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WO1996030527A1 - Proteines mutees, codees par un gene env mute de lentivirus, fragments peptidiques et vecteurs d'expression - Google Patents

Proteines mutees, codees par un gene env mute de lentivirus, fragments peptidiques et vecteurs d'expression Download PDF

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WO1996030527A1
WO1996030527A1 PCT/FR1996/000449 FR9600449W WO9630527A1 WO 1996030527 A1 WO1996030527 A1 WO 1996030527A1 FR 9600449 W FR9600449 W FR 9600449W WO 9630527 A1 WO9630527 A1 WO 9630527A1
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WO
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seq
sequence
mutated
lentivirus
hiv
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PCT/FR1996/000449
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Gianfranco Pancino
Pierre Sonigo
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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Publication date
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    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to mutated proteins, encoded by a mutated env gene of lentivirus, and in particular VTF, HIV or CAEV, to peptide fragments included in said mutated proteins, to expression vectors expressing said mutated proteins as well as their applications.
  • Feline immunodeficiency is caused by a lentivirus, the feline immunodeficiency virus (FIV), which has a genetic structure similar to that of primate lentiviruses (HIV and VIS).
  • FV feline immunodeficiency virus
  • TM1 a fragment including a segment of 51 amino acids, which corresponds to positions 595-647 of the Env protein of VIF
  • TM2 a fragment including a segment of 31 amino acids, called TM2, which corresponds to positions 681-711 of the Env protein of VIF, which fragment contains an epitope including the sequence: Cys 697 -Asn-Gln-Asn-Gln-Phe -Phe-Cys- Lys 705 (peptide called P237),
  • TM3 a fragment including a segment of 45 amino acids, called TM3
  • TM3 a fragment including a segment of 45 amino acids, called TM3
  • TM3 a fragment including a segment of 29 amino acids
  • TM4 which corresponds to positions 826-854 of the Env protein of VIF.
  • a complete and mature envelope protein in its oligomeric form, is preferable for inducing the formation of antibodies directed against confon ⁇ national epitopes, among which neutralizing antibodies (CC BRODER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11699-1 1703).
  • HIV-1 the Principal Immunodominant Domain (PID) of the envelope of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is very conserved among the various viral isolates of VJ ⁇ -1.
  • the sequence between the two DIP cysteines is also conserved among the HIV-1 subtypes, except for the subtype 0 (Outsider), which could correspond to a new type of HTV-1.
  • the HIV-1 DIP sequence is completely different from that of HIV-2, which is identical to that of the simian immunodeficiency virus (SIV), to which HTV-2 is phylogenetically related.
  • the DP of lentiviruses can cause the formation of antibodies facilitating viral infection, the action of which has a deleterious effect and is contrary to - j that of the protective antibodies generated by vaccination with the Env protein, as specified above, for the VIF envelope protein.
  • the Applicant has set itself the goal of providing Env proteins mutated at the level of said principal immunodominant domain (PID) of the transmembrane glycoprotein of lentiviruses and in particular of the feline immunodeficiency virus or of the human immunodeficiency virus.
  • PID principal immunodominant domain
  • the Applicant has set itself the goal of providing Env proteins mutated at the level of said principal immunodominant domain (PID) of the transmembrane glycoprotein of lentiviruses and in particular of the feline immunodeficiency virus or of the human immunodeficiency virus.
  • PID principal immunodominant domain
  • the present invention therefore relates to peptide fragments, characterized in that they constitute mutants of the wild primary immunodominant domain (PID) of a wild transmembrane protein (TM) of lentivirus and in particular of the immunodeficiency virus feline (VIF), human immunodeficiency virus (HIV-1 and HIV-2) and arthritis and caprine encephalitis virus (CAEV), which peptide fragments are capable of modifying the immunogenic properties of DIP , so that the lentivirus Env protein containing them does not cause the production of facilitating or deleterious antibodies against wild-type DIP, whereas it retains the capacity to produce neutralizing antibodies.
  • PID wild primary immunodominant domain
  • TM wild transmembrane protein
  • CAEV caprine encephalitis virus
  • DIP mutant is understood, within the meaning of the present invention, at least one sequence between the two cysteines of a wild DIP of a TM protein of a lentivirus, which sequence is modified (1) either by that at least one inoacid is mutated, (2) either in that it comprises the sequence of a DIP of a Env protein lentivirus different from that in which said DIP sequence is inserted.
  • said peptide fragments can comprise downstream and / or upstream of said sequence between the two cysteines, at least one additional amino acid.
  • Such peptide fragments therefore replace the main immuno ⁇ dominant domain (DIP) of a wild transmembrane protein (TM) of lentivirus and in particular of the feline immunodeficiency virus (VIF), of the human immunodeficiency virus (VTH-1 and HTV-2) and the arthritis virus and caprine encephalitis (CAEV) and constitute functional mutants of the Env protein DIP into which they are inserted.
  • DIP main immuno ⁇ dominant domain
  • TM wild transmembrane protein
  • VIF feline immunodeficiency virus
  • VTH-1 and HTV-2 human immunodeficiency virus
  • CAEV arthritis virus and caprine encephalitis
  • n92 the CRPAAFFCK fragment
  • sequences ID No. 1 to JD No. 10 are functional mutants of the DIP of VIF; in particular, the sequence ED No. 10 contains the sequence of the DIP of HIV-1, in a sequence of the VIF (that is to say in the context of the VTF), while the SEQ ID Nos. 1 and 12 are functional mutants of the HIV-1 DIP: SEQ ID No. 11 contains the sequence of the VIF DIP in the context of HIV-1 (HIV-1 / VIF chimera) and SEQ ID No. 12 contains the VIS DIP sequence in the context of HIV-1 (chimera HTV-1 / SIV). The sequences SEQ ID No. 1 there 9 are mutated sequences of the DIP of the VIF.
  • the present invention also relates to Env proteins, characterized in that they are mutated in the main immunodominant domain (DIP) of the transmembrane protein (TM) of lentiviruses and in particular of the feline immunodeficiency virus (VIF), human immunodeficiency virus (HIV-1 and HIV-2) and arthritis and caprine encephalitis virus (CAEV), and in that they comprise one of the fragments such as defined above, at the DIP level, which proteins do not cause the production of deleterious antibodies, in particular facilitating antibodies, against wild DIP, but retain an adequate conformation for the production of a protective immune response, including in particular the production of neutralizing antibodies for a protective vaccine application.
  • DIP main immunodominant domain
  • TM transmembrane protein
  • VEF feline immunodeficiency virus
  • HIV-1 and HIV-2 human immunodeficiency virus
  • CAEV caprine encephalitis virus
  • the present invention also relates to vectors for expressing lentivirus Env proteins, characterized in that they comprise at least one mutated nucleic acid fragment coding for a mutated Env protein as defined above.
  • such vectors allow the expression of a functional viral envelope, but whose immunological reactivity is significantly modified, compared to that of the wild-type Env protein. Indeed, the mutated and expressed protein does not lead to the production of facilitating antibodies against
  • said expression vector consists of an expression vector, comprising a sequence coding for a VIF Env protein, in which the sequence coding for DIP (sequence 2077-2115, with reference to the sequence of formula I of Application EP 0 577 458) is replaced by a sequence coding for any one of the peptide fragments SEQ Nos. 1 to 10, as defined above.
