées ont été testées (données non-présentées). Le greffage de plantes mutantes sur des tiges de tabac de type sauvage a également permis la restauration du phénotype sauvage.
Le mutant AA67 a été croisé avec le mutant aba 1 . précédemment isolé chez N. plumbaginifolia (Bitoun et al, 1989, Rousselin et al., 1992). La complémentation entre ces deux mutants a montré qu'ils étaient mutés sur des gènes différents. En conséquence, le mutant AA67 a été appelé aba2.
2. Relation entre la mutation aba2 et l'insertion de l'élément A_ç
2.1. Matériel et méthode
2.1.1. Analyse de Southern
L'ADN génomique a été extrait à partir de 2 g de matériel foliaire comme décrit par Dellaporta et al. ( 1983), et purifié sur un gradient de chlorure de césium. Dix μg d'ADN ont été digérés par les enzymes de restriction appropriées, séparés sur des gels d'agarose à 0,8 % et transférés sur une membrane de nylon ( Hybond-N, Amersham). L'hybridation des membranes a été réalisée dans des conditions stringentes en utilisant les sondes A (un fragment AccI-HindIII de 0,7 kb de l'extrémité 5' d'Aç), B (un fragment HindIII-AccI de 0,8 kb du bord 3' d'Aç) et C (une sonde d'IPCR décrite ci-dessous), comme représenté sur la figure 5.
2.1.2. Analyse de northern
Les ARN totaux des feuilles ont été extraits selon Verwoerd et al. (1989) et 8μg ont été chargés sur un gel d'agarose à 1,2 % contenant du formaldéhyde (Maniatis et al., 1982). Les hybridations ont été réalisées dans des conditions stringentes un utilisant la sonde C (figure 5) et le fragment d'ADNc EcoRI-SalI de 1,6 kb de la sous-unité β, codée par le noyau, de l'ATPase mitochondriale provenant de N. plumbaginifolia (Boutry et Chua, 1985).
2.1.3. Réaction inverse de polymérisation en chaîne (IPCR)
L'amplification IPCR des séquences adjacentes à Aç. a été réalisée comme décrit par Earp et al. ( 1990). Pour l'amplification des séquences adjacentes 5' et 3', l'ADN génomique a été digéré par Kpnl et ligaturé à l'aide de l'ADN ligase du phage T4. La réaction PCR a été réalisée avec les oligonucléotides #2 (5 'CGATAACGGTCGGTACGGGA-3 ') et #6 ( 5 '-
CCCGTTCGTTTTCGTTACCG3'). L'oligonucleotide #2 s'hybride à 44 pb situées en aval du bord 5' d'Aç. L'oligonucleotide #6 s'hybride à 1 15 pb situées en amont du bord 3' d'Aç. Les réactions de PCR ont utilisé les conditions suivantes : 30 cycles de dénaturation de 45 sec à 94°C, 30 sec d'hybridation à 60°C, 2 min d'extension à 72°C avec une extension finale unique de 10 min à 72°C. Le fragment de 2 kb amplifié a été clone et partiellement séquence par des processus classiques. Ce fragment a été utilisé comme sonde C (figure 5) pour s'hybrider à des transferts northern et Southern et pour cribler une banque d'ADNc.
2.2. Résultats 2.2.1. La mutation aba 2 est due à l'insertion de Aç_.
La mutation responsable de la déficience en ABA a co-ségrégé avec une nouvelle bande s'hybridant à Aç dans l'analyse de Southern de la descendance par autofécondation d'une plante R AA67. Les ADN provenant de la descendance mutante et sauvage ont été analysés par digestion par différentes enzymes et hybrides avec la sonde A (bord 5' de Ac). Après digestion EcoRI, le transformant primaire (Rυ) a présenté une bande unique de 3 kb s'hybridant à Aç, correspondant à la localisation d'Aç au sein de l'ADN-T (figure 4). Dans la plante R i AA67, deux nouvelles insertions d'Aç (signaux d'hybridation à 4,5 et à 2,6 kb) ont été révélées par la même sonde. Comme visualisé sur la figure 4, la bande de 4,5 kb était présente dans chaque plante mutante R2 (Ml à M3) mais seulement dans certaines des plantes soeurs R2 présentant un phénotype sauvage (NI à N5). La bande plus petite de 2,6 kb représentait une seconde insertion d'Ac. non-liée à la mutation responsable de la déficience en ABA.
En tout, 26 plantes présentant un phénotype sauvage et 13 plantes mutantes ont été analysées. Toutes les plantes mutantes ont présenté la bande de 4,5 kb s'hybridant à Aç. Sur 26 plantes normales, 17 avaient la bande de 4,5 kb et présentaient une ségrégation, au niveau de leur descendance, dans laquelle une plante sur quatre avait le phénotype mutant. 8 autres plantes ne présentaient pas la bande de 4,5 kb et ont donné une descendance de type sauvage. Ces résultats sont en accord avec le rapport des hétérozygotes pour la mutation (deux-tiers) (66,6%) attendu au sein de plantes ayant un phénotype de type sauvage. Ces données ont suggéré que la mutation était liée à la bande trAc.
Une des plantes à phénotype sauvage ne présentait pas la bande à 4.5 kb mais ségrégeait le phénotype mutant en descendance. La possibilité d'une excision d'Aç dans cette plante a été étudiée. 2.2.2. La mutation aba2 est instable.
