+

WO1996016976A1 - Oligonucleotide anti-sens et agent cancerostatique contenant cet oligonucleotide - Google Patents

Oligonucleotide anti-sens et agent cancerostatique contenant cet oligonucleotide Download PDF

Info

Publication number
WO1996016976A1
WO1996016976A1 PCT/JP1995/002452 JP9502452W WO9616976A1 WO 1996016976 A1 WO1996016976 A1 WO 1996016976A1 JP 9502452 W JP9502452 W JP 9502452W WO 9616976 A1 WO9616976 A1 WO 9616976A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
sequence
oligonucleotide
nucleotide sequence
protein kinase
Prior art date
Application number
PCT/JP1995/002452
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masahiko Tsuchiya
Timothy G. Geiser
Original Assignee
Pola Chemical Industries Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pola Chemical Industries Inc. filed Critical Pola Chemical Industries Inc.
Publication of WO1996016976A1 publication Critical patent/WO1996016976A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C12N2310/3145—Phosphoramidates with the nitrogen in 3' or 5'-position
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification

Definitions

  • the present invention relates to anticancer agents comprising antisense oligonucleotides against human protein kinases, particularly human protein kinases A-RI, anticancer agents comprising the antisense oligonucleotides, and anticancer agents comprising the antisense oligonucleotides.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing an anticancer agent.
  • Prior Art Cancer has long been known as an incurable disease, but it has not changed much to date. It is a so-called rebellious molecule, in which cancer cells are derived from the organism itself. The basic physiological mechanism is not much different from normal cells, so if you try to kill cancer cells with anticancer drugs or the like, normal cells It also causes side effects.
  • oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to a part of the gene, so that it is called a cancer-related gene.
  • Antisense technology for covering has been devised, and various studies have been made on this technology. Since this antisense oligonucleotide inhibits gene expression indiscriminately for both cancer cells and normal cells, it is important to know what kind of gene expression is to be suppressed. I have.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to increase the anti-cancer effect of the antisense oligonucleotide on the protein kinase Ait gene to a practically usable level. As a result, they found that the anticancer effect was significantly increased and completed the invention.
  • the present invention relates to an oligonucleotide having at least a part of a nucleotide sequence complementary to all or a part of the sequence of the human protein kinase A gene and having a structure represented by the general formula (I). It is.
  • n represents an integer
  • R represents a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • B represents a nucleic acid base.
  • the human protein kinase A gene the human protein kinase A Sequences encoding tree portions or portions thereof are included. Further, the regulatory portion includes RI- ⁇ .
  • the present invention provides an anticancer drug comprising the above-mentioned oligonucleotide, and a pharmaceutical composition for treating cancer, comprising at least one selected from the anticancer drugs.
  • antisense oligonucleotide refers to an oligonucleotide that suppresses the expression of its gene by hybridizing to a gene or mRNA, and the coding strand of gene DNA (( +) Strand) or an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to the mRNA, as well as an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to the non-coding strand ((-) strand).
  • the antisense oligonucleotide of the present invention has a nucleotide sequence at least partially complementary to all or a part of the sequence of human protein kinase A ⁇ gene. Oligonucleotide. As a part of the sequence of the human protein kinase A gene, a sequence encoding the regulatory part of human protein kinase A or a part thereof can be mentioned. Further, the regulatory part includes RI-na.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention has a base sequence as described above, and the bonding mode between the nucleotides constituting the oligonucleotide is a 3′-amino group represented by the general formula (I). This is due to the phosphoramidate bond to which the 5 'phosphate group is bound (hereinafter simply referred to as "phosphoraamidate bond").
  • the length of the oligonucleotide chain is not particularly limited as long as the specificity for the protein kinase A gene is maintained.
  • the preferred length is 9 to 40 in terms of the number of bases. This is because if it is less than 9, the specificity for the gene may be low and the anticancer effect may not be sufficiently exerted, and if it exceeds 40, it will be extremely difficult to synthesize by controlling the nucleotide sequence.
  • a more preferable chain length is one having a base number of 15 to 24, which has the best balance between effects and economics.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it is a nucleic acid having a sequence complementary to a gene involved in the biosynthesis of protein kinase A-RIa. That is, as long as the bond between nucleotides is a phosphoramidate bond, even if the oligonucleotide is of the DNA type (R is a hydrogen atom in the general formula (I)), the RNA type (R in the general formula (I)) May be a hydroxyl group).
  • sequence of the antisense oligonucleotide to protein kinase A-RI ⁇ is a sequence substantially complementary to a part of the base sequence of the coding or non-coding chain of the protein kinase ⁇ -RI ⁇ gene, in other words, non-coding. If the sequence is substantially identical to a part of the nucleotide sequence of the protein or the code chain, it is expected that the biosynthesis of protein kinase ⁇ -RI ⁇ can be suppressed.
  • the above effect can be expected at any site in the gene, but when the expression of protein kinase A-RI ⁇ activity is more completely suppressed, From this point of view, it is preferably a part of the sequence consisting of 300 nucleotides from the initiation codon to the 100th codon, at the 5 'end of the coding strand of the gene. 300 nucleotides in the coding region of this protein kinase ⁇ —RI ⁇ ⁇ gene The sequence of the reotide is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the antisense sequence corresponding to this sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • SEQ ID NO: 6 the relationship between the sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the sequence shown in SEQ ID NO: 6 is complementary, and anticancer activity can be expected with antisense oligonucleotides for either strand of the gene.
  • nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 6 it is preferable that the nucleotide sequence is 5 'end in SEQ ID NO: 1 and 3' end in SEQ ID NO: 6.
  • substantially complementary does not require that all the nucleotides in the oligonucleotide be complementary to the protein kinase A gene, and that the oligonucleotide is the gene DNA or m. It means that it only has to hybridize to the corresponding site of RNA and be complementary enough to inhibit transcription or translation. Therefore, some nucleotides in the nucleotide chain may be substituted, deleted or inserted as long as specific hybridization is not inhibited under physiological conditions.
  • nucleotides that can be replaced in an antisense oligonucleotide vary depending on the length and sequence of the oligonucleotide, but generally the effects of substitution, deletion and insertion are less near the ends of the oligonucleotide than inside. , AT (or AU) base pairs are less affected by substitution than GC base pairs.
  • Methods for calculating the hybridization intensity of nucleic acids are known, and those skilled in the art may modify some of the sequences based on the sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 6 so that hybridization under physiological conditions is not impaired. It is easy to do.
  • those having a homology of 90% or more to the protein kinase A gene can be expected to have some expected effect and can be defined as substantially complementary. . Further, even if an oligonucleotide having a non-specific sequence is added to the 5 'end or 3' end of such an oligonucleotide, it is not substantially affected.
  • the type of nucleotides constituting the antisense oligonucleotide of the present invention may be a DNA-comprising nucleotide analog in which the base is thymine, adenine, cytosine, or guanine and the sugar is deoxyribose.
  • RNA-constituting nucleotide analogs containing ribonucleic acid, cytosine, and guanine and sugar as ribose may be used.
  • non-specific hydrogen bonding with other bases such as inosine is possible. It may contain a functional base.
  • Most preferred are oligonucleotides of nucleotide analogs that are complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the antisense oligonucleotide sequence to protein kinase A-RI ⁇ has a sequence complementary to a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, that is, a sequence identical to a part of the sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • Specific examples include oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 3, 4, and 5.
  • a sequence complementary to a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, that is, a sequence having the same sequence as a part of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 is specifically shown in SEQ ID NOs: 7, 8, and 9.
  • oligonucleotides The positions of these oligonucleotides on the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 6 are shown below.
  • SEQ ID NO: 2 Nucleotide number 280 to 300 of SEQ ID NO: 6
  • SEQ ID NO: 3 Nucleotide numbers 46 to 57 of SEQ ID NO: 6
  • SEQ ID NO: 4 Nucleotide number of SEQ ID NO: 6 1 4 8 to 16 5
