WO1996018102A1

WO1996018102A1 - Methode de mesure de la concentration en proteines de fixation de fk506

Info

Publication number: WO1996018102A1
Application number: PCT/JP1995/002427
Authority: WO
Inventors: Masakazu Kobayashi; Kazuyuki Ohtsuka
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1994-12-07
Filing date: 1995-11-29
Publication date: 1996-06-13
Also published as: AU3993695A

Description

明細書

FK506結合蛋白質濃度測定法

「技術分野」

本発明は、 FK506結合蛋白質の検出又はその濃度測定法、およびその検出又は濃度測定用キットに関するものであり、医療の分野で利用できる。

「背景技術」

FK506もしくは FR-900506とも表記される化合物は、強力な免疫抑制作用を有し、臓器移植時の拒絶反応や自己免疫疾患の予防剤または治療薬として使用しうることはよく知られている（例えば特開昭 61 - 148181号）。

しかしながら、その作用は、非常に強力であるため、最適投与量の決定は重要な問題であり、副作用等を発生させることなく、効果的な免疫抑制活性を発揮させ得る量を投与することが極めて重要である。

一方、その後の研究により、 FK 506の免疫抑制作用はぺプチジルプロリノレシストランスィソメラーゼと同様な活性を有する、細胞内の FK506結合蛋白質（以下、 FKBP と表記）と結合することにより発揮すると考えられてレ、る [例えは'、 Na ture, 357, 692— 694および 695— 697 ( 1992 ) ] o

該 FKBPは、その分子量の違いによって数種のタイプが存在することが知られており、例えば FKBP— 12 (分子量 12KDa) 、 FKBP- 13 (分子量 13KDa) 、 FKBP- 25 (分子鼋 25KDa) 、 FKBP— 52 (分子量 56KDa) 等か'報告され、それぞれの構造も既に決定されている。

たとえば、 Nature, 341 , 755— 757および 758— 760 ( 1989 ) . J . Am. Chem. Soc. 113. 1409 - 1411 ( 1991 ). P roc. Na t l . Acad. Sc i . 88, 6229 - 6233 ( 1991 ) 等参照。

また、分子量 11, 819ダルトンで 107個のァミノ酸からなる FKBPは遺伝子工学技術を用いて製造する手段も既に報告されてレ、る [ Nature, 346, 671 - 674 ( 1990 ) ] 。

—方、それら FKBPの中で FK506が最も強く結合するのは、 FKBP— 12であり、その親和性定数（ Kd) は 0· 4ηΜであること、更に、 FKBP- 12はリンパ球のみならず、赤血球を含めたあらゆる組織に多く存在していることも報告されてレ、る [ Transpl . P roc. 23 (6 ), 2760— 2762 ( 1991 ) ] 。

ところで、マウス MLRの系で、 FKBP— 12を一定量の FK 506と共に添加すると、添加する FKBP— 12の量に比例して、 FK506の免疫抑制効果が阻害されることにより、血中に FKBP— 12か *存在すれは'、 FK506力血獎中の FKBP- 12 に結合され、その免疫抑制効果が血漿中濃度から予想される程、得られないことになる。手術後などでは、患者の赤血球が溶血し、赤血球の FKBP - 12が血漿中に循環すること、及び、患者により FK506に対する感受性に差があることを考えれば、患者の FK506感受性を推測し、より望ましい FK506血漿中濃度を設定する為に、血漿中 FKBP濃度を正確に測定する技術が望まれている。

血漿中 FKBP濃度を測定する技術としては、国際公開公報 94Z 04700に 2 種類の FKBP濃度の測定法が開示されている。 1 つには、 FKBP中の抗原決定基を認識するが、 FKBPと FK506との結合には影響を与えることのない抗 FK BP抗体を固定化し、これに（1 )被検試料中の FKBPを反応させ、次に（2)酵素で標識された FK506を作用させ、更に (3)その酵素活性を測定することを特徴とする FKBP濃度の測定法、もう 1 つには、固定化した FKBPに、（ 1 )被検試料および酵素で標識された FK506を作用させることにより固定化した FKBPと、被検試料中の FKBPとの競合反応を行わせ、（2)固定化した FKBPに捉えられている酵素標識 FK506の酵素活性を測定することを特徴とする FKBP濃度の測定法が開示されている。

しかし、これらの方法では、 FKBPの有する FK506との結合能力を利用し FKBP港度を定量する方法であるため、 FK506が共存する被検試料中の FKBP濃度を正確に測定することは困難であった。

そこで、 FK506が共存していても被検試料中の FKBP濃度を正確に測定できる技術の開発が望まれていた。

「発明の開示」

本発明の発明者等は、鋭意研究の結果、 FKBPの抗原決定基を認識するモノクローナル抗体を利用し、血清や血漿のような被検試料中の FKBPの検出またはその濃度を正確に測定する方法、ならびに検出またはその濃度測定用キットを確立した。

従って、本発明の目的は、被検試料中の FKBPを検出またはその濃度を正確に測定する酵素免疫測定法を提供すること、さらには、その検出、またはその濃度測定に供する測定用キットを提供することである。

すなわち、本発明は、

(1 ) 固相に固定化された第一抗体（ FKBP中の抗原决定基を認識するモノクローナル抗体）、

(2) 被検試料中の FKBP、及び

(3) 第二抗体（ FKBP中の抗原決定基を認識するが、上記第一抗体とは異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体）

