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WO1996031624A1 - Methode de detection des cellules mammaires cancereuses - Google Patents

Methode de detection des cellules mammaires cancereuses Download PDF

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Publication number
WO1996031624A1
WO1996031624A1 PCT/JP1996/000897 JP9600897W WO9631624A1 WO 1996031624 A1 WO1996031624 A1 WO 1996031624A1 JP 9600897 W JP9600897 W JP 9600897W WO 9631624 A1 WO9631624 A1 WO 9631624A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
chromosome
breast cancer
cells
aneuploidy
detection method
Prior art date
Application number
PCT/JP1996/000897
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Johji Inazawa
Original Assignee
Daikin Industries, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daikin Industries, Ltd. filed Critical Daikin Industries, Ltd.
Priority to AU51235/96A priority Critical patent/AU706212B2/en
Priority to EP96907754A priority patent/EP0819767A4/en
Publication of WO1996031624A1 publication Critical patent/WO1996031624A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to the following methods: (1) chromosome 1 and chromosome 11; (2) chromosome 1 and chromosome 17; or 3 chromosome 1 and chromosome 11 and chromosome 17. (Aneusomy) is detected to identify whether the test cell is a breast cancer cell or not. (1) One or both of chromosome 1 and chromosome 11, (2) Chromosome 1 and chromosome 17 If one or both, or 3 Chromosome 1 and / or at least one of Chromosome 11 and Chromosome 17 are detected as abnormal, aneuploidy (An eusomy) is judged as a breast cancer cell
  • the present invention relates to a method for detecting breast cancer cells, and a kit used for carrying out the method.
  • numerical abnormalities and aneuploidy are defined as the deletion of one of the monosomes (Monosomy / chromosome).
  • polysomy Polysomy / addition of one or more chromosomes, resulting in three or more chromosomes of a particular type in a cell).
  • Imaging diagnosis and tumor marker diagnosis are only indirect and auxiliary, and it is difficult to accurately determine whether the test cells are benign or malignant. Therefore, the importance of diagnostic results such as atypia and invasiveness by cytology using specimens such as puncture aspiration materials has been emphasized at present.
  • An object of the present invention is to provide a simple, rapid, and highly accurate method for detecting breast cancer cells that can be applied to clinical examination of actual breast cancer cells.
  • microsatellite markers ⁇ 53 (17 ⁇ 13.1) (. ⁇ Jones et al., Genes Chromosomes Cancer, 5> 89, 1992) and AFM207Xall (17pl3.3.3) (G. Grapay et al. , Nat. Genetics, 7, 246, 1994).
  • AFM207Xall 17.pl3.3.3
  • a breast cancer cell can be determined when a numerical abnormality or aneuploidy is detected in at least one of human chromosomes 1, 11, and 17 in a test cell.
  • chromosome 1 numerical abnormalities and aneuploidy (Aneusoray) were found in 64 (87.7%) of 73 breast cancer cases.
  • chromosome 11 48 out of 73 breast cancer cases (65.8%) showed numerical abnormalities and aneuploidy (Aneusomy).
  • breast cancer cells were also detected by this detection system in three cases (breast cancer cases Nos. 2, 4 and 5 in Example 1) determined to be class 111 by conventional cytology before surgery.
  • breast cancer cases Nos. 2, 4 and 5 in Example 1 determined to be class 111 by conventional cytology before surgery.
  • two cytoplasmic papillomas (the benign tumors Nos. 6 and 7 in Example 1), which are considered to be the most difficult to determine before surgery, were classified into class IV by conventional cytology.
  • the detection system was able to accurately determine that the cells were benign.
  • nipple secretion fluid puncture suction material, duct washing solution, scraping material for erosion surface of nipple and areola, marking smear of surgical extirpation material and the like can be used.
  • these samples contain at least 100 cells or more.
  • collect the cells contained in the sample by centrifugation or the like in advance.
  • fix with an organic solvent an alcohol such as methanol or ethanol
  • an acid acetic acid
  • a cross-linking agent formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde, etc.
  • hypotonic treatment with a 0.075 M KC1 solution or the like may be performed by a conventional method.
  • Fixed cells may be in solution or in slurry. After being spread on a glass plate, it can be subjected to various in situ hybridization reactions.
  • the fluorescence in situ hybridization (FI SH) method is preferred, but each has a different ligand or label.
  • the probe used to carry out the present invention by the FISH method is not particularly limited, and a probe having a specific sequence on each of chromosome 1, chromosome 11, and chromosome 17 is used.
  • a painting probe specific to each chromosome eg, Whole Chromosome Painting System manufactured by BRL
  • various satellite DNAs (1, II, III, IV, a, / 3, etc.
  • probes containing telomere sequences Eg, manufactured by 0NC0R, etc.
  • Chromosome 1-specific probes include chromosome 1-specific satellite pUCl.77 (HJ Cooke et al., Nucleic.
  • Probes prepared from plasmid pSD1-1 containing ⁇ -satellite DNA are preferred.
  • Chromosome 11-specific probes include cCRll (see Example 1) and plasmid pLCllA containing chromosome 11-specific ⁇ satellite DN ⁇ (J.S.Waye et al., Chromosoina,
  • chromosome 17-specific probes include CCI17-321 (J. Inazawa et al., Genomics, JJ, 153, 1993) and plasmid pl7H8 containing chromosome 17-specific ⁇ satellite DNA (JSWaye et al., Mol. Cell. Biol., 63156, 1986) are preferred.
  • Ligands that can bind to specific lipomolecules overnight include piotin, digoxigenin, and both.
  • a probe containing biotin and a probe containing digoxigenin are separately prepared in advance.
  • each probe can be used separately, such as fluorescein isothiosinate, carboxymethylindocyanin succinimidyl ester, rhodamine, Texas red (sulfolodamine), tetramethylrhodamine isothiosinate, or 7-amino-4-methylcoumarin-13-acetic acid. It may be directly labeled with various fluorescent labels.
  • the present invention extracts DNA from cells before fixation contained in the above-mentioned specimen by a standard method, and 1) chromosome 1 and chromosome 11, 2) chromosome 1 and chromosome 17, or 3 chromosome 1 and chromosome 11 Alternatively, it can be carried out by Southern hybridization using a polymorphism marker suitable for detecting anomalies and aneuploidy (Aneusomy) on chromosome 17.
  • the present invention extracts DNA from cells before fixation contained in the above-mentioned specimen by a standard method, and can be used for (1) chromosome 1 and chromosome 11, (2) chromosome 1 and chromosome 17, or 3 chromosome 1 and chromosome 11
  • the present invention can be carried out by using a minisatellite or microsatellite marker suitable for detecting a numerical abnormality / aneuploidy (Aneusomy) on chromosome ⁇ .
  • the method of searching for LOH using microsatellite polymorphism is being introduced as a genetic diagnosis technique because it is simpler than the conventional Southern hybridization method.
  • the inclusion of normal cells in the collected tumor specimen makes it difficult to determine LOH, and false positives such as "no deletion" may occur.
  • the cancer cell detection method using the FI SH method sufficiently overcomes this problem.
  • the present invention also relates to a simple, rapid and highly accurate kit for detecting breast cancer cells.
  • a kit according to the invention may include, for example, the following reagents:
  • Chromosome 1 specific probe (2) Chromosome 11 specific probe; (3) Hybridization solution; (4) Washing solution; (5) Staining solution.
  • Chromosome 1 specific probe (2) Chromosome 17 specific probe; (3) Hybridization solution; (4) Washing solution; (5) Staining solution.
  • Chromosome 1 specific probe (2) Chromosome 11 specific probe; (3) Chromosome 17 specific probe; (4) Hybridization solution; (5) Wash solution;
  • a total of 21 benign tumors and 14 malignant tumors shown in Table 1 and Table 2, respectively, were subjected to puncture suction using a 21-gauge injection needle, and the obtained puncture suction material was The tube was transferred to an eppendorf tube containing 0. lral 75 mM KC1 solution and incubated at room temperature for 30 minutes. Then, an equal volume of Carnoy's solution (acetic acid: methanol solution 1: 3) was added to fix the cells. After centrifugation, the supernatant was removed, and the cells were suspended again in Carnoy's solution and dropped on a slide glass. After fixing by fire or air drying, drying was performed at 70 ° C for 5 hours.