  • Said vector can advantageously be constructed from a vector as described in G. PANCINO et al., Virology, 1995, 206, 796-806.
  • said expression vector consists of an expression vector, comprising a sequence coding for a VTH-1 Env protein in which the sequence coding for wild-type DIP is replaced by a coding sequence for a mutant of the wild primary immuno-dominant domain (DIP) of a wild transmembrane protein (TM), derived from the human immunodeficiency virus (HIV-1 and VJ ⁇ -2) or another lentivirus and capable of modifying the immunogenic properties of DIP; preferably, said sequence codes for any one of the peptide fragments SEQ No. 11 or 12, as defined above.
  • sequences coding for DP are selected from the following sequences (SEQ ID N ° 13 to 24):
  • sequence ID No. 7 TGT TTG ACA GAT TCG TTT TTC TGC AAA (SEQ ID No. 19), for obtaining the vector pn67 ⁇ 20,
  • nucleic acid sequences according to the invention include all the sequences coding for the same amino acids (amino acid coded by a codon different from that illustrated in sequences 13 to 24).
  • the present invention also relates to infectious molecular clones of mutated lentiviruses, characterized in that they include a sequence coding for a mutated Env protein, as defined above.
  • said mutated clones are obtained by introduction into an infectious molecular clone of VIF, preferably in the molecular clone infectious area p34TF10, of a fragment containing the above-mentioned mutations at the level of the sequences coding for DIP, in place of the corresponding wild-type sequences.
  • clones According to the mutated sequence introduced, the following clones are obtained: pTf8, pTfd, pTfh, pTnl4, pTnl9, pTn67, pTn73, pTn92 and pTM5.
  • Such clones are in particular obtained by incorporation into the genome of "VTF p34TF10, of Spel-BstBI 8287-8918 fragments of said genome of VIF p34TF10 containing the above-mentioned mutations, in place of the corresponding wild-type sequences.
  • said mutated clones are obtained by introduction into a infectious molecular clone of HIV-1, of a fragment containing the above-mentioned mutations, at the level of the sequences coding for DP, in place of the corresponding wild-type sequences.
  • a subject of the present invention is also vacinal compositions, characterized in that they comprise at least one mutated Env protein and / or at least one expression vector and / or at least one mutated clone, as defined above. above.
  • the present invention further relates to a method for monitoring an anti-lentivirus vaccination and / or for differentiating between an anti-lentivirus vaccination and a lentivirus infection, characterized in that it comprises the implementation in contact with a peptide fragment according to the invention with a biological sample (blood, in particular) and the detection of the antigen (peptide fragment) - antibody complex (produced during vaccination or during infection) formed, by any appropriate means.
  • the mutated DP advantageously serves as a marker sequence; indeed, the antibodies produced against DP will be different in the event of vaccination (mutated DP) and in the event of infection (wild-type DP).
  • wild-type DP if a viral infection occurs during vaccination, we can effectively distinguish it, the two immunological responses being different, due to the presence of the mutated DP and the absence of wild-type DP, in the vaccine composition .
  • detection systems such as those described in European Patent Applications No. 0 564 477 of November 20, 1991, No. 0 577 458 of June 16, 1993, and French No. 94 07062 of June 9, 1994; to detect the mutated DP, analogous detection systems can be used, using the peptides of the mutated DP as defined above, as reactants, instead of the wild-type DP (see Example 1).
  • FIG. 1 represents the alignment of the sequences of the DPs of TM of different lentiviruses
  • FIG. 2 represents the envelope expression vector pT ⁇ 20
  • FIG. 3 shows the result of the fusion tests with the vector containing the sequence M5.
  • Example 1 Construction of mutants in the VIF context (chimeras in which an HIV DIP replaces the wild VIF DIP, in an Env sequence of VIF).
  • sequence coding for the Env protein of " VTF is modified, so that the sequences coding for the peptide fragments according to the invention as defined above (SEQ ID Nos. 1 to 10) are inserted, at the place of the sequence coding for the abovementioned P237 peptide (positions 2077-2115 of the sequence coding for the Env protein, as described in European Patent Application No. 0 577 458; said sequences coding for an Env protein, thus modified ( mutant env sequences), are inserted into a vector called pT ⁇ 20, which comprises a deletion from nucleotide 923 to nucleotide 5410 in the VIF gene (gag and pot genes).
  • pT ⁇ 20 which comprises a deletion from nucleotide 923 to nucleotide 5410 in the VIF gene (gag and pot genes).
  • the Env expression vector pT ⁇ 20 (FIG. 2) is derived from the infectious molecular clone of VIF p34TF10, by deletion of the gag andpol genes.
  • a deletion of the gag and pol genes is carried out in the provirus p34TF10 (TALBOTT et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 5743-5747) by Tthl 11-EcoRV digestion and religation after treatment with the Klenow enzyme.
  • a clone, called pT ⁇ 20, which includes a larger deletion, from nucleotide 923 to nucleotide 5410 effectively expresses said Env protein, after transfection into CrFK cells (Virology, 1995, 206, 796-806).
  • Example 2 Mutated peptides obtained in Example 1 and Env proteins containing them: functionality and reactivity. * Method:
  • the aforementioned expression vectors (pf8 ⁇ 20, pfd ⁇ 20, pfh ⁇ 20, prm ⁇ 20, pnl4 ⁇ 20, pnl9 ⁇ 20, pn67 ⁇ 20, pn73aA20, pn92 ⁇ 20, pM5 ⁇ 20,) producing mutated Env proteins in the form of the invention are transfected into CrFK cells and analyzed for their ability to induce fusion of cell membranes (formation of syncytia).
  • a cell line of feline fibroblasts CrFK-H06Tl / 2 (OSBORNE et al., J. Gen. Virol., 1994, 75, 3641-3645) is cultured in a modified Eagle Dulbecco medium supplemented with 10% calf serum.
  • the plasmids are purified using the maxiprep Promega system, then extracted with phenol-chloroform.
  • the transfection is carried out using the calcium phosphate precipitation method.
  • the transfection conditions are optimized and standardized using plasmids expressing the reporter genes ⁇ -galactosidase or luciferase.
  • an ELIS A with the peptides according to the invention is carried out.
  • Microtiter plates containing 96 wells (Immunolon ® 2) are covered with said peptide in carbonate buffer 0, 1 M, pH 9.6 (5 ug ml) at 4 ° C overnight.
  • feline sera diluted in PBS, 1% bovine serum albumin and 0.1% Tween 20 are added and incubated for 2 hours.
  • the reactivity of the mutated domains can be tested with human sera infected with HIV-1.
  • the protocol is the same, except for the use of 5% fetal calf serum, in place of bovine serum albumin.
  • the mutated vector pM5 ⁇ 20 containing a mutated fragment of the HIV DP, was tested in another experiment and also showed the formation of syn ⁇ cytia.
  • FIG. 3 illustrates the results obtained with the vector M5 (in comparison with the wild type W).
  • the HIV VP M5 chimeras are capable of inducing the formation of syncytia (Figure 3), smaller in size (5-20 nuclei, 48 hours after transfection) than those induced by the wild type (W).
  • the size and number of syncytia induced by M5 increases over time up to 72 hours.
  • DP by the mutations which preserve the fusogenic capacity of the mutant envelopes are tested by “ELISA peptide”.
  • the peptides corresponding to the mutated DP (Table I) are synthesized and used to cover ELISA microplates. 8 sera from cats, experimentally infected with 4 different isolates of VP and 11 sera from cats naturally infected are tested to evaluate the reactivity of these peptides.