からなる複合体を形成させた後、その複合体を測定することからなる FKBPの検出、またはその濃度測定法、及び、前記第一抗体、第二抗体及び標準品としての FKBPを含有するキットに関する。

FKBP中の抗原決定基を認識する第一抗体及び第二抗体は、例えば、ケーラーとミノレスタイン（ Kohl er and Mi 1 s tein) の基本方法 [ ature, 256.495 ( 1975 ) ] のような常法の細胞融合法より製造することができる。

好ましくは、 FKBPで免疫したマウスから得られた脾細胞と、マウス骨髄腫細胞とを細胞融合してハイブリドーマを製造し、その中から後述の製造例 1 あるいは製造例 2 のような方法で、 FKBPを認識するモノクローナル抗体を調製することができる。より好ましくは、 0ゃ ^1^のクラスであり、最も好ましくは、 186₁スゃ 18。₁ のょぅなサブクラスである。本願明細書記載の方法により、特に 12KDaの FKBPのみと反応するか、または 12 Kd及び 30 ~ 35Kdの両方の FKBPと反応する抗 FKBPモノクローナル抗体が得られる。該方法は、国際公開公報 94Z 04700及び Transpl . Proc. 25.655 - 657 ( 1993 ) (こより既 {こ公である。

尚、上記のようにして得られるモノクローナル抗体のうち、 FKBP中のそれぞれ別の抗原決定基を認識する 2 つの型のモノクローナル抗体を選択し、第一抗体及び第二抗体として各々使用することが出来る。

そして、特に好ましい第一抗体及び第二抗体用のモノクローナル抗体としては、 FKBPが FK506と結合していても何ら影響を受けることなく、 FKBP中のそれぞれ別の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体が挙げられる。

なお、本発明における「第二抗体」なる用語は、前記のように第一抗体とは異なる F K B P 中の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体そのものに加え、複合体の検出、または定量時において使用される適当な標識を有する前記モノクローナル抗体をも意味する。

本発明における「標識を有する第二抗体」における標識としては、そのものの存在が検出されうるものであればよいが、たとえば酵素、ある蛋白質に親和性を有する化合物（例えばピオチン）、第三抗体（第二抗体を認識する抗体）、放射性同位元素、螢光物質、発光物質等力挙げられる。

酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、その例としてはたとえば（ 1 ) カルボヒドラ一ゼ [例、グリコシダーゼ（例、ーガラクトシダーゼ、 β ーグノレコシダ一ゼ、 >5 — グルクロニダーゼ、 5 — フノレクトシダーゼ、 or — ガラクトシダーゼ、 α — グノレコシダ一ゼ、 σ — マンノシダ一ゼ）、アミラーゼ（例、 α — アミラ一ゼ、 >8 — アミラーゼ、イソアミラーゼ、ダルコアミラーゼ、タカアミラーゼ A ) 、セノレラーゼ、リゾチーム等 ] 、（2 ) アミダーゼ（例、ゥレアーゼ、ァスパラギナーゼ）、（3 ) エステラーゼ [例、コリンエステラーゼ (例、ァセチノレコリンエステラーゼ）、ホスファタ一ゼ (例、ァノレカリホスファターゼ）、スノレファターゼ、リパーゼ等 ] 、（4 ) ヌクレアーゼ（例、デォキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ）、（5 ) 鉄 ' ポルフィリン酵素（例、力タラ一ゼ、ペルォキシダ一ゼ、チトクロームォキシダーゼ）、（6 ) 銅酵素（例、チロシナーゼ、ァスコルビン酸ォキシダーゼ）、（7 ) 脫水素酵素（例、ァルコール脫水素酵素、リンゴ酸脫水素酵素、？し酸脫水素酵素、イソクェン酸脱水素酵素）などが挙げられ、とりわけ、ァノレ力リフォスファターゼが好ましい。

ピオチンは、ビタミン H として知られる化合物であり、卵白中に存在する塩基性蛋白質であるアビジンと極めて高い親和性を有している。アビジンは、 4 個のサブユニットから成ることが知られてレ、るが、本発明のアビジンとはこれらのサブュニットおよび前記酵素（好ましくは、ァノレカリフォスファタ一ゼ）で標識されたァビジンをも含む。

第二抗体を認識する抗体である第三抗体としては、たとえば、抗マウスラムダ鎖抗体、抗マウスカッパー鎖抗体などの抗免疫グロブリン抗体などが挙げられ、そのうち前記標識を有していてもよい、とりわけ酵素（アル力リフォスファターゼ）を有する抗マウスラムダ鎖抗体が好ましい。

放射性同位元素としてはたとえば ¹²⁵ I ， ¹³¹ I , ³H ,

¹⁴ C などが挙げられる。

螢光物質としては、フルォレスカミン、フルォレツセンスイソチオシァネートなどが、発光物質としてはルミノーノレ、ノレミノ一ノレ誘導体、ノレシフェリン、ノレシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。

標識を有する第二抗体または第三抗体の調製に際しては、前記抗体と標識とを結合させうる公知の方法を用いることができるが、たとえばクロラミン T法、過ヨウ素酸法、マレイミド法などが用いられる。より具体的には、後記実施例の方法を用いることができる。

本発明における FK506結合蛋白質（ FKBP) とは、前記のような FKBP - 12、 FKBP - 13、 FKBP - 25、 FKBP - 52等を意味する。

