WO1996030383A1 - Nukleinsäure-polyester-polyamide - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
Definitions
- Natural nucleic acids have a 3 '-5' linkage, which is the basis for the formation of the double helix and thus for the biological function of nucleic acids. Such nucleic acids are easily cleaved by hydrolysis of the phosphoric ester bond. When using nucleotides for molecular biological, diagnostic and therapeutic purposes, the production of nuclease-resistant compounds is therefore always an important goal.
- oligonucleotide analogs which are not linked by 3 '-5'- but 2' -5-'- are also able to pair with natural RNA or DNA, especially if the The number of atoms between the two sugar rings of the nucleosides is 3, but special attention is paid to the type of linking elements. Too great flexibility of such a link between two nucleoside units can lead to a severe restriction or even to the loss of the binding ability. On the other hand, rigidization that is too rigid or too sterically demanding can have the same negative effect.
- the present invention relates to nucleotide carboxylic acid esters and amides of the general formula I
- R 5 is a hydrogen, chlorine or bromine atom, a hydroxyl, amino, monomethoxytritylamino, mercapto, methylamino, dimethylamino, phenylamino or hydroxylamino group
- R 9 hydrogen, fluorine, chlorine, or bromine or iodine atom, a methyl, trifluoro, ethyl, ethyl or hydroxymethyl group, and the salts of compounds of general form I with acids or bases.
- the invention includes Nukleotidoligoester and -oligoamide with the above St ⁇ * ⁇ jJ structure with a number of from 2 to 200 nucleotide units.
- oligonucleotide analogs of the subject invention can be prepared from the suitably protected monomers by conventional condensation processes after the carboxylic acid has been activated beforehand.
- Binding experiments with natural nucleic acids show that oligonucleotides of the present invention are suitable for pairing with natural nucleic acids.
- Molecular dynamics Studies show that esters and amide bonds are superior to other bridging compounds.
- the invention includes the use of such nucleotide oligoesters and oligoamides as therapeutic agents, for diagnostic purposes and as research reagents.
- the best way to investigate the binding behavior of a short Watson-Crick complementary strand is with the additional cooperative "support" of a third polymer strand that forms the pair of Hoogsteen.
- the artificial dinucleotide 4 was thus examined under salt and buffer conditions that allow triplex formation.
- the transformation temperature of the 2Poly-U / artificial dinucleotide system was 15 ° C. It could thus be shown that such 2'-5 'ester-linked artificial nucleotides recognize natural 3'-5'-phosphate-linked oligonucleotides and can interact with them.
- ester modification showed the highest affinity for the complementary RNA strand. More flexible linking systems such as ether modification did not show a high affinity for the counterpart, but the hybrid double strand dissolved after a short time and the strands became entangled.
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Abstract
Die Erfindung beinhaltet neue Struktur-modifizierte Oligonukleotide, ein Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung. Diese Oligonukleotidanaloga sind nicht wie natürliche Oligonukleotide 3'-5'- sondern 2'-5'- verknüpft. Die Zahl der Atome zwischen den beiden Zuckerringen beträgt 3, und die Verknüpfung besteht entweder aus einem Carbonsäureester oder Carbonsäureamid. Derartig modifizierte Oligonukleotide können mit natürlicher Nukleinsäure interagieren. Daher können Oligomere dieser Erfindung als potentielle Arzneistoffe Verwendung finden.
Description
Nukleinsäure-Polyester-Polyamide
Natürliche Nukleinsäuren weisen eine 3 '-5 '-Verknüpfung auf, welche die Basis für die Ausformung der Doppelhelix und somit für die biologische Funktion von Nukleinsäuren ist. Solche Nukleinsäuren werden leicht durch eine Hydrolyse der Phosphorester-Bindung gespalten. Bei der Anwendung von Nucleotiden für molekularbiologische, diagnostische und therapeutische Zwecke ist daher die Herstellung nukleaseresistenter Verbindungen stets ein wichtiges Ziel.
