WO1996028182A1 - Procede pour empecher l'adsorption de tpo et composition stable contenant du tpo - Google Patents

Description

明 細

Τ Ρ 0 の吸着防止方法お よ び安定な Τ_Ρ 0 含有組成物 発 明 の背景

発明の技術分野

本発明 は、 糖鎖部を有 し て い な い Τ Ρ 0 タ ン パ ク 質を 含有す る 安定な組成物 に関 し 、 特 に 、 容器壁上への吸着 ま た は会合、 重 合 な ど に よ る 活性成分 の 損失、 力 価低下 を 防止す る 安定 な

Τ Ρ Ο 含有組成物に関す る も の で あ る 。 本発明 は ま た、 該組成 物を含有す る 容器壁上 へ の Τ Ρ 0 の吸着 に よ る 力価低下を 防止 す る た め の方法 に関す る

従来技術の 開示

ヒ ト Τ Ρ Ο ( t h rombopo i e t i n) は 、 サ イ ト 力 イ ン の レ セ プ 夕 一 ス ー パ ー フ ア ミ リ ー の 一 つ で あ る M p 1 の リ ガ ン ド と し て ク ロ ー ニ ン グ さ れ た タ ン パ ク 質 で あ る （ de Sau v a geら 、 Na t u f e (L on d o n) 369卷、 533-565 頁、 （1994) 、 B a r t I e y, T. D. ら 、

77 巻、 1117- 1124 頁、 （1994) ) 。 こ れ ら の M p 1 リ ガ ン ド は い ずれ も 血小板減少症の動物 （ ヒ ト 、 マ ウ ス 、 ィ ヌ ） の血 淸ゃ血漿中 に検出 さ れ、 巨核球形成や血小板形成への関与が確 認 さ れて い る 。

血小板減少症の治療剤の 開発 を念頭 に お い て、 本出願人 も 、 ッ ト 骨髄 よ り 高度 に純化 し た 巨核球前駆細胞か ら の 巨核球生 成を促進す る 活性を 指標に し て、 血小板減少症の ラ ッ ト 血漿 よ り ラ ッ ト T P O を精製 し 、 そ の部分 ア ミ ノ 酸配列 に基づ い て、

、ソ ト T P O c D N A 、 さ ら に は ヒ ト T P O c D N A を ク ロ ー ニ ン グ し 、 遺伝子組換え技術 に よ っ て大量に 均一な ヒ ト T P O を取得す る こ と に 成功 し た （ H. M i y a z a k i ら 、 E i p. H em a t o I . 22巻、 8 頁、 （199 ） 。 本 出願人が取得 に 成功 し た こ の ヒ 卜 T P O は、 前述の ヒ ト M p 1 の リ ガ ン ド と し て取得 さ れた 因子 と 同一の ア ミ ノ 酸配列 を有す る こ と が判明 し て い る （配列表 ： 配列番号 1 )

本発明者 ら は 、 該 ヒ ト T P O を制 ガ ン 剤や免疫抑制剤の投与 あ る い は放射線照射 ^ B M T に よ っ て骨髄抑制の起 き た血小板 減少症の マ ウ ス に投与 し た と こ ろ 、 血小板減少阻止効果、 血小 板増加促進効果、 さ ら に は、 造血機能の亢進が認め ら れ、 本発 明の T P 0 が こ れ ら の血小板減少症 に 有効で あ る こ と を見 い だ し て い る WO 96/28182 ― _q _ PCT/JP96/0

T P O は 、 そ の高活性ゆ え に 極め て微量で使用 さ れ、 活性成 分 と し て通常 0. O S ^ g Z k g体重〜 l m g Z k g体重、 好 ま し く は 0. 5 / g Z k g体重〜 5 0 // g Z k g体重を 、 病状 性別及 び投与経路 に 応 じ て、 一 日 数回程度投与 さ れ得 る 。 従 つ て、 極め て微量で製剤化す る こ と が要求 さ れ る が、 こ の場合、 製剤容器 （バ イ ア ル、 ア ン プル等） への 吸着 に よ る 力価低下、 点滴静注時 に輸液 と 配合す る 場合の輸液瓶、 点滴 ラ イ ン へ の吸 着損失が無視で き な い。

そ こ で、 本発明者 は、 糖鎖部を 有 し て い な い T P 0 タ ン パ ク 質を製剤化 あ る い は輸液配合す る 際の 力価低下防止 を 目 的 と し て 吸着を防止す る よ う な 安定な T P 0 含有組成物を 得 る ベ く 、 種 々 の検討を 行 っ た。 そ の結果、 T P O に 薬学的 に 許容 さ れ る タ ン パ ク 質、 セ ル ロ ー ス誘導体、 硫酸化多糖、 界面活性剤、 ポ リ ビ ニ ノレ ア ノレ コ 一 ノレ 、 マ ク ロ ゴ ー ノレ （別名 ： ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル） 、 ァ ミ ノ 酢酸 （別名 ： グ リ シ ン ） を添加す る こ と が有 効で あ る こ と を見 い だ し 、 本発明を完成 し た。

発明 の要約

本発明 は、 糖鎖部を有 し て い な い T P 0 夕 ン パ ク 質を含有す る 組成物中に 、 タ ンパ ク 質、 セ ル ロ ー ス 誘導体、 硫酸化多糖、 界面活性剤、 ポ リ ビニ ル ア ル コ ー ル、 マ ク ロ ゴ ー ル、 ア ミ ノ 酢 酸か ら な る 群 よ り 選ばれ る 少 な く と も 1 種の薬学的 に許容 さ れ る 添加剤を含有 さ せ る こ と を 特徴 と す る 、 該組成物を 含有す る 容器壁上への Τ Ρ 0 の 吸着に よ る 力価低下を 防止す る た め の 方 法を提供す る

ま た 、 本発明 は、 糖鎖部を 有 し て い な い Τ Ρ 0 タ ン パ ク 質 と 薬学的 に 許容 さ れ る タ ン パ ク 質、 セ ル ロ ー ス 誘導体、 硫酸化多 糖、 界面活性剤、 ポ リ ビ ニ ル ア ル コ ー ル 、 マ ク ロ ゴ ー ル 、 ア ミ ノ 酢酸か ら な る 群 よ り 選ばれ る 少な く と も 1 種の 添加剤を含有 す る こ と を特徴 と す る Τ Ρ Ο 含有組成物 を提供す る 。

図面の 簡単 な説明

図 1 は 、 E L I S A 法 に よ り 決定 さ れ た 、 Τ Ρ Ο ( 1 - 163 ) / E. c 01 i の 濃度 と 吸収値 （45 GZ 650 nm) と の 関係 を 示す標準曲 fee で の る 。

図 2 は、 種 々 の 澳度の ヒ ト 血清 ア ル ブ ミ ン （ H S A ) を添加 し た と き の、 T P O ( 1 - 163 ) Z E. c 01 ί の 回収率の経時変化 を示す

発明の詳細 な 説明

本発明 に お け る Τ Ρ 0 と は 、 純度が高 く 、 単離 さ れた タ ン パ ク 質で あ ればそ の製法に よ る 由来 は 問 わ な いが、 配列番号 1 に 記載の ァ ミ ノ 酸配列か ら な り 、 糖鎖部を 有 し て い な い 夕 ン パ ク 質が用 い ら れ る 。 あ る い は、 配列番号 1 に 示 さ れ た ア ミ ノ 酸配 列の う ち 、 T P 0 活性 を保持す る 限 り に お い て そ の一部が改変 (置換、 欠失、 挿入、 お よ び Z ま た は 付加） さ れて い る よ う な ア ミ ノ 酸配列か ら な り 、 糖鎖部を 有 し て い な い タ ン パ ク 質 も 本 発明の T P O と し て用 い る こ と 力 で き る 。