  • the cosmid clone cCRll containing the chromosome 11 centromere region-specific sequence was prepared by the method of Tanigami et al. (A. Tanigami et al., Am. J. Hum. Genet., 50, 56, 1992; Tanigami et al., Protein Nucleic Acid Enzyme, ⁇ , 244, 1993; Laboratory Manual for Human Genome Mapping, p. 41, Masaaki Hori, edited by Yusuke Nakamura, Maruzen Co., Ltd., 1991).
  • a cosmid library was prepared from Chinese hamster X human hybrid cells having only chromosome 11 as human DNA. (T. Tokino et al., Am. J, Hum. Genet., 48.258, 1991) That is, didomic DNA was extracted from the cells and partially cut with the restriction enzyme Sau3AI. A fraction containing a DNA fragment of 35 to 45 kb was obtained by sugar density gradient centrifugation. The cut end was partially filled in by the action of the Klenow enzyme in the presence of dATP and dGTP.
  • the obtained DNA fragment was cut with a restriction enzyme Xhol, and the cut end was inserted into a cosmid vector pWEX15 partially filled in by the action of the Klenow enzyme in the presence of dCTP and dTTP by a ligation reaction.
  • the obtained cosmid clone having the inserted DNA derived from human chromosome 11 was obtained by a conventional method (J. Sarabrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Isolated and purified.
  • the localization of the DNA fragment derived from chromosome 11 contained in the obtained cosmid clone was determined by the method of Inazawa et al. (J. Inazawa et al., Genomics> 10 1075, 1991; J. Inazawa et al., Genomi cs, II, 153, 1993) by the FI SH method.
  • a pre-replication metaphase R staining chromosome specimen was prepared by the thymidine-synchronized ZBrdU release method (E. Takahachi et al., Hum. Genet., M, 14, 1990).
  • the slides were then denatured in 70% formamide Z2XSSC (0.3M NaCl; 0.03M sodium citrate) for 75, 2-5 minutes.
  • Cosmid DNA probes were prepared by the standard method (Cell Engineering Separate Volume, “Experimental Protocol Series“ FI SH Experimental Protocol ”, Part 2, Chapter 2, supervised by Ken Matsubara and others, Shujunsha) , 1994) using nick translation method with biotin-16-dUTP (Boehringer). Short-chain salmon sperm DNA and E. coli tRNA were added to the labeled cosmid probe, recovered by ethanol precipitation, and then dissolved in formamide.
  • PI propidium iodide
  • lig / ml was added to it, and an anti-fading reagent containing 1% DABC 0 (1,4-diazabicyclo [2.2,2] octane) (manufactured by Sigma) was added.
  • FXA Fluorescence microscope
  • PUCl.77 containing the centromere-specific region of chromosome 1 (HJ Cooke et al., Nucleic Acids Res., 6, 3177, 1979) and cC R11 containing the centromere-specific region of chromosome 11 are obtained by standard methods (Cell Engineering Supplement Nick-transformer using biotin-16-dUTP (Boehringer) according to the protocol series "FI SH Experiment Protocol", supervised by Part 2, Chapters 2 and 11, Kenichi Matsubara et al., Shujunsha, 1994) Labeled by the ration method. Similarly, it contains cCRll and the chromosome 17 centromere-specific region.
  • CI17-321 was labeled by the nick translation method using digoxigenin-11-dUTP (Boehringer). Short-chain salmon sperm DNA and E. coli tRNA were added to the labeled probe, recovered by ethanol precipitation, and dissolved in formamide.
  • the slide obtained in (1) was denatured for 4 minutes in 75% 70% formamide 2 ⁇ SSC. After immersing in a 70% ethanol solution at -20 ° C for 2 to 5 minutes at -20 ° C, dehydration was performed using an ethanol series.
  • a biotin-labeled cCRll probe solution (50 ng / il) and a digoxigenin-labeled cCRll probe solution (50 ng /) Ul were mixed in a ratio of 7: 3.
  • CCRll piotin / digoxigenin mixture PUCl.77 probe solution (50 ng / ⁇ l) labeled with piotin, cCI17-321 probe solution (50 ng / 1) labeled with digoxigenin and cCRll piotin Z digoxigenin mixture (50 ng /; tl) : 4: 3 (V / V).
  • 1.0 / l of Cot-1 DNA 5 mg ml was added to the mixture 9.
  • the final mixture was denatured at 70 for 10 minutes and then cooled on ice for 5 minutes before adding an equal volume of 20% dextran sulfate Z4 XSSC. After prehybridization for 20 minutes at 37 ° C, the hybridization solution was placed on a slide that had been denatured previously. After being covered with parafilm, the cells were hybridized in a sealed humidity box for 24 to 48 hours. After washing with 50% formamide / 2 x SSC, 2 x SSC, 2 x SSC, and 1 x SSC, respectively, for 15 minutes, slides were washed with avidin-FITC (5 g / ml) (Boehringer) and rhodamine anti-digoxigenin.
  • avidin-FITC 5 g / ml
  • the cells were incubated in 1% Block Ace TM (Dainippon Pharmaceutical) / 4XSSC containing an antibody (l ⁇ g / ml) (Boehringer) at 37 for 40 minutes.
  • the signal from the chromosome 1 centromere region is green (FITC), the signal from the chromosome 17 centromere region is red (rhodamine), and the signal from the chromosome 11 centromere region is yellow (a false signal synthesized by the fluorescence of FITC and rhodamine). It is detected as a spot of similar color.
  • FITC green
  • rhodamine red
  • rhodamine red
  • the signal from the chromosome 11 centromere region is yellow (a false signal synthesized by the fluorescence of FITC and rhodamine). It is detected as a spot of similar color.
  • Example 2 As in Example 1, two slides per case were used for a total of 74 cases, including 15 benign tumors (Table 3) and 59 malignant tumors (Tables 4 to 6) not included in Example 1. Was prepared.
  • PUCl.77 containing the chromosome 1 centromere-specific region (HJ Cooke et al., Nucleic. A cids Res., 6, 3177, 1979) and cCI17-321 containing the chromosome 17 centromere-specific region were obtained by standard methods (cell Engineering Separate Volume ⁇ Using the otin-16-dUTP (manufactured by Boehringer Co., Ltd.) by the experimental protocol series “FI SH Experimental Protocol”, supervised by Kenichi Matsubara et al., Shujunsha, 1994, Part 2 Chapters 2 and 11 The nick translation method was used.
  • cCRll containing a chromosome 11 centromere-specific region was labeled by nick translation method using digoxigen in-11-dUTP (manufactured by Behringer). Short-chain salmon sperm DNA and E. coli tRNA were added to the labeled probe, recovered by ethanol precipitation, and dissolved in formamide.
  • the procedure was performed in substantially the same manner as (4) in Example 1, except that the three-color FISH method using three types of probes at once was not performed. 2 per sample prepared in (1)
  • One of the slides was first subjected to a two-color FISH method using probes specific to chromosomes 1 and 11, resulting in numerical abnormalities on chromosomes 1 and 11.
  • the other slide was subjected to the FISH method using a chromosome 17-specific probe, and the presence or absence of chromosome 17 aneuploidy (Aneusomy) was examined.
  • hybridization solution was placed on a previously denatured slide. After the parafilm was applied, hybridization was performed in a sealed wet box at 37 ° C for 24-48 hours. Wash with 50% formamide 2 XSSC at 37 ° C for 15 minutes, then with 2 x SSC and 1 x SSC at room temperature for 15 minutes, and slide the slides in avidin-FITC (5 ⁇ g / ml) 1% Block Ace TM (manufactured by Boehringer) and Rhodamine anti-digoxigenin antibody (l ⁇ g / m 1) (Dainippon Pharmaceutical) No. Incubate in 4 x SSC for 37 ⁇ 40 minutes did.
  • the number of signals derived from these two types of probes was counted using a low-pass filter (manufactured by Omega Optical).
  • the signal derived from the chromosome 1 centromere region is detected as a green (FITC), and the signal derived from the chromosome 11 centromere region is detected as a red (rhodamine) spot.
  • FITC green
  • rhodamine red
  • If the interphase nucleus in which the number of signals derived from each probe is abnormal is more than 20%, it is judged that there is a numerical abnormality or aneuploidy (Aneusomy). 2 Denatured in XSSC for 75 to 2 to 5 minutes. After immersion in a 70% ethanol solution of —20 for 3 minutes, the mixture was dehydrated with an ethanol series.
