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WO1996035791A1 - Sequence d'adn codant pour un ribozyme a titre de medicament, et compositions pharmaceutiques la contenant - Google Patents

Sequence d'adn codant pour un ribozyme a titre de medicament, et compositions pharmaceutiques la contenant Download PDF

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WO1996035791A1
WO1996035791A1 PCT/FR1996/000691 FR9600691W WO9635791A1 WO 1996035791 A1 WO1996035791 A1 WO 1996035791A1 FR 9600691 W FR9600691 W FR 9600691W WO 9635791 A1 WO9635791 A1 WO 9635791A1
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WO
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nucleic acid
sequence
acid sequence
seq
cells
Prior art date
Application number
PCT/FR1996/000691
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English (en)
Inventor
Jean-Paul Escande
Salman Al-Mahmood
Claire Lugassy
Original Assignee
Sanofi
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Publication date
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Priority to AU58252/96A priority Critical patent/AU5825296A/en
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/121—Hammerhead

Definitions

  • the present invention relates to the medical field. More particularly, the invention relates to a nucleic acid sequence as a therapeutically active substance. The invention also relates to pharmaceutical compositions containing said sequence.
  • the phosphatase involved in the reaction was found to be of the Serine Threonine protein phosphatase type. Its molecular weight is 190 kDa. The inhibition of this enzyme results from phosphorylation at the level of tyrosine.
  • IRS-1 insulin receptor 1
  • oligonucleotide (SEQ ID N * 1): 5 '- TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTC TGGCCTAG-3' has remarkable anti-tumor activity.
  • the present invention therefore relates to a nucleic acid sequence chosen from:
  • phosphodiester bonds of sequences (a), (b) or (c) are protected.
  • This protection is generally carried out chemically, according to conventional methods well known to those skilled in the art.
  • the phosphodiester bonds can be protected by a thiol or amino function or even by a phenyl group.
  • the 5'- and / or 3'- ends of the above sequences are protected, for example by using the technique indicated above to protect the phosphodiester bonds.
  • the nucleic acid sequences (a), (b) and (c) can be synthesized according to conventional techniques well known to those skilled in the art, for example using a DNA synthesizer marketed by the Company Biosearch Inc., USA.
  • the nucleic acid sequences according to the invention block the multiplication of cells, in particular tumor cells in vivo. Although their mechanism of action is not fully understood, it is believed that they inhibit the adhesion of cancer cells to the extracellular matrix.
  • nucleic acid sequence (a) is an antisense oligonucleotide directed against the gene for the 190 kDa protein mentioned above, we can then hypothesize that the protein 190 kDa represents the crossroads where the integrin-dependent signaling pathways (membrane proteins responsible for the adhesion of cells to the extracellular matrix) and those involving the response to hormones and growth factors meet.
  • the nucleic acid sequences according to the invention are therefore indicated as an anti-cell multiplication agent, in particular as an anti-tumor agent. They are also indicated as an anti-angiogenesis agent.
  • the invention therefore also relates to a method for inhibiting the multiplication of tumor cells, especially human melanoma cells, which comprises administering to patients in need thereof an effective amount of the nucleic acid sequence (a), (b ) or (c).
  • the invention also relates to a method of treating cancer, in particular melanoma, which comprises administering to patients in need thereof an effective amount of the nucleic acid sequence (a), (b) or (c). Hair regrowth has also been observed in nude mice treated with the nucleic acid sequences according to the invention. These are therefore also indicated in the treatment of baldness and alopecia.
  • the invention therefore also relates to a method of treating alopecia which consists in administering to patients who need it an effective amount of the nucleic acid sequence (a), (b) or (c).
  • the invention also relates to a laboratory tool consisting of a nucleic acid sequence as defined above, in particular for the in vitro study of signaling pathways involving the 190 kDa protein (for example on cells, tumor or not, transfected with one of the sequences (a), (b) or (c)), but also for the in vivo study of signaling pathways involving the 190 kDa protein in a large number of physiological and pathological phenomena (such as carcinogenesis), mainly from the kinase / phosphatase ratio.
  • the nucleic acid sequences according to the invention are in particular active principles of pharmaceutical compositions, the toxicity of which is compatible with their use as medicaments.
