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WO1996023069A1 - Recombinant dna prepared by integrating dna that codes for myosin heavy-chain sm1 isoform protein into vector dna, and microorganism and arteriosclerosis remedy both containing the recombinant dna - Google Patents

Recombinant dna prepared by integrating dna that codes for myosin heavy-chain sm1 isoform protein into vector dna, and microorganism and arteriosclerosis remedy both containing the recombinant dna Download PDF

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WO1996023069A1
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aag
cag
glu
ctg
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PCT/JP1996/000134
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Kazuhide Hasegawa
Emi Arakawa
Shoji Oda
Yuzuru Matsuda
Katsuhito Takahashi
Michihiro Sugawara
Haruo Ishiyama
Original Assignee
Vessel Research Laboratory Co., Ltd.
Osaka Prefectural Government
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Publication date
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Definitions

  • Recombinant DNA in which DNA encoding myosin heavy chain SMI isoform protein is incorporated into vector DNA, microorganisms containing the recombinant DNA, and therapeutic agents for atherosclerosis
  • the present invention relates to a recombinant DNA in which a DNA encoding a myosin heavy chain SM1 isoform protein used for a therapeutic treatment is incorporated into a vector DNA, a microorganism containing the recombinant DNA, and a therapeutic agent for arteriosclerosis.
  • Smooth muscle type myosin heavyweight SM1 isoform protein poor is one of myosin heavy chain isoform proteins specifically expressed in smooth muscle cells and is a protein responsible for smooth muscle contraction and relaxation.
  • the base sequence of the cDNA of the egret SM1 isoform is known [P. Babij et al .: Broding, Ob the, National Academy of Sciences. Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 88. 10676 (1991) 3, however, the nucleotide sequence homology between their DNAs is not known.
  • a recombinant DNA in which a smooth muscle-type myosin heavy chain SM1 isoform protein DNA that can be injected into animal cells is incorporated into a vector DNA is not known.
  • the present invention includes the following inventions.
  • the vector DNA is a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, or a plasmid for an expression animal.
  • DNA encoding the smooth muscle type myosin heavy chain SM1 isoform protein comprising the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or one or more basic forces W) Q, Lost or replaced DNA.
  • Examples of the DNA encoding the smooth muscle type myosin heavy chain SMI isoform protein include cDNA or genomic type DNA encoding the smooth muscle type myosin heavy chain SM1 isoform protein, preferably human, egret, Examples include DNAs such as mice.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding the smooth muscle myosin double feeder SM1 isoform protein includes the cDNA of the egret SM1 isoform protein (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 88 »10676 (1991)], The nucleotide sequence of the DNA encoding the murine myosin heavy chain SM1 isoform protein represented by SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 specified by the homologous portion of these nucleotide sequences.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 includes the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of cDNA of the egret SM1 isoform protein.
  • the partial nucleotide sequence of the cDNA of human smooth muscle type myosin heavy chain SM1 isoform protein is also known [American Journal of Medical Genetics (Amer. J.
  • the nucleotide sequence obtained by combining the DNA partial sequence with the partial sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is also a DNA encoding the smooth muscle myosin heavy chain SM1 isoform protein of the present invention. It is included in the base sequence.
  • Vector DNAs include retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, and expression animal PCXN2 [Gene, 108, 193-200 (1991)], PAGE207 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-46841) or a modified version thereof can be used.
  • the therapeutic agent for arteriosclerosis of the present invention comprises a recombinant DNA obtained by incorporating DNA encoding a smooth muscle type myosin heavy chain SM1 isoform protein, which is an active ingredient, into vector DNA, a gene therapeutic agent.
  • virus particles containing recombinant DNA are prepared and used as a base for gene therapy. Can be formulated together with the drug to produce a therapeutic agent [Nature Genet., 8, 42 (1994)].
  • the base used for the gene therapy agent is not particularly limited as long as it is a base usually used for injections. Salt water such as distilled water, sodium chloride or a mixture of sodium salt and inorganic salt, mannitol And lactose, dextran, glucose and the like; amino acid solutions such as glycine and arginine; organic acid solutions or mixed solutions of salt solutions and glucose solutions.
  • these bases are used with an osmotic pressure adjusting agent, a pH adjusting agent, a vegetable oil such as sesame oil, soybean oil, or an auxiliary agent such as a surfactant such as lecithin or a non-ionic surfactant.
  • the injection may be prepared as a solution, suspension, or dispersion. These injections can also be prepared as preparations for dissolution at the time of use by operations such as powdering and freeze-drying.
  • the above-mentioned therapeutic agent for arteriosclerosis can be used for treatment by dissolving it in the above-mentioned base sterilized by 'i5' while maintaining the liquid state as it is immediately before gene therapy, and in the case of a solid state.
  • the method of administering the therapeutic agent for arteriosclerosis of the present invention is a method for administering to a patient who has been treated with PTCA, a daily dose of 1 ng to 1 g by daily administration or once postoperatively, for vascular smoothing at the treatment site of the patient. It may be administered locally using a catheter or the like so that it is absorbed by muscle cells.
  • the therapeutic agent for arteriosclerosis of the present invention is safe within the dosage.
  • a method for producing a recombinant DNA in which a DNA encoding the smooth muscle type myosin heavy chain SM1 isoform protein of the present invention is incorporated into a vector DNA will be described.
  • Recombinant DNA in which DNA encoding smooth muscle type myosin heavy chain SM1 isoform protein has been incorporated into vector DNA can be produced by the following general genetic engineering method or a method analogous thereto.
  • Recombinant DNA incorporating myosin heavy chain SM1 isoform protein can be produced by rapidly ligating the DNA fragment downstream of the promoter in an appropriate vector DNA [J. Sambrook ( ⁇ Sambrook). Et al., Molecular Cloning, 2nd edition, 1 volume, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989].
  • an appropriate vector DNA J. Sambrook ( ⁇ Sambrook). Et al., Molecular Cloning, 2nd edition, 1 volume, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
  • promoters since animal cells are used as promoters, SV40-derived promoters, retroviral promoters, meta-oral-zine-in motors, 3-actin promoters and the like can be used.
  • the use of enhancers is also effective for expression.
  • the conditions of SJT in the recombination technique are shown below.
  • the digestion of DNA with a restriction enzyme is usually carried out by digesting 0.1 to 20 ng of DNA with 2 to 200 ⁇ (preferably 10 to 40 mM) at 113-1 «: 1 (1 ⁇ 6.0 to 9.5, preferably PH 7.0 to 8.0).
  • a reaction solution containing 0 to 200% sodium chloride and 2 to 20m (preferably 5 to 10m) magnesium chloride 0.1 to 100 units (preferably 1 to 1 DNA per DNA) (3 units) for 15 minutes to 24 hours at 20-70 (optimal temperature depends on the restriction enzyme used).
  • Sit is usually stopped at 55 to 75 for 5 to 30 minutes.
  • a method of inactivating the restriction by a reagent such as phenol can also be used.
  • DNA fragment binding reaction can be performed using a DNA ligation kit (Takara Shuzo).
  • a transformant is produced using the recombinant DNA containing the DNA encoding the smooth muscle type myosin heavy chain SM1 isoform protein thus constructed.
  • the transformation of the Escherichia coli can be performed according to the method of Koen et al. [SN Cohen et al .: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]. it can.
  • the virus vector host includes animal cells capable of producing viruses, such as monkey cell COS-7, Chinese hamster cell CH0, mouse cell BALB / 3T3, and human cell HeLa. Examples include WCRE, WC RIP [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • adenovirus vector As a host for the adenovirus vector and the adeno-associated virus vector, human embryo-derived 293 cell medicine, 12, 316 (1994)] and the like are used.
  • the viral vector can be introduced into animal cells by the calcium phosphate method (Virology, 52, 456 (1973)) or the like.
  • the obtained transformant can be cultured as follows depending on the cell type and used for production of recombinant DNA.
  • a liquid medium is suitable as a medium to be used for the cultivation, and includes a carbon source, a nitrogen source, and a carbon source necessary for the growth of the transformant.
  • Inorganic substances and others are contained.
  • Carbon sources include, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, glycerol, etc.
  • Nitrogen sources include, for example, ammonium salts, peptone, casein, etc.
  • Inorganic substances include, for example, calcium chloride, dihydrogen phosphate Sodium, magnesium chloride, etc. You. Yeast extract, vitamins, etc. may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8 s.
  • Examples of culture media for culturing Escherichia coli include, for example, ifTerrific broth (KD Tartof et al .: Bethesda Research Laboratory Focus, 9, 12 (1987)). Culture is usually performed at about 15 to 43 for about 8 to 24 hours, and aeration and agitation can be added by the following method.After completion of the culture, the method of Burnboim (Nucleic Acid Res., 7, 1513 (1979) )], A recombinant DNA containing a DNA encoding the smooth muscle type myosin heavy chain SM1 isoform protein can be obtained.
  • Burnboim Nucleic Acid Res., 7, 1513 (1979)
  • the culture medium may be, for example, 199 medium containing about 5 to 20% of fetal blood serum [Morgan et al .: Proc. Soci. Biol. Med., 73, 1 (1950)), MEM medium [H. Eagle: Science, 122, 501 (1952)], DMEM [R. Dulbecco] et al .: Virology, 8, 396 (1959)).
  • 199 medium containing about 5 to 20% of fetal blood serum
  • MEM medium H. Eagle: Science, 122, 501 (1952)]
  • DMEM R. Dulbecco] et al .: Virology, 8, 396 (1959)
  • a pH of about 6-8 forces is preferred.
  • Culture is usually performed at about 30 to 40 for about 18 to 60 hours, and if necessary, aeration and agitation are added.
  • FIG. 1 shows the restriction map of cDNA encoding the mouse smooth muscle type myosin heavy chain SM1 isoform protein and the location of the translation region.
  • FIG. 2 shows the area ratio between the colonies that were selected by introducing pSE-SMl-Hyg into CHO cells and selected with hygromycin and those that were introduced by introducing PAGE208.
  • FIG. 3 shows the area ratio between the colonies that appeared by introducing pSE-SMl-Hyg into HeLa cells and selected with hygromycin and the colonies that appeared by introducing PAGE 208.
  • Figure 4 shows a comparison of the growth rates of wild-type CHO cells, PAGE208-transfected clones, and SM1-isoform-expressing clones (SM1-5-2-1, S1-5-3-3) using the MTT method. Show.
  • Figure 5 shows the intimal hyperplasia in the case of introducing SM1 Liao gene into the blood vessel wall of the heron model with balloon injury (Example) and the case of introducing 13-galactosidase gene (Comparative example).
  • Escherichia coli DH5 ⁇ was transformed with the obtained plasmid to obtain transformants Escherichia coli DH5 ⁇ / pmsmhc20 ⁇ pmsrahcC5, pmsmhc N08, and pmsmhcN14.
  • the plasmid obtained from the transformant was further excised by digestion with exonuclease, or cut with an appropriate restriction enzyme, followed by self-closing or subcloning, and a ⁇ -type DN for sequence analysis.
  • a fluorescent DNA sequencer (Applied Biosystems) was used for sequencing, and MacMolly (manufactured by Soft Gene GmbH) was used for data analysis. Is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the deduced result of the amino acid sequence obtained from the result of the nucleotide sequence is also shown in SEQ ID NO: 1.
  • Plasmid pmSMl containing cDNA encoding the entire SM1 isoform translation region was prepared from the four clones obtained above by the following method. [Jay Sambrook et al., Molecular 'Cloning, 2nd Edition, Volume 1, Cold Laboratory, Laboratory Laboratory Breath, 1989]. First, in order to shorten the 5 'untranslated region, plasmid pmsmhcN14, which is ⁇ of the four clones, was digested with restriction enzymes BamHI and Bglll, and a 5 kb DNA fragment was purified and recovered. This DNA fragment was self-cyclized to transform Escherichia coli DH5 ⁇ , and colonies resistant to ampicillin were obtained. A known method [H.C. Bernburn (H.C.
  • Plasmid pmsmhcN08 was also digested with Nsil and EcoRV to purify and recover an lkb DNA fragment, which was ligated with the previously obtained 4kb DNA fragment derived from plasmid pmsmhcN14 'to construct pmsmhcN14-08. The structure of this plasmid was confirmed by digestion with Nsil and EcoRV. The obtained prasmhcN14-08 was digested with restriction enzymes Apal and Kpnl, and a 5 kb DNA fragment was purified and recovered.
  • plasmid pmsmhc20 was also digested with Apal and Kpnl to purify and collect a 1.5 kb DNA fragment, which was ligated to the 5 kb DNA fragment to construct plasmid ptnsmhcN14-08-20. The structure of this plasmid was confirmed by digestion with Apal and Kpnl.
  • pmsrahcN14-08-20 was digested with the restriction enzyme Apal to produce and recover a 6 kb DNA fragment.