Wir konnten mittels Molecular Modeling Studien zeigen (Figur 1), daß Oligonucleotidanaloga, welche nicht 3 '-5'- sondern 2 '-5 -'-verknüpft sind, auch mit natürlicher RNA bzw. DNA grundsätzlich paaningsfahig sind, vor allem, wenn die Anzahl der Atome zwischen den beiden Zuckerringen der Nukleoside die Zahl 3 beträgt, wobei aber besonderes Augenmerk der Art der Verknüpfungselemente -αikommt. So kann eine zu große Flexibilität einer solchen Verknüpfung zwischen zwei Nukleosideinheiten zu einer starken Einschränkung oder gar zum Verlust der Bindungsfähigkeit fuhren. Anderseits kann eine zu starre oder sterisch zu anspruchsvolle Rigidisierung den gleiche negativen Effekt ausüben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Nukleotidcarbonsäureester und -amide der allgemeinen Formel I
bei welchen die Zuckerringe der Nukleoside mit mindestens einer Brücke verknüpft sind, welche aus 3 Atomen besteht und entweder eine Carbonsäureester oder Carbonsäureamid Gruppe beinhaltet und welcher A = -0-C(=0)-, -N(-Rι)-C(=0)-, wobei R,= H, oder unverzweigtes oder verzweigtes unsubstituiertes oder entständig mit Säure- oder Basenfunktion substituiertes Alkyl mit einer Kettenlänge von 1 bis 6 C-Atomen bedeutet, in welcher R2 und R3=H oder Niederalkyl in beliebiger Kombination bedeutet und R4=H, OH oder unverzweigtes oder verzweigtes unsubstituiertes oder endständig mit Säure¬ oder Basenfunktion substituiertes O-Alkyl mit einer Kettenlänge von 1 bis 6 C-Atomen
ERSATM.ATT (REGEL 26)
bedeutet und in welcher B den N-glykosidisch gebundenen Rest einer Purin- oder Pyrimidinbase der allgemeinen Formel II oder III
II m
bedeutet, wobei R5 ein Wasserstoff-, Chlor- oder Bromatom, eine Hydroxyl-, Amino-, Monomethoxytritylamino, Mercapto-, Methylamino-, Dimethylamino-, Phenylamino- oder Hydroxylaminogruppe, R* ein Wasserstoff-, Chlor- oder Bromatom, eine Hydroxyl-, Amino-, Mercaptogruppe, R eine Hydroxyl- oder Aminogruppe, Rg ein Sauerstoffatom (=0), und R9 Wasserstoff-, Fluor-, Chlor-, oder Brom- oder Jodatom, eine Methyl-, Trifluor, ethyl-, Ethyl oder Hydroxymethylgruppe bedeutet, sowie die Salze von Verbindungen der allgemeinen Form I mit Säuren oder Basen.
Die Erfindung beinhaltet Nukleotidoligoester und -oligoamide mit der oben angeführten Stι*τjJ tur mit einer Anzahl von Nucleotideinheiten von 2 bis 200.
Die Oligonucleotidanaloga der gegenständlichen Erfingdung können durch übliche Kondensationsverfahren nach vorhergehender Aktivierung der Carbonsäure aus den geeignet geschützten Monomeren hergestellt werden.
Bindungsexperimente mit natürlichen Nukleinsäuren zeigen, daß Oligonukleotide der gegenständlichen Erfindung zur Paarung mit Natürlichen Nukleinsäuren geeignet sind. Molekül Dynamik Studien zeigen, daß Ester und Amid-Bindungen anderen Brückenverknüpfungen überlegen sind.
Die Erfindung beinhaltet die Anwendung derartiger Nukleotidoligoester und -oligoamide als Therapeu ika, für diagnostische Zwecke und als Forschungsreagenzien.
ERSÄΓZBLAΪT (REGEL 26)
Beispiele:
5'-Deoxy-6N-monomethoxytrityl-2,-3'isopropylidenadenosiιι-carboιιsäure-2'-0(3'-0- methy l-5'-O-monomethoxytrityI)-uridinyl-ester ( 1 )
590 mg (0.96 mmol) 5,-Deoxy-6-N-[4-(methoxyphenyl)-diphenyl-methyl]-2',3,-0- isopropyliden-adenosin-5 '-carbonsäure wurden in wasserfreiem Dichlormethan gelöst und mit 590 mg (1.2 mmol) 3'-0-Methyl-5'-0-momomeώoxytrityl-uridin, 300 mg (1.45 mmol) DCC und 10 mg Dimemylammopyridin versetzt. Die Lösimg wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann eingedampft. Nach Reinigung mittels Säulenchromatographie (80 g Kieselgel, Eluens: Dichlormethan/Aceton 9/1) wurde 670 mg (65 % der Theorie) 1 erhalten. DC: Dichlormethan/Aceton=9/l, Rf.: 0.46 1: weißer Schaum
-H-NMR (CDC13) (300 MHz): δ= 8.05 (s, IH, 2-H); 7.9 (s, IH, 8-H); 7.8 (d, IH, 6-H Uridin); 7.4-7.2 ( , 24H, MMT); 6.85 (d, 2H, MMT); 6.75 (d, 2H, MMT); 6.1 (d, IH, 1'- H-A); 6.04 (d, IH, l'-H-U); 5.5 (m, IH, 2'-H-U); 5.45 (m, IH, 2'-H-A); 5.38 (d, IH, 5-H Uridin); 5.09 (m, IH, 3'-H-A); 4.65 (m, IH, 4'-H-A); 4.2-4.1 (m, 2H, 3',4'-H-U); 3.85 (s, 3H, OCH3-MMT); 3.8 (s, 3H, OCH3-MMT); 3.55 (d, IH, 5'-H'-U); 3.4 (d, IH, 5'-H"-U); 3.3 (s, 3H, OCH3); 3.0-2.9 (m, 2H, 5'-CH2-A); 1.6 (s, 3H, CH3); 1 4 (s, 3H, CH3).