  • Formamide 6.01 was added to 3.01 of the CCI17-321 probe solution (30 ng / tl) labeled with biotin.
  • the mixture was denatured at 70 for 10 minutes, cooled on ice for 5 minutes, and an equal volume of 20% dextran sulfate / 4XSSC was added. After prehybridization for 10-20 minutes at 37, the hybridisation solution was placed on previously denatured slides. After being covered with parafilm, the cells were hybridized in a sealed wet box at 37 to 24 to 48 hours.
  • DAPI 4, 6-diamidino-2-phenyl indole
  • 1% DABC 0 1,4-diazabicyclo [2,2,2] octane
  • the anti-fading reagent was added, covered with a cover glass, and detected with a Nikon fluorescence microscope FXA. Screen interphase nuclei stained with DAPI through a UV-2A filter, physically intact and not in contact with each other, for more than 100 complete interphase nuclei, B-
  • the number of signals derived from the CCI17-321 probe was counted using a 2E filter. Chromosome 17 The signal is detected as a green (FITC) spot.
  • FITC green
  • Tables 3 to 6 show the results of FISH analysis of these two slides.
  • Table 3 shows the results for benign tumor cells, and
  • Tables 4 to 6 show the results for breast cancer cells.
  • Fibroadenoma fibroadenoma. Fibroadenoma. Fibroadenoma. Fibroadenoma. Fibroadenoma. Fibroadenoma. Fibroadenoma.
  • chromosome 1 and chromosome 11 in cells contained in specimens such as nipple secretion fluid, puncture suction material, ductal lavage fluid, scraping material of nipple and areola erosion surface, or marking smear of surgically removed material Chromosome, 2 Chromosome 1 and chromosome 17, or 3 Chromosome 1 and chromosome 11 and chromosome 17 Numerical abnormalities.
  • aneuploidy Aneusomy
  • test cells (1) one or both of chromosome 1 and chromosome 11, (2) one or both of chromosome 1 and chromosome 17, or 3 chromosome 1 and
  • aneuploidy Aneusomy
  • the test cells are determined to be breast cancer cells.

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Description

明細書 乳ガン細胞の検出方法 技術分野
本発明は、 被験ヒト細胞中の、 ①第 1染色体及び第 11染色体、 ②第 1染色体及 び第 17染色体、 または③第 1染色体及び第 11染色体及び第 17染色体の数的異常 · 異数性 （Aneusomy) を検出することにより、 被験細胞が乳ガン細胞か否かを識別 することを特徴としており、 ①第 1染色体及び第 11染色体のいずれか一方または 両方、 ②第 1染色体及び第 17染色体のいずれか一方または両方、 または③第 1染 色体及び第 11染色体及び第 17染色体の少なくとも 1種類に数的異常 ·異数性 （An eusomy) が検出された場合に乳ガン細胞であると判定することを特徵とする、 乳 ガン細胞の検出方法、 及び該方法の実施に使用するキッ卜に関する。 なお、 本明 細書において、 数的異常 ·異数性 （Aneusomy) とは、 モノソミー （Monosomy/染 色体の 1本が欠失すること その結果細胞内の特定の種類の染色体は 1本になる
) またはポリソミー （Polysomy/染色体が 1本以上増加することノその結果細胞 内の特定の種類の染色体は 3本以上になる） を意味する。
背景技術
我が国における乳ガンの罹患率及び死亡率は、 食生活を中心とする生活環境の 欧米化などにより年々増加しつつあり、 現在乳ガンによる死亡数は子宮ガンの死 亡数を超え、 近 I、将来日本人女性のガンによる死亡原因の第 1位を占めることが 予想されている。
乳ガンを診断する際には、 まず視触診を行い、 腫瘍等の異常が認められた場合 は、 マンモグラフィ、 超音波、 サ一モグラフィ等による画像診断、 乳頭分泌液 · 穿刺吸引材料 ·乳管洗浄液 ·乳頭及び乳輪部びらん面の擦過材料 ·手術摘出材料 の捺印スメァ等の検体を用いる細胞診や生検といった病理診断や腫瘍マーカー等 による免疫学的診断等を行うのが一般的である。
画像診断並びに腫瘍マーカー診断はあくまで間接的、 補助的であり、 被験細胞 の良性，悪性の正確な判断を下すことは困難である。 従って、 現在では穿刺吸引 材料等の検体を用いる細胞診による異型性、 浸潤性等の診断結果が重要視されて いる。
しかしながら細胞診による悪性度診断の解釈は人によつて若干異なるために客 観性に欠ける。 従って一握りの熟練者の経験に頼るところが大きく、 ガン細胞の 検出精度は必ずしも高くはな t、。 穿刺吸引材料を用 L、る細胞診の偽陰性率は 10% 以上にも上ると言われている （H. Strawbridgeら、 Surg. Genecol. Obstet.、 152 1、 1981 ) 。 実際悪性度クラス I I〜I I Iと判定された場合、 医師がその後の処置に ついての適切な判断を行うことが極めて困難であるのが実情である。
一方、 発ガンの過程で複数の遣伝子異常が多段階的に起こり、 その蓄積がガン を生物的にも臨床的にもより悪性の形質獲得へと導くことが明らかにされてきて いる。 これらの知見は、 既知のガン遺伝子の増幅や遺伝子産物の過剰発現、 ガン 抑制遺伝子の存在が推定されている染色体領域の欠失、 さらに多彩な染色体の過 剰変化を捉えることで、 正確なガン細胞の検出のみならず、 ガン細胞が多段階発 ガン過程の 「どのステージにあるか」 を知り、 その悪性度判定も可能であること を示唆している。
乳ガンにかかわるガン遺伝子としては、 c-rayc、 erbB、 erbB2、 PRAD1 等が知ら れている。 乳ガン組織ではこれらの遺伝子の増幅や遺伝子産物の過剰発現が認め られ、 これらの遺伝子変異がガンの悪性度や疾患の予後と深くかかわつているこ とが示唆されている。 また、 乳ガンに関与するガン抑制遺伝子の候補のうちです でに単離されているものとして、 P53、 Rb、 NM23, プロヒビチン （prohibitin) 、 BRCA1等がある。 （滝田賢一ら、 蛋白質 核酸 酵素、 ^、 305、 1993； Miki Y. , et al.、 Science, 2£6> 66、 1994) また現在までに乳ガンでは、 lp、 lq、 3p、 llp、 13q、 16q、 17 等でヘテロ接 合性消失 (Loss of heterozygosity. LOH) が報告されている。 （T. Satoら、 Can cer Res.、 50, 7184、 1990； L Takitaら、 Cancer Res.、 52. 3914、 1992； I. Bie cheら、 Cancer Res.、 53, 1990、 1993； R. Winqvistら、 Cancer Res.、 53, 4486 、 1993 ; L. C. Chenら、 Cancer Res.、 M、 3021、 1994) また lip と 17p の欠失と リンパ節転移との相関も示唆されている。 （K. Takitaら、 Cancer Res.、 52, 391 4、 1992) 17 では p53 の領域よりもテロメァ側 （Πρ13. 3) の欠失がリンパ節 転移と関係している。 また、 連鎖解析により早発型遺伝性乳ガンの原因遺伝子が 第 17染色体長腕 （17q21 ) に存在することが明らかになつている。 （滝田賢一ら 、 蛋白質 核酸 酵素、 、 305、 1993； Miki Y.ら、 Science、 266, 66、 1994) し かしながらそれぞれの染色体異常と乳ガンとの相関は必ずしも充分に高いとは言 えず （高くても 50数パーセント程度） 、 個々の遺伝子異常を一つ一つ症例毎に検 出することにより被験細胞が良性か悪性かを正確に判定することはできな t、ため 、 乳ガン細胞の高精度の検出法として実用化されているものはない。
