WO1996033215A1

WO1996033215A1 - Proteine nouvelle et son procede de fabrication

Info

Publication number: WO1996033215A1
Application number: PCT/JP1996/001062
Authority: WO
Inventors: Fusao Makishima; Hiroyuki Takamatsu; Hideo Miki; Shinji Kawai; Michio Kimura; Tomoaki Matsumoto; Mieko Katsuura; Koichi Enomoto; Yusuke Satoh
Original assignee: Hoechst Pharmaceuticals & Chemicals K.K.
Priority date: 1995-04-19
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 1996-10-24
Also published as: DK0955313T3; EA000582B1; HU225424B1; US7268114B2; AU704515B2; NO974812L; HUP9801697A2; US7816103B2; UA46767C2; US7235527B2; US20090325864A1; DE69636728D1; ATE325131T1; CA2216741A1; EP0955313A1; BR9608019A; EP0955313B1; NO321153B1; DE69636728T2; US20020102633A1

Description

明細書

新規なタンパク質およびその製法

技術分野

本発明は、 MP52由来の配列表配列番号 1のアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。また、本発明は前記タンパク質の二量体およびこの二量体タンパク質からなる軟骨、骨疾患治療剤に関する。また、本発明は上記タンパク質を発現しうる D NA配列を含むプラスミドで形質転換した大腸菌を用いて上記タンパク質を大量かつ高純度で製造する方法に関する。さらに本発明は上記二量体タンパク質を投与することからなる軟骨- 骨疾患の治療方法に関する。

背景技術

現在、骨疾患の予防ないしは治療剤としては、エストロゲン、カルシトニン、ビタミン D 3とその誘導体およびビスホスホン酸誘導体などが知られている。また最近になって TGF - ^ジーンスーパ一ファミリーに属する骨誘導因子（Bone raorphogenetic protein：以降 BMPと呼ぶ）である BMP- 2から BMP- 9等の一連のタンパク質に骨誘導の作用のあることが報告されている。

さらに MP52と称されるタンパク質（WO 93/16099および WO 95/04819) に骨誘導の作用があることが報告されている。成熟型 MP52は N末端にァラニンを有する 1 20残基からなるタンパク質であると考えられており、そのァミノ酸配列はこれらの特許に記載されている。

また MP52とよく似たアミノ酸配列を有する GDF- 5と称されるマウス由来の蛋白質については Na ture, vol . 368、 p. 639-643 ( 1994年）および WO 94/ 15949に記載されている。

しかしながら、これらのタンパク質を工業的な規模で純粋な形で製造することは容易ではない。

MP52を遺伝子工学的に製造するに当たって L -細胞のような動物細胞を使うことが試みられた。しかし純粋な MP52を収率よく製造することは容易ではない。

発明の開示

本発明者らは、 MP52を大腸菌を使って遗伝子工学的手法により大量に製造することを試みた。すなわちァラニンから始まる MP52をコードする DNAの 5プライム末端にメチォニンをコードするコドンを付加して大腸菌によって M P 52を製造することを試みた。その結果生産されるものは MP 52のみならず N末端にメチォニンを有する 12 1残基のタンパク質、および N末端のァラニンが脱落してプロリンから始まる 1 1 9残基のタンパク質が生成しこの混合物から MP52を純粋に分離することは極めて困難であった。

本発明者は、 M P52の N末端のァラニンを削除した 1 19残基よりなる配列表配列番号 1のァミノ酸配列をコードする DNA配列の 5プライム末端にメチォニンをコードするコドンを結台させたプラスミドを構築し、このプラスミドを導入した大腸菌を用いて発現させたところ、 N末端がプ口リンから始まる配列表配列番号 1記載のタンパク質を選択的に極めて収率よく生産することを見い出した。

しかも配列表配列番号 1に記載したタンパク質の二量体は钦骨 ·骨誘導活性を有することを確認し、本発明を完成した。

本発明は、配列表配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。このタンパク質は 1 20残基からなる成熟型部分と見なされているヒト M P52より N末端のァラニンを削除した 1 1 9残基のァミノ酸からなる夕ンパク質である。本発明により得られる夕ンパク質は水溶液に可溶性である。さらに本発明のタンパク質はヒト由来であることを特徴とするため、それ自身の毒性は少ない。

また本発明は、配列表配列番号 1で示されるァミノ酸配列を有する夕ンパク質の二量体からなる钦骨および（または）骨疾患の治療剤に関する。より詳細には、本発明のタンパク質の二量体は钦骨 ·骨誘導活性を有するため、骨粗鬆症、先天性钦骨 ·骨疾患、変形性膝関節症 ·変形性股関節症等の変形性関節症または、骨関節炎、半月損傷等の軟骨損傷、外傷 ·腫瘍摘出等による骨 ·軟骨欠損部の再生、骨 ·钦骨欠損、骨折、軟骨形成不全症 ·軟骨発育不全症 ·軟骨無形成症 · 口蓋裂 ·骨形成不全症等の先天性钦骨 ·骨疾患、さらには、歯根 ·歯槽の欠損等の予防および治療剤に関する。さらに本発明のタンパク質は軟骨，骨誘導活性を有するため美容外科の骨移植の治療等に用いることが出来る。これらの治療には、獣医外科領域のものも含まれる。

