WO1996016987A1 - Facteur thrombocytotique - Google Patents

Description

明細書 血小板増多因子 技術分野

本発明は、 巨核球系細胞に作用し、 その分化、 成熟を促進し、 血 小板の生成を促進する活性を有する新規生理活性物質 （血小板増多 因子） 、 及び当該生理活性物質を有効成分とする血小板減少治療用 医薬組成物に関するものである。 本発明の生理活性物質 （血小板増 多因子） は、 巨核球-血小板系に作用し、 その分化、 成熟を促進し 、 血小板の生成を促進する活性を有するので、 化学療法や骨髄移植 に伴う血小板減少症及び血小板減少性紫斑病、 血小板減少が原因と 考えられる出血傾向を示す各種の疾患の治療薬、 予防薬の有効成分 等と して、 特に医療の分野において有用なものである。 背景技術

生体を構成する体細胞に不可欠な媒質である血液中には、 有形成 分としての、 赤血球、 白血球、 リ ンパ球、 血小板等の血液細胞が存 在し、 当該血液細胞は、 それぞれ固有の機能を分担して、 生体を恒 常に保つ役割を担っている。 ところで、 当該血液細胞の生体内にお ける分化、 成熟、 及び増殖等の実体を解明するこ とは、 血液学分野 における長年の研究課題とされてきたが、 近年になって、 各種の血 液細胞は、 骨髄中の 1種類の多機能性造血幹細胞より分化、 成熟す るこ と、 及び、 その分化、 成熟の過程において各種の生体内液性因 子が関与しているこ と等の事実が明らかとなった。

これらの事実から、 当該生体内液性因子は、 血球系細胞の'减少を 伴う疾患の治療薬等の医薬品への応用が期待されており、 これまで に、 例えば、 エ リ スロポエチン、 G— C S F、 G M— C S F、 M - C S F、 イ ンターロイキン等の各種の液性因子が見い出され、 その 一部は、 赤血球系、 白血球系、 リ ンパ球系等の血液細胞に対する分 化、 成熟を促進する作用を有する医薬品と して実際に応用されるに 至っている。

と こ ろで、 血小板は、 血液中に存在する直径 2〜 3 i mの無核の 細胞であり、 生体における止血や血栓の形成に重要な役割を有する 血液中の有形成分の一種であるが、 当該血小板は、 骨髄中の多機能 性造血幹細胞から巨核球系前駆紬胞を経て巨核芽球となり、 更に成 熟した巨核球の細胞質が断片化して生成され、 血液中に放出される こ とが明らかとなっている。

そ して、 最近になって、 巨核球—血小板系についての研究成果 種々報告されており、 例えは、 1 L一 6力、 血小板の前駆 ¾ΠΓ てあ る巨核球の成熟を促進する作用を有するこ とが報告されている 〔丁 o s h i y u k i I s h i b a s h i , e t a 1. , P r o c . a t l . A c a d. S c i . U S A. , V o l . 8 6， 5 9 5 3 - 5 9 5 7 ( 1 9 8 9 ) 、 及び丁 0 5 11 1 1] 1^ 1 I s h i b a s h i , e t a 1 . , B l o o d. , V o l . 7 4 , 1 2 1 - 1 2 4 4 ( 1 9 8 9 ) o

更に、 これまでの研究による と、 骨髄細胞から巨核球コロニーを 形成させるには、 2種類の異なった作用を有する因子がある と考え られている 〔 W i l l i a m s , N. ， e t a 1 . , J . C e 1 1 P h y s i o l . , 1 1 0 , 1 0 1 ( 1 9 8 2 ) 〕 。 すなわち 、 当該因子と しては、 単独で巨核球コロニーを形成する巨核球コ ロ ニー刺激因子 M e g - C S Fと、 それだけでは巨核球コロニ—を 成させる活性はないか、 当該 M e g— C S Fの存在下に巨核球コ ロ ニー数を増加させたり、 その成熟を促進する活性を有する巨核球増 幅因子 M e g— P OTの存在が報告されている。

そ して、 例えば、 ヒ トで M e g— C S F活性を有する ものと して は、 I L - 3 LT e r a m u r a, M . , e t a 1 . , E x p . H e m a t o に ， 1 6. 8 4 3 ( 1 9 8 8 ) 〕 や、 顆粒球 . マ ク 口フ ァージコロニー刺激因子 [ T e r a m u r a . M. , e t a 1 . , E x p . H e m a t o l . , 1 7 , 1 0 1 1 ( 1 9 8 9 ) 〕 c - M ρ 1 リガン K 〔 d e S a u v a g e F . J . , e t a 1 . , N a t u r e , 3 6 9 , 5 3 3 ( 1 9 9 4 ) 、 K a u s h a n s k y K. , e t a l . , N a t u r e , 3 6 9 , 5 6 8 ( 1 9 9 4 ) 〕 等が報告されている。 また、 ヒ トで M e g — P 〇 T活性を有するものとしては、 I L 一 6 CT e r a m υ r a , M . a n d M i z o g u c h i , H. , I n t . J . C e l l C 1 o n i n g , 8 , 2 4 5 ( 1 9 9 0 ) 〕 、 I L - 1 1 C T e r a m υ r a , M. , e t a l . , B l o o d , 7 9， 3 2 7 ( 1 9 9 2 ) 〕 、 及びエリ スロポエチン 〔 B r u n o , E . , e t a 1 . , B l o o d , 7 3 , 6 7 1 ( 1 9 8 9 ) 〕 等が報告されている o

しかしながら、 これらのものの多く は巨核球—血小板系に特異的 に作用する因子ではなく、 むしろ他の血球系や血球系以外の細胞に 対しても作用してその活性を発現することが知られている。 従って 、 仮りに、 これらのものを医薬品として巨核球一血小板系への作用 を期待して投与した場合、 当該活性とは別の活性をも発現してしま う こ とが危惧される。 すなわち、 例えば、 前記 I L 一 6 は、 前記作 用以外にも多岐に亘る作用を有しており、 その 1 例と して、 生体内 での急性期反応蛋白質と して、 炎症の惹起に深く関与している二 と 等が知られていることから示唆されるように、 当該 I L — 6 をその まま医薬品として使用した場合には、 強力な副作用を伴う こ とが危 惧される。

このようなことから、 巨核球一血小板系に作用する因子について は、 当該巨核球一血小板系に特異的に作用するものであって、 かつ 、 その分化、 成熟を促進する高い活性を有する生理活性物質を見い 出すこ とが重要であり、 当業界において、 このような生理活性物質 を開発することが強く要請されている状況にあった。 発明の要約