Le mutant hétérozygote ne présentant pas la bande de 4.5 kb pourrait être dû à un événement d'excision imprécise ne restaurant pas la fonctionnalité du gène. Un fragment Kpn I (figure 5) a été clone et séquence après amplification IPCR. Des oligonucléotides ont été synthétisés de chaque côté de l'insertion d'Aç. L'ADN correspondant a été amplifié et séquence chez le sauvage et le mutant hétérozygote. Une empreinte d'excision de 7pb laissée par l'excision d'A c est vraisemblablement responsable du phénotype. En effet, la séquence partielle du fragment Knp I indique que l'insertion d'Aç s'est produite dans une séquence codante. L'excision d'Aç a provoqué l'introduction d'un codon stop TGA en phase dans les 7pb additionnelles et le mutant stable a été appelé aba 2-sl.
La descendance provenant d'une plante mutante, homozygote pour la bande de 4,5 kb s'hybridant à Aç, a été mise à pousser et criblée pour l'apparition d'événements de réversions somatique et germinale, aboutissant à une vitesse de transpiration normale et à une survie dans des conditions de serre. La réversion de la mutation vers le type sauvage devrait être en corrélation avec la restauration d'un fragment d'ADN de la taille de celui du type sauvage. Cinq plantes révertantes (trouvées parmi approximativement 5000 graines) ont été analysées au niveau moléculaire (figure 7). Lorsqu'elles sont hybridées avec la sonde C, les transferts de Southern des plantes mutantes ont présenté un fragment EcoRV de 10 kb, s'hybridant également aux sondes d'Aç . Une bande EcoRV de 2,8 kb a été également révélée et correspond à un fragment génomique situé en aval du point d'insertion d'A . (figure 5). Les plantes de type sauvage ont présenté une bande de 5,5 kb et la bande de 2,8 kb. Les revenants portaient le fragment EcoRV de 10 kb avec des quantités variables du fragment de 5,5 kb trouvé dans le type sauvage. Des niveaux variables de signaux suggèrent que les révertants sont des chimères, dans lesquelles seulement une partie des cellules a récupéré la potentialité à synthétiser l'ABA, complémentant ainsi les secteurs mutés et conférant un phénotype de type sauvage. Le profil à deux bandes trouvé dans les plantes révertantes était similaire à celui observé avec l'ADN provenant de plantes hétérozygotes R2 (ligne R2 sur la figure 7), alors que dans des plantes mutantes homozygotes, seule la bande s'hybridant à Aç était visible, ainsi que la bande de 2,8 kb, située en aval de l'insertion d'Aç (pistes M4 et M5 sur la figure 7). La descendance de certaines plantes révertantes a été semée et évaluée vis-à-vis d'un phénotype à germination précoce. Les révertants 1, 2 et 3 ont présenté une ségrégation de la descendance avec un taux de un quart de germination précoce, ainsi ils ont été considérés comme des événements d'excision d'A_ç_ affectant les cellules L2 engendrant une descendance revenante. Le revertant 4 a donné une descendance homogène à germination précoce et il pourrait être considéré comme un revenant somatique. Pour deux de ces révertants, l'excision d'Aç. a restauré exactement le profil du type sauvage (voir figure 8).
2.2.3. L'insertion d'Aç est dans une séquence codante.
L'analyse de transfert northern réalisée sur l'ARN total de feuilles de type sauvage et mutantes permet d'observer un transcrit unique de 2,5 kb dans les feuilles de type sauvage après hybridation avec la sonde C (figure 5), alors que chez les feuilles mutantes l'ARNm était long de 7, 1 kb. Cette différence de 4,6 kb a suggéré la présence d'un élément Aç. entier dans une séquence codante (figure 6). Ceci a été confirmé par le séquençage partiel du fragment d'IPCR (voir plus loin). Un témoin d'hybridation a été réalisé avec la sous-unité β, codée par le noyau, de l'ATPase mitochondriale de N. plumbaginifolia (Boutry et Chua, 1985).
3. Déficience du mutant aba2 pour l'époxidation de la zéaxanthine.
Comme l'instabilité de la mutation aba2 pouvait donner naissance à des secteurs de réversion, les mesures d'ABA et de caroténoïdes ont été effectuées sur les feuilles du mutant aba2-sl . 3.1. Matériel et méthode
3.1.1. Analyse de l'ABA
L'analyse de l'ABA et de ses métabolites a été réalisée comme décrit par Julliard et al., (1993). Des échantillons de feuilles ont été immédiatement congelés dans l'azote liquide et lyophilisés avant d'être réduits en poudre. Une extraction dans du méthanol non-oxydatif/eau (80:20, v/v), une pré-purification et un fractionnement par chromatographie liquide haute-pression (HPLC) utilisant un gradient d'acide formique/méthanol 0,2 % (v/v) ont été réalisés comme décrit ci- dessus. Une quantification des molécules immunoréactives a été réalisée en utilisant un test d'immunosorbant lié à l'enzyme (ELISA). Ce test ELISA a été légèrement modifié, en utilisant un anticorps monoclonal anti-ABA disponible auprès de Phytoscience (Angers, France), marqué par la péroxydase conjuguée à un anticorps de chèvre dirigé contre des immunoglobulines de souris (Sigma).