しかし、 FK506が最も強く結合するのが FKBP - 12であること、そして FKBP— 12があらゆる組織に多量に存在していることを考慮すると、特に好ましいのは FKBP— 12である。そして、その場合の第一抗体及び第二抗体とは、 FKBP - 12が FK506と結合していても何ら影響を受けることがなく、 FKBP- 12中のそれぞれ別の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体である。

本発明において、第一抗体、 FKBP及び第二抗体からなる複合体を定量するに際しては、慣用の種々の方法が可能であるが、特に酵素基質反応を用いる場合、例えば、次のような方法が考えられる。

(A) あらかじめ適当な酵素を用いて第二抗体を標識しておき、前記複合体を形成させた後、その酵素に応じた適当な酵素基質反応を行なう。

(B) 第一抗体、 FKBP及びビォチンを常法により結合させたビォチンで標識した第二抗体との複合体を形成させた後に、適当な酵素で標識したアビジンを反応させ、その標識酵素に応じた適当な酵素基質反応を行なつ。

(C) あるいは、あらかじめ第二抗体を認識する酵素標識抗体（たとえば、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスラムダ鎖抗体）と第二抗体との結合体を用意しておき、第一抗体、 F K B P 及びその結合体との複合体を形成させた後、適当な酵素基質反応を行な

1 o

酵素基質反応に使用される基質としては、酵素の種類によって選択することが出来る。例えば、 4 ーメチルゥンベリフェリノレフォスフェート、クロマーゲン、 0 — フエ二レンジァミンなどを用いることが出来る力、'、好ましくは、 4 — メチノレゥンベリフェリノレフォスフェートである。

そして、生成した複合体量を反映した酵素基質反応によって生じる基質の変化量を吸光度や螢光強度として慣用の方法により測定する。

また、被検試料がヒト血清、血漿及び組織柚出液の場合には、エチレンジァミン四酢酸ニナトリウム（ E D T A . 2 N a ) 、クェン酸ニナトリウムのようなキレート試薬を添加することにより、より測定精度を上げることも可能である。

なお、第一抗体を固相に固定化する方法は第一抗体を固相とともに適当な時間放置するというような慣用の方法により行なわれ、その際の固相としては、モノクロ一ナル抗体のような抗体を固定化出来、その後の反応液との分離作業を容易に出来るものであれば、慣用のものが使用できるが、好ましくはィムノプレートを用いることができる。

本願発明における第一抗体と被検試料中の F K B Pとの反応体、あるいは更に第二抗体との複合体形成の際の反応は、通常の抗原抗体反応に適した条件において行われればよく、好ましくは、室温下数時間振とうすればよい。

より具体的な F K B Pの検出、または濃度測定の手順は、後記の実施例と同様にして行なわれるが複合体を形成させる際の、第一抗体、 FKBPおよび第二抗体の添加順序は、後記の実施例の順序に限定されるものではない。

本発明により、種々の藏器ゃ血中の被検試料中の FKBP を簡便に、より正確に検出または濃度を測定することが出来るようになったことにより、例えば、 FK506の最適投与 Sを決定する際の重要な判断材料を提供することが可能となった。

そして、必要に応じ、ある特定の FKBP (例えば、 FKBP 一 12) のみを選択的に検出したりまたは、その濃度を測定したり、全ての FKBPを検出しまたはその総濃度を測定出来るようになつたため、実際の医療の場で、個々の患者の状態に応じた FK506の投与量をきめこまかく設定できるようになった。

特に、 FKBP力、' FK506と結合してレ、ても、何ら影響を受けることなく FKBP中の抗原決定基を認識し得るモノクローナル抗体（例えば、後記実施例で使用したような抗 FKBP - 12モノク口ーナル抗体 2C1— 87，抗 FKBP— 12モノクローナル抗体 3F4— 70) を第一抗体及び第二抗体として、それぞれ用いる場合には、 FK506が既に投与された患者の血清もしくは血漿から、 FK 506を前もって除去しなくても FKBPを正確に简便に検出またはその濃度を測定することが可能であるため、特に有用である。

以下、本発明を製造例、実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。製造例 1 抗 FKBP抗体の製造

(1) FKBP- 12の製造と特徴

Nature. 346, 671 - 674 ( 1990 ) の中で Ha rva rd大学 S.

L. (：11 61 6 1"らの報告してレ、る 1 八 569 61^6ょり、 FKBP 一 12の C 一末にネ目当する DNA 48me r ^ Ap l ied Bi osystem 社の DNA syn thes i ze rを使って合成した。

5 ' - C C A C A T G C C A C T C T C G T C T T C G A T G T G G A G C T T C T A A A A C T G G A A T G A - 3 '

この 48— merの末端を²⁵ P でラベノレし、プローブとして CL0NTECH社のヒト T一 cel l cDNAラィブラリ一 HL1016b 50万プラークをスクリーニングしたところ、ポジティブプラークを一つ得た。このプラークより FKBP— 12cDNAを含む断片をサブクローニングした [ pUC— 23 ( Ec ) ] 。この pUC— 23 ( Ec) をシークェンスしたところ、 N—末 DNAシークェンス 1 番から 32番に相当する部分が欠損していたので、この部分を補完すると共に、大腸菌での発現を高くする為に合成した AT rich si lent mutant N - 末 DNA約 80b. p. とを禾 ij用し、 EcoRI— BamHI si teとして、 t ryptophan promotorの制御下で発現するプラスミドに組み込み、発現ベクター PFKBP333を得た。これを、 E. co 1 i HB101に形質転換し、発現菌 HB101Z pFKBP ( AT) 311を得た。これを、 L 一 a m p . b r o t hにて 19時間培養し、蛋白合成の誘発は、 90 g/ ml ( f inal濃度）となる様に IAA ( I ndol — Acryl ic acid) を添加することにより行った。 E. co l iを集菌し、 50mM Tri s - HC1 , 2 mM β - ME, 2 mM CaCl₂ , lOmM MgCl , 5 % glycerol中で French P r e s sにて細胞を粉砕し、遠心（ 4 °C， 6.000 X g , 30分）一上清を 60'C， 15分間熱処理 - 遠心（ 4 °C , 6, 000 X g , 45分 + 4 'C , 18, 000 g , 20分 x 2 回）一透析 [ 20mM Tri s - HC1 ( pH7.4) ， 4 °C 終夜 ] - DEAE 一 Toyo PEARL 650M—逆相 HPLC ( C 4 ) にて FKBP— 12を精製した。