本発明は、 巨核球 -血小板系に作用 し、 巨核球細胞の分化、 成熟 を促進し、 血小板の生成を促進する活性を有する生理活性物質を提 供するこ とを目的とする。

本発明は、 分子中に下記のア ミ ノ酸配列を有するこ とを特徴とす る血小板増多因子、 及び当該血小板増多因子を有効成分と して含有 する こ とを特徴とする血小板減少治療用医薬組成物、 に係る。

Xaa G l y As n Asn As p G l u Ser As n 【l e Ser Phe Ly s G l u し y s Asp l i e

( Xaa は、 ア ミ ノ酸が特定されていないこ とを示す）

上記生理活性物質は、 化学治療や骨髄移植に伴う血小板減少症及 び血小板減少性紫斑病、 血小板減少が原因と考えられる出血傾向を 示す各種の疾患の治療薬及び予防薬等の有効成分と して有用である

発明の開示

二のような状況を踏まえて、 本発明者等は、 巨核球-血小板系に 作用 し、 その分化、 成熟及び Z又は増殖を促進し、 血小板の生成を 促進する活性を有する新しい生理活性物質を見い出すこ とを目標と して鋭意研究を積み重ねた結果、 未分化甲状腺癌患者由来の K H M 一 5 M細胞株、 シーゼリ ィ病患者由来の H U T 7 8細胞株等の培養 上清中に当該活性を有する物質が存在するこ とを見い出すと共に、 更に当該培養上清から、 巨核球-血小板系に対する活性を指標と し て、 目標とする生理活性物質を採取し、 精製、 単離して、 その性状 を明らかにする こ とに成功し、 本発明を完成するに至った。

本発明は、 巨核球 -血小板系に作用 し、 その分化、 成熟を促進 し 、 血小板の生成を促進する活性を有する新規生理活性物質 （血小板 増多因子） を提供するこ とを目的とする ものである。 また、 本発明は、 巨核球—血小板系に作用し、 アセチルコ リ ンェ ステラーゼ産生を促進する活性を有する新規生理活性物質 （血小板 増多因子） を提供するこ とを目的とするものである。

また、 本発明は、 当該生理活性物質 （血小板増多因子） を有効成 分として含有するこ とを特徴とする血小板減少治療用医薬組成物を 提供するこ とを目的とするものである。

更に、 本発明は、 当該生理活性物質を有効成分とするこ とを特徴 とする医薬組成物であって、 血小板減少に伴う疾患や、 血小板の機 能異常を伴う疾患の治療あるいは予防等に有効な医薬組成物を提供 するこ とを目的とするものである。

こ のよ う な課題を達成する本発明は、 以下の （ 1 ) 〜 （ 2 ) の技 術的手段から構成される。

( 1 ) 次の性質 ；

①げっ歯類の巨核球系細胞に作用し、 ァセチルコ リ ンエステラ ーゼ 産生を促進する活性を有する ；

② i n v i t r oにおいて、 巨核球の分化、 成熟を促進する活性 を有する ；

③ S D S— P A G Eで測定される分子量が約 4 2 k Dである ；

④分子中に下記のァ ミ ノ酸配列

Xaa Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn 【le Ser Phe し ys Glu Lys

Asp lie

( Xaa は、 ア ミ ノ酸が特定されていないこ とを示す） を有する ；

こ とを特徴とする血小板増多因子。

( 2 ) 前記 （ 1 ) に記載の血小板増多因子を有効成分と して含有す るこ とを特徴とする血小板減少治療用医薬組成物。

以下に、 本発明の内容を詳細に説明する。

本発明の新規生理活性物質 （血小板増多因子） は、 げっ歯類の巨 核球一血小板系に作用し、 アセチルコ リ ンエステラーゼ （以後、 A c h E と記載するこ とがある） の産生を促進する活性を有するこ と を特徴とする。 しかして、 当該アセチルコ リ ンエステラーゼは、 げ つ歯類の巨核球系細胞の分化及び/又は成熟に伴い産生される酵素 であることから、 前記 A c h E産生を促進する活性は、 本発明の生 理活性物質が、 巨核球一血小板系に対して作用するこ とを示すもの である。

このように、 本発明の生理活性物質は、 巨核球-血小板系に対す る活性を有するが、 こ こで言う巨核球 -血小板系に対する活性とは 、 巨核球もしく はその前駆細胞の分化、 成熟を促進する、 あるいは 、 巨核球から血小板が生成される過程における血小板の生成を促進 する活性を有することを意味する。

次に、 本発明の生理活性物質の巨核球 -血小板系に対する前記活 性を測定するには、 例えば、 骨髄細胞や巨核球系細胞を使用 し、 被 実験物質 （サンプル） をこれらの細胞に作用させて、 巨核球や血小 板に特異的な蛋白質や酵素の出現を測定する方法が好適なものと し て使用される。

げっ歯類の巨核球系細胞は、 その分化、 成熟に伴い、 ァセチルコ リ ンエステラーゼを産生するので、 例えば、 細胞を染色して A c h Eを産生する細胞数を測定するか、 も しく は産生される A c h E活 性を分光光度計で測定するこ と [T o s h i r o N a g a s a w a等， 日本血液学会雑誌， 4 9巻， 1 6 8 8 — 1 6 9 5頁 （ 1 9 8 6年） 参照〕 等により、 生理活性物質の巨核球 -血小板系に対する 前記活性を測定するこ とができる。

尚、 後述するように、 本発明の生理活性物質は、 当該測定方法に よりその活性を測定した結果、 巨核球系細胞に作用 し、 ァセチル コ リ ンエステラーゼ産生を促進する活性を有するものであり、 その分 化、 成熟を促進し、 血小板の生成を促進する活性を有するものであ るこ とが分った。

次に、 本発明の生理活性物質は、 S D S - P A G E ( S D S -ボ リアク リ ルア ミ ドゲル電気泳動） で測定される分子量か、 約 4 2 k Dであるこ とを特徴とする。 一般に、 生理活性物質の分子量は、 ゲ ル濾過や S D S— P A G E等の分子量測定方法により測定され、 そ の測定値は、 当該測定方法の種類、 測定に用いる担体や分子量マー カーの種類、 測定条件等によって微妙に変動するこ とがあるか、 本 発明の生理活性物質は、 前記したように、 S D S— P A G Eで測定 した場合の分子量が、 約 4 2 k Dである。

尚、 この場合、 後述するように、 分子量マ一力一と して、 フ ア ル マシア L MW k i t E (フ ア ルマ シア社製） の 1 4. 4 k D 、 2 0. l k D、 3 0 k D、 4 3 k D、 6 7 k D及び 9 4 k Dの分 子量マーカーを使用 して測定を行った。