3.1.2. Analyse des caroténoïdes
Pour les mesures des chlorophylles et des caroténoïdes, des feuilles ont été congelées dans l'azote liquide et stockées à -80°C. Des échantillons de feuilles (100 mg de poids frais), ont été broyés dans un mortier avec de l'azote liquide et environ 5 mg de NaHC03 et ensuite, ont été extraits par un solvant contenant un mélange d'acétone-méthanol-éther de pétrole (50- 30-20 %). Les extraits ont été centrifugés pendant 5 min à 12 000 g et le surnageant stocké dans de la glace. Le culot a été remis en suspension dans le solvant ci-dessus et centrifugé de nouveau. Ce processus a été répété jusqu'à ce que le surnageant soit incolore. Les surnageants finaux ont été passés à travers des filtres de 0,5 μm et ensuite évaporés. Les extraits secs ont été stockés à -20°C à l'obscurité sous argon. Les pigments de type caroténoïde ont été séparés par une HPLC non-aqueuse en phase inverse comme décrit par Gilmore et Yamamoto (1991). 3.2. Résultats
3.2.1. La teneur en ABA est réduite chez le mutant aba2-sl.
Trois mesures indépendantes (chacune répétée cinq fois) de la teneur en ABA ont été effectuées sur des feuilles non stressées de 3 à 5 plantes. Les feuilles sauvages présentaient de 393 ± 57 à 1263 ± 36 pmol d'ABA par gramme de poids sec, et de 158 ± 11 à 236 + 21 pmol (équivalent ABA) d'ABA-GE par gramme de poids sec. La teneur en ABA du mutant aba 2-sl était comprise entre 23 et 48 % du sauvage, tandis que celle en AGA-GE était indétectable dans deux des expériences et de 139 pmol dans la troisième.
3.2.2. La composition en caroténoïdes est modifiée chez le mutant aba2-sl.
La possibilité que la lésion dans le mutant aba2 affecte la partie C40 de la voie de biosynthèse de l'ABA a été étudiée en analysant le contenu en caroténoïdes des deux types de feuilles sauvages et mutantes. Une des trois mesures indépendantes réalisées est représentée sur la figure 2. Il n'y a aucune différence significative dans la quantité totale de caroténoïdes accumulés dans les deux génotypes (respectivement 3065 ± 160 et 3704 + 900 μg de caroténoïdes totaux par g de FW). Il y avait des différences significatives concernant la zéaxanthine et les produits dérivés. La zéaxanthine apocaroténoïde n'a pas pu être détectée dans les feuilles de type sauvage, mais elle s'est accumulée jusqu'à 7% du contenu total en pigments dans les feuilles du mutant. Au contraire, la violaxanthine, l'anthéraxanthine et la néoxanthine n'ont pu être détectées dans les feuilles du mutant, comparées aux feuilles de type sauvage, où la quantité totale des trois molécules a représenté 4, 1% du contenu total en caroténoïdes. Il peut être noté que les niveaux de β-carotène, de lutéïne et de chlorophylles ont été comparables dans le type sauvage et chez le mutant, suggérant que la photo-protection des appareils photosynthétiques n'est pas affectée par la mutation. Selon les mesures des caroténoïdes, on peut conclure que le mutant aba2-s l présente une déficience au niveau de l 'époxydation de la zéaxanthine qui est de manière conséquente accumulée et aboutit à l'absence des produits suivants dans la biosynthèse de l'ABA (figure 3).
4. Clonage d ΑDNc et séquence nucléotidique
4.1. Matériel et méthode
Construction et criblage d'une banque d'ADNc.
De jeunes plantes, au premier stade foliaire, (âgées de 3 à 4 semaines) ont été récoltées (en incluant les racines) et l'ARN total a été purifié. La fraction poly (A) + a été sélectionnée sur des colonnes oligo dT (Pharmacia). L'ADNc double-brin a été synthétisé en utilisant un kit de synthèse d'ADNc (Promega) et un adaptateur-amorce-Notl-oligo (dT). Après la ligation d'adaptateurs EcoRI (Pharmacia), l'ADNc a été digéré par Notl et clone de manière directionnelle dans le vecteur λgtll Sfi-Not (Promega). Environ 1,5 x 106 recombinants indépendants ont été obtenus après empaquetage phagique (Stratagene) et infection dans la souche LE 392 (Promega). La banque d'ADNc de λgtll a été amplifiée dans la souche RY 1090 d'Escherichia coli. Une hybridation de plaques phagiques, en utilisant la sonde C, a été réalisée selon des procédures standards (Maniatis et al., 1982). Des lavages ont été faits dans des conditions de faible stringence dans SCC 2 x, sarkosyl 0,5 % à 65°C. Les inserts d'ADN des phages recombinants positifs ont été clones de manière subséquente dans - les sites EcoRI-Notl d'un vecteur pBS-SK+ (Stratagene) et dans les sites Eco- Rl-Sacl d'un vecteur pGEM-7Z (Promega). En utilisant ces sous-clones, le séquençage des deux brins a été réalisé après digestion partielle à l'aide d'un kit de délétion à une Exonucléase III (Pharmacia). La séquence nucléotidique des clones délétés a été déterminée avec un dispositif de séquençage d'ADN automatique ABI 373A (Applied Biosystems) en utilisant des amorces à coloration et une enzyme Sequenase. 4.2. Résultats
La sonde C radioactive a été utilisée pour cribler 3 x 105 plaques de la banque λgtll. Un clone positif a montré un insert de 2,4 kb. Ceci était la taille attendue pour le transcrit (figure 6). Après le clonage dans un vecteur pBluescript, et un sous-clonage dans un vecteur pGEM, l'insert a été complètement séquence sur les deux brins. La séquence complète de l'ADNc (longue de 2400 nucléotides) et le plus grand cadre de lecture ouvert (ORF) démarrant par une méthionine sont représentés sur la figure 8. Cet ORF se compose de 1989 pb, correspondant à un polypeptide de 663 résidus d'acides aminés (aa), ayant une masse moléculaire prédite de 72,54 kDa. Un codon stop en phase situé en amont de cet ORF au niveau de la position nucléotidique -20 confirme que l'ORF présenté sur la figure 6A est la région codante entière du gène correspondant. Si l'ATG au niveau du nuciéotide 1 est le codon d'initiation, l'ADNc a une séquence 5 ' non- traduite de 40 pb, une région codante de 1989 pb, et une séquence 3' non- traduite de 310 pb, suivie par une queue poly(A) (longue de 58 pb). La séquence 3' non-traduite contient trois signaux supposés d'addition de poly(A) (ATAAA) au niveau des nucléotides 2015, 2109 et 2276 (Joshi, 1987).