5'-Deso_y-adenosin-5,-carboιιsäure-2,-0-(3'-0-methyl)-uridinyI-ester 2
300 mg (0.28 mmol) 1 wurden in 3 ml Dichlormethan/Wasser 1/1 gelöst und mit 300 mg Trichloressigsäure versetzt. Nach 30 Minuten wurde die Lösung zwischen Diethylether und Wasser verteilt, die wäßrige Phase mit Diethylether extrahiert und eingedampft. Der Rückstand wurde in wenig Dichlormethan aufgenommen und in Diethylether digeriert. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert und getrocknet. Ausbeute: 110 mg (80 % der Theorie) 2.
DC: Dichlormethan Methanol=8/2, Rf.: 0.45 2: weiße Kristalle
ERSATZBLÄTT (REGEL 26)
iH-NMR (D2θ) (300 MHz): d= 8.39 (s, 2H, 8-H und 2-H Adenosin); 7.65 (d, IH, 6-H Uridin); 6.10 (d, IH, l'-H-A); 5.93 (d, IH, l'-H-U); 5.71 (d, IH, 5-H Uridin); 5.45 (m, IH, 2'-H-U); 4.85 (m, IH, 2 -H-U); 4.5 (m, IH, 4'-H-A); 4.35 (m, IH, 3'-H-A); 4.1 (m, 2H, 3'und 4Η-U); 3.85 (m, IH, 5'-H*U); 3.96 (m, IH, 5'-H-"U); 3.25 (s, 3H, O-CH3); 3.0 (m, 2H, 5'- CH2-A).
5'-Deo-_y-6-N-[4-(methoxyphenyl)-diphenyl-metlιyI]-2' '-0-isopropy-iden-adenosin- 5'-carbonsäure-2,-[3'-deox -6-N-5'-0-(Di-(4-(methoxyphenyl)-diphenyl-methyI))- adenyl]-ester 3
120 mg (0.19 mmol) 5,-Deoxy-6-N-[4-(methoxyphenyl)-diρhenyl-methyl]-2',3'-0- isopropyliden-adenosin-5'-carbonsäure wurden in wasserfreiem Dichlormethan gelöst und mit 200 mg (0.25 mmol) 3'-Deoxy-6-N-5'-0-di[4-(methoxyphenyl)-diphenyl- methylj-adenosin , 60 mg (0.27 mmol) DCC und 5 mg Dimemylaminopyridin versetzt. Die Lösung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann eingedampft. Nach Reinigung mittels Säulenchromatographie (20 g Kieselgel, Eluens: Dichlormethan/Aceton 9/1) wurden 60 mg (23 % der Theorie) 3 erhalten. DC: Dichlormethan/Aceton=9/l, Rf.: 0.56 3: weißer Schaum
-H-NMR (CDCI3) (300 MHz): δ= 8.09 (s, IH, 2-H); 7.98 (s, IH, 2-H); 7.93 (s, IH, 8- H); 7.85 (s, IH, 8-H); 7.50-7.16 (m, 36H, MMT); 6.85-6.75 (m, 6H, MMT); 6.10 (d, IH, l'-H-A"); 6.02 (d, IH, l'-H-A'); 5.73 (m, IH, 2'-H-A'); 5.45 (m, IH, 2'-H-A"); 5.05 (m, IH, 3'-H-A"); 4.40 (in, IH, 4'-H-A"); 4.10 (m, IH, 4'-H-A'); 3.81, 3.80, 3.79 (3s, 9H, CH3-O-MMT); 3.36 (m, 2H, 5'-CH2-A'); 2.90 (m, 2H, 5'-CH2-A"); 2.59 (m, IH, 3'-H'- A'); 2.10 (m, IH, 3'-H"-A'); 1.6 (s, 3H, CH3); 1.38 (s, 3H, CH3).