次に、 本発明の生理活性物質は、 分子中に以下に示すァ ミ ノ酸配 列を有するこ とを特徴とする。 当該ア ミ ノ酸配列は、 後述するよう に、 プロテイ ンシーケンサ一により、 実験的に同定したものである

(配列）

Xaa Gl y Asn Asn Asp Gl u Ser Asn Me Ser Phe し ys G 1 u し ys Asp lie

(Xaa は、 ア ミ ノ酸が特定されていないこ とを示す）

次に、 本発明の生理活性物質は、 その由来として、 前記未分化甲 状腺癌患者由来の K HM - 5 M細胞株、 シーゼリ ィ病患者由来の H U T 7 8細胞株等が好適なものと してあげられる力 その由来はこ れに限定されるものではなく、 例えば、 本発明の生理活性物質を産 生し得る ヒ ト由来細胞の培養上清や、 尿等のヒ ト体液から得たもの 、 本発明の生理活性物質に対する遺伝子を利用して遺伝子工学的に 產生させたもの等であってもよい。

尚、 後述するように、 本発明の具体的説明においては、 K HM - 5 M細胞株及び HU T 7 8細胞株を使用し、 かつ当該 K HM - 5 M 細胞株あるいは H U T 7 8細胞株の培養上清から得られたものを好 適な例と して開示している。

次に、 本発明の生理活性物質の製法について説明する と、 本発明 の生理活性物質は、 例えば、 下記の工程によ り効率よ く 製造する こ とができる。

( 1 ) K HM— 5 M細胞株等を培養する。

( 2 ) K HM— 5 M細胞株等の培養上清を回収する。

( 3 ) 培養上清を限外濾過膜によ り濃縮する。

( 4 ) 下記の①〜⑤により精製を行なう。

① D E A E— S e p h a r o s e F Fイオン交換ク ロマ 卜 ケ ラフ ィ ー

②第 1 回目逆相高速液体ク ロマ ト グラフ ィ ー

③第 2回目逆相高速液体ク ロマ ト グラ フ ィ ー

④ゲル濾過

⑤ S D S - P A G E

本発明では、 当該工程による製法が好適なものと してあげられる が、 これに限定される ものではな く 、 これらの工程に、 必要に応じ て他の工程を付加した製法も適宜使用される。

次に、 前記各工程について説明する。

前記 （ 1 ) の K HM - 5 M細胞株等の培養工程は、 当該細 11 か ¾ 殖し得る培養条件によ り適宜実施される。 すなわち、 K HM— 5 M 細胞株等を増殖させるのに好適な濃度の血清や増殖因子、 例えは、 ゥシ胎児血清やイ ンス リ ン等を含む培地を用いて、 3 7 °Cで培養す る。 培地と しては、 一般的に使用されている DME M ( D u 1 b e c c 0 ' s M o d i f i e d E a g l e ' s M e d i u m ) 、 I MDM C I s c o v e ' s M o d i f i e d D u 1 b e c c o ' s M e d i u m) 、 及び R P M I - 1 6 4 0等の培地が好 適なものと してあげられる。 当該細胞を、 その増殖に好適な条件で 培養した後、 本発明の生理活性物質の回収に適切な条件、 例えは、 血清等を含まない完全合成培地に移して培養するこ とか好ま しい。 また、 当該細胞を、 動物固体を利用して培養するこ とも可能であ る。 すなわち、 動物個体内に当該細胞を移植するか、 又は動物個体 内あるいは個体外に取り付けた拡散チャ ンバ一内にて、 動物の体液 を利用して培養するこ とも可能である。 更に、 動物個体を利用 して 培養した当該細胞を、 動物個体から取り出して分散し、 適当な増殖 培地にて培養するこ とも可能である。 当該細胞を動物個体を利用 し て培養する場合に使用する動物と しては、 当該細胞が増殖し得る動 物であれば適宜使用可能であり、 例えば、 胸腺摘出あるいは抗胸腺 抗体処理されたマウス、 ラ ッ ト、 ノヽムスター、 ヌー ドマウス、 ヌ 一 ドラ ッ ト等が好適なものとしてあげられる。

次に、 前記 （ 2 ) の K H M - 5 M細胞株等の培養上清の回収工程 は、 例えば、 前記 （ 1 ) により K H M— 5 M細胞株等を培養した培 地から、 適宜の手段でその培養上清を回収すればよく、 K H M - 5 M細胞株等を培養後、 培養容器から培地を取り出し、 必要かあれは 、 遠心分離、 據過等の手段により、 培地中の当該細胞と培養上清と を分離し、 培養上清を回収する。

このように、 培養上清は、 本発明の生理活性物質を含有する K H M - 5 M細胞株等の培養上清であれば、 血清等を含む培地であって も、 あるいは動物の体液であってもよい。

次に、 前記 （ 3 ) の限外據過膜による培養上清の濃縮は、 常法に より市販の限外濾過膜を利用して実施することにより、 適宜のしべ ルに濃縮し、 液体濃縮物を調製すればよ く 、 その手段は、 特に限定 されるものではない。

尚、 本発明の生理活性物質を含有する液体濃縮物と しては、 前記 1く？1 1^ー 5 1^細胞株、 H U T 7 8細胞株等が好適なものと して使用 されるか、 その他、 本発明の生理活性物質を産生しうる組織ゃ紬^ の培養上清、 本発明の生理活性物質を産生し得る細胞や微生物を培 養した培地、 本発明の生理活性物質を含有する体液等の濃縮物を適 宜使用するこ とができる。 次に、 このよう にして得た培養上清の濃縮物から本発明の生理活 性物質を精製する方法は、 特に限定される ものではな く 、 塩折、 限 外濾過、 等電点沈澱、 ゲル濾過、 ィォン交換ク 口マ ト ダラ フ ィ —、 疎水性ク ロマ ト グラフ ィ ー、 抗体ァフ ィ 二ティ ークロマ ト グラ フ ィ 一、 クロマ ト フ ォーカシング、 吸着ク ロマ ト グラフ ィ ー、 逆相ク ロ マ ト グラフ ィ 一等、 多く の成書、 例えば、 〔生化学実験口座 1 夕 ンパク質の科学， 日本生化学会編， 東京化学同人 （ 1 9 7 6年 〕 等に記載された方法の中から、 適宜の方法を選択し、 適宜実施すれ ばよいが、 特に、 前記工程 （ 4 ) は、 ① D E A E - S e p h a r o s e F Fイオン交換クロマ ト グラフ ィ ー、 ②〜③逆相高速液体ク 口マ ト グラ フ ィ ー、 ④ゲル濾過、 及び⑤ S D S— P A G Eを組み合 わせてなる好適な精製ステップであり、 当該精製ステップを利用す る こ とによ り、 本発明の生理活性物質を効率よ く 精製する こ とかで きる。