  • the optical density values obtained with the mutant DP peptides are compared with the values obtained with the wild-type DP peptide (TM2) comprising the peptide P237.
  • Peptides p237 and SP89029 (Catalog ANRS, 1994) corresponding to the sequences of VP and VTH-1 (DP) respectively and 2 peptides chemically cyclized between the two cysteines (Y-15-Vc (YOELGCNONOFFCLV and L-15 -Tc fLLGIWGCSGKLICTT) respectively for VP and VTH-1), so as to mimic natural folding, were used to cover microtiter plates.
  • VP of DP in the context of IPV-1 or other mutations that modify the antigenic properties of DP of IPV-1.
  • a reciprocal approach is also possible in the case of vaccination against VP, using a DP VTH-1 or other mutated sequences of the VP envelope.
  • the Env expression vector pT ⁇ 20 derived from the infectious molecular clone of VP p34TF10, by deletion of the gag andpol genes, is used to vaccinate cats.
  • the vector pT ⁇ 20 is injected intramuscularly into 4 cats (4 injections of 200-400 ⁇ g of DNA).
  • the antico ants response is analyzed using 4 different pepti ⁇ corresponding to the epitopes of linear B cells (SU2, SU3, TM2 and TM4) by ELISA and by immunoprecipitation of Env glycoproteins, from lysates of a FL4 cell line, infected with VP, after labeling 35 S.
  • Example 4 Construction of mutants in the chimeric VTH-1 context in which a DIP of VIF or VIS replaces the wild DIP of VT ⁇ -1. in an Env sequence of VTH-1 1; functionality and reactivity of the products obtained.
  • sequence coding for the Env protein of VTH-1 is modified, so that the sequences coding for the peptide fragments SEQ ID No. 1 1 or 12, as defined above, are inserted, in place of the sequence coding for the peptide fragment contained between the two cysteines of the DP of VTH-1. Sequences are thus obtained coding for modified Env proteins, in which the sequence contained between the two cysteines of the DP of VTH-1, in the envelope of HIV-1 LAI, has been replaced by the corresponding sequences of the virus of feline immunodeficiency (VP) or VIS.
  • VP feline immunodeficiency
  • the Smal-BamHI fragment of the envelope of VTH-1 LAI was subcloned into the plasmid pTZ18 and the mutations were introduced by site-directed mutagenesis (Kunkel), using oligonucleotides corresponding to the mutations, as specified above:
  • P s t F I V 5'-ATTTGGGGTTGCAATCAAAATCAATTCTTCTGCACCACTGCAGTGCCTTGGAAT-3 '; P s t S I V:
  • a PstI restriction site upstream of the DP has also been introduced into the envelope, so as not to modify the amino acid sequence.
  • the mutated fragment was then cloned into the expression vector pMA243 (DRAGIC T. et al., J. Virol., 1992, 66, 4794-4802), to analyze the properties of the mutant envelopes.
  • the capacity of the mutant envelopes to induce fusion between cellular membranes, property of the wild envelope, was analyzed using a fusion test carried out after transfection of the envelopes in COS cells and coculture with HeLa cells expressing the cellular receptor.
  • HIV-1, CD4, and the gene for ⁇ -galactosidase placed under the control of HIV-1 LTR (DRAGIC T. et al supra. CHARNEAU P et al, J. Virol, 1992, 66, 2814-... 2820).
  • the fusion of two cell types cells, mediated by the HIV-1 envelope activates the expression of ⁇ -galactosidase and the fused cells can be detected by a blue color, derived from an enzymatic reaction.
  • the two mutant envelopes induced cell fusions and the formation of syn- cytia (Table II).
  • the chimeric clone containing the sequence of VP in the context of the envelope of HIV-1 has shown good efficacy in inducing cell fusion.
  • NAME PANCINO Gianfranco
  • B STREET: 14 QUAI DE LA MARNE

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Abstract

Protéines mutées, codées par un gène env muté de lentivirus, et notamment VIF, VIH ou CAEV, fragments peptidiques inclus dans lesdites protéines mutées, vecteurs d'expression exprimant lesdites protéines mutées ainsi que leurs applications. Lesdits fragments peptidiques sont inclus dans le domaine immunodominant principal (DIP) de la protéine transmembranaire (TM) des lentivirus et notamment du virus de l'immunodéficience féline (VIF), du virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1 et VIH-2) et du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine (CAEV), et sont aptes à modifier les propriétés immunogéniques du DIP et de la protéine Env de lentivirus les contenant. Ces fragments présentent notamment l'une des séquences suivantes: SEQ ID N°1; CNQNQWLCK, SEQ ID N°2: CNQNQFLCK, SEQ ID N°3: CNQNQLWCK, SEQ ID N°4: CNQNQPFCK, SEQ ID N°5: CEHQHFFCK, SEQ ID N°6: CSMGTFFCK, SEQ ID N°7: CLTDSFFCK, SEQ ID N°8: CELKNFFCK, SEQ ID N°9: CRPAAFFCK, SEQ ID N°10: ELGCSGKLICKIP, SEQ ID N°11: IWGCNQNQFFCTTAVPWN, SEQ ID N°12: IWGVAFRQVCTTAVPW.

Description

PROTEINES MUTEES, CODEES PAR UN GENE ENV MUTE DE LENTIVIRUS , FRAGMENTS PEPTI¬ DIQUES ET VECTEURS D ' EXPRESSION
5 La présente invention est relative à des protéines mutées, codées par un gène env muté de lentivirus, et notamment VTF, VIH ou CAEV, à des fragments peptidiques inclus dans lesdites protéines mutées, à des vecteurs d'expression expri¬ mant lesdites protéines mutées ainsi qu'à leurs applications.
L'immunodéficience féline est due à un lentivirus, le virus de l'immunodéficience féline (VIF), qui présente une structure génétique similaire à celle des lentivirus des primates (VIH et VIS).
Un certain nombre de fragments ont été sélectionnés et ont permis la mise au point de tests sensibles et spécifiques pour la détection des animaux séroposi¬ tifs, comme décrits dans les Demandes de Brevets européens n° 0 564 477 du 20 no- vembre 1991, n° 0 577 458 du 16 juin 1993, et français n° 94 07062 du 9 juin 1994, au nom de la Demanderesse, et sont issus, pour la plupart de la protéine Env de VIF, comprenant 854 aminoacides, dont la séquence est décrite dans la Demande euro¬ péenne 0 577 458, qui fournit après clivage 2 fragments glycoprotéiques dénommés SU (glycoprotéine de surface) et TM (glycoprotéine transmembranaire). En particulier, la protéine TM inclut plusieurs fragments intéressants, à savoir :
- un fragment incluant un segment de 51 aminoacides, dénommé TM1, qui correspond aux positions 595-647 de la protéine Env de VIF,
- un fragment incluant un segment de 31 aminoacides, dénommé TM2, qui correspond aux positions 681-711 de la protéine Env de VIF, lequel frag¬ ment contient un épitope incluant la séquence : Cys697-Asn-Gln-Asn-Gln-Phe-Phe-Cys- Lys705 (peptide dénommé P237),
- un fragment incluant un segment de 45 aminoacides, dénommé TM3, qui correspond aux positions 744-788 de la protéine Env de VIF, et - un fragment incluant un segment de 29 aminoacides, dénommé
TM4, qui correspond aux positions 826-854 de la protéine Env de VIF.