本発明は、配列表配列番号 1で示されるヒト MP52由来の 1 19残基のァミノ酸からなるタンパク質を大腸菌を用いて製造する方法に関する。さらに、本発明は配列表配列番号 1で示されるヒト MP52由来の 1 19残基のアミノ酸配列をコードする DNA配列の 5プライム末端にメチォニンをコードする DNAを含有するプラスミドの構築に関する。ヒ卜 MP52cDNA は、 WO 93Z16099記載の cDNAを含んだプラスミドベクターを铸型 DNAとして、成熟型部分のみをポリメラーゼ連鎖反応（PCR法）を用いて増幅した。ここで用いる PCR法とは通常核酸 DNAまたは RNAの微量断片を米国特許番号 4, 683. 195に記載されている方法で増幅することを意味する。本発明のタンパク質を生産するために、このタンパク質をコードしている DNAを含んだ適切な発現ベクターを構築し、遺伝子工学の手法により好ましい大腸菌の宿主に導入する事が必要である。本発明のタンパク質を大量に生産するため以下の 2つの改良方法を施した。 1 ) 目的蛋白質の生産性を上げる方法： M. Nobuharaらが報告（Agri Biol. Chem. , 52(6), 1331〜1338. 1988)している翻訳効率を上げる方法、即ち、開始コドン ATG周辺の AT含量を上げる方法、および 2 )プラスミドの複製数を上げる方法、即ち複製オリジンを pBR系から pUC系に改変する方法。さらにプロモーター領域と配列表配列番号 1のァミノ酸配列をコードする MA配列とを直接つなぐことにより本発明の発現べクタ一（pKOT245) を構築した。このベクターは通商産業省、工業技術院国立生命科学 ·人間技術研究所（NIBH) (茨城県筑波郡谷田部町東 1丁目 1一 3 (日本）に 1995 年 4月 14日付で受託番号 FERM P- 14895号として寄託され、 1996年 4月 10 日付でブタペスト条約に基づく寄託へ移管された（FERM BP- 5499) 。本発明は、配列表配列番号 1で示されるアミノ酸配列をコードする DNA配列の 5プライム末端にメチォニンをコードするコドンを付加した DNAを含有するプラスミドを構築し、そのプラスミドで大腸菌を形質転換し、その大腸菌を培養することよって得られるィンクル一ジョンボディを可溶化し、精製することによって得られる単量体のタンパク質、およびこれを再生、精製することによって得られる配列表配列番号 1のタンパク質の二量体のタンパク質の製造方法に関する。すなわち、本発明のタンパク質は大腸菌ィンクルージョンボディを可溶化した後、 SP - Sepharose FFカラムおよび Sephacryl S-200カラムにより単一なスルホン化 MP52単量体を得た。それからリフォールデイングを行った後等電点沈殿し、逆相 HPLCの RESOURCE RPCカラムを通すことにより本タンパク質の精製二量体画分を得た。得られた本タンパク質の物理化学的性質は N 末端アミノ酸配列、アミノ酸組成および電気泳動による分析で解析した。

本発明は、さらに本発明の発現ベクターを組み込んだ大腸菌の培養を培養液の温度 28て〜 34°C、 pH 6〜8、溶存酸素濃度 20〜50%の条件下で行う製造方法に関する。

本発明の夕ンパク質の二量体の生物学的活性は異所性軟骨 ·骨形成 (ェクトピックボーンフォーメーション）の钦 X線写真撮影解析、組織学的解析および経時的解析により評価した。さらに、膜内骨化に対する作用、関節软骨の再生に対する効果および骨折 ·骨欠損に対する治癒効果により、本発明のタンパク質が钦骨 ·骨再建に有効であることを確認した。

全身投与方法としては静脈内、筋肉内および腹腔内投与が可能であり- 静脈内投与の場台は通常の静脈内注射の他点滴静注が可能である。

注射用製剤としては、例えば注射用粉末製剤とすることができる。その場合は適当な水溶性賦形剤、例えばマンニトール、ショ糖、乳糖、マルトース、ブドウ糖、フルクトース等の一種または 2種以上を加えて水で溶解し、バイアルまたはアンプルに分注した後、凍結乾燥し密封して製剤とすることができる。