前記工程 （ 4 ) において、 イオン交換ク ロマ ト グラフ ィ ーと して は、 D E A E - S e p h a r o s e F Fイオン交換ク ロマ 卜 グ ラ フ ィ 一が、 逆相高速液体ク ロマ ト グラフ ィ ーと しては、 V y d a c P r o t e i n C 4 R P— H P L Cが、 また、 ゲル濾過と し ては、 T S K G 3 0 0 0 S WX L G P Cが好適なものと してあ けられる。

尚、 本発明の生理活性物質 （血小板増多因子） は、 このように し て精製されるが、 一旦採取、 精製され、 その性質が解明された後は 、 それらの性質を指標と して蛋白質の単離、 精製に用いられる適当 な方法を利用するこ とが可能である。

更に、 本発明の生理活性物質を遺伝子工学的手段によ り製造する こ と も可能である。 例えば、 上記株化細胞の K HM - 5 M細胞株等 から常法に従って m R N Aを単離し、 当該 m R N Aを用いて常法に よ り c D N Aライブラ リ 一を作製するこ とができる。 この c D N A ライブラ リ ーをスク リ ーニ ン グするための D N Aプローブは、 例え ば、 本発明によって明らかにされた部分ア ミ ノ酸配列に基づいて設 計するこ とができる。 あるいは、 本発明の生理活性物質を酵素的に 又は化学的に切断し、 その断片のア ミ ノ酸配列を決定した後、 その ァ ミ ノ酸配列に基づいて D N Aプローブを設計するこ ともできる。 次に、 こ う して得られた生理活性物質をコー ドする c D N Aを適 宜の発現ベクターに挿入した後、 当該発現ベクターにより宿主を形 質転換し、 こ の形質転換体を培養するこ とにより本発明の生理活性 物質を製造するこ とができる。 宿主と しては、 大腸菌の如き原核紬 胞、 酵母の如き下等真核細胞、 哺乳動物細胞の如き高等真核細胞等 、 常用の宿主を用いればよい。

以下に、 前記工程により製造された本発明の生理活性物質 （血小 板増多因子） の特性を示す。

( 1 ) 分子量

本発明の生理活性物質は、 S D S - P A G Eで測定される分子量 が約 4 2 k Dである。

( 2 ) 部分ァ ミ ノ酸配列

本発明の生理活性物質は、 分子中に以下のァ ミ ノ酸配列を有する

Xaa Gl y Asn Asn Asp Gl u Ser Asn lie Ser Phe Lys G 1 u Ly Asp lie

(Xaa は、 ア ミ ノ酸が特定されていないこ とを示す）

( 3 ) 血小板増多活性

①げっ歯類の巨核球系細胞に作用し、 アセチルコ リ ンエステラーゼ 産生を促進する活性を有する。

② i n v i t r oにおいて、 巨核球の分化、 成熟を促進する活性 を有する。

尚、 本発明者等がスク リーニングし、 細胞株として樹立した前記 未分化甲状腺癌患者由来の K HM— 5 M細胞株は、 1 9 9 4年 1 1 月 2 9 日付で、 公的微生物寄託機関である通商産業省工業技術院生 命工学工業技術研究所 ； あて名 ： 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3号 （郵便番号 3 0 5 ) に K H M - 5 M , 受託番号 ： F E R M B P— 4 9 0 1 と して寄託 （ブダぺス 卜条約に基づく 国際寄託） さ れている。 尚、 後記する実施例 2 に示されるように、 上記 K H M— 5 Mは、 微生物寄託機関の通告に従って、 マイ コプラズマを除染し た K H M— 5 M細胞株と して寄託されている。

次に、 本発明の血小板減少治療用医薬組成物について説明する。 本発明の医薬組成物は、 本発明の生理活性物質 （血小板増多因子 ) を有効成分と して含有するこ とを特徴とする ものである。 当該生 理活性物質 （血小板増多因子） と しては、 前記ア ミ ノ酸配列をその 分子中の N末端も し く は適宜の部位に有する ものを使用する こ とか できる。 本発明の医薬組成物は、 当該生理活性物質 （血小板増多因 子） を、 凍結乾燥、 除菌濾過等の製剤学的に必要な工程で処理した だけのものでも充分にその効果を奏するこ とができる ものであるが 、 当該生理活性物質に、 製剤学的に許容されう る補助成分を適宜添 加し、 常法によ り製剤化し得るこ とは言う までもない。

こ の補助成分と しては、 基剤、 安定剤、 防腐剤、 保存剤、 乳化剤 、 懸濁化剤、 溶解剤、 溶解補助剤、 滑沢剤、 矯味剤、 着色剤、 芳香 剤、 無痛化剤、 賦形剤、 結合剤、 粘稠剤、 緩衝剤等があげられるか 、 具体的には、 例えば、 炭酸カルシウム、 乳糖、 蔗糖、 ソ ル ビ ッ 卜 、 マ ンニ ト ール、 デンプン、 ア ミ ロぺクチ ン、 セルロ ース誘導体、 ゼラチ ン、 カ カオ脂、 注射用蒸留水、 塩化ナ ト リ ウム水溶液、 リ ン ゲル溶液、 グルコース溶液、 ヒ ト血清アルブ ミ ン （ H S A ) 等があ げられる。

これらの補助成分を利用 して、 本発明の医薬組成物を調製するに 際しては、 例えば、 医薬品添加物一覧表 （財団法人東京医薬品工業 協会医事法規委員会及び大阪医薬品工業協会医事法規研究委員会発 行） にある如く 、 当該補助成分を適宜選択し、 使用すればよい。 ま た、 補助成分の使用量は、 製剤学的に許容され得る範囲内において 、 医薬組成物の薬剤形態等に応じて適宜選択すればよい。

本発明の医薬組成物の投与量は、 患者の状態、 年齢、 性別、 体重 等に応じて適宜決定される。 また、 その投与方法は、 患者の状態に 応じ、 経口投与、 筋肉内投与、 腹腔内投与、 皮内投与、 皮下投与、 静脈内投与、 動脈内投与、 直腸投与等の種々の投与方法から適宜選 択される。

当該医薬組成物は、 化学療法や骨髄移植に伴う血小板減少症及び 血小板減少性紫斑病、 血小板減少が原因と考えられる出血傾向を示 す各種の疾患や、 巨核球及び Z又は血小板の機能異常を伴う疾患の 治療薬や予防薬等と して有用なものである。 図面の簡単な説明