Alors que dans le domaine de la détection, l'on dispose maintenant d'un ensemble de réactifs pour la détection du VTF, dans le domaine de l'immunoprotection, il est apparu que le domaine immunodominant principal (DIP) de la protéine d'enveloppe du VIF, comprenant le peptide P237 précité, peut entraîner la formation d'anticorps facilitant l'infection virale, dont l'action a un effet délétère et contraire à celle des anticorps protecteurs engendrés par la vaccination par la protéine Env (J.R. MASCOLA et al., AIDS Research & Human Retroviruses, 1993, 9, 12, 1 175-1184).
En outre, une protéine d'enveloppe complète et mature, sous sa forme oligomérique, est préférable pour induire la formation d'anticorps dirigés contre des épitopes confoπnationnels, parmi lesquels des anticorps neutralisants (C.C. BRODER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11699-1 1703).
Il est apparu que élimination ou le remplacement des résidus Cys du DIP entraîne un défaut de maturation de l'enveloppe qui n'est plus présentée sous sa forme mature, à la surface des cellules infectées (SYU W.J. et al., 1991, J. Virol., 65, 6349-6352, DEDERA et al., J. Virol., 1992, 66, 1207-1209). Les deux résidus cystéines voisins du peptide P237, conservés dans l'ectodomaine de la TM, chez la plupart des rétrovirus, définissent une structure en boucle qui est le constituant majeur du DIP. La séquence en aminoacides entre les deux résidus cystéine est hautement conservée dans une même espèce de lentivirus, telle que VIF ou VIH. Par contre, lorsque l'on compare les différentes espèces de lentivirus, par exemple VIH-1 et VIF, bien que les deux résidus cystéines soient conservés, les séquences en aminoacides situées entre ces deux résidus, ne présentent aucune homologie (figure 1A).
En ce qui concerne le VIH, le Domaine Immunodominant Principal (DIP) de l'enveloppe du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est très conservé parmi les différents isolats viraux du VJΗ-1. La séquence comprise entre les deux cystéines du DIP est aussi conservée parmi les sous-types de VIH- 1 , sauf pour le sous-type 0 {Outsider), qui pourrait correspondre à un nouveau type de VTH-1. La séquence du DIP de VIH-1 diffère totalement de celle de VIH-2, qui est par contre identique à celle du virus de l'immunodéficience simienne (SIV), auquel le VTH-2 est phylogénétiquement apparenté.
De manière générale, le DP des lentivirus peut entraîner la formation d'anticorps facilitant l'infection virale, dont l'action a un effet délétère et contraire à - j celle des anticorps protecteurs engendrés par la vaccination par la protéine Env, comme précisé ci-dessus, pour la protéine d'enveloppe du VIF.
En conséquence, la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à des protéines Env mutées au niveau dudit domaine immunodominant principal (DIP) de la glycoprotéine transmembranaire des lentivirus et notamment du virus de l'immunodéficience féline ou du virus de l'immunodéficience humaine, qui présentent une réactivité significativement différente de celle de la protéine Env sauvage, notam¬ ment en ce qu'elles n'induisent pas la formation d'anticorps délétères, notamment faci¬ litants contre le DIP sauvage, tout en conservant la capacité à produire une réponse immune protectrice, incluant notamment des anticorps neutralisants.
La présente Invention a, en conséquence, pour objet des fragments peptidiques, caractérisés en ce qu'ils constituent des mutants du domaine immunodo¬ minant principal sauvage (DIP) d'une protéine transmembranaire sauvage (TM) de lentivirus et notamment du virus de rimmunodéficience féline (VIF), du virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1 et VIH-2) et du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine (CAEV), lesquels fragments peptidiques sont aptes à modifier les propriétés immunogéniques du DIP, de sorte que la protéine Env de lentivirus les contenant n'entraîne pas la production d'anticorps facilitants ou délétères contre le DIP sauvage, alors qu'elle conserve la capacité à produire des anticorps neutralisants. On entend par mutant du DIP, au sens de la présente invention, au moins une séquence comprise entre les deux cystéines d'un DIP sauvage d'une pro¬ téine TM d'un lentivirus, laquelle séquence est modifiée (1) soit en ce qu'au moins un a inoacide est muté, (2) soit en ce qu'elle comprend la séquence d'un DIP d'une pro¬ téine Env de lentivirus différente de celle dans laquelle ladite séquence DIP est insérée. Pour des raisons pratiques d'insertion, lesdits fragments peptidiques peuvent comprendre en aval et/ou en amont de ladite séquence comprise entre les deux cystéi¬ nes, au moins un aminoacide supplémentaire.
De tels fragments peptidiques remplacent donc le domaine immuno¬ dominant principal (DIP) d'une protéine transmembranaire sauvage (TM) de lentivirus et notamment du virus de l'immunodéficience féline (VIF), du virus de l'immunodéficience humaine (VTH-1 et VTH-2) et du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine (CAEV) et constituent des mutants fonctionnels du DIP de la protéine Env dans laquelle ils sont insérés.
Parmi lesdits fragments, on peut citer :
- le fragment CNQNQWLCK, dénommé f8, (SEQ ID N°l), - le fragment CNQNQFLCK, dénommé fd, (SEQ ID N°2),
- le fragment CNQNQLWCK, dénommé fh, (SEQ ID N°3),
- le fragment CNQNQPFCK, dénommé fin, (SEQ ID N°4),
- le fragment CEHQHFFCK, dénommé nl4, (SEQ ID N°5),
- le fragment CSMGTFFCK, dénommé ni 9, (SEQ H) N°6), - le fragment CLTDSFFCK, dénommé n67, (SEQ ID N°7),
- le fragment CELKNFFCK, dénommé n73, (SEQ ID N°8),
- le fragment CRPAAFFCK, dénommé n92, (SEQ ID N°9),
- le fragment ELGCSGKLICKTP, dénommé M5, (SEQ ID N°10),
- le fragment IWGCNQNQFFCTTAVPWN (SEQ ID N°l 1), - le fragment IWGVAFRQVCTTAVPW (SEQ ID N° 12).
Les séquences ID N°l à JD N°10 sont des mutants fonctionnels du DIP du VIF ; en particulier, la séquence ED N°10 contient la séquence du DIP de VIH- 1, dans une séquence du VIF (c'est-à-dire dans le contexte du VTF), alors que les SEQ ID N°l 1 et 12 sont des mutants fonctionnels du DIP de VIH-1 : la SEQ ID N°l 1 con- tient la séquence du DIP du VIF dans le contexte du VIH-1 (chimère HIV- 1 /VIF) et la SEQ ID N°12 contient la séquence du DIP du VIS dans le contexte du VIH-1 (chimère HTV-1/SIV). Les séquences SEQ ID N°là 9 sont des séquences mutées du DIP du VIF.
La présente Invention a, également, pour objet des protéines Env, caractérisées en ce qu'elles sont mutées au niveau du domaine immunodominant prin¬ cipal (DIP) de la protéine transmembranaire (TM) des lentivirus et notamment du virus de l'immunodéficience féline (VIF), du virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1 et VIH-2) et du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine (CAEV), et en ce qu'elles comprennent l'un des fragments tels que définis ci-dessus, au niveau du DIP, lesquelles protéines n'entraînent pas la production d'anticorps délétères, notamment d'anticorps facilitants, contre le DIP sauvage, mais conservent une conformation adéquate pour la production d'une réponse immune protectrice, incluant notamment la production d'anticorps neutralisants pour une application vaccinale protectrice.