局所投与方法としては、その部位の钦骨 ·骨あるいは歯の表面をコラ一ゲンペースト、フイブリンのりまたは他の接着剤を用いて本タンパク質で覆う方法がある。これらのうち骨移植に用いる骨は天然骨の他、従来用いられる人工骨にも利用できる。人工骨とは金属、セラミックス、ガラス等の天然素材または人工無機質素材で出来た骨を意味する。人工無機質素材として好ましくはハイドロキシァパタイ卜があげられる。例えば、人工骨の内部材料に金属そしてその外側の材料にハイド口キシァパタイトを使用する。さらに、本タンパク質は骨再構築を促進するために癌性骨組織にも投与出来、また、軟骨移植にも利用可能である。

投与量については、本タンパク質の作用に影響する様々な要因、たとえば、形成が望まれる骨 ·钦骨の重量、骨 ·钦骨損傷の部位およびその状態、患者の年齢、性別、感染の重症度、投与時間および他の臨床要因を考慮して担当医が決定する。また、用量は本タンパク質との再構成に用いる担体の種類によって変動し得る。一般的に、投与量は、支持体との組成物として使用するとき、所望の骨 ·軟骨湿重量当たり、本タンパク質約 1 0〜10 ^βナノグラム、注射剤として局所および全身性に適用するとき、患者 1人当たり 0. 1〜； 10⁴マイクログラムを一週間に一度から一日に一度の頻度で投与することが好ましい。

骨 ·钦骨再生に対して既知の成長因子例えば i nsu l i n- l i ke grow th factor- I (IGF- 1) 等を同時適用することにより相乗効果が期待できる o

このように本発明のタンパク質を工業的な規模でしかも純粋な形で製造する方法は今まで報告されておらず、軟骨 ·骨誘導活性を有する軟骨, 骨疾患治療剤として有効である。さらに本発明の製造方法は今まで動物細胞でのみしか産生できなかった TGF- βジーンスーパーファミリ一に属する前述の骨誘導因子の製造にも応用できる。

図面の簡単な説明

図 1は、実施例 1 (2)で得られた本発明のタンパク質の発現ベクター (ΡΚΟΤ245) のプラスミドマップである。

図 2は、実施例 4 (1 )で得られたマウス大腿筋内に誘導された骨 ·钦骨石灰化組織の钦 X線写真である。

図 3は、実施例 4 (1 )で得られたマウス大腿筋内に誘導された骨 ·钦骨石灰化組織の非脱灰切片の組織染色顕微鏡写真である。

図 4は、実施例 4 (2)で得られたマウス大腿筋内において観察された钦骨 ·骨誘導の経時的変化を示す組織染色顕微鏡写真である。

図 5は、実施例 4 (3)で得られたラット頭頂骨の脱灰切片の組織染色顕微鏡写真である。

図 6は、実施例 4 (4)で得られた家兎の関節钦骨を含む大腿骨頭部の脱灰組織切片の組織染色顕微鏡写真である。

図 7は、実施例 4 (5)で得られた大腿骨に骨欠損が作成されたラットの大腿部の软 X線写真である。

発明を実施するための最良の形態

次に、実施例を示して本発明の効果を具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

実施例 1 ベクターの作製

( 1 ) 変異型 ΜΡ52成熟型部分の単離ヒト MP52cDNAは、 WO 93 6099に記載された cDNAを含んだプラスミドベクター（pSK52s) を铸型 DNAとして、成熟型部分のみをポリメラ一ゼ連鎖反応 (PCR) を用いて増幅した。

開始コドン ATG周辺の AT含量を上げる事により、目的タンパク質の生産性を上げる方法 {M. Nobuharaらの報告（Agri Biol. Chem. , 52(6), 1 331〜1338, 1988) } に従い成熟型の MP52遺伝子の一部の DNAを置換し置換の方法は、配列番号 2の順方向 PCRプライマーを用い、 PCR法で行つた。 PCRプライマ一の DNA配列は、順方向ブライマーとして配列番号 2 , および逆方向プライマーとして配列番号 3記載の DNAを用いた。

PCRは、同じ試験管中で、铸型 DNA ( 10ナノグラム）、順方向および逆方向 PCRプライマ一各々 50ピコモル、 dNTP(0. 2ミリモル）、および MgC ₂ ( 1. 5ミリモル）を Taq DNAポリメラ一ゼ（5U) と共に加えることにより行つた。

各サイクルが、変性（94°C、 1分間）、プライマーアニーリング（55 °C、 1分間）、およびプライマー伸長（72°C、 2分間）からなる 30サイクルの PCRを行った（以下の PCRはすべてこの条件で行った）。

PCR反応からの生成物を 1. 5%低融点ァガロース（FMC社）中で電気泳動により分離し、配列番号 1のアミノ酸配列に相当する約 360bpからなる DNAを切り出した（これをフラグメント 1とする）。