図 1 は、 本発明の実施例 1 の逆相系の高速液体クロマ ト グラ フ ィ 一のモニタ リ ン グチヤ 一 卜を示す。

図 2は、 本発明の実施例 1 の第 2回目の逆相系の高速液体ク ロマ ト グラ フ ィ 一のモニタ リ ン グチ ヤ一トを示す。

図 3は、 本発明の実施例 1 の T S K G 3 0 0 0 SWX Lによる ゲル濾過の溶出パター ンを示す。

図 4 は、 本発明の実施例 1 の S D S— P A G E後蛋白質を抽出し 、 活性を測定した結果を示す。

図 5 は、 本発明の実施例 1 の S D S - P A G E後 P V D F膜に転 写して蛋白染色したパター ンを示す。

図 6 は、 M y c o p l a s m a P C R P r i m e r S e t により各細胞株のマイコプラズマを検出した結果を示す。

図 7は、 ウェスタ ンプロ ッ トにより各細胞株の培養上清中の本発 明の生理活性物質の産生を検出した結果を示す。 発明を実施するための最良の形態

以下に、 実施例に基づいて本発明を具体的に説明するか、 本発明 はこれらにより限定されるものではない。 尚、 以下の記載において は、 一部、 当該分野における慣用の略号を使用して記載した。

実施例 1

( 1 ) ヒ ト由来 K HM— 5 M細胞株の継代培養

ヒ ト由来 K HM— 5 M細胞株は、 前記したように未分化甲状腺癌 患者由来の樹立された株化細胞であり、 当該細胞株の継代培養を以 下の方法により行なつた。

先ず、 1 0 %非働化ゥシ胎児血清 （ F C S ) を含む R P M I - 1 6 4 0培地 1 0 0 m 1 に、 ヒ ト由来 K HM— 5 M細胞株を植え込み 、 底面積 1 7 5平方セ ンチ メ ー ト ルの培養フ ラ ス コ （ F a 1 c o n 社製） で、 3 7 °Cで 3 日間培養した。

培養終了後、 培地を取り除き、 R P M I - 1 6 4 0培地で 2回洗 浄した後、 E D TA含有ト リプシ ン溶液約 2〜 5 m l を加えて細胞 を剥離せしめ、 1 0 % F C Sを含む R P M I - 1 6 4 0培地を加え 、 細胞浮遊液を調製し、 それを、 培養フ ラス コで、 3 7 °Cで培養し た。

以後、 同様にして継代培養を行なった。

( 2 ) K HM - 5 M細胞株の培養及び培養上清の調製

K HM— 5 M細胞株を 1 0 %非働化ゥシ胎児血清を含む R P M ！ 一 1 6 4 0培地 1 0 0 m l を用いて底面積 1 7 5平方セ ンチ メ — 卜 ルの培養フ ラスコで、 3 7 °C、 5 % C 02 、 湿度 1 0 0 %の条件下 で 3 日間培養した。 培養終了後、 培地を除去し、 細胞を I M D M培 地にて 3回洗浄し、 I MDM培地 1 0 0 m 1 を用いて更に 3 日問培 養した。 この培養上清を集め、 8 0 0 0回転で 2 0分間遠心した丄 清を、 K HM— 5 M細胞株の培養上清と し、 一 2 0でで凍結保存し た。

( 3 ) 本発明の生理活性物質 （血小板増多因子） の精製

1 ) 限外濾過膜による濃縮

上記の培養上清約 2 0 Lを室温にて融解し、 限外濾過膜 （アサ ヒ メディ カル社製、 PAN 1 2 0 0及びア ミ コ ン社製、 PM— 1 0 ) を用いて 5 0 0〜 1 0 0 O m l まで濃縮し、 当該濃縮物を凍結保存 した。

2 ) D E A E - S e p h a r o s e F Fイオン交換クロマ ト グラ フィ 一

上記の濃縮した培養上清を 2 0 mMト リスー塩酸緩衝液 p H 7. 4に対して透析した。 これを同一の緩衝液で平衡化してある D E A E - S e p h a r o s e F F (フ ァルマンァ社製） のカラムに吸 着させ、 N a C l の濃度を 2 5 0 mM、 l O O O mMと段階的に増 加させて溶出させた。 以下の精製は、 2 5 0 mMN a C 1 で溶出さ れる画分について行なった。

3 ) V y d a c P r o t e i n C 4 R P - H P L C

次に、 上記の 2 5 0 mMN a C l で溶出される画分を、 V y d a c P r o t e i n C 4 (V y d a c社製） のカラ厶を用いた逆 相系の高速液体クロマ トグラフィ ーで分画した。 すなわち、 流速 8 m l /m i nで 4 0 %ァセ トニ ト リ ルを含む 0. 1 % ト リ フルォ口 酢酸溶液で平衡化してあるカラムに吸着させ、 6 0分間でァセ トニ ト リ ルの濃度を 8 0 %まで直線的に増加させて溶出した。 当該高逨 液体クロマ トグラフ ィ ーによる溶出結果を図 1 に示す。 得られた画 分の活性を測定した結果、 フラ ク シ ョ ン N o. 1 9— 2 1 に活性か 認められた。

4 ) 2 n d V y d a c P r o t e i n C 4 R P - H P L C 上記の活性画分を、 再度、 2回目の V y d a c P r o t e i n C 4 (V y d a c社製） のカラムを用いた逆相系の高速液体ク ロ マ トグラフ ィ 一で分画した。 すなわち、 流速 l m l Zm i nで 4 u %ァセ トニ ト リ ルを含む 0. 1 % ト リ フルォロ酢酸溶液で平衡化し てあるカラムに吸着させ、 4 0分間でァセ トニ ト リ ルの濃度を 8 0 %まで直線的に増加させた。 当該 2回目の高速液体クロマ 卜 グ ラ つ ィ 一による溶出結果を図 2に示す。 得られた画分の活性を则定し 結果、 フ ラ ク シ ョ ン N o . 7 — 9 に活性が認められた。

5 ) T S K G 3 0 0 0 S WX L G P C

次に、 上記の活性画分を、 それぞれ、 T S K G 3 0 0 0 S WX L (東ソ一株式会社製） のカラムを用いてゲル濾過に供した。 流 ¾ 0. S S m l Zm i nで 4 0 %ァセ トニ ト リ ルを含む 0 . 1 ¾> ト リ フルォロ齚酸溶液で平衡化してあるカラムでゲル濾過した。 得られ た画分の活性を測定した結果、 いずれもフ ラ ク シ ョ ン N 0. 6 - 9 に活性が認められた。 1 例と して 2 n d V y d a c P r o t e i n C 4 R P— H P L C フ ラ ク シ ョ ン N o . 8 を T S K G 3 0 0 0 SWX L G P Cで分画した結果を図 3 に示した。