別の言 い方を すれば、 ァ ミ ノ 酸配列が実質的 に配列番号 1 に 示 さ れ た ア ミ ノ 酸配列 で あ り 、 糖趙部を 有 し て い な い タ ン パ ク 質を も 用 い る こ と がで き る 。 こ こ で言 う 「実質的 に 配列 番号 1 に 示 さ れた ア ミ ノ 酸配列」 と は 、 配列番号 1 に 示 さ れ た ァ ミ ノ 酸配列 に加え て 、 「 T P 0 活性を保持す る 限 り に お い て、 配列 番号 1 に 示 さ れ た ア ミ ノ 酸配列の 一部 に 置換、 欠失、 挿入、 お よ び ま た は 付加な どがあ る ア ミ ノ 酸配列」 を 含む こ と を 意味 す る 。

本出願人 は、 ヒ ト T P 0 の C 末端側 に つ い て は配列番号 に 示 さ れ た ア ミ ノ 酸配列の 1 5 2 位 ま で欠失 さ せ て も 活性を 保持 し て い る こ と 、 N 末端側 に つ い て は 6 位 ま で欠失 さ せ て も 活性 を 保持 し て い る こ と を確認 し て い る 。 具体的 な デ ー タ に つ い て は 表 1 に示 し た。 誘導体 活性の 有無

- 2 3 位 + - 2 1 位 + - 1 9 位 +

7 1 位 +

6 3 位 +

5 7 位 +

5 6 位 +

5 5 位 +

5 4 位 +

5 3 位 + 5 1 位 +

5 0 位

6 3 位 +

8 一 6 3 位

1 3 — 2 3 1 位 従 っ て、 本発明の T P O と し て は 、 配列番号 1 に 示 さ れ た ァ ミ ノ 酸配列 の 7 位 か ら 1 5 1 位の ア ミ ノ 酸配列 を 含 み 、 かつ Τ Ρ Ο 活性を有す る 糖鎖部を 有 し て い な い タ ン パ ク 質 も 含 ま れ る 。 よ り 具体的 に は配列番号 1 に 示 さ れ た ア ミ ノ 酸配列 の う ち 位力、 ら 2 3 1 位、 1 位か ら 2 位、 1 位力、 ら 1 9 1 位、 位か ら 1 7 1 位、 1 位力、 ら 1 6 3 位、 1 位 5 7 位、 1 位力、 ら 1 5 6 位、 1 位か ら 1 5 5 位、 1 位か ら 1 5 4 位、 1 位力、 ら 1 5 3 位、 1 位力、 ら 1 5 1 位 お よ び 7 位か ら 1 6 3 位か ら な る 糖鎖部を有 し て い な い 夕 ン パ ク 質が本発明 の Τ Ρ 0 と し て挙げ ら れ る 。

更 に は 、 上記 7 位 か ら 1 5 1 位の 配列 内 部 ま た は 外 部 に 、 Τ Ρ 0 活性を損な わ な い範囲で、 少 な く と も 1 つ の ア ミ ノ 酸の 置換、 欠失、 挿入、 お よ び Ζま た は 付加を 有 し て い る ア ミ ノ 酸 配 列 か ら な り 、 糖鑌 部 を 有 し て い な い タ ン パ ク 質 も 本発 明 の Τ Ρ Ο に含 ま れ る 。

本発明 に お け る Τ Ρ 0 を更 に 例示すれば、 糖鎖部を も た ず、 か つ 少 な く と も 、 配 列 番 号 1 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 有 す る ヒ 卜 Τ Ρ Ο の 1 位の セ リ ン 残基が ァ ラ ニ ン残基 に 、 かつ 3 位の ァ ラ ニ ン残基がパ リ ン残基 に 置換 さ れた タ ン パ ク 質、 2 5 位の ア ル ― o ―

ギ ニ ン 残基 が ァ ス パ ラ ギ ン 残基 に 置 換 さ れ た タ ン パ ク 質、 3 3 位 の ヒ ス チ ジ ン 残基 が ト レ オ ニ ン 残基 に 置換 さ れ た 夕 ン パ ク 質 2 5 位 の ア ル ギ ニ ン 残基 が ァ ス パ ラ ギ ン 残基 に 、 か つ 2 3 1 位 の グ ル タ ミ ン 酸残基 が リ ジ ン 残基 に 置 換 さ れ た タ ン パ ク 質 、 更 に こ れ ら の タ ン パ ク 質 の C 末 端 に T h r S e r I 1 e G 1 y T y r P r o T y r A s p V a l P r o A s p T y r A l a G 1 y V a 1 H i s H i s H i s H i s H i s H i s の ポ リ べ プ チ ド が付加 さ れ た 夕 ン パ ク 質 を 挙 げ る こ と が で き る 。

更 に は 、 糖 鎖部 を も た ず 、 かつ 配列 番 号 1 の ア ミ ノ 酸配列 に 対 し 、 少 な く と も 、 3 3 位 の ヒ ス チ ジ ン 残基 が 欠 失 し た タ ン パ ク 質 、 6 位 の ダ リ シ ン 残基 が 欠失 し た 夕 ン パ ク 質 、 7 位 の ア ル ギ ニ ン 残基 が 欠失 し た タ ン パ ク 質 、 3 3 位 の ヒ ス チ ジ ン 残基 と 3 4 位 の プ ロ リ ン 残基 の 間 に ト レ オ ニ ン 残基 が 挿 入 さ れ た タ ン パ ク 質 、 3 3 位 の ヒ ス チ ジ ン 残 基 と 3 4 位 の プ ロ リ ン 残基 の 間 に ァ ラ ニ ン 残基 が挿 入 さ れ た タ ン パ ク 質 、 3 3 位 の ヒ ス チ ジ ン 残基 と 3 4 位 の プ ロ リ ン 残基 の 間 に グ リ シ ン 残基 が挿 入 さ れ た タ ン パ ク 質 、 3 3 位 の ヒ ス チ ジ ン 残基 と 3 4 位 の プ ロ リ ン 残基 の 間 に グ リ シ ン 残基 が 挿 入 さ れ 、 か つ 3 8 位 の プ ロ リ ン 残基 が セ リ ン 残基 に 置 換 さ れ た タ ン パ ク 質 、 6 位 の グ リ シ ン残基 7 位の ア ルギニ ン残基の 間 に ァ ス パ ラ ギ ン残基 が挿入 さ れた 夕 ン パ ク 質、 6 位の ダ リ シ ン残基 と 7 位 の ア ルギニ ン残基の 間 に ァ ラ ニ ン 残基が挿入 さ れた タ ン パ ク 質

6 位の ダ リ シ ン残基 1 7 位の ア ルギニ ン 残基の 間 に グ リ シ ン 残基が挿入 さ れ た タ ン パ ク 質を挙 げ る こ と がで き る 。 ま た、 少な く と も 、 1 2 9 位の ロ イ シ ン 残基が ア ルギニ ン 残基 に 置換 さ れ た タ ン パ ク 質、 1 3 3 位の ヒ ス チ ジ ン 残基が ァ ノレギニ ン残基 に 置換 さ れ た タ ン パ ク 質、 1 4 3 位の メ チ ォ ニ ン残基が ア ルギニ ン残基 に 置換 さ れ た 夕 ン パ ク 質、 8 2 位の ダ リ シ ン 残 基が ロ イ シ ン残基 に 置換 さ れた 夕 ン パ ク 質、 1 4 6 位の ダ リ シ ン残基が ロ イ シ ン 残基 に 置換 さ れた タ ン パ ク 質、 1 4 8 位の セ リ ン 残基が プ ロ リ ン 残基 に 置換 さ れた タ ン パ ク 質、 5 9 位の リ ジ ン 残基が ア ルギニ ン 残基 に 置換 さ れ た タ ン パ ク 質、 1 1 5 位 の グル 夕 ミ ン が ア ルギニ ン 残基 に 置換 さ れ た タ ン パ ク 質が挙 げ ら れ る 。

ま た、 本発明の T P O と し て は、 配列番号 1 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 を 有 す る ヒ ト T P O お よ び前述 の 誘導体 の 一 2 位 に メ チ ォ ニ ン残基、 かつ — 1 位 に リ ジ ン 残基が付加 さ れた糖鎖部 を有 し て い な い 夕 ン パ ク 質、 位に メ チ ォ ニ ン 残基が付加 さ 一 1 u ―

れ た糖鎖部を有 し て い な い 夕 ン パ ク 質 も 含 ま れ る 。

本発明の T P O は、 c D N A 、 染色体 D N A 、 ま た は 化学合 成 に よ り 得 ら れ る D N A を含む組換え ベ ク タ ー で、 形質転換 さ れ た宿主細胞か ら 分離 · 精製 し て 得 ら れ た も の で あ る こ と が好 ま し い。 宿主 と し て は 、 原核生物 （細菌、 好 ま し く は 大腸菌） を用 い る こ と がで き る 。

本発明の安定 な T P 0 含有組成物 を 得 る た め に 使用 し 得 る 添 加剤 と し て は、 タ ン パ ク 質、 セ ル ロ ー ス 誘導体、 硫酸化多糖、 界面活性剤、 ポ リ ビニ ル ア ル コ ー ル、 マ ク ロ ゴ ー ル、 ア ミ ノ 酢 酸 な どが挙げ ら れ る 。 こ れ ら の 添加剤 は 、 例 え ば ガ ラ ス 製、 樹 脂製等の 容器、 チ ュ ー ブ （例 え ば点滴 ラ イ ン ） 等への T P O の 吸着を 防止す る も の で あ れば、 そ の種類を 問 わ な い が、 例 え ば 下記の も の が挙げ ら れ る 。

タ ン パ ク 質 と し て は 、 ヒ 卜 血清 ア ル ブ ミ ン 、 ゼ ラ チ ン 、 牛血 清 ァ ノレ ブ ミ ン 、 カ ゼ イ ン 、 コ ラ ー ゲ ン 、 ヒ ト 血清 グ ロ ブ リ ン な どが利用 で き る 。

セ ル ロ ー ス 誘導体 と し て は 、 メ チ ノレ セ ノレ ロ ー ス 、 ヒ ド ロ キ シ プ ロ ビ ル セ ノレ ロ ー ス 、 ヒ ド ロ キ シ ェ チ ル セ ノレ ロ ー ス な どが利用 で き る 界面活性剤 と し て は 、 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン硬化 ヒ マ シ 油、 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ヒ マ シ 油 、 ポ リ ソ ル ベ ー 卜 8 0 や モ ノ ラ ウ リ ン 酸 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ソ ル ビ 夕 ン （別 名 ： ポ リ ソ ル ベ ー 卜 2 0 ) な ど の ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ソ ノレ ビ タ ン 脂肪酸エ ス テ ノレ 、 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ポ リ オ キ シ プ ロ ピ レ ン グ リ コ ー ル 、 モ ノ ォ レ ィ ン 酸 ソ ノレ ビ タ ン な ど の ソ ル ビ 夕 ン 脂 肪酸 エ ス テ ノレ 、 シ ョ 糖 モ ノ ラ ゥ リ ン 酸 エ ス テ ル な ど の シ ョ 糖脂肪酸エ ス テ ル 、 卵黄 レ シ チ ン な ど の卵黄 リ ン脂質、 塩化べ ン ゼ ト ニ ゥ ム 、 塩化べ ン ザ ル -コ ニ ゥ ム な ど の 芳 香族 四 級 ア ン モ ニ ゥ ム 塩 、 ラ ウ リ ル 硫酸 ナ ト リ ウ ム な どの ア ルキ ル硫酸塩が利用 で き る 。

硫酸化多 糖 と し て は 、 コ ン ド ロ イ チ ン 硫酸ナ 卜 リ ゥ 厶 、 へパ リ ン ナ ト リ ウ ム な どが利用 で き る 。

本発明 に お い て用 い ら れ る こ れ ら の添加剤 は、 T P 0 含有組 成物を水溶液 と し た場合 に 0 . 0 0 1 〜 1 0 % の 濃度範囲で使 用 さ れ う る 。 ま た 、 本 発 明 に お い て 用 い ら れ る 添 加 剤 は 、 一般 に 活性 成 分 と し て の T P 0 タ ン パ ク 質 1 重量部 に 対 し 、 0 . 0 2 重量部〜 1 0 , 0 0 0 重量部の範囲内 で使用 す る こ と が望 ま し い。

更 に 本発明の T P 0 含有組成物は、 そ の製剤化の 目 的 に 応 じ て希釈剤、 可溶化剤、 防腐剤、 酸化防止剤、 賦形剤 お よ び等張 化剤等を含有す る こ と がで き る 。

本発明の 安定 な T P 0 含有組成物 は 注射な どの非経 口 、 経肺 経鼻、 お よ び経 口 を含め た種 々 の投与経路 に 応 じ た剤形 と し て 溶液剤、 懸阑剤、 錠剤、 丸剤、 カ プ セ ル剤、 顆粒剤、 凍結乾燥 製剤な どが例示 さ れ る 。 T P 0 と 本発明 に 係わ る 添加剤が必ず し も 当初か ら 同一の組成物中 に共存 し た 伏態で与え ら れ る 必要 が な く 、 そ れぞれを 別 々 に 用意 し 、 用 時 に両者を混合すれば よ い よ う な 組成物剤形 も 可能で あ る 。

以下、 実験例、 実施例 に よ っ て本発明 を 具体的 に 説明す る 。

実施例

以下の実験例で使用 す る T P 0 の 固相酵素免疫定量法 は以下 の と お り で あ る 。

抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を用 い た 固相酵素免疫定量法

( E L I S A法）

固相抗体 と し て、 ヒ ト T P O の HT- 1領域 （配列番号 1 の 8 位 〜 2 8 位の ア ミ ノ 酸配列 に 相当） を認識す る 抗 ヒ 卜 T P O モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 （ L 3 - 1の サ ブ ク ロ ー ン L 3 -卜 54 ) を 、 50 mM 炭 酸塩バ ッ フ ァ ー （ p H 9. 2 ) に て 20 g /m I に調製 し 96ゥ エ ル マ ク 一 1 s ―

ロ タ イ タ 一プ レ ー ト （ Nunc-lmmuno P l a t e Max i So r p^TM、 I n t e r M e d社製、 C a . N o . 4 - 42 4 ) の 各 ゥ エ ル に 50〃 1 ずつ 分注 し た。 マ イ ク ロ プ レ ー ト ミ キ サ ー （ ADVANTEC TS- 96、 ア ドバ ン テ ッ ク 東洋株式会社製） で撹拌 し 各 ゥ エ ル の底面 に 固相抗体 を ゆ き わ た ら せ た。 プ レ ー ト シ ー ル （ SUMI L0N 社製、 Ca. No. MS- 30020) で シ ー ル し 37 で 2 時間、 或い は 4°Cでー晚静置 し て 固相抗体 を プ レ ー 卜 に 吸着 さ せ た。 次 に 20 πΜ T r i s - H C 1 / 0. 5 M N a C 1 /0. 1 % Twe e n 20 (pH 7. 5) の 洗浄バ ッ フ ァ ー で洗浄後、 4 倍希釈 B I 0 c k A c e (大 日 本製薬株式会社製、 Ca. No. UK-B25) を 300 β ゥ エ ル加え 、 プ レ ー ト シ ー ルで シ ー ル し Π ΐ:で 1 時間、 或 い は 4 ΐでー晚静置 し て ブ ロ ッ キ ン グ処理 し た。 洗浄バ ッ フ ァ ー で 4 回洗浄後、 10倍希釈 eck A c e で希釈 し た 被検体 ま た は 標 準 と す る 濃度既知 TP0 を各 ゥ エ ル に 50 / I 添加 し 、 マ イ ク ロ プ レ ー ト ミ キ サ ー 撹拌後、 プ レ ー ト シ ー ルで シ ー ル し 37。Cで 2 時 間、 或 い は でー晚静置 し て反応 さ せ た。 反応終了後、 洗浄 ノ ッ フ ァ ー で ₄ 回洗浄 し た。 次 に 、 ヒ 卜 T P 0 の H T - 2領域 （配 列 番 号 1 の 4 7 位 〜 6 2 位 の ァ ミ ノ 酸 配 列 に 相 当 ） を 認 識 す る 抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ ー ナ ノレ抗体 （ U- 1の サ ブ ク ロ ー ン L4 -卜 31 , 1 次抗体） を ピオ チ ン 標識 し 、 10倍希釈 B l oc k Ac e で 500n g/m lに 希釈 し て各 ゥ エ ル に 50 / 1 添加 し 、 マ イ ク ロ プ レ — 卜 ミ キ サ ー で撹拌後、 プ レ ー ト シ ー ル で シ ー ノレ し °C で 2 時 間、 或 い は 4 でー晚静置 し て反応 さ せ た。 反応終了後、 洗浄 ノく ッ フ ァ ー で 4 回洗浄 し 、 ペ ル ォ キ シ ダ 一 ゼ標識 ア ビ ジ ン 1 t r a A V i d i n ^{T M} - Ho r s e ra d i s h Pe ro x i da s e、 L e i n c o Te c h n o l og i e s 社製、 Ca. No. A 106) を 10倍希釈 B l oc k Ac e で 2000倍希釈 し て 各 ゥ エ ル に 50 1 添加 し 、 マ イ ク ロ プ レ ー ト ミ キ サ ー で撹拌後 プ レ ー ト シ ー ルで シ ー ル し て Πで で 1 時間反応 さ せ た。 反応終 了後、 洗浄バ ッ フ ァ 一 で 4 回洗浄 し た後、 ペ ルォ キ シ ダ ー ゼ用 発色キ ヅ 卜 （ SUM ON 社製、 C a. No. ML - 1120 T) の Τ Μ Β Ζ 発色 剤 に 1 / 100 容の基質液を加え た 発色剤を 各 ゥ エ ル に 1 G Q μ I 添 加 し マ イ ク ロ プ レ ー ト ミ キ サ ー で撹拌後、 プ レ ー ト シ ー ノレ で シ ー ル し て室温下 で反応 さ せ た。 約 30分後 に 反応停止液 を 各 ゥ ェ ル に 100 β 1 加え、 マ イ ク ロ プ レ ー ト ミ キ サ ー で撹拌 し て発色 反応を停止 し た。 EL I SA プ レ ー ト リ ー ダー （ THERMOma i! 、 Mo l e c « 1 a r De v i ce s 社製） で 450 / 650 n m の波長の 吸収を 測定 し た。

後述 の 参 考 例 に 記載の 方法 で 得 ら れ る 、 濃度既知 の T P 0

( 1-163 ) / E. C D l iに よ る 吸収値 を も と に 標準曲線 を作製 し た

(図 1 参照） 。 な お、 こ こ で用 い る 抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を 産生 す る ハ イ プ リ ド ー マ U - 1の サ ブ ク ロ ー ン （ U -卜 31 ) 及 び L 3 - 1 の サ ブ ク ロ ー ン （ L 3- 1 - 54 ) は、 1 9 9 4 年 1 2 月 2 7 日 付け で 曰 本国の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 に そ れぞれ受託番号 F E R M B P — 4 9 5 6 、 F E R M B P - 4 9 5 5 と し て、 ブ ダぺ ス 卜 条約下で国際寄託 さ れて い る 。 上 記サ ブ ク ロ ー ン は ま た、 中国寄託機関 ( CC TCC ) に 、 そ れぞれ Mo u s e -Mo u s e h y b r i d o m a L 4 - 1 - 31 と し て受託番号 C C T C C - C 95003 で 、 ま た M o u s e - M o u s e h y b r i d om a L 3 - 1 - 5 と し て 受 託 番 号 C C T C C - 5002で寄託 さ れて い る 。

< 実験例 1 >

l O m M ト リ ス バ ッ フ ァ ー （ p H 7 . 5 ) に ヒ ト 血清 ア ル ブ ミ ン 0. 005 %、 0. 01 %、 0. 02 %、 0. 05 % . 0. 1 %、 0. 2 %、

0. 5 % と な る よ う に 含有せ し め た も の を用意 し 検体試料 と し た。 他 に対照試料 と し て、 l O m M ト リ ス バ ッ フ ァ ー （ p H 7 . 5 ) の み を用意 し た。

各試料 1 0 0 0 1 を加 え た ガ ラ ス 正試験管 に 後述の参考例 に記載の 方法で得 ら れ る T P O 3 / g を 含む溶液 5 1 を 加 え 、 室 温 に て 放置 し た 。 0 . 5 分、 1 時 間 、 2 時 間後 に 1 0 1 ずつ 採取 し 、 E L I S A法 に て溶液中の T P O 量を 測 定 し 、 期待値 に対す る 回収率を求め た。

そ の結果を 図 2 に 示す。 図中、 B L A N K は 1 0 m M ト リ ス バ ッ フ ァ ー （ p H 7 . 5 ) の み の場合、 H S A は 、 ヒ ト 血清 ァ ル ブ ミ ン を示す。 図 よ り 、 ヒ ト 血澝 ア ル ブ ミ ン が吸着防止効果 を示す こ と が判明 し た

< 実験例 2 >

表 2 に 示す各種添加剤を 0 % の 濃度で 1 0 m M ト リ ス バ ッ フ ァ ー （ p H 7 . 5 ) に 溶解 し た も の 1 0 0 0 〃 1 を加え た ガ ラ ス 製試験管 に後述の参考例 に 記載の方法で得 ら れ る T P 0 [ T P 0 ( 1-163 ) / I. c 0 I i ] 3 / g を含む溶液 2 . 7 1 を加え 、 E L I S A法に よ り 2 4 時間放置後の 回収率を測定 し た。 結果を表 2 に 示す

O 96/28182

表 2 添加物 （添加濃度 l m g ノ m l ) 回収率 （50 ヒ ト 血清 ア ル プ ミ ン 4 1 . 3 精製ゼ ラ チ ン （ タ イ プ A ) 4 1 . 2 精製ゼ ラ チ ン （ タ イ プ B ) 2 4 . 9 ア ミ ノ 舴 酸 2 1 . 7 メ チ ル セ ル ロ ー ス 4 4 . 0 ヒ ド ロ キ シ プ ロ ピ ル セ ル ロ ー ス 5 1 . 5 ヒ ド ロ キ シ ェ チ ノレ セ ノレ ロ ー ス 2 3 . 3 コ ン ド ロ イ ン チ ン 硫酸ナ ト リ ゥ ム 6 1 . 6 へ パ リ ン ナ ト リ ウ ム 4 1 . 4 マ ク ロ ゴ ー ル 4 0 0 2 4 . 4 ポ リ ビニ ル ァ ノレ コ ー ル （部分 け ん 化物） 3 6 . 7 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン 硬 化 ヒ マ シ 油 6 0 5 0 . 3 ポ リ ソ ル べ 一 ト 8 0 6 7 . 8 モ ノ ラ ウ リ ン 酸 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ソ ル ビ タ ン 5 7 . 6 ホ。 リ才キシエチレン U 60) ホ。 リ才キシプ Dヒ。 レン （30)グリコール 3 3 . 7 モ ノ ォ レ イ ン 酸 ソ ノレ ビ タ ン 8 9 . 6 シ ョ 糖 モ ノ ラ ウ リ ン 酸 エ ス テ ル 5 9 . 2 卵 黄 リ ン 脂 質 2 0 . 8 塩化べ ン ゼ 卜 ニ ゥ ム 9 7 . 6 ラ ウ リ ル硫酸ナ ト リ ウ ム 7 2 . 6 無 添 加 1 6 . 2 —— 1 o ―

表か ら 明 ら か な よ う に 、 ガ ラ ス 製試験管 に 接触 し た と き に み ら れ る T P 0 の 吸着 を 各種添加剤が防止す る こ と が判明 し た。 本発明の T P 0 含有組成物の 製造例 を以下 に 示す。

< 実施例 1 >

p H 6 . 0 の 5 m M リ ン 酸 緩 衝 液 1 0 m l 中 に T P O 1 0 0 0 z g 、 ヒ ト 血清 ア ル ブ ミ ン 0 . 0 2 5 g 、 塩化ナ ト リ ゥ ム 8 7 . 6 6 m _g を 含む水溶液 を無菌的 に 調製 し 、 1 m l ず つ バ イ ア ル に 分注 し 密封す る 。

ぐ 実施例 2 >

実施例 1 に お け る ヒ 卜 血清 ァ ノレ ブ ミ ン 0 . 0 2 5 g に 代え て 精製ゼ ラ チ ン （ タ イ プ B ) 0 . l g を用 い 、 同様 に し て製剤 を 調製 し た。

< 実施例 3 >

P H 6 . 0 の I m M ク ェ ン 酸緩 衝液 1 0 m l 中 に T P O

2 5 0 0 g 、 ポ リ ソ ノレ べ 一 卜 8 0 0 m g 、 ソ ノレ ビ ト ー ル

0 . 5 g を含む水溶液を無菌的 に調製 し 、 1 m l ずつ バ イ ア ル に 分注 し 密封す る 。

く 実施例 4 >

P H 6 . 5 の 1 0 m M ト リ ス 緩 衝液 1 0 m l 中 に T P O 2 5 0 0 g 、 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン 硬化 ヒ マ シ 油 6 0 0 m g 、 塩化ナ ト リ ウ ム 8 1 . 8 2 m g を含む水溶液を 無菌的 調製 し 、 1 m 1 ずつ バ イ ア ル に分注 し 密封す る 。

以下、 参考例 と し て本発明の 有効成分で あ る 丁 P 0 の製造例 を示す

く 参考例 〉 大腸菌 に お け る T P O ( 1- 163 ) / E. c 0 I i の 製造 例

( 1 ) h M K T ( 1- 163 ) の 大腸菌発現用 プ ラ ス ミ ド pAMG l l - h M K T ( 1-163 ) の構築、 大腸菌 に お け る 発現

配列番号 1 の 1 位〜 1 6 3 位 ま での ァ ミ ノ 酸配列 を有す る 夕 ン パ ク 質 （以下、 T P 0 ( 1-163 ) E. c 0 I iと い う 。 ） を大腸 菌で発現 さ せ る た め に 、 そ の ァ ミ ノ 酸配列 を コ ー ド す る D N A を大腸菌 に お け る 先 コ ド ン を用 い て化学合成 し た。 更 に 、 そ の N 末端に メ チ ォ ニ ン残基 と リ ジ ン残基 を 、 ま た C 末端側 に ス ト ッ プ コ ド ン を コ ー ドす る D N A 配列 を 付加 し た。 こ の D N A 配列 に よ り コ ー ド さ れ る タ ン パ ク 質、 即 ち 配列番号 1 の 1 位か ら 1 6 3 位の ア ミ ノ 酸配列の N 末端 に M e t - L y s が付加 さ れて い る タ ン パ ク 質 （以下、 「 h M K T ( 1-163 ) 」 と い う ） の ア ミ ノ 酸配列 に つ い て は配列番号 2 に 示 し た 合成 さ れ た h M K T ( 1-163 ) 遗 伝 子 フ ラ グ メ ン ト は 、 の

5 ' 末端 、 3 ' 末端 に そ れ ぞ れ ] (ba I 、 H i nd 制 限酵素部位 を 有 し て お り 、 リ ボ ソ ー ム 結 合部位 、 A T G 開 始 コ ド ン 、 h M K T ( 1-163 ) の ア ミ ノ 酸配列 を コ ー ド す る 配列 、 お よ び s t 0 p コ ド ン を 含 ん で い る 上記 フ ラ グ メ ン ト は ラ ク ト ー ス 誘 導 性 発 現 べ ク タ 一 、 pAMG l l の X b a I . H i nd 部 位 に ク ロ 一 ニ ン グ さ れ た 。 p A M G 11ベ ク タ

— は 、 pU OO 由 来 の 複製 起 源 を も つ 低 コ ピ ー 数 の プ ラ ス ミ ド で あ る 。 発現 ベ ク タ ー 、 pAMGUは プ ラ ス ミ ド pCのFM1656 ( AT C C No

. 69576、 9 9 4 年 2 月 2 4 日 付 で 寄 託 さ れ て い る 。 ） 力、 ら P

C R を 利 用 し た 変異導 入 法 に よ り 一 連 の 部 位特 異 的 塩 基 の 変異 を 起 こ す こ と に よ っ て 得 る こ と 力く で き る

複 製 プ ロ モ ー タ ー 、 P c o p B の す ぐ 5 ' 側 に あ る Bg 部位

( プ ラ ス ミ ド bp # 180 ) か ら 始 ま っ て 、 プ ラ ス ミ ド 複 製 遺 伝 子 が続 い て い る が、 塩基 対 の 変異 は 以 下 、 表 3 に 示 す と お り で あ る 一 2

表 3 p AMG 11 bp # bp i n p C FM 1656 b D c ha ng e d t o _i n _p A M G 11

# 204 T/A C/G

f i 28 A/T G/C

# 509 G/C A/T

# 617 - - 2 対の G/C を挿入

# 9 G/C T/A

# 980 T/A C/G

9 994 G/C A/T

# 1004 A/T C/G

# 1007 C/G T/A

# 1028 A/T T/A

. t 1047 C/G T/A

# l G/C T/A

# 1 "6 G/C T/A

# 2028 G/C 欠失

# 21 Π C/G T/A

# 2480 A/T T/A

t 2499-2502 AGTG GTCA

TCAC CAGT

# 2642 TCCGAGC 欠失

A G G C T C G

# 3435 G/C A/T

t 3" 6 G/C A/T

# 3H3 A/T T/A

# 4489-4512 - - 以下の塩基対を挿入

G AGCTCACTAGTGTCG ACCTGCAG

CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC α ^ I 3 8 | ¾ -B- $ ¾ i ¾ ^ ¾ G) dt ¾ »f I 3 Β _Ί f ) ^ ¾ ¾ ¾Γ ^ _b ！ t> B | °： Ί ¾ ¾ί ¾ ¾ ^ *Η Ι -)Ι ¾ «( ¥ ^ ^ 3 1ί ¾Γ ½ Ι b Β I i °- ,Η \ ( £ 91 - 1 ) i ¾ lAi q - I I 0 H V d 、 ¾

° 2 ίι$ IK Q ： 1 ^v ( I 3 Π ) 一 : ( 一 4 2 ·? ^呦華士 ¾ ¾ I | 厪翻 γ 、 】 ¾ ©士 ¾ » (89 - 1 - 1 ) 丄 ） 、 2 ： 1一 一 ½ α

Λ 丄 V3:)丄 V丄丄 IVV VO丄:） 33；) V3丄 3丄丄 VV3丄 3丄丄 ViV V丄丄 V31丄;）丄 iV—

一 V VV丄;） D丄 VVV3 丄丄丄 V3丄丄 V VVVVV 丄丄丄丄 VV丄 V3丄;）丄!）；） V3 ,5 ° W $ 翁 ¾ f :l一 一 ¾ 口 ¾ ¾ 一 4 6 ^ ο ^ Φ - ^ - ^ α ^ s ^ 每 ^ ^ ^ っ ：！ 土 ¾ ¾ Φ i ¾ ¾ ( £ 91 - 1 ) i >i !A[ q : W $ Y * :l i: i: €) W V d

) I β 13

,ε 丄V丄liVV3 V：)l：)3：)；)V；)13丄lVV：)丄31丄YlVViiVί)— 一 VV3VV丄 i丄丄 VD3 V丄丄丄 3丄:） VV ViSVV i丄丄 1丄 VVVVV丄丄 Vi!)Vi)V;);)i ー丄 i3丄丄 VVVV丄；） 丄 VVV3 V3丄丄丄 V3丄丄 VVVVVV丄丄丄 1丄 VV1V3丄 3 ,S

( ) 1 1 1 " 。 つ 稱靨 - 、 ^ ^ P (, ©丄 ¾ ¾ V N a O Φ ? ¾ ^ Ι 8！ 0 ？ ¾ SIS 1 I 1 « V W M ¾ 、 ： ί 夏

- ζ ζ -

9e900/96df/XDd 18Ϊ8Ζ/96 OAV モ ー 夕 一 の 内部 に お け る 変異で あ り 、 そ の結果、 P s 4 プ ロ モ 一 夕 に よ る タ ン パ ク 質の発現 に 関 し 、 よ り 厳密 な コ ン ト ロ ー ル を う け る こ と に な る 。 従 っ て 、 こ の株 に お い て は、 ラ ク ト ー ス の非存在下で は、 h M K T ( 1 - 163 ) の発現 は L a e I に よ り 抑 制 さ れ る ク ト ー ス の 添加 に よ り P s 4 プ ロ モ ー タ ー の オ ペ レ ー タ ー部位への L a e I タ ン パ ク 質の結合が減少 し 、 P s 4 プ 口 モ ー タ ー に よ る h M K T ( 1 - 163 ) 遗伝子の 転写が開始 さ れ る の 実施例 で宿主細胞 と し て用 い ら れ た大腸菌 は 1 9 9 4 年 月 3 0 日 付で ATCCに ATCC No. 69717 と し て 寄託 さ れて い る

の 大 腸 菌 （ A T C C N o. 69717 ) を 、 p AMG l l - h M K T ( 1

163 ) プ ラ ス ミ ド に よ り 形質転換 し 、 以下の 培養条件 に て培養 し た

( 2 ) h M K T ( 1 - 163 ) を 発 現す る 組換 え 大腸菌 の 培養、 T P O ( 1 - 163 ) Z E. c o l iの 製造

得 ら れ た 形質転換株を L B 培地に て 3 0 ^eC 、 約 1 2 時間培養 し た。 培養 し た細胞 は、 バ ッ チ培地 （酵母抽 出物 20 gZ l ； ク ェ ン酸 3. ； ₂ ΗΡ0 5 g/ 1 ； Dow P 2000 15 ro I ； グノレ コ ー ス 5g/l ; MgS0₄ - 7H₂ 0 1 g/1 ； 微量金厲類 5. 5m l/ l ビ 夕 ミ ン 5. 5in l / l を含む） を含む発酵槽に無菌的 に移 さ れ た ま ず 、 最 初 の 培 養 工 程 で は 、 そ の 培 養 液 の O D が A ₆。。 で 5 . 0 ± 1 . 0 に 至 る ま で続 け た。

次 に 、 第 1 フ ィ ー ド 培 地 （ グ ノレ コ ー ス 70 ( / l ; M _g S O ₄ · 7H ₂ 0 6. 75 g/ lを 含む） は添加速度を規定の 方法 に 従 っ て、 2 時間 ご と に 調整 し な が ら 培養を行 っ た。

第 2 フ ィ ー ド培地 （ ト リ プ チ カ ー ゼ ペ プ ト ン 129 g/ l ； 酵 母抽 出物 258 g/ l ) の 添加 は、 培養液の O D が A ₆。。 で 2 0 〜 2 5 に な っ て か ら 開始 し た。 そ の第 2 フ ィ 一 ド培地の添加 は、 第 1 フ ィ ー ド培地の添加を調整 し 続 け る 一方で、 一定の 流速を 維持 し た。

培養 は全工程 に わ た っ て約 3 0 °C で行 っ た。 培養液 は必要 に 応 じ て酸や塩基を添加す る こ と に よ り p H 約 7 . 0 に 保た れ た 望 ま し い溶存酸素演度 は発酵槽に お け る 撹拌速度、 通気速度、 お よ び酸素流入速度を調整す る こ と に よ り 維持 し た。 そ の培養 液の O D が A ₆。。 で 5 7 〜 6 3 に達 し て か ら 、 第 3 フ ィ ー ド培 地 （ ラ ク ト ー ス 301 /I ) を一定の速度で発酵槽に送 り こ ん だ 第 1 フ ィ ー ド培地の 添加を止め、 第 2 フ ィ ー ド培地の流速を新 た に一定の速度 に変更 し た。 培養を第 3 フ ィ 一 ド培地の 添加開 始後、 約 1 0 時間続 け た。 培養後、 そ の 培養液を 1 5 ± 5 で ま で冷却 し 、 細胞を遠心分離に よ り 回収 し た。