  • the present invention relates to pharmaceutical compositions containing, as active principle, a nucleic acid sequence as defined above, mixed with any pharmaceutically acceptable excipient.
  • compositions are more particularly produced so that they can be administered by the subcutaneous, intramuscular, intravenous or transdermal route.
  • aqueous suspensions, isotonic saline solutions or sterile injectable solutions which contain pharmacologically compatible dispersing agents and / or wetting agents, for example propylene glycol or butylene glycol.
  • the usual unit dose to be administered generally contains from 0.01 mg to 50 mg of active ingredient.
  • oligonucleotide or "oligonucleotide (a)" denotes the nucleic acid sequence (a).
  • Example 1 Demonstration of the 190 kDa Protein in Human Tumor Cells The 190 kDa protein was demonstrated as follows: Cells from human melanoma, prepared according to the method described in J. Inv. Dermatol., 1991, 9JL N * 2, 238-242, are suspended in a phosphate buffer (PBS) containing 200 ⁇ g / ml either of RGDS or of YIGSR, at a rate of 2 ⁇ 10 ⁇ cells / ml. This cell suspension is then incubated at room temperature for 30 min.
  • PBS phosphate buffer
  • the cells are recovered by centrifugation at 1000 g for 10 min. and are suspended in cell lysis buffer containing sodium orthovanadate. This solution is then clarified by centrifugation at 14,000 g for 15 min. The supernatant thus obtained is used to extract the phosphorylated proteins at the level of tyrosine. This extraction is carried out after immunoprecipitation using a monoclonal anti-phosphotyrosine antibody (Sigma). After addition of the anti-phosphotyrosine antibody, the supernatant is incubated for 2 h at room temperature and then centrifuged at 14,000 g for 15 min.
  • the precipitate obtained is taken up with an electrophoresis solution containing 2% SDS and 15 mM of dithiothreitol, heated at 100 ° C. for 5 min. then deposited in polyacrylamide gel (gradient from 4 to 15% in acrylamide) under denaturing conditions (present with 2% SDS). After migration and revelation of the gel with silver nitrate, the presence of a protein of molecular weight 190 kDa is observed in the preparations originating from melanoma cells treated with RGDS or treated with YIGSR; this protein is absent from the preparation derived from melanoma cells incubated only in PBS.
  • Example 2 Evaluation of the in vitro activity of the oligonucleotide
  • Human melanoma cells (cf. example 1) are transfected with the oligonucleotide. The transfection is carried out as follows: the human melanoma cells are suspended in a solution of oligonucleotide in PBS at the rate of 100 ⁇ g of oligonucleotide / ml of PBS. The suspension is then incubated at room temperature for 2 hours. After incubation, the cells are recovered by centrifugation at 1000 g for 10 minutes.
  • Matrigel (marketed by the Company Becton Dickinson), under the following conditions: From 'a solution of Matrigel (10 mg / ml) in PBS, samples were placed in a 96-well microtiter plate at the rate of 50 ⁇ l / well. The plate is incubated at 37 ° C for 2 h and then washed three times with a buffer phosphate (PBS) to remove the non-adsorbed product.
  • PBS buffer phosphate
  • the melanoma cells (transfected with the oligonucleotide for the tests, or not transfected for the controls) which are in suspension in phosphate buffer (PBS) at the rate of 10 ⁇ cells / ml, were distributed at the rate of 50 l /well. After elimination of the nonadherent cells by three washes with phosphate buffer (PBS), the optical density obtained for the wells containing cells transfected with the oligonucleotide is compared with that obtained for the wells containing cells not transfected. Reading the results, it then appears that the transfection of human melanoma cells with the oligonucleotide inhibits the adhesion of these cells to the Matrigel.
  • PBS phosphate buffer
  • Example 3 Evaluation of the in vivo activity of the oligonucleotide (a) Five batches of nude mice were used. There were 5 mice per batch.
  • Lot N * 1 This lot served as a witness. Each mouse is inoculated subcutaneously at OJ with 200 ⁇ l of a suspension of B16 melanoma cells (supplied by the Gustave Roussy Institute of Villejuif) dispersed in PBS at the rate of 10 ⁇ cells / ml. These mice are not further processed. Lot N * 2: Each mouse is inoculated subcutaneously on D0 with 200 ⁇ l of a suspension of B16 melanoma cells dispersed in PBS at the rate of 10 ⁇ cells / ml.
  • each mouse receives a subcutaneous injection of 200 ⁇ l of an oligonucleotide solution diluted in PBS at the rate of 500 ⁇ g / ml.
  • the oligonucleotide injection is carried out near the injection site of the cells.
  • Lot N * 3 The B16 melanoma cells used to inoculate the mice in this lot were previously transfected with the oligonucleotide. For the transfection to take place, the B16 melanoma cells were suspended in an oligonucleotide solution diluted in PBS at a rate of 500 ⁇ g / ml for 2 hours at room temperature. After this incubation, each mouse is inoculated on D0 with 200 ⁇ l of this suspension of cells transfected in PBS at the rate of 10 6 cells / ml.
  • Lot N * 4 The B16 melanoma cells used to inoculate the mice in this lot were also previously transfected with the oligonucleotide. For the transfection to take place, the B16 melanoma cells were suspended in an oligonucleotide solution diluted in PBS at the rate of 500 ⁇ g ml for 2 hours at room temperature. After this incubation, each mouse is inoculated at OJ with 200 ⁇ l of this suspension of cells transfected in PBS, at a rate of 10 ⁇ cells / ml. On D1, D2 and D3 each mouse receives an injection of 200 ⁇ l of an oligonucleotide solution in PBS at the rate of 500 ⁇ g / ml. The injection is carried out in the same way as for lot N * 2.
  • mice in this lot are not inoculated with B16 melanoma cells. However, each of these mice receives an injection of 200 ⁇ l of an oligonucleotide solution in PBS at a rate of 500 / g / ml; injections are made on D1, D2 and D3.
  • the results are as follows:
  • mice of lot N * 1 After inoculation, in mice of lot N * 1, the tumor mass grows very rapidly. Indeed, the tumor mass reaches a size of 1.6 to 2.5 cm in diameter after ten days in mice of lot N * 1 (untreated mice).
  • the evolution of the tumor mass in the mice of lot N * 2 (mice treated after inoculation by injections of oligonucleotide at D1, J2 and J3), as in the mice of lot N * 3 (mice inoculated with melanoma cells B16 previously transfected with the oligonucleotide) shows a less marked increase in the volume of the tumor mass.
  • the tumor mass in mice of lots 2 and 3 does not exceed 1 cm in diameter on the tenth day. On the fourteenth day, the difference between the mice of lots N * 2 and 3 on the one hand, and the mice of lot N * 1 on the other hand, is remarkable.
  • mice of batch N * 4 it is noted that there is practically no evolution of the tumor mass until the fourteenth day after the inoculation of the mice by the melanoma B16 cells. After this period, in some mice the tumor mass begins to develop while in others the development of the tumor mass is not noticeable until 40-42 days.
  • mice of lot N * 5 (mice which did not receive melanoma B16 cells, but treated by injections of oligonucleotide for three days) there is an unexpected general effect on the skin. It is identical to that noted in all the mice which were treated with the oligonucleotide (lots 2 and 4). The skin takes on an aged, wrinkled appearance. The appearance of hair is also noted in all the mice treated. There is a parallelism during the evolution between the regression of skin signs and the resumption of tumor growth. It is therefore found that the nucleic acid sequence (a) according to the invention inhibits the multiplication of human melanoma cells in vitro; on the other hand remarkable anti-tumor activity in vivo and even allows hair regrowth in nude mice.

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Abstract

La présente invention concerne une séquence d'acide nucléique codant pour un ribozyme 'hammerhead' dirigé contre le substrat du récepteur de l'insuline (IRS-1) et choisie parmi: (a) 5' -TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTC TGGCCTAG- 3'; (b) les fragments de (a) qui comportent au moins 21 bases; et (c) les séquences d'acide nucléique qui hybrident dans des conditions strictes avec (a) ou (b), pour son utilisation comme substance thérapeutiquement active. L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques contenant ladite séquence, et leur utilisation pour le traitement de tumeurs, de l'alopécie, de l'angiogénèse ou de la calvitie.

Description

SEQUENCE D ' ADN CODANT POUR UN RIBOZYME A TITRE DE MEDICAMENT, ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LA CONTENANT
La présente invention concerne le domaine médical. Plus particulièrement, l'invention concerne une séquence d'acide nucléique comme substance thérapeutiquement active. L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques contenant ladite séquence.
L'adhésion des cellules sur les composants de la matrice extracellulaire est un point central dans la biologie du vivant. En pathologie humaine, et spécialement dans le domaine du cancer, ce phénomène tient un rôle crucial dans le développement de la maladie. Il est en effet impliqué dans la migration des cellules cancéreuses, dans le phénomène d'invasion ainsi que dans la colonisation métastatique à distance. Des travaux concernant l'interaction cellule-matrice extracellulaire ont d'abord permis de mettre en évidence une inhibition de l'activité phosphatasique membranaire des cellules de mélanome malin humain après interaction de ces cellules avec des séquences spécifiques de la matrice extracellulaire, telle que les séquences RGDS (séquence Arg-Gly-Asp-Ser, présente dans le collagène, la fibronectine, la vitronectine, la thrombospondine, etc..) et YIGSR (séquence Tyr- Ile-Gly-Ser-Ar présente dans la laminine) (J. Invest. Dermatol., 1994, 102. N*619, 627 ; J. Cellul. Biochem., 1994, l≤jβ, QZ 300, 89 ; J. Clin. Experim. Metast., 1994, 12, N*95, 37).
Des travaux ultérieurs ont montré que cette inhibition survient dans le cadre d'une opération de signalisation cellulaire impliquant une protéine tyrosine kinase. En utilisant des inhibiteurs de cette famille d'enzymes, il est possible, en effet, de supprimer l'effet inhibiteur de la séquence RGDS ou de la séquence YIGSR vis-à- vis de l'activité phosphatasique des cellules de mélanome humain (J. Clin. Experim. Metast., 1994, 12, N*134, 50-51).
La phosphatase impliquée lors de la réaction s'est révélée être de type Sérine Thréonine protéine phosphatase. Son poids moléculaire est de 190 kDa. L'inhibition de cette enzyme résulte d'une phosphorylation au niveau de la tyrosine.
Cette protéine est déjà connue en tant que substrat du récepteur à l'insuline (dénommé IRS-1). Elle a été, en effet, partiellement repérée et étudiée par certains auteurs travaillant sur le diabète (Quon et al., J. Biol. Chem. (1994), 269 (45), 27920-27924). Ces auteurs ont étudié le rôle de l'IRS-l sur (i) la translocation du GLUT 4 stimulée par l'insuline et (ii) le transport du glucose, dans des cellules adipeuses de rat. Pour ce faire, ils ont construit un plasmide contenant un oligonucléotide bicaténaire, obtenu à partir de l'oligonucléotide sens 5 ' -TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTC TGGCCTAG- 3 * , et l'ADNc codant pour l'IRS-l humain, et ont transfecté des cellules adipeuses de rat par ce plasmide. On a maintenant mis en évidence le fait que cette protéine de 190kDa est également présente au niveau des cellules tumorales. De plus, on a trouvé de manière surprenante que l'oligonucléotide ci-dessus (SEQ ID N* 1) : 5' - TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTC TGGCCTAG- 3 ' possède une activité anti-tumorale remarquable. La présente invention concerne donc une séquence d'acide nucléique choisie parmi :
(a) 5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTC TGGCCTAG- 3'
(SEQ ID N* 1)
(b) les fragments de (a) qui comportent au moins 21 bases ; et (c) les séquences d'acide nucléique qui hybrident dans des conditions strictes avec
(a) ou (b), pour son utilisation comme substance thérapeutiquement active.
Avantageusement, tout ou partie des liaisons phosphodiester des séquences (a), (b) ou (c) sont protégées. Cette protection s'effectue généralement par voie chimique, selon des méthodes classiques bien connues de l'homme du métier. Par exemple, on peut protéger les liaisons phosphodiester par une fonction thiol ou aminé ou bien encore par un groupe phényle.
De façon également avantageuse, les extrémités 5'- et/ou 3'- des séquences ci- dessus sont protégées, par exemple en utilisant la technique indiquée précédemment pour protéger les liaisons phosphodiester.
A titre d'exemples de séquence (b), on peut mentionner les oligonucléotides suivants (SEQ ID N* 2 à SEQ ID N* 21) :
5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTC TGGCC- 3'
5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTC TG- 3' 5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACT- 3'
5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAA- 3'
5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GAC- 3'
5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG- 3'
5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGT- 3' 5'-TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTC- 3*
5*-TCGATGTGAC GCTACTGATG A- 3' 5 ' -ATGTGACGCT ACTGATGAGT CCGTGAGGAC GAAACTCTGG CCTAG- 3' 5 ' -TGACGCTACT GATGAGTCCG TGAGGACGAA ACTCTGGCCT AG- 3 ' 5 * -CGCTACTGAT GAGTCCGTGA GGACGAAACT CTGGCCTAG- 3 ' 5 ' -TACTGATGAG TCCGTGAGGA CGAAACTCTG GCCTAG- 3 * 5' -TGATGAGTCC GTGAGGACGA AACTCTGGCC TAG- 3 ' 5 ' -TGAGTCCGTG AGGACGAAAC TCTGGCCTAG- 3' 5' -GTCCGTGAGG ACGAAACTCT GGCCTAG- 3' 5' -CGTGAGGACG AAACTCTGGC CTAG- 3 ' 5' -GAGGACGAAA CTCTGGCCTA G- 3* 5 ' -TACTGATGAG TCCGTGAGGA C-3 ' 5 ' -TGATGAGTCC GTGAGGACGA A-3'
Les séquences d'acide nucléique (a), (b) et (c) peuvent être synthétisées selon les techniques conventionnelles bien connues de l'homme du métier, par exemple à l'aide d'un synthétiseur d'ADN commercialisé par la Société Biosearch Inc., USA. Les séquences d'acide nucléique selon l'invention bloquent la multiplication des cellules, notamment des cellules tumorales in vivo. Bien que leur mécanisme d'action ne soit pas entièrement élucidé, on pense qu'elles inhibent l'adhésion des cellules cancéreuses à la matrice extracellulaire. Dans la mesure où on a mis en évidence que la séquence d'acide nucléique (a) est un oligonucléotide antisens dirigé contre le gène de la protéine de 190 kDa mentionnée ci-dessus, on peut alors émettre l'hypothèse selon laquelle la protéine 190 kDa représente le carrefour où se rejoignent les voies de signalisation dépendantes des intégrines (protéines membranaires responsables de l'adhésion des cellules sur la matrice extracellulaire) et celles impliquant la réponse aux hormones et facteurs de croissance. Les séquences d'acide nucléique selon l'invention sont donc indiquées comme agent anti-multiplication cellulaire, en particulier comme agent anti-tumoral. Elles sont également indiquées comme agent anti-angiogénèse. L'invention concerne par conséquent également une méthode pour inhiber la multiplication des cellules tumorales, notamment des cellules de mélanome humain, qui consiste à administrer aux patients qui en ont besoin une quantité efficace de la séquence d'acide nucléique (a), (b) ou (c).
L'invention concerne aussi une méthode de traitement du cancer, en particulier des mélanomes, qui consiste à administrer aux patients qui en ont besoin une quantité efficace de la séquence d'acide nucléique (a), (b) ou (c). On a par ailleurs constaté la repousse des poils chez des souris nude traitées avec les séquences d'acides nucléiques selon l'invention. Celles-ci sont donc également indiquées dans le traitement de la calvitie et de l'alopécie.
L'invention concerne donc aussi une méthode de traitement de l'alopécie qui consiste à administrer aux patients qui en ont besoin une quantité efficace de la séquence d'acide nucléique (a), (b) ou (c).
Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi un outil de laboratoire constitué par une séquence d'acide nucléique telle que définie ci-dessus, notamment pour l'étude in vitro des voies de signalisation impliquant la protéine 190 kDa (par exemple sur des cellules, tumorales ou non, transfectées par une des séquences (a), (b) ou (c)), mais également pour l'étude in vivo des voies de signalisation impliquant la protéine 190 kDa dans un grand nombre de phénomènes physiologiques et pathologiques (tels que la cancérogénèse), essentiellement à partir du rapport kinase/phosphatase. Les séquences d'acide nucléique selon l'invention sont notamment des principes actifs de compositions pharmaceutiques, dont la toxicité est compatible avec leur utilisation en tant que médicaments.
Ainsi, selon un autre aspect, la présente invention concerne des compositions pharmaceutiques contenant, en tant que principe actif, une séquence d'acide nucléique telle que définie précédemment, mélangée avec tout excipient pharmaceutiquement acceptable.
Les compositions ci-dessus sont plus particulièrement réalisées de manière à pouvoir être administrées par voie sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse ou transdermique. Pour une telle administration, on utilise notamment des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion et/ou des agents mouillants pharmacologiquement compatibles, par exemple le propylèneglycol ou le butylèneglycol. La dose unitaire usuelle à administrer contient généralement de 0,01 mg à 50 mg de principe actif.
L'invention est illustrée par les exemples ci-après, dans lesquels on désigne par "oligonucléotide" ou "oligonucléotide (a)" la séquence d'acide nucléique (a). Exemple 1 : mise en évidence de la protéine 190 kDa dans les cellules tumorales humaines La protéine 190 kDa a été mise en évidence de la manière suivante : Des cellules issues de mélanome humain, préparées selon la méthode décrite dans J. Inv. Dermatol., 1991, 9JL N*2, 238-242, sont mises en suspension dans un tampon phosphate (PBS) contenant 200 μg/ml soit de RGDS, soit de YIGSR, à raison de 2 x 10^ cellules/ml. Cette suspension cellulaire est ensuite incubée à température ambiante pendant 30 min. Après cette incubation, les cellules sont récupérées par centrifugation à 1000 g pendant 10 min. et sont mises en suspension dans un tampon de lyse cellulaire contenant de l'orthovanadate de sodium. Cette solution est ensuite clarifiée par centrifugation à 14 000 g pendant 15 min. Le surnageant ainsi obtenu est utilisé pour extraire les protéines phosphorylées au niveau de la tyrosine. Cette extraction est réalisée après une immunoprécipitation à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-phosphotyrosine (Sigma). Après addition de l'anticorps anti-phosphotyrosine, le surnageant est incubé pendant 2 h à température ambiante puis centrifugé à 14 000 g pendant 15 min. Le précipité obtenu est repris avec une solution d'électrophorèse contenant 2 % SDS et 15 mM de dithiothréitol, chauffé à 100* C pendant 5 min. puis déposé en gel de polyacrylamide (gradient de 4 à 15 % en acrylamide) dans des conditions dénaturantes (en présente de 2 % SDS). Après migration et révélation du gel par le nitrate d'argent, on constate la présence d'une protéine de poids moléculaire 190 kDa dans les préparations issues des cellules de mélanome traitées avec le RGDS ou traitées avec le YIGSR ; cette protéine est absente de la préparation issue des cellules de mélanome incubées seulement dans du PBS. Exemple 2 : Evaluation de l'activité in vitro de l'oligonucléotide (a) Des cellules de mélanome humain (cf. exemple 1) sont transfectées par l'oligonucléotide. La transfection est réalisée de la façon suivante : les cellules de mélanome humain sont mises en suspension dans une solution d'oligonucléotide dans le PBS à raison de 100 μg d'oligonucléotide/ml de PBS. La suspension est alors incubée à température ambiante pendant 2 heures. Après incubation, les cellules sont récupérées par centrifugation à 1000 g pendant 10 minutes. On a ensuite testé l'effet de la transfection par l'oligonucléotide des cellules de mélanome humain sur l'adhésion de ces cellules à une matrice extracellulaire : le Matrigel (commercialisé par la Société Becton Dickinson), dans les conditions suivantes : A partir d'une solution de Matrigel (10 mg/ml) dans le PBS, des échantillons ont été placés dans une plaque de microtitration à 96 puits à raison de 50 μl/puits. La plaque est incubée à 37* C pendant 2 h puis lavée trois fois avec un tampon phosphate (PBS) pour éliminer le produit non adsorbé. Les cellules de mélanome (transfectées par l'oligonucléotide pour les tests, ou non transfectées pour les contrôles) qui se trouvent en suspension dans du tampon phosphate (PBS) à raison de 10^ cellules/ml, ont été distribuées à raison de 50 l/puits. Après élimination des cellules non adhérentes par trois lavages au tampon phosphate (PBS), la densité optique obtenue pour les puits contenant des cellules transfectées par l'oligonucléotide est comparée avec celle obtenue pour les puits contenant des cellules non transfectées. A la lecture des résultats, il apparaît alors que la transfection des cellules de mélanome humain par l'oligonucléotide inhibe l'adhésion de ces cellules sur le Matrigel.
Lorsque l'on tente de cultiver les cellules de mélanome humain après transfection par l'oligonucléotide on observe une inhibition de la multiplication de ces cellules. Exemple 3 : Evaluation de l'activité in vivo de l'oligonucléotide (a) Cinq lots de souris nude ont été utilisés. Il y avait 5 souris par lot.
Lot N* 1 : Ce lot a servi de témoin. Chaque souris est inoculée en sous-cutané à JO avec 200 μl d'une suspension de cellules de mélanome B16 (fournies par l'Institut Gustave Roussy de Villejuif) dispersées dans du PBS à raison de 10^ cellules/ml. Ces souris ne sont pas traitées par la suite. Lot N* 2 : Chaque souris est inoculée en sous-cutanée à J0 avec 200 μl d'une suspension de cellules de mélanome B16 dispersées dans le PBS à raison de 10^ cellules/ml.
A Jl, J2 et J3 chaque souris reçoit une injection sous-cutanée de 200 μl d'une solution d'oligonucléotide diluée dans le PBS à raison de 500 μg/ml. L'injection d'oligonucléotide est effectuée à proximité du site d'injection des cellules.
Lot N* 3 : Les cellules de mélanome B16 utilisées pour inoculer les souris de ce lot ont été auparavant transfectées par l'oligonucléotide. Pour que s'opère la transfection, les cellules de mélanome B16 ont été suspendues dans une solution d'oligonucléotide dilué dans le PBS à raison de 500 μg/ml pendant 2 heures à température ambiante. Après cette incubation chaque souris est inoculée à J0 avec 200 μl de cette suspension de cellules transfectées dans le PBS à raison de 106 cellules/ml.
Lot N* 4 : Les cellules de mélanome B16 utilisées pour inoculer les souris de ce lot ont été, elles aussi, préalablement transfectées par l'oligonucléotide. Pour que s'opère la transfection, les cellules de mélanome B16 ont été suspendues dans une solution d'oligonucléotide dilué dans le PBS à raison de 500 μg ml pendant 2 heures à température ambiante. Après cette incubation, chaque souris est inoculée à JO avec 200 μl de cette suspension de cellules transfectées dans le PBS, à raison de 10^ cellules/ml. A Jl, J2 et J3 chaque souris reçoit une injection de 200 μl d'une solution d'oligonucléotide dans le PBS à raison de 500 μg/ml. L'injection est effectuée selon les mêmes modalités que pour le lot N* 2.
Lot N* 5 : Les souris de ce lot ne sont pas inoculées avec les cellules de mélanome B16. Cependant, chacune de ces souris reçoit une injection de 200 μl d'une solution d'oligonucléotide dans le PBS à raison de 500 / g/ml ; les injections sont faites à Jl, J2 et J3. Les résultats sont les suivants :
Après inoculation, chez les souris du lot N* 1, la masse tumorale se développe d'une façon très rapide. En effet, la masse tumorale atteint une taille de 1,6 à 2,5 cm de diamètre après dix jours chez les souris du lot N* 1 (souris non traitées). L'évolution de la masse tumorale chez les souris du lot N* 2 (souris traitées après inoculation par injections d'oligonucléotide à Jl, J2 et J3), comme chez les souris de lot N* 3 (souris inoculées avec des cellules de mélanome B16 préalablement transfectées par l'oligonucléotide) montre une moindre augmentation nette du volume de la masse tumorale. La masse tumorale chez les souris des lots 2 et 3 ne dépasse pas 1 cm de diamètre au dixième jour. Au quatorzième jour, la différence entre les souris des lots N* 2 et 3 d'une part, et les souris du lot N* 1 d'autre part, est remarquable.
Chez les souris du lot N* 4, on remarque qu'il n'y a pratiquement pas d'évolution de la masse tumorale jusqu'au quatorzième jour après l'inoculation des souris par les cellules de mélanome B16. Après cette période, chez certaines souris la masse tumorale commence à se développer alors que chez d'autres le développement de la masse tumorale n'est perceptible qu'au 40-42ème jour.
Chez les souris du lot N* 5 (souris n'ayant pas reçu de cellules de mélanome B16, mais traitées par injections d'oligonucléotide pendant trois jours) on note un effet général inattendu sur la peau. Il est identique à celui noté chez toutes les souris qui ont été traitées par l'oligonucléotide (lots 2 et 4). La peau prend un aspect vieilli, fripé. On note aussi l'apparition de poils chez toutes les souris traitées. Il existe un parallélisme au cours de l'évolution entre la régression des signes cutanés et la reprise de la croissance tumorale. On constate donc que la séquence d'acide nucléique (a) selon l'invention inhibe la multiplication des cellules de mélanome humain in vitro ; elle possède d'autre part une activité anti-tumorale in vivo remarquable et permet même la repousse des poils chez la souris nude.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: SANOFI
(B) RUE: 32/34 Rue Marbeuf
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75008
(G) TELEPHONE: (1) 53774000 (H) TELECOPIE: (1) 537742 16
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Séquence d'ADN à titre de médicament et compositions pharmaceutiques en contenant
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 21
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D* EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 9505468
(B) DATE DE DEPOT: 09-MAY-1995
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 48 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTC TGGCCTAG 48
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 4 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTC TGGCC 4
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 42 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTC TG 42
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACT 39 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAA 36
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GAC 33
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGT 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTC 24
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
TCGATGTGAC GCTACTGATG A 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 4 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
ATGTGACGCT ACTGATGAGT CCGTGAGGAC GAAACTCTGG CCTAG 45
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 42 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
TGACGCTACT GATGAGTCCG TGAGGACGAA ACTCTGGCCT AG 42
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
CGCTACTGAT GAGTCCGTGA GGACGAAACT CTGGCCTAG 39
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
TACTGATGAG TCCGTGAGGA CGAAACTCTG GCCTAG 36
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
TGATGAGTCC GTGAGGACGA AACTCTGGCC TAG 33
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
TGAGTCCGTG AGGACGAAAC TCTGGCCTAG 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
GTCCGTGAGG ACGAAACTCT GGCCTAG 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
CGTGAGGACG AAACTCTGGC CTAG 24
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:
GAGGACGAAA CTCTGGCCTA G 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:
TACTGATGAG TCCGTGAGGA C 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:
TGATGAGTCC GTGAGGACGA A 21

Claims

REVENDICATIONS
1. Séquence d'acide nucléique choisie parmi :
(a) 5 ' -TCGATGTGAC GCTACTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTC TGGCCTAG- 3' (b) les fragments de (a) qui comportent au moins 21 bases ; et
(c) les séquences d'acide nucléique qui hybrident dans des conditions strictes avec
(a) ou (b), pour son utilisation comme substance thérapeutiquement active.
2. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 1, dans laquelle tout ou partie des liaisons phosphodiester sont protégées.
3. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle l'extrémité 5'- et/ou 3'- est protégée.
4. Agent anti-multiplication cellulaire, contenant à titre de principe actif la séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
5. Agent anti-tumoral, contenant à titre de principe actif la séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
6. Agent anti-angiogénèse, contenant à titre de principe actif la séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
7. Agent pour le traitement de la calvitie ou de l'alopécie, contenant à titre de principe actif la séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
8. Composition pharmaceutique contenant, à titre de principe actif, la séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, mélangée avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
9. Outil de laboratoire constitué par la séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
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