従って、 実地の乳ガンの臨床に応用可能な、 簡便で高精度な乳ガン細胞の検 出方法の確立が強く望まれている。 発明の開示
本発明は、 実地の乳ガン細胞の臨床検査に応用可能な、 簡便で迅速で高精度な 乳ガン細胞の検出方法を提供することを課題とする。
患者乳腺腫瘤より穿刺吸引法にて回収した検体を用いて、 既にリンパ節転移と の相関が報告されている第 17染色体短腕 17pl3. 3 の欠失の有無を、 2 0症例 （ 良性腫瘤 7例、 悪性腫瘍 1 3例） で検討した。 腫瘤径は、 最小 12 x l2mm、 最大 50 x 30mniであった。 YNZ22のコスミッ ドマーカー （17pl3. 3) を新たに単雜し （M. Is omuraら、 Genes Chromosomes Cancer S> 173、 1994) 、 これと 17qll (cCI 17 - 3 21 ) マーカ一 （J. Inazawaら、 Genomics、 12、 153、 1993) とをプローブに用いた ダブルターゲッ ト ·マルチカラ一 F I S H (細胞工学別冊 ·実験プロトコールシ リーズ「F I S H実験プロトコール」 、 128ページ、 松原謙一他監修、 秀潤社、 1994) を行い、 シグナルを観察した。 良性腫瘤については 17pl3. 3 の欠失は全 く見られなかった。 悪性腫瘍については、 17ρ13· 3 の欠失は 13例中 8例 （67% ) と高頻度に検出され、 内 6例 （75% ) はリンパ節転移があった。 一方 17ρ13. 3 欠失なしと判定された 4例中 2例 （50% ) においてもリンパ節転移が認められた。 また、 これらの症例の一部でマイクロサテライトマ一カーの ΤΡ53 (17ρ13. 1) ( . Η· Jonesら、 Genes Chromosomes Cancer、 5> 89、 1992) 及び AFM207Xall (17pl3. 3) (G. Grapayら、 Nat. Genetics, 7, 246、 1994) を用いて L O Hの検索を行つ た。 情報が得られたもののうち、 F I S H法で欠失なしと判定した症例では L O Hはなく、 欠失有りと判定した症例においては、 いずれかのマ一カーで L O Hを 確認することができた。 このことは、 穿刺吸引法で腫瘤より直接採取した微量の サンプルを検体として、 F I S H法で染色体欠失の判定が正確に行えることを意 味している。
次に同様の穿刺吸引検体 （前述の良性腫瘤 7例、 悪性腫瘍 1 3例に、 良性腫瘤 1 5例、 悪性腫瘍 6 0例を加えた、 良性腫瘤計 2 2例、 悪性腫瘍計 7 3例、 表 1 〜 6の症例に相当） について、 第 1及び第 11及び第 17染色体の数的異常，異数性 (Aneusomy) の有無について、 各染色体のセントロメァ領域特異的プローブ （pU C1. 77、 cCRlU cCI17- 321) を用いた F I S H法によって調べた。 その結果、 驚 くべきことに、 良性腫瘤についてはこれら 3種類の染色体について数的異常 ·異 数性 （Aneusomy) は全く検出されなかったのに対して、 乳ガン 73症例中 68例 （93. 2% ) に、 第 1染色体、 第 11染色体のいずれか一方または両方に異常があること 、 乳ガン 73症例中 67例 （91. 8% ) に、 第 1染色体、 第 17染色体のいずれか一方ま たは両方に異常があることを見い出した。 即ち、 本発明者は、 被験細胞中のヒト 第 1染色体、 第 11染色体のいずれか一方または両方、 または第 1染色体、 第 17染 色体のいずれか一方または両方に数的異常 ·異数性が検出された場合に乳ガン細 胞であると判定できることを 、だして本発明を完成した。 なお、 本発明者らは
、 73症例中 70例 （95. 9% ) に、 t、験細胞中のヒト第 1染色体及び第 11染色体及び 第 17染色体の少なくとも 1種類に異常があることも見い出した。 即ち、 本発明者 は、 被験細胞中のヒト第 1染色体及び第 11染色体及び第 17染色体の少なくとも 1 種類に数的異常 ·異数性が検出された場合に乳ガン細胞であると判定できること も見い出した。 なお、 第 1染色体については、 乳ガン 73症例中 64例 （87. 7% ) に 数的異常，異数性 （Aneusoray) が見られた。 第 11染色体については、 乳ガン 73症 例中 48例 （65. 8% ) に数的異常 ·異数性 （Aneusomy)が見られた。 第 17染色体に ついては、 乳ガン 73症例中 38例 （52. 1 % ) に数的異常 ·異数性 （Aneusomy) が見 られた。 これらのことは、 各染色体単独の数的異常 .異数性 （Aneusomy) を調べ るだけでは、 正確な乳ガン細胞の検出ができないことを示している。
手術前に従来の細胞診によってクラス 111と判断された 3症例 （実施例 1中の 乳ガン症例 No. 2、 4および 5 ) についても、 本検出システムにより乳ガン細胞 が検出された。 また手術前には最も判断が難しいとされている乳管内乳頭腫 （in traductal papilloma) 2症例 （実施例 1中の良性腫瘤例 No. 6および 7 ) につい ても、 従来の細胞診ではクラス IVと判断されたが、 本検出システムにより正確に 良性細胞と判断できた。
本発明を F I S H法で実施するための検体としては、 乳頭分泌液、 穿刺吸引材 料、 乳管洗浄液、 乳頭及び乳輪部びらん面の擦過材料、 手術摘出材料の捺印スメ ァ等が用いられ得る。 これらの検体中には少なくとも 100個以上の細胞が含まれ ているのが望ましい。 液状の検体の場合は必要に応じて検体に含まれている細胞 を遠心分離操作等によりあらかじめ回収する。 次に定法により有機溶媒 （メタノ ールゃエタノール等のアルコール） 、 酸 （酢酸） または架橋剤 （ホルマリン、 パラホルムアルデヒド、 グルタルアルデヒド等） などにより固定する。 酢酸ノメ 夕ノール液 （ 1 : 3 ) で固定するのが好ましい。 固定する前に定法により 0. 075 M KC1 溶液等で低張処理してもよい。 固定された細胞は、 溶液中か、 またはスラ ィドグラス上に展開した後に種々のィンサイチュハイブリダィゼーション反応に 供することができる。 蛍光インサイチュハイブリダィゼーシヨン （F I SH) 法 が好ましいが、 それぞれ異なるリガンドもしくは標識を有する、 ①第 1染色体及 び第 11染色体、 ②第 1染色体及び第 17染色体、 または③第 1染色体及び第 11染色 体及び第 17染色体に特異的配列を有するプロ一ブを用いるマルチカラ一蛍光ィン サイチュハイブリダィゼーシヨン （F I SH)法で同時に検出するのが簡便であ る。 マルチカラー F I SH法を含むいろいろな F I SHの手法については、 細胞 工学別冊.実験プロトコールシリーズ「F I SH実験プロトコール」 （松原謙一 他監修、 秀潤社、 1994) に詳しく記載されている。
本発明を F I SH法で実施するために使用されるプローブとしては、 特に制限 はなく、 第 1染色体、 第 11染色体、 第 17染色体にそれぞれ特異的な配列を有する プローブが用いられる。 例えばそれぞれの染色体に特異的なペインティングプロ ーブ （例えば BRL社製、 Whole Chromosome Painting System) 、 各種サテライ ト DNA (1、 II、 III、 IV、 a、 /3等） やテロメァ配列を含むプローブ （例えば 0NC0R社製他） やその他の部位特異的プローブ （locus specific probe)が使用 され得る。 第 1染色体特異的プローブとしては第 1染色体特異的サテライト ΠΙ DN A配列を含むプラスミ ドである pUCl.77 (H.J. Cookeら、 Nucleic. Acids Res.、 6 3177、 1979)や、 第 1染色体特異的 αサテライト DN Aを含むプラスミ ド pSD 1-1 (J.S.Wayeら、 Genomics,丄、 43、 1987)から調製したプローブが好まし い。 第 11染色体特異的プローブとしては cCRll (実施例 1参照） や、 第 11染色体特異 的 αサテライト DN Αを含むプラスミ ド pLCllA (J.S.Wayeら、 Chromosoina、