6 ) S D S - P A G E

上記の T S K G 3 0 0 O SWX L G P Cのそれぞれのフラ ク シ ヨ ンについて活性と相関して S D S — P A G Eで分子量 4 2 k D の銀染色バン ドが認められた。 こ の蛋白質が活性本体である こ とを 確認するために S D S — P A G Eを行ない、 ゲルからの抽出を行な つた。 すなわち、 2 n d V y d a c P r o t e i n C 4 R P — H P L C フラ ク ショ ン N o . 7を T S K G 3 0 0 0 S WX L G P Cで分画したフ ラ ク シ ョ ン N o . 6 について非還元条件 （ 4 % S D S、 2 0 %グリ セロ ール、 0 . 1 2 5 M ト リ ス -塩酸緩衝 液 （ p H 6. 8 ) を 1 0 0 'Cで 3分間処理した直後の溶液をサンプ ルと 1 ： 1 で混和した） で S D S化を行ない、 S D S — P A G E m i n i ゲル （ T E F C〇社製、 1 0 T %) を用いて定電流 （濃 縮ゲル ： 1 0 m A、 分離ゲル ： 1 5 m A) で泳動した。

分子量マーカーと してはフ アルマ シア社製 L MW k i t Eの 1 4. 4 k D、 2 0. l k D、 3 0 k D、 4 3 k D、 6 7 k D及ひ 9 4 k Dを用いた。 泳動後、 ゲルを 2 mm間隔にスライ ス して 0 . 1 % B S Aを含む I MD M培地 （ 1 m 1 ) に入れて蛋白質を!'容出さ せた。 ポア一サイズ 0. 2 111フ ィ ルター （ニュ ーステラ ディ ス ク 、 ク ラボウ社製） で濾過して活性測定を行なった。 その結果、 図 4 に示すように分子量 4 2 k D付近 （ 4 2 - 4 5 k D ) に活性か認め られた。 このこ とから、 分子量 4 2 k Dに認められる銀染色バン ド が活性本体と考えられた。

( 4 ) 活性 （巨核球系細胞に対する作用） の測定

1 ) A c h E A s s a y (アセチルコ リ ンエステラーゼ ア ツ セ ィ）

①活性測定用細胞懸濁液の調製

〇 5 7 8し 6 (： 1"マゥス （ 6〜 1 0週齢） （日本 S L C . 社製 ) の大腿骨及び脛骨より骨髄細胞を採取し、 これを 1 0 % F C S Z I MDM培地に懸濁した。 メ ッ シュ径 1 0 0 〃 mのフィ ルタ一濾.過 により、 骨片などを除去した後、 細胞培養用シャー レに蒔き込み、 3 7 °C、 5 % C 〇 ₂ の条件下で 9 0分間静置した。 シャー レに付着 した細胞を除去し、 非付着性細胞懸濁液に 1 Z 1 0量の K A C 2 ¾ 液 （大塚アツセィ研究所製） を添加し、 1 0分間ごとに攪拌しなか ら 3 7 °Cで 1 時間イ ンキュベー ト した。

この非付着性細胞懸濁液をリ ンフ ォライ ト M溶液 4 m l 当り 1 0 m l 重層し、 遠心分離機を用いて 2 5 °Cにて 1 , 5 0 0回転/分で 3 0分間遠心した。 リ ンフ ォライ ト M溶液と培地の界面に存在する 非貪食性細胞を集め、 2 , 0 0 0回転/分で 5分間遠心して細胞を 沈澱として回収した。 このようにして得られた非付着性かつ非貪食 性細胞を 0. 1 % B S A/ I MD M培地で 2回洗浄した。

②活性の測定

活性測定用サンプルは 0. 1 % B S A I MD Mで稀釈した。 9 6 穴マイ ク ロプレー トを準備し、 実験群には上記サンプ儿を、 対照 群には 0. 1 % B S AZ I MD M培地を、 それぞれ 1 0 0 " 1 ノウ エルずづ添加した。 次に、 上述した活性測定用細胞を 1 0 % D F P ( D i i s o p r o p y l F l u o r o P h o s p h a t e ) 処理した F C S 1 0 %を含む I MD M培地に 0. 8 x 1 0 ⁶ 細胞 Z m l となるように懸濁し、 これを 1 0 0 /z 1 /ゥ ュルずつ添加し、 3 7 °Cにて 4 日間培養した。

培養終了後、 プレー ト ごと 1 , 5 0 0回転 分で 1 0分間遠心し 、 各ゥ ヱルより上清 1 5 0 is 1 を除去し、 代わりに p H 7. 2 に調 製した P B S (—） を 1 5 0 1 ずつ添加した。 次に、 3. 1 5 m g /m 1 D T N B Z 1 %クェン酸 N a溶液を 1 % T r i t o n X— 1 0 0溶液で 1 0倍稀釈し、 これを 5 0 1 ノゥ ヱ ルずつ添加 してプレー ト ミ キサ一で攪拌し、 波長 4 0 5 n mと 6 9 O n mの吸 光度差を測定して O m i n における吸光度と した。

次に、 2. 1 7 m g /m l ョー化了セチルチオコ リ ン溶液を 2 0 a 1 ゥ ヱルずつ添加し、 室温にて 3 0分間又は 6 0分間反応させ た後、 波長 4 0 5 n mと 6 9 O n mの吸光度差を測定し （ 3 0 m i n又は 6 O m i nにおける吸光度） 、 AO D ( 3 O m i n 又は 6 0 m i nの吸光度と O m i nの吸光度の差） を求めた。 尚、 D T N Bは、 5. 5 ' - d i t h i o b i s - ( 2 - n i t r o b e n z o i c a c i d ) の略称である。

対照群に比較して、 明らかに△ 0 Dが高い場合、 アセチルコ リ ン エステラーゼ活性が誘導されたものと し、 血小板系の造血に対する 作用がある と判断した。

③結果

前記 （ 3 ) の 6 ) で得られた 4 2 k D付近のゲルから溶出させた 蛋白質をサンプルと して、 前記した方法によ り A c h E A s s a yを実施した。 その結果、 対照群に比較して、 高いアセチル コ リ ン エステラーゼ活性を有する こ とが確認された。