得 ら れ た ペ レ ツ ト は ー 6 0 °C以下で保存 さ れ た。

こ う し て組換え大腸菌で産生 さ れ た h M K T ( 1-163 ) の 精 製、 お よ び T P O ( 1-163 ) Z E. c iの 製造 は次の よ う に 行 つ た o

細胞菌体 18D0gを約 1 8 L の 10mM EDTA に 懸濁 し 、 高圧 ホ モ ジ ナ イ ザ ー に 15 , G 0 Q p s i に て通 し た。 破砕 し た細胞懸濁液を遠 心分離に か け 、 そ の 沈澱物を 1 0 L の 1 Q m M EDTA に再懸濁 し た そ の 懸 濁 液 を 逮心分離 に か け 、 沈澱物 を 、 2 L の 8M塩 酸 グ ァ ニ ジ ン 、 l OmM DTT、 5mM EDTAを 含む 10mM T r i s 緩衝液、 pH 8. 7 で可溶化 し た。 こ の溶液を 2 0 0 L の 3 M 尿素、 3 G % グ リ セ ロ ー ノレ 、 3mM シ ス 夕 ミ ン 、 ImM シ ス テ ィ ン を 含有す る 10mM CAPS. ρΗΠ. 5で ゆ っ く り と 希釈 し た。

こ の 希釈 液 を 1 6 時間、 室温 に て ゆ つ く り と 撹拌 し 、 pHを 6. 8 に 調整 し た。 pH調整後、 淸澄化 し 、 1. 5M尿素、 15% グ リ セ ロ ー ル を含む l QmMリ ン酸ナ ト リ ゥ ム 緩衝液、 pH 6. 8で予 め平衡 化 し た 2 L の CM Sepha roseカ ラ ム （ フ ア ル マ シ ア バ イ オ テ ク 社 製） に添加 し た。 添加終了後、 15% グ リ セ ロ ー ル を含有す る リ ン 酸ナ ト リ ウ ム緩衝液、 pH 7. 2で洗浄 し た。 h M K T ( 1 - 163 ) は l OmMリ ン酸ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ pH 7. 2) 中で塩化ナ ト リ ウ ム 濃度 0 か ら 0. 5Mの 直線濃度勾配 に よ り 溶出 さ れ た。

こ の よ う に し て得 ら れた CM S e p h a r o s e力 ラ ム の 溶 出画分を 、 分子量 10, 000カ ツ 卜 の膜を 用 い て mMリ ン 酸ナ 卜 リ ゥ ム 緩衝液

( P H 6. 5 ) で -濃 縮 し か つ バ ッ フ 交 換 し た の 濃 縮 液

( タ ン パ ク 濃 度約 2 m g /m I ) は、 9 0 分間、 室温 に て カ テ ブ シ ン

C (基質 タ ン パ ク 質 ： 酵素 = 500 : 1 ( モ ル比） ） に よ り 処理 し た

こ の 反応液を 、 15% グ リ セ ロ ー ノレを 含有す る l OraMリ ン 酸ナ ト リ ウ ム （pH 7. 2)で予 め平衡化 し た 1. 2 の 5卩 H i h P e r f o r ma n c e

S e ph a r o s e カ ラ ム （ フ ア ル マ シ ア ノ、' ィ ォ テ ク 社製） に 添加 し た 添加終了後、 h M K T ( 1 - 163 ) の N 末端の M e L y s が 切断 さ れた T P O 活性 タ ン パ ク 質、 即 ち 、 T P O ( 1 - 1 - 63) / I. c 01 i は 1 G in Mリ ン 酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ p H 7. 2) 中 で塩化ナ ト リ ウ ム 濃度 0. 1 か ら 0. 25M の 直線濃 度勾配で溶出 し た。

こ の S P H i g h P e r f o rma n c e カ ラ ム 力、 ら の溶出液 に 0. 6Mに な る ま で硫酸 ア ン モ ニ ゥ ム を 添加 し 、 0. 6M硫酸 ア ン モ ニ ゥ ム を含む

10 m Mリ ン 酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ p H 7. 2 ) で予 め平衡化 し た 1. 6 L - 2 1 - の Pheny l Toyopea r lカ ラ ム （東 ソ 一 社製） に 添加 し た。 T P O ( 1-163 ) Z E. co l iの ピ ー ク は、 10mMリ ン酸ナ ト リ ウ ム 緩衝液 ( pH7. 2 ) 中 で硫酸 ア ン モ ニ ゥ ム 漠度 0. 6 か ら 0Mの 直線濃度勾 配 に よ り 溶出 さ れ た

こ の よ う に し て得 ら れた Pheny l Toyopea r lの溶出液を、 分子 量 10 , 000カ ツ 卜 の膜を用 い て 5 % ソ ル ビ ト ー ル含有 10 m M T r i s 緩衝液 （ p H 7. 5 ) で濃縮かつ バ ッ フ ァ 一 交換 し た

配 列 表 配列番号 配列の長 さ ： 3 3 2 配列 の型 ： ア ミ ノ 酸 配列の種類 ： タ ン パ ク 質 起源 ： ヒ ト （ H o m o S a p i e n s ) 配列

S e r Pro Ala Pro Pro Ala Cy s Asp Leu A r g Va I Leu Ser L y s Leu Leu

1 5 10 15

A r g Asp Ser His V a I Leu His Ser A r g L e u S e r Gin Cys Pro G I u Va！

20 25 30

His Pro Leu Pro Th r Pro V a 1 Leu Leu Pro A I a Va I Asp Phe Ser Leu

35 40 45

G 1 G 1 II T r p L y s Th r Gin Met G I u G I u Th r L y s A I a Gin Asp l ie Leu

50 55 60

G 1 A 1 a Va 1 Th r Leu Leu Leu G 1 u G I y V a I Met Ala Ala A r g G I y Gin 65 70 75 80

Leu G I y Pro T h r C" Leu Ser Ser Leu Leu G I y Gin Leu Ser G I y Gin

85 90 95

Va 1 A r g L e u Leu Leu G I y A！ a Leu Gin Ser Leu Leu G I y Th r Gin Leu

100 105 110

Pro Pro Gin G I y A r g Th r Th r A 1 a His Ly s Asp Pro As n A 1 a Me Phe

115 120 125

Leu Ser Phe Gin His Leu Leu A r g G 1 y L y s V a I A r g Phe Leu Met Leu 130 135 140 Va 1 Gl G I y Se r Thr Leu Cys Va I Arg Arg A 1 a Pro Pro Th r Thr A I a Π 5 150 155 160

Va I Pro Se r Ar Thr S e r Leu Va I Leu Thr Leu As n G I u Leu Pro As n

165 170 175

Arg Thr S e r G I y Leu Leu G I u Thr A s n Ph e Thr A 1 a S e r A I a Arg Thr

180 185 190

Thr G I S e r G I Leu Leu Lys Trp Gin Gin G 1 y Ph e Arg A 1 a Lys I 1 e

195 200 205

Pro G 1 y Leu Leu A s n Gin Thr S e r A r g S e r Leu Asp Gin l ie Pro G 1

210 215 220

Ty r Leu A s n Arg l ie His Glu Leu Leu A s n G I y Thr Arg G I y Leu Ph e 225 230 235 240

Pro G i y Pro Se r Arg Arg Thr Leu G I y A I a Pro Asp I I e Se r Se r G I y

245 250 255

Thr Se r Asp Thr G 1 y Se r Leu Pro Pro As n Leu Gin Pro G I j Ty r Se r

260 265 270

Pro Se r Pro Thr His Pro Pro Thr G I y Gin Ty r Thr Leu Phe Pro Leu

275 280 285

Pro Pro Thr Leu Pro T r Pro Va 1 Va I G I n Leu His Pro Leu Leu Pro

290 295 300

Asp Pro Se r Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Se r Pro Leu Leu Asn Thr 305 ' 310 315 320

Se r Ty r Thr His Se r Gin Asn Leu Se r Gin Glu G I y 配列番号 ： 2

配列の長 さ ： 5 3 5

配列 の型 ： 核酸

鎖の数 ： 二本鎖

ト ポ ロ ジ ー ： 直鎖伏

配列の種類 ： 合成 D N A

起源 ト H o m o S a p i e n s )

配列

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA 28

ATG AAA AGT CCT GCA CCA CCT GCA TGT GAT TTA CGG GTC CTG TCT AAA 76

Met L y s S e r Pro A I a Pro Pro A I a C y s Asp Leu A r g V a 1 Leu S e r L y s

+1 5 10

CTG CTG CGC GAC TCT CAC GTG CTG CAC TCT CGT CTG TCC CAG TGC CCG 124

L e u Leu A r g A s p S e r Hi s V a 1 Leu Hi s S e r A r g Leu S e r Gi n Cys Pro

15 20 25 30

GAA GTT CAC CCG CTG CCG ACC CCG GTT CTG CTT CCG GCT GTC GAC TTC 172

G 1 u Va 1 Hi s Pro Leu Pro Thr Pro Va I Leu L e u Pro Al a Va I Asp Ph e

35 40 45

TCC CTG GGT GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAA GAG ACC AAA GCT CAG GAC 220

S e r Leu G I G I u Trp L y s Th r Gi n Me t G I u G 1 u Th r L y s A I a Gi n Asp

50 55 60

ATC CTG GGT GCA GTA ACT CTG CTT CTG GAA GGC GTT ATG GCT GCA CGT 268 l ie L e u G 1 A I a V a I Th r L e u Leu L e u G I u G I y V a I Me t Al a A I a A r g

65 TO 75 WO 96/28182 — ₃ 丄 _ PCX謹幅

GGC CAG CTT GGC CCG ACC TGC CTG TCT TCC CTG CTT GGC CAG CTG TCT 316 G I T Gin Leu G 17 Pro Th r Cy s Leu S e r S e r L e u Leu G 1 y Gin Leu S e r

80 85 90

GGC CAG GTT CGT CTG CTG CTC GGC GCT CTG CAG TCT CTG CTT GGC ACC 364 G I y Gin V a I A r g Leu Leu L e u G I y A I a L e u Gin S e r L e u Leu G Th r

95 100 105 110

CAG CTG CCG CCA CAG GGC CGT ACC ACT GCT CAC AAG GAT CCG AAC GCT i 12 Gin Leu Pro Pro Gin G I y A r g Thr T r A I a H i s L y s Asp Pro A s n A I a

115 120 125

ATC TTC CTG TCT TTC CAG CAC CTG CTG CGT GGC AAA GTT CGT TTC CTG 460 11 e Ph e Leu S e r P h e Gin His Leu Leu A r g G I y L y s Va I A r g P h e Leu

130 135 HO

ATG CTG GTT GGC GGT TCT ACC CTG TGC GTT CGT CGG CCG CCG CCA ACC 508 M e ί Leu V a I G I G I S e r Thr Leu C y s V a I A r g A r g Al a Pro Pro Thr

Π5 150 155

ACT GCT GTT CCG TCT TAATGAAAGC TT 535 Thr A I a Va I Pro Se r

160

Claims

請 求 の —範 — 囲

1 . 糖鎖部 を 有 し て い な い T P O タ ン パ ク 質 と 、 タ ン パ ク 質 セ ル ロ ー ス 誘導体 、 硫酸 化多 糖 、 界面活性 剤 、 ポ リ ビ ニ ル ア ル コ ー ル 、 マ ク ロ ゴ ー ル 、 ァ ミ ノ 酢酸 か ら な る 群 よ り 選 ば れ る 少 な く と も 1 種 の 薬学 的 に 許容 さ れ る 添 加 剤 と を 含 む こ と を 特徴 と す る T P O 含有 組成物。

2 . T P 0 含 有 組 成 物 を 水 溶 液 と し た 場 合 に 添 加 剤 が 0 . 0 0 1 〜 ： L 0 %で あ る 請求項 1 に 記 載 の T P O 含 有組成物

3 . 該 タ ン パ ク 質 が 、 ヒ ト 血清 ア ル ブ ミ ン 、 お よ び Z ま た は ゼ ラ チ ン で あ る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 1 ま た は 2 に 記 載 の T P 0 含 有組成物。

4 . 該 セ ル ロ ー ス 誘 導 体 が 、 メ チ ノレ セ ル ロ ー ス 、 ヒ ド ロ キ シ プ ロ ピ ル セ ノレ ロ ー ス 、 ヒ ド ロ キ シ ェ チ ノレ セ ノレ ロ ー ス か ら な る 群 よ り 選 ば れ る 少 な く と も 1 種 で あ る こ と を 特徴 と す る 請求項 1 ま た は 2 に 記 載 の T P 0 含 有組成物。

5 . 該界 面 活性 剤 が、 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン 硬 化 ヒ マ シ 油 、 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ヒ マ シ 油 、 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ソ ノレ ビ タ ン 脂 肪酸 エ ス テ ル 、 ソ ル ビ タ ン 脂肪 酸 エ ス テ ル 、 シ ョ 糖 脂肪酸 エ ス テ ル、 卵黄 リ ン 脂質、 芳香族四級 ア ン モ ニ ゥ ム 塩、 ア ル キ ル硫 酸塩か ら な る 群か ら 選ばれ る 少 な く と も 1 種で あ る を特徴 と す る 請求項 1 ま た は 2 に記載の T P 0 含有組成物。

6 該硫酸化多糖が、 コ ン ド ロ イ チ ン 硫酸 ナ 卜 リ ゥ ム 、 お よ び ま た はへパ リ ン ナ 卜 リ ウ ム で あ る こ と を 特徴 と す る 請求項 1 ま た は 2 に記載の T P 0 含有組成物。

7 糖鎖部を有 し て い な い T P O タ ン パ ク 質 を 含有す る 組成 物中 に 、 タ ン パ ク 質、 セ ル ロ ー ス 誘導体、 硫酸化多 糖、 界面活 性剤、 ポ リ ビニ ノレ ア ル コ ー ル、 マ ク ロ ゴ ー ル、 ア ミ ノ 舴酸力、 り な る 群 よ り 選ばれ る 少な く と も 1 種の薬学的 に 許容 さ れ る 添加 剤 を 含有 さ せ る こ と を特徴 と す る 、 該組成物を 含有す る 容器壁 上への T P 0 の吸着 に よ る 力価低下を 防止す る た め の方法„