  • SEQ ID NO: 5 Nucleotide number of SEQ ID NO: 6 from 250 to 2 79
  • SEQ ID NO: 7 Nucleotide numbers 1 to 21 of SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 8 Nucleotide number 2 4 4 to 25 5 of SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 9 Nucleotide number of 13 to 6 in SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 10 base number 280 to 300 of SEQ ID NO: 6
  • the antisense oligonucleotide of the present invention is characterized in that nucleotides are connected to each other by a nitrogen-phosphorus bond as shown in the general formula (I).
  • the antisense oligonucleotide represented by such a general formula has a more excellent tumor-suppressing effect than a conventional antisense oligonucleotide having a binding mode such as phosphorothioate, as described in Examples below.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention can be synthesized while controlling the nucleotide sequence by successively extending nucleotides according to the following reaction formula.
  • tetrazole is further substituted with 3'-amino group of 3'-amino-5'-dimethyltrityldeoxyribonucleotide in the presence of triethylamine, and this dimethyltrityl Condensation of 3'-amino5'-dimethyltrityldeoxyribonucleoside in the same manner If it returns Repetitive, ethoxy Xia Roh Foss phosphoroamidate on polymer attached by a bond of a fixed arbitrary nucleotide sequence in E ester bond O Rigo nucleotides are obtained. This Is subjected to dedimethyltritylation and deesterification using ammonium to obtain an oligonucleotide having a structure represented by the general formula (I).
  • an oligonucleotide having an arbitrary nucleotide sequence can be automatically obtained by using a commercially available DNA synthesizer and the above reaction reagent.
  • a nucleoside in which the sugar chain part is replaced with 2′-acyl-3′-amino-5′-dimethyltritylribose is used, an RNA-like antisense oligonucleotide can be obtained.
  • the anticancer agent of the present invention comprises at least one selected from the above-mentioned oligonucleotides.
  • an oligonucleotide is used as a mixture of two or more, a higher anticancer effect may be obtained.
  • the anticancer agent of the present invention exhibits an excellent anticancer effect on various cancer cells.
  • the cancer for which the anticancer agent of the present invention is effective is not particularly limited as long as it is a human cancer.
  • the antisense oligonucleotide which is the anticancer agent of the present invention, is expected to be ineffective in some cases because it is an antisense oligonucleotide to the human protein kinase A-RI ⁇ ⁇ gene. You.
  • cancers for which the anticancer agent of the present invention is effective include leukemia, colon cancer, rectal cancer, colon cancer, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, kidney cancer, malignant lymphoma, tongue cancer, esophageal cancer, breast cancer, Includes pharyngeal cancer, brain tumor, malignant fibroids, melanoma, cervical cancer, etc.
  • the preferred dosage of the anticancer drug of the present invention varies depending on the disease type, medical condition, age, weight, gender, physical condition, etc., but it is approximately 10 to 200,000 mg once or several times per adult per day. It is appropriate to administer in divided doses.
  • the administration route include intravenous, intraarterial, intraportal, subcutaneous, intradermal, intramuscular, and intralesional injection, and oral administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises the above-mentioned anticancer agent and an optional component in the dosage form.
  • the optional components in the dosage form can be used without any particular limitation as long as they are commonly used in pharmaceutical compositions.
  • oral preparations include bulking agents, binders, flavoring agents, disintegrating agents, lubricants, S-coated agents, sugar coatings, etc.
  • injections include pH regulators, isotonic agents , Stabilizers and the like can be exemplified. It may be formulated together with other drugs known to have anticancer effects.
  • the method of forming these anticancer agents and optional components into dosage forms may be a conventional method. Detailed Description of Preferred Embodiments B Month The present invention will be described more specifically with reference to the following examples.
  • Example 1 Production Example of Antisense Oligonucleotides (1) SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, and 5 were prepared using the nucleic acid synthesizer ABI384 Synthesizer (manufactured by Applied Biosystems) by the method described above. DNA-type oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in 7, 8, and 9 were synthesized. That is,
  • the dimethyltritylated nucleoside having the 3 'terminal base of each sequence fixed to the polymer with an ester bond was treated with a 3% methylene chloride solution of dichlorodic acid for 1.5 minutes to perform a dedimethyltritylation reaction.
  • Phosphitylation was carried out using 0.2 mol of (2-cyanoethoxy)-(N, N-diisopropylamino) clophosphine and 0.2 mol of N, N-diisopropylethylamine in methylene chloride. The reaction was carried out for 10 minutes to obtain cyanoethoxynucleotide.
  • nucleosides are sequentially linked in accordance with each base sequence. Nucleotide removal was performed. The base sequence was previously input to the automatic synthesizer.
  • Example 2 Production Example of Antisense Oligonucleotide (2) A reaction was carried out in the same manner as in Example 1 except that the monomer nucleoside was changed to 2′-acetyl-13′-amino-1,5,1-dimethyltritylribonucleoside, An RNA-type oligonucleotide having the sequence shown in SEQ ID NO: 10 was produced.
  • Example 3 Production Example of Antisense Oligonucleotide (3) Synthesizing a DNA type oligonucleotide having a sequence in which two bases GG at the 5 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 were replaced with TT in the same manner as in Example 1. did.
  • Example 4 Anticancer Action on Leukemia Cells (In Vitro) The oligonucleotides produced in Examples 1 to 3 were examined for their growth inhibitory action using HL-60 leukemia cells. That is, cells cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 1096 FBS (fetal calf serum) and washed twice with PBS (phosphate buffered saline) were added to RPMI 1640 medium supplemented with 10% FBS.
  • FBS fetal calf serum
  • the thiooligonucleotide of SEQ ID NO: 1 (21-mer) described in JP-A-6-211889, that is, the binding mode of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 in Example 1 of the present invention was used as a positive control. What was converted from phosphoramidate to phosphorothioether was used. Table 1 shows the results.
  • the oligonucleotide of the present invention has an anticancer effect and that the oligonucleotide of the present invention has an excellent anticancer effect as compared with the conventional oligonucleotide.
  • Oligonucleotide i * 3 ⁇ 4r inhibition degree (uM) Example 1 SEQ ID NO: 202
  • Example 4 for Example 5 colon cancer cells Like the Antitumor effects (in vitro) Example 4 for Example 5 colon cancer cells, the t complete growth inhibition minimum concentration viewed antiproliferative activity using colon cancer-derived cell LS 1 7 4 T in Table 2 Show. This indicates that the oligonucleotide of the present invention also has the same effect on colon cancer as leukemia.
  • Colon cancer-derived cells LS174T were used to transplant them into nude mice (male, 5 mice per group), and the present invention was used to examine the proliferation.
  • the oligonucleotide should be mixed and emulsified with 49.5% peanut oil, 49.5% saline and 196 Tween 80 so that the final concentration of the oligonucleotide would be 1 Omg / ml.
  • the sample mixed with the vehicle was subcutaneously administered to a 0.0 lm 1 tumor and the left back skin, and the size of the tumor was measured after the administration.
  • the average volume of tumor in the oligonucleotide-administered group was subtracted from the average volume of tumor in the non-administered group, and this value was divided by the average volume of tumor in the non-administered group, multiplied by 100.
  • oligonucleotide of the present invention an oligonucleotide having the sequence shown in SEQ ID NO: 2 was used, and as a control, the phosphorothioate-type oligonucleotide shown in Example 1 was used.
  • the growth inhibitory rate of the oligonucleotide of the present invention was 71%, whereas the oligonucleotide of the control product was 35%. This indicates that the oligonucleotide of the present invention has an excellent anticancer effect even in vivo. In addition, no undesired toxicity was observed even after administration of the oligonucleotide, indicating that the therapeutic index indicated by the safety and the effective concentration for toxicity was high.
  • Example 7 Effect of Combination of Antisense Oligonucleotides of Diplomacy Similar to Example 4, the oligonucleotide of the present invention having the sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the oligonucleotide of the present invention having the sequence shown in SEQ ID NO: 3, etc.
  • the molar mixture was tested for its anticancer effect on HL-60.
  • the minimum cytostatic concentration was 0.4 ⁇ M (a mixture of 0.2 M of the oligonucleotide of the present invention of SEQ ID NO: 2 and 0.2% of the oligonucleotide of the present invention of SEQ ID NO: 3), which was additive. It can be seen that the effect is more than the effect.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The antisense oligonucleotide for the protein kinase A gene of the present invention has a high anticancer effect, and thus is very useful as an anticancer agent and a medical composition for treating cancer.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