Comme indiqué par un séquençage partiel du fragment Kpnl d'IPCR clone, l'insertion d'Ac a lieu dans l'ORF au niveau du nuciéotide 434 (aa 145). Les 8 pb dupliquées après l'insertion d'Ac dans l'ADN génomique sont encadrées sur la figure 8.
4.3. Recherche d'homologie de séquence.
Les séquences des nucléotides et des acides aminés ont été utilisées pour vérifier les homologies possibles avec des séquences dans des banques de données. Les recherches dans les banques de données (National Center for Biotechnology Information utilisant the BLAST network service) ont révélé trois segments de la séquence d'acides aminés ayant une homologie significative avec des protéines connues de Pseudomonas sp. ou d' E. coli (figure 9). Les meilleurs ajustements ont été obtenus avec nahG (salicylate 1-hydroxylase, You et al., 1991 ); ubiH (2-octaprényl-6-méthoxyphénol monooxygénase, Nakahigashi et al., 1992), visA (ferrochélatase, Nakahigashi et al., 1992), pheA (phénol m on oo xy g é n as e , Nu r k e t a l . , 1 99 1 ) ; p c p B (pentachlorophénol-4-monooxygénase, Orser et al., 1993) et PHBH (p- hydroxybenzoate hydroxylase, Weijer et al., 1982). Toutes ces séquences protéiques partagent une fonction commune, qui est une hydroxylation ou une oxydation d'un cycle aromatique. Ceci est en accord avec l'activité supposée de la protéine codée par l'ADNc clone, c'est-à-dire l'époxydation de la zéaxanthine, un substrat contenant un cycle aromatique. Deuxièmement, ces enzymes utilisent un cofacteur commun, soit le FAD soit le NAD(P). Ainsi, un site de liaison à l'ADP est localisé au niveau des acides aminés 81 à 109, qui correspondent à la séquence consensus (empreinte) impliquée dans la liaison à l'ADP (Wierrenga et al., 1986). Ce motif riche en glycines, commun aux enzymes se liant au cofacteur, permet de prédire si une séquence d'acides aminés particulière peut se replier en βαβ avec des propriétés de liaison à la partie ADP de la NAD(P) ou du FAD. Ainsi, un site supposé de liaison au FAD a été trouvé. La séquence d'acides aminés MQHGRLFLAGD est impliquée dans la liaison au FAD de PHBH (Wijnands et al., 1986). Les résidus d'acides aminés 359 à 372 montrent 9 résidus identiques avec cette séquence, suffisamment pour garantir la conformation qui est nécessaire à la liaison au FAD. Quelques résidus au-delà de ce segment, les acides aminés 379 et 382 de notre époxydase supposée sont présents dans les séquences de PHBH et de la salicylate- 1-hydroxylase et ont été décrits comme ayant une importance structurale et fonctionnelle dans ces enzymes (You et al., 1991 ). Un troisième fragment d'homologie est compris entre les résidus d'acides aminés 230 et 249 de l'ORF. Ce segment d'homologie n'a pas encore été décrit jusqu'à maintenant, mais est présent dans toutes les séquences protéiques présentant une certaine homologie avec la séquence en question. 5. La protéine ABA2 est importée dans les chloroplastes
Les recherches sur les bases de données ont indiqué l'existence d'une extension à l'extrémité amino terminale de l'ADNc par rapport aux protéines de Pseudomonas et d'E. coli. L'extension à l'extrémité amino terminale était comprise entre les résidus d'acides aminés 1 et 50. Le contenu en acides aminés dans cette région de la séquence a révélé un enrichissement en serine et en thréonine. Ces acides aminés constituent respectivement 18 et 8% du contenu total en acides aminés de ce peptide, alors qu'ils sont beaucoup moins abondants dans la séquence complète de 663 acides aminés (6,8 et 5% respectivement). Cette caractéristique a été décrite dans des peptides connus d'adressage au chloroplaste, responsables de l'import de protéines nucléaires (Von Heijne et al., 1989).
5.1. Matériel et méthode.
L'ADNc clone dans un vecteur pBS-SK+ était traduit à partir du promoteur de l'ARN polymérase de T3. La construction PsaD, codant pour une protéine du photosystème I localisée dans les chloroplastes (Kjaruff et Okkels, 1993), a été utilisée comme témoin positif pour les réactions d'import. La transcription/traduction in vitro a été réalisée avec l μg de chaque plasmide et avec de la méthionine marquée au S35 en utilisant le Système de Lysats de Réticulocytes couplés au TNT (Promega Corporation, Madison, WI). Des chloroplastes ont été isolés à partir de feuilles provenant de plantes de pois âgées de deux semaines selon Cline et al. ( 1985). Les tests d'import ont été réalisés comme décrit par Hoff et al. ( 1995). Les échantillons ont été analysés sur des gels de polyacrylamide- SDS (12 % pour la réaction d'import de PsaD et 5% pour notre construction) selon Laemmli (1970), suivis par une fluorographie (Skinner et Griswold, 1983).
5.2. Résultats
Afin d'étudier la localisation chloroplastique de la zéaxanthine époxydase, on a réalisé la transcription et traduction in vitro du clone d'ADNc correspondant. Les produits de traduction marqués ont été incubés avec des chloroplastes purifiés de pois. Une partie aliquote de la réaction a été traitée avec de la thermolysine pour dégrader les protéines situées à la surface du chloroplaste, ainsi seules les protéines situées à l'intérieur des organites étaient protégées. La Figure 10 représente la fluorographie du gel de polyacrylamide-SDS chargé avec les réactions d'import. PsaD, une protéine de 28 kDa du photosystème I, utilisée comme témoin positif, a été importée et maturée (20kDa) comme attendu (données non présentées). La protéine époxydase (72,5 kDa) a été également importée et maturée en une protéine mature de 69 kDa, en accord avec l'analyse des données de séquences.