La présente invention a également pour objet des vecteurs d'expression de protéines Env de lentivirus, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un fragment d'acide nucléique muté codant pour une protéine Env mutée telle que définie ci-dessus.
De manière surprenante, de tels vecteurs permettent l'expression d'une enveloppe virale fonctionnelle, mais dont la réactivité immunologique est signifi- cativement modifiée, par rapport à celle de la protéine Env sauvage. En effet, la pro- téiπe mutée et exprimée n'entraîne pas la production d'anticorps facilitants contre le
DIP sauvage, alors qu'elle conserve la capacité à produire des anticorps neutralisants.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur d'expression, il est constitué par un vecteur d'expression, comprenant une séquence codant pour une protéine Env de VIF, dans laquelle la séquence codant pour le DIP (séquence 2077- 2115, en référence à la séquence de formule I de la Demande EP 0 577 458), est rem¬ placée par une séquence codant pour l'un quelconque des fragments peptidiques SEQ N° 1 à 10, tels que définis ci-dessus.
Ledit vecteur peut être avantageusement construit à partir d'un vec¬ teur tel que décrit dans G. PANCINO et al., Virology, 1995, 206, 796-806. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit vecteur d'expression, il est constitué par un vecteur d'expression, comprenant une séquence codant pour une protéine Env de VTH-1 dans laquelle la séquence codant pour le DIP sauvage est remplacée par une séquence codant pour un mutant du domaine immuno¬ dominant principal sauvage (DIP) d'une protéine transmembranaire sauvage (TM), issu du virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1 et VJΗ-2) ou d'un autre lentivirus et apte à modifier les propriétés immunogéniques du DIP ; de manière préférée, la dite séquence code pour l'un quelconque des fragments peptidiques SEQ N° 11 ou 12, tels que définis ci-dessus.
De manière préférée, lesdites séquences codant pour le DP sont sélectionnées parmi les séquences suivantes (SEQ ID N° 13 à 24) :
- séquence codant pour la séquence ID N°l : TGT AAT CAA AAT CAA TGG CTT TGC AAA (SEQ ID N°13), pour l'obtention du vecteur pf8. 20, - séquence codant pour la séquence ID N° 2 : TGT AAT CAA AAT CAA TTT TTA TGC AAA (SEQ ID N°14), pour l'obtention du vecteur pfdΔ20,
- séquence codant pour la séquence ID N° 3 : TGT AAT CAA AAT CAA TTG TGG TGC AAA (SEQ ID N°15), pour l'obtention du vecteur pfhΔ20, - séquence codant pour la séquence ID N° 4 : TGT AAT CAA AAT
CAA CCT TTT TGC AAA (SEQ ID N°16), pour l'obtention du vecteur pfmΔ20,
- séquence codant pour la séquence ID N° 5 : TGT GAA CAT CAG CAT TTT TTC TGC AAA (SEQ ID N°17), pour l'obtention du vecteur pnl4Δ20,
- séquence codant pour la séquence ID N° 6 : TGT AGT ATG GGG ACG TTT TTC TGC AAA (SEQ ID N°18), pour l'obtention du vecteur pnl9Δ20,
- séquence codant pour la séquence ID N° 7 :TGT TTG ACA GAT TCG TTT TTC TGC AAA (SEQ ID N°19), pour l'obtention du vecteur pn67Δ20,
- séquence codant pour la séquence ID N° 8 : TGT GAA CTC AAA AAC TTT TTC TGC AAA (SEQ ID N°20), pour l'obtention du vecteur pn73Δ20, - séquence codant pour la séquence ID N° 9 : TGT CGG CC A GCT
GCT TTT TTC TGC AAA (SEQ ID N°21), pour l'obtention du vecteur pn92Δ20,
- séquence codant pour la séquence ID N° 10 : GAG CTC GGA TGT TCT GGA AAA CTC ATT TGC AAA ATC CCT (SEQ ID N°22), pour l'obtention du vecteur pM5Δ20, - séquence codant pour la séquence ID N° 11 : ATT TGG GGT TGC
AAT CAA AAT CAA TTC TTC TGC ACC ACT GCA GTG CCT TGG AAT-3' (SEQ ID N°23).
- séquence codant pour la séquence ED N° 12 ATT TGG GGT TGC GCG TTT AGA CAA GTC TGC ACC ACT GCA GTG CCT TGG AA-3' (SEQ ID N°24).
Les séquences nucléiques selon l'invention incluent toutes les sé- quences codant pour les mêmes aminoacides (aminoacide codé par un codon différent de celui illustré aux séquences 13 à 24).
La présente invention a également pour objet des clones moléculaires infectieux de lentivirus mutés, caractérisés en ce qu'ils incluent une séquence codant pour une protéine Env mutée, telle que définie ci-dessus. De manière préférée, lesdits clones mutés sont obtenus par introduc¬ tion dans un clone moléculaire infectieux de VIF, de préférence dans le clone molécu- laire infectieux p34TF10, d'un fragment contenant les mutations précitées au niveau des séquences codant pour le DIP, à la place des séquences sauvages correspondantes. Selon la séquence mutée introduite, on obtient les clones suivants : pTf8, pTfd, pTfh, pTnl4, pTnl9, pTn67, pTn73, pTn92 et pTM5. De tels clones sont notamment obtenus par incorporation dans le génome de "VTF p34TF10, de fragments Spel- BstBI 8287-8918 dudit génome de VIF p34TF10 contenant les mutations précitées, à la place des séquences sauvages corres¬ pondantes.
Egalement de manière préférée, lesdits clones mutés sont obtenus par introduction dans un clone moléculaire infectieux de VIH-1, d'un fragment contenant les mutations précitées, au niveau des séquences codant pour le DP, à la place des séquences sauvages correspondantes.
De tels clones ont l'avantage de pouvoir être directement utilisés en tant que vaccin vivant atténué. La présente invention a également pour objet des compositions vac¬ cinales, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une protéine Env mutée et/ou au moins un vecteur d'expression et/ou au moins un clone muté, tels que définis ci-dessus.
La présente invention a, en outre, pour objet un procédé de sur- veillance d'une vaccination anti-lentivirus et/ou de différenciation entre une vaccination anti-lentivirus et une infection par un lentivirus, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact d'un fragment peptidique selon l'invention avec un échantillon biologi¬ que (sang, notamment) et la détection du complexe antigène (fragment peptidique)- anticorps (produits lors de la vaccination ou lors de l'infection) formé, par tout moyen approprié.
Dans un tel procédé, le DP muté sert avantageusement de séquence marqueur ; en effet, les anticorps produits contre le DP seront différents en cas de vaccination (DP muté) et en cas d'infection (DP sauvage). Dans un tel contexte, si une infection virale intervient pendant la vaccination, on pourra effectivement la distin- guer, les deux réponses immunologiques étant différentes, du fait de la présence du DP muté et de l'absence du DP sauvage, dans la composition vaccinale. On peut, pour le DP sauvage, utiliser les systèmes de détection tels que ceux décrits dans les Demandes de Brevets européens n° 0 564 477 du 20 novem¬ bre 1991, n° 0 577 458 du 16 juin 1993, et français n° 94 07062 du 9 juin 1994 ; pour détecter les DP mutés, on peut utiliser des systèmes de détection analogues, mettant en oeuvre les peptides du DP muté tels que définis ci-dessus, comme réactifs, au lieu du DP sauvage (voir Exemple 1).