182、 1987)から調製したプローブが好ましい。 第 17染色体特異的プローブ とし ては CCI17- 321 (J.Inazawaら、 Genomics, JJ、 153、 1993)や、 第 17染色体特異 的 αサテライト DNAを含むプラスミ ド pl7H8 (J.S.Wayeら、 Mol. Cell. Biol.、 6 3156、 1986)力、ら調製したプローブが好ましい。
リガンドまたは標識を有するプローブを調製するためには、 ニックトランスレ —シヨン法やランダムプライム法などの公知の方法が用いられる。 特異的なリポ 一夕一分子と結合できるリガンドとしては、 ピオチン、 ジゴキシゲニンや両者
(ピオチンとジゴキシゲニン） の混合物の使用が好ましい。 あるいはピオチンを 有するプローブと、 ジゴキシゲニンを有するプローブとをあらかじめ別々に調製 し
、 これらを混合してピオチンとジゴキシゲニンとの両方を有するプローブとして 使用することもできる。 （細胞工学別冊 ·実験プロトコールシリーズ「F I S H 実験プロトコール」 、 128ページ、 松原謙一他監修、 秀潤社、 1994) これらのリ ガンドを有するプローブを使用する場合には、 ハイブリダィゼーションの後に適 当な蛍光物質を結合させたアビジン、 ストレプトアビジンや抗ジゴキシゲニン抗 体を反応させて検出する。 またそれぞれのプローブは別々に、 フルォレセインィ ソチオシァネート、 カルボキシメチルインドシァニンサクシニミジルエステル、 ローダミン、 テキサスレツド （スルフォローダミン） 、 テトラメチルローダミン イソチオシァネート、 または 7—アミノー 4ーメチルクマリン一 3—酢酸等の種 々の蛍光標識で直接標識されていてもよい。
また、 本発明は上記検体中に含まれる固定前の細胞から定法により D N Aを抽 出し、 ①第 1染色体及び第 11染色体、 ②第 1染色体及び第 17染色体、 または③第 1染色体及び第 11染色体及び第 17染色体に異常 ·異数性 （Aneusomy) を検出する のに適した多型性マー力一を利用したサザンハイブリダイゼーシヨンによっても 実施することができる。
さらに、 本発明は上記検体中に含まれる固定前の細胞から定法により D N A を抽出し、 ①第 1染色体及び第 11染色体、 ②第 1染色体及び第 17染色体、 または ③第 1染色体及び第 11染色体及び第 Π染色体に数的異常 ·異数性 （Aneusomy) を 検出するのに適したミニサテライトまたはマイクロサテライトマーカーを利用す ることによつても実施することができる。
しかしながら本発明の過程で、 F I S H法による解析では例えば 17pl3. 3欠 失ありと判定された症例で、 マイクロサテライトマ一カーによる LOHの検出で は、 摘出腫瘍より抽出した DNAをテンプレートにした場合、 正常細胞の混入か ら欠失の有無の判定が困難な場合が多く、 欠失なしと判定される場合があつた。 このため同一腫瘍でへマトキシリン*ェォジン染色標本を作成し、 腫瘍成分の 密な場所を同定し、 腫瘍組織をパラフィ ンブロックより正確に回収した後これを 材料に LOHを再確認したところ 17P13.3欠失ありと正確に判定できた。 現在 、 マイクロサテライト多型による LOHの検索法は、 従来のサザンハイブリダィ ゼ一シヨン法より簡便であることから遺伝子診断技術として導入されつつある。 し力、し、 採取した腫瘍検体中に正常細胞が混入することにより、 LOHの判定は 困難となり、 「欠失なし」 と偽陰性の判定がなされる場合も生じてくる。 このこ とは、 日常のガン臨床でルーチン化して得られてくる微量腫瘍サンプルを利用し て解析する場合、 マイクロサテライトマ一力一による染色体異常の解析法では、 その精度に問題が残ることを意味している。 F I SH法によるガン細胞検出法は この問題点を充分に克服するものである。
本発明はまた、 簡便で迅速で高精度な乳ガン細胞検出用キッ 卜に関する。
本発明によるキッ卜は、 例えば以下のような試薬を包含し得る ：
(1)第 1染色体特異的プローブ； （2)第 11染色体特異的プローブ； （3)ハ イブリダィゼ一シヨン溶液； （4)洗浄液； （5)染色液。
( 1 )第 1染色体特異的プローブ； （2)第 17染色体特異的プローブ； （3)ハ イブリダィゼーシヨン溶液； （4)洗浄液； （5)染色液。
(1)第 1染色体特異的プローブ； （2)第 11染色体特異的プローブ； （3)第 17染色体特異的プローブ； （4)ハイブリダィゼ一シヨン溶液； （5)洗浄液；
( 6 )染色液。 発明を実施するための最良の形態
本発明を説明するために以下に実施例を示す。 これらの実施例は、 本発明の例 示であり、 本発明を限定するものではない。
[実施例 1 ]
( 1 ) 検体の調製方法
表 1及び表 2にそれぞれ示す良性腫瘤 7例および悪性腫瘍 1 4例の計 2 1症例 について、 21ゲージの注射針を使用して定法により穿刺吸引を行い、 得られた穿 刺吸引材料を、 0. lralの 75mM KC1 溶液の入ったエツペンドルフチューブに移して 室温で 30分間ィンキュベートした。 そして等量のカルノァ液 （酢酸：メタノール 液 = 1 ： 3 ) を加えて細胞を固定した。 遠心分離後上清を除去し、 再びカルノア 液に細胞を懸濁してからスライドグラス上に滴下した。 火炝あるいは風乾にて固 定後、 70°Cで 5時間乾燥させた。
( 2 ) 第 11染色体セントロメァ領域特異的配列を含むコスミ ドクローン cCRl lの 単離
第 11染色体セントロメァ領域特異的配列を含むコスミ ドクローン cCRllを、 谷 上らの方法 （A. Tanigamiら、 Am. J. Hum. Genet. , 50, 56、 1992；谷上ら、 蛋白質 核酸酵素、 ^、 244、 1993；ラボマニュアルヒトゲノムマッピング、 41ページ、 堀 雅明 ·中村祐輔編、 丸善 （株） 、 1991) に準じて単離した。
まず、 ヒ卜の D N Aとして第 11染色体のみを有するチャイニーズハムスター X ヒト雑種細胞よりコスミ ドライブラリーを作成した。 （T. Tokinoら、 Am. J, Hum. G enet.、 48. 258、 1991) すなわち、 該細胞よりジヱノミック D N Aを抽出し、 制 限酵素 Sau3AIで部分切断した後、 10%〜38%のショ糖密度勾配遠心により、 35〜 45kbの D N A断片を含む分画を得た。 その切断端を dATP及び dGTP存在下でク レノウ （Klenow) 酵素の作用により部分的にフィルインした。 得られた D N A断 片を、 制限酵素 Xhol で切断して、 その切断端を dCTP及び dTTP存在下でクレ ノウ酵素の作用により部分的にフィルインしたコスミ ドベクター pWEX15 にライ ゲーション反応にて挿入した。
GIGAPACK I I GOLD (Strategene社製） を用いて得られたライゲーシヨン後の D N Aのパッケージングを行って、 コスミ ドライブラリーを作成した。 得られたコ スミ ドを感染させた大腸菌 490A株を 50/zg/ralのアンピシリンを含む LB寒天 培地に播き、 37 で一晩培養した。 （プレートあたり約 2 X 104個のコロニ 一が出現するように調製した。 ） ヒト第 11染色体由来の挿入 DN Aを有するクロ ーンを、 32Pで標識したヒトジエノミック DNA (Cotl DNA/GIBCO BRL社製） をプローブとして用いたコロニーハイブリダィゼーシヨン法によって選別した。 陽性クローンを取り、 96穴のマイクロプレート中で培養した。 得られたヒト第 11 染色体由来の挿入 DN Aを有するコスミ ドクローンは、 常法 （J.Sarabrookら、 "M olecular Cloning: A Laboratory Manual" 、 苐 2版、 Cold Spring Harbor Labor atory Press, 1989) により単離、 純化した。
得られたコスミ ドクローンに含まれる第 11染色体由来の DN A断片の局在を、 稲澤らの方法 (J. Inazawaら、 Genomics > 10 1075、 1991； J. Inazawaら、 Genomi cs、 II、 153、 1993) による F I SH法で解析した。
まずチミジン同調 ZBrdUリリース法 （E.Takahachiら、 Hum. Genet.、 M、 14、 1 990) によって複製前中期 R分染染色体標本を作成した。 次にスライドを 70%ホ ルムアミ ド Z2XSSC (0.3M NaCl; 0.03M クェン酸ナトリウム） 中で 75 、 2 〜5分間変性させた。 -20 の 70%エタノール溶液に 3分間浸した後に、 エタノー ルシリーズにより脱水した。
得られた多数のコスミ ド DN Aプローブは、 常法 （細胞工学別冊'実験プロト コールシリーズ「F I SH実験プロトコ一ル」、 第 2部、 第 2章、 松原謙ー他監 修、 秀潤社、 1994) により biotin-16-dUTP (ベーリンガー社製） を用いてニック トランスレーション法でラベルした。 ラベルしたコスミ ドプローブに短鎖化サケ 精子 DN Aと大腸菌 tRNAとを加えて、 エタノール沈殿で回収した後、 ホルムアミ ドに溶解させた。
ピオチンラベルしたそれぞれのコスミ ドプローブ溶液 （50ng/ml) に対し て、 Cot-IDNA (GIBCO BRL社製) (5mg/ml) を 1.0^1加えた。 得られた混合物を 7 0 で 10分間変性させてから氷上で 5分間冷却後、 等量の 20%デキストラン硫酸 ノ 4 XS SCを加えた。 37てで 20分間プレハイブリダィゼーシヨンさせた後、 こ のハイブリダィゼーシヨン液を先に変性させておいたスライド上にのせた。 パラ フィルムを被せてから 37 で 16〜48時間密閉湿箱中でハイブリダィゼーシヨンさ せた。 50%ホルムアミ ドノ 2 X S S C、 2 x S SC、 1 x S S Cでそれぞれ 42 、 15分間洗浄した後、 スライ ドをアビジン— F I TC (5/ g/ml) (ベーリンガ 一社製） を含む 1 %ブロックエース τΜ (大日本製薬社製） ノ 4 X S SC中で 37 40分間インキュベートした。 次に 4 x S SC、 4 XS SCZ0.05%トライトン（T riton)X- 100、 4 x S S Cでそれぞれ 10分間づっ室温で洗浄した。 ピオチン化抗 アビジン抗体及びアビジン— F I TCを用いたシグナル増幅 （D.Pinkelら、 Pro Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2934、 1986) を行った後に、 P I (propidium iodide ) (l ig/ml) を溶解させた、 1 % D A B C 0 (1, 4-diazabicyclo[2.2, 2]octane ) (シグマ社製） を含む抗退色試薬を添加し、 カバーグラスを被せてから蛍光顕 微鏡 FXA (ニコン社製） で検出した。 P I染色された染色体上の Rバンドと F I TCのシグナルは、 Nicon B-2Aフィルターを通して観察した。
このような F I SH法による解析により、 第 11染色体セントロメァ領域特異的 DNA配列を含むコスミ ドクローン cCRll を単離した。 また、 常法により cCRl 1 をプローブにしてヒトジエノミック DN Aを用いたサザンハイブリダィゼ一シ ョンを行った結果、 cCRllは反復配列を有することが判明した。
(3) プローブの調製
第 1染色体セン トロメァ特異的領域を含む pUCl.77 (H. J. Cookeら、 Nucleic. Acids Res.、 6, 3177、 1979) と第 11染色体セントロメァ特異的領域を含む cC R11 は定法 （細胞工学別冊 ·実験プロトコールシリーズ「F I SH実験プロトコ 一ル」 、 第 2部、 第 2章及び第 11章、 松原謙一他監修、 秀潤社、 1994) により biotin-16-dUTP (ベーリンガー社製） を用いてニックトランスレーション法で ラベルした。 また同様に cCRll と第 17染色体セントロメァ特異的領域を含む c CI17-321 を digoxigenin-11- dUTP (ベーリンガ一社製） を用いてニックトラン スレーション法でラベルした。 ラベルしたプローブに短鎖化サケ精子 DN Aと大 腸菌 t RNAを加えて、 エタノール沈殿で回収した後、 ホルムアミ ドに溶解させ た。
(4) インサイチュハイブリダィゼーション （マルチカラ一 F I SH)
細胞工学別冊.実験プロトコ一ルシリーズ「F I SH実験プロトコール」 、 第 2部、 第 2章及び第 11章 （松原謙一他監修、 秀潤社、 1994) に準じて行った。
( 1 ) で得られたスライドを 70%ホルムアミ ドノ 2 X S S C中で 75て、 4分間 変性させた。 - 20°Cの 70%エタノール溶液に- 20°Cで 2〜5分間浸した後に、 エタ ノールシリーズにより脱水した。
ピオチンラベルした cCRll プローブ溶液 （50ng/ il) とジゴキシゲニンラベ ルした cCRll プローブ溶液 （50ng/)Ul) とを 7 ： 3の割合で混合した。 （cCRll ピオチン/ジゴキシゲニン混合液） ピオチンラベルした pUCl.77プローブ溶液 (50ng/^l) 、 ジゴキシゲニンラベルした cCI17- 321 プローブ溶液 （50ng / 1) と cCRllピオチン Zジゴキシゲニン混合液 （50ng/;t l) を 2 ： 4 ： 3 (V/V) の割合で混合した。 これらの混合液 9. に対して Cot- 1DNA (5mg ml) を 1.0/ l 加えた。 最終混合物を 70 で 10分間変性させてから氷上で 5分間冷却 後、 等量の 20%デキストラン硫酸 Z4 X S S Cを加えた。 37てで 20分間プレハイ プリダイゼーションさせた後、 このハイプリダイゼーション液を先に変性させて おいたスライド上にのせた。 パラフィルムを被せてから 37てで 24〜48時間密閉湿 箱中でハイブリダィゼ一シヨンさせた。 50%ホルムアミ ド /2 x S SC、 2 X S SC、 1 x S S Cでそれぞれ 42て、 15分間ずつ洗浄した後、 スライドをアビジン 一 F I TC (5 g/ml) (ベーリンガー社製） とローダミン抗ジゴキシゲニン抗 体 （l^g/ml) (ベーリンガー社製） を含む 1 %ブロックエース TM (大日本製薬社 製） /4 X S SC中で 37て40分間インキュベートした。 次に 4 x S SC、 4 x S S CZO.05%トライトン （Triton) X- 100、 4 x S S Cでそれぞれ 10分間ずつ室 温で洗浄した。
D A P I (4, 6-diainidino-2-phenylindole) ( 1 / g/ml) を溶解させた、 1 % D A B C O ( 1, 4-diazabicyclo[2, 2, 2]octane) (シグマ社製) を含む抗退色試薬 を添加し、 カバーグラスを被せてから蛍光顕微鏡 FXA (ニコン社製） で検出した 。 UV-2Aフィルターを通して D A P Iで染色された、 物理的損傷を受けておらず 、 互いに接していない間期核をスクリーニングし、 100個以上の完全な間期核に ついて、 ダブルバンドパスフィルタ一 （Omega Optical社製） を用いてこれら 3 種類のプローブ由来のシグナル数をカウントした。 第 1染色体セントロメァ領域 由来のシグナルは緑色 （F I T C ) 、 第 17染色体セントロメァ領域由来のシグナ ルは赤色 （ローダミン） 、 第 11染色体セントロメァ領域由来のシグナルは黄色 ( F I T Cとローダミンの蛍光により合成される偽似カラ一） のスポッ トとして 検出される。 それぞれのプローブ由来のシグナル数が異常である間期核が 20%以 上存在する場合に数的異常 ·異数性 （Aneusomy) ありと判定した。 結果を表 1、 表 2に示す。 表 1には良性腫瘤細胞に関する結果を、 表 2には乳ガン細胞に関す る結果を示す。
表 1
《良性腫瘤》
Histology 2)
症例 " 細胞診 数的異常 ·異数性の有無
(第 1ノ第 1 第 17染色体) 35
1 [Mastopathy. 乳腺症] クラス I -/-/-)
2 [Fibroadenoma. 線維腺腫] クラス II
3 [Fibroadenoma, 線維腺腫] クラス III -/-/-)
4 [Fibroadenoma, 線維腺腫] クラス II
5 [Fibroadenomas 線維腺腫] クラス III
6 [Intraductal papilloma^ クラス IV
乳管内乳頭腫]
7 [Intraductal papilloma> クラス IV (-/-/-)
乳管内乳頭腫]
表 2
《乳ガン》
症例 TNM" リンパ節 : 細胞診 Histology 数的異常 ·異数性の有無 転移 (第 1 第 11 第 17染色体）
1 T2 n (+ ) クラス V Pt6)
2 T2 n (-） クラス III Pt {+/-/-
3 T2 n (-) クラス V M7) (+/-/+
4 T3 n (-) クラス III Pt (+/-/-
5 T1 n ( クラス、 III Sci8 、
6 T1 n ( クラス IV Pt
7 T2 n (-) クラス V Pt
8 T2 11 (0 Sci
9 T2 n (+) クラス V Lo9)
10 T1 n (+) クラス V Sci
11 T1 n (+) クラス V Sci
12 T2 n (り クラス V St10)
13 T2 n (-) クラス V St
14 T1 n (-) クラス V St ( + /-/ + なお、 表 1、 表 2中の添字の付いた記号の意味は以下の通りである。
1)：外科摘出材料の病理組織診断結果。 本診断によって最終的に良性であ
ると診断されたものを" 良性腫瘤" 、 悪性であると診断されたものを " 乳ガン" と表記した。
2)：穿刺吸引材料を用いた細胞診結果。 )： 「十」 は数的異常 ·異数性有り。 「一」 は数的異常 ·異数性無し。
)： UICC (国際対ガン連合） による病期分類 （TNM分類）
)： 「η ( + ) 」 はリンパ節転移有り。 「n (-) 」 はリンパ節転移無し。
)： Papillotublar carcinoma^ 乳頭腺管ガン
)： Medullary carcinoma、 ϋ様ガン
)： Scirrhous carcinoma 5¾力ン
)： Invasive lobular carcinoma^ 浸潤性, Jヽ葉ガン
10)： Solidtublar carcinoma, 充実腺管ガン
[実施例 2]
( 1 ) 検体の調製方法
実施例 1に含まれていない良性腫瘤 15例 （表 3)及び悪性腫瘍 59例 （表 4 〜6) の計 74症例について、 実施例 1と同様にして、 1症例につき 2枚のスラ ィドを調製した。
(2) プローブの調製
第 1染色体セン トロメァ特異的領域を含む pUCl.77 (H. J. Cookeら、 Nucleic. A cids Res.、 6、 3177、 1979) と第 17染色体セントロメァ特異的領域を含む cCI17 - 321は、 常法 （細胞工学別冊 ·実験プロトコールシリーズ「F I SH実験プロト コール」 、 第 2部第 2章及び第 11章、 松原謙一他監修、 秀潤社、 1994) により otin-16-dUTP (ベーリンガ一社製） を用いてニックトランスレーション法でラベ ノレした。 また同様に第 11染色体セントロメァ特異的領域を含む cCRllを digoxigen in-11-dUTP (ベ一リンガー社製） を用いてニック トランスレーション法でラベル した。 ラベルしたプローブに短鎖化サケ精子 DN Aと大腸菌 t RNAを加えて、 エタノール沈殿で回収した後、 ホルムアミ ドに溶解させた。
(3) インサイチュハイブリダィゼ一シヨン
実施例 1の （4) とほぼ同様にして行ったが、 今回は 1度に 3種類のプローブ を用いる 3色 F I SH法は実施しなかった。 （1)で調製した 1検体当たり 2枚 のスライドの内の 1枚のスライドについてまず第 1及び第 11染色体特異的プロ一 ブを用いる 2色 F I SH法を行い、 第 1及び第 11染色体の数的異常 .異数性 （An eusomy) の有無を調べてから、 もう 1枚のスライドについて第 17染色体特異的プ ローブを用いる F I SH法を行って第 17染色体の数的異常 ·異数性 （Aneusomy) の有無を調べた。
( 1 ) で得られた 1検体当たり 2枚のスライドの内の 1枚のスライ ドを、 70% ホルムアミ ドノ 2 X S S C中で 75°C、 2〜5分間変性させた。 — 20 の 70%エタ ノール溶液に 3分間浸した後に、 エタノールシリーズにより脱水した。 ピオチン ラベルした pUCl.77プローブ溶液 （30ng// l) とジゴキシゲニンラベルした cCRll プローブ溶液 （30ng/ l) を 2 ： 7 (V/V) の割合で混合した。 この混合液 9. 0 1に対して Cot-IDNA (5mg/ml) を 1.0 1加えた。 最終混合物を 70 で 10 分 間変性させてから氷上で 5分間冷却後、 等量の 20%デキストラン硫酸 Z 4 X S S Cを加えた。 37てで 10〜20分間プレハイブリダィゼーシヨンさせた後、 このハイ ブリダィゼーシヨン液を先に変性させておいたスライド上にのせた。 パラフィル ムを被せてから 37 で 24〜48時間密閉湿箱中でハイブリダイゼーシヨンさせた 。 50%ホルムアミ ドノ 2 X S S Cで 37°C、 15分間洗浄してから、 2 x S S C、 1 x S SCでそれぞれ室温、 15分間ずつ洗浄した後、 スライドをアビジン— F I T C (5^g/ml) (ベ一リンガー社製） とローダミン抗ジゴキシゲニン抗体 （l〃g/m 1) (ベーリンガー社製） を含む 1 %ブロックエース TM (大日本製薬社製） ノ 4 x S S C中で 37^40分間ィンキュベートした。 次に 4 X S S C、 4 x S S C/0.05 %TritonX-100、 4 x S S Cでそれぞれ 10分間ずつ室温で洗浄した。 DAP I (4, 6-diamidino-2-phenylindole) ( 1 ^g/ml) を溶解させた、 1 %D AB C O (1, 4-diazabicyclo[2, 2, 2]octane) (シグマ社製） を含む抗退色試薬を添加し、 カバ 一グラスを被せてからニコン社製蛍光顕微鏡 FXAで検出した。 UV-2Aフィルタ 一 を通して DAP Iで染色された、 物理的に損傷を受けておらず、 互いに接してい ない間期核をスクリーニングし、 100個以上の完全な間期核について、 ダブルバ ンドパスフィルター （Omega Optical社製） を用いてこれら 2種類のプローブ 由 来のシグナル数を計数した。 第 1染色体セントロメァ領域由来のシグナルは緑色 (F I TC) 、 第 11染色体セントロメァ領域由来のシグナルは赤色 （ローダミン） のスポットとして検出される。 それぞれのプローブ由来のシグナル数が異常であ る間期核が 20%以上存在する場合に数的異常，異数性 （Aneusomy) ありと判定し 次にもう 1枚のスライドを 70%ホルムァミ ド /2 X S S C中で 75 、 2〜5分 間変性させた。 —20 の 70%エタノール溶液に 3分間浸した後に、 エタノールシ リーズにより脱水した。 ピオチンラベルした CCI17-321プローブ溶液 （30ng/ t l ) 3.0 1にホルムアミ ド 6,0 1を加えた。 この混合液 9.0 / 1に Cot-ID N A (5ig /ml) を l.Ojul 加えた。 混合物を 70 で 10分間変性させてから氷上で 5分間冷 却後、 等量の 20%デキストラン硫酸 /4 X S SCを加えた。 37 で 10〜20分間プ レハイブリダィゼーションさせた後、 このハイブリダィゼーション液を先に変性 させておいたスライド上にのせた。 パラフィルムを被せてから 37 で 24〜48時間 密閉湿箱中でハイブリダィゼーシヨンさせた。 50%ホルムアミ ド /2 X S SCで 37 、 15分間洗浄してから、 2 x SSC、 1 X S S Cでそれぞれ室温、 15分間ず つ洗浄した後、 スライドをアビジン— F I TC (5 /g/inl) (ベーリンガー社製） を含む 1 %ブロックエース TM (大日本製薬社製） /4 X S S C中で 37^40分間ィ ンキュペートした。 次に 4 x S SC、 4 X S S C/0.05%TritonX-100 4 x S S Cでそれぞれ 10分間ずつ室温で洗浄した。 D A P I (4, 6-diamidino-2-phenyl indole) ( 1 / g/ml) を溶解させた、 1 % D A B C 0 (1， 4-diazabicyclo[2, 2, 2] octane) (シグマ社製） を含む抗退色試薬を添加し、 カバ一グラスを被せてか ら ニコン社製蛍光顕微鏡 FXAで検出した。 UV-2Aフィルターを通して D AP Iで染 色された、 物理的に損傷を受けておらず、 互いに接していない間期核をスクリ一 ニングし、 100個以上の完全な間期核について、 B-2Eフィルターを用いて CCI17-3 21プローブ由来のシグナル数を計数した。 第 17染色体セントロメァ領域由来のシ グナルは緑色 （F I T C ) のスポットとして検出される。 CCI 17- 321プローブ 由 来のシグナル数が異常である間期核が 20%以上存在する場合に数的異常 ·異数性 (Aneusomy) ありと判定した。
これらの 2枚のスライドについての F I S H法による解析結果を表 3〜6に示 す。 表 3には良性腫瘤細胞に関する結果を、 表 4〜 6には乳ガン細胞に関する結 果を示す。
表 3
《良性腫瘤》 数的異常 ·異数性の有無 症例 [Histology] (第 1 第 1/第 17染色体）
1 [Fibrocystic desease、 乳 症] - / - / - )
2 [Mastopathy. 乳腺症]
3 [Fat necrosis. 脂肪組織壊死] —ノー/一）
4 [Fibroadenoma. 線維腺腫] 一/一/一）
5 [Fibroadenoma. 線維腺腫] —/一/一、
6 [Fibroadenoma. 線維腺腫]
7 [Fibroadenoma. 線維腺腫]
8 [Fibroadenoma^ 線維腺腫]
9 [Fibroadenoma、 維腺腫」 一ノー/一） 10 [Fibroadenoma^ 維腺腫」 —/一/一、 11 [Fibroadenoma. 線維腺腫]
12 [Fibroadenoma. 線維腺腫]
13 [Fibroadenoma. 線維腺腫]
14 [ Adenoma Λ 腺腫」
15 [Papillary hyperplasia. 乳頭状異形成] — Z一/一）
表 4
《乳ガン》
症例 TNM4) リンノ、°節5) Histology 15 数的異常 ·異数性の有無 転移 (第 1Z第 11Z第 17染色体) 35
1 T1 n (-) Pt6 + .
2 T1 n (-) Pt
3 T2 n (-) St10)
4 T1 n (-) Sci8)
5 T2 n (-) Sci
6 T2 n (-) Pt
7 T4 n (+ ) Sci
8 T2 n (-) Pt
9 T2 n (-) Pt
10 T3 n (+ ) St
11 T1 n (-) Pt
12 T1 n (+ ) Sci
13 T1 n (+ ) St
14 T2 n (+ ) St
15 T1 n (+ ) St
16 T3 n (+ ) Pt
17 T1 n (-） St
18 T2 n ） Pt +
19 T1 n (-) Sci
20 T4 n (-) Pt
21 T2 n (-) Sci 十
+
O
C C
CO
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r+ O r-t- O O r-+ r+ r+ <-t O r+ r+ r-t- c+ O r+ <-+ O r+ r-f r-+ r+
\ Si
3D}
Figure imgf000025_0001
gyf Jls Histoo v TN 47 Tl n (-) Pt (-/-/-) 48 T2 n (-) Pt ( + / + / + ) 表 6
症例 TNM リンパ節 Histology 数的異常 ·異数性の有無 転移 (第 1 Z第 1 Z第 17染色体）
PMS u t t
Figure imgf000026_0001
57 Tl n (-)
58 Tl n ( + ) +/+/-) 59 丁 1 n ( +/-/-) なお、 表 4〜 6中の添字の付いた記号の意味は、 表 1、 2に示したものと同じ であるが、 以下の記号が追加される。
11)： Mucinous carcinoma^ 粘液力ン
表 1〜6までの結果を総合すると、 良性腫瘤細胞 22例についてはこれら 3種 類の染色体について数的異常 ·異数性 （Aneusomy) は全く検出されなかったのに 対して、 乳ガン 73症例中 68例 （93.2%) に、 第 1染色体、 第 11染色体のいずれか 一方または両方に異常があること、 乳ガン 73症例中 67例 （91.8%) に、 第 1染色 体、 第 17染色体のいずれか一方または両方に異常があることが判明した。 従って 、 被験細胞中の第 1染色体、 第 11染色体のいずれか一方または両方、 または第 1 染色体、 第 17染色体のいずれか一方または両方に数的異常 ·異数性が検出された 場合に乳ガン細胞であると判定できることが確認された。 また、 乳ガン 73症例中 70例 （95. 9% ) に、 被験細胞中の第 1染色体及び第 11染色体及び第 Π染色体の少 なくとも 1種類に異常があることが判明した。 従って、 被験細胞中の第 1染色体 及び第 11染色体及び第 17染色体の少なくとも 1種類に数的異常 ·異数性が検出さ れた場合は、 乳ガン細胞であると判定できることも確認された。 産業上の利用の可能性
本発明によって、 乳頭分泌液、 穿刺吸引材料、 乳管洗浄液、 乳頭及び乳輪部び らん面の擦過材料または手術摘出材料の捺印スメァ等の検体に含まれる細胞中の ①第 1染色体及び第 11染色体、 ②第 1染色体及び第 17染色体、 または③第 1染色 体及び第 11染色体及び第 17染色体の数的異常 .異数性 （Aneusomy) を検出するこ とにより、 被験細胞が乳ガン細胞か否かを検出することが可能になった。 すなわ ち、 本発明によって、 被験細胞中の、 ①第 1染色体、 第 11染色体のいずれか一方 または両方、 ②第 1染色体、 第 17染色体のいずれか一方または両方、 または③第 1染色体及び第 11染色体及び第 17染色体の少なくとも 1種類に数的異常 ·異数性 (Aneusomy) が検出された場合に被験細胞は乳ガン細胞であると判定することに より、 従来の細胞診と同等の簡便性、 非侵襲性を有しながら、 細胞診よりもはる かに高精度で客観的な乳ガン細胞の検出が可能になった。

Claims

請求の範囲
1 . 被験ヒト細胞中の第 1染色体、 第 11染色体のいずれか一方または両方、 また は第 1染色体、 第 17染色体のいずれか一方または両方に数的異常 ·異数性が検出 された場合に乳ガン細胞であると判定することを特徴とする、 乳ガン細胞の検出 方法。
2 . 被験ヒト細胞中の第 1染色体及び第 11染色体及び第 Π染色体の少なくとも 1 種類に数的異常 ·異数性が検出された場合に乳ガン細胞であると判定することを 特徴とする、 乳ガン細胞の検出方法。
3 . 被験細胞が、 乳頭分泌液、 穿刺吸引材料、 乳管洗浄液、 乳頭及び乳輪部びら ん面の擦過材料または手術摘出材料の捺印スメァ由来である請求項 1または 2に 記載の検出方法。
4 . 第 1染色体、 第 11染色体または第 17染色体にそれぞれ特異的な配列を有する プローブを用いたインサイチュハイブリダィゼーシヨン （ I S H
) 法を用いることを特徴とする請求項 1または 2に記載の検出方法。
5 . リガンドまたは標識を有する第 1染色体、 第 11染色体または第 17染色体にそ れぞれ特異的な配列を有するプロ一ブを用 、た蛍光ィンサイチュハイブリダィゼ ーシヨン （F I S H ) 法を用いることを特徴とする請求項 4に記載の検出方法。
6 . リガンドがピオチン、 ジゴキシゲニンまたは両者の混合物であり、 ハイプリ ダイゼーシヨ ンの後に適当な蛍光物質を結合させたアビジンまたは抗ジゴキシゲ ニン抗体を反応させることを特徴とする請求項 5に記載の検出方法。
7 . 標識が、 フルォレセインイソチオシァネート、 カルボキシメチルインドシァ ニンサクシ二ミジルエステル、 ローダミン、 テキサスレッド （スルフォローダミ ン） 、 テトラメチルローダミンィソチオシァネ一卜または 7—ァミノ— 4—メチ ルクマリンー 3—酌酸からなる群から選択される蛍光標識であることを特徴とす る、 請求項 5に記載の検出方法。
8 . 被験細胞中の第 1染色体及び第 11染色体の数的異常 ·異数性をそれぞれ検出 することができる 2種類のプローブを含むことを特徴とする、 乳ガン細胞検出用 キッ ト。
9 . 被験細胞中の第 1染色体及び第 17染色体の数的異常 ·異数性をそれぞれ検出 することができる 2種類のプローブを含むことを特徴とする、 乳ガン細胞検出用 キッ 卜。
1 0 . 被験細胞中の第 1染色体、 第 11染色体及び第 17染色体の数的異常 ·異数性 をそれぞれ検出することができる 3種類のプローブを含むことを特徴とする、 乳 ガン細胞検出用キット。
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