  • pmsmhcC5 was digested with Apal to purify and collect a 2 kb DNA fragment, which was ligated to a 6 kb DNA fragment of pmsmhcN14-08-20 to construct plasmid pmsmhcN14-08-5-20.
  • the structure of this plasmid was confirmed by cutting with EcoRI and Nrul.
  • Blasmid pmsmhcN14-08-5-20 was digested with restriction enzymes Nsil and Nrul to purify and recover an 8-kb DNA fragment.
  • the plasmid pmsmhcN08 is also digested with Nsil and Nrul, the 1.5 kb DNA fragment is purified and recovered, ligated with the 8 kb DNA fragment, and translated into a mouse smooth muscle type myosin heavy chain SM1 isoform.
  • a plasmid pmSMl containing the region was constructed. The structure of the plasmid was confirmed by digestion with Nsil and Nrul. The obtained pmSMl was digested with restriction enzymes Xbal and Kpnl, and a 6 kb DNA fragment was purified and recovered.
  • PAGE 208 in which the Sraal site in the promoter of the hygromycin B resistance gene was deleted from the expression vector PAGE 207 was used, cut with Xbal and Kpnl, and cut into a 6 kb DN.
  • the A fragment was purified and recovered, and ligated to the previously obtained 6 kb DNA fragment derived from pmS to construct an expression plasmid pSE-SMl-Hyg.
  • the structure of this plasmid was confirmed by digestion with Xbal and Kpnl.
  • the DNA fragment obtained by digesting pmSMl with Xbal and Kpnl was blunted using a DNA blunting kit (Takara Shuzo). Furthermore, the expression vector PCXN2 was digested with Xhol and blunted using a DNA blunting kit (Takara Shuzo). By combining these two DNAs, an expression plasmid pCAG-SMl was constructed. The structure of this plasmid was confirmed by digestion with Bglll.
  • the plasmid pSE-SMl-Hyg was incorporated into Escherichia coli to obtain a transformant.
  • This transformant was designated as Escherichia coli pSE-SMl-Hyg (FERM BP-4974) by the Institute of Biotechnology, Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) in 1995. Deposited on January 24, 2014.
  • Example 3 Balloon injury: Inhibition of intimal hyperplasia when SM1 gene was forcibly introduced into the blood vessel wall of a heron model
  • a 3 French (Fr) PTCA catheter was inserted from the femoral artery of a Japanese white rabbit weighing 2.4 to 3.2 kg and guided to the right common carotid artery.
  • the right common artery was rubbed three times with the balloon inflated with ⁇ ⁇ ⁇ , and the vessel wall was breached.
  • a mixed solution of 300 mg of pCAG-SMl and ribofectin (GIBCO BRL) was infused into the vascular tolerated area at 6 atm using a Wolinski type infusion catheter manufactured by Bird.
  • an injured blood vessel was prepared in the same manner, and a plasmid expressing 0-galactosidase was introduced in place of pCAG-SMl as a comparative example.
  • SM1 gene introduction As in Examples (SM1 gene introduction) and Comparative examples (0-galactosidase gene introduction), the amplified DNA and its cut with the restriction enzyme Nhel were subjected to agarose gel electrophoresis. Although the band of SM1 was detected slightly in the comparative example and strong in the example, only the band of the example was cut by a force of 5 Nhel. Since the cut site of the enzyme was not found in rabbit SM1, but only in mouse SM1, it was confirmed in the Examples that the mouse-derived SM1 gene was expressed.
  • the right common carotid artery was removed.
  • the portion introduced by the infusion catheter was cut out and embedded in paraffin to prepare a slice of the blood vessel.
  • One blood vessel was divided into four equal parts, and one section was prepared from each tissue, and stained with hematoxylin-eosin staining.
  • the intima was divided into media at the boundary of the inner elastic plate of the blood vessel, and the area of each was measured. For each of the obtained sections, the ratio of the intimal area to the fertility was determined, and the average was taken to determine the degree of intimal thickening.
  • the intimal hyperplasia was determined for three animals and three comparative examples, and as a result, it was confirmed that forcible introduction of the SM1 messenger suppressed inner application toe thickness (Fig. 5).
  • brasmids pSE-SMl-Hyg and pCAG-SMl have a cell proliferation-reducing effect, and that they are ⁇ J in restenosis of arteriosclerosis caused by abnormal proliferation of vascular cells.
  • Sequence type nucleic acid
  • ATC GAG GCC ⁇ GCC AAG GCC ACC TAT GAG CGC CTT TTC CGA TGG ⁇ 1412 lie Glu Ala Leu Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Arg Leu Phe Arg Trp He
  • AAG CCC AAG CAG CTA AAG GAC AAA ACA GAG TTC TCC ATC ATC CAC TAT 1844 Lys Pro Lys Gin Leu Lys Asp Lys Thr Glu Phe Ser lie He His Tyr
  • Arg Cys lie lie Pro Asn His Glu Lys Arg Ser Gly Lys Leu Asp Ala
  • CAG ⁇ GCA GAG CTC AAG ATG CAG CTG GCA AAG AAA GAG GAA GAG CTA 3380 Gin lie Ala Glu Leu Lys Met Gin Leu Ala Lys Lys Glu Glu Glu Leu
  • GCC CTA AAG AAG ⁇ CGC GAG CTA GAG GGC CAT ATC TCA GAC CTA CAA 3476 Ala Leu Lys Lys He Arg Glu Leu Glu Gly His lie Ser Asp Leu Gin
  • AAG CGA GAC CTG GGG GAG GAG CTG GAG GCA CTC AAG ACG GAG CTG GAG 3572 Lys Arg Asp Leu Gly Glu Glu Leu Glu Ala Leu Lys Thr Glu Leu Glu
  • CAG ( ⁇ GAA CAG GAG GCC AGA GAG AAA CAG GCG GCC ACC AAG TCG CTG 5636 Gin Val Glu Gin Glu Ala Arg Glu Lys Gin Ala Ala Thr Lys Ser Leu
  • GAG CGC AAG ATG GCA GAG CAG TAC AAG GAG CAG GCA GAG AAA GGA AAC 5732 Glu Arg Lys Met Ala Glu Gin Tyr Lys Glu Gin Ala Glu Lys Gly Asn
  • Sequence type nucleic acid
  • AAG YAS CTO CCC ATC TAC TCN GAN AAG ATC GTG GAN ATG TAC AAG GGC 432
  • AAG AAG AGG CAN GAG ATG CCN CCN CAC ATC TAB GCC ATN GCC GAC ACN 480
  • AGC ATC ACG GGG GAG CTG GAN AAG CAG CTT CTTi CAN GCA AAC CCN ATC 672
  • AAG CAC ACN CAG CTG NCN GAG GAG AAG ANN CTG CTG CAG GAG CAG NTG 2688
  • GAG GCC AAG ATC AAG AAN NTG GAG GAN GAC ATC TG GTN ATG GAN GAT 2976 CAG AAC ANN AAN CTO TCA AAA GAN CGA AAA CTC CTN GAA GAG AGG NTN 3024 AGN GAN TIH ACA ACN AAN CTO GCN GAN GAG GAA GAN AAG GCN AAN AAC 3072 CTN ACN AAG CTG AAG ANC AAG CAT GAN TCN ATG ATC TCA GAN CTG GAN 3120 GTG NGG CTG AAG AAN GAG GAG AAG AGC CGG CAG GAG CTG GAG AAN CTN 3168 AAG NGG AAN NTG GAN GGN GAN GCC ACT GAC NTC CAN GAG CAG ATC GCN 3216 GAC NTO CAG GCN CAG ATN GCA GAG CTC AAG ATG CAG CTG GCN AAN 3264 GAN GAN GAG CTO CAG GCN GCN CTO GCC A
  • GCN GCN CGG GCC CTN GAN GAN GCC NTG GAN GCC AAA GAN GAN CTO GAG VGN 4512
  • GCA GCN AAG AAG AAG CTG GAN GGG GAC CTN AAA GAC CTN GAG CTN CAG 4896

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Description

明 細 書
ミオシン重鎖 SMIァイソフォームタンパク質をコードする DN Aをベクター DNAに組み込んだ組換え体 D N A並びに該組換え体 D N Aを含有する微生物及 び動脈硬化治療剤 技術分野
本発明は、 遣 治療に用いるミオシン重鎖 SM1ァイソフォームタンパク質 をコードする DNAをベクター DNAに組み込んだ組換え体 D N A並びに該組換 え体 D N Aを含有する微生物及び動脈硬化治療剤に関する。 背景技術
平滑筋型ミオシン重鎮 SM 1アイソフォームタンパク貧は平滑筋細胞で特異的 に発現しているミオシン重鎖ァイソフォームタンパク質の一つで、 平滑筋の収縮 弛緩を担うタンパク質である。該タンパク質の DNAとしては、 ゥサギ SM1ァ イソフォームの cDN Aの塩基配列が知られている [ビー 'バビジ (P. Babij)ら ：ブロシ一ディング，ォブ ·ザ，ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 88. 10676 (1991) 3 が、 それらの DNAの間の 塩基配列の相同性は知られていない。 また、 動物細胞へ注入できる平滑筋型ミオ シン重鎖 SM1ァイソフォームタンパク質の DN Aをベクター DN Aに組み込ん だ組換え体 D N Aは知られていない。
平滑筋細胞に存在するカルボニンと呼ばれるタンパク質の cDNAをラ、ソト 肺動脈由来血管平滑筋細胞株に導入して発現したところ、 細胞の倍增時間が約 4時間長くなること 〔高橘ら：サーキユレイシヨン（Circulation), 88, 1-174 (1993) ] 、 ゥサギの頸動脈をバルーン擦過した部位にヒトカルボニンの c DNAを局所注入すると内 BWE厚力柳制されること [高橘ら： Circulation, 88» 1-656 (1993) ) 力 告されているが、 ミオシン重鎖 SM 1ァイソフォームタン パク質の DNAをベクター DNAに組み込んだ組換え体 D N A力 効果を持つ こと、 遗^治療に用いられることは全く知られていない。
動脈硬化症の治療として、 パルーンカテーテルで狭窄部位を広げる経皮的冠動 脈形成術 （PTCA)力 ^盛んに行われている。 該治療法はバイパス手術などに比 ベて容易に行うことができ、 成功率も高いという利点を持つ反面、 治療を行った 患者の 30〜40%に血管細胞の異常増殖により、 再び血管力 s塞がってしまう再 狭窄を起こすという欠点がある。 そのため、 該再狭窄を防ぐために有用な動脈硬 化治療剤の開発力 まれている。 発明の開示
本発明は、 以下の発明を包含する。
( 1 ) 平滑筋型ミオシン重鎖 SM 1アイソフォームタンパク質をコードする DNAをベクター DNAに組み込んだ組換え体 D N A。
(2) ベクター DNAがレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 ァ デノ随伴ウィルスベクター又は発現動物用プラスミドである前記 (1) に記載の 組換え休 DNA。
(3)発現動物用ブラスミドが PCXN2又は PAGE208である前記 （2) に記载の組換え体 DNA。
(4)平滑筋型ミオシン重鎖 SMIアイソフオームタンパク質がヒト平滑筋型、 ゥサギ平滑筋型又はマウス平滑筋型である前記 （1) 〜 （3) のいずれかに記載 の組換え体 DNA。
(5) 平滑筋型ミオシン重鎖 SM 1アイソフォームタンパク質をコードする D N A力 列番号 1記載の塩基配列又は該塩基配列において 1又は複数の塩基が 付加、 欠失又は置換されている前記 （1)〜 （3) のいずれ力 >に記載の組換え体 DNA。
(6) 平滑筋型ミオシン重鎖 SM 1アイソフォームタンパク質をコードする D N Aであって、 配列番号 1記載の塩基配列からなる D N A又は該塩基配列にお いて 1もしくは複数の塩基力 W)Q、 欠失もしくは置換されている D N A。
(7)前記 （5) に記載の組換え体 DN Aを保持する微生物。
(8) ェシヱリヒア厲に厲する前記 （7) に記載の 物。
(9)前記 （1)〜 （5) のいずれかに記載の組換え体 DNAを含有する動脈硬 化治療剤 β 平滑筋型ミオシン重鎖 SMIァイソフォームタンパク質をコードする DN Aと しては、 平滑筋型ミオシン重鎖 SM1ァイソフォームタンパク質をコードする cDNA又はゲノム型 DNAがあげられ、 好ましくはヒト、 ゥサギ、 マウス等の DN Aがあげられる。
平滑筋型ミオシン重饋 SM 1アイソフォームタンパク質をコードする DN Aの 塩基配列としては、 ゥサギ SM1ァイソフォームタンパク質の cDNA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 88» 10676 (1991) ] 、 配列番号 1で示されるマウスミ ォシン重鎖 SM1ァイソフォーム夕ンパク質をコードする D N Aの塩基配列又は これらの塩基配列の相同部で特定した配列番号 2で示される塩基配列 〖なお配列 中、 Yは T、 U又は Cを表し、 Sは G又は Cを表し、 Vは A、 G又は Cを表し、 Βは G、 C、 T又は Uを表し、 Wは A、 T又は Uを表し、 Nは A、 C、 G、 Tも しくは U又は単結合を表す。 また、 コドン YAS (388— 390) は TAC又 は CAGを表す。 ] があげられる。従って、 配列番号 2で示される塩基配列は、 配列番号 1で示される塩基配列及びゥサギ SM 1アイソフォームタンパク質の cDN Aの塩基配列を含む。 また、 ヒト平滑筋型ミオシン重鎖 SM1ァイソ フォームタンパク質の cDN A部分塩基配列が知られているが 〔ァメリカン · ジャーナル ·ォブ ·メディカル · ジェネティックス （Amer. J. of Medical Genetics) , 46, 61-67(1993)) 、 該 DNA部分配列と配列番号 2で示される塩基 配列の部分配列とを組み合わせた塩基配列も、 本発明における平滑筋型ミオシン 重鎖 SM1ァイソフォームタンパク質をコードする DN Aの塩基配列に含まれ る。
更に、 部位特定変異誘発 [ヌクレイック，ァシド · リサーチ （Nucleic Acid Research) , 10, 6487-6508(1982)3により、 配列番号 2で示される塩基配列又は 配列番号 2で示される塩基配列の部分配列とヒト平滑筋由来の DN Αの塩基配列 とを組み合わせた塩基配列において、 1又は複数の塩基カ ¾1、 欠失又は置換さ れた塌合も、 本発明における平滑筋型ミオシン重鎖 SM 1アイソフォームタンパ ク質をコ一ドする D N Aの塩基配列に含まれる。
ベクター DNAとしては、 ウィルスベクターとしてレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノ随伴ウィルスベクター又は発現動物用ブラスミ ドである PCXN2 [ジーン（Gene), 108, 193-200(1991)] 、 PAGE207 (特開平 6— 46841号公報） 又はその改変体等を用いることができる。
本発明の動脈硬化治療剤は、 活'性成分である平滑筋型ミオシン重鎖 SM 1アイ ソフォームタンパク質をコードする DN Aをべクタ一 DN Aに組み込んだ組換え 体 DNAを、 遺伝子治療剤に用いる基剤と共に調合して製造することができる。 なお、 該製剤は投与する直前に、 必要によりリボソーム等に封入した後、 動脈 硬化の遗伝子治療に用いることができる [Proc. Natl. Acad. Sci. USA.， 90, 11307(1993) 】。
また、 平滑筋型ミオシン重鎖 SM 1アイソフォームタンパク質をコードする D N Aをウイルスべクタ一に組み込んだ塌合は、 組換え体 D N Aを含有するゥィ ルス粒子を調製し、 遺伝子治療剤に用いる基剤と共に調合して治療剤を製造する ことができる [ネイチヤー ·ジエネテイクス（Nature Genet.), 8, 42(1994)]。 遺伝子治療剤に用いる基剤としては、 通常注射剤に用いる基剤であればどのよ うなものでもよく、 蒸留水、 塩化ナトリウム又は塩ィヒナトリウムと無機塩との混 合物等の塩港液、 マンニトール、 ラクトース、 デキストラン、 グルコース等の溶 液、 グリシン、 アルギニン等のアミノ酸溶液、 有機酸溶液又は塩溶液とグルコ一 ス溶液との混合溶液等があげられる。 また、 常法に従い、 これらの基剤に浸透圧 調整剤、 PH調整剤、 ゴマ油、 ダイズ油等の植物油又はレシチンもしくは非ィォ ン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、 溶液、 懸濁液、 分散液として注 射剤を調製してもよい。 これらの注射剤を、 粉末化、 凍結乾燥等の操作により用 時溶解用製剤として調製することもできる。
前記の動脈硬化治療剤は、 遣伝子治療の直前に液体の塌合はそのままで、 固体 の場合は' i5¾により滅菌処理をした前記の基剤に溶解して治療に使用することが できる。
本発明の動脈硬化治療剤の投与方法は、 P T C A処置を行った患者に対して、 毎日又は術後 1回の投与で、 1日 1 n g〜 1 gの用量を、 患者の治療部位の血管 平滑筋細胞に吸収されるように、 カテーテル等を用いて局所的に投与すればよ い。
本発明の動脈硬化治療剤は、 投与量内で安全である。 以下に、 本発明の平滑筋型ミオシン重鎖 S M 1ァイソフォームタンパク質を コードする DNAをベクター DNAに組み込んだ組換え体 D N Aの製造方法を説 明する。
平滑筋型ミオシン重鎖 SM1ァイソフォームタンパク質をコードする DN Aを ベクター D N Aに組み込んだ組換え体 D N Aは、 以下に述べる一般の遺伝子工学 的手法あるいはそれに準じる方法を用いて製造することができる。
子宮、 大動脈等の平滑筋力 i主である鍾の cDNAライブラリーからエイ · 7 ベらの方法 [EC Lダイレク卜 DNAラベリング検出システム解説書 （アマシャ ム (Amersham)社） 】 により平滑筋型ミオシン重鎖 SM 1ァイソフォームタンパク Kをコードする DNAのクローンを検出する。
該 D N A断片を適当なベクター D N A中のプロモーターの下流に速結するこ とによりミオシン重鎖 S M 1ァイソフォームタンパク を組み込んだ組換え体 DNAを製造することができる [ジエイ ·サンブルック（丄 Sambrook) ら、 モレ キュラー ·クローユング (Molecular Cloning) 、 第 2版、 1卷、 コールドスブリ ングハーバーラボラトリーブレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press) 、 1989年】 。 なお、 プロモーターとしては動物細胞を宿主とするため、 SV 40由来のプロモーター、 レトロウイルスのプロモーター、 メタ口チォネインブ 口モーター、 3ァクチンプロモーター等が利用できる。 なお、 発現にェンハン サ一の利用も効果的である。
以下に、 前記組み換え技法における SJT、の条件を示す。 DN Aの制限酵素によ る消化 は、 通常 0.1〜20ngの DNAを 2〜200πΜ (好ましくは 10〜40mM) の丁113-1«：1( 1{6.0〜9.5好ましくは PH7.0〜8.0 ) 、 0〜200Β»Μの塩化ナトリウ ム、 2〜20m (好ましくは 5〜10m ) の塩化マグネシウムを含む反応液中で、 制 P艮酵素 0.1 〜100単位 （好ましくは 1 の DNAに対して 1〜3単位） を用 い、 20-70 (至適温度は用いる制限酵素により異なる） において、 15分間〜 24 時間行う。 Sit、の停止は、 通常 55〜75でで、 5〜30分間加熱することによるが、 フエノール等の試薬により制限醉素を失活させる方法も用いることができる。 制限酵素消化によって生じた DNA断片あるいはギヤッブト，デュブレックス DNAの精製は Pr印- A-Gene Matrix (バイオラヅド（BI0-RAD) 社） を用いて行う ことができる。 DNA断片の結合反応は、 DNAライゲーシヨンキット （宝酒造 社） を用いて行うことができる。
このようにして構築された平滑筋型ミオシン重鎖 SM1ァイソフォームタンパ ク質をコードする DNAを含有する組換え体 DNAを用いて、 形質転換体を製造 する。
発現動物用ブラスミドベクターの宿主としては、 エシュリヒア厲に厲する エシュリヒア · コリの K 12 · HB 101 [ェイチ ·ダブリユー ·ボイヤー
(H.W. Boyer) ら：ジャーナル.ォブ 'モレキュラー.バイオロジー （丄 Mol. Biol. ) , 41, 459 (1969)] 、 DH 5 α [ディー .ハナハン （D. Hanahan) ： J. Mol. Biol., 166, 557 (1983) ] 等が用いられる。 該ェシエリヒア厲菌の 形質転換は、 コーェンらの方法 [エス 'ェヌ ' コ一ェン （S. N. Cohen ) ら： Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972) 〗 に従って行うことができる。 ゥィルスベクターの宿主としては、 ウイルス生産能を有する動物細胞であ る、 サル細胞 COS- 7、 チャイニーズハムスター細胞 CH0、 マウス細胞 BALB/3T3、 ヒト細胞 He La等が用いられ、 レトロウイルスベクターの宿主 としては、 WCRE、 WC R I P [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6460 (1988)] 、 MLV [ジャーナル'ォブ.ヴイロロジー U. Virol.) , 65, 1202 (1991)) 等が、 アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウィルスベクターの宿主 としては、 ヒト胎児 臓由来の 293細胞 医学、 12, 316 (1994)] 等が用 いられる。 ウィルスベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法 [ヴイロ ロジー （Virology), 52, 456(1973)) 等で行うことができる。
得られた形質転換体は、 細胞種の違いにより以下のように培養し、 組換え体 D N Aの生産に供することができる。
宿主がエシュリヒア厲菌である形質転換体を培養する際、 培養に使用される培 地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生育に必要な炭素 源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例えばグル コース、 デキス卜リン、 可溶性でんぷん、 ショ糖、 グリセロール等、 窒素源とし ては、 例えばアンモニゥム塩類、 ペプトン、 カゼイン等、 無機物としては、 例え ば塩化カルシウム、 リン酸ニ水素ナトリゥム、 塩化マグネシウム等が挙げられ る。 また酵母抽出物、 ビタミン類等を添加してもよい。 培地の pHは約 5〜8 力 s望ましい。 ェシエリヒア厲菌を培養する際の培地としては、 例え ifTerrific broth (ケィ 'ディー ·タートフ （K. D. Tartof) ら：ベテスダ ·レサーチ ·ラ ボラトリー ·フォーカス （Bethesda Res. Lab. Focus) , 9, 12 (1987) ] カ'好ま しい。 培養は通常約 15〜43 で約 8〜24時間行い、 により通気ゃ搜拌 を加えることもできる。培養終了後、 バーンボイムの方法 (Nucleic Acid Res., 7, 1513(1979) ] 等により精製することにより、 平滑筋型ミオシン重鎖 SM 1ァ イソフォームタンパク質をコードする DNAを含有する組換え体 DNAを得るこ とができる。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば約 5〜 20%のゥシ胎児血消を含む 199培地 [モーガン （Morgan) ら： Proc. Soci. Biol. Med., 73, 1 (1950) )、 MEM培地 [ェイチ.イーグル （H. Eagle) ： サイエンス （Science ) , 122, 501 (1952) 〗、 DMEM [アール♦ダルべッ コ (R. Dulbecco ) ら： Virology, 8, 396 (1959) ) 等が用いられる。 pHは約 6〜8力 i好ましい。 培養は通常約 30〜40でで約 18〜60時間行い、 必要に応じて通 気ゃ报拌を加える。
組換え体 D N Aを含有するゥィルス粒子は培養上清中に放出されるので、 ゥィ ルス粒子の醜、 精製を塩化セシウム遠心法 [沢田幸治ら、 新生化学実験講座 2 —V, 33(1992)] 、 ポリエチレングリコール沈澱法 [アーチ一ブ*ヴイロオジー (Arch. Virol.), 71, 185(1982)) 、 フィルター濃縮法 [ジャーナル.ォブ *セ ル*バイオロジー（丄 Cell Biol.), Ill, 217(1990)]等で行うことにより、 平滑 筋型ミオシン重鎖 SM 1アイソフォームタンパク質をコードする DN Aを含有す る組換え体 D N Aを得ることができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 マウス平滑筋型ミオシン重鎖 SM1ァイソフォームタンパク質をコー ドする c DN Aの制限酵素地図及び翻訳領域の位置を示す。
ブラスミド名： SM— 1 Ftext
ブラスミドのサイズ： 6175bp 枠内部：翻訳領域
A： Apal
B： BamHI
Sa： Sad
Sm： Smal
図 2は、 CHO細胞に pSE-SMl-Hygを導入してハイグロマイシンで選択して出 現したコロニーと PAGE208を導入して出現したコロニーとの面積比を示 す。
図 3は、 H e L a細胞に pSE-SMl-Hygを導入してハイグロマイシンで選択して 出現したコロニーと PAGE 208を導入して出現したコロニーとの面積比を示 す。
図 4は、 CHO細胞の野生型、 PAGE208導入クローン、 SM1ァイソ フォーム発現クローン （SM1-5-2-1、 S 1-5-3-3 ) の増殖速度の MT T法を用い ての比較を示す。
— 0— CHO
— Δ— PAGE208 - 1
— ·— SM1 5-2-1
—■— SM1 5-3-3
図 5は、 バルーン傷害ゥサギモデルの血管壁に SM1遼伝子を導入した例 （実 施例） と 13—ガラクトシダーゼ遗伝子を導入した例 （比較例） における内膜肥厚 度を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をより具体的に説明する力 本発明はこれらに限定 されるものではない。
(^例 1) マウス平滑筋型ミオシン重鎖 SM1ァイソフォームタンパク質 をコードする DN Aをベクター DN Aに組み込んだ組換え体 DN A
(a) プローブの作製
ゥサギ平滑筋型ミオシン重鎖 SM 2ァイソフォームタンパク質の cDN A断片 をクローユングしたブラスミド pSMHC29及び pIH61 〔ジャーナル ·ォブ ·バイオ ケミストリー U. Biol. Chem. ) , 264, 9734-9737(1989)) を使用した。 これを EcoRI (宝酒造社製、 以下制限酵素に関しては特記しないかぎりすべて宝酒造社 製） で切断し、 ゥサギ平滑筋型ミオシン重鎖 SM2ァイソフォームタンパク質の 揷入闬 cDN A断片を調製した。 これを ECLダイレクト DNAラベリングシス テム （アマシャム社） を闬いて標識し、 以下のスクリーニングにおけるプローブ として用いた。
(b) スクリーニング
gtllベクターマウス子宮 cDNAライブラリー （クローンテック（CL0NTECH) 社製） を:^菌 Y1090 (クローンテック社製） と混ぜ、 37 で 15分間インキ ュペートした後、 0.7 %ァガロース NZY [Nucleic Acid Res. , 16, 7583-7600 (1988) ) を加え、 1.5 %寒天 ΝΖΥプレートにまいた。 プラークのできたブレー トにナイロンフィルターを βき、 フィルターにプラークを転写した。 このフィル ターをアルカリ処理することによつて変性させた後、 80*02時間の加熱によつ て DNAの固定を行った。 （a) において、 ECLダイレクト DNAラベリング システムのブロトコールにしたがって先に檁識したプローブと、 DNAをハイブ リダィズさせた。 更に EC L検出システム [アマシャム社製〕 を用いてオートラ ジォグラフィ一を行ってハイブリダィズするクローンを検出した。
(c) DN A塩基配列謹
4個のクローンが同定され、 各クローンを配列解析のために pUC119 (宝酒造 社） 又は pBluescript SK (-) (ストラタジーン（STRATAGEE)社） にサブクローニ ングした。 得られたプラスミドで大腿菌 DH 5 αを形質転換し、 形質転換体ェ シエリヒア ·コリ (Escherichia coli) D H 5 α / pmsmhc20x pmsrahcC5、 pmsmhc N08、 pmsmhcN14を得た。 該形質転換体から されたブラスミドを、 更にェキ ソヌクレアーゼ消化によって段階的に削っていき、 又は適当な制限酵素によって 切断後、 自己閉瑰あるいはサブクローユングし、 配列解析のための鎊型 DN Aを 調製した [Gene, 28, 351-359 (1984) 】 。 配列決定には蛍光式 D N Aシーケン サー （アブライドバイオシステムズ (Applied Biosystems}社） を用い、 データー 解析には MacMolly [Soft Gene GmbH¾製] を使用した。 DNAの塩基配列の結果 を配列番号 1に示した。 また該塩基配列の結果から得たアミノ酸配列の推定結果 も配列番号 1に示した。
(d) マウス平滑筋型ミオシン重鎖 SMIァイソフォーム発現ブラスミドの作製 先に得た 4個のクローンから SM 1ァイソフォーム全翻訳領域をコードする cDNAを含むプラスミド pmSMl を以下の方法により作製した [ジエイ ·サンブ ルックら、 モレキュラー 'クローニング、 第 2版、 1巻、 コールドスブリングハ 一バーラボラトリーブレス、 1989年] 。 まず 5' 非翻訳領域を短くするた めに、 4個のクローンの ^であるプラスミド pmsmhcN14を制限酵素 BamHI と Bglll で切断し 5 kbの DNA断片を精製、 回収した。 この DN A断片を自己閉 環して大腸菌 DH 5 αを形質転換し、 アンピシリン耐性のコロニーを得た。 こ のコロニーの培養菌体から公知の方法 [ェイチ · シー ·バーンボイム （H. C.
Birnboira) ら： Nucleic Acid Res., 7, 1513 (1979) 〗 に従ってブラスミド DNAを回収した。 得られたブラスミドの構造は、 BamHI及び Kpnlで切断後、 ァ ガロースゲル電気泳動により確認した。 このブラスミドを pmsmhcN14'とよぶ。 得られたブラスミド pmsmhcN14'を制限酵素である Nsil (ニューィングランドパ ィォラブ（New England Biolabs) 社） と EcoRVで切断し、 4kbのDNA断片を 精製、 回収した。 またプラスミド pmsmhcN08 も Nsilと EcoRVで切断して lkbの DNA断片を精製、 回収し、 先に得られたプラスミド pmsmhcN14'由来の 4kbの DNA断片と結合させて、 pmsmhcN14-08を構築した。 このプラスミドの構造は Nsil及び EcoRVで切断して確認した。 得られた prasmhcN14-08を制限酵素 Apalと Kpnlで切断して 5 kbの DN A断片を精製、 回収した。 また同様にプラスミド pmsmhc20も Apalと Kpnlで切断して 1.5kbの DNA断片を精製、 回収し、 先の 5kb の DNA断片と結合させて、 プラスミド ptnsmhcN14-08-20を構築した。 このブラ スミドの構造は Apal及び Kpnlで切断して確認した。
得られた pmsrahcN14-08-20を制限酵素 Apalで切断して 6 kbの D N A断片を耥 製、 回収した。 また pmsmhcC5を Apalで切断して 2kbの DNA断片を精製、 回収 し、 pmsmhcN14-08-20の 6kbの D N A断片と結合させてプラスミド pmsmhcN14- 08-5-20を構築した。 このブラスミドの構造は EcoRI及び Nrulで切断して確認し ブラスミド pmsmhcN14-08-5-20 を制限酵素 Nsilと Nrulで切断して 8kbの D N A 断片を精製、 回収した。 またプラスミド pmsmhcN08 も同様に Nsilと Nrulで切断 し、 1.5kbの DNA断片を精製、 回収し、 先の 8kbの D N A断片と結合させて、 マゥス平滑筋型ミオシン重鎖 S M 1アイソフォ一ムの全翻訳領域を含むブラスミ ド pmSMl を構築した。 プラスミドの構造は Nsil及び Nrulで切断して確認した。 得られた pmSMl を制限酵素 Xbalと Kpnlで切断して 6kbの DNA断片を精製、 回 収した。 また発現ベクター PAGE 207 (特開平 6— 46841号公報） の ハイグロマイシン B耐性遺伝子のプロモーター部にある Sraal部位を欠失させた PAGE 208を用い、 これを Xbalと Kpnlで切断して 6 kbの DN A断片を精製、 回収し、 先に得られた pmS 由来の 6kbの DNA断片と結合させて、 発現ブラス ミド pSE-SMl-Hygを構築した。 このブラスミドの構造は Xbal及び Kpnlで切断して 確認した。
pmSMl を Xbalと Kpnlで切断した DNA断片を DNAブランティングキッ卜 （宝 酒造社） を用いて平滑化した。 更に、 発現ベクター PCXN2を Xholで切断し て DNAブランティングキッ ト （宝酒造社） を用いて平滑化した。 この 2つの DNAを結合させて、 発現プラスミド pCAG-SMlを構築した。 このプラスミドの構 造は Bglll で切断して確認した。
前記ブラスミド pSE-SMl-Hygを Escherichia coli に組み込んで形質転換体を 得た。
なお、 本形質転換体は、 Escherichia coli pSE-SMl-Hyg (FERM BP-4974 ) と して工業技術院生命工学工業技術研究所 （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3 号） に平成 7年 1月 24日付けにて寄託されている。
(実施例 2) CH0細胞及び He La細胞で S Mlァイソフォームを発現さ せた際の細胞増殖に与える効果
発現プラスミド pSE-SM卜 Hyg 2 μ gとリボフヱク卜ァミン （商品名：ギブコ 社製） 4 w 1を混合して 15分間インキュベートして複合体を作った。 これを CH 0細胞あるいは H e L a細胞に添加して、 37 °Cで 5時間ィンキュベートし て遺伝子を導入した。 遣伝子導入細胞を希釈してシャーレにまき、 ハイグロマイ シン （商品名：シグマ社製） で遗伝子導入細胞を選択した。 約 10日後、 薬剤耐 性細胞のコロニーをクマシ一ブルー （商品名：バイオラッド社製） で染色して、 面積を画像解析装置で測定した。 その結果、 対照のベクター P A G E 208を導 入した場合に比べて面積の小さなコロニーが多く、 S M 1アイソフオームの発現 により増殖力 i抑制させること力示された （図 2、 図 3) 。 また、 このハイグロマ イシン耐性 CHO細胞のクローニングを行い、 得られたクローン SM1-5-2-1 及び SM1-5-3-3の増殖速度を調べたところ、 野生型あるいは PAGE 208導入細胞 と比べ低下していた （図 4) 。
(実施例 3) バルーン傷害ゥサギモデルの血管壁に SM1遺伝子を強制導入し た時の内膜肥厚抑制効果
体重 2.4〜3.2kg の日本白色家兎の大腿動脈から X線透視下、 3フレンチ (Fr) の PTCAカテーテルを挿入し右総頸動脈まで誘導した。 ΙΟ^Εで拡張さ せたバルーンにより右総 動脈を 3回擦過し、 血管壁を した。 擦過 3日後の 血管堪害部に対して、 pCAG-SMl 300mgとリボフヱクチン （GIBCO BRL社） の混合 液をバード社製ヴォリンスキー型インフュージョンカテーテルを用いて、 6気圧 でインフュージョンした。 別の家兎を用い、 同様の方法で傷害血管を作製し、 pCAG-SMlの代わりに 0—ガラクトシダーゼの発現ブラスミドを導入して比較例と した。
インフュージョン後 3日目にへパリン生理食塩水により港流して儀死せしめた 後、 右総頸動脈を摘出し、 細切後 ISOGEN (和光純薬） 1mlを加え、 ポリトロン ホモジナイザーによりホモジナイズした。 AGPC法 〔ビー 'コムジンスキー （P. Chomczynski ) とェヌ 'サツチ （N. Sacchi ) ： Anal. Biochem. , 162, 156-159 (1987)] により総 RN Αを抽出した後、 RT-PCR法により SM1の mRNAを增幅 した。実施例 （SM1遺伝子導入） および比較例 （0-ガラクトシダーゼ遺伝子 導入） にっき、 増幅させた DNA、 及びそれを制限酵素 Nhelで切断したものをァガ ロースゲル電気泳動にかけた。実施例には強く、 比較例ではわずかに SM1のバ ンドが検出されたが、 実施例のパンドのみ力5 Nhelにより切断された。 同酵素の切 断部位は、 家兎の SM1にはなく、 マウス SM1のみにあることから、 実施例に おいてマウス由来の SM1遺伝子が発現していることが裏付けられた。
導入 2週後に 2 %パラホルムアルデヒドを含む P B Sにより港流し屠殺、 固定
2 を行い、 右総頸動脈を摘出した。 インフュージョンカテーテルにより導入された 部分を切り出し、 パラフィン包埋し、 血管の輪切り切片を作製した。 1本の血管 を 4等分し、 それぞれの組織から 1枚ずつ切片を作製し、 へマトキシリンーェォ ジン染色により染色した。 血管の内弾性板を境に内膜を中膜にわけ、 それぞれの 面積を測定した。 得られた各切片につき、 内膜面積と中 穣の比をとり、 その 平均を取って内膜肥厚度を求めた。実施例 3頭、 比較例 3頭につき内膜肥厚度を 求めた結果、 S M 1遣伝子の強制導入により内願巴厚が抑制されることが確認さ れた （図 5 ) 。
この結果から、 ブラスミド pSE-SMl-Hyg及び pCAG-SMlに細胞增殖低下作用が あり、 血管細胞の異常増殖により生じる動脈硬化の再狭窄に^ Jであること力 > '示 唆された。 上の利用可能性
本発明の平滑筋型ミオシン重鎖 S M 1ァイソフォームタンパク質をコードす る D N Aをベクター D N Aに組み込んだ組換え体 D N Aを動物細胞で発現させ ると、 その増殖が抑制されることが明らかとなった。 この効果はヒト由来の H e L a細胞においても見られた。 したがって、 本発明の組換え体 D N Aは P T C A処 S後の再狭窄に対する遠伝子治療剤として有効に用いることができ る。
3 配列表
- 配列番号： 1
配列の長さ： 6175
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ··直鎖状
配列の種類： cDNA o mRNA
起源
生物名：マウス
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 105, 6023
特徴を決定した方法： E
特徴を表す記号： mat epti de
存在位置： 105, 6020
特徴を決定した方法： S
配列
AGATTTGGAC CATCCCAGCC TGGGATCAGT GCCAGATCCG AGCTCTCCAT CCGGTGTCCT 60 CCTGCTAATC CACCCCCGGA GTAGATCTGG GACCACCAGA CATC ATG GCG CAG AAA 116
Met Ala Gin Lys
1
GGG CAG CTC AGC GAT GAT GAG AAG TTC CTC ΠΤ GTG GAT AAA AAC TTC 164 Gly Gin Leu Ser Asp Asp Glu Lys Phe Leu Phe Val Asp Lys Asn Phe
5 10 15 20
ATG AAC AGC CCA ATG GCT CAG GCC GAC TGG GTA GCC AAG AAG CTG GTG 212 Met Asn Ser Pro Met Ala Gin Ala Asp Trp Val Ala Lys Lys Leu Val
25 30 35
TGG GTC CCT TCA GAG AAG CAG GGC TTC GAA GCA GCC AGC ATC AAG GAG 260 Trp Val Pro Ser Glu Lys Gin Gly Phe Glu Ala Ala Ser lie Lys Glu 40 45 50
GAG AAG GGC GAT GAG GTG GTC GTG GAG HG GTG GAA AAT GGA AAG AAG 308 Glu Lys Gly Asp Glu Val Val Val Glu Leu Val Glu Asn Gly Lys Lys
55 60 65
GTC ACA GH GGC AAA GAT GAC ATC CAA AAA ATG AAC CCA CCC AAG TTC 356 Val Thr Val Gly Lys Asp Asp lie Gin Lys Met Asn Pro Pro Lys Phe
70 75 80
TCT AAG GTG GAG GAC ATG GCA GAG CTG ACG TGC CTC AAT GAG GCC TCT 404 Ser Lys Val Glu Asp Met Ala Glu Leu Thr Cys Leu Asn Glu Ala Ser
85 90 95 100
GTG CTG CAC AAC CTG AGG GAG CGA TAC TTC TCA GGC CTC ATC TAT ACC 452 Val Leu His Asn Leu Arg Glu Arg Tyr Phe Ser Gly Leu lie Tyr Thr
105 110 115
TAC TCT GGC CTC TTC TGT GTG GTG GTC AAC CCC TAC AAG TAC CTA CCC 500 Tyr Ser Gly Leu Phe Cys Val Val Val Asn Pro Tyr Lys Tyr Leu Pro
120 125 130
ATC TAC TCA GAA AAG ATC GTG GAT ATG TAC AAG GGC AAG AAG AGG CAT 548 He Tyr Ser Glu Lys lie Val Asp Met Tyr Lys Gly Lys Lys Arg His
135 140 145
GAG ATG CCG CCT CAC ATC TAT GCC ΑΠ GCC GAC ACA GCC TAC AGA AGC 596 Glu Met Pro Pro His lie Tyr Ala lie Ala Asp Thr Ala Tyr Arg Ser
150 155 160
ATG CTA CAA GAT CGT GAA GAC CAG TCC ΑΠ CTG TGC ACA GGT GAG TCT 644 Met Leu Gin Asp Arg Glu Asp Gin Ser lie Leu Cys Thr Gly Glu Ser
165 170 175 180
GGA GCC GGA AAG ACA GAG AAC ACA CAG AAA GTC ATA CAG TAC HG GCT 692 Gly Ala Gly Lys Thr Glu Asn Thr Gin Lys Val lie Gin Tyr Leu Ala
185 190 195
GTG GTG GCG TCC TCC CAC AAG GGC AAG AAA GAC AGC AGC ATC ACG GGG 740 Val Val Ala Ser Ser His Lys Gly Lys Lys Asp Ser Ser lie Thr Gly
200 205 210
GAG CTG GAA AAG CAG CIT CTA CAG GCA AAC CCA ATC CTG GAG GCT TTC 788 Glu Leu Glu Lys Gin Leu Leu Gin Ala Asn Pro lie Leu Glu Ala Phe
215 220 225
GGC AAT GCG AAA ACC GTC AAG AAC GAC AAC TCC TCT CGC ΉΤ GGC AAG 836 Gly Asn Ala Lys Thr Val Lys Asn Asp Asn Ser Ser Arg Phe Gly Lys
230 235 240
TTC ΚΠ CGC ATC AAC TTC GAT GTC ACT GGT TAC ΑΠ GTA GGT GCC AAT 884 Phe lie Arg lie Asn Phe Asp Val Thr Gly Tyr lie Val Gly Ala Asn
245 250 255 260
ΑΠ GAA ACA TAT CIT CTG GAA AAG TCT AGG GCT ΑΠ CGA CAG GCT AGG 932 lie Glu Thr Tyr Leu Leu Glu Lys Ser Arg Ala lie Arg Gin Ala Arg
265 270 275
GAT GAG AGA ACA TIT CAC ATC TTC TAC TAC CTG CTC GCC GGA GCC AAG 980 Asp Glu Arg Thr Phe His lie Phe Tyr Tyr Leu Leu Ala Gly Ala Lys
280 285 290
GAA AAG ATG AAA AGT GAC CTG CIT HG GAG AGC TTC AAC AGC TAC ACA 1028 Glu Lys Met Lys Ser Asp Leu Leu Leu Glu Ser Phe Asn Ser Tyr Thr
295 300 305
ITT ΠΑ TCC AAT GGC TIT GTG CCC ATC CCA GCT GCA CAA GAT GAT GAG 1076 Phe Leu Ser Asn Gly Phe Val Pro lie Pro Ala Ala Gin Asp Asp Glu
310 315 320
ATG TTC CAG GAG ACA CTG GAA GCC ATG TCT ATC ATG GGC TTC AAT GAA 1124 Met Phe Gin Glu Thr Leu Glu Ala Met Ser lie Met Gly Phe Asn Glu
325 330 335 340
GAG GAA CAG CTA GCC ATC TTG AAG GTA GTA TCA TCT GTC CTT CAG CTT 1172 Glu Glu Gin Leu Ala lie Leu Lys Val Val Ser Ser Val Leu Gin Leu
345 350 355 GGA AAC ΑΠ CTC TTC AAG AAG GAG CGA AAC ACA GAC CAG GCA TCC ATG 1220 Gly Asn lie Val Phe Lys Lys Glu Arg Asn Thr Asp Gin Ala Ser Met
360 365 370
CCT GAT AAC ACA GCG GCT CAG AAA GH TGC CAC CTC GTG GGG ΚΠ AAT 1268 Pro Asp Asn Thr Ala Ala Gin Lys Val Cys His Leu Val Gly lie Asn
375 380 385
GTG ACA GAT TTC ACT AGA GCC ATC CTG ACC CCA CGT ATC AAA GH GGA 1316 Val Thr Asp Phe Thr Arg Ala lie Leu Thr Pro Arg lie Lys Val Gly
390 395 400
CGG GAT GTG GTG CAG AAG GCT CAG ACC AAA GAA CAG GCT GAC TTC GCC 1364 Arg Asp Val Val Gin Lys Ala Gin Thr Lys Glu Gin Ala Asp Phe Ala
405 410 415 420
ATC GAG GCC ΠΑ GCC AAG GCC ACC TAT GAG CGC CTT TTC CGA TGG ΑΠ 1412 lie Glu Ala Leu Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Arg Leu Phe Arg Trp He
425 430 435
CTC AGC CGT GTA AAC AAG GCC TTG GAC AAG ACC CAT CGG CAG GGG GCC 1460 Leu Ser Arg Val Asn Lys Ala Leu Asp Lys Thr His Arg Gin Gly Ala
440 445 450
TCC TTC CTG GGC Ή CTG GAT AH GCT GGG ΉΤ GAA ATC TIT GAG GTA 1508 Ser Phe Leu Gly lie Leu Asp lie Ala Gly Phe Glu lie Phe Glu Val
455 460 465
AAC TCC TTC GAG CAG CTG TGC ATC AAC TAC ACC AAC GAG AAG CTG CAG 1556 Asn Ser Phe Glu Gin Leu Cys lie Asn Tyr Thr Asn Glu Lys Leu Gin
470 475 480
CAG CTG TTC AAC CAC ACG ATG TTC ATC CTG GAG CAG GAA GAG TAC CAG 1604 Gin Leu Phe Asn His Thr Met Phe lie Leu Glu Gin Glu Glu Tyr Gin
485 490 495 500
CGA GAG GGC ATC GAG TGG AAC TTC ATC GAC TTC GGC CTG GAC CTG CAG 1652 Arg Glu Gly lie Glu Trp Asn Phe lie Asp Phe Gly Leu Asp Leu Gin 505 510 515
CCT AGT AH GAG CTG ΑΠ GAG CGG CCG AAC AAC CCT CCC GGT GTG CTG 1700 Pro Ser lie Glu Leu lie Glu Arg Pro Asn Asn Pro Pro Gly Val Leu
520 525 530
GCC CTG CTG GAT GAA GAA TGC TGG TTC CCC AAA GCT ACA GAC AAG TCT 1748 Ala Leu Leu Asp Glu Glu Cys Trp Phe Pro Lys Ala Thr Asp Lys Ser
535 540 545
ΤΓΤ GTG GAG AAG CTA TGC TCA GAG CAG GGA AAT CAC CCC AAA TIT CAG 1796 Phe Val Glu Lys Leu Cys Ser Glu Gin Gly Asn His Pro Lys Phe Gin
550 555 560
AAG CCC AAG CAG CTA AAG GAC AAA ACA GAG TTC TCC ATC ATC CAC TAT 1844 Lys Pro Lys Gin Leu Lys Asp Lys Thr Glu Phe Ser lie He His Tyr
565 570 575 580
GCT GGG AAG GTG GAC TAC AAT GCA AGT GCC TGG CTG ACC AAG AAC ATG 1892 Ala Gly Lys Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ala Trp Leu Thr Lys Asn Met
585 590 595
GAC CCG CTA AAT GAC AAT GTG ACA TCA CTC CTC AAT GCC TCC TCT GAC 1940 Asp Pro Leu Asn Asp Asn Val Thr Ser Leu Leu Asn Ala Ser Ser Asp
600 605 610
AAG ΉΤ GTG GCT GAC CTG TGG AAG GAT GTG GAC CGC Απ GTG GGG CTG 1988 Lys Phe Val Ala Asp Leu Trp Lys Asp Val Asp Arg lie Val Gly Leu
615 620 625
GAC CAG ATG GCC AAG ATG ACT GAG AGC TCA CTG CCC AGT GCC TCA AAG 2036 Asp Gin Met Ala Lys Met Thr Glu Ser Ser Leu Pro Ser Ala Ser Lys
630 635 640
ACC AAA AAG GGC ATG TTC CGC ACC GTG GGA CAG CTC TAC AAA GAG CAG 2084 Thr Lys Lys Gly Met Phe Arg Thr Val Gly Gin Leu Tyr Lys Glu Gin
645 650 655 660
GGG AAA CTG ATG GCT ACA CTG CGC AAT ACC ACG GCT AAC ΉΤ GTG 2132
8 Leu Gly Lys Leu Met Ala Thr Leu Arg Asn Thr Thr Ala Asn Phe Val
665 670 675
CGC TGC ATC ATC CCC AAC CAT GAG AAG AGG TCT GGC AAG CTG GAT GCA 2180
Arg Cys lie lie Pro Asn His Glu Lys Arg Ser Gly Lys Leu Asp Ala
680 685 690
ΤΤΓ CTA GTG CTG GAA CAG CTG CGC TGC AAC GGT GTG HG GAA GGC ATC 2228
Phe Leu Val Leu Glu Gin Leu Arg Cys Asn Gly Val Leu Glu Gly lie
695 700 705
CGC ATC TGC CGT CAG GGC TTC CCC AAC AGG ΑΠ GTC TTC CAA GAG TTC 2276
Arg lie Cys Arg Gin Gly Phe Pro Asn Arg lie Val Phe Gin Glu Phe
710 715 720
CGG CAA CGC TAT GAG ATC CTG GCA GCG AAC GCC ATC CCC AAA GGC TTC 2324
Arg Gin Arg Tyr Glu lie Leu Ala Ala Asn Ala lie Pro Lys Gly Phe
725 730 735 740
ATG GAT GGA AAG CAA GCC TGC AH CTC ATG ATC AAA GCC CTC GAA CIT 2372
Met Asp Gly Lys Gin Ala Cys lie Leu Met lie Lys Ala Leu Glu Leu
745 750 755
GAC CCT AAC CTG TAC AGG ΑΠ GGG CAG AGC AAA ATC TTC TO CGA ACG 2420
Asp Pro Asn Leu Tyr Arg lie Gly Gin Ser Lys lie Phe Phe Arg Thr
760 765 770
GGG GTC CTG GCC CAC CTA GAG GAG GAA CGA GAC CTG AAA ΑΠ ACT GAT 2468
Gly Val Leu Ala His Leu Glu Glu Glu Arg Asp Leu Lys lie Thr Asp
775 780 785
GTC ATC ATG GCC TTC CAG GCA ATG TGT CGT GGC TAC CIT GCC AGA AAG 2516
Val lie Met Ala Phe Gin Ala Met Cys Arg Gly Tyr Leu Ala Arg Lys
790 795 800
GCC TTC ACC AAG AGG CAG CAA CAG CTG ACA GCC ATG AAG GTG ATC CAG 2564
Ala Phe Thr Lys Arg Gin Gin Gin Leu Thr Ala Met Lys Val lie Gin
805 810 815 820 AGG AAC TGC GCT GCC TAC CIT AAG CTC CGC AAC TGG CAA TGG TGG CGG 2612 Arg Asn Cys Ala Ala Tyr Leu Lys Leu Arg Asn Trp Gin Trp Trp Arg
825 830 835
CTC TTC ACC AAA GTA AAG CCA HG CTC CAG GTG ACA CGG CAG GAG GAG 2660 Leu Phe Thr Lys Val Lys Pro Leu Leu Gin Val Thr Arg Gin Glu Glu
840 845 850
GAG ATG CAG GCC AAG GAG GAG GAG ATG CAA AAG ATC ACG GAG CGG CAG 2708 Glu Met Gin Ala Lys Glu Glu Glu Met Gin Lys lie Thr Glu Arg Gin
855 860 865
CAG AAG GCA GAG ACT GAG AAG GAG CTG GAG CAG AAG CAC ACT CAG 2756 Gin Lys Ala Glu Thr Glu Leu Lys Glu Leu Glu Gin Lys His Thr Gin
870 875 880
CTG GCT GAG GAG AAG ACT CTG CTG CAG GAG CAG HG CAG GCA GAG ACA 2804 Leu Ala Glu Glu Lys Thr Leu Leu Gin Glu Gin Leu Gin Ala Glu Thr
885 890 895 900
GAG CTG TAT GCT GAG TCT GAG GAG ATG CGG GTC CGG Ή(ί GCA GCC AAG 2852 Glu Leu Tyr Ala Glu Ser Glu Glu Met Arg Val Arg Leu Ala Ala Lys
905 910 915
AAG CAG GAA CTG GAG GAG ATC CTA CAT GAG ATG GAG GCC CGC CTG GAG 2900 Lys Gin Glu Leu Glu Glu lie Leu His Glu Met Glu Ala Arg Leu Glu
920 925 930
GAA GAG GAA GAC CGG CGC CAG CAA CTA CAG GCT GAG AGG AAG AAG ATG 2948 Glu Glu Glu Asp Arg Arg Gin Gin Leu Gin Ala Glu Arg Lys Lys Met
935 940 945
GCT CAG CAG ATG CTA GAC CTG GAG GAG CAA CTG GAG GAG GAA GAG GCC 2996 Ala Gin Gin Met Leu Asp Leu Glu Glu Gin Leu Glu Glu Glu Glu Ala
950 955 960
GCC AGA CAG AAA CTA CAG CTA GAG AAG GTC ACG GCT GAG GCC AAG ATC 3044 Ala Arg Gin Lys Leu Gin Leu Glu Lys Val Thr Ala Glu Ala Lys lie 965 970 975 980
AAG AAA CTG GAG GAT GAC ATC HG GIT ATG GAT GAT CAG AAC AGT AAA 3092
Lys Lys Leu Glu Asp Asp lie Leu Val Met Asp Asp Gin Asn Ser Lys
985 990 995
CH TCA AAA GAA CGA AAA CTC CTT GAA GAG AGG GTC AGC GAC HG ACA 3140 Leu Ser Lys Glu Arg Lys Leu Leu Glu Glu Arg Val Ser Asp Leu Thr
1000 1005 1010
ACC AAC CTA GCA GAA GAG GAA GAA AAG GCT AAA AAC CTC ACA AAG CTG 3188 Thr Asn Leu Ala Glu Glu Glu Glu Lys Ala Lys Asn Leu Thr Lys Leu
1015 1020 1025
AAG AGC AAG CAT GAG TCT ATG ATC TCA GAG CTG GAG GTG AGG CTG AAG 3236 Lys Ser Lys His Glu Ser Met lie Ser Glu Leu Glu Val Arg Leu Lys
1030 1035 1040
AAA GAG GAG AAG AGC CGG CAG GAG CTG GAG AAA CTC AAG AGG AAA CTG 3284 Lys Glu Glu Lys Ser Arg Gin Glu Leu Glu Lys Leu Lys Arg Lys Leu
1045 1050 1055 1060
GAG GGT GAT GCC AGT GAC TTC CAT GAG CAG ATC GCT GAC HG CAG GCC 3332 Glu Gly Asp Ala Ser Asp Phe His Glu Gin lie Ala Asp Leu Gin Ala
1065 1070 1075
CAG Ή GCA GAG CTC AAG ATG CAG CTG GCA AAG AAA GAG GAA GAG CTA 3380 Gin lie Ala Glu Leu Lys Met Gin Leu Ala Lys Lys Glu Glu Glu Leu
1080 1085 1090
CAG GCA GCT CTA GCC AGG ΠΤ GAT GAA GAG ATC GCC CAG AAA AAC AAT 3428 Gin Ala Ala Leu Ala Arg Leu Asp Glu Glu lie Ala Gin Lys Asn Asn
1095 1100 1105
GCC CTA AAG AAG ΚΠ CGC GAG CTA GAG GGC CAT ATC TCA GAC CTA CAA 3476 Ala Leu Lys Lys He Arg Glu Leu Glu Gly His lie Ser Asp Leu Gin
1110 1115 1120
GAG GAC CTA GAC TCA GAG CGG GCT GCC AGG AAC AAG GCC GAG AAG CAG 3524 Glu Asp Leu Asp Ser Glu Arg Ala Ala Arg Asn Lys Ala Glu Lys Gin
1125 1130 1135 1140
AAG CGA GAC CTG GGG GAG GAG CTG GAG GCA CTC AAG ACG GAG CTG GAG 3572 Lys Arg Asp Leu Gly Glu Glu Leu Glu Ala Leu Lys Thr Glu Leu Glu
1145 1150 1155
GAT ACG CTG GAC AGC ACA GCT ACC CAG CAG GAG CTC AGA GCC AAG AGG 3620 Asp Thr Leu Asp Ser Thr Ala Thr Gin Gin Glu Leu Arg Ala Lys Arg
1160 1165 1170
GAA CAG GAG GTG ACA GTG CTG AAG AAG GCC CTG GAT GAG GAG ACG CGG 3668 Glu Gin Glu Val Thr Val Leu Lys Lys Ala Leu Asp Glu Glu Thr Arg
1175 1180 1185
TCC CAT GAG GCC CAG GTC CAG GAG ATG AGG CAG AAG CAC ACA CAG GCA 3716 Ser His Glu Ala Gin Val Gin Glu Met Arg Gin Lys His Thr Gin Ala
1190 1195 1200
GTG GAG GAA CTC ACA GAG CAG CTG GAG CAG TTC AAA AGG GCC AAG GCA 3764 Val Glu Glu Leu Thr Glu Gin Leu Glu Gin Phe Lys Arg Ala Lys Ala
1205 1210 1215 1220
AAC CTG GAC AAA AGC AAG CAG ACA CTG GAG AAG GAG AAC GCG GAC CTG 3812 Asn Leu Asp Lys Ser Lys Gin Thr Leu Glu Lys Glu Asn Ala Asp Leu
1225 1230 1235
GCT GGG GAG CTG CGT GTC CTG GGC CAG GCG AAG CAG GAG GTG GAA CAC 3860 Ala Gly Glu Leu Arg Val Leu Gly Gin Ala Lys Gin Glu Val Glu His
1240 1245 1250
AAG AAG AAG AAG CTG GAG GTG CAG CTG CAG GAT CTG CAG TCC AAG TGC 3908 Lys Lys Lys Lys Leu Glu Val Gin Leu Gin Asp Leu Gin Ser Lys Cys
1255 1260 1265
AGT GAT GGG GAG CGT GCC CGG GCT GAG CTC AGT GAC AAG GTC CAC AAG 3956 Ser Asp Gly Glu Arg Ala Arg Ala Glu Leu Ser Asp Lys Val His Lys
1270 1275 1280 CTA CAG AAT GAA GTG GAG AGT GTC ACT GGC ATG CTC AAT GAG GCA GAG 4004 Leu Gin Asn Glu Val Glu Ser Val Thr Gly Met Leu Asn Glu Ala Glu
1285 1290 1295 13Q0
GGC AAA GCC ATC AAA CTG GCC AAA GAT GTG GCT TCC CIT GGA TCC CAG 4052 Gly Lys Ala He Lys Leu Ala Lys Asp Val Ala Ser Leu Gly Ser Gin
1305 1310 1315
CIT CAG GAC ACC CAA GAG CTG CTC CAA GAA GAA ACC CGG CAG AAG CTC 4100 Leu Gin Asp Thr Gin Glu Leu Leu Gin Glu Glu Thr Arg Gin Lys Leu
1320 1325 1330
AAT GTG TCT ACC AAG CTG CGT CAG HG GAA GAT GAA AGG AAC AGC CTG 4148 Asn Val Ser Thr Lys Leu Arg Gin Leu Glu Asp Glu Arg Asn Ser Leu
1335 1340 1345
CAG GAC CAG CTG GAT GAG GAG ATG GAG GCT AAG CAA AAC CTG GAG CGC 4196 Gin Asp Gin Leu Asp Glu Glu Met Glu Ala Lys Gin Asn Leu Glu Arg
1350 1355 1360
CAT GTC TCA ACA CTG AAC ΚΠ CAG CTC TCA GAC TCT AAG AAG AAG CTG 4244 His Val Ser Thr Leu Asn lie Gin Leu Ser Asp Ser Lys Lys Lys Leu
1365 1370 1375 1380
CAG GAC ΉΤ GCA AGT ACC ATC GAG GTC ATG GAG GAG GGG AAG AAG AGG 4292 Gin Asp Phe Ala Ser Thr lie Glu Val Met Glu Glu Gly Lys Lys Arg
1385 1390 1395
ΠΑ CAG AAA GAG ATG GAG GGC CTC AGC CAG CAG TAT GAG GAG AAG GCG 4340 Leu Gin Lys Glu Met Glu Gly Leu Ser Gin Gin Tyr Glu Glu Lys Ala
1400 1405 1410
GCT GCC TAT GAC AAA CTG GAG AAA ACC AAG AAC AGG CTC CAG CAG GAG 4388 Ala Ala Tyr Asp Lys Leu Glu Lys Thr Lys Asn Arg Leu Gin Gin Glu
1415 1420 1425
CTG GAT GAC CTG GTC GTG GAC HG GAC AAC CAG CGG CAA CTG GTA TCC 4436 Leu Asp Asp Leu Val Val Asp Leu Asp Asn Gin Arg Gin Leu Val Ser z
9Ϊ6Ϊ- WD VDV DVD IVl 9V0 3V3 DD DVO DOO 9V3 V13 9V0 ODV 99V DW DVO
S89T 08ST S/.ST
ηχο usy u^g njg dsy Sjy ¾TV "T9 nsl DSV 3JV ηχο ai¾ u^g
898 OVD IW 9V3 WD 1V9 ODD IDD 9V3 310 m ODD WD ILL OVD ODD DW
0i9T S99T 09ST
nai Βχν ujg aw usy NTD ひ3 Ί 3JV Η3Ί s^] ¾χν dsy ηχ^ jqj, BJV O OJJ ODD OVO OIV OW JJJ OVD VID DDD 913 DW OOD IVD DVD IDV OOD
9SST 0S9T S^9I
UTD ΪΒΛ dsy dsy njg jas njg T\JQ na uig J¾ S ^a^ η·^ ηχο
ZLL DVO DID OVD 1V9 DVD 901 OVD OVD 3JJD OVO OOV VW OIV DVD WD 31V
OfrST 9E9T 0S9T
u g J¾I njg na ¾ γ 3JV sA jas SJ^ η ο nai n g SJH χ¾Λ USV SiH
9V0 OOV DV9 DLL 039 103 9W 001 DW DVD 910 W9 IVO DID OW OVV
02ST ST9T 0Τ9Ϊ T3 ΤΒΛ dsV dsV s l Jas J3S ΐΒΛ η3Ί dsV ηΐ9 nTD BTV n3>l
9i9t- ODD VID IVD IVO 9W 331 03V OID 010 OVD WD DIV 9V9 109 VW 310
909T 009T 56fl
Ϊ9Η s η usy jq 3jy n g na ηχο siq ¾χν πχο nai ¾χγ ηχο n-[g
91V OW DW OOV DDV DVD 913 DVD WO VW 009 VV9 013 330 VVO DVD
06H 99^1 08^1
nai ¾-[v 2JV ¾TV Η3Ί J3S Η3Ί ¾τν sA J¾, n g sjq njg 2jy B V n"[g
Qm DID 009 D03 300 VXD 131 911 109 OW VOV DVO OW WD 09V OOD DVD n un S9
Β ν
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jaS 9TI USV sKl
ZZ^ VOO WD 139 VOO OVD VOV 9V0 IVD 309 IVl DW 301 DDI 01V OW 9VV
09 m o \ n g n g ¾ γ na^ na-j ujg dsy a¾ s s ^[ ujg sjq SJTJ njg na usy 8 OVD DVD IDD Vil OIL OVO OVD JJI VW OW 0V3 DW OW W9 DID IW
Ο^ΐ 9St-T οε^ΐ
½100/96<ir/X3d 690CZ/96 OAV Glu Lys Arg Arg Gin Leu Gin Arg Gin Leu His Glu Tyr Glu Thr Glu
1590 1595 1600
CTG GAA GAT GAA CGG AAG CAG AGA GCT CTG GCG GCG GCA GCT AAG AAG 4964 Leu Glu Asp Glu Arg Lys Gin Arg Ala Leu Ala Ala Ala Ala -Lys Lys
1605 1610 1615 1620
AAG CTG GAA GGG GAC CTA AAA GAC CTA GAG CTC CAG GCT GAC TCA GCC 5012 Lys Leu Glu Gly Asp Leu Lys Asp Leu Glu Leu Gin Ala Asp Ser Ala
1625 1630 1635
ATC AAA GGG AGG GAG GAA GCC ATC AAG CAG CTT CGA AAA CTG CAG GCT 5060 He Lys Gly Arg Glu Glu Ala lie Lys Gin Leu Arg Lys Leu Gin Ala
1640 1645 1650
CAG ATG AAG GAC TTC CAA AGA GAG CTG GAT GAT GCC CGT GCC TCC AGG 5108 Gin Met Lys Asp Phe Gin Arg Glu Leu Asp Asp Ala Arg Ala Ser Arg
1655 1660 1665
GAT GAG ATC ΉΤ GCC ACC TCA AM GAG AAT GAG AAG AAA GCC AAG ACT 5156 Asp Glu lie Phe Ala Thr Ser Lys Glu Asn Glu Lys Lys Ala Lys Ser
1670 1675 1680
CTG GAG GCA GAC CTC ATG CAG CTC CAA GAG GAC CTG GCA GCA GCT GAG 5204 Leu Glu Ala Asp Leu Met Gin Leu Gin Glu Asp Leu Ala Ala Ala Glu
1685 1690 1695 1700
AGA GCT CGC AAG CAA GCT GAC CTG GAG AAG GAG GAG CTG GCC GAG GAG 5252 Arg Ala Arg Lys Gin Ala Asp Leu Glu Lys Glu Glu Leu Ala Glu Glu
1705 1710 1715
CTG GCT AGC AGC HG TCA GGA AGG AAT ACA CTG CAG GAT GAG AAG CGC 5300 Leu Ala Ser Ser Leu Ser Gly Arg Asn Thr Leu Gin Asp Glu Lys Arg
1720 1725 1730
CGC CTG GAG GCA AGG ATC GCC CAA CTA GAG GAG GAG CTG GAG GAA GAG 5348 Arg Leu Glu Ala Arg lie Ala Gin Leu Glu Glu Glu Leu Glu Glu Glu
1735 1740 1745 CAG GGC AAC ATG GAG GCC ATG AGT GAT AGA GTA CGC AAG GCC ACA CTG 5396 Gin Gly Asn Met Glu Ala Met Ser Asp Arg Val Arg Lys Ala Thr Leu
1750 1755 1760
CAG GCT GAG CAA CTG AGC AAT GAG CTG GCC ACA GAA CGC AGC ACG GCT 5444 Gin Ala Glu Gin Leu Ser Asn Glu Leu Ala Thr Glu Arg Ser Thr Ala
1765 1770 1775 1780
CAG AAG AAT GAG AGC GCA CGG CAA CAG CTG GAG CGC CAG AAC AAG GAA 5492 Gin Lys Asn Glu Ser Ala Arg Gin Gin Leu Glu Arg Gin Asn Lys Glu
1785 1790 1795
CTG CGA AGC AAG CAG GAG GTA GAA GGT GCT GTC AAA GCC AAG CTC 5540 Leu Arg Ser Lys Leu Gin Glu Val Glu Gly Ala Val Lys Ala Lys Leu
1800 1805 1810
AAG TCC ACT GH GCG GCG CTG GAG GCC AAG ΚΠ GCA CAG CTG GAG GAG 5588 Lys Ser Thr Val Ala Ala Leu Glu Ala Lys lie Ala Gin Leu Glu Glu
1815 1820 1825
CAG (ΠΤ GAA CAG GAG GCC AGA GAG AAA CAG GCG GCC ACC AAG TCG CTG 5636 Gin Val Glu Gin Glu Ala Arg Glu Lys Gin Ala Ala Thr Lys Ser Leu
1830 1835 1840
AAG CAA AAG GAC AAG AAG CTA AAG GAG GTC CTG CTG CAG GTG GAG GAT 5684 Lys Gin Lys Asp Lys Lys Leu Lys Glu Val Leu Leu Gin Val Glu Asp
1845 1850 1855 1860
GAG CGC AAG ATG GCA GAG CAG TAC AAG GAG CAG GCA GAG AAA GGA AAC 5732 Glu Arg Lys Met Ala Glu Gin Tyr Lys Glu Gin Ala Glu Lys Gly Asn
1865 1870 1875
ACC AAG GTC AAG CAG CTG AAG AGG CAG CTG GAA GAG GCA GAG GAG GAG 5780 Thr Lys Val Lys Gin Leu Lys Arg Gin Leu Glu Glu Ala Glu Glu Glu
1880 1885 1890
TCC CAG TGC ATC AAC GCC AAC CGC AGG AAG CTG CAG CGG GAG CTA GAT 5828 Ser Gin Cys lie Asn Ala Asn Arg Arg Lys Leu Gin Arg Glu Leu Asp 1895 1900 1905
GAG GCC ACA GAG AGC AAT GAG GCC ATG GGC CGT GAG GTG AAC GCC CTC 5876 Glu Ala Thr Glu Ser Asn Glu Ala Met Gly Arg Glu Val Asn Ala Leu
1910 1915 1920
AAG AGC AAA CTC AGG AGA GGA AAC GAG GCT TCA TIT GH CCT TCC AGA 5924 Lys Ser Lys Leu Arg Arg Gly Asn Glu Ala Ser Phe Val Pro Ser Arg
1925 1930 1935 1940
AGG GCT GGG GGC CGT AGA GH AH GAA AAC ACA GAT GGT TCT GAA GAA 5972 Arg Ala Gly Gly Arg Arg Val lie Glu Asn Thr Asp Gly Ser Glu Glu
1945 1950 1955
GAA ATG GAC GCT CGG GAC TCA GAC TTC AAT GGA ACC AAA GCC AGT GAA 6020 Glu Met Asp Ala Arg Asp Ser Asp Phe Asn Gly Thr Lys Ala Ser Glu
1960 1965 1970
TAAAHCAGG AHGGACACC ATGTCAGGGA AAACAGAACA CTAAACGACA GCAGAGCCCA 6080 GCAGACTGCT TAGCACITGT GFTCCATTCGT TCTCAAGTCA CAGAAATCAC TCCACCCCTC 6140 ACCAGGAGTC AACCACAGCC CTGCACAAAG GGTGT 6175 配列番号： 2
配列の長さ： 5 9 1 9
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： c D N A t o m R NA
配列の特徴
特徴を決定した方法： S
配列
ATG GCG CAG AAN GGN CAN CTC AGC GAN GAT GAG AAG TTC CTC ΤΠ CTG 48 GAN AAN AAC TTC ATO AAC AGC CCN NTG GCN CAG GCC GAC TGG GTO GCC 96 AAG ANG CTC GTG TGG GTC CCT TCN GAG AAG CAG GGC TTC GAN GCN GCC 144 AGC ATC AAG GAG GAG AAG GAT GAG GTG GTC GTG GAG NTG GTG GA 192 AAT GGN AAG AAG GTC ACN GTO GGC AAN GAT GAC ATC CAN AAN ATG AAC 240
CCN CCC AAG TTC TCN AAG GTG GAN GAC ATG GCN GAG CTG ACG TGB CTC 288
AAN GAN GCN TCN GTG CTG CAC AAC CTG AGG GAG VGN TAC TTC TCN GGN 336
CTC ATC TAN ACN TAC TCN GGC CTC TTC TGB GTG GTG GTC AAC CCC TAC 384
AAG YAS CTO CCC ATC TAC TCN GAN AAG ATC GTG GAN ATG TAC AAG GGC 432
AAG AAG AGG CAN GAG ATG CCN CCN CAC ATC TAB GCC ATN GCC GAC ACN 480
GCC TAC AGN AGC ATG CTN CAN GAT CGN GAN GAC CAG TCC ΑΠ CTN TGC 528
ACA GGN GAG TCT GGA GCC GGN AAG ACN GAG AAC ACN VAG AAA GTC ATO 576
CAG TAC NTG GCN GTG GTG GCN TCN TCC CAC AAG GGC AAG AAN GAC ANN 624
AGC ATC ACG GGG GAG CTG GAN AAG CAG CTT CTTi CAN GCA AAC CCN ATC 672
CTG GAG GCN TTN GGC AAN GCN AAN ACN GTC AAG AAN GAC AAC TCC TCN 720
CGN r GGC AAG TTC ATN CGC ATC AAC TOi GAN GTC ACT GGT TAC ATO 768
GTN GGN GCC AAN KTl GAN ACN TAT CTO CTG GAA AAG TCN VGN GCN ATO 816
CGN CAN GCN VGN GAN GAG AGN ACN TTO CAC ATC TTN TAC TAC CTG TO 864
GCN GGN GCC AAG GAN AAG ATG ANA ANT GAC NTG CTO HG GAG NGC TTC 912
AAC ANC TAC ACA TTN NTO TCC AAT GGC ΉΤ GTG CCC ATC CCA GCN GCN 960
CAN GAT GAN GAG ATG TTC CAG GAN ACN NTG GAN GCC ATG TCN ATC ATG 1008
GGC TTC ANT GAA GAG GAN CAG CTN NCN TO HG AAG GTN GTO TCN TCN 1056
GTC CTO CAG ΖΉ GGA AAC ATO GTC TTC AAG AAG GAN VGA AAC ACA GAC 1104
CAG GCN TCC ATG CCN GAN AAC ACA GCN GCN CAG AAA GTT TGC CAC CTC 1152
NTG GGN Α AAN GTG ACA GAT TTC ACN AGA NCC ATC CTG ACC CCN CGT 1200
ATC AAA GH GGA CGG GAN GTO GTG CAG AAN GCT CAG ACN AAA GAA CAG 1248
GCN GAC TTC GCN NTC GAG GCN TDi GCN AAG GCC ACN TAT GAN CGC CTT 1296
TTC CGN TGG CTC AGC CGT GTN AAC AAN GCC NTG GAC AAG ACC CAT 1344
CGG CAG GGG GCN TCC TTC CTG GGN ATTi CTG GAN ATN GCT GGN ΓΓΓ GAN 1392
ATC TIT GAG m AAC TCC TTC GAG CAG CTG TGC ATC AAC TAC ACC AAC 1440
GAG AAG CTG CAG CAG CTG TTC AAC CAC ACN ATG TTC ATC CTG GAG CAG 1488
GAN GAG TAC CAG CGN GAG GGC ATC GAG TGG AAC TTC ATC GAC TTC GGN 1536
CTN GAC CTG CAG CCN WGY ΑΠ GAG CTO ΑΠ GAG CGG CCG AAC AAC CCT 1584 CCN GGT GTG CTG GCC CTG CTG GAT GAN GAN TGC TGG TTC CGC AAA GCN 1632 ACA GAN AAG TCT TIT GTG GAG AAG CTO TGC NCA GAG CAN GGN AAN CAC 1680 CCC AAN TOI CAG AAG CCC AAG CAG CTN AAG GAC AAA ACN GAG TTC TCC 1728
ATC ATC CAN TAN GCT GGG AAG GTG GAC TAC AAN GCN AGT GCC TGG CTG 1776
ACC AAG AAC ATG GAC CCN CTTi AAT GAC AAN GTG ACN TCN CTC CTC AAN 1824
GCC TCC TCN GAC AAG TITi GTG GCN GAC CTTi TGG AAG GAN GTG GAC CGC 1872
AT GTG GGG CTG GAC CAG ATG GCC AAG ATG ACN GAG AGC TCA CTG CCC 1920 AGN GCC TCN AAG ACC AAN AAG GGC ATG TTC CGC ACN GTG GGN CAG CTO 1968
TAC AAN GAG CAG NTG GGG AAN CTG ATG NCN ACN CTG CGC AAN ACC ACG 2016
NCN AAC Wi GTG CGC TGC ATC ATC CCC AAC CAN GAG AAG NGG TCN GGC 2064
AAG CTG GAN GCN TTTi CTN GTG CTG GAN CAG CTG CGN TGC AAC GGN GTG 2112
NTG GAA GGC ATC CGN ATC TGC CGN CAG GGC TTC CCC AAC AGG ATN GTC 2160
TTC CAN GAG TTC CGN CAA CGC TAN GAG ATC CTG GCA GCN AAC GCC ATC 2208
CCC AAN GGC TTC ATG GAT GGN AAG CAA GCC TGC ΑΠ CTC ATG ATC AAA 2256
GCN Cm GAA CTO GAC CCN AAC NTG TAC AGG ATO GGG CAG AGC AAA ATC 2304
TTC TTC CGN ACG GGN GTTI CTG GCC CAC CTO GAG GAG GAN CGN GAC NTG 2352
AAN ATO ACN GAN GTC ATC ATG GCC TTC CAG GCN ATG TGT CGT GGC TAC 2400
CTN GCC VGN AAG GCC TTC NCC AAG NGG CAG CAN CAG CTG ACN GCC ATG 2448
AAG GTG ATC CAG AGG AAC TGC GCN GCC TAC CTN AAG CTO CGN AAC TGG 2496
CAN TGG TGG CGN CTC TTC ACC AAN GTO AAG CCN NTG CTN CAG GTG ACA 2544
CGG CAG GAG GAG GAG ATG CAG GCC AAG GAG GAN GAG NTG CAN AAG ATC 2592
ANG GAG CGN CAG CAG AAG GCN GAG ANN GAG NTO VAG GAG CTG VAG CAG 2640
AAG CAC ACN CAG CTG NCN GAG GAG AAG ANN CTG CTG CAG GAG CAG NTG 2688
CAG GCN GAG ACN GAG CTG TAN GCN GAG NCN GAG GAG ATG CGN GTC CGG 2736
NTG GCN GCC AAG AAG CAG GAN CTG GAG GAN ATC CTN CAT GAG ATG GAG 2784
GCC CGC CTG GAG GAN GAG GAA GAC CGG NGC CAG CAN CTO CAG GCN GAG 2832
AGG AAG AAG ATG GCN CAG CAG ATG CTO GAC CTG GAN GAG CAA CTG GAG 2880
GAG GAN GAN GCN GCC AGN CAG 編 CTA CAG CTN GAN AAG GTC ACN GCN 2928
GAG GCC AAG ATC AAG AAN NTG GAG GAN GAC ATC TG GTN ATG GAN GAT 2976 CAG AAC ANN AAN CTO TCA AAA GAN CGA AAA CTC CTN GAA GAG AGG NTN 3024 AGN GAN TIH ACA ACN AAN CTO GCN GAN GAG GAA GAN AAG GCN AAN AAC 3072 CTN ACN AAG CTG AAG ANC AAG CAT GAN TCN ATG ATC TCA GAN CTG GAN 3120 GTG NGG CTG AAG AAN GAG GAG AAG AGC CGG CAG GAG CTG GAG AAN CTN 3168 AAG NGG AAN NTG GAN GGN GAN GCC ACT GAC NTC CAN GAG CAG ATC GCN 3216 GAC NTO CAG GCN CAG ATN GCA GAG CTC AAG ATG CAG CTG GCN AAG AAN 3264 GAN GAN GAG CTO CAG GCN GCN CTO GCC AGG CTN GAN GAN GAN ANN NCN 3312 CAG AAN AAC AAN GCC CTO AAG AAG m CGN GAG CTO GAG GGN CAN ATC 3360 TCN GAC CTO CAN GAG GAC CTN GAC TCA GAG CGG GCN GCC AGG AAC AAG 3408 GCN GAN AAG CAG AAG CGA GAC CTN GGN GAG GAG CTG GAG GCN CTO AAG 3456 ACN GAG CTG GAN GAN ACN CTG GAC ANC ACN GCN ACN CAG CAG GAG CTC 3504 VGN GCC AAG NGG GAN CAG GAG GTG ACN GTG CTG AAG AAG GCC CTG GAN 3552 GAN GAG ACN CGG TCC CAT GAG GCN CAG GTC CAG GAG ATG AGG CAG AAN 3600 CAC NCA CAG GNN GTG GAG GAN CTC ACN GAG CAG CTO GAN CAG TTC AAN 3648 AGG GCC AAG GCN AAC CTN GAC AAN ANC AAG CAG ACN CTG GAG AAN GAG 3696 AAC GCN GAC CTG GCN GGN GAG CTG CGN GTC CTG GGC CAG GCN AAG CAG 3774 GAG GTG GAN CAN AAG AAG AAG AAG CTG GAG GNG CAG NTG CAG GAN CTG 3792 CAG TCC AAG TGC AGN GAT GG6 GAG CGN GCC CGG GCN GAG CTC ANN GAC 3840 AAN GTC CAC AAG CTN CAG AAT GAA GTO GAG AGN GTC ACN GGN ATG cm 3888 ANN GAG GCN GAG GGN AAN GCC ATTi AAN CTG GCC AAN GAN GTG GCN TCC 3936 CTN GGN TCC CAG CTO CAG GAN ACC CAN GAG CTG CTN CAA GAA GAA ACC 3984 CGG CAG AAG CTC AAN GTG TCN ACN AAG CTG CGN CAG NTG GAN GAN GAN 4032 NGG AAC AGC CTG CAN GAN CAG CTG GAN GAG GAG ATG GAG GCN AAG CAN 4080 AAC CTG GAG CGC CAN NTC TCN ACN CTO AAC m CAG CTC TCN GAC TCN 4128 AAG AAG AAG CTG CAG GAC ΉΤ GCN AGN ACC NTO GAN NNY NTG GAN GAN 4176 GGN AAG AAG AGG T i CAG AAN GAN ATO GAG NNC CTC ANC CAG CAG TAY 4224 GAN GAG AAN GCN GCN GCN TAN GAN AAA CTG GAN AAN ACC AAG AAC AGG 4272 CTN CAG CAG GAG CTG GAN GAC CTG GTO GTO GAN HG GAN AAC CAG CGG 4320 CAA C GTO TCC AAN CTG GAA AAG AAG CAG ANG AAN ΤΓ GAN CAG HG 4368 ΠΑ GCN GAG GAN AAN AAC ATC TCN TCC AAN TAN GCG GAT GAN AGN GAC 4416
VGA GCN GAN GCN GAN GCN AGG GAN AAG GAN ACN AAG GCN NTG TCN CTN 4464
GCN CGG GCC CTN GAN GAN GCC NTG GAN GCC AAA GAN GAN CTO GAG VGN 4512
ACC AAC AAN ATG CTC AAN GCN GAN ATG GAA GAC CTO GTC AGC TCC AAG 4560
GAN GAN GTO GGC AAG AAC GTO CAT GAN CTG GAG AAG TCC AAG CGN GCC 4608
NTG GAG ACN CAG ATG GAN GAG ATG AAN ACN CAG CTG GAN GAG YYR GAG 4656
GAN GAN NTG CAN GCC ACN GAG GAN GCC AAN CTG CGG TN GAN GTC AAC 4704
ATG CAG GCN CTC AAN GNC CAG m GAN VGN GAT CTC CAN GCN CGG GAN 4752
GAN CAG AAN GAG GAG AAG AGG AGG CAN CTO CAG VGN CAG CTO CAN GAG 4800
TAN GAG ACN GAA CTG GAA GAN GAN CGN AAG CAN VGN GCN CTG GCN GCN 4848
GCA GCN AAG AAG AAG CTG GAN GGG GAC CTN AAA GAC CTN GAG CTN CAG 4896
GCN GAC TCN GCC ATC AAN GGG NGG GAG GAA GCC ATC AAG CAG CTO CNN 4944
AAA CTG CAG GCT CAG ATG AAG GAC TTN CAN AGA GAN CTG GAN GAT GCC 4992
CGT GCC TCC AGN GAN GAG ATC TIT GCC ACN NCN AAN GAG AAN GAG AAG 5040
AAA GCC AAG AGN NTG GAN GCA GAC CTC ATG CAG CTO CAA GAG GAN CTTi 5088
GCN GCN GCN GAG AGN GCT CGC AAN CAN GCN GAC NTO GAG AAG GAG GAN 5136
CTG GCN GAG GAG CTG GCN AGN AGC NTG TCN GGA AGG AAN NCN CTN CAG 5184
GAN GAG AAG CGC CGC CTG GAG GCN NGG ATC GCN CAN CTN GAG GAG GAG 5232
CTG GAG GAN GAN CAG GGC AAC ATG GAG GCN ATG AGN GAN VGN GTN CGC 5280
AAN GCN ACN CNG CAG GCN GAG CAN CTN AGC AAN GAG CTG GCC ACA GAN 5328
CGC AGC ACN GCN CAG AAG AAT GAG AGN NCN CGG CAN CAG CTO GAG CGN 5376
CAG AAC AAG GAN CTO URN AGC AAG m CAN GAG NTN GAN GOi GCN GTC 5424
AAN NCC AAG NTC AAN TCC ACN NTN GCG GCG CTG GAG GCC AAG ΑΠ GCN 5472
CAG Cm GAG GAG CAG GTO GAN CAG GAG GCC AGA GAG AAN CAG GCG GCC 5520
NCC AAG NCG CTG AAG CAN ANN GAC AAG AAG CTO AAG GAN TO NTG CTG 5568
CAG GTC GAN GAN GAG CGC AAG ATG GCN GAG CAG TAC AAG GAG CAG GCA 5616
GAG AAA 6GN AAN NCC ANG GTC AAG CAG CTO AAG AGG CAG CTG GAN GAG 5664
GCN GAG GAG GAG TCN CAG NGC ATC AAC GCC AAC CGC AGG AAG CTG CAG 5712
CGG GAG CTN GAN GAG GCC ACN GAG AGC AAN GAG GCC ATG GGC CGN GAG 5760 GTG AAC GCN CTC AAG AGC AAN CTC AGG VGA GGA AAC GAG NCN TCN Wi 5808
CCT NCN AGA AGG NCT GGN GGN CGT AGA GH ΑΠ GAA AAN NCA GAT 5856
GGN TCT GAN GAN GAA NBG GAC NCT CGN GAC NCA GAC TTC AAT GGA ACC 5904
AAN NCC AGT GAA TRA 5919

Claims

請 求 の 範 囲
1. 平滑筋型ミオシン重鎖 SM 1アイソフォームタンパク質をコ一ドする DN A をべクタ一 DNAに組み込んだ組換え体 DNA。
2. ベクター DNAがレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデ ノ随伴ウィルスベクター又は発現動物用ブラスミドである請求の範囲第 1項記載 の組換え体 DNA。
3. 発現動物用ブラスミドが PCXN2又は PAGE208である請求の範囲第 2項記載の組換え体 DNA。
4. 平滑筋型ミオシン重鎖 SM 1アイソフォームタンパク質がヒト平滑筋型、 ゥサギ平滑筋型又はマウス平滑筋型である請求の範囲第 1項に記載の組換え体 DNA。
5. 平滑筋型ミオシン重鎖 SM 1アイソフォームタンパク質をコードする DN A 力配列番号 1記載の塩基配列又は該塩基配列において 1又は複数の塩基が付加、 欠失又は置換されている請求の範囲第 1項記載の組換え体 D N A。
6. 平滑筋型ミオシン重鎖 SMIァイソフォームタンパク質をコードする DNA であって、 配列番号 1記載の塩基配列からなる D N A又は該塩基配列において 1 もしくは複数の塩基が付加、 欠失もしくは置換されている D N A。
7. 請求の範囲第 5項記載の組換え体 DMAを保持する微生物。
8 · ェシヱリヒァ属に属する請求の範囲第 7項記載の微生物。
9. 請求の範囲第 1項記載の組換え体 D N Aを含有する動脈硬化治療剤。
PCT/JP1996/000134 1995-01-25 1996-01-25 Recombinant dna prepared by integrating dna that codes for myosin heavy-chain sm1 isoform protein into vector dna, and microorganism and arteriosclerosis remedy both containing the recombinant dna WO1996023069A1 (en)

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