6. L'ADNc clone complémente la mutation aba2-s l .
6.1. Matériel et méthode.
Le vecteur de transformation végétale pKYLX71-35S2 a été utilisé pour cloner l'ADNc entre un promoteur 35S ayant un domaine activateur dupliqué B et une région rbcS 3' (Maiti et al. 1993). Le plasmide résultant, ainsi qu'un plasmide témoin sans l'insert d'ADNc, ont été introduits par conjuguaison triparentale dans une souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens désarmée, comme décrit par Koncz et Schell ( 1986). La transformation de disques de feuilles a été réalisée comme décrit précédemment (Marion-Poll et al., 1993 ). Des feuilles de mutants homozygotes aba2-sl de plantes cultivées in vitro ont été utilisées.
6.2. Résultats
Des disques de feuilles de plantes aba2-s l ont été transformés via
Agrobacterium par une construction comportant l'ADNc de l'époxydase sous contrôle du promoteur 35S ou par un plasmide témoin sans insert. Les transformants régénérés poussant sur un milieu sélectif ont été testés pour leur composition en caroténoïdes. Les régénérants transformés par un plasmide témoin ont montré une absence d'anthéraxanthine, de néoxanthine et de violaxanthine, et une accumulation de zéaxanthine comme le témoin non-transformé. Les régénérants obtenus après transformation par la construction contenant l'ADNc ont présenté une composition en caroténoïdes de type sauvage. Ainsi l'ADNc clone a été capable de rétablir le phénotype sauvage lorsqu'il est réintroduit dans l'environnement génétique mutant, fournissant un argument supplémentaire pour l'étiquetage du gène de l'époxydase.
7. Cartographie du locus ABA2 dans Arabidopsis.
7.1. Matériel et méthode.
Cartographie de l'EST d'Arabidopsis.
Le criblage par PCR de la banque YAC CIC a été effectué sur des lots de YACS tridimensionnels. Les oligonucléotides utilisés permettaient l'amplification d'un fragment de 230 pb de la séquence EST (T45502).
7.2. Résultats.
La comparaison de la séquence d'ADNc avec des séquences EST
(Expressed Séquence Tags) d'une base de données (dbEST) a abouti à l'identification d'une EST homologue chez Arabidopsis thaliana (numéro de référence T45502). Cette séquence EST est longue de 480 pb et la séquence d'acides aminés déduite entre la paire de bases 4 et la paire de bases 210 montre 71 % d'identité (81 % de similarité) avec la séquence d'acides aminés de l'ADNc de N. plumbaginifolia. Des oligonucléotides, permettant d'amplifier un fragment de 230 pb dans l'ADNc de A. thaliana et un fragment génomique de 416 pb, ont été utilisés pour cribler la banque YAC CIC d'Arabidopsis (Creusot et al., en préparation). Un clone YAC unique a été identifié qui est situé en bas du chromosome cinq et fait partie d'un contig contenant le marqueur RFLP ve028, situé à la position 134.1 sur la carte (Lister, 1995). Cette localisation est en parfaite corrélation avec la position du locus aba sur la carte d'Arabidopsis (Koornneef et al., 1982). Ce résultat, sans être une preuve définitive, fournit un argument supplémentaire pour dire que le locus ABA2 de N. plumbaginifolia est l'homologue du locus ABA d'Arabidopsis. BIBLIOGRAPHIE
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LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INRA
(B) RUE: 147 RUE DE L'UNIVERSITE
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75338
(ii) TITRE DE L' INVENTION: CLONAGE DU GENE DE L'ACIDE ABSCISSIQUE (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2400 paires de bases
(B) TYPE: nuciéotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (iv) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: NICOTIANA PLUMBAGINIFOLIA
(B) SOUCHE: CV. viviani
(D) STADE DE DEVELOPPEMENT: plantule (F) TYPE DE TISSU: plante entière
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 41..2032
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