( 2 ) 本タンパク質の大腸菌発現ベクターの構築

プラスミドの複製数を上げるためには、複製オリジンを pBR系から pUC 系に改変した。市販の大腸菌発現べクタ一 PKK223- 3 (フアルマシア ·バィォテク株式会社より購入）の tacプロモータ一領域を制限酵素 Ssplと EcoR Iで消化後、 Mung Bean Nuclease (宝酒造株式会社，カタログ番号 2420A) で処理し、フラグメント 1の開始コドン側に T4DNA Ligase (宝酒造株式会社. カタログ番号 2011 A)で結台させ、 pKK223- 3の rrnBL Tzターミネーター領域を制限酵素 Sailと Ssplで消化し、 Sailで消化したフラグメント 1の終止コドン側に結合させ、 pUC18の Sraal部位に組み込むことにより、本タンパク質の生産のための発現ベクター {pKOT245(受託番号微ェ研寄第 Ρ- 14895号）} (図 1 ) を構築した。 ΡΚΟΤ245の DNAの長さは 3.7 kbである。作製した本発明のタンパク質発現ベクターは、 Pharmacia ALF DNA シークェンサ一によりその塩基配列の決定を行った。

(3) 形質転換

形質転換は、 Kushnerらの塩化ルビジウム法（Genetic Engineering, p.17. Elsevier (1978)) に従った。即ち、 pKOT245を宿主大腸菌 W3110M へ上記の手法に従い移入し、本発明のタンパク質生産大腸菌とした。実施例 2 培養

(1 ) 培養

本発明のタンパク質発現大腸菌を改変 S0C培地（Bacto tryptone 20g/ i , Bacto yeast extract 5 g / £ , NaCi 0.5 g / £ , MgCi₂*6H₂0 2.03 g / £ , Glucose 3.69 で前培養し、生産用培地（Bacto tryptone 5 g / £ , Citric acid 4.3 » / £ , K₂HP0₄ 4.675 g / £ , KH₂P0₄ 1.2759 / £ , NaC 0.865 g / £ , FeS0₄-7H₂0 100«9/ £ . CuS0₄' 5H₂0 l g/ £ , MnS0₄-nH_z0 0.5*?/ ί . CaC ₂'2H₂0 2，g / Ά , Na₂B₄0₇ - 10H₂0 0.225覼 9ハ. (ΝΗ₄)_β ο₇0₂4 ·4Η₂0 0. g/ H, ZnS0₄-7H₂0 2.25 n₉/£, CoC^₂-6H₂0 6*9 H , MgS0₄-7H₂0 2.2 g / £, Thiamine

5. Qmg £ , Glucose 3 g / £ ) 5 Lに対し菌体懸濁液を 100» 添加し、 10Lの培養槽で通気攪拌しながら培養し、対数増殖前期（OD550=5.0) に達した段階で 1 mMの濃度でィソプロピル- 3 - D -チォガラクトピラノシドを添加し、さらに OD550が 150に達するまで培養した。培養中、温度は 32°C、 pHはアンモニアを添加することにより 7.15に制御し、溶存酸素濃度の低下を防ぐために搜拌速度をあげることにより空気飽和の 50% に溶存酸素濃度を制御した。また、高菌体濃度とするために溶存酸素濃度の急激な上昇を指標として、 50%グルコース溶液を 0.2%濃度で添加しながら培養した。

(2) 大腸菌インクルージョンボディの調製

上記方法により得られた培養液を遠心して菌体を回収し、 lOtnMェチレンヂアミン四酢酸を含む 25mM Tris- HC 緩衝液を（pH7.3) に懸濁し菌体破砕装置（ゴーリン社製）を用いて細菌を破砕し、再度遠心してインクルージョンボディを含む沈殿を回収した。

実施例 3 精製

(1 ) 大腸菌インクル一ジョンボディの可溶化

大腸菌インクル一ジョンボディを 1 % Triton X- 100で 3回洗浄後、 3000 X 9で 30分間、 4°Cで遠心し、得られた沈殿を 20raM Tris- HC 緩衝液、 pH8.3、 8M尿素、 10mM DTT、 1 m EDTAで超音波をかけながら可溶化した。

(2) 単量体精製

その可溶化液を 20000X 9で 30分間、 4°Cで遠心し、その上清を回収した。得られた上清を 20raM Tris*HC 緩衝液 pH8.3、 6 M尿素、 1 mM EDTAで平衡化した SP-Sepharose FF (フアルマシア社）に通し、同溶液で洗浄後、 0.5M食塩を含む同溶液で溶出させた。溶出液に Na₂S0₃と Na₂S₄0_eをそれぞれ最終濃度が lllmM、 13mMになるように加え 4 °C、 15時間スルホン化を行った。スルホン化溶液を 20mM Tris-HC^緩衝液、 pH 8.3、 6M尿素、 0.2M食塩、 ImM EDTAで平衡化した Sephacryl S-200 HR (ファルマンァ社）でゲル'慮過を行い、単一なスルホン化された本発明のタンパク質単量体を得た。