明細書 ァンチセンスォリゴヌクレオチド及びそれを用いた制癌剤 術分 ¾r 本発明は、 ヒトプロティンキナーゼ 、 特にヒトプロティンキナーゼ A— R I なに対するァンチセンスォリゴヌクレオチド及びこのァンチセンスオリゴヌクレ ォチドからなる制癌剤並びにこの制癌剤を含有する医薬組成物に関する。 従来の技術 癌は昔より不治の病として知られているが、 それは現在に至っても大きく変化 していない。 それは癌細胞が生物体自身に由来する、 いわば反乱分子であり、 基 本的な生理機構は正常細胞と大して違いがないため、 抗癌剤等で癌細胞を死滅さ せようとすれば、 正常細胞をも傷つけてしまい、 副作用が発現されるためである。 かかる状況を鑑みて、 選択的に癌のみを攻撃し治療する方法が検討されてきた。 例えば、 癌細胞特有の抗原に対するモノクロナール抗体あるいはリボソーム等の 担体を利用し、 これらに薬剤を担持させる方法が考え出されたが、 これらには網 内系による捕捉と分解の問題や、 モノクローナル抗体あるいは担体と薬剤との結 合力の問題や、 リリースの問題があり、 充分な効果を発揮できなかった。
1 9 8 0年代前半より各種の遺伝子操作技術が進歩し、 癌治療の分野に応用さ れるようになってきた。 これらの内、 癌の生理 '増殖に特異的に必要な遺伝子に 対し、 その遺伝子の一部に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド （アン チセンスオリゴヌクレオチド） を反応させ、 いわば癌関連遺伝子に蓋をするアン チセンス技術が考案され、 このものについて種々の検討が為されてきた。 このァ ンチセンスオリゴヌクレオチドは遗伝子発現を、 癌細胞に対しても正常細胞に対 しても無差別に阻害する為、 何の遣伝子発現を抑制するかが重要なボイントにな つている。
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる制癌作用の中で、 ユーン ·ス ーン ·チョウチュンらがプロテインキナーゼ Aが増殖期の癌細胞の分裂に必要と されることに注目し、 開発したプロティンキナーゼ A— R I aに対するアンチセ ンスオリゴヌクレオチドの技術は、 そのメ力二ズムの新規性から注目を集めてい た （特開平 6— 2 1 1 8 8 9号） 。 しかしながら、 そのィン · ビボにおける制癌 作用は著しく優れて 、るとは言えず、 実効性には問題があつた。 発明の概要 本発明はかかる状況に鑑みて為されたものであり、 制癌作用を高めたプロティ ンキナーゼ A遺伝子に対するアンチセンスォリゴヌクレオチドを提供することを 課題とする。
本発明者らは上記実状を踏まえ、 プロティンキナーゼ Ait伝子に対するアンチ センスオリゴヌクレオチドの制癌作用を実用可能な程度に高めるため、 鋭意研究 を重ねた結果、 ヌクレオチド間の結合をフォスホロアミデートにすることで、 制 癌作用が著しく高まることを見いだして発明を完成させた。
すなわち本発明は、 ヒトプロテインキナーゼ A遺伝子の配列の全部又は一部に 対して、 少なくとも一部が相補的な塩基配列を有し、 一般式 （ I ) で表される構 造を有するォリゴヌクレオチドである。
Figure imgf000005_0001
(一般式 （ I ) 中、 nは整数を表し、 Rは水素原子又は水酸基を表し、 Bは核酸 塩基を表す。 ） ヒ トプロテインキナーゼ A遺伝子の一部としては、 ヒ トプロテインキナーゼ A のレギユラ トリー部分またはその一部をコードする配列が挙げられる。 さらに、 レギユラ トリー部分としては、 R I— αが挙げられる。
さらに本発明は、 上記オリゴヌクレオチドからなる制癌剤、 及びこの制癌剤か ら選ばれる 1種以上を含有する癌治療用の医薬組成物を提供する。
尚、 本明細書において、 「アンチセンスオリゴヌクレオチド」 とは、 遣伝子又 は m R Ν Αにハイブリダィズすることによってその遺伝子の発現を抑制するオリ ゴヌクレオチドをいい、 遺伝子 D N Aのコード鎖 （（ + )鎖） あるいは m R N Aに 相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのみでなく、 非コード鎖 （（—）鎖） に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドも含まれる。
以下、 本発明について詳細に説明する。
( 1 ) 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 ヒトプロティンキナーゼ A遗伝 子の配列の全部又は一部に対して、 少なくとも一部が相補的な塩基配列を有する オリゴヌクレオチドである。 ヒ トプロテインキナーゼ A遺伝子の配列の一部とし ては、 ヒ トプロティンキナーゼ Aのレギユラトリー部分またはその一部をコード する配列が挙げられる。 さらに、 レギユラトリー部分としては、 R I—なが挙げ られる。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 上記のような塩基配列を 有し、 且つ、 オリゴヌクレオチドを構成する各ヌクレオチド間の結合様式が、 一 般式 （ I ) に示されるような 3 ' ァミノ基と 5 ' リン酸基が結合したフォスホロ アミデート結合 （以下、 単に 「フォスホロアミデート結合」 という） によるもの である。
ォリゴヌクレオチドの鎖の長さは、 プロティンキナーゼ A遺伝子に対する特異 性が維持されれば特段の限定は受けない。 好ましい鎮長としては塩基数にして 9 〜4 0である。 これは、 9未満では遺伝子に対する特異性が少なくなり制癌作用 を充分に発揮できない場合があり、 4 0を越えると、 塩基配列をコントロールし て合成することが著しく困難になるからである。 より好ましい鎖長は、 効果と経 済性のバランスが最も良い、 塩基数で 1 5〜2 4のものである。
本発明のアンチセンスォリゴヌクレオチドは、 プロティンキナーゼ A— R I a の生合成に係わる遣伝子に相補的な配列を有する核酸であれば、 その種類は問わ ない。 即ち、 ヌクレオチド間の結合がフォスホロアミデート結合である限り、 D N A型 （一般式 （ I ) 中、 Rが水素原子） のオリゴヌクレオチドであっても、 R N A型 （一般式 （ I ) 中、 Rが水酸基） のオリゴヌクレオチドであってもよい。 プロティンキナーゼ A— R I αに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの配 列としては、 プロティンキナーゼ Α— R I α遺伝子のコード鎖または非コード鎖 の塩基配列の一部と実質的に相補的な配列、 言い換えれば非コード鎮またはコー ド鎖の塩基配列の一部と実質的に同一な配列であれば、 プロティンキナーゼ Α— R I αの生合成を抑制できることが期待される。 プロテインキナーゼ Α— R I a 遗伝子の塩基配列の一部としては、 遺伝子のどの部位であっても上記の効果は期 待できるが、 より完全にプロティンキナーゼ A— R I α活性の発現を抑制すると いう観点からは、 該遣伝子のコード鎖の 5 ' 末端側、 好ましくは開始コドンから 1 0 0番目のコドンまでの 3 0 0ヌクレオチドからなる配列の一部であることが 好ましい。 このプロティンキナーゼ Α— R I α遗伝子のコード領域の 3 0 0ヌク レオチドの配列を配列番号 1に示す。 また、 この配列に対するアンチセンス配列 (非コード鎖の配列と同じ） を配列番号 6に示す。 ここで、 配列番号 1に示す配 列と配列番号 6に示す配列の関係は相補的関係にあり、 遺伝子のどちらの鎖に対 するアンチセンスオリゴヌクレオチドであっても制癌作用は期待できる。