TGAAGACTAC ACTCTTTCTT GAACTTGGGT TCAAGTAAAG ATG TAT TCA ACT GTG 55
Met Tyr Ser Thr Val 1 5
TTT TAC ACT TCA GTT CAT CCA TCC ACT TCA GCT TTT TCA AGA AAG CAG 103 Phe Tyr Thr Ser Val His Pro Ser Thr Ser Ala Phe Ser Arg Lys Gin 10 15 . . 20
CTG CCT TTA TTG ATC TCT AAG GAT TTT CCA ACA GAG TTG TAT CAT TCT 151 Leu Pro Leu Leu Ile Ser Lys Asp Phe Pro Thr Glu Leu Tyr His Ser 25 30 35
TTA CCA TGC AGT AGA AGC TTG GAA AAT GGT CAA ATC AAG AAA GTC AAA 199 Leu Pro Cys Ser Arg Ser Leu Glu Asn Gly Gin Ile Lys Lys Val Lys 40 45 50
GGT GTA GTA AAA GCC ACA ATA GCT GAA GCT CCA GCA ACT ATT CCT CCA 247 Gly Val Val Lys Ala Thr Ile Ala Glu Ala Pro Ala Thr Ile Pro Pro 55 60 65 ACT GAT TTA AAA AAG GTA CCA CAG AAG AAG CTG AAA GTA TTA GTA GCA 295 Thr Asp Leu Lys Lys Val Pro Gin Lys Lys Leu Lys Val Leu Val Ala 70 75 80 85
GGT GGT GGG ATT GGA GGA TTA GTT TTT GCA TTG GCG GCA AAG AAA AGG 343 Gly Gly Gly Ile Gly Gly Leu Val Phe Ala Leu Ala Ala Lys Lys Arg 90 95 100
GGA TTT GAT GTG TTG GTA TTT GAG AGA GAT TTA AGT GCT ATT AGA GGA 391 Gly Phe Asp Val Leu Val Phe Glu Arg Asp Leu Ser Ala Ile Arg Gly 105 110 115
GAA GGA CAA TAT AGA GGA CCA ATT CAG ATA CAA AGC AAT GCA TTG GCT 439 Glu Gly Gin Tyr Arg Gly Pro Ile Gin Ile Gin Ser Asn Ala Leu Ala 120 125 130
GCT TTA GAA GCA ATT GAT ATG GAT GTT GCT GAA GAC ATA ATG AAT GCT 487 Ala Leu Glu Ala Ile Asp Met Asp Val Ala Glu Asp Ile Met Asn Ala 135 140 145
GGT TGT ATC ACT GGT CAA AGG ATT AAT GGT TTG GTT GAT GGT GTT TCT 535 Gly Cys Ile Thr Gly Gin Arg Ile Asn Gly Leu Val Asp Gly Val Ser 150 155 160 165
GGT AAC TGG TAT TGC AAG TTT GAT ACG TTT ACT CCA GCC GTG GAA CGC 583 Gly Asn Trp Tyr Cys Lys Phe Asp Thr Phe Thr Pro Ala Val Glu Arg 170 175 180
GGA CTT CCT GTG ACA AGA GTC ATC AGC CGC ATG ACT TTG CAA CAG AAC 631 Gly Leu Pro Val Thr Arg Val Ile Ser Arg Met Thr Leu Gin Gin Asn 185 190 195
CTT GCA CGT GCC GTC GGG GAA GAT ATC ATT ATG AAT GAA AGT AAT GTA 679 Leu Ala Arg Ala Val Gly Glu Asp Ile Ile Met Asn Glu Ser Asn Val 200 205 210
GTG AAC TTT GAG GAT GAT GGT GAA AAG GTT ACT GTG ACT CTT GAG GAT 727 Val Asn Phe Glu Asp Asp Gly Glu Lys Val Thr Val Thr Leu Glu Asp 215 220 225
GGA CAG CAA TAT ACA GGT GAT CTT CTG GTT GGT GCT GAT GGC ATA AGG 775 Gly Gin Gin Tyr Thr Gly Asp Leu Leu Val Gly Ala Asp Gly Ile Arg 230 235 240 245
TCT AAG GTA CGG ACT AAT TTG TTC GGA CCC AGT GAT GTA ACT TAC TCT 823 Ser Lys Val Arg Thr Asn Leu Phe Gly Pro Ser Asp Val Thr Tyr Ser 250 255 260
GGC TAC ACT TGT TAC ACT GGA ATT GCA GAT TTT GTT CCT GCT GAT ATT 871 Gly Tyr Thr Cys Tyr Thr Gly Ile Ala Asp Phe Val Pro Ala Asp Ile 265 270 275
GAG ACA GTT GGG TAC CGA GTC TTT TTG GGC CAC AAA CAG TAC TTT GTT 919 Glu Thr Val Gly Tyr Arg Val Phe Leu Gly His Lys Gin Tyr Phe Val 280 285 290
TCT TCA GAT GTG GGT GGA GGC AAG ATG CAG TGG TAT GCA TTT CAC AAT 967 Ser Ser Asp Val Gly Gly Gly Lys Met Gin Trp Tyr Ala Phe His Asn 295 300 305
GAA CCA GCT GGC GGT GTG GAT GAT CCA AAC GGT AAA AAG GCA AGA TTG 1015 Glu Pro Ala Gly Gly Val Asp Asp Pro Asn Gly Lys Lys Ala Arg Leu 310 315 320 325 CTT AAA ATA TTT GAG GGG TGG TGT GAC AAT GTT ATA GAC CTA TTA GTA 1063 Leu Lys Ile Phe Glu Gly Trp Cys Asp Asn Val Ile Asp Leu Leu Val 330 335 340
GCC ACA GAT GAA GAT GCA ATT CTT CGA CGT GAC ATC TAT GAT AGA CCG 1111 Ala Thr Asp Glu Asp Ala Ile Leu Arg Arg Asp Ile Tyr Asp Arg Pro 345 350 355
CCA ACA TTT AGT TGG GGA AAA GGT CGT GTT ACA TTG CTT GGG GAC TCT 1159 Pro Thr Phe Ser Trp Gly Lys Gly Arg Val Thr Leu Leu Gly Asp Ser 360 365 370
GTC CAT GCT ATG CAG CCT AAT TTG GGT CAA GGG GGA TGC ATG GCC ATA 1207 Val His Ala Met Gin Pro Asn Leu Gly Gin Gly Gly Cys Met Ala Ile 375 380 385
GAG GAT AGC TAT CAA CTA GCA CTG GAA CTT GAT AAA GCA TTG AGC CGA 1255 Glu Asp Ser Tyr Gin Leu Ala Leu Glu Leu Asp Lys Ala Leu Ser Arg 390 395 400 405
AGC GCC GAG TCA GGA ACC CCT GTG GAT ATC ATC TCA TCT TTA AGG AGC _ 1303 Ser Ala Glu Ser Gly Thr Pro Val Asp Ile Ile Ser Ser Leu Arg Ser 410 415 420