(3) リフオールディング

スルホン化された本発明の夕ンパク質単量体の溶液に 9倍量の 50mM Na- Glycine緩衝液 pH9.8、 0.2M塩化ナトリウム、 16mM CHAPS. 5mM EDTA. 2mM GSH (還元型グルタチオン）、 1 mM GSSG (酸化型グルタチオン）を加えた後、 1日間、 4 °Cで撹拌しリフォールデイングを行った。

( 4 ) 二量体精製

リフォールディングされた試料を純水で 2倍希釈し、 6 N塩酸を加え pHを約 7. 4に合わせて等電点沈殿を行った。沈殿を 3000 X 9 20分の遠心で集めた後、 30%ァセトニトリル、 0. 1 % TFAに溶解した。その溶液を純水で 2倍希釈し、 0. 05 % TFA、 25 %ァセトニトリルで平衡化しておいた逆相 HPLCの RESOURCE RPCカラム（ファルマンァ社）に通し、 0. 05%TFA、 25〜45%ァセトニトリルグラジェントにより溶出した。溶出液は吸光度光度計を用い 280n mの吸光度によりモニターし、精製された本発明のタンパク質二量体画分を得た。これを、スピードバックコンセントレー夕一（サーバント社）により凍桔乾燥した。

( 5 ) 精製された本発明のタンパク質の物理化学的性質の測定

(ァ） N末端アミノ酸配列分析

上記で得られた精製された本発明のタンパク質にっき、 N末端ァミノ酸配列をァミノ酸シークェンサ一、モデル 476A (アプライドバイオシステムズ社）により分析したところ、配列表配列番号 1で示す N末端から 30番目までのァミノ酸配列が確認された。

(ィ）アミノ酸組成分析

上記で得られた精製された本発明のタンパク質のァミノ酸組成をァミノ酸分析機 [PICO TAGシステム（ウォーターズ社）〕により調べた。その結果を表 1に示す。表に示された数は 1モノマー当りのアミノ酸残基数を示す。ァミノ寞 ffi 期待镇

A α v X Ji.. e 1丄

1 八 1丄 Πリ■ Q 1 1

Se t* Q

G 1 y 4 3 4

H i s A 0 A *t

Th r 5 4

A 1 a 7.3 7 r

Pro 1 0 1 nリ

Ty r 2 Q Q

Me t 5.1 4

V.Cy s 2.6 7

I I e 4.9 6

Leu 10.0 10

Ph e 4.0 4

L y s 5.9 6

Tr p 2

配列の長さ 119

-：検出不可能

(ゥ）電気泳動による分析

上記で得られた精製された本発明のタンパク質の分子量を非還元条件下の SDS- PAGEにより確認したところ、約 28KDaの分子量を示した。

上記（ァ）、（ィ）および（ゥ）に示された結果より、本発明のタンパク質は N末端が単一に Proから始まる 119残基からなるタンパク質であることが解った。

実施例 4 生物学的活性の測定

(1 ) 異所性钦骨，骨組織の誘導作用

実施例 3により得られた夕ンパク質約 500〃 gを lOmll塩酸 50 こ溶解、同溶媒で希釈し、 1〃 9 10 ^、 10 ₉ノ10〃、および 100 9ノ ΙΟί^ の濃度の溶液を調製し、その 10 / を豚腱由来 type- 1 コラーゲン溶液 150// （高研、 0.5%、 pH3、 I-AC) と混和し、中和した後、凍結乾燥し、得られた混和物を 8週令の雄性 ICRマウスの大腿筋内に埋め込み、 21日後に大腿部を摘出し、皮膚を剥離した後、钦 X線写真撮影により、骨，軟骨石灰化組織の発現率を検討した。表 2にその結果を示す。 1 jLt ₉ , 部位以上の用量においてその発現を認め、 10// 9/部位以上の用量において用いられたマウス全例にその発現を認めた。

表 2

~ MP 52タンパク質の用量 *骨 ·軟骨石灰化組轍の発現率対照（type-〖コラーゲン単独） 0Z4

部位 3 4 10#gノ部位 4Z4

100 g /部位 4/4

*各群 4例における実験の骨 ·钦骨石灰化組織の软 X線写真撮影解析による発現率を示す。また、図 2に各用量における典型的な骨 ·軟骨石灰化組織の钦 X線写真像を示す。図 2において、 Aは MP52タンパク質 1 部位、 Bは MP 52タンパク質 10/ g/部位、 Cは MPタンパク質 100 9ノ部位の用量でそれぞれ MP52タンパク質をマウス大腿筋肉に埋め込んだ例の結果を示す。この結果より、用量依存的な骨 · ί欠骨石灰化組織の増加が認められた。さらにこれらマウスの大腿部を、固定後、非脱灰切片を作成し、フォンコッサ（von Kossa) 染色、アルシアンブルー（Alcian blue) 染色、およびへマトキシリン -ェォシン（Hematoxylin-eosin) 染色をそれぞれ実施した。