( 5 ) ア ミ ノ酸配列の決定

1 ) 同定方法

前記 2回目の逆相系の高速液体ク ロマ ト グラ フ ィ ー （ V y d a c 社製） で得られた活性画分 （ フ ラ ク シ ョ ン N 0. 8 ) を T S K G 3 0 0 0 S WX Lゲル濾過ク ロマ ト グラフ ィ ー （東ソ一株式会社製 ) で分画した。 活性が認められたフラ ク シ ョ ン N o . 7 に S D Sを 最終濃度 0. 0 4 %になるように添加し N 2 ガスを吹き付け濃縮し た。 濃縮画分は 0. I N N a OHで中和した後サンプル処理液 （ 4 % S D S、 1 0 % 2 - メルカプ トエタ ノ ール、 2 0 %グリ セ口一 ル、 0. 1 2 5 M ト リ スー塩酸緩衝液 （p H 6. 8 ) ) と 1 : 1 で混和して 1 0 0てにて 3分間処理した。 得られたサンプルは S D S - P A G E m i n i (T E F C〇社製、 1 0 T%) ゲルに添 加し、 定電流 （濃縮ゲル 1 0 m Α、 分離ゲル 1 5 mA) で泳動を行 なつた。 泳動後セ ミ ドライブロ ッティ ング装置 （ B i 0— r a d、 TRANS - B L OT S D S EM I - D R Y T R A N S F E R C E L L) を用いて PVD F膜に 1 4 0 mA、 4 h r転写後ク マシーブルー染色液で染色した （図 5 ) 、 （平野久 著， 遺伝子ク ローニングのためのタ ンパク質構造解析. p 4 1 〜ρ 7 1 ) 。

この 4 2 k Dのバン ドを切り出しモデル 4 7 6 Aプロテイ ン シ一 クェンサー （アブライ ドバイオシステム社製） により分子中の N末 端ア ミ ノ酸配列を決定した。 すなわち、 エ ドマン分解によって遊離 した P TH -ア ミ ノ酸を紫外部吸収にて検出し予め分離した標準 P T H—ァ ミ ノ酸 （アプライ ドバイオシステム社製） の保持時間を基 準に してア ミ ノ酸を同定した。

2 ) 結果

この結果、 本発明の生理活性物質 （血小板増多因子） は、 N末端 に以下のァ ミ ノ酸配列を有している こ とが確認された。

Xaa Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn lie Ser Phe Lys Glu Lys

1 5 10

Asp lie

15

(Xaa は、 ア ミ ノ酸が特定されていないこ とを示す） 実施例 2

(本発明の生理活性物質の產生機序） 工業技術院生命工学工業技術研究所から寄託した KHM - 5 M細 胞株にマイコプラズマが感染していると通告された。 そこで、 本発 明者等は、 本発明の生理活性物質の産生機序を明らかにするために 、 本発明の生理活性物質.（血小板増多因子） の産生に及ぼすマイ コ プラズマ感染の影響について検討した。

( 1 ) 方法

以下に示される方法の他は、 実施例 1 の場合と同様の方法に従つ た。

1 ) 細胞株の継代維持及び培養上清の調製

細胞株は 1 0 %牛胎児血清 （F B S) を含む R PM I - 1 6 4 0 培地あるいは I MDM培地で継代維持した。 本生理活性物質の産生 を確認するための試料は、 細胞を F B S存在下あるいは非存在下で 培養し、 遠心で細胞を除いた上清を使用した。

2 ) マイ コプラズマの感染

細胞株に感染しているマイコプラズマは大日本製薬の MC - 2 1 0で除去した。 1 0 %牛胎児血清 （F B S) を含む R PM I - 】 6 4 0培地又は I MDM培地に最終濃度 0. 5 〃 gノ m l となるよう に MC— 2 1 0を添加し、 7日から 1 4 日間継代培養した。 その後 、 M C - 2 1 0を添加していない培地で数回継代して、 マイ コ ブラ ズマを除去した細胞株と した。

3 ) 本生理活性物質の N末端部分のア ミ ノ酸配列を含むペプチ ド抗 体の作成

本生理活性物質の N末端部分のァ ミ ノ酸配列を含む 1 9ア ミ ノ酸 からなるペプチ ドを MA P法で合成 （ （株） サヮディ 一 · テク ノ ロ ジー） して抗原と した。 この M A Pペプチ ドをフ レ ン ドの完全ア ジ ュバン トでェマルジヨ ンと し、 ゥサギの皮内に免疫した。 このゥサ ギの血清を抗 S b血清と した。 また、 一部の抗 S b血清は本生埋活 性物質の部分ペプチ ドを固定化したカラムを用い、 ァフ ィ 二テ ィ ー 精製して使用した （A F抗 S b抗体） 。 4 ) 本生理活性物質の検出

本生理活性物質は抗 S b血清あるいは A F抗 S b抗体を使用した ウェスタ ンブロ ッ 卜で検出した。 S D S— P A G Eは L a e mm l i らの方法を部分的に改変して行った。 試料は適切な濃度に希釈し て TE F C Oサンプルバッ ファーと 1 ： 1 で混合し、 1 0 0 Cで 3 分間処理した。 分子量の推定は T E F C 0分子量マーカー （T E F C O社製） を標準蛋白質と して用いた。 泳動は T E F C O S D S 一 P A G Em i n i ( 1 0 T%、 1 mm) ゲルで、 B i o— R a d の E 】 e c t r o p h o r e s i s B u f f e r系を用い、 定電 流 1 8 mAで行った。 泳動終了後、 ゲル中の蛋白質を B i o - R a d S e m i — D r y T r a n s b l o t装置を使用して P VD F膜に移行させた。 S D S添加 B j e r r u m a n d S c h a f e r - N i e 1 s e n転写バッファ一系で定電圧 1 0 - 2 0 Vで 3 0分間泳動して移行させた。 標準蛋白質のレー ンは C B B R 2 5 0で蛋白質染色した。 試料のレー ンは一次抗体と して抗 S b血清 あるいは A F抗 S b抗体、 二次抗体としてアルカ リ ホスファ ターゼ をコン ジュゲー トさせた抗ゥサギ I g G抗体を使用し、 免疫酵素染 色した。

5 ) マイ コプラズマの検出

マイコプラズマの検出には My c o p l a s m a P C R P r i m e r S e t ( S TRATAG EN E) を使用 した。 細胞から の G e n om i c DNAは Q I A am p B L O OD K I T ( Q I A G E N) で調製した。

6 ) マイコプラズマ感染細胞株の作製

感染させるマイコプラズマと しては感染 HUT 7 8及び同様にマ ィコプラズマが感染していると予想される他の細胞株の培養上清を 使用した。 これらのマイ コプラズマをあらかじめ除染しておいた H U T 7 8細胞株に加えて数回継代維持して感染細胞株と した。

( 2 ) 検討及び結果 1 ) K HM - 5 M紬胞株での本生理活性因子産生に及ほすマイ コ プ ラズマ感染の影響

前記実施例 1 で用いた K HM— 5 M細胞株は、 前記のように、 未 分化甲状腺癌患者由来 株化紬胞であり、 当該 K HM - 5 M細胞株 ではマイ コプラズマ感染か M y c o p l a s m a P C R P r i m e r S e t で確認できた。 しかし、 K HM - 5 M細胞株に感染 していたマイ コプラズマを M C— 2 1 0を使用 して除去する と、 本 発明の生理活性物質を検出できなかった。 こ のこ とは、 本生理活性 因子の産生にマイ コプラズマの感染が寄与している可能性を示唆す る ものである。

2 ) 各種細胞株での本生理活性因子の産生とマイ コプラズマ感染 そこで、 K HM - 5 M細胞株以外の本生理活性物質産生細胞株で もマイ コプラズマ感染が寄与しているかどうか検討した。 検討した 細胞株培養上清の中で、 本生理活性物質を検出できた細胞株は H U T 7 8のみであった。 この HU T 7 8は S e z a r y S y n d r o m e ( シ一ゼリ イ病） 患者末梢血由来の T紬胞株である。 こ の細 胞株でもマイ コプラズマ感染が M y c o p 1 a s m a P C R P r i m e r S e tで確認できた。 更に、 K H M - 5 M細胞株の場 合と同様に、 感染しているマイ コプラズマを M C— 2 1 0 を使用 し て除去する と、 その培養上清中の生理活性物質を検出できな く なつ た。 尚、 H U T 7 8 は、 市販品と して入手する こ とかできる （ A T C C T I B 1 6 1 ) カ^ 本実施例 2で用いた H U T 7 8 は、 継代 培養中に何らかの形でマイ コプラズマ汚染されたものであった。

3 ) マイ コプラズマを感染させるこ とによる本生理活性因子の産生 上記の結果から、 本発明の生理活性物質を産生する細胞株では未 分化甲状腺癌患者由来 K HM— 5 M及びシーゼリ ィ病患者由来 H U T 7 8 と もにマイ コプラズマに感染している こ とが明らかとな っ た 。 また、 いずれもマイ コプラズマを除去する と、 ウエス タ ン ブロ ッ 卜で特異的なバン ドが検出できなかった。 これらのこ とか ら、 本 4·. 理活性物質の産生にマイコプラズマの感染が関与していると推定し た。 一方、 マイコプラズマに感染している他の細胞株ではこの生理 活性物質を産生しないこ とから、 マイコプラズマの種類あるいは細 胞株の種類が寄与しているものと考えた。 そこで、 マイコプラズマ を除去した HUT 7 8細胞株に、 HUT 7 8に感染していたマイ コ プラズマあるいは他の細胞株に感染していたマイコプラズマを感染 させ、 本生理活性物質が産生されるかどうかウェスタ ンブロ ッ 卜で 解析した。

まず、 これら細胞株にマイコプラズマが感染したこ とを M y c o l a s m a P C R P r i m e r S e tを使用して確認した 。 その結果を図 6に示す。 図中、 1 はマイコプラズマを除染した H UT 7 8、 2はマイコプラズマ感染 HUT 7 8、 3は他の細胞株由 来マイコプラズマを再感染させた HUT 7 8、 4は HUT 7 8由来 マイコプラズマを再感染させた H U T 7 8、 5は l O O b p L a d d e rマーカー （P h a r m a c i a社製） 、 をそれぞれ示す。

HUT 7 8細胞株由来のマイコプラズマと他の細胞株由来のマイ コ プラズマで感染させた H U T 7 8細胞株では、 いずれも P C Rでマ ィ コプラズマに特異的なバン ドが認められた。 しかし、 そのバン ド のサイズが異なるこ とから、 種類の異なるマイコプラズマであると 推定した。 この HUT 7 8紬胞株由来のマイコプラズマは My c o p 1 a s m a f e r m e n t a n sに類 ί以した泳動ノヽター ンを不 した。

次に、 これらの培養上清中の本生理活性物質の産生をウエス タ ン プロ ッ トで解析したところ、 H U Τ 7 8細胞株由来のマイ コブラズ マを感染させた細胞の培養上清では特異的なバン ドか検出されたか 、 他の細胞株由来のマイ コプラズマを感染させた細胞の上清では検 出するこ とができなかった。 その結果を図 7に示す。 図中、 1 はマ ィ コプラズマを除染した HUT 7 8、 2はマイ コプラズマ感染 H U Τ 7 8、 3は他の細胞株由来マイ コプラズマを再感染させた HU T 7 8、 4 は HU T 7 8由来マイコプラズマを再感染させた H U T 7 8、 5 は分子量マーカ一 （T E F C O社製） 、 をそれぞれ示す。 こ のこ とから、 本生理活性物質の産生に特定のマイコプラズマによる 感染が寄与していると推定した。

産業上の利用可能性

本発明の生理活性物質は、 巨核球 -血小板系に作用を示す血小板 増多活性を有する因子であり、 巨核球細胞の分化、 成熟を促進し、 血小板の生成を促進する活性を有する。 また、 当該生理活性物質を 有効成分として含有する本発明の医薬組成物は、 化学治療や骨髄移 植に伴う血小板減少症及び血小板減少性紫斑病、 血小板減少か原因 と考えられる出血傾向を示す各種の疾患の治療薬及び予防薬と して 有用である。

配列表 配列番号 ： 1

配列の長さ ： 1 6

配列の型 ： ア ミ ノ酸 （ a m i n o a c i d )

トポロジー ： 直鎖状 （ l i n e a r )

配列の種類 ： ペプチ ド （p e p t i d e )

配列の特徴

特徴を表す記号 ： p e p t i d e

存在位置 ： 1 . . 1 6

特徴を決定した方法 ： E

配列

Xaa Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn lie Ser Phe Lys CI u Lys

1 5 10

Asp lie

15

Claims

請求の範囲

1 . 次の性質 ；

( 1 ) げっ歯類の巨核球系細胞に作用し、 アセチルコ リ ンエステラ 一ゼ産生を促進する活性を有する ；

( 2 ) i n v i t r oにおいて、 巨核球の分化、 成熟を促進する 活性を有する ；

( 3 ) S D S— P A G Eで測定される分子量が約 4 2 k Dである ； ( 4 ) 分子中に下記のァ ミ ノ酸配列

Xaa Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn He Ser Phe し ys Glu Ly s Asp lie

( Xaa は、 ア ミ ノ酸が特定されていないこ とを示す） を有する ；

こ とを特徴とする血小板増多因子。

2. 請求項 1 に記載の血小板増多因子を有効成分と して 含有することを特徴とする血小板減少治療用医薬組成物。