5'-Deoxy-5'-carbonsäure-2'-[3'-deo--y-adenyl]-ester 4
60 mg (0.04 mmol) 3 wurden in 3 ml Dichlormethan gelöst und mit 30 mg Trichloressigsäure versetzt. Nach 30 Minuten wurde die Lösung zwischen Diethylether und Wasser verteilt, die wäßrige Phase mit Diethylether extrahiert und eingedampft. Der Rückstand wurde in wenig Dichlormethan aufgenommen und in Diethylether digeriert. Der Niederschlag wurde abzentrifiigiert, mehrmals mit Diethylether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 8 mg (38 % der Theorie) 4. DC: Dichlormethan/Methanol-=8/2, Rf.: 0.42
ERSATZBLATΓ (REGEL 26)
4: weiße Kristalle iH-NMR (D20) (300 MHz): δ= 8.56 (s, IH, 2-H); 8.41 (s, 2H, 2-H, 8-H); 8.35 (s, IH, 8- H); 6.20 (d, IH, l'-H-A"); 6.12 (d, IH, l'-H-A'); 5.65 (m, IH, 2'-H-A'); 5.57 (m, IH, 2'- H-A"); 5.09 (m, IH, 3'-H-A"); 4.68 (m, IH, 4'-H-A"); 4.30 (m, IH, 4'-H-A"); 3.86 (m, IH, 5'-H'-A'); 3.66 (m, IH, 5*-H"-A'); 2.92 (m, IH, 5'-H'-A"); 2.78 (m, IH, 5'-H"-A"); 2.40 (3'- H'-A'); 2.10 (m, IH, 3*-H"-A'); 1.66 (s, 3H, CH3); 1.44 (s, 3H, CH3).
Formelschema I:
12
ERSATZBLÄTT (REGEL 26)
Biopysikalische Bindungsstudien zur Interaktion vom Dinukleotidester 4 mit Polyuridinylsäure (Poly-U)
Poly-U bildet unter bestimmten Bedingungen - in Anwesenheit von Magnesiumsalzen - mit Mono, Di- und Oligonukleotiden Komplexe1. Von Th. Ackermann et al. wurde IR- spektroskopisch2 nachgewiesen, daß es dabei zur Bildung von Tripelhelices kommt.
Zum Nachweis von Duplex- oder Triplexaggregaten bietet sich der starke Hypochrome Effekt der Basenstapelung, besonders wegen seines geringen Substanzbedarfs, an.
Je höher die Umwandlungstemperatur bei gleicher Konzentration, desto stabiler ist die Paarung. Bereits eine zusätzliche Phosphatverknüpfung etwa vom Dimer zum Trimer führt zu einer Stabilisierung der Tripelhelix und zu einem Anstieg der Umwandlungstemperatur um 12.2°C von 13.5°C (ApA) auf 25.7°C (ApApA) 1.
Somit untersucht man das Bindungsverhalten eines kurzen Watson-Crick- Komplementärstrangs am besten mit der zusätzlichen kooperativen "Unterstützung" eines dritten Polymerstrangs, der das Hoogsteenpaar ausbildet. Das artifizielle Dinukleotid 4 wurde somit unter Salz- und Puffer- Konditionen untersucht, die Triplexbildung zulassen.
Hierzu wurde 4 im Verhältnis 1/2 mit Poly-U im Puffer gemischt. Die Lösung wurde auf 90°C erwärmt und wieder auf 5°C abgekühlt. Die Temperatur wurde dann stufenweise auf 40°C erhöht. Deutlich konnte eine Veränderung der Absorbtion mit der Temperatur beobachtet werden. Eine Hyperchromizität von 36% wurde gemessen.
Die Umwandlungstemperatur des Sytems 2Poly-U/artifizielles Dinukleotid lag bei 15°C. Somit konnte gezeigt werden, daß derartige 2'-5 '-esterverknüpfte artifizielle Nukleotide natürliche 3'-5'-phosphatverknüpfte Oligonukleotide erkennen und mit ihnen wechselwirken können.
1 A. M. Michelson C. Monny, Biochim. Biophys. Ada 149 (1967) 107
2 U. Schemau, S. Marcino ski und Th. Ackermann Zeitschrift für Physikalische Chemie 117 (1979) 11- 18
Moleküldynamik Simulationen derartiger Oligonukleotidester - a ide
Mole^-Dynamik (MD) Simulationen von Duplexen aus einem modifizierten Strang und einem natürlichen komplementären RNA-Strang wurden durchgeführt (Figur 1). Auftretende Konformationsänderungen, Bewegung und Stabilität der modifizierten Oligonukleotide konnten beobachtet werden. Das Verhalten der in dieser Erfindung genannten OUgonukleotidanaloga wurde sowohl mit natürlicher RNA als auch mit anderen flexibleren Verknüpfungstypen verglichen.