図 3に、本タンパク質 10〃9/部位の用量において type- 1 コラーゲンとともに埋め込まれた標本の組織染色の顕微鏡写真を示す。図 3において、 Aはフォンコッサ染色、 Bはアルシアンブルー染色、 Cはへマトキシリンーェォシン染色をそれぞれ示す。

図 3 ( A )において、矢印 ctの部分は石灰化組織を示し、矢印 ccの部分は石灰化軟骨細胞を示す。図 3 ( B )において、矢印 rcの部分は残存钦骨組織を示す。図 3 ( C )において、矢印 ad部分は脂肪細胞、矢印 bm部分は骨髄細胞、矢印 lb部分は層板骨、矢印 ob部分は骨芽細胞、矢印^部分は線維性骨をそれぞれ示す。図 3から、 MP52タンパク質の投与により、骨芽細胞、骨髄細胞、石灰化軟骨細胞が生成し、骨 ·软骨石灰化組織が形成されることが明らかである。

実施例 4の結果から、本発明のタンパク質の二量体は、钦骨 ·骨誘導作用を有することが明らかとなった。

( 2 ) 異所性骨化作用の経時的解析

実施例 3により得られたタンパク質約 3 を含有する実施例 4 (1)に記載された方法と同様に調製した凍結乾燥物を I CRマウスの大腿筋中に埋め込み、 3、 7、 10、 14、 21および 28曰後に組織を摘出、 10%ホルマリンで固定後、それらの組織切片にへマトキシリン-ェオシン染色（HE) およびフォンコッサ染色（von Kossa) を施した。図 4にその染色切片の光学顕微鏡写真像を示す。

3日目（図 4 A、 HE) において、埋め込まれたコラーゲン線維（co) と周囲の筋組織（m ) との間に、形態学的には結合織性細胞を含む未分化間葉系細胞（mc) の出現が認められた。 7日目（図 4 B、 HE) から 10 曰目（図 4 C、 HE) にかけて、この部位には未分化間葉系細胞（me) が集積 ·増殖し、未分化間葉系細胞の肥大化および前钦骨様組織への変化が認められた。 14日目（図 4 D、 HE；図 4 E、 von Kossa) において、石灰化钦骨組織（矢印 cc) および骨組織（矢印 b ) の形成を認めた。 21日目（図 4 F、 HE；図 4 G、 von Kossa)において、骨髄細胞（矢印 bm) の形成が見られる一方、 14曰目に観察された石灰化钦骨組織はほとんど認められず、石灰化钦骨組織が骨組織（矢印 b ) に変換されたものと考えられた。 28曰目（図 4 H、 HE) において、広範囲に骨髄細胞（bra) が認められ、形成された骨組織（b ) は、吸収過程にあるようであった。このように、 r!IP52は、従来 BMPsについて明らかにされているように異所性に軟骨組織を誘導し、引き続き、軟骨内骨形成を引き起こすことができる夕ンパク質であることが明らかであった。

( 3 ) 膜内骨化に対する作用

実施例 3により得られたタンパク質を 0. 01 %ヒト血清アルブミンを含む生理的リン酸緩衝液（pH3. 4) に溶解し、 0. 01 ^ 9/20 ^ 0.

を調製し、その 20 をスプラグドーレー系ラットの左右の頭頂骨のうちその一方の骨膜に生後 1曰目から、マイクロシリンジを用いて一日一回、 12日間連日同一部位に注射した。他方の頭頂骨骨膜内には同量のその溶媒を注射した。また、両方の頂骨骨膜にその溶媒を注射し、比較対照とした。最終投与一曰後に、左右頭頂骨を摘出 ·固定後、投与部位を横断する脱灰へマトキシリン -ェオシン染色標本を作成し、左右頭頂骨投与部位の厚さを顕微鏡写真上にて測定し、同一個体における溶媒投与部位の厚さに対する本発明の蛋白質投与部位の厚さの比を算出した。表 3にその結果を示す。また、図 5に本発明の蛋白質 0. 1 // 9 20 ^ を連铳注射した場台の組織切片の光学顕微鏡写真像の一例（図 5 B ) を反対側溶媒投与群のそれ（図 5 A ) とともに示す _c 本発明の蛋白質投与により、骨膜細胞（p ) の活性化および増殖が認められるとともに、活性化された骨芽細胞（矢印 ob) が頭頂骨内および骨膜（p ) との境界領域に数多く出現し、用量依存的に頭頂骨（b ) の厚さが投与部位において増す事が明らかである。このことは、本発明の蛋白質が、少なくとも局所注入した場合、膜骨化を亢進し、骨粗鬆症、骨折ならびに歯槽、歯根欠損の治療に有用であることが示された。表 3 本発明の蛋白質の用量投与部位の頭頂骨の厚さ（ μ ») ― 厚さの比

( ₉Ζ部位 Ζ曰）溶媒投与（Α) 本発明の蛋白質投与（Β ) ( Β/Α)