(2) FKBP - 12のマウスへの免疫

FKBP- 12のリン酸緩衝液（以下、 PBSと表記）溶液 250 gZ ml 0. 1ml と等量の Freund 's Com lete Adjuvant ( FCA) を混合し、マウス BALBZ c の腹腔内に免疫した o 同量の FKBP— 12を F reund ' s Incomplete Adjuvant ( FI A) と混合し、およそ 10日毎に数回、腹腔内に免疫した。

(3) 血中抗体価の測定

マウス尾静脈より 1を採血し、 PBS 990 β 1と混合し、遠心後測定試料とした。測定に当たっては、 10 g / mlの FKBP— 12 PBS溶液 50 1をィ厶ノプレートゥエルに加え、室温 3 時間反応させ、表面に結合させる。その後、ゥヱルを洗浄、 0.2% ミルクブロッカー PBSで非特異的結合サイトをブロックし、再び洗净後、試料希釈液 50 1を加え、室温下 1 時間反応させる。洗浄後、 anti— mouse IgG ( H + L ) 一 POD [ベクター ( Vector Lab. ) 社製 ] 100 1ノウヱル添加し、室温で更に 1 時間反応させる。洗浄後、常法により 0 - フエ二レンジァミンの系で発色させた。

(4 ) 抗 FKBP - 12抗体の産生

抗体価の上昇が見られたマウスに更に最終免疫として FKBP - 12 250 β g/ m 1 ( PBS) 0.2m lを尾静脈力、ら注射した。 4 日後に脾臓を抽出し、脾臓細胞 1.44 X 10⁸cel 1 sを調整した。一方、マウス骨髄腫細胞 P3X63Ag8U. 1 を 2.9 X 10⁷cel l調整し、 50% PEG4000中（最終濃度）で細胞融合を行った。その後、 HAT培地にて 24ゥヱルプレート上、 10⁶ c e l l s Z m l x i m l ノウヱノレで融合細胞のスクリーニングを行った。 2 週間後、 HAT培地で細胞の成育が確認できた 144ゥヱルについて、抗 FKBP— 12抗体の産生を血中抗体価の測定法によってスクリーニングした。つまり、血中抗体価の測定法において、抗 FKBP— 12抗体を含む試料を添加反応させる時に、 f i nal 5 gZ mlの FKBP- 2 を共存させ、 FKBP - 12存在下での発色が消失するものを選択した。更に FKBP— 12に対して抗体価の高いクローン 32クローンを選択した。

(5 ) FKBP— 12を認識し、 FK506. FK506 - C 32 ( LA) 一 PODと FKBP - 12との結合を阻害しない抗 FKBP - 12抗体の選択

固相に抗マウス IgG ( H + L ) を結合させ、更にスクリーニングの抗体を結合させた後、の FKBP- 12 50 1 と下記（6)で得られた FK 506— C 33 ( LA) - POD ( 1000倍希釈） 50 1とを共存させた。 0 - フヱニレンジアミンとの反応により生じた 490nmでの吸光度の上昇が見られたクローンを選択した。この時、 lOyu gZralの FK506を共存させた時の発色の消失により、抗マウス IgG ( H + L ) により結合された FKBP— 12は FK506— C 32 ( LA) 一 PODの FK506を認識してレ、ること力、'分力、る。その結果、 FKBP— 12をそのまま抗原として用いた免疫法からは 5 種類の抗体（ 5 — 1 一 A 5 ， 5 - 1 - B 3 , 5 — 1 - C 5 , 5 - 2 - D l ( I Gj ) , 5 - 4 一 D 2 ) 、下記（7 )のように FKBP— 12を尿素で変性させたものを抗原として用いた免疫法からは I A 4 ( IgM) , 3 A 8

( IgG₂ ) , I F 7、 3 B 8 、また、下言已（ 8 )のように FK BP— 12をォブアルブミンと結合させたものを抗原として用いた免疫法からは 4 F 8 の合計 10種のモノクローナル抗体が得られた。

(6) FKBP506 - C 32 ( LA) 一 PODの製造法

特開平 1 一 92659号の実施例 1 と同様にて得られたコハク酸一 FR— 900506物質ハーフエステノレ（ 230mg) 、 N ーヒドロキシサクシンイミド（ 35mg) 及び 1 ーェチノレー 3 — （ 3 — ジメチノレアミノプロピル）カノレボジイミド塩酸塩（ 43mg) の塩化メチレン溶液（ 10ml ) を室温下 5 時間撹拌した後、反応混合物を水洗し、さらに乾燥した。溶媒を留去した後、得られた残渣（ 250mg) を 11— ァミノウンデカン酸（ 120rag) 及びトリエチノレアミン（ 60 mg ) とともにジメチノレホノレムアミドー水（ 1 ： 1 ， 20 ml ) 溶媒中で室温下 6 時間撹拌した。反応混合物は水洗後矻燥した上で溶媒を留去し、得られた残渣をクロロホル厶を展開溶媒とするシリカゲルカラムに付し、 17— ァリノレー 1 . 14ージヒドロキシー 12— [ 2 — ( 4 - N - ( 10 - 力ノレボキシデシノレ）一 ( 4 一アミノー 1 , 4 ージォキソ一 1 ーブチノレオキシ））一 3 — メトキシシクロへキシノレ）一 1 ーメチルビ二ノレ] 一 23, 25— ジメトキシ一 13. 19, 21, 27—テトラメチノレー 11, 28— ジォキサー 4 一ァザトリシクロ [ 22, 3 . 1. 0⁴' ⁹] ォクタコス一 18— ェンー 2 , 3 , 10， 16—テトラオン（ 120rag ) を得た。

NMR (CDC1 a ) ： 1. 2-1. 4 (m) , 5. 9-6. 1 ( 1H, m)

* FAB MASS ： 1109 (M+Na )⁺

更に、上記化合物を用い、特開平 1 一 92659号の実施例 1 の 3 ) と同様にしてホースラディッシュ . ペルォキシダーゼを反応させることにより、 FK506— C 32 ( LA) 一 POD溶液を得た。

(7 ) 尿素変性 FKBP - 12の調製

FKBP - 12の 0. 08% トリフルォロ酢酸含有水溶液（ 847 β g/ m l ) 460 μ 1に尿素 312mgを添加し、室温下、混合 if 伴し、 FKBP— 12 ( 600 ;u gZ inl ) の溶液 650 lを調製した。これを、このまま免疫に使用した。

(8 ) ォブアルブミン結合 FKBP— 12の調製

FKBP - 12 1032 g ( 1 mgZ m lを 1032 1使用）とォフ- ァノレブミン ( シグマ社、 Lo t No. 76 F - 8040 ) の PBS溶液 ( 2 mg/ m l ) 1032 1を混合する。これに、 0. 13M グルタルアルデヒドー PBS溶液 0. 62m lを滴下する。室 ^下、 14時間撹拌し、その後、 PBS11に対し、 3 回透析し、これを免疫原として使用した。

FKBP— 12とォブァノレブミンとの混合比率は、 FKBP— 12 1032 μ g：ォブアルブミン 2064 gで、溶液量は 2. 7mlであった。

製造例 2 抗 FKBP - 12抗体の製造

( 1 ) 製造例 1 の（1 )および（2 )のようにしてマウスに免疫した。

(2 ) 血中抗体価の測定

20 μ gZmlの FKBP - 12の PBS溶液 50 1を ELI SA用 96ゥェルプレー卜の各ゥヱルに分注し、 4 'C でー晚放置した。ゥェノレの FKBP— 12溶液を吸弓 I除去し、 0. 05% Tween20Z P B S溶液で 3 回洗浄した。プレートの各ゥエルに 0. 2 % ミノレク / PBS溶液 250 1を加え、室温で 30分間放置した。ゥヱルの 0. 2% ミルク PBS溶液を吸引除去し、 0.2% ミルク Z 0. 05% Tween20Z PBS溶液で希釈した各抗血清を ΙΟΟ μ ゥヱルに加え、室温で 2 時間放置した。次いで、ゥヱルの抗血清希釈液を吸引除去し、 0. 05% Tween 20ノ PBS溶液で 3 回洗浄した。 0. 2% ミルク /0. 05¾ Tween 20Z PB S溶液で 1000倍に希釈したァノレ力リフォスファターゼ標籙抗マウス I gG ( H + L ) 溶液を各ゥヱルに 100 1加え、室温で 2 時間放置した。ゥヱノレのァノレカリフォスファターゼ標識抗マウス I gG ( H + L ) 溶液を吸弓 I除去し、 0. 05% Tween20/ PBSi容液で 5 回先浄した。その後、 0. 1m Μ 4 —メチノレゥンベリフェリノレフォスフエ一ト（ 4 MU— P ；シグマ社）の緩衝液（ 10mMジエタノールアミン 70.5% MgCl。 / 0) 溶液を各ウエノレに 100 1 加え、室温で 15分間放匱した。各ゥエルの螢光強度 ( Exi tat ion ; 360nm, Emissi on ； 460nm ) を後光プレート · リーダーで測定した。

(3) 抗体価の一番強いマウスを選択し、 4 回目注射の 10 日後に最終免疫として 1.5mgZ mlの FKBP— 12の PBS溶液 0.2mlをマウスの尾静脈から注射した。

(4) 細胞融合

製造例 1 一（ 4 )と同じ方法で細胞融合を行い、ハイブリドーマ（ 3 — 3 - D 4 — C 6 , 2 C 1 — 87及び 3 F 4 - 70) を得た。

(5) 抗体の産生と精製

スクリーニング及びクロ一ニングで得られたハイブリドーマ 2 C 1 一 87、あるレ、はハイブリドーマ 3 F 4 - 70 を、それぞれ F 7 5 フラスコに 5 X 10⁴ 個/ " ml ( 50ml F 75) になるように播種し、 4 日間培養後、培養液を遠心し、血清無添加培地で 2 回洗浄後、それぞれ 0.5m 1に浮遊させた。 2 週間前に、プリスタン 0.5m 1を腹腔内に注射した BALBノ C マウス（ BALB/ C ，雌， 6 週令）の腹腔内へハイブリドーマ浮遊液 0.5mlを移植した。 10日後、マウスを開腹し、それぞれのマウスから腹水を 5 ml 得た。それぞれの腹水をァフィゲルプロテイン A MAPS 一 I Iキット（バイオラド）にて精製を行い、抗 FKBP- 12 モノクローナル抗体 2 C 1 一 87 ( サブタイプ： I g G j λ ) 及び 3 F 4 一 70 (サブタイプ： IgGi ）精製抗体を得た。また、ハイブリドーマ 3 — 3 — D 4 — C 6 を同様に培養後、抗 FK BP— 12モノクローナル抗体 3 — 3 — D 4 — C 6 ( サブタイプ： IgM) を得た。

実施例 1 . FKBP— 12の酵素免疫測定法（ AP- !HcAb法）

1 ) モノクローナル抗体のァノレ力リフォスファターゼ標識

精製された 1 mgの抗 FKBP- 12モノク口一ナル抗体 2 C 1 一 87あるレ、は 3 F 4 一 70をィムノリンクーアノレ力リフォスファターゼーラベリングキット（ケンブリッジバイオケミカノレ社製，コード CK一 07— 1000) 添付記載の方法に従ってアル力リフォスファターゼ標識を行い、各標識抗体 l mlを得る。

2) 抗体の固相への吸着操作

モノクローナノレ抗体 2 C 1 - 87もしくは 3 F 4 - 70 の PBS溶液（ 5 u _g/ ml ) 50 1ずつをエリザ用プレート（マキシソープ F 96，ヌンク社製）の各ゥヱルに分注し、 4 でー晚静置する。プレートを 0.05%ツイ一ン 20の PBS溶液で 3 回洗浄する。

3 ) 特異的吸着防止操作

上記の各プレートに， 4 %ブロックエース（雪印社製，コード UK— B 80) の水溶液を 250 1分注し，室温で 30分放置後、プレートを 0.05% ツイーン 20の PBS溶液で 1 回洗浄する。 ) 抗原抗体反応

4 %ブ口ックエース一 0. 1 % ツイーン 20の水溶液で希釈した標準 FKBP - 12溶液 100 1ずつを上記プレートの各ゥエルに分注し、プレートミキサーで振とうしながら室温で 2 時間置く。プレートを 0. 05%ツイーン 20 の PBS溶液で 7 回洗浄する。

) 標識抗体反応

1 %ブ口ックエース一 0. 1%ツイーン 20の水溶液で 1000倍に希釈したアル力リフォスファターゼ標識モノクロ一ナル抗体を 100 1ずつ上記プレートの各ゥヱルに分注し，プレートミキサーで振とうしながら室温で 2 時間置く（ 2 C 1 — 87固相の場合は 3 F 4 - 70標識抗体， 3 F 4 一 70固相の場合は 2 C 1 - 87標識抗体）。プレートを 0. 05% ツイーン 20の PBS溶液で 7 回洗浄する。

) 酵素 ί¾ じ、

下記のように調製した酵素基質溶液（ 100 // 1 ) を上記プレート各ゥエルに分注し， 30分間室温で反応させる。酵素基質溶液は使用直前に調製する。

酵素基質溶液：

0. 5 m Μ 4 ーメチノレゥンベリフエリノレフォスフエ一トジエタノールァミン 10 ml

塩化マグネシウム · 1 水和物

( MgCl₂ - H 0) 10 mg

蒸留水 90 ml 7) 測定

標準 FKBP— 12溶液の代わりに 4 %ブ口ックエース一 0. 1 % ツイ一ン 2 0 の水溶液を加えたウエノレを対照とし、サイトフ口一（商品名，ミリポア社製）により螢光強度 ( Ex. 360nm, Em. 460nm) を測定する。

以上の測定法の結果を表 1 に示す。

表 1 F K B P - 1 2 の酵素免疫測定法

( A P — M c A b 法）結果

実施例 2 . FKBP - 12の酵素免疫測定法（ピオチン一 McAb 法） 1 ) モノクローナル抗体のピオチン標識

精製 2 mgの抗 FKBP— 12モノクローナル抗体 2 C 1 - 87あるいは 3 F 4 一 70を 7.5%重炭酸ナトリゥム緩衝液（ pH8.5) 溶液 1 m 1 に溶解し lOmgZ mlの BNHS ( N ― hydroxysuccinimidyl - 6 一 ( biot inamido) hexanoa te, ベクター社製，コード SP— 1200) の DMS0 溶液 20 1を加え，時々撹拌しな力、' ら，室温で 2 時間反応させた後， PBSに対して一晩透析し，ピオチン標識抗体 1 mlを得る。

2) 抗体の固相への吸着操作

モノクローナル抗体 2 C 1 一 87もしくは 3 F 4 - 70 の PBS溶液（ S /u gZ ml ) 50/i lずつをエリザ用プレート（マキシソープ F 96，ヌンク社製）の各ゥヱルに分注し， 4 。C でー晚静置する。プレートを 0.05% ツイ一ン 20の PBS溶液で 3 回洗浄する。

3) 特異的吸着防止操作

上記の各プレートに， 4 %ブロックエース（前記述）の水溶液を 250 μ 1分注し，室温で 30分放置後，プレートを 0.05% ツイーン 20の PBS溶液で 1 回洗浄する。