TAT GAA AGT TCT AGA AAA CTT CGA GTT GGA GTT ATC CAT GGA CTG GCT 1351 Tyr Glu Ser Ser Arg Lys Leu Arg Val Gly Val Ile His Gly Leu Ala 425 430 435
AGA ATG GCT GCA ATC ATG GCA TCA ACT TAC AAG GCT TAT CTT GGT GTC 1399 Arg Met Ala Ala Ile Met Ala Ser Thr Tyr Lys Ala Tyr Leu Gly Val 440 445 450
GGA CTT GGT CCA TTA TCA TTT TTG ACC AAG TTT AGG ATA CCA CAT CCT 1447 Gly Leu Gly Pro Leu Ser Phe Leu Thr Lys Phe Arg Ile Pro His Pro 455 460 465
GGA AGA GTT GGT GGA AGA TTT TTT ATT GAC TTG GGA ATG CCG CTT ATG 1495 Gly Arg Val Gly Gly Arg Phe Phe Ile Asp Leu Gly Met Pro Leu Met 470 475 480 485
TTA AGC TGG GTT CTA GGA GGC AAC GGG GAA AAG CTT GAA GGC AGA ATA 1543 Leu Ser Trp Val Leu Gly Gly Asn Gly Glu Lys Leu Glu Gly Arg Ile 490 495 500
CAA CAT TGC AGG CTA TCT GAG AAA GCA AAT GAC CAA TTG AGA AAT TGG 1591 Gin His Cys Arg Leu Ser Glu Lys Ala Asn Asp Gin Leu Arg Asn Trp 505 510 515
TTT GAA GAT GAT GAT GCT TTA GAG CGT GCT ACT GAT GCA GAG TGG CTA 1639 Phe Glu Asp Asp Asp Ala Leu Glu Arg Ala Thr Asp Ala Glu Trp Leu 520 525 530
TTG CTT CCT GCC GGG AAT AGC AAT GCT GCT TTA GAA ACT CTC GTT TTA 1687 Leu Leu Pro Ala Gly Asn Ser Asn Ala Ala Leu Glu Thr Leu Val Leu 535 540 545
AGC AGA GAT GAG AAC ATG CCT TGC AAT ATT GGG TCT GTC TCA CAT GCA 1735 Ser Arg Asp Glu Asn Met Pro Cys Asn Ile Gly Ser Val Ser His Ala 550 555 560 565
AAC ATT CCT GGA AAA TCA GTT GTT ATA CCT TTG CCT CAG GTG TCC GAA 1783 Asn Ile Pro Gly Lys Ser Val Val Ile Pro Leu Pro Gin Val Ser Glu 570 575 580 ATG CAC GCC CGG ATA TCC TAC AAA GGT GGA GCA TTT TTT GTA ACT GAT 1831 Met His Ala Arg Ile Ser Tyr Lys Gly Gly Ala Phe Phe Val Thr Asp 585 590 595
TTA CGA AGT GAA CAT GGT ACC TGG ATT ACG GAT AAC GAA GGC AGA AGA 1879 Leu Arg Ser Glu His Gly Thr Trp Ile Thr Asp Asn Glu Gly Arg Arg 600 605 610
TAC CGA GCA TCT CCA AAC TTC CCT ACT CGC TTT CAT CCA TCA GAT ATT 1927 Tyr Arg Ala Ser Pro Asn Phe Pro Thr Arg Phe His Pro Ser Asp Ile 615 620 625
ATT GAA TTT GGT TCT GAT AAA AAG GCA GCA TTT CGC GTA AAG GTA ATG 1975 Ile Glu Phe Gly Ser Asp Lys Lys Ala Ala Phe Arg Val Lys Val Met 630 635 640 645
AAA TTT CCT CCA AAA ACT GCT GCA AAA GAA GAG CGT CAA GCA GTG GGG 2023 Lys Phe Pro Pro Lys Thr Ala Ala Lys Glu Glu Arg Gin Ala Val Gly 650 655 660
GCA GCT TGA AAATTCGGAA GTTTGGCCTG ATATAAACGG GGAAATTGTA __ 2072
Ala Ala *
CAGCATTTTT ATAGCAACAG CACAAACTGA GCCATTTAAA TCAGCTAATT TTGTATACTG 2132
TAGGTTTAGA AGATTGATAA ACAGAACAAC AATGCAAGAA ACTACAAGGG TTATATAGCT 2192
TCCCCCTATA GAAACCTGGA GAAAGTTATG GTACATTGGT CCTTTCTACC ATTGCTAAAA 2252
TATAGTAGTA GTTTTGTATG TATACCCAAT TACAGGGGCC ATAATGTTAA GTTGTCTTCC 2312
TTCATAAATT ACGGCCATAT ATTTTCTTAT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2372
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA 2400
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1989 paires de bases
(B) TYPE: nuciéotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (iv) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: NICOTIANA PLUMBAGINIFOLIA
(B) SOUCHE: CV. viviani
(D) STADE DE DEVELOPPEMENT: plantule (F) TYPE DE TISSU: plante entière
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
ATGTATTCAA CTGTGTTTTA CACTTCAGTT CATCCATCCA CTTCAGCTTT TTCAAGAAAG 60
CAGCTGCCTT TATTGATCTC TAAGGATTTT CCAACAGAGT TGTATCATTC TTTACCATGC 120
AGTAGAAGCT TGGAAAATGG TCAAATCAAG AAAGTCAAAG GTGTAGTAAA AGCCACAATA 180
GCTGAAGCTC CAGCAACTAT TCCTCCAACT GATTTAAAAA AGGTACCACA GAAGAAGCTG 240 AAAGTATTAG TAGCAGGTGG TGGGATTGGA GGATTAGTTT TTGCATTGGC GGCAAAGAAA 300
AGGGGATTTG ATGTGTTGGT ATTTGAGAGA GATTTAAGTG CTATTAGAGG AGAAGGACAA 360
TATAGAGGAC CAATTCAGAT ACAAAGCAAT GCATTGGCTG CTTTAGAAGC AATTGATATG 420
GATGTTGCTG AAGACATAAT GAATGCTGGT TGTATCACTG GTCAAAGGAT TAATGGTTTG 480
GTTGATGGTG TTTCTGGTAA CTGGTATTGC AAGTTTGATA CGTTTACTCC AGCCGTGGAA 540
CGCGGACTTC CTGTGACAAG AGTCATCAGC CGCATGACTT TGCAACAGAA CCTTGCACGT 600
GCCGTCGGGG AAGATATCAT TATGAATGAA AGTAATGTAG TGAACTTTGA GGATGATGGT 660