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 représente l'alignement des séquences des DP de TM de différents lentivirus,
- la figure 2 représente le vecteur d'expression d'enveloppe pTΔ20,
- la figure 3 représente le résultat des tests de fusion avec le vecteur contenant la séquence M5.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 : Construction de mutants dans le contexte VIF (chimères dans les- quelles un DIP de VIH remplace le DIP sauvage de VIF, dans une séquence Env de VIF).
La séquence codant pour la protéine Env de "VTF est modifiée, de manière à ce que les séquences codant pour les fragments peptidiques selon l'invention tels que définis ci-dessus (SEQ ID N°l à 10), soient insérées, à la place de la séquence codant pour le peptide P237 précité (positions 2077-2115 de la séquence codant pour la protéine Env, telle que décrite dans la Demande de Brevet Européen n° 0 577 458 ; lesdites séquences codant pour une protéine Env, ainsi modifiées (séquences env mutantes), sont insérées dans un vecteur dénommé pTΔ20, qui comporte une délétion du nucléotide 923 au nucléotide 5410 dans le gène VIF (gènes gag et pot). L'obtention du vecteur ρTΔ20 est décrite dans G. PANCINO et al.,
Virology, 1995, 206, 796-806. Le vecteur d'expression Env pTΔ20 (figure 2) est dérivé du clone moléculaire infectieux de VIF p34TF10, par délétion des gènes gag etpol.
Des fragments Spel-BstBI 8287-8918 du gène env de VTF ρ34TF10, contenant les mutations précitées sont introduites dans le vecteur d'expression, à la place des fragments correspondants contenant la séquence sauvage.
Pour produire le vecteur d'expression env du VP et pour l'utiliser dans les cellules félines, une délétion des gènes gag et pol, est réalisée dans le provirus p34TF10 (TALBOTT et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 5743-5747) par digestion Tthl 11-EcoRV et religature après un traitement avec l'enzyme de Klenow. Un clone, dénommé pTΔ20, qui comporte une délétion plus large, du nucléotide 923 au nucléotide 5410 exprime effectivement ladite protéine Env, après transfection dans les cellules CrFK (Virology, 1995, 206, 796-806). Exemple 2 : Peptides mutés obtenus à l'exemple 1 et protéines Env les conte¬ nant : fonctionnalité et réactivité. * Méthode :
- Pour tester la fonctionnalité des enveloppes mutées, les vecteurs d'expression précités (pf8Δ20, pfdΔ20, pfhΔ20, prmΔ20, pnl4Δ20, pnl9Δ20, pn67Δ20, pn73aA20, pn92Δ20, pM5Δ20,) produisant des protéines Env mutées con¬ formes à l'invention sont transfectés dans des cellules CrFK et analysés pour leur capacité à induire la fusion des membranes cellulaires (formation de syncytia).
Pour réaliser ce test, il est nécessaire de transfecter lesdits 10 vec¬ teurs d'expression, contenant les enveloppes mutées, dans des fibroblastes félins CrFK, conformément au protocole suivant :
Une lignée cellulaire de fibroblastes félins CrFK-H06Tl/2 (OSBORNE et al., J. Gen. Virol., 1994, 75, 3641-3645) est cultivée dans un milieu Eagle modifié Dulbecco complémenté avec du sérum de veau à 10 %.
Les plasmides sont purifiés en utilisant le système maxiprep Promega, puis sont extraits au phénol-chloroforme. La transfection est réalisée en utilisant la méthode de précipitation au phosphate de calcium. Les conditions de transfection sont optimisées et standardisées en utilisant des plasmides exprimant les gènes reporters β-galactosidase ou luciférase. - Pour tester la réactivité des domaines mutés avec des sérums de chats infectés par un VP, un ELIS A avec les peptides selon l'invention est réalisé. Les plaques de microtitration, contenant 96 puits (Immunolon® 2), sont recouvertes avec lesdits peptides, dans un tampon carbonate 0, 1 M, pH 9,6 (5 μg ml), à 4°C pendant une nuit.
Après blocage avec de la sérum albumine bovine à 3 %, des sérums félins dilués dans du PBS, de la sérum albumine bovine à 1 % et du Tween 20 à 0, 1 %, sont ajoutés et incubés pendant 2 heures.
Après 5 lavages avec du PBS Tween 20 1 %, des anticorps anti-chat conjugués à de la peroxydase sont incubés pendant 1 heure. Après 5 lavages, la réac¬ tion est révélée en utilisant de l'ABTS à 0,4 mg/ml et en lisant la densité optique 30 min après.
De la même manière, on peut tester la réactivité des domaines mutés avec des sérums humains infectés par le VIH-1. Dans ce cas, le protocole est le même, à l'exception de l'utilisation de sérum de veau foetal à 5 %, à la place de la sérum albumine bovine.
* Résultats :
- Formation de syncytia :
Les vecteurs mutés contenant les séquences ID N°l à N°10, produi- sent des syncytia, comme illustré dans le Tableau I ci-après :
TABLEAU I
Figure imgf000013_0001
* » 100 syncytia/puits °°ND : non effectué
#NI : non interprétable dans l'ELISA-peptide, à cause du bruit de fond dans la réaction du peptide n92 avec des sérums témoins de chats non infectés. L'existence d'une réaction croisée du peptide n92 avec le peptide TM2 a été toutefois écartée par des expériences de compétition entre les deux peptides.
Le vecteur muté pM5Δ20, contenant un fragment muté du DP de VIH a été testé dans une autre expérience et a également montré la formation de syn¬ cytia.
La figure 3 illustre les résultats obtenus avec le vecteur M5 (en com¬ paraison avec le type sauvage W).
Les chimères VIH VP M5 sont capables d'induire la formation de syncytia (figure 3), plus petits en taille (5-20 noyaux, 48 heures après la transfection) que ceux induits par le type sauvage (W).
La taille et le nombre de syncytia induits par M5 augmentent avec le temps jusqu'à 72 heures.
- Réactivité immunologique : Les modifications produites dans les propriétés immunologiques des
DP par les mutations qui conservent la capacité fusogénique des enveloppes mutantes sont testées par « ELISA peptide ». Les peptides correspondant au DP muté (Tableau I) sont synthétisés et utilisés pour recouvrir des microplaques ELISA. 8 sérums de chats, expérimentale¬ ment infectés avec 4 isolats différents de VP et 11 sérums provenant de chats naturel¬ lement infectés sont testés pour évaluer la réactivité de ces peptides. Les valeurs de densité optique obtenues avec les peptides DP mutants sont comparées avec les valeurs obtenues avec le peptide DP sauvage (TM2) comprenant le peptide P237.
Une réduction importante de la réactivité de la plupart des mutants est mise en valeur par rapport au peptide TM2. Le Tableau I ci-dessus montre pour chaque peptide, le nombre de sérums qui ont montré une réactivité de plus de 25 % par rapport à la réactivité du peptide TM2.
Dans certains cas, avec les sérums qui montrent une réactivité avec les peptides mutants, des essais par compétition ont été réalisés entre le peptide TM2 et les peptides mutés.