4 ) 抗原抗体反応

4 %ブ口ックエース一 0. 1 % ツイーン 20の水溶液で希釈した標準 FKBP— 12溶液 100/ 1ずつを上記プレートの各ゥヱルに分注し，プレートミキサーで振とうしながら室温で 2 時間置く。プレートを 05% ツイーン 20 の PBS溶液で 7 回洗浄する。 ) 標識抗体反応

1 %ブ口ックエース一 0. 1% ツイーン 20の水溶液で 1000倍に希釈した上記ピオチン標識モノク口一ナル抗体を 100 1ずつ上記プレー卜の各ゥヱルに分注し，プレートミキサーで振とうしながら室温で 2 時間置く

( 2 C 1 一 87固相の場合は 3 F 4 一 70標識抗体， 3 F 4 一 70固相の場合は 2 C 1 — 87標識抗体）。プレートを 0.05% ツイーン 20の PBS溶液で 7 回洗浄する。

) ピオチン一アビジン反応

1 %ブロックエース一 0.1% ツイーン 20の水溶液で

1000倍に希釈したアル力リフォスファターゼ標識アビジン溶液（ベクター社製，コード A - 2100) を上記プレートの各ゥヱノレに分注し，プレートミキサーで振とうしながら室温で 30分間置く。プレートを 0.05% ッィーン 20の PBS溶液で 7 回洗浄する。

) 酵素 ¾じ、

下記のように調製した酵素基質溶液（ 100/u l ) を上記プレート各ゥエルに分注し， 30分間室温で反応させる。酵素基質溶液は使用直前に調製する。

酵素基質溶液：

0.5mM 4 ーメチノレゥンベリフエリノレフォスフエ一トジェタノ一ノレアミン 10 ml

塩化マグネシウム， 1 水和物

( MgCl₂ · H₂0) 10 mg

蒸留水 90 ml ) 測定標準 FKBP— 12溶液の代わりに 4 %ブロックエース一 0. 1 %o tツイーン 20の水溶液を加えたゥエルを対照と

n i

し、サイトフロー（商品名，ミリポア社製）により螢光強度（ Ex. 360nm, Era. 460nm ) を測定する。以上の測定法の結果を表 2 に示す。表 2 F K B P - 1 2 の酵素免疫測定法

( ピオチン一 M c A b 法）結果第一抗体（螢光強度）

3 F 4 — 7 0 2 C 1 - 8 7

1000 2 3 9 1 7 1 3

500 1 9 1 3 4 1 7

250 1 2 8 8 2 4 1

125 7 3 6 1 2 5

62. 5 3 8 2 6 0

31. 25 1 7 5 2 4

7 8

7. 8125 1 4 実施例 3 . FKBP— 12の酵素免疫測定法（ AP - ant i A - McAb法） 1 ) 抗体の固相への吸着操作

モノクロ一ナル抗体 3 F 4 一 70の PBS溶液（ 5 μ g/ m 1 )50 1ずつをェリザ用プレート（マキシソープ F 96. ヌンク社製）の各ゥヱルに分注し， 4 °C でー晚静置する。プレートを 0.05% ツイーン 20の PBS溶液で 3 回洗净すでる。

2) 特異的吸着防止操作

上記の各プレートに， 4 %ブロックエース（前記述）の水溶液を 250 i分注し，室温で 30分放置後，プレートを 0.05% ツイ一ン 20の PBS溶液で 1 回洗浄する。

3 ) 抗原抗体反応

4 %ブ口ックエース一 0. 1% ツイーン 20の水溶液で希釈した標準 FKBP— 12溶液 100 1ずつを上記プレートの各ゥエルに分注し，プレートミキサーで振とうしながら室温で 2 時間置く。

) 2 C 1 一 87， AP - ant i λ 結合体作製

モノクローナノレ抗体 2 C 1 — 87を 5 u gZ mlになる様に 1 %ブ口ックエース一 0. 1 % ツイーン 20水溶液で希釈しこれに 5000倍希釈になるようにアル力リフォスファターゼ標識抗マウスラムダ鎖抗体溶液（サザンバィォテクノロジ一社製，コード 1060— 04 ) を加え 2 時間放置する。 ) 結合抗体反応

プレートを 0.05% ッィ一ン 20の PBS溶液で 7 回洗浄し， 4) で作製した結合抗体を 100 1ずつ上記プレー卜の各ゥヱノレに分注し，プレートミキサーで振とうしながら室温で 2 時間置く。プレートを 0.05%ツイーン 20の PBS溶液で 7 回洗浄する。

) 酵素 R じ、

下記のように調製した酵素基質溶液（ 100/ l ) を上記プレート各ゥエルに分注し， 30分間室温で反応させる。酵素基質溶液は使用直前に調製する。

酵素基質溶液：

0.5mM 4 - メチノレゥンベリフエリノレフォスフエ一トジエタノールァミン ιθ ιηΐ

塩化マグネシウム · 1 水和物

( MgCl ο - H₂0) 10 rag

蒸留水 90 ml

) 測定

標準 FKBP— 12溶液の代わりに 4 %ブロックエース一 0. 1 % ツイ一ン 20の水溶液を加えたゥュノレを対照とし、サイトフロー（商品名，ミリポア社製）により螢光強度 ( Ex. 360nm, Em. 460nm) を測定する。

以上の測定法の結果を表 3 に示す。表 3 F K B P - 1 2 の酵素免疫測定法

( A P — a n t i Λ - M c A b 法）

実施例 4 . ヒト血清中の FKBP— 12滠度の測定

実施例 2 の 4) において特異的吸着防止操作を終了したプレートの各ウエノレに 50 / 1の 0.4%エチレンジァミン四酢酸ニナトリウム， 2 水和物（ EDTA— 2 Na) , 4 % ブロックエース， 0. 1% ツイーン 20を含む水溶液（以後アツセィバッファーと記述）を加えたのち， 4 %ブロックエース， 0. 1 % ツイーン 20の水溶液（以後アツセィ希釈液と記述）で希釈した FKBP— 12を標準溶液とし，ヒト血清（対照）あるいは FKBP— 12を 25ngZ mlになるように添加したヒト血清を 50 μ 1加える。血清中の添加 FKBP 一 12の濃度を標準曲線より計算した。結果を表 4 に示す。

表 4 . ト血清中の F K B P — 1 2 濃度測定

F K B P - 1 2 濃度測定値

( ng/ m 1 )

1 2 9 ， 4 5

2 2 3 . 3 2

3 3 2 ， 9 3

4 3 3 . 7 7

実施例 5 . 採血法の異なる検体の血中 FKBP— 12濃度の測病態の異なる患者（ A , B， C ) から異なる採血法で血液を採取し血中 FKBP— 12濃度を測定した。実施例 3 の 4 )において特異的吸着防止操作を終了したプレー卜の各ウェブレに 50 1のアツセイノ、 * ッファーを加えたのち，ァッセィ希釈液で希釈した標準 FKB P— 12あるいは同一患者から採取した血清，へパリン採血血漿， EDTA- Na採血血漿をアツセィ希釈液で 3 倍に希釈した検体 50 μ ΐをそれぞれゥルに加え実施例 3 にしたがって測定した。患者血清中の FKBP- 12の濃度を標準曲線より計算した。結果を表 5 に示す。表 5 . 採血法の異なる血中 F K B P — 1 2 濃度の測定

実施例 6 . 肝臓移植患者の FKBP - 12濃度の測定

ある肝隳移植患者からへパリン採血し血漿を得て、実施例 5 と同様に血中 FKBP— 12濃度を測定した。結果を表 6 に示す„

6 . 肝臓移植悉者の血中 F K B P — 1 2 濃度の測定血中 F K B P - 1 2 濃度手術後の日数

( n g / m 1 ) 千 nit

ナ rrJ Uリ ^ 3 ΛJ Π \J Π \J

A P ^

? t» Q 4 ^ . υ ς

7 R 2 ς η η V

1 1 曰 4 4 3 . 5

1 4 曰 1 5 3 . 3

1 7 曰 2 7 0 . 4

1 8 曰 8 1 . 1 1

Claims

請求の範囲

1 . 固相に固定化された第一抗体（ FK506結合蛋白質中の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体）、被検試料中の FK506結合蛋白質および第二抗体（ FK506結合蛋白質を第一抗体とは異なった抗原決定基で認識するモノクローナル抗体）からなる複合体を形成させた後、その複合体の存在または量を検出または測定することを特徴とする FK506結合蛋白質の検出または濃度測定方法。

2 . 第一抗体および第二抗体であるモノクローナル抗体が FK506結合蛋白質と FK506との結合を阻害することのないモノクローナル抗体である請求の範囲第 1 項記載の方法。

3 · FK506結合蛋白質力 FKBP— 12である請求の範囲第 1 項または第 2 項記載の方法。

4 . 第二抗体が標識を有する第二抗体であり、その標識を利用することにより、複合体の存在または量を検出または測定することを特徴とする請求の範囲第 1 項、第 2 項または第 3 項記載の方法。

5 . 標識が酵素であり、その酵素基質反応を利用する請求の範囲第 4 項記載の方法。

6 . 標識がピオチンであり、そのピオチンと反応するァビジンを作用させ、結合したアビジンの存在または量を検出または測定することを特徴とする請求の範囲第 4 項載の方法。

7 . 結合したアビジンの存在または量を検出または測定するに際し、アビジンを標識する酵素を利用する請求の範囲第 6 項記載の方法。

8 . 標識が第三抗体（第二抗体を認識する抗体）である請求の範囲第 4 項記載の方法。

9 . 第三抗体が抗マウスラムダ鎖抗体である請求の範囲第 8 項記載の方法。

10. 抗マウスラムダ鎖抗体が標識を有する抗マウスラムダ鎖抗体である請求の範囲第 9 項記載の方法。

11. 標識を有する抗マウスラムダ鎖抗体が酵素で標識された抗マウスラムダ鎖抗体である請求の範囲第 10項記載の方法。

12. 酵素がアルカリフォスファターゼである請求の範囲第 5 項、第 7 項または第 11項記載の方法。

13. 被検試料がキレート試薬を添加した被検試料である請求の範囲第 4 項記載の方法。

14. 固相に固定化された第一抗体（ FK506結合蛋白質の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体）に、（1) FK506結合蛋白質を含有するまたは含有する疑いのある被検試料を作用させ、ついで（2)第二抗体（第一抗体とは異なる FK506結合蛋白質の抗原决定基を認識するモノクローナル抗体）を作用させ、その後（3)生成した複合体の存在または量を検出または測定することを特徴とする請求の範囲第 1 項記載の方法。

15. FK506結合蛋白質、第一抗体および第二抗体を含有するキット „