WO1996016973A1

WO1996016973A1 - Fraction d'oligosaccharide de sulfate de keratane et medicament la contenant

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Publication number: WO1996016973A1
Application number: PCT/JP1995/002386
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Maruyama; Kiyoshi Morikawa; Akira Tawada; Satoshi Miyauchi; Keiichi Yoshida; Akira Asari
Original assignee: Seikagaku Corporation
Priority date: 1994-12-01
Filing date: 1995-11-22
Publication date: 1996-06-06
Also published as: AU3935695A; JP4429386B2; HUT77134A; JP2010046070A; EP0795560B1; JP5001989B2; EP0795560A1; EP0795560A4; JP2009019044A; US5939403A; DE69532293T2; US6159954A; CN1174557A; ATE256137T1; AU704429B2; CA2206611A1; DE69532293D1

Description

明細書ケラタン硫酸ォリゴ糖面分及びそれを含む薬剤技術分野本発明は、抗炎症剤、抗アレルギー剤、免疫調節剤、細胞の分化誘導剤、アポトーシス誘導剤及びこれらの薬剤の有効成分として有用なケラタン硫酸ォリゴ糖に関する。背景技術ケラタン硫酸は、 N—ァセチルグルコサミン残基の 6位が 0—硫酸化された N 一ァセチルラクトサミンを基本構造とするグリコサミノグリカンである。特に、構成二糖単位中の N -ァセチルグルコサミン残基の 6位以外の水酸基がさらに硫酸化された高硫酸化ケラタン硫酸は、サメなどの軟骨魚類、クジラ、ゥシなどの哺乳動物の軟骨、骨や角膜に存在することが知られている。その分解物であるケラタン硫酸オリゴ糖を生成する方法として、ケラタン硫酸に、バチルス厲細菌由来のケラタン硫酸分解酵素（ケラタナーゼ I I；特開平 2— 5 7 1 8 2号公報）を用いた報告がある。

また、ゥシ軟骨由来のケラタン硫酸をケラタナーゼ I Iで分解後、分画して得られた 2 5種のオリゴ糖画分について分析し、下記（ I ) 式で表される四硫酸化 N —ァセチルラクトサミン四糖（以下、「ケラタン硫酸四糖（ I ) 」ともいう」）、下記（I I) 式で表される三硫酸化 N—ァセチルラクトサミン五糖（以下、「ケラタン硫酸五糖（II) 」ともいう）、下記（III) 式で表される二硫酸化 N—ァセチルラクトサミンニ糖（以下、「ケラタン硫酸二糖（III) 」ともいう）等の構造を推定した報告 [Biochemistry, 33, 4836-4846 (1994)〕もある。

Gal(6S) β l-4GlcNAc(6S) l-3Gal(6S) β l-4GlcNAc(6S) · · · ( I ) NeuAc〜Gal ^^-4GlcNAc(6S) ^ ^3Gal(6S) S l-4GlcNAc(6S) · · · (I I) Gal(6S) /S l-4GlcNAc(6S) · · · (I I I) (式中、 Galはガラクトースを、 GlcNはダルコサミンを、 Neuはノイラミン酸を、 Acはァセチル基を、 6Sは 6-0-硫酸エステルをそれぞれ表す。また、〜はな 2 , 3 結合又は α 2 , 6結合を表す。）しかしながら、現在までに不純物（例えばエンドトキシン、核酸、蛋白質、プ口テアーゼ、ケラタン硫酸オリゴ糖以外の他のグリコサミノグリカン類等）を除いた純粋なケラタン硫酸オリゴ糖、特にケラタン硫酸四糖（ I ) 、ケラタン硫酸五糖（Π) 及びケラタン硫酸二糖（I II) を効率良く大量に調製した報告はない。特に、このような不純物の混在は、ケラタン硫酸オリゴ糖を医薬品として利用する場合に致命的な欠点になるおそれがある。更に、このケラタン硫酸オリゴ糖の薬理作用（特に、抗炎症作用、抗アレルギー作用、免疫調節作用、細胞の分化誘導作用、アポトーシス誘導作用）については全く知られていない。発明の開示本発明は、上記観点からなされたものであり、不純物が実質的に混在しないケラタン硫酸オリゴ糖を抗炎症剤、抗アレルギー剤、免疫調節剤、細胞の分化誘導剤（以下、「分化誘導剤」という）又はアポトーシス誘導剤として利用することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために、高硫酸化ケラタン硫酸をケラタン硫酸分解酵素で分解し、その分解産物の中から二〜五糖単位のオリゴ糖、特に二糖、四糖及び五糖単位のオリゴ糖を調製し、その薬理作用について鋭意研究を重ねた結果、これらのオリゴ糖及びその塩が優れた抗炎症作用、抗アレルギー作用、免疫調節作用、細胞の分化誘導作用、アポトーシス誘導作用を示すことを見い出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明の抗炎症剤、抗アレルギー剤、免疫調節剤、分化誘導剤又はアポ卜一シス誘導剤（以下、これら薬剤を総称して「本発明の薬剤」ということがある）は、ケラタン硫酸オリゴ糖及び Ζ又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する。本明細書中において「ケラタン硫酸オリゴ糖」とは、ケラタン硫酸をェンド— ;3— Ν—ァセチルグルコサミニダ一ゼ型ケラ夕ン硫酸分解酵素で分解して得られうるケラタン硫酸の分解生成物を意味する。

本発明の薬剤に用いるケラタン硫酸オリゴ糖としては、シアル酸及び又はフコースを含みうる硫酸化された N—ァセチルラクトサミン単位を有するケラタン硫酸オリゴ糖、硫酸化された N—ァセチルグルコサミンを還元末端に有する二〜五糖単位のォリゴ糖であつて、 1分子中の少なくとも 2個所の水酸基が硫酸化されたケラタン硫酸オリゴ糖、特に、少なくとも Gal(6S)-GlcNAc(6S) (ただし、 Ga 1はガラクトースを、 GlcNはグルコサミンを、 Acはァセチル基を、 6Sは 6-0-硫酸ェステルをそれぞれ表す。）で表される二糖を構成成分として含む上記ケラタン硫酸オリゴ糖が例示される。さらに、前記ケラタン硫酸オリゴ糖として、下記（ I ) 式で表される四硫酸化 N—ァセチルラクトサミン四糖、（Π) 式で表される三硫酸化 N—ァセチルラクトサミン五糖、（Ι Π) 式で表される二硫酸化 N—ァセチルラクトサミンニ糖等が好適な例として挙げられる。

Gal(6S) β l-4GlcNAc(6S) β l-3Gal(6S) β l-4GlcNAc(6S) · · · ( I ) NeuAc；〜 Gal /9 1-4GlcNAc(6S) ;^-3Gal(6S) ;9 1-4GlcNAc(6S) · · · (II) Gal(6S) ^ l-4GlcNAc(6S) · · · (I I I)

(式中、 Galはガラクトースを、 GlcNはグルコサミンを、 Neuはノイラミン酸を、 Acはァセチル基を、 6Sは 6-0-硫酸エステルをそれぞれ表す。また、〜はな 2 , 3 結合又は α 2 , 6結合を表す。）本発明はまた、硫酸化された Ν—ァセチルグルコサミンを還元末端に有する二〜五糖単位のオリゴ糖であって、 1分子中の少なくとも 2個所の水酸基が硫酸化されたケラタン硫酸オリゴ糖を 9 9 %以上含有し、下記の特性を有するケラタン硫酸ォリゴ糖画分を提供する。

( a ) エンドトキシンを実質的に含まず、また核酸、蛋白質、プロテア一ゼの含有量は検出限界以下である。

( b ) ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、へパラン硫酸及びケラタン硫酸を実質的に含まない。

本発明はまた、少なくとも Gal(6S)- GlcNAc(6S)で表される二糖を構成成分として含むケラタン硫酸オリゴ糖を 9 9 %以上含有し、かつ上記（a ) および（b ) の特性を有するケラタン硫酸オリゴ糖画分を提供する。また、前記オリゴ糖画分に含有されるケラタン硫酸オリゴ糖として、上記（ I ) 式で表される四硫酸化 N 一ァセチルラクトサミン四糖、（II) 式で表される三硫酸化 N—ァセチルラク卜サミン五糖、（II I) 式で表される二硫酸化 N—ァセチルラクトサミンニ糖等が好適な例として挙げられる。さらに、これらのケラタン硫酸オリゴ糖としては、軟骨魚類由来の高硫酸化ケラタン硫酸をェンドー ^3— N—ァセチルグルコサミニダーゼ型ケラタン硫酸分解酵素で分解後、分画して得られるケラタン硫酸オリゴ糖が挙げられる。

本発明はさらに、ケラタン硫酸を、下記の理化学的性質：

①作用：

ケラタン硫酸に作用し、その N—ァセチルグルコサミニド結合を加水分解する

②基質特異性：

ケラタン硫酸 I、ケラタン硫酸 II及びケラタンポリ硫酸に作用し、主な分解物として硫酸化ケラタン硫酸二糖及び硫酸化ケラタン硫酸四糖を生じる；、好ましくはさらに下記の理化学的性質：