2'-5'-OligonucleotidanalogonRNA-Doppelstrang
G G A A G G A G C U 0 ?
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
C C U U C C U C G A r C rX pXpXpXpXp λpλpλpλpλP P
X= 2'-5'-Ester-, Ether- bzw. Amidverknüpfiing
Die Estermodifikation zeigte die höchste A-ffinität zum komplementären RNA-Strang. Flexiblere Verknüpfungssysteme wie die Ethermodifikation zeigten keine hohe Affinität zum Gegenstrag, sondern der Hybrid - Doppelstrang löste sich bereits nach kurzer Zeit auf, und die Stränge verknäulten sich ineinander.
f SATZBLATT (REGEL 26)
Claims
1. Nukleotidcarbonsäureester und -amide der allgemeinen Formel I wobei:
die Zuckerringe der Nucleotide mit mindestens einer Brücke verknüpft sind, welche aus 3
Atomen besteht und entweder eine Carbonsäureester- oder Carbonsäureamidgruppe beinhaltet und in welcher
A0 -0-C(=O=-, -N(-Rι)-C(=0)- wobei Rι=H, oder unverzweigtes oder verzweigtes unsubstituiertes oder endständig mit Säure oder Basenfunktion substituiertes Alkyl mit einer Kettenlänge von 1 bis 6C-Atomen bedeutet, in welcher R2 und R3=H oder
Niederalkyl in beUebiger Kombination bedeutet und R}=H, OH oder unverzweigtes oder verzweigtes unsubstituiertes oder endständig mit Säure- oder Basenfunktion substituiertes
O- Alkyl mit einer Kettenlänge von n =1-6 C-Atomen bedeutet und in welcher
B den N-glykosidisch gebunden Rest einer Purin- oder Pyrimidinbase der aUgemeinen
Form II oder III bedeutet, wobei
π
R5 ein Wasserstoff-, Chlor- oder Bromatom, eine Hydroxyl-, Amino-, Monomemoxytritylamino-, Mercapto-, Methylamino-, Dimeraylamino-, Phenylamino-, oder Hydroxylamino, Röβin Wasserstoff-, Chlor- oder Bromatom, eine Hydroxyl-, Amino-, Mercaptogruppe, R7 eine Hydroxyl- oder Aminogruppe,
Rg ein Sauerstoffatom (=0), und
R9 Wasserstoff-, Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatom, eine Methyl-, Trifluormethyl-,
Ethyl- oder Hydroxymethyl bedeutet, sowie die Salze von Verbindungen der allgemeinen
Formel I mit Säuren oder Basen.
2. Nukleotidoligoester und -oligoamide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl von Nukleotideinheiten 2 bis 200 beträgt.
3. Verfahren zur Herstellung
Nukleotidester und oligoamide der Formel I dadurch gekennzeichnet, daß nach vorhergehender Aktivierung der Carbonsäure die Monomere nach üblichen Methoden kondensiert werden.
4. Verwendung der Verbindungen der Formel I zur Herstellung von Therapeutika und für diagnostische Zwecke
5. Verwendung der Nukleotidoligoester und -oligoamide der Formel I zum Einbau in natürliche und anders modifizierte Oligonucleotide.
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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| AT53895 | 1995-03-24 |
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|---|---|---|---|
| PCT/AT1996/000056 WO1996030383A1 (de) | 1995-03-24 | 1996-03-25 | Nukleinsäure-polyester-polyamide |
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|---|---|---|---|---|
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| WO1994022891A1 (en) * | 1993-03-31 | 1994-10-13 | Sterling Winthrop Inc. | Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages |
-
1996
- 1996-03-25 AU AU49311/96A patent/AU4931196A/en not_active Abandoned
- 1996-03-25 WO PCT/AT1996/000056 patent/WO1996030383A1/de active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| Title |
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| A.D. MESMAEKER ET AL.: "Synthetic Modifications of Antisense Oligonucleotides: Novel Backbone Replacements with Improved Properties", BULL. SOC. CHIM. BELG., vol. 103, 1994, pages 705 - 17, XP002008196 * |
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| US8871737B2 (en) | 2010-09-22 | 2014-10-28 | Alios Biopharma, Inc. | Substituted nucleotide analogs |
| US9278990B2 (en) | 2010-09-22 | 2016-03-08 | Alios Biopharma, Inc. | Substituted nucleotide analogs |
| US8980865B2 (en) | 2011-12-22 | 2015-03-17 | Alios Biopharma, Inc. | Substituted nucleotide analogs |
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Also Published As
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