また、 配列番号 1又は 6に示す塩基配列の一部としては、 配列番号 1において は 5 ' 末端側であり、 配列番号 6については 3 ' 末端側であることが好ましい。 ここで、 「実質的に相補的」 とは、 オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチ ドがプロティンキナーゼ A遺伝子に対して相補的であることを必要とするもので はなく、 オリゴヌクレオチドが遺伝子 D N Aまたは m R N Aの相当する部位にハ イブリダィズし、 転写または翻訳を阻害することができる程度に相補的であれば よいことを意味する。 したがって、 生理条件下で特異的なハイブリダィゼーショ ンが阻害されない限り、 ヌクレオチド鎖中の一部のヌクレオチドの置換、 欠失ま たは挿入があっても良い。
アンチセンスオリゴヌクレオチド中で置き換わってもよいヌクレオチドは、 ォ リゴヌクレオチドの長さや配列によって異なるが、 一般的にォリゴヌクレオチド の両端部近辺は、 内部に比べて置換、 欠失及び挿入の影響が少なく、 A T (又は A U ) 塩基対の方が G C塩基対に比べて置換の影響が少ない。 核酸のハイブリダ ィゼーシヨン強度の計算方法は公知であり、 当業者にとって、 配列番号 1及び 6 に示す配列をもとに、 生理条件下でのハイブリダイゼ一ションが損なわれないよ うに一部の配列を改変することは容易である。 具体的には、 プロテインキナーゼ A遗伝子に対して 9 0 %以上のホモロジ一を有しているものは、 多少なりとも所 期の効果が期待でき、 実質的に相補的であると定義できる。 さらに、 このような オリゴヌクレオチドの 5 ' 末端又は 3 ' 末端に非特異的な配列を有するオリゴヌ クレオチドが付加されていても、 実質的に影響を受けない。
又、 本発明のァンチセンスォリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドの種類 としては、 塩基をチミン、 アデニン、 シトシン、 グァニンとし、 糖をデォキシリ ボースとした D N A構成ヌクレオチド類縁体でもよく、 塩基をゥラシル、 アデ二 ン、 シトシン、 グァニンとし、 糖をリボースとした R N A構成ヌクレオチド類縁 体でも構わない。 さらに、 イノシンのように非特異的に他の塩基と水素結合が可 能な塩基を含んでいてもよい。 最も好ましいものは、 配列番号 1の塩基配列に対 して相補的な、 D N A構成ヌクレオチド類縁体のォリゴヌクレオチドである。 プロティンキナーゼ A— R I αに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの配 列としては、 配列番号 1に示す塩基配列の一部と相補的な配列、 すなわち配列番 号 6に示す配列の一部と同一の配列を有するものとして具体的には、 配列番号 2、 3、 4、 5に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。 また、 配 列番号 6に示す塩基配列の一部と相補的な配列、 すなわち配列番号 1に示す配列 の一部と同一の配列を有するものとして具体的には配列番号 7、 8、 9に示すォ リゴヌクレオチドが挙げられる。 これらのォリゴヌクレオチドの配列番号 1また は 6に示す配列上の位置を次に示す。 配列番号 2 ：配列番号 6の塩基番号 2 8 0〜 3 0 0
配列番号 3 ：配列番号 6の塩基番号 4 6〜 5 7
配列番号 4 ：配列番号 6の塩基番号 1 4 8〜 1 6 5
配列番号 5 ：配列番号 6の塩基番号 2 5 0〜 2 7 9
配列番号 7 ：配列番号 1の塩基番号 1 〜 2 1
配列番号 8 ：配列番号 1の塩基番号 2 4 4〜 2 5 5
配列番号 9 ：配列番号 1の塩基番号 1 3 6〜 1 5 3
配列番号 10：配列番号 6の塩基番号 2 8 0〜 3 0 0 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 ヌクレオチド同士を一般式 （ I ) に示す様に窒素—燐結合でつなぐことを特徴とする。 この様な一般式に表される アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 後記実施例に示すように、 従来のホスホロ チォエート等の結合様式を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも優れた 癌抑制効果を有する。
( 2 ) 本発明のァンチセンスォリゴヌクレオチドの製造方法
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 下記反応式に従って、 順次ヌク レオチドを伸長することにより、 塩基配列を制御しながら合成することができる。
Figure imgf000009_0001
(ただし、 式中 P Oはポリマー残基を表し、 Rは水素原子又はァシロキシ基を表 し、 Bは核酸塩基を表す。 ） 即ち、 ポリマー等の固相にエステル結合で固定したジメチルトリチル化したヌ クレオシドを、 ジクロロ酢酸で脱トリチル化し、 （2—シァノエトキシ） 一 （N. N—ジイソプロピルアミノ） クロ口ホスフィンと N, N—ジイソプロピルェチル ァミンを反応させてフォスフイチル化することにより、 シァノエトキシヌクレオ チドとし、 これにテトラゾ一ルを反応させた後、 更に卜リエチルァミン存在下、 3 ' —アミノー 5 ' -ジメチルトリチルデォキシリボヌクレオチドの 3 ' —アミ ノ基でテトラゾールを置換し、 このジメチルトリチル体について同様に 3 ' —ァ ミノー 5 ' —ジメチルトリチルデォキシリボヌクレオシドを縮合させる操作を繰 り返せば、 エトキシシァノフォスホロアミデート結合で結合したポリマー上にェ ステル結合で固定された任意の塩基配列のォリゴヌクレオチドが得られる。 これ をァンモニァを用いて脱ジメチルトリチル化及び脱エステル化すれば一般式 （ I ) で表される構造を有するォリゴヌクレオチドが得られる。
上記一連の反応は、 市販されている D N Aシンセサイザー、 及び上記の反応試 薬を用いることにより、 自動的に任意の塩基配列のォリゴヌクレオチドを得るこ とが可能である。 上記の反応において、 糖鎖部分を 2 ' —ァシルー 3 ' —ァミノ - 5 ' ージメチルトリチルリボースで置き換えたヌクレオシドを用いれば、 R N A類似のアンチセンスオリゴヌクレオチドが得られる。
( 3 ) 本発明の制癌剤
本発明の制癌剤は、 上記記載のォリゴヌクレオチドから選ばれる 1種以上から なる。 オリゴヌクレオチドは、 二種以上の混合物として用いると、 より高い制癌 作用が得られる場合がある。
本発明の制癌剤は後記実施例に示すように、 各種の癌細胞に対して優れた制癌 作用を示す。 本発明の制癌剤が有効な癌は、 ヒトの癌であれば特に限定はない。 動物の癌に対しては、 本発明の制癌剤であるアンチセンスオリゴヌクレオチドが ヒトのプロティンキナーゼ A— R I α遗伝子に対するアンチセンスォリゴヌクレ ォチドであるため、 有効でない場合があることも予想される。
本発明の制癌剤が有効な癌としては、 具体的に例示すれば、 白血病、 大腸癌、 直腸癌、 結腸癌、 肺癌、 胃癌、 肝臓癌、 腎臓癌、 悪性リンパ腫、 舌癌、 食道癌、 乳癌、 咽頭癌、 脳腫瘍、 悪性筋腫、 メラノーマ、 子宮頸癌等が举げられる。 本発 明の制癌剤の好ましい投与量であるが、 病種や病状、 年齢、 体重、 性別、 体調な どにより異なるが、 おおよそ成人一人一日当たり、 10 mg 〜 200000 mg を一回な いしは数回に分けて投与するのが適当である。 投与経路としては、 静脈内、 動脈 内、 門脈内、 皮下、 皮内、 筋肉内、 病巣内等へ投与する注射による投与、 経口投 与等が例示できる。