③至適反応 p H：

4 . 5〜6 (0. 1M齚酸緩衝液及び 10mM トリスー酢酸緩衝液中、 3 7て）；

④ p H安定性：

6〜7 (0. 1M 酢酸緩衝液及び lOraM トリス—酢酸緩衝液中、 3 7 、 1時間放置）；

⑤至適反応温度：

5 0〜6 0 （0. 1M酢酸緩衝液、 p H 6 . 0、 1 0分反応）；

⑥熱安定性：

少なくとも 4 5て以下で安定（0. 1M酢酸緩衝液、 p H 6. 0、 1時間放置）、を有するケラタン硫酸分解酵素によつて分解するステップと、この分解生成物から下記性質を有するケラタン硫酸ォリゴ糖を分画するステツプとを含む、ケラ夕ン硫酸ォリゴ糖画分の製造法を提供する。

( A)硫酸化 N—ァセチルラクトサミンを基本骨格とするケラタン硫酸オリゴ糖を主成分とする；

( B ) エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、蛋白質及びプロテアーゼの含有量は微量もしくは検出限界以下である；

( C ) ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、へパラン硫酸及びケラタン硫酸を実質的に含まない。

また、上記ケラタン硫酸オリゴ糖面分の製造方法において、例えば、原料のケラタン硫酸として高硫酸化ケラタン硫酸を用いると、上記（I ) 式で表される四硫酸化 N—ァセチルラクトサミン四糖、（I I) 式で表される三硫酸化 N—ァセチルラクトサミン五糖、（I II) 式で表される二硫酸化 N—ァセチルラクトサミンニ糖等を含むケラタン硫酸オリゴ糖、特に（ I ) 式で表される四硫酸化 N—ァセチルラク卜サミン四糖及び（II I) 式で表される二硫酸化 N—ァセチルラクトサミン二糖を主成分とするケラタン硫酸ォリゴ糖が得られる。

なお、本発明において好ましい二〜五糖単位のケラタン硫酸オリゴ糖は、通常 2〜4力所が硫酸化されているものである。また、本発明において用いることができるシアル酸を含むケラタン硫酸オリゴ糖において、シアル酸としては、 N— ァセチルノイラミン酸及び N—グリコリルノイラミン酸を挙げることができるが、好ましいのは N—ァセチルノイラミン酸である。また、シアル酸が α 2 , 3結合又は α 2 , 6結合したものの何れをも用いることができるが、好ましいのは α 2 , 3結合したものである。以下、本発明を詳細に説明する。

< 1 >本発明に用いるケラタン硫酸オリゴ糖およびケラタン硫酸オリゴ糖画分本発明に用いるケラタン硫酸ォリゴ糖の原料となるケラタン硫酸は、主としてガラク卜ース又はガラクトースー 6—硫酸と Ν—ァセチルグルコサミンー 6—硫酸との二糖の繰り返し構造で構成され、動物種及び器官などによつて硫酸含有量が異なっているが、通常はサメなどの軟骨魚類、クジラ、ゥシなどの哺乳動物の軟骨、骨や角膜等の生原料から製造される。原料として使用されるケラタン硫酸は、通常入手できるものであればよく、特に限定されないが、構成糖であるガラクトース残基が硫酸化された高硫酸化ケラタン硫酸（構成二糖当たり 1 . 5〜 2分子の硫酸基を含む高硫酸化ケラタン硫酸をケラタンポリ硫酸ということもある）を用いることが好ましい。また、ガラクトース残基の硫酸基の位置としては、 6位が好ましい。このような高硫酸化ケラタン硫酸は、例えば、サメ等の軟骨魚類の軟骨のプロテオグリカンから取得できる。また、市販されているものを使用することもできる。

本発明のケラタン硫酸オリゴ糖は、ケラタン硫酸、好ましくは高硫酸化ケラタン硫酸の緩衝溶液にェンド— 3— N—ァセチルグルコサミニダ一ゼ型ケラタン硫酸分解酵素、例えばバチルス属細菌由来のケラタナーゼ I I (特開平 2— 5 7 1 8 2号公報）、または本発明者らがバチルス属に属する細菌から新たに見出した新規ケラタン硫酸分解酵素を作用させて分解した後、得られた分解物を分画することにより得られる。この分解反応は、例えばケラタン硫酸濃度 1 . 0〜1 0 O m g /m 1で、 p H 6 . 0〜7 . 0に調整された緩衝溶液を温度 2 5〜4 0 で 1〜7 2時間反応させて行われる。この場合、緩衝液の濃度は、通常 0 . 0 1〜0 . 2 M である。緩衝液としては、上記 p H範囲に調整できるものであれば、種類は特に制限されず、例えば酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液が挙げられる。また、分解反応に使用される酵素の量は、ケラタン硫酸 1 gに対し 0 . 1力、ら 1 . 0 ユニットが例示できる。ここで、 1ユニットとは、 1分間に 1 molの N—ァセチルグルコサミンに相当する還元末端を生成する酵素量である。

上記の新規ケラタン硫酸分解酵素は、バチルス ·サーキュランス、例えば本発明者らによって分離されたバチルス ·サーキュランス K s T 2 0 2株が産生する酵素であり、熱安定性に優れたケラタン硫酸分解酵素である。この酵素は、バチルス ·サーキュランス K s T 2 0 2株を好適な培地で培養し、この培地又は/及び細菌菌体から、通常の酵素の精製法に準じて精製することにより得られる。バチルス ·サーキュランス K s T 2 0 2株は、平成 6年 9月 5日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号 3 0 5 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号）に微生物受託番号 F E RM P - 1 4 5 1 6として寄託され、平成 7 年 1 1月 6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されて、 F E R M B P - 5 2 8 5の受託番号で寄託されている。

また、上記新規ケラタン硫酸分解酵素の理化学的性質を以下に示す。

①作用：

ケラタン硫酸に作用し、その N—ァセチルグルコサミニド結合を加水分解する _c

②基質特異性：

ケラタン硫酸 I、ケラタン硫酸 II及びケラタンポリ硫酸に作用し、主な分解物として硫酸化ケラタン硫酸二糖及び硫酸化ケラタン硫酸四糖を生じる。また、硫酸化ケラタン硫酸五糖も生じることが確認されている。

③至適反応 p H ：

4 . 5〜6 (0· 1M酢酸緩衝液及び 10mM 卜リス一酢酸緩衝液中、 3 7 ）

④ p H安定性：

6〜7 (0. 1M 酢酸緩衝液及び 10 トリスー酢酸緩衝液中、 3 7て、 1時間放置）

⑤至適反応温度：

5 0〜6 0て (0. 1M 酢酸緩衝液、 p H 6. 0、 1 0分反応）

⑥熱安定性：

少なくとも 4 5て以下で安定（0. 1M 醉酸緩衝液、 p H 6. 0、 1時間放置）本発明のケラ夕ン硫酸ォリゴ糖画分を製造する際には、この様な新規ケラタン硫酸分解酵素や上記ケラタナーゼ IIなどのケラタン硫酸分解酵素を、更に、常法により固定化した固定化酵素を用いて反応を行わせることもできる。

上記のような酵素による分解反応によって、ケラタン硫酸はォリゴ糖に分解される。

次に、こうして得られたオリゴ糖は、通常の分雜精製方法、例えば、エタノール沈澱や各種ク口マトグラフィ一によつて精製され、目的のケラタン硫酸ォリゴ糖を分離精製することができる。この精製方法を例えば二糖、四糖及び五糖のケラタン硫酸オリゴ糖の場合について更に詳しく説明すると、通常、前記分解生成物を初めエタノール沈澱によって濃縮し、次いでゲル滤過（分画分子量範囲 1 0 0〜 1 0 , 0 0 0 ) により、ほぼ二糖、四糖、五糖近辺のケラ夕ン硫酸ォリゴ糖にそれぞれ粗分画する。更に、この粗画分を陰イオン交換クロマトグラフィーによって、エンドトキシンを実質的に含まず、また、核酸、蛋白質、プロテアーゼの含有量は検出限界以下であり、さらにヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、へパラン硫酸及びケラタン硫酸を実質的に含まない、すなわち実質的に純粋な二糖、四糖および五糖に分雜、分画する。本発明において「実質的に含まない」とは、鋭敏な検出法によって検出はされるが、ケラタン硫酸オリゴ糖の薬理作用（抗炎症作用、抗アレルギー作用、免疫調節作用、細胞の分化誘導作用、アポトーシス誘導作用等）に影響を及ぼさない程度の含量であることをい。

また、本発明のケラタン硫酸オリゴ糖は、ケラタン硫酸を原料とし、これをェンドー ;3— N—ァセチルグルコサミニダーゼによって分解し、二〜五糖単位のォリゴ糖画分を分画したものであり、原料であるケラタン硫酸を実質的に含まない。尚、ケラタン硫酸を構成するガラクトース又はガラクトースー 6—硫酸と N— ァセチルグルコサミンー 6—硫酸との N—ァセチルグルコサミド結合を優先的に又は特異的に切断する化学的分解法によってケラタン硫酸を分解した分解物からも、ケラタン硫酸オリゴ糖は取得され得る。