Dans aucun cas, un peptide muté inhibe la réactivité du sérum vis-à- vis du peptide TM2, tandis que le peptide TM2 inhibe complètement la réactivité des sérums de chats infectés par les protéines mutées.
Ces résultats montrent que les mutations introduites dans le DP de VP modifient profondément sa reconnaissance par des sérums de chats infectés par un VP (immunoréactivité significativement modifiée).
* Réactivité croisée entre les DIP de VIF et de VIH-1 : Deux ELISA ont été mis au point pour tester soit la réactivité du DP de VP avec du sérum humain infecté par VIH-1, soit la réactivité du DP de VTH-1 avec du sérum de chat infecté par le VP.
La réactivité des sérums de 8 patients infectés par le VIH-1 et de 10 chats naturellement infectés par le VTF avec les peptides correspondants aux DP soit de VTH-1 ou VP, a été testée avec un ELISA.
Les peptides p237 et SP89029 (Catalogue ANRS, 1994) correspon- dant aux séquences de VP et de VTH-1 (DP) respectivement et 2 peptides chimique¬ ment cyclisés entre les deux cystéines (Y-15-Vc (YOELGCNONOFFCLV et L-15-Tc fLLGIWGCSGKLICTT) respectivement pour le VP et le VTH-1), de manière à mimer le repliement naturel, ont été utilisés pour recouvrir des plaques de microtitration.
Les sérums d'individus infectés par le VIH-1 réagissent fortement avec les peptides contenant un DP issu de VJΗ-l (SP89029 et L-15-Tc), mais pas avec les peptides VP, c'est-à-dire les peptides contenant un DP issu du VTF (P237 et
Y-15-Vc) et, de manière correspondante, les sérums de chats infectés par le VP reconnaissent les peptides VP, mais pas les peptides VIH-1.
Ainsi, aucune réaction croisée ne peut être détectée entre les deux
DP. Ceci permet l'utilisation d'un ELISA peptide adapté, pour suivre les protocoles de vaccination anti-VIH-1, basés sur des enveloppes chimères contenant la séquence de
DP du VP dans le contexte VPI-1 ou d'autres mutations qui modifient les propriétés antigéniques du DP de VPI-1.
Une approche réciproque est également possible dans le cas de la vaccination contre le VP, en utilisant un DP VTH-1 ou d'autres séquences mutées de l'enveloppe de VP.
Exemple 3 : Vaccination génîque
L'administration des produits de gène env de VP tels que définis ci- dessus, par injection d'ADN brut a été étudiée, de manière à permettre un protocole vaccinal qui permettrait l'analyse de la réponse immune des protéines d'enveloppe sau- vage, en comparaison avec les enveloppes mutées dans la région DP.
Le vecteur d'expression Env pTΔ20, dérivé du clone moléculaire infectieux de VP p34TF10, par délétion des gènes gag etpol, est utilisé pour vacciner des chats.
On injecte du vecteur pTΔ20 en intra-musculaire à 4 chats (4 injec- tions de 200-400 μg d'ADN). La réponse en anticoφs est analysée en utilisant 4 pepti¬ des différents correspondant aux épitopes des cellules B linéaires (SU2, SU3, TM2 et TM4) par ELISA et par immunoprécipitation des glycoprotéines Env, à partir des lysats d'une lignée cellulaire FL4, infectés avec du VP, après marquage 35S.
3 des 4 chats montrent une réponse faible au moins à 2 peptides. Un sérum est également capable de précipiter les glycoprotéines d'enveloppe (dernière dilution testée 1:320) à partir des cellules FL4. Ces résultats indiquent que l'immunisation basée sur le gène env entraîne bien une réponse immune et donc son utilisation dans les vaccins avec les protéines Env mutées.
Exemple 4 ; Construction de mutants dans le contexte VTH-1 chimères dans les¬ quelles un DIP de VIF ou de VIS remplace le DIP sauvage de VTϋ-1. dans une séquence Env de VTH-1 1 ; fonctionnalité et réactivité des produits obtenus.
La séquence codant pour la protéine Env de VTH-1 est modifiée, de manière à ce que les séquences codant pour les fragments peptidiques SEQ ID n°l 1 ou 12, tels que définis ci-dessus, soient insérées, à la place de la séquence codant pour le fragment peptidique contenu entre les deux cystéines du DP de VTH-1. On obtient ainsi des séquences codant pour des protéines Env modi¬ fiées, dans lesquelles la séquence contenue entre les deux cystéines du DP de VTH-1, dans l'enveloppe de HIV-1 LAI, a été remplacée par les séquences correspondantes du virus de l'immunodéficience féline (VP) ou du VIS.
Pour ce faire, le fragment Smal-BamHI de l'enveloppe de VTH-1 LAI a été sous-cloné dans le plasmide pTZ18 et les mutations ont été introduites par mutagénèse dirigée (Kunkel), en utilisant des oligonucléotides correspondants aux mutations, comme précisé ci-dessus :
P s t F I V : 5'-ATTTGGGGTTGCAATCAAAATCAATTCTTCTGCACCACTGCAGTGCCTTGGAAT-3 ' ; P s t S I V :
5 •-ATTTGGGGTTGCGCGTTTAGACAAGTCTGCACCACTGCAGTGCCTTGGAA-3 ' .
Pour permettre le criblage des clones recombinants, on a aussi intro¬ duit dans l'enveloppe un site de restriction Pstl en amont du DP, de façon à ne pas modifier la séquence en acides aminés. Le fragment muté a été ensuite clone dans le vecteur d'expression pMA243 (DRAGIC T. et al., J. Virol., 1992, 66, 4794-4802), pour analyser les propriétés des enveloppes mutantes.
La capacité des enveloppes mutantes à induire la fusion entre mem¬ branes cellulaires, propriété de l'enveloppe sauvage, a été analysée en utilisant un test de fusion effectué après transfection des enveloppes dans des cellules COS et coculture avec des cellules HeLa exprimant le récepteur cellulaire de VIH-1, CD4 et le gène de la β-galactosidase placé sous le contrôle du LTR VIH-1 (DRAGIC T. et al. précité ; CHARNEAU P. et al., J. Virol., 1992, 66, 2814-2820). La fusion de deux types cellu- laires, médiée par l'enveloppe de VIH-1, active l'expression de la β-galactosidase et les cellules fusionnées peuvent être détectées par une coloration bleue, dérivée d'une réac¬ tion enzymatique. Après transfection de 3 μg d'ADN/puits dans des plaques de 6 puits, les deux enveloppes mutantes ont induit des fusions cellulaires et la formation de syn- cytia (Tableau II). En particulier, le clone chimérique contenant la séquence du VP dans le contexte de l'enveloppe du VIH-1 a montré une bonne efficacité à induire la fusion cellulaire.