GAAAAGGTTA CTGTGACTCT TGAGGATGGA CAGCAATATA CAGGTGATCT TCTGGTTGGT 720
GCTGATGGCA TAAGGTCTAA GGTACGGACT AATTTGTTCG GACCCAGTGA TGTAACTTAC 780
TCTGGCTACA CTTGTTACAC TGGAATTGCA GATTTTGTTC CTGCTGATAT TGAGACAGTT 840
GGGTACCGAG TCTTTTTGGG CCACAAACAG TACTTTGTTT CTTCAGATGT GGGTGGAGGC 900
AAGATGCAGT GGTATGCATT TCACAATGAA CCAGCTGGCG GTGTGGATGA TCCAAACGGT 960
AAAAAGGCAA GATTGCTTAA AATATTTGAG GGGTGGTGTG ACAATGTTAT AGACCTATTA 1020
GTAGCCACAG ATGAAGATGC AATTCTTCGA CGTGACATCT ATGATAGACC GCCAACATTT 1080
AGTTGGGGAA AAGGTCGTGT TACATTGCTT GGGGACTCTG TCCATGCTAT GCAGCCTAAT 1140
TTGGGTCAAG GGGGATGCAT GGCCATAGAG GATAGCTATC AACTAGCACT GGAACTTGAT 1200
AAAGCATTGA GCCGAAGCGC CGAGTCAGGA ACCCCTGTGG ATATCATCTC ATCTTTAAGG 1260
AGCTATGAAA GTTCTAGAAA ACTTCGAGTT GGAGTTATCC ATGGACTGGC TAGAATGGCT 1320
GCAATCATGG CATCAACTTA CAAGGCTTAT CTTGGTGTCG GACTTGGTCC ATTATCATTT 1380
TTGACCAAGT TTAGGATACC ACATCCTGGA AGAGTTGGTG GAAGATTTTT TATTGACTTG 1440
GGAATGCCGC TTATGTTAAG CTGGGTTCTA GGAGGCAACG GGGAAAAGCT TGAAGGCAGA 1500
ATACAACATT GCAGGCTATC TGAGAAAGCA AATGACCAAT TGAGAAATTG GTTTGAAGAT 1560
GATGATGCTT TAGAGCGTGC TACTGATGCA GAGTGGCTAT TGCTTCCTGC CGGGAATAGC 1620
AATGCTGCTT TAGAAACTCT CGTTTTAAGC AGAGATGAGA ACATGCCTTG CAATATTGGG 1680
TCTGTCTCAC ATGCAAACAT TCCTGGAAAA TCAGTTGTTA TACCTTTGCC TCAGGTGTCC 1740
GAAATGCACG CCCGGATATC CTACAAAGGT GGAGCATTTT TTGTAACTGA TTTACGAAGT 1800
GAACATGGTA CCTGGATTAC GGATAACGAA GGCAGAAGAT ACCGAGCATC TCCAAACTTC 1860
CCTACTCGCT TTCATCCATC AGATATTATT GAATTTGGTT CTGATAAAAA GGCAGCATTT 1920
CGCGTAAAGG TAATGAAATT TCCTCCAAAA ACTGCTGCAA AAGAAGAGCG TCAAGCAGTG 1980
GGGGCAGCT 1989

Claims

REVENDICATIONS
1. Fragment d'acide nucléique codant pour un enzyme impliqué dans la voie de biosynthèse de l'acide abscissique (ABA) chez les plantes.
2. Fragment selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'enzyme est une époxydase impliquée dans les deux premières étapes de la voie de biosynthèse de l'ABA.
3. Fragment selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que l'enzyme présente une activité d'époxydation de la zéoxanthine.
4. Fragment selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est isolé de Nicotiana Plumbaginifolia.
5. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence de nucléotides telle que montrée dans l'identificateur de séquence (IDS) N" 1.
6. Fragment selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence codante allant du nuciéotide n° 41 à 2029 de l'IDS N° 1.
7. Fragment selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte en outre la séquence leader allant du nuciéotide n° 1 à 40 de l'IDS N° 1.
8. Fragment selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'il comporte en outre la séquence de terminaison allant du nuciéotide 2030 à 2400 de l'IDS N" 1.
9. Fragment selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comporte ladite séquence de terminaison augmentée d'une queue poly A à son extrémité 3'.
10. Fragment selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence complète de 2400 nucléotides telle que montrée sur l'IDS N° 1.
11. Fragment selon l'une des revendications 4 à 9 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence complémentaire, homologue ou complémentaire de l'homologue de celle de la ou desdites séquence(s) de l'IDS N° 1.
12. Fragment d'acide nucléique capable de s'hybrider dans des conditions faiblement stringentes avec un fragment selon l'une des revendications 1 à 11 et codant pour unedite enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de l'ABA.
PCT/FR1996/000820 1995-05-31 1996-05-31 Fragment d'acide nucleique codant pour un enzyme implique dans la voie de biosynthese de l'acide abscissique (aba) chez les plantes WO1996038566A1 (fr)

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FR95/06466 1995-05-31

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