上記のようにして、ケラタン硫酸オリゴ糖、特に前記（ I ) 式で表される四硫酸化 N—ァセチルラクトサミン四糖、（Π) 式で表される三硫酸化 N—ァセチルラクトサミン五糖、（I I I) 式で表される二硫酸化 N—ァセチルラクトサミンニ糖等が得られる。なお、式（ I ) 、式（Π) 、式（II I) で表される物質の核磁気共鳴スぺクトル（' Η— NMR、 ^{1 3} C - NMR ) 及び高速原子衝繋質量分析による解析結果は、後述の実施例に示す通りである。

また、本発明に用いられるケラタン硫酸オリゴ糖は、電離した状態のもの、プ口トンが付加した構造のもの、或はアルカリ金属（ナトリウム、カリウム、リチゥ厶等）やアルカリ土類金属（カルシウム等）、アンモニゥム等との無機塩基との間で形成された塩、又はジエタノールアミン塩、シクロへキシルァミン塩、ァミノ酸塩等との有機塩基との間で形成された塩のうち、薬学的に許容される塩も包含する。

また、本発明に用いられるケラタン硫酸オリゴ糖及び又はその塩と、通常医薬に用いられる担体、賦形剤、その他の添加物等とからなる医薬組成物も新規なものであり、抗炎症、抗アレルギー、免疫調節、細胞の分化誘導、アポトーシス誘導等を目的として投与することができる。

本発明のケラタン硫酸オリゴ糖画分は、以上の方法により、ケラタン硫酸、特に高硫酸化ケラタン硫酸の酵素分解物から、エンドトキシン、核酸、蛋白質、プ口テアーゼ、目的のケラタン硫酸オリゴ糖以外の他のグリコサミノグリカン類等の不純物を除去し、ケラタン硫酸オリゴ糖の含有量を 9 9 %以上としたものである。

< 2 >本発明の薬剤

上記のようなケラタン硫酸オリゴ糖及び/又はその薬学的に許容される塩は、抗炎症剤、抗アレルギー剤、免疫調節剤、分化誘導剤あるいはアポトーシス誘導剤等、その他の用途の医薬品として広く利用できる。

本発明の抗炎症剤は、炎症が関与するあらゆる疾患に対して有効であるが、具体的な適応症として、例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、変形性脊椎症、変形性関節症、腰痛症、手術後及び外傷後の炎症及び腫脹の緩解、肩甲関節周囲炎、顎関節症、腱腱鞘炎、腱周囲炎、上腕骨顆炎（テニス肘）、筋肉痛、角結膜炎等を挙げることができる。本発明の抗炎症剤は、含有するケラタン硫酸オリゴ糖及び Z又はその薬学的に許容される塩の働きでこれらの疾患並びに症状に対して鎮痛、消炎、解熱等の抗炎症作用を有する。

本発明の抗ァレルギ一剤はァレルギ一が関与するあらゆる疾患に対して有効であるが、具体的な適応症として、例えばアレルギー性森炎、アレルギー性角結膜炎、春季カタル、湿疹皮膚炎、蓴麻疹、アトピー性皮膚炎等を挙げることができる。

本発明の免疫調節剤は、免疫系の異常により引き起こされるあらゆる疾患に対して有効である力、'、具体的な適応症として、例えば、ヒ卜自己免疫性リンパ球増殖性 δΕ候群 (human autoimmune 1 ymphopro 1 i f e ra t i ve syndrome； Cell 81, 935- 946 (1995)、 Science 268. 1347- 1349 (1995)) 、リンパ球増殖性疾患 ( lymphop roliferative disorder； Leukemia and Lymphoma 16, 363-368 (199r>;) 、血管免疫芽紬胞性リンパ節症（angioi麵 unoblastic lymphadenopathy； Blood 85(10), 2862-2869 (1995)) 、免疫芽細胞性リンパ節症（immunoblastic lymphadenopath y； The American Journal of Medicine 63, 849- (1977)) 、慢性関節リゥマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎（皮庸筋炎）、強皮症、混合結合組織病、慢性甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性贫血、グッドーパスチユア（Good- pasture) 症候群、急性進行性糸球体肾炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交感性脈炎、多発性硬化症、進行性全身性硬化症、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎等）、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、特発性血小板減少性紫斑病、シエーグレン症候群、抗リン脂質抗体症候群等を挙げることができる。

本発明の分化誘導剤は、生理的な細胞分化の不全、免疫系の異常、悪性腫瘍等により引き起こされるあらゆる疾患に対して有効であるが、具体的な適応症としては、例えば、ヒト自己免疫性リンパ球増殖性症候群、リンパ球増殖性疾患、血管免疫芽細胞性リンパ節症、免疫芽細胞性リンパ節症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎等）、進行性全身性硬化症、多発性筋炎（皮膚筋炎）、シ X—グレン症候群、癌、白血病、リンパ腫、癌転移の抑制、過形成の防止（乾癖等の治療）、創傷治癒、骨髄異形成症候群、強皮症等を挙げることができる。

本発明のアポトーシス誘導剤は、生理的なアポトーシスの不全、免疫系の異常、悪性腫瘍等により引き起こされるあらゆる疾患に対して有効であるが、具体的な適応症としては、例えば、ヒト自己免疫性リンパ球増殖性症候群、リンパ球增殖性疾患、血管免疫芽細胞性リンパ節症、免疫芽細胞性リンパ節症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、進行性全身性硬化症、多発性筋炎（皮膚筋炎）、シユーグレン症候群、癌、白血病、リンパ腫、癌転移の抑制、過形成の防止（乾癖等の治療）、骨髄異形成症候群、強皮症、異常メサンギゥム細胞のアポトーシス誘導（糸球体肾炎の治療）等を挙げることができる。

リンパ節重量の抑制、分化誘導、およびアポトーシス誘導については、 MRL-lp iVlprマウスにおいてそれらの効果が認められた。ヒト自己免疫性リンパ球増殖性症候群 (autoimmune lymphoproliferative syndrome) は、 MRL- lpr/lprマウスと同様に F a s遺伝子の異常が原因とされており、また、 Jンパ節の腫脹が見られるなど、 MRい lpr八 prマウスの病態との類似性が高い。 MRい lpr/lprマウスは、ヒト自己免疫性リンパ球増殖性症候群の的確なモデルといえる。よって、免疫調節剤、分化誘導剤およびアポ卜一シス誘導剤において、最も好ましい本発明薬剤の適応症は、ヒト自己免疫性リンパ球増殖性症候群（autoimmune lymphoproliferative syndrome; である。

本発明の薬剤は、注射（筋肉内、皮下、皮内、静脈内、関節腔内、眼内、腹腔内等）、点眼、点入、経皮、経口、吸入等の投与方法に応じ、製剤化することができる。剤型としては、注射剤（溶液、魅濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟裔剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、点眼剤、眼軟裔剤等が挙げられる。製剤調製に当たり、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、その他着色剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用することができる。また、本発明の薬剤においては、ケラタン硫酸オリゴ糖と共にこれ以外の抗炎症成分、抗アレルギー成分、免疫調節成分、分化誘導成分、アポトーシス誘導成分等を併用することもできる。

上記の投与方法および剤型のうち、抗炎症剤および抗アレルギー剤において好ましいものを表 1に示す。また、免疫調節剤、分化誘導剤およびアポトーシス誘導剤において好ましい投与方法及び剤型を表 2に示す。

投与経路剤型静脈内、筋肉内、皮下、皮内注射剤

関節腔内、眼内点眼点眼剤点入軟裔剤経口錠剤、カプセル剤、顆粒剤

散剤、液剤、リポ化剤経皮軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤吸入スプレー剤、吸入散剤

投与経路剤型静脈内、筋肉内、皮下、皮内注射剤経口錠剤、カプセル剤、顆粒剤

散剤、液剤、リポ化剤

本発明の抗炎症剤、抗アレルギー剤の推定有効投与量は、全身的に投与される場合、ケラタン硫酸オリゴ糖の量として 30〜30 OmgZ人ノ日であり、また局所的に投与される場合、 1〜1 OmgZ人/日である。また、本発明の免疫調節剤、分化誘導剤、アポトーシス誘導剤の推定有効投与量は、ケラタン硫酸オリゴ糖の量として 30〜600 Omgノ人日である。図面の簡単な説明図 1は、実施例 1で製造した四硫酸化 N—ァセチルラク卜サミン四糖（ケラタン硫酸四糖（I) ) について HPLCによるゲル濾過を行った時のクロマトグラムを示す図である。

図 2は、実施例 1で製造した三硫酸化 N—ァセチルラクトサミン五糖（ケラタン硫酸五糖（Π) ) について HPLCによるゲル據過を行った時のクロマトグラムを示す図である。

図 3は、実施例 1で製造した二硫酸化 N—ァセチルラクトサミン二糖（ケラタン硫酸二糖（III) ) について HPLCによるゲル據過を行った時のクロマトグラムを示す図である。

図 4は、実施例 1で製造したケラタン硫酸五糖（II) の 400 MHzにおける ^lH— NMRスぺクトルを示す図である。

図 5は、ケラタン硫酸四糖（I)、ケラタン硫酸五糖（II)又はケラタン硫酸二糖（ΠΙ) を投与したハ°パイン関節炎モデルゥサギの関節液量を示す図である。図 6は、炎症を惹起させたラッ卜に対し、炎症惹起 5分前にケラタン硫酸四糖 ( I )又は各種試験物質を投与したときの足浮腫率の経時変化を示す図である。図 7は、炎症を惹起させたラットに対し、炎症惹起 3時間前にケラタン硫酸四糖（I)又は各種試験物質を投与したときの足浮腫率の経時変化を示す図である。図 8は、ケラタン硫酸四糖（I)又は酢酸デキサメサゾンを投与した力ラゲ二ン胸膜炎モデルラッ卜の胸水液量を示す図である。