0 (溶媒） 128土 7 141±20 1. 10±0. 16 0. 01 134± 9 167±30 1. 27±0. 33 0. 1 119±19 190±29 1. 60±0. 10* 1 132土 9 225±25 1. 70±0. 14** 頭頂骨の厚さおよびその比の値は、 4例の平均値土標準偏差を示す。

* ρ <0. 05、 * * ρ <0. 01 対左右頭頂骨溶媒投与群（ウイリアムズ法）

( 4 ) 関節钦骨の再生に対する効果

6匹の 12週令の雄性家兎（ニュージーランドホワイト）の右側膝部の皮膚および関節包を切開の後、腱を損傷しないように大腿骨の膝蓋骨溝を露出し、その部位に歯科用ドリルを用いて直径 5 ««の骨髄腔まで貫通した関節钦骨 ·骨欠損を作成し、その欠損部位に実施例 3により得られたタンパク質約 10 // 9含有または非含有タイプ- I コラーゲン凍結乾燥物を実施例 4 (1)に記載された方法と同様に調製し、 3例ずつ埋め込み、関節包および皮) *を縫合し、 3週間後に、大腿骨頭を摘出 ·固定後、全例の脱灰組織切片を作成し、アルシアンブルー染色を行った。図 6にそれぞれの典型的一例の光学顕微鏡写真像を示す。タイプ- I コラーゲン凍結乾燥物のみを埋め込んだ場合（図 6 Αおよび 6 Β ) 、欠損部位（矢印 d ) には線維性の組織（ f ) を認めるのみであつたが、実施例 3により得られた本発明のタンパク質約 10 ^ 9含有タイプ- I コラーゲンを埋め込んだ場合（図 6 Cおよび 6 D ) 、欠損部位に細胞外にアルシアンブルー染色陽性の基質の沈着を伴った、钦骨細胞（ch) の形成を認めた。また、その形成された組織は、正常関節軟骨組織において観察される静止細胞層、増殖細胞層、肥大細胞層といった層状構造に類似の細胞構成構造を欠損部位の外側から内側へと構築していた。これらの所見は、用いられた家兎のいずれにおいても認められ、本発明のタンパク質が、钦骨の再生、特に、変形性関節症または骨関節炎等により引き起こされた関節軟骨変性組織の正常組織への回復に有効であることを示している。

( 5 ) 骨折 ·骨欠損に対する治癒効果

30匹のスプラグドーレー系雄性ラット（約 15週令）を用い、大腿部の皮膚組織を切開、周囲筋肉組織から大腿骨を露出させ、大腿骨骨幹部中央に歯科用ドリルにて 5 «»の円柱状の骨欠損部を作成、残存大腿骨両端をステンレス製ネジを用いてポリエチレン製のプレー卜で固定した。実施例 3により得られたタンパク質 0、約 1、 10または 100 / 9含有タイプ - I コラーゲン凍結乾燥物をその骨欠損部位に埋め込み、皮膚組織を縫合した。埋め込み直後および 12週目においてそれらの软 X線写真撮影を行った結果を図 7に示す。図 7 Aは骨欠損作成時の写真である。図 7 B 〜Eに示されている如く、タイプ- I コラーゲン単独（図 7 B )および本研究のタンパク質 1 含有タイプ- I コラーゲン（図 7 C ) の埋め込みでは 12週目において欠損部両端からの若干の仮骨（矢印 cs) の形成を認めたのみであり、骨癒合には至らなかった。一方、 10または 100 9 含有タイプ- I コラーゲン（図 Dおよび図 E ) の埋め込みではその骨欠損部位全体に亙って仮骨（矢印 cs) の形成を認め、 X線上で骨癒台を認めた。 12週目において大腿骨を摘出、ポリエチレン製プレー卜をはずし, 二重 X線吸収法（Aloka, DCS-600) により 1 ««間隔のスキャンニングモ一ドで骨欠損作成部を含む大腿骨長軸方向 15««を連続的にその方向に対して垂直に走査し、作成骨欠損中央部 3 相当部位における骨塩量を積算するとともに両骨端を樹脂で固定し、骨強度測定装置（マルトー製作所、 MZ- 500D)に装着し、 180° 分のスピードで下部樹脂で回転させ、大腿骨を破壌するのに必要な最大ねじり力を測定した（表 4 ) 。本発明のタンパク質のラット大腿骨欠損部位への埋め込みはこのように、用量依存的にその部位での骨塩量を増加させるとともに、その部位の骨強度 (ねじり力）を上昇させることが示され、本発明のタンパク質が、骨折の治癒および骨欠損部における骨再建に有効であることを示している。

表 4

本発明の蛋白質のラット大腿骨骨欠損部最大ねじり力

用量（ 9 部位）における骨塩量（《9) (kgf - c«) 例数コ一ゲン単独 120.2±24.5 2.92±0.09 6

1 176.9±36.4 6.24±1.00 8

10 277.4±63.9 9.35±3.14 8 100 374.8±67.1* 40.34±7.64* 8 平均値土準誤差を示す。

* p <0.05 対コラーゲン単独群（Students' s t-test) 産業上の利用可能性

配列表配列番号 1記載のァミノ酸配列を有するタンパク質の二量体からなるタンパク質は軟骨 ·骨誘導活性を有し、軟骨、骨疾患の治療剤として有用である。さらに本発明の夕ンパク質の発現べクターを改変することにより大腸菌を用いた遺伝子工学の手法により工業的な規模で純粋な形で該タンパク質を製造することが可能である。

配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 1 1 9

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直線状配列の種類：ぺプチド

フラグメント型： N末端フラグメント

起：

生物名：ヒ卜 ( homo sapiens)

組織の種類：ヒト胎児

配列の特徴：

存在位置：

他の情報： MP52ァミノ酸配列の 383番目から 501番目のァミノ酸配列。配列：

CCA CTG GCC ACT CGC CAG GGC AAG CGA CCC AGC AAG AAC CTT AAG GCT 48 Pro Leu Ala Thr Arg Gin Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala

5 10 15

CGC TGC AGT CGG AAG GCA CTG CAT GTC AAC TTC AAG GAC ATG GGC TGG 96 Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp

20 25 30

GAC GAC TGG ATC ATC GCA CCC CTT GAG TAC GAG GCT TTC CAC TGC GAG 144 Asp Asp Trp lie lie Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu

35 40 45

GGG CTG TGC GAG TTC CCA TTG CGC TCC CAC CTG GAG CCC ACG AAT CAT 192 Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His

50 55 60

GCA GTC ATC CAG ACC CTG ATG AAC TCC ATG GAC CCC GAG TCC ACA CCA 240 Ala Val lie Gin Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro 65 70 75 80 CCC ACC TGC TGT GTG CCC ACG CGA CTG ACT CCC ATC AGC ATC CTC TTC 288 Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro lie Ser He Leu Phe

85 90 95

ATT GAC TCT GCC AAC AAC GTG GTG TAT AAG CAG TAT GAG GAC ATG GTC 336 lie Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gin Tyr Glu Asp Met Val

100 105 110

GTG GAG TCG TGT GGC TGC AGG 357 Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg

115 配列番号： 2

配列の長さ： 27

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直線状

配列の種類：他の核酸

起源：なし

生物名：なし

株名：なし

配列の特徴： MP52成熟型単離用順方向 PCRプライマ一。

配列：

ATAATGCCAC TAGCAACTCG TCAGGGC 27

配列番号： 3

配列の長さ： 26

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直線状

配列の種類：他の核酸起源：なし

生物名：なし

株名：なし

配列の特徴： MP52成熟型単離用逆方向 PCRプライマー。配列：

CGTCGACTAC CTGCAGCCAC ACGACT 26

Claims

請求の範囲

1 . 配列表配列番号 1記載のァミノ酸配列を有するタンパク質。

2 . 請求項 1記載のタンパク質の二量体からなるタンパク質。

3 . 請求項 2記載のタンパク質を有効成分とする钦骨、骨疾患治療剤。

4 . 钦骨、骨疾患が骨粗鬆症である請求項 3記載の軟骨、骨疾患治療剤。

5 . 钦骨、骨疾患が変形性関節症または、骨関節炎である請求項 3記載の钦骨、骨疾患治療剤。

6 . 軟骨、骨疾患が骨折、骨欠損である請求項 3記載の軟骨、骨疾患治療剤。

7 . 钦骨、骨疾患が歯根，歯槽の欠損である請求項 3記載の钦骨、骨疾患治療剤。

8 . 請求項 1のタンパク質を発現しうる DNA配列を含むプラスミドで形質転換した大腸菌を用いて請求項 1のタンパク質を製造する方法。

9 . 配列表配列番号 1記載のアミノ酸配列をコードする DNA配列の 5プライム末端にメチォニンをコードするコドンを付加した DNAを含有するプラスミドを構築することを特徴とする請求項 8の製造方法。

10. 配列表配列番号 1記載のァミノ酸配列をコードする DNA配列の 5プライム末端にメチォニンをコードするコドンを付加した DNAを含有するプラスミドを構築し、そのプラスミドで大腸菌を形質転換し、その大腸菌を培養することよって得られるインクルージョンボディを可溶化し、精製することによって得られる単量体のタンパク質を二量体に再生し、これを精製することを特徴とする請求項 2のタンパク質の製造方法。

11. 請求項 2記載のタンパク質を投与することからなる钦骨、骨疾患の治療方法。

12. 软骨、骨疾患が骨粗鬆症である請求項 11の治療方法。

13. 軟骨、骨疾患が変形性関節症または骨関節炎である請求項 Πの治療法。

14. 钦骨、骨疾患が骨折、骨欠損である請求項 11の治療方法。

15. 钦骨 ·骨疾患が歯根、歯槽の欠損である請求項 11の治療方法。