( 4 ) 本発明の制癌用の医薬組成物
本発明の医薬組成物は上記制癌剤と剤形上の任意成分とからなる。 剤形上の任 意成分は通常医薬組成物に用いられているものであれば特に制限無く用いること ができる。 例えば、 経口製剤としては、 増量剤、 結合剤、 嬌味嬌臭剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 被 S剤、 糖衣剤等が例示でき、 注射剤としては、 p H調節剤、 等張剤、 安定剤等が例示できる。 また、 他の制癌作用が知られている薬剤とともに製剤化 してもよい。 これらの制癌剤と任意成分を剤形化する方法は、 通常の方法によれ ば良い。 好適な実施例の詳細な説 B月 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明がこれら実 施例に何等限定を受けないことは言うまでもない。 実施例 1 アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造例 （ 1 ) 上記に述べた方法により、 核酸合成機 A B I 3 8 4シンセサイザー （アプライ ドバイオシステムズ社製） を用いて、 配列番号 2、 3、 4、 5、 7、 8、 9に示 す塩基配列を有する D N A型のオリゴヌクレオチドを合成した。 即ち、
ポリマーにエステル結合で固定した各配列の 3 ' 末端塩基を有するジメチルトリ チル化したヌクレオシドを、 ジクロロ齚酸の 3 %塩化メチレン溶液を用い 1 . 5 分間処理して脱ジメチルトリチル化反応を行った。 さらに 0 . 2モルの （2—シ ァノエトキシ） 一 （N , N—ジイソプロピルアミノ） クロ口ホスフィ ンと 0 . 2 モルの N, N—ジイソプロピルェチルァミンの塩化メチレン溶液を用いてフォス フイチル化反応を 1 0分間行い、 シァノエ卜キシヌクレオチドとした。 これに 0 . 4モルのテトラゾールの 9 0 %ァセトニトリル水溶液に溶解した溶液を用いて 5 分間反応させたてテトラゾリル化した後、 3 ' 末端から 2番目の塩基を有する 0 . 2モルの 3 ' —アミノー 5 ' -ジメチルトリチルデォキシリボヌクレオシドと 0 . 2モルのトリエチルァミンの 5 0 %四塩炭ァセトニ卜リル溶液を用いてこれらの ヌクレオシドのカップリングを 2 0分間行った。
上記と同様にして、 各塩基配列に従って順次ヌクレオシドを結合させ、 最後に アンモニアのメタノール飽和溶液を用いて 5 ' 末端のヌクレオチドの脱ジメチル トリチル化、 脱シァノエトキシ化及びエステルの加水分解によるポリマーからの オリゴヌクレオチドの離脱を行った。 塩基配列は予め自動合成機にインプッ 卜し ておいた。 実施例 2 アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造例 （2) モノマーヌクレオシドを、 2' —ァセチル一3' —ァミノ一 5， 一ジメチルト リチルリボヌクレオシドに変えた以外は実施例 1と同様にして反応を行い、 配列 番号 10に示す配列を有する RN A型のオリゴヌクレオチドを作製した。 実施例 3 アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造例 （3) 実施例 1と同様にして、 配列番号 2に示す塩基配列の 5' 末端の 2塩基 GGを TTに置き換えた配列の DN A型オリゴヌクレオチドを合成した。 実施例 4 白血病細胞に対する制癌作用 （イン · ビトロ） 実施例 1〜 3で作製したオリゴヌクレオチドについて、 HL— 60白血病細胞 を用いて増殖抑制作用を調べた。 即ち、 1096FB S (牛胎仔血清） を添加した RPMI 1 640培地中で培養した後、 PB S (燐酸緩衝生理食塩水） で 2回洗 浄した細胞を、 10%FB S添加 RPM 1 1 640培地で希釈し 2 x 106個 Zm 1の濃度に調整した。 これに最終濃度が所定の濃度になるように調整した、 各種 濃度の実施例 1〜 3で製造したォリゴヌクレオチドの生理食塩水溶液を加えた。 その後 1週間 5%炭酸ガス混合ガス雰囲気で 37ての温度で培養し、 毎日細胞数 をカウントした。 培養開始 7日後の細胞数より、 細胞増殖を 100%抑制する最 小濃度を決定した。 尚、 ポジティブコントロールとしては、 特開平 6— 21 18 89号記載の配列番号 1のチォオリゴヌクレオチド （21マー） 、 即ち、 本発明 の実施例 1の配列番号 2のォリゴヌクレオチドの結合様式をフォスホロアミデー 卜からフォスホロチォエーテルに変えたものを用いた。 結果を表 1に示す。
この結果より、 本発明のォリゴヌクレオチドが制癌作用を有していること及び 本発明のォリゴヌクレオチドが従来のォリゴヌクレオチドょりすぐれた制癌作用 を有することが判る。 オリゴヌクレオチド i*¾r抑制港度 ( u M ) 実施例 1 配列番号 2 0 2
実施例 1 配列番号 3 2
実施例 1 配列番号 4 0 . 8
実施例 1 配列番号 5 0 . 8
実施例 1 配列番号 7 4
実施例 1 配列番号 8 2
実施例 1 配列番号 9 4
実施例 2 配列番号 1 0 8
実施例 3 1 6
ホスホロチォエート配列番号 2 3 2
実施例 5 結腸癌細胞に対する制癌作用 （イン · ビトロ） 実施例 4と同様に、 結腸癌由来細胞 L S 1 7 4 Tを用いて増殖抑制作用を見た t 完全増殖抑制最小濃度を表 2に示す。 これより、 本発明のオリゴヌクレオチドは 結腸癌に対しても白血病と同様の作用を示すことがわかる。
表 2 オリゴヌクレオチド 増殖抑制濃度 実施例 1 配列番号 2 0 . 1
実施例 1 配列番号 3 4
実施例 1 配列番号 4 0 . 8
実施例 1 配列番号 5 0 . 4
実施例 1 配列番号 7 2
実施例 1 配列番号 8 4
実施例 1 配列番号 9 4
実施例 2 配列番号 1 0 1 6
実施例 3 3 2
ホスホロチォエート配列番号 2 3 2 実施例 6 結腸癌細胞に対する制癌作用 （ィン · ビボ） 結腸癌由来細胞 L S 1 7 4 Tを用いて、 これをヌードマウス （雄性、 1群 5匹） に移植し、 その増殖に対する本発明の抑制作用を調べた。 即ち、 前培養し濃度を 2 x 1 0 7個 1に調整した癌の分散液を 0 . 1 m l右側背部皮膚に注射して癌 細胞を移植し、 7日飼育した後、 実験に使用した。 即ち、 オリゴヌクレオチドを 最終濃度で 1 O m g /m Iになるように、 4 9 . 5 %のピーナッツオイルと 4 9 . 5 %の生理食塩水と 1 96のツイーン 8 0を混合、 乳化したべヒクルに混ぜ込んだ 検体を 0 . 0 l m 1腫瘍と左側背部皮膚に皮下投与し、 投与後腫瘍の大きさを測 定した。 オリゴヌクレオチド投与群の腫瘍の平均体積を無投与群の腫瘪の平均体 積から減じ、 この値を無投与群の腫瘍の平均体積で除したものに 1 0 0を乗じた 数値を増殖抑制率とした。
本発明のォリゴヌクレオチドとしては、 配列番号 2に示す配列を有するォリゴ ヌクレオチドを、 対照品としては実施例 1に示したホスホロチォエー卜タイプの オリゴヌクレオチドを用いた。 本発明のォリゴヌクレオチドの増殖抑制率が 7 1 %であったのに対し、 対照品のオリゴヌクレオチドは 3 5 %であった。 これより、 本発明のオリゴヌクレオチドがィン · ビボに於いても優れた制癌作用を有するこ とが判る。 又、 オリゴヌクレオチドを投与した後も好ましくない毒性は観察され ておらず、 安全性並びに毒性に対する効果濃度で示される治療係数も高いもので あることがわかる。 実施例 7 複教のアンチセンスオリゴヌクレオチドの併用効果 実施例 4と同様に配列番号 2に示す配列を有する本発明のォリゴヌクレオチド と配列番号 3に示す配列を有する本発明のォリゴヌクレオチドの等モル混合物に ついて、 H L— 6 0に対する制癌作用を調べた。 細胞増殖抑制最小濃度は 0 . 4 〃M ( 0 . 2 Mの配列番号 2の本発明のオリゴヌクレオチドと 0 . 2〃Μの配 列番号 3の本発明のオリゴヌクレオチドの混合物） で、 相加効果以上の効果があ ることがわかる。 産業上の利用可能性 本発明のプロティンキナーゼ A遣伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチ ドは制癌作用が高いので、 制癌剤、 癌治療用の医療用組成物としてたいへん有用 である。
配列表
(1)一般情報
(i) 出願人： ポーラ化成工業株式会社
(ii) 発明の名称： アンチセンスオリゴヌクレオチド及びそれを用いた制癌剤 (iii) 配列数： 10
(iv) 連絡先：
(A)宛名
(B)番地
(C)市
(D)州
(E)国
(F) ZIP：
(V) コンピュータ読取り可能形式
(A)媒体： フロッピーディスク
(B)コンピュータ ： IBM PC互換
(C)操作システム： PC- DOS/MS-DOS
(D)ソフトゥヱァ： FastSEQ Version 1. 5
(vi) 現行出願データ
(A)出願番号
(B)出願日
(C)分類
(viii)代理人 Z事務所情報
(A)名前：
(B)登録番号：
(C)整理番号：
(ix)通信情報
(A)電話番号：
(B)ファクシミ リ番号：
(2) 配列番号 1の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 300 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： Genomic DNA
(iv) アンチセンス： NO
(xi) 配列： SEQ ID N0: 1 :
ATGGAGTCTG GCAGTACCGC CGCCAGTGAG GAGGCACGCA GCCTTCGAGA ATGTGAGCTC 60 TACGTCCAGA AGCATAACAT TCAAGCACTG CTCAAAGATT CTATTGTGCA GTTGTGCACT 120 GCTCGACCTG AGAGACCCAT GGCATTCCTC AGGGAATACT TTGAGAGGTT GGAGAAGGAG 180 GAGGCAAAAC AGATTCAGAA TCTGCAGAAA GCAGGCACTC GTACAGACTC AAGGGAGGAT 240 GAGATTTCTC CTCCTCCACC CAACCCAGTG GTTAAAGGTA GGAGGCGACG AGGTGCTATC 300
(2) 配列番号 2の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 21 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 縝の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： 他の核酸 合成 ίリコ' 5 [クレオチド
(iv) アンチセンス： YES
(xi) 配列： SEQ ID N0:2 :
GGCGGTACTG CCAGACTCCA T 21
(2) 配列番号 3の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 12 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成オリ〕' クレオチト'
(iv) アンチセンス： YES (xi) 配列： SEQ ID N0:3 :
AT 12
(2) 配列番号 4の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 18 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成； 51クレオチド (iv) アンチセンス： YES
(xi) 配列： SEQ ID N0:4 :
CCTGAGGAAT GCCATGGG 18
(2) 配列番号 5の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 30 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎮状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成^〕'？クレオチト' (iv) アンチセンス： YES
(xi) 配列： SEQ ID N0:5 :
TTCTCGAAGG CTGCGTGCC TCCTCACTGGC 30
(2) 配列番号 6の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 300 bases
(B) 配列の型： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： Genomic DNA
(iv) アンチセンス： YES
(xi) 配列： SEQ ID NO: 6：
GATAGCACCT CGTCGCCTCC TACCTTTAAC CACTGGGTTG GGTGGAGGAG GAGAAATCTC 60 ATCCTCCCTT GAGTCTGTAC GAGTGCCTGC TTTCTGCAGA TTCTGAATCT GTTTTGCCTC 120 CTCCTTCTCC AACCTCTCAA AGTATTCCCT GAGGAATGCC ATGGGTCTCT CAGGTCGAGC 180 AGTGCACAAC TGCACAATAG AATCHTGAG CAGTGCTTGA ATGTTATGCT TCTGGACGTA 240 GAGCTCACAT TCTCGAAGGC TGCGTGCCTC CTCACTGGCG GCGGTACTGC CAGACTCCAT 300
(2) 配列番号 7の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 21 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成; Η〕'ヌクレオチに
(iv) アンチセンス： NO
(xi) 配列： SEQ ID NO: 7 :
ATGGAGTCTG GCAGTACCGC C 21
(2) 配列番号 8の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 12 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成； H〕' 5tクレオチド (iv) アンチセンス： NO
(xi) 配列： SEQ ID NO: 8 :
ATHCTCCTC CT 12
(2) S£列番号 9の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 18 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成； H]'ヌクレオチド (iv) アンチセンス： NO
(xi) 配列： SEQ ID NO: 9 :
CCCATGGCAT TCCTCAGG 18
(2) 配列番号 1 0の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 21 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成; H]'ヌクレオチド (iv) アンチセンス： YES
(xi) 配列： SEQ ID NO: 10:
GGCGGUACUG CCAGACUCCA ϋ 21

Claims

請求の範囲
1. ヒトプロテインキナーゼ A遺伝子の配列の全部又は一部に対して、 少なく とも一部が相補的な塩基配列を有し、 一般式 （I ) で表される構造を有するオリ ゴヌクレオチド。
Figure imgf000021_0001
(一般式 （I) 中、 nは整数を表し、 Rは水素原子又は水酸基を表し、 Bは核酸 塩基を表す。 ）
2. ヒトプロティンキナーゼ A遺伝子の一部がヒトプロティンキナーゼ Aのレ ギュラトリー部分またはその一部をコードする配列である請求項 1記載のオリゴ ヌクレオチド。
3. レギユラトリー部分が R I一 αである請求項 1又は 2記載のオリゴヌクレ ォチド。
4. 配列番号 1に示すヒトプロティンキナーゼ Α— R I α¾伝子のコード鎖の 塩基配列に、 少なくとも一部が相補的な塩基配列を有する請求項 3記載のオリゴ ヌクレオチド。
5. 配列番号 6に示すヒトプロテインキナーゼ Α— R I α遺伝子の非コード鎖 の塩基配列に、 少なくとも一部が相補的な塩基配列を有する、 請求項 3記載のォ リゴヌクレオチド。
6 . 大きさが 9マー以上 4 0マー以下であることを特徴とする請求項 1 ~ 5の 何れか一項に記載のォリゴヌクレオチド。
7. 配列番号 2〜 5又は 1 0に示す塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有す る請求項 4記載のオリゴヌクレオチド。
8. 塩基配列が配列番号 2〜 5又は 1 0に示す塩基配列の何れかである請求項 7記載のオリゴヌクレオチド。
9 . 配列番号 7〜 9に示す塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する請求項 5記載のオリゴヌクレオチド。
1 0 . 塩基配列が配列番号 7〜 9に示す塩基配列の何れかである請求項 9記載の オリゴヌクレオチド。
1 1 . 請求項 1〜 1 0の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドからなる制癌剤 c
1 2 . 請求項 1 1記載の制癌剤から選ばれる 1種以上を含有する癌治療用の医薬 組成物。
PCT/JP1995/002452 1994-12-02 1995-12-01 Oligonucleotide anti-sens et agent cancerostatique contenant cet oligonucleotide WO1996016976A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP6324006A JPH1135595A (ja) 1994-12-02 1994-12-02 アンチセンスオリゴヌクレオチド及びそれを用いた制癌剤
JP6/324006 1994-12-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1996016976A1 true WO1996016976A1 (fr) 1996-06-06

Family

ID=18161082

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1995/002452 WO1996016976A1 (fr) 1994-12-02 1995-12-01 Oligonucleotide anti-sens et agent cancerostatique contenant cet oligonucleotide

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPH1135595A (ja)
WO (1) WO1996016976A1 (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997011171A1 (en) * 1995-09-22 1997-03-27 Hybridon, Inc. Modified protein kinase a-specific oligonucleotides and methods of their use
WO1998040479A1 (en) * 1997-03-12 1998-09-17 Hybridon, Inc. Modified protein kinase a-specific oligonucleotides and methods of their use
WO2001040285A1 (fr) * 1999-11-30 2001-06-07 Bioroad Gene Development Ltd. Shanghai Nouveau polypeptide, proteine kinase 38, et polynucleotide codant pour ce polypeptide
WO2002012299A1 (fr) * 2000-07-07 2002-02-14 Biowindow Gene Development Inc. Shanghai Nouveau polypeptide, proteine kinase humaine 27.17, et polynucleotide codant ce polypeptide
US6624293B1 (en) 1995-08-17 2003-09-23 Hybridon, Inc. Modified protein kinase A-specific oligonucleotides and methods of their use
US7074768B2 (en) 1995-08-17 2006-07-11 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modified protein kinase A-specific oligonucleotides and methods of their use
US7528117B2 (en) * 2002-12-05 2009-05-05 The Research Foundation Of State University Of New York High efficacy antisense RIαPKA poly-DNP oligoribonucleotides

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993013740A2 (en) * 1991-12-31 1993-07-22 Worcester Foundation For Experimental Biology Antiparasitic oligonucleotides active against drug resistant malaria

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993013740A2 (en) * 1991-12-31 1993-07-22 Worcester Foundation For Experimental Biology Antiparasitic oligonucleotides active against drug resistant malaria

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6624293B1 (en) 1995-08-17 2003-09-23 Hybridon, Inc. Modified protein kinase A-specific oligonucleotides and methods of their use
US7074768B2 (en) 1995-08-17 2006-07-11 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modified protein kinase A-specific oligonucleotides and methods of their use
WO1997011171A1 (en) * 1995-09-22 1997-03-27 Hybridon, Inc. Modified protein kinase a-specific oligonucleotides and methods of their use
WO1998040479A1 (en) * 1997-03-12 1998-09-17 Hybridon, Inc. Modified protein kinase a-specific oligonucleotides and methods of their use
WO2001040285A1 (fr) * 1999-11-30 2001-06-07 Bioroad Gene Development Ltd. Shanghai Nouveau polypeptide, proteine kinase 38, et polynucleotide codant pour ce polypeptide
WO2002012299A1 (fr) * 2000-07-07 2002-02-14 Biowindow Gene Development Inc. Shanghai Nouveau polypeptide, proteine kinase humaine 27.17, et polynucleotide codant ce polypeptide
US7528117B2 (en) * 2002-12-05 2009-05-05 The Research Foundation Of State University Of New York High efficacy antisense RIαPKA poly-DNP oligoribonucleotides

Also Published As

Publication number Publication date
JPH1135595A (ja) 1999-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1012267B1 (en) An antisense oligonucleotide preparation method
JP2018528781A5 (ja)
TW201726918A (zh) 抑制lpa之基因表現之組合物及方法
CN105008533A (zh) 嵌合单链反义多核苷酸和双链反义试剂
JP2010538677A5 (ja)
JP2022507282A (ja) 細胞におけるｌｐａの発現を抑制するための核酸
EP2898887B1 (en) Combined telomerase inhibitor and gemcitabine for the treatment of cancer
HUP0103465A2 (hu) A VEGF expressziójának gátlására szolgáló rövid oligonukleotidok
JP2003505080A (ja) ヒトｅｇ５の発現を阻害するためのオリゴヌクレオチド
KR20110017005A (ko) Ｔｇｆ-베타 수용체 유전자 발현 억제용 조성물 및 방법
JPWO2019022196A1 (ja) 一本鎖オリゴヌクレオチド
KR20220069103A (ko) 최소 플루오린 함량을 갖는 작은 간섭 rna의 화학적 변형
JP7553036B2 (ja) ｓｎｏＲＮＡの発現抑制剤を有効成分とするがん増殖抑制剤
WO2017068791A1 (ja) 少なくとも１つのバルジ構造を有する核酸複合体
WO1996016976A1 (fr) Oligonucleotide anti-sens et agent cancerostatique contenant cet oligonucleotide
WO2021157730A1 (ja) 核酸医薬とその使用
WO2020171149A1 (ja) ヘテロ核酸の最適ｐｓ修飾パターン
WO2024212954A1 (zh) 抑制lpa基因表达的化合物、药物组合物及其用途
JP7128517B2 (ja) 副作用を減じたアンチセンス核酸
JP2024501673A (ja) 修飾核酸コンジュゲート
WO2021010449A1 (ja) Ｒｎａ分子、キメラ型ｎａ分子、二本鎖ｒｎａ分子、および二本鎖キメラ型ｎａ分子
WO2022250050A1 (ja) ｓｃｐＢＮＡ又はＡｍＮＡを含むヘテロ核酸
WO2021070959A1 (ja) 修飾ヘテロ核酸
WO2025026228A1 (zh) Cfb抑制剂组合物及其应用
CN118878604A (zh) 磷酯骨架修饰的核苷酸及寡核苷酸

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT CA CN FI GE JP KR NO NZ RU UA

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
CFP Corrected version of a pamphlet front page

Free format text: UNDER INID NUMBER(71)"APPLICANTS",DELETE"GEISER,TIMOTHY,G.",AND UNDER INID NUMBER(72)"INVENTOR",ADD"GEISER,TIMOTHY,G."

122 Ep: pct application non-entry in european phase
点击 这是indexloc提供的php浏览器服务，不要输入任何密码和下载