図 9は、ケラタン硫酸四糖（I)又は酢酸デキサメサゾンを投与した力ラゲ二ン胸膜炎モデルラッ卜の胸水中の白血球数を示す図である。

図 10は、 N—ホルミノレ- Met-Leu-Phe (FMLP)刺激によるモルモット好中球に対する、ケラタン硫酸四糖（I) 、ケラタン硫酸五糖（Π)及びケラタン硫酸二糖（III) の活性酸素（0₂— ) 産生抑制効果を示す図である。

図 11は、ケラタン硫酸四糖（I)投与及び非投与のアレルギー性結膜炎モデルモルモッ卜の結膜炎の程度の評点を示す図である。

図 12は、ケラタン硫酸四糖（I) 、ケラタン硫酸五糖（II) 又はケラタン硫酸二糖（III) 投与及び非投与のアレルギー性結膜炎モデルモルモッ卜の結膜炎の程度の評点を示す図である。

図 1 3は、アレルギー性結膜炎モデルモルモッ卜に対し、各種濃度でケラタン硫酸四糖（ I ) を投与したときの結膜炎の程度の評点を示す図である。

図 14は、自己免疫疾患モデルマウスである MRLマウスに対し、各種投与量でケラタン硫酸二糖（III) を 28日間反復投与したときのマウスの顎下リンパ節重量を示す図である。

図 1 5は、各種投与量でケラタン硫酸二糖（III) を 56日間反復投与したときの MRLマウスの腸間膜リンパ節重量を示す図である。

図 1 6は、各種投与量でケラタン硫酸二糖（III) を 56日間反復投与したときの MR Lマウスの顎下リンパ節重量を示す図である。

図 1 7は、各種投与量でケラタン硫酸二糖（ΙΠ) を投与したときの MRLマウスの腸間膜リンパ節切片標本（HE染色）の染色濃度についての解析結果を示す図である。

図 1 8は、各種投与量でケラタン硫酸二糖（III) を投与したときの MRLマウスの顎下リンパ節切片標本（HE染色）の染色濃度についての解析結果を示す図である。

図 1 9は、各種投与量でケラタン硫酸二糖（III) を投与したときの MRLマウスのリンパ球における CD 3及び CD 4陽性細胞の割合（％) を示す図である。図 20は、各種投与量でケラタン硫酸二糖（III) を投与したときの MRLマウスのリンパ球における CD 3及び CD 8 a陽性細胞の割合（％) を示す図である。図 2 1は、各種投与量でケラタン硫酸二糖（III) を投与したときの MRLマウスのリンハ °球における CD 3及び B 220陽性細胞の割合（％) を示す図である。図 22は、各種投与量でケラタン硫酸二糖（III) を投与したときの MRLマウスの顎下リンパ節中のアポト一シス細胞数を示す図である。発明を実施するための最良の形態以下、本発明を実施例によって更に具体的に説明する。なお、製造例は、バチルス厲細菌から得られた新規なケラタン硫酸分解酵素の製造例を示し、実施例 1 は、ケラタン硫酸オリゴ糖画分の製造実施例、実施例 2はケラタン硫酸オリゴ糖の急性毒性及び各種薬理作用の実施例をそれぞれ示す。また、実施例 3、 4、 5 及び 6は製剤の実施例である。製造例ケラタン硫酸分解酵素の製造

< 1〉バチルス ·サーキュランス Ks T 202株の分雜

窒素源、無機塩類及びケラタン硫酸を含む液体培地 5m】に土壌を少量添加し、 45てで 3日間、振逸培養した。培養後、培養上清 10 1を濂紙にスポットした。同様に培地（対照）も 10^ 1濂紙にスポッ卜した。風乾後、トルイジンブルー液に據紙を浸した。薄い齚酸液で充分爐紙を洗浄した後、スポットした部位の色調を培養上清と対照とについて比較した。トルイジンブルーは、ケラタン硫酸と結合して青色を示すので、対照に比べて色調が薄くなつた試料にはケラタン硫酸資化性菌の存在が確認され、培養液から菌を平板培地（例えば、ハートインフュージョン寒天培地： Heart infusion Agar)を用いて、常法により純粋分離し

T o

純粋分雜した種々の菌について、液体培地を用いて上記と同様にしてケラタン硫酸の資化能を調べることにより、ケラタン硫酸資化性菌を得た。この株の形態学的性質、生育特性、生理学的性質を調べた結果、本菌株はバチルス >サーキュランス（Bacillus circulans)と同定された。本菌株は、ケラタン硫酸を資化する点で公知の菌株と区別される新菌株である。尚、バチルス ·サーキュランス K s T 202株は、平成 6年 9月 5日に工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM P— 14516として寄託され、平成 7年 1 1月 6日にブダぺス卜条約に基づく国際寄託に移管されて、 FERM B P - 5285の受託番号で寄託されている。

< 2 >ケラタン硫酸分解酵素の調製

ペプトン（極東製薬工業（株）製） 1.5%、ビール酵母エキス（日本製薬（株）製） 0.75%、サメ軟骨より調製したケラタンポリ硫酸（生化学工業（株）製） 0.75%, K2HPO4 0.5%、 MgSO₄ 7 H₂0 0.02 %, N a C 1 0. 5%、消泡剤アデ力ノール LG 109 (商品名、旭電化工業（株）製） 0.00 1 5% (pH8.0) の組成からなる培地 20 Lを 30 L容量のジャーファーメン夕一に仕込み、 1 21 で 20分間蒸気滅菌後、予め同じ培地で 37 で 1 6時間振燙培養しておいた K s T 202株の培養液 1 L (5%) を無菌的に植菌し、 4 5 で 24時間通気（1 V vm) 撮拌（300 r pm) 培養した。培養液 20 L を連続遠'!:、分雜機で処理して菌体を除き、約 20 Lの菌体外液を得た。

この菌体外液に硫酸アンモニゥムを 0.7飽和になるように加え、生じた沈澱を遠心分雜で集め、 2.5 Lの l OmMトリス酢酸緩衝液（ p H 7.5 ) に溶解した。この溶液に硫酸アンモニゥムを 0.35飽和になるように添加し、生じた沈殿を遠心分離で除き、更に硫酸アンモニゥムを 0.55飽和になるように添加後、生じた沈澱を遠心分離で回収した。

沈殿を 2.5しの1 OmMトリス齚酸緩衝液（pH7.5) に溶解し、予め同緩衝液で平衡化した DE A E—セルロース DE 52 (ヮッ卜マン社製）カラム（5. 2 x 24 cm) に通して酵素を吸着させた。同緩衝液 1.5 Lでカラムを洗浄後、同緩衝液中、食塩濃度を直線的に 0から 0.3Mに上昇させ、酵素を溶出させた。活性画分を集めて硫酸アンモニゥムを 0.55飽和になるように添加し、沈澱を遠心分雜で集め、少量の 1 OmMトリス齚酸緩衝液（pH7.5) に溶解した。その後、セフアクリル S— 300 (フアルマシア社製）カラム（3.4 X 1 10 cm ) に負荷し、 0. 5Mの食塩を含む 5 OmM卜リス酢酸緩衝液（pH7. 5) でゲノレ濾過を行った。

活性画分を UK— 10膜（アドバンテック東洋（株）製）を用いた限外濾過で濃縮し、約 1 00倍量の 1 OmM卜リス酢酸緩衝液（pH7.5) で透析した。内液を予め同緩衝液で平衡化した DEAE—トヨパール（東ソ一（株）製）カラム (2.2 X 1 5 cm) に通して酵素を吸着させ、 0. 1 Mの食塩を含む同緩衝液 1 50m lでカラムを洗净後、同緩衝液中、食塩濃度を直線的に 0. 1力、ら 0.2M に上昇させ、酵素を溶出させた。

活性画分を限外濾過で濃縮し、セフアクリル S— 300カラム（2.2 x 1 0 1 cm) に負荷し、ゲル濾過を行った。

活性画分に食塩を 4Mになるように添加した後、 4M食塩を含む 1 OmMトリス酢酸緩衝液（pH7.5) で平衡化したフヱニルセファロース（フアルマシア社製）カラム（1.6 x 15 cm) に通して酵素を吸着させ、同緩衝液中、食塩濃度を直線的に 4 Mから 0に減少させ酵素を溶出させた。

得られた酵素は 29ュニットであり、比活性は 2.09ュニット mg (ゥシ血清アルブミン重量換算）であった。精製酵素中にグリコシダーゼ類の夾雑酵素は含まれていなかった。