TABLEAU II
* moyenne du dénombrement de 3 puits L'expression et la maturation des enveloppes mutantes ont été ana¬ lysées par marquage métabolique avec méthionine et cystéine [ ]S des cellules trans- fectées, suivi par une immunoprécipitation des protéines de l'enveloppe avec un pool de sérums humains provenants de donneurs séropositifs. Cette étude a montré que les précurseurs d'enveloppe des deux mutants étaient produits en quantité comparable au clone sauvage. Les précurseurs des deux enveloppes mutantes étaient correctement clivés pour donner naissance aux deux sous-unités du complexe mature de l'enveloppe, la glycoprotéine extracellulaire (SU) et la glycoprotéine transmembranaire (TM). L'immunoprécipitation des glycoprotéines SU des surnageants de culture a montré que les SU des enveloppes mutées étaient libérées dans le surnageant en quantité supérieure à celle de l'enveloppe sauvage.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nul¬ lement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien¬ nent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les va¬ riantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
- CNRS
(B) RUE: 3 RUE MICHEL ANGE (C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75794 CEDEX 16
(A) NOM: PANCINO Gianfranco (B) RUE: 14 QUAI DE LA MARNE
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75019 (A) NOM: SONIGO Pierre
(B) RUE: 23 RUE GUTEMBERG
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75015
(ii) TITRE DE L'INVENTION: PROTEINES MUTEES CODEES PAR UN GENE env MUTE
DE LENTIVIRUS, FRAGMENTS PEPTIDIQUES INCLUS DANS LESDITES PROTEINES, VECTEURS D'EXPRESSION EXPRIMaWT LESDITES PROTEINES ET LEURS APPLICATIONS.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 24
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 9503566
(B) DATE DE DEPOT: 27-MAR-1995
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 9 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1
Cys Asn Gin Asn Gin Trp Leu Cys Lys 1 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 9 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Cys Asn Gin Asn Gin Phe Leu Cys Lys 1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 9 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Cys Asn Gin Asn Gin Leu Trp Cys Lys 1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 9 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Cys Asn Gin Asn Gin Pro Phe Cys Lys 1 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 9 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Cys Glu His Gin His Phe Phe Cys Lys 1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 9 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Cys Ser Met Gly Thr Phe Phe Cys Lys 1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 9 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: Cys Leu Thr Asp Ser Phe Phe Cys Lys 1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 9 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Cys Glu Leu Lys Asn Phe Phe Cys Lys 1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 9 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Cys Arg Pro Ala Ala Phe Phe Cys Lys 1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 13 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
Glu Leu Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Lys Ile Pro 1 5 10 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
Ile Trp Gly Cys Asn Gin Asn Gin Phe Phe Cys Thr Thr Ala Val Pro 1 5 10 15
Trp Asn
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
Ile Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gin Val Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp 1 5 10 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: TGTAATCAAA ATCAATGGCT TTGCAAA 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléi-que
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: TGTAATCAAA ATCAATTTTT ATGCAAA 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
TGTAATCAAA ATCAATTGTG GTGCAAA 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: TGTAATCAAA ATCAACCTTT TTGCAAA 27 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE*
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: TGTGAACATC AGCATTTTTT CTGCAAA 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18: TGTAGTATGG GGACGTTTTT CTGCAAA 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléi-que
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: TGTTTGACAG ATTCGTTTTT CTGCAAA 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGOLUCLEOTIDE "
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20: TGTGAACTCA AAAACTTTTT CTGCAAA 27 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:
TGTCGGCCAG CTGCTTTTTT CTGCAAA 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22: GAGCTCGGAT GTTCTGGAAA ACTCATTTGC AAAATCCCT 39 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 54 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23: ATTTGGGGTT GCAATCAAAA TCAATTCTTC TGCACCACTG CAGTGCCTTG GAAT 54 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 24:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 50 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24:
ATTTGGGGTT GCGCGTTTAG ACAAGTCTGC ACCACTGCAG TGCCTTGGAA 50

Claims

REVENDICATIONS 1°) Fragments peptidiques, caractérisés en ce qu'ils constituent des mutants du domaine immunodominant principal sauvage (DP) d'une protéine trans¬ membranaire sauvage (TM) de lentivirus et notamment du virus de l'immunodéficience féline (VP), du virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1 et VPI-2) et du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine (CAEV), lesquels fragments peptidiques sont aptes à modifier les propriétés immunogéniques du DP, de sorte que la protéine Env de lentivirus les contenant n'entraîne pas la production d'anticoφs facilitants ou délétères contre le DP sauvage, alors qu'elle conserve la capacité à produire des anticoφs neutralisants.
2°) Fragments peptidiques selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une séquence comprise entre les deux cystéines d'un DP sauvage d'une protéine TM d'un lentivirus, laquelle séquence est modifiée (1) soit en ce qu'au moins un aminoacide est muté, (2) soit en ce qu'elle comprend la séquence d'un DP d'une protéine Env de lentivirus différente de celle dans laquelle ladite séquence DP est insérée.
3°) Fragments selon la revendication 1 ou la revendication 2, carac¬ térisés en ce qu'ils présentent l'une des séquences SEQ P) N°l à SEQ ID N°12.
4°) Protéines Env, caractérisées en ce qu'elles sont mutées au niveau du domaine immunodominant principal (DP) de la protéine transmembranaire (TM) des lentivirus et notamment du virus de l'immunodéficience féline (VP), du virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1 et VIH-2) et du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine (CAEV), et en ce qu'elles comprennent l'un des fragments selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, lesquelles protéines n'entraînent pas la pro- duction d'anticoφs délétères contre le DP sauvage, mais conservent une conformation adéquate à la production d'une réponse immune protectrice, incluant notamment des anticoφs neutralisants.
5°) Vecteur d'expression de protéines Env de lentivirus, caractérisé en ce qu'il est constitué par un vecteur d'expression, comprenant une séquence codant pour une protéine Env de lentivirus, dans laquelle la séquence codant pour le DP est remplacée par une séquence codant pour l'un quelconque des fragments peptidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 6°) Vecteur selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdites séquences codant pour le DP sont sélectionnées parmi les séquences SEQ ID N°13 à 24.
7°) Clones moléculaires infectieux de lentivirus mutés, caractérisés en ce qu'ils incluent une séquence codant pour une protéine Env mutée, selon la revendi¬ cation 4.
8°) Clones selon la revendication 7, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par introduction dans un clone moléculaire infectieux de VP, de préférence dans le clone moléculaire infectieux p34TF10, d'un fragment contenant des mutations au niveau des séquences codant pour le DP telles que définies aux revendications 1 à
3, à la place des séquences sauvages correspondantes.
9°) Clones selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés parmi pTf8, pTfd, pTfh, pTnl4, pTnl9, pTn67, pTn73, pTn92 et pTM5, selon la séquence mutée introduite. 10°) Clones selon la revendication 7, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par introduction dans un clone moléculaire infectieux de VIH-1, d'un fragment contenant des mutations, au niveau des séquences codant pour le DP, à la place des séquences sauvages correspondantes.
11°) Compositions vaccinales, caractérisées en ce qu'elles compren- nent au moins une protéine Env mutée selon la revendication 4 et/ou au moins un vec¬ teur d'expression selon l'une quelconque des revendications 5 à 6 et/ ou un clone selon l'une quelconque des revendications 7 à 10.
12°) Procédé de surveillance d'une vaccination anti-lentivirus et/ou de différenciation entre une vaccination anti-lentivirus et une infection par un lentivirus, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact d'un fragment peptidique selon l'invention avec un échantillon biologique (sang, notamment) et la détection du complexe antigène (fragment peptidique)-anticoφs (produits lors de la vaccination ou lors de l'infection) formé, par tout moyen approprié.
13°) Réactif de diagnostic, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
PCT/FR1996/000449 1995-03-27 1996-03-26 Proteines mutees, codees par un gene env mute de lentivirus, fragments peptidiques et vecteurs d'expression WO1996030527A1 (fr)

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