このようにして得られたケラ夕ン硫酸分解酵素は、以下に示す性質を有している。

①作用：

ケラタン硫酸に作用し、その N—ァセチルダルコサミニド結合を加水分解する。

②基質特異性：

③至適反応 pH ：

4.5〜6 (0.1M酢酸緩衝液及び lOmM トリスー酢酸緩衝液中、 37て）

④ pH安定性：

6〜7 (0.1M酢酸緩衝液及び 10mM トリスー酢酸緩衝液中、 37て、 1時間放置）

⑤至適反応温度：

50〜60V (0.1M 酢酸緩衝液、 pH6.0、 1 0分反応）

⑥熱安定性：

少なくとも 45て以下で安定（0.1M 酢酸緩衝液、 p H 6.0、 1時間放置）以下の実施例では、上記のようにして得られたケラタン硫酸分解酵素を用いた力、'、本発明はこの酵素に限定されるものではなく、例えばケラタナーゼ IIのような他のエンド一; 3— N—ァセチルグルコサミニダ一ゼ型ケラタン硫酸分解酵素を用いてもよい。 1 サメ軟骨由来の高硫酸化ケラタン硫酸 50 gを 300m 1の 0.1M齚酸緩衝液（PH6.0) に溶解した。この液に上記ケラタン硫酸分解酵素を 25ユニット加えて 37てで 24時間分解を行った。反応終了後、 2倍量（容量、以下同様）のエタノールを加えて擁拌し、室温で一晩放置した。翌日、反応液を遠心分離

(4000 r pm、 15分）により上清と沈澱とに分饈し、上清を減圧濃縮した (以下、この濃縮物を上清 Aという）。一方、沈殿には 300m lの蒸留水を加えて溶解し、 3倍量のエタノールを加えて擁拌後、室温にて一晩放置した。翌日、遠心分雜にて上清と沈澱を分け、上清を減圧濃縮した（以下、この濃縮物を上清 Bという）。

上清 Aを少量の蒸留水に溶解し、バイオゲル P— 2カラム（バイオラッド社製） (3.6 X 134 cm) を用い、蒸留水を溶媒としてゲル減過クロマトグラフィーを行ない、さらにイオン交換クロマトグラフィーを行なって、ケラタン硫酸四糖

(I) 、ケラタン硫酸五糖（II)及びケラタン硫酸二糖（III) を含む画分をそれぞれ分取して凍結乾燥した。

これらのケラタン硫酸ォリゴ糖画分をそれぞれ少量の蒸留水に溶解し、予め蒸留水で平衡化したムロマックカラム（室町化学工業（株）製）（4.3 X 35 cm) を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによりそれぞれさらに精製した。溶出溶媒には食塩水を用い、食塩濃度を直線的に 0から 3 Mに上昇させて、ケラタン硫酸四糖（I) 、ケラタン硫酸五糖（II) 、ケラタン硫酸二糖（III) をそれぞれ溶出させた。

得られたケラタン硫酸四糖（ I )画分、ケラタン硫酸五糖（Π)画分、ケラタン硫酸二糖（III) 画分をそれぞれ減圧濃縮後、セル口ファイン GCL— 25カラム（生化学工業（株）製）（3.2 X 125 cm)を用いたゲル濾過クロマトグラフィ一により脱塩し、凍結乾燥した。

上清 Bからも同様の操作によってケラタン硫酸四糖（I) 、ケラタン硫酸五糖

(II) 、ケラタン硫酸二糖（III) を得た。

こうして得られたケラタン硫酸四糖（ I ) 、ケラタン硫酸五糖（Π) 及びケラタン硫酸二糖（III) について HPLC (高速液体クロマトグラフィー）によるゲル濾過を行った時のクロマトグラムをそれぞれ図 1、図 2、図 3に示す。

ケラタン硫酸 50 gから得られたケラタン硫酸四糖（I) は 7.8 g (15.6 %) 、ケラタン硫酸五糖（II) は 1. 3 g (2. 6%) 、ケラタン硫酸二糖（Π I) は 10. 4 g (20. 8%)であり、いずれにもエンドトキシン、核酸、蛋白質、プロテアーゼ、他のグリコサミノグリカン類は含まれていなかった。

得られたケラタン硫酸四糖（I)、ケラタン硫酸五糖（Π)及びケラタン硫酸二糖（III) の¹ H- NMRスペクトルを日本電子 J NM - EX 400 (400MHz)、 ¹³C -NMRスペクトルを日本電子 J NM— EX 400 (100MHz) を用い、 3— （トリメチルシリル）プロピオン酸ナトリウム—D₄を内部標準物質として測定した。ケミカルシフトは <5 (ppm) 、結合定数は Hzで表した。測定結果を以下に示す。ケラタン硫酸四糖（ I )

•H-N R δ (D₂0, 40*0 ： 4.757C1H, d).4.565C1H, d), 4, 56K1H, d), 4.402C1H, dd),

4.342 (2H, dd).3.71K1H, dd), 3.626C1H, dd),

3.555C1H, dd), 2.069C3H, s), 2.047C3H, s)

I 3 C-NMR(5(D₂0, 25て） 177.81, 177.63, 177.30, 105.87, 105.69, 97.84,

93.34, 84.98， 82.41, 81.91, 81.25, 75.55, 75.44， 75.20. 75.13, 75.02， 73.70, 72.68, 72.07, 71.10. 71.01, 70.61, 69.82, 69.59, 69.29, 58.92, 57.94, 56.42, 25.09, 24.76 ケラタン硫酸五糖（II)

Ή-N R (5(D₂0,25て）：測定チヤ一トを図 4に示す。

，³C-NMR5(D₂0,25 ）： 177.80, 177.32, 176.86, 105.92, 105.78, 104.94,

102.60, 97.86, 93.32, 85.08, 82.55. 82.04,

79.75, 78.16, 77.93, 75.69. 75.59, 75.48. 75.24.

74.98. 74.36, 72.68, 72.33, 72.07, 71.38. 71.01,

70.65, 70.35， 69.62, 69.13, 65.38, 63.94, 58.92，

57.99, 56.42. 54.57, 42.47, 25.07, 24.93, 24.76 ケラタン硫酸二糖（III)

Ή-NMR (D₂0,4(nC) ： 5.235(0.64H, d, J=l.46Hz), 4.766(0.41H, d, J=4.88Hz),

4.562(1.15H, d, J=7.82Hz), 4.44(0.15B, br),

4.42(0.22H, br), 4.357(1.30H, d, J=3.42Hz),

4.313(0.22H, d, J=4.88Hz), 4.286(0.15H, d, J=3.90Hz), 4.213(2.37H, d, J=5.37Hz),

4.183(0.37H, t, J=3.42, 2.93Hz), 4.01-3.97(2.06H, m), 4.006(d, J=2.44Hz), 3.927(1.27H, d, J=5.37Hz),

3.86-3.83(0.37H, br), 3.78-3.69(2.78H, m),

3.59-3.56(1.04H, m), 2.052(3.00H. m)

13

C-NMR5(D₂0,25 ）： 177.61, 177.30, 105.80, 105.63， 97.82, 93.38,

82.02, 81.55， 75.60, 75.47, 75.15, 75.09, 73.70, 72.04, 71.12, 71.07, 69.93, 69.51, 59.00, 56.44， 25.05, 24.76 また、得られたケラタン硫酸四糖（ I ) 、ケラタン硫酸五糖（II) 及びケラタン硫酸二糖（III) を高速原子衝撃質量分析法（FABMS) により分析した。

(1 ) 陽イオン FABMS (陽イオン高速原子衝繫質量分析法）

ケラタン硫酸四糖（ I ) は 25nmolノ 1の水溶液に、ケラタン硫酸五糖（II) は 40nmolZ;ulの水溶液に、ケラタン硫酸二糖（III) は 50nmolZ 1の水溶液にそれぞれ調製され、それぞれ 1.0 1を α—チォグリセロール（マトリクスとして使用） 1.0 1 と混和して測定に用いた。測定は finnigan MAT TSQ700 三連四重極型質量分析計により行った。また衝突原子にはキセノン（8kV) を用いた。結果を表 3に示す。なお、表中の括弧内の数字はピークの相対強度（％) を示す。表 3

([M-2H+3Na-102r及び [M-2H+3Na-102-102]⁺はフラグメントイオンである。 )

(2) 陰イオン FABMS (陰イオン高速原子衝撃質量分析法）

ケラタン硫酸四糖（ I ) は 25nmolZ の水溶液に、ケラタン硫酸五糖（Π) は 40nmolZ 1の水溶液に、ケラタン硫酸二糖（ΙΠ) は 40nmol ^ 1の水溶液にそれぞれ調製された。得られた各ケラタン硫酸オリゴ糖の水溶液をそれぞれ 1.0 1、 1.0 】、 0.5〃 1取り、それぞれ 1.0 1の α—チォグリセロール（マトリクスとして使用）と混和して測定を行った。測定は finnigan MAT TSQ700三連四重極型質量分析計により行った。また衝突原子にはキセノン（8kV) を用いた。結果を表 4に示す。なお、表中の括弧内の数字はピークの相対強度（％) を示す。表 4

([M+Na-2H-102rはフラグメントイオンである。）

さらに、得られた精製ケラタン硫酸四糖（ I ) 、ケラタン硫酸五糖（II) 及びケラタン硫酸二糖（III) 中のエンドトキシン、核酸、蛋白質、及びプロテア一ゼの含有量を測定した。結果を表 5に示す。

表 5

注） a)：ケラタン硫酸オリゴ糖 lmg当たりのェンドトキシン含有量で、トキシカラー（商標）システム（生化学工業（株）製）を用いて測定。

EU：ェンドトキシン単位（Endotoxin Unit)

b)： DN Aについてスレツシュホールド法〔DNA測定装置：スレッシュホ一ルド（米国モレキュラーデバイス社製）〕で測定。

c)：ゥシ血清アルブミンを標準物にしてローリー法で測定。

d)： FITC-カゼィンを基質として測定。また、精製ケラタン硫酸四糖（I) 、ケラタン硫酸五糖（II)及びケラタン硫酸二糖（III) 中のヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、へパラン硫酸及びケラタン硫酸等のグリコサミノグリカン類の含有量を、セルロースァセテート膜（セパラックス：富士写真フィルム（株）製）を用いた電気泳動法 (緩衝液： 0. 1 Mピリジン ·ギ酸、 pH 3. 0、電流： 0. SmAZcm、泳動時間： 30分、染色： 0. 5%アルシアンブルー溶液）で確認したところ、どのケラタン硫酸オリゴ糖からも、いずれの化合物も検出されなかった（検出限界以下）。実施例 2 以上のようにして得られたケラタン硫酸四糖（I)、ケラタン硫酸五糖（Π) 及びケラタン硫酸二糖（III) について急性毒性試験及び各種薬理作用試験を行つ

<急性毒性試験〉

5週令の I CR系マウスの雌雄を用いて、実施例 1で調製した精製ケラタン硫酸オリゴ糖のそれぞれについて急性毒性試験を実施した。ケラタン硫酸四糖（I)、ケラタン硫酸五糖（II)及びケラタン硫酸二糖（ΙΠ) のそれぞれ PBS (リン酸緩衝生理食塩水）溶液を 100 OmgZk g又は 200 OmgZk gの用量で静脈内に投与し、投与後 14日間、一般状態及び生死についての観察と体重の測定とを行った。その後、動物を屠殺し、剖検を実施した。

その結果、死亡した動物は認められず、一般状態、体重、剖検においても異常は認められなかった。

以上の結果から、上記ケラタン硫酸オリゴ糖のいずれをマウスの静脈内に投与した場合でも、最少死亡量は 200 Omg/k g以上であると結論された。ぐ抗炎症作用試験〉

( 1 ) ゥサギのパパィン誘発関節炎モデルを用いた抗炎症作用試験

ゥサギのパパイン誘発関節炎モデルを用いて、関節液量を指標としてケラタン硫酸オリゴ糖の抗炎症作用について試験した。

(1— 1)両膝関節炎モデルを用いた、ケラタン硫酸四糖の関節腔内投与による抗炎症効果

体重約 3 k gの日本白色在来種ゥサギ（雌）の両膝関節腔内にパパインの生理食塩水溶液（ 1 %)を 150 1注入し、関節炎モデルを作製した。パパィン注入後 1日目に左側膝関節腔内に実施例 1で調製した精製ケラ夕ン硫酸四糖（ I ) の PBS溶液（1%) を 150 1 (1.5mg/関節）注入し（以下、ケラタン硫酸四糖（I )投与足という）、また右側膝関節腔内には PBSを 150 1注入した（以下、ケラタン硫酸四糖（ I )非投与足という。また、以下ケラタン硫酸四糖（ I ) を投与したゥサギを投与群という）。また、パパイン注入処理のみを施したゥサギ（以下、対照群という）およびパパインを注入しない正常なゥサギ (以下、正常群という）についても同様に試験した。注入後 7日目にゥサギの耳介動脈から採血し、へパリン加血漿を分離した。採血後ゥサギを解剖し、両膝関節を分離した。 2m 1の生理食塩水液で 3回、関節腔を洗净し、回収関節液を採取した。血漿と回収関節液中のカルシウム濃度を測定し、下記の式から関節液量を算定した。関節液量 (：^ 】関節） =

回収関節液中のカルシウム量（ g/関節）血漿中のカルシウム濃度（ gZ 1 ) 以上の結果を表 6に示す。なお表中の nは、実験に用いた各群のゥサギの匹数を示す。表 6

注） * ：有意性は、 D u n c a n多重比較検定による。この結果から明らかなように、本発明によるケラタン硫酸四糖（ I ) 投与群の関節液量は対照群のそれに比べて有意に少なく、ケラタン硫酸四糖（ I ) の関節炎に対する改善作用が認められた。

( 1 -2) 両膝関節炎モデルを用いた、ケラタン硫酸四糖の筋肉内投与による抗炎症効果

(1 - 1 ) に記載された方法で関節炎モデルを作製し、パパイン注入後 1日目に、左脊部の筋肉内に実施例 1で調製した精製ケラタン硫酸四糖（I) の PBS 溶液（1%溶液）を 150 1 (0.5mg/kg体重）注入した（以下、ケラタン硫酸四糖（I)投与群という）。対照は、ケラタン硫酸四糖（I) の PBS溶液の代わりに PBSを 150 1注入したものとした（以下、対照群という）。ノ、。パインを注入しない正常なゥサギ（以下、正常群という）についても同様に試験した注入後 7日目に（1一 1) と同じ方法で関節液量を算定した。

以上の結果を表 7に示す。なお表中の nは、実験に用いた各群のゥサギの匹数を示す。

注） * ：有意性は、 D u n c a n多重比較検定による。

この結果から明らかなように、本発明によるケラタン硫酸四糖（I)投与群の関節液量は対照群のそれに比べて有意に少なく、ケラタン硫酸四糖（I) による関節炎の改善作用が認められた。

(1 -3) 片膝関節炎モデルを用いた、ケラタン硫酸四糖の筋肉内投与による抗炎症効果

体重約 3 k gの日本白色在来種ゥサギ（雌）の左膝関節腔内にパパインの生理食塩水溶液（ 1 %) を 150 1注入し、右膝は無処置のままとして片膝関節炎モデルを作製した。パパイン注入後 1日目に、左膂部の筋肉内に実施例 1で調製した精製ケラタン硫酸四糖（I) の PBS溶液（2%、 1%ぉょび0. 5%溶液）を 150〃 1 (1.0mg/kg、 0.5mg/kg, 0.25mg/kg)注入した（以下、ケラタン硫酸四糖（ I )投与群という）。対照は、ケラタン硫酸四糖（ I ) の PB S溶液の代わりに PBSを 150 1注入したものとした（以下、対照群という）。パパインを注入しない正常なゥサギ（以下、正常群という）についても同様に試験した _c 注入後 7日目に（1— 1) と同じ方法で関節液量を算定した。

以上の結果を表 8に示す。なお表中の nは、実験に用いた各群のゥサギの匹数を示す。表 8

注） * ：有意性は、 T UK EY多重比較検定による。この結果から明らかなように、本発明によるケラタン硫酸四糖（I) 投与群の関節液量は対照群のそれに比べて有意に少なく、ケラタン硫酸四糖（I) による関節炎の改善作用が認められた。

(1 -4)片膝関節炎モデルを用いた、各種ケラタン硫酸オリゴ糖の筋肉内投与による抗炎症効果

実施例 1で調製した精製ケラタン硫酸四糖（I) 、ケラタン硫酸五糖（II)及びケラタン硫酸二糖（III) の 1. 0%?85溶液を150〃 1 (0.5mgZkg) 用いたこと以外は、（1— 3) と全く同様の方法で試験を行った。結果を図 5に示す。なお、図中、 * * *及び * * *は、それぞれ p<0.05 pく 0.01 pく 0.001で有意差があることを表す。また、試験に用いたゥサギは各群とも 10匹であった。この結果からケラタン硫酸四糖（I)投与群、ケラタン硫酸五糖（II)投与群及びケラタン硫酸二糖（III)投与群の関節液量はいずれも、対照群のそれに比べて有意に少なく、前記各ケラタン硫酸オリゴ糖による関節炎の改善作用が認められた。

( 2 ) ラット足浮腫逆受け身ァルサス反応を用いた抗炎症作用試験

II I型アレルギー炎症モデルであるラット足浮腫逆受け身ァルサス反応におけるケラタン硫酸オリゴ糖の効果を検討した。すなわち、試験物質を投与したラットの足踏にゥサギ抗卵白アルブミン血清を皮下投与し、さらに卵白アルブミンを尾静脈から注射して炎症（浮腫）を惹起し、試験物質の浮腫に対する抑制効果を調ベた。

(試験物質の投与）

5週齢の C r j ： S D系雄性ラットを、 1週間予備飼育を行った後、約 1 7時間絶食を行い、炎症惹起前に試験物質として実施例 1で調製した精製ケラタン硫酸四糖（ I ) 、インドメタシン（シグマ社、 Lot No. 19F0018) もしくはデキサメサゾン（万有製薬（株）、デカドロン注射液、 Lot No. 8D307P) 、あるいは陰性対照として生理食塩液（（株）大塚製薬工業、 Lot No. 3H72) を投与した。ケラタン硫酸四糖（ I ) 及びデキサメサゾンは生理的食塩液に溶解させたものを、インドメタシンは 0. 5¾ カルボキシメチルセルロースナトリウム（C M C— N a ：和光純薬工業（株）、 Lot No. PTN1418) に溶解させたものを、各々使用した。投与容量は全て体重 100g当たり 0, 5mlとした。また、投与経路としては、ケラタン硫酸四糖 ( I ) 、生理的食塩液およびデキサメサゾンは尾静脈より投与し、インドメタシンは経口投与とした。なお、インドメタシンを除く薬物はブラインド法により投与した。

各試験物質の投与量及び投与スケジュールは次の通りである。各群は 5匹で構成した。

(i)炎症惹起 5分前投与

①生理食塩水（陰性対照）

②ケラタン硫酸四糖（ I ) lmg/kg

③ケラタン硫酸四糖（ I ) 3mg/kg

④ケラタン硫酸四糖（ I ) 10mg/kg

(ii)炎症惹起 3 0分前投与 ⑤インドメタシン（陽性対照） 5m_g/kg

(iii)炎症惹起 3時間前投与

⑥ケラタン硫酸四糖（ I ) lmg/kg

⑦ケラタン硫酸四糖（ I ) 3mg/kg

⑧ケラタン硫酸四糖（ I ) 10mg/kg

⑨デキサメサゾン（陽性対照） lmg/kg

(炎症の惹起）

上記の各ラッ卜の足踱にゥサギ抗卵白アルブミン血清を皮下投与し、さらに卵白アルブミンを尾静脈から注射して炎症（足浮腫）を惹起した。用いた抗血清は次のようにして調製した。ゥサギの背部皮内に 2 %卵白アルブミン（Egg Albumi n 5 x Cryst, Lot No. P93601,生化学工業（株））含有生理的食塩液とフロイント •コンプリート 'アジュバント（F C A ) との等量混合液（ェマルジヨン）を 1 m 1 ( 1匹あたり卵白アルブミン 1 O m g ) を週 1回、計 3回注射して感作した。最終感作後から約 3 4日に採血して抗血清を得た。得られた抗血清について重層法により抗体価を測定した。すなわち、生理的食塩液で希釈した抗血清と 0 . 1 %卵白アルブミン含有生理的食塩液（lmg/ml) との白色沈澱反応を指標として測定した。その結果、得られた抗血清の抗体価は X 2 ⁷であった。

各試験物質を投与したラットの左後肢足踱に、各群毎に設定された時間が経過後に、 6倍に希釈した抗血清を 0 . 1 m 1皮下投与した。次に、 0 . 5 %卵白ァルブミン含有生理的食塩液（25mg/5inl/kg) を尾静脈より投与して炎症を惹起した ₍ 炎症惹起前、および惹起後 1、 2、 3および 4時間の各群の処置足の容積を足容積測定装置（T K一 1 0 1、ュニコム（株））を用いて測定し、惹起前値との差より足浮腫率を求め、さらに試験物質投与群の対照群に対する浮腫抑制率を算出した。得られた個々の浮腫率について最小有意差検定より平均値の差の検定を行つた。各投与群における足浮腫率及び浮腫抑制率を表 9に、炎症惹起 5分前及び 3時間前に薬物を投与した群の足浮腫率をそれぞれ図 6、 7に示した。図中、 * 及び * *は、それぞれ p<0. 05、 p<0. 01で有意差があることを表す。表 9

*. * * ： P< 0. 05 (*) 及び P< 0. 01 (**) で対照と有意差がある

その結果、陰性対照である生理的食塩液投与群では、 1時間後の足浮腫率が 4 0. 9%であったのに対し、ケラタン硫酸四糖（ I ) 一炎症惹起 5分前投与群では、 29· 1〜34. 4%であり、 lmg/kg投与群および lOrag/kg投与群に有意差が認められた。炎症惹起 1時間後以降は、用量依存的な反応はみられなかったが、 4時間後においても 3mg/kg投与群および 10mg/kg投与群で 37. 2%および 35. 4%と有意に低値であった。また、ケラタン硫酸四糖（ I ) 一炎症惹起 3時間前投与群では、炎症惹起 1時間後に有意な差はみられなかったが、 2時間後に 3mg/ kg投与群で 35. 3%、 3時間後に 10mg/kg投与群で 4 1. 5 %、さらに 4時間後には lmg/kg投与群でも 38%と有意に低値を示した。また、インドメタシン投与群では、 2時間後及び 4時間後に有意に低値を示した。またデキサメサゾン投与群では、 1〜4時間後にかけていずれの測定時点でも有意に低値であった。

足浮腫抑制率は、インドメタシン投与群では、 1〜4時間後にかけて 9〜 1 7. 596であったのに対し、ケラタン硫酸四糖（ I ) 一 5分前投与群では、 8. 6〜 36. 5%の高い足浮腫抑制率が算出された。また、ケラタン硫酸四糖（ I ) 一 3時間前投与群では、一 8. 1〜24. 4%であった。一方、デキサメサゾン投与群では、 3 1. 7〜 58. 1 %の高い足浮腫抑制率であった。

(3) ラッ卜の力ラゲニン胸膜炎モデルを用いた抗炎症作用試験

抗炎症剤の評価に一般的に用いられる炎症モデルであるラッ卜のカラゲニン胸膜炎モデルを使用して、ケラタン硫酸ォリゴ糖の作用を検討した。

試験には、体重約 1 50〜 170gの S. D.ラット（雌） 37匹を使用した。ス -力ラゲニン（シグマ社製）を生理食塩液で 2%濃度に溶解し、 0.8〃mのフィルターで濾過をした。得られた力ラゲニン溶液を 1 00 1/匹の割合いで、ラットの胸腔内に投与し、胸膜炎モデルを作製した。

上記胸膜炎モデルラット 1 9匹に、 PB Sに溶解したケラタン硫酸四糖（ I ) を、 20mg/kgまたは 1 Omg/kgの投与量で皮下（S. C. ) 投与した。また、陽性対照として上記ラット 8匹にステロイド剤（齚酸デキサメサゾン（万有製薬（株））を、臨床投与量である 150 i/g/kgで皮下投与した。陰性対照として、 10匹に PB Sを皮下投与した。各々の投与は、力ラゲニン投与直後に行った。投与区分をまとめると、表 10の通りである。表 10 投与群被検物質投与用量投与部位

① n=10 ケラタン硫酸四糖（I) 2mg/ml lOmg/kg s. c.

② n= 9 ケラタン硫酸四糖（I) 4mg/ml 20mg/kg S. C.

③ n= 8 齚酸テ 'キサ 'バン 30/ g/ml 150 zg/kg S. C.

④ n=10 PBS (陰性対照） S. C.

各々のラットを、ス-力ラゲニン投与後 6時間後に解剖した。ラットの胸腔を開放し、ゾンデ付き 2m 1シリンジで貯留した胸水を採取した。その後、 1m lの生理食塩液で胸腔内を洗浄し、洗浄液を回収した。シリンジで回収された胸水液量を測定し、さらに胸水中の白血球数（細胞数）を自動血球計算装置で測定した。結果を、各々図 8、 9に示す。図中、 *及び * *は、それぞれ ρ〈0·05、 ρ<0.01 (Ρはダンカンテストにおける危険率）で有意差があることを表す。

図 8に示されるように、ケラタン硫酸四糖（ I ) 10mg/kg投与群の胸水液量は、陰性対照群と比べ有意に少なかったが、ケラタン硫酸四糖（ I ) 20mg/kg投与群と比べ差が無く、用量依存性は認められなかった。酢酸デキサメサゾン投与群の胸水液量は、陰性対照群に比べて有意に少なかった。また、胸水中の白血球数は、ケラタン硫酸四糖（ I ) 10mg/kg投与群及び 20rag/kg投与群のいずれも陰性対照群と比べ有意に少なく、用量依存的に減少した（図 9) 。酢酸デキサメサゾン投与群の白血球数は、対照群と比べ有意に少なかった（図 9) 。

上記結果から、ケラタン硫酸四糖（ I ) はラッ卜の力ラゲニン胸膜炎モデルに対して抗炎症作用を示すことがわかる。

(4)モルモット好中球の活性酸素（0 ）産生抑制作用

生理食塩水に溶解したグリコーゲン（Type II、 Oyster；シグマ社製）の 0. 2 %水溶液を高圧蒸気滅菌後、 5週齢の Hartley系モルモット（雌；日本エスエルシ一社より購入）の腹腔内に 2 Om 1投与した。投与の 1 6時間後にモルモッ卜を脱血死させ、へパリン 1 O UZm ]を含む生理食塩液 2 Om 1を腹腔内に注入し、腹腔浸出液を回収した。以後、インキュベート時以外は全て氷冷下で操作した。回収した液を lOOOrpniで 1 0分間遠心分離し、得られた沈渣を精製水で 3 0秒間溶血させた後、これを 2倍濃度のハンクス液（フエノールレツド不含；日水製薬製）で等張にもどし、更に lOOOrpniで 1 0分間遠心分離した。得られた沈渣をハンクス液に懸濁させ、遠心分雜する操作を 2回行い、好中球を得た。

採取したモルモット好中球をハンクス液に懸濁させ、血球測定装置 (System -2000；東亜医用電子（株）製）により白血球数を測定し、ハンクス液で 2 X 1 0 ⁶個 m 1に希釈したものを細胞浮遊液として測定に用いた。細胞浮遊液 l m 1 と上記実施例 1で調製された精製ケラタン硫酸オリゴ糖（ケラタン硫酸四糖（ I )、ケラタン硫酸五糖（II) またはケラタン硫酸二糖（III) ) の 1 0 1を混和した後、 3 7てで 1時間のプレインキュベーションを行った。その後、これに 1. 6 mMのチトクローム c (Type III, Horse Heart; シグマ社製）液 5 0 1、 1 0 0 /iMの N—ホルミル- Met-Leu-Phe (以下 FML Pともいう。シグマ社製） 1 0 1を順番に加え、混和した。これを 3 7 で 1 0分間ィンキュベートした後、氷冷して反応を停止させ、 3000rpmで 5分間の遠心分雜を行つた。

遠心分離で得られた上清を取り出し、その 5 5 0 nmにおける吸光度を測定して、 1 0分間のインキュベート後の 2 X 1 0⁶細胞当たりの還元型チトクローム c 量を求めた。活性酸素（ΟΓ ) が産生されると、還元型チトクローム c量が増加する。なお、組換ヒ卜 S OD (recombinant human superoxide disrautase) を終濃度で 2 0 u g/m 1添加したものをブランクとした。また用いたモルモッ卜は 6匹であり、それぞれ独立に実験した。対照群（ケラタン硫酸オリゴ糖を添加しないもの）における還元型チトクローム c量を 1 00 %としたときの各ケラタン硫酸オリゴ糖添加群の割合をそれぞれ算出し、対照群との差を活性酸素（ΟΓ) 産生抑制率（％) として算出し、さらに各実験の平均を求めた。結果を図 1 0に示す。なお、図中の各ケラタン硫酸オリゴ糖の濃度は終濃度である。

この結果より、ケラタン硫酸四糖（ I ) は 0. 0 1、 0. 1及び 1. OmgZ m 1の濃度で、濃度依存的に顕著に活性酸素（0₂— )産生を抑制していることがわかり、これは、ケラタン硫酸四糖（I)が抗炎症作用を有することを支持するものである。また、ケラタン硫酸二糖（III) およびケラタン硫酸五糖（Π) も、わずかながら活性酸素の産生抑制作用が認められた。この結果から、ケラタン硫酸オリゴ糖は好中球の活性酸素（o ) の産生を抑制することにより、抗炎症作用を発揮することが示唆された。〈抗アレルギー作用〉

アレルギー性結膜炎を惹起させたモルモッ卜に、各種ケラタン硫酸オリゴ糖を点眼し、その効果を検討した。

(1) アレルギー性結膜炎に対するケラタン硫酸四糖（I) の効果

トルエン · ジイソシアナ一ト（toluene diisocyanate, 以下 TD Iという）を酢酸ェチルで 10%濃度に希釈した。得られた 10%TD Iを体重約 900〜10 00 gの Hartley系モルモット（雌） 10匹の左右真前庭（ 10 1ノ匹）に 1日

1回、 5日間塗布し、 TD I感作モデルを作製した。 TD I感作モデルの左眼に、実施例 1で調製した精製ケラタン硫酸四糖（I) の PBS溶液（lOOmg/ral) を、右眼には対照として PBSを点眼した。点眼用量は、いずれも点眼容器からの 1 滴（48±4,6〃 1 (S.D. )) とした。 10分後、両眼に 10%TD Iを 6. 5 1点眼し、結膜炎を惹起させた。 5分間放置した後、さらに左眼にケラタン硫酸四糖

( I ) の PB S溶液（lOOmg/ml) を、右眼には P B Sを点眼した。 15分後、両眼を観察した。結膜炎の程度は、充血、浮腫、流涙の 3項目について 0、 + 1、 + 2、 +3の 4段階の評点で段階付けをした。結果として評点の平均値を標準偏差と共に図 1 1に示す。尚、図中 *は、 pく 0.05 (pは X ²検定における危険率）で有意差があることを表す。

その結果、ケラタン硫酸四糖（I) は、観察した充血、浮腫、流涙の 3項目全てについて抑制する傾向にあり、特に浮腫については対照に比べ有意に抑制した。

( 2 ) ァレルギ一性結膜炎に対する各種ケラタン硫酸ォリゴ糖の効果

上記（1) と同様に作成した各群 10匹ずつの TD I感作モデルの左眼に、被検物質として上記実施例 1で調製した精製ケラタン硫酸二糖（ΠΙ) 、ケラタン硫酸四糖（I) またはケラタン硫酸五糖（II) の PBS溶液（いずれも 6.0ragZml) を点眼し、右眼には対照として PBSを点眼した。結膜炎の程度は上記（1) と同様に評価した。結果として評点の平均値を標準偏差と共に図 12に示す。尚、図中 *は、 p<0.05 (pは X ²検定における危険率）で有意差があることを表す。その結果、ケラタン硫酸二糖（III) 、ケラタン硫酸四糖（I)及びケラタン硫酸五糖（II) のいずれもが、充血、浮腫、流涙の 3項目全てについて、これを抑制する傾向にあり、特にケラタン硫酸四糖（I) については、浮腫を有意に抑制する効果を示すことがわかった。

(3) アレルギー性結膜炎に対する各種濃度のケラタン硫酸四糖（I) の効果上記（1) と同様に作成した各群 10匹ずつの TD I感作モデルの左眼に、被検物質として実施例 1で調製した精製ケラタン硫酸四糖（ I ) を各種濃度（GnigZ ml、 3mg/mU 1.5mg/mlまたは 0.75mg/nil) で含有する P B S溶液を点眼し、右眼には対照として PBSを点眼した。結膜炎の程度は上記（1) と同様に評価した。結果として評点の平均値を標準偏差と共に図 13に示す。尚、図中 *は、 pく 0.05 (pは検定における危険率）で有意差があることを表す。

その結果、いずれの濃度のケラタン硫酸四糖（1) PBS溶液においても、充血、浮腫、流涙の 3項目全てについて抑制する傾向にあり、特に GmgZm 3mg/ ml及び 1.5mg/mlの濃度のケラタン硫酸四糖（I) PBS溶液は、浮腫について有意な抑制効果を示した。

〈免疫調節作用 ·細胞の分化誘導作用 ·アポトーシス誘導作用〉

自己免疫疾患モデルマウスである MRLマウスに対する、ケラタン硫酸オリゴ糖の効果を検討した。

( 1 ) リンパ節重量抑制作用

(1— 1) MR Lマウスにおけるケラタン硫酸四糖（I) の 4週間反復筋肉内投与試験

MRL— lpiVlprマウスに、実施例 1で調製した精製ケラタン硫酸四糖（I) の PBS溶液（lOOmg/ml)を 1回 10mg/kg体重となるように（以下、投与群という）、また対照として PBSを、それぞれ 5回ノ週で 4週間、大腿筋内に注射した。その後マウスを解剖し、脾臓および腸間膜リンバ節の重量を測定し平均重量を求めた。結果を標準誤差と共に表 11に示す。なお表中の nは、用いたマウスの匹数を示す。表 1 1

その結果、ケラタン硫酸四糖（I) を注射した群において、脾臓および腸間膜リンパ節の重量増加抑制傾向が認められ、ケラタン硫酸四糖（ I ) の免疫調節作用が示唆された。

(1 -2) MR Lマウスにおけるケラタン硫酸二糖（III) の 28日間反復筋肉内投与試験

MRL-lpr/lprマウスに、実施例 1で調製した精製ケラタン硫酸二糖（III) の PBS溶液を 1回 lmg/kg体重、 5mg/kg体重または 25mg/kg体重となるように（以下、それぞれ lmg/kg投与群、 5mg/kg投与群、 25mg/kg投与群という）、また対照として PBSを（以下、対照群ともいう）、それぞれ 7回/週で 4週間、大腿筋内に注射した。その後マウスを解剖し、顎下リンパ節の重量を測定し平均重量を求めた。結果を標準誤差と共に図 14に示す。なお用いたマウスは各群とも 6匹であった。また、図中 *は、 pく 0.05 (pは Bonferroni多重比較検定における危険率）で有意差があることを示す。

この結果、いずれの投与量のケラタン硫酸二糖（III)投与群においても顎下リンパ節の重量増加抑制効果が認められ、特に 5mgZkg投与群においては対照群と比較して有意な重量増加抑制効果が認められ、ケラタン硫酸二糖（ΠΙ) が免疫調節作用を有することが示唆された。 (1 -3) MR Lマウスにおけるケラタン硫酸二糖（III) の 56日間反復筋肉内投与試験

MRL-lpr/lprマウスに、実施例 1で調製した精製ケラタン硫酸二糖（III) の P B S溶液を 1回 2· 5mg/kg体重、 5mg/kg体重または 10mg/kg体重となるように (以下、それぞれ 2.5rag/kg投与群、 5mg/kg投与群、 10mg/kg投与群という）、また対照として PBS (以下、対照群ともいう）を、それぞれ 7回 Z週で 8週間、大腿筋内に注射した。その後マウスを解剖し、腸間膜リンノぐ節及び顎下リンハ°節の重量を測定しそれぞれ平均重量を求めた。腸間膜リンパ節に関する結果を図 15 に、顎下リンパ節に関する結果を図 16に、それぞれ標準誤差と共に示す。なお用いたマウスは各群とも 7匹である。

この結果、ケラタン硫酸二糖（III) の 2.5π^ Ί¾投与群において腸間膜リンパ節の重量抑制効果が、 lOmgZkg投与群において腸間膜リンパ節及び顎下リンパ節の重量増加抑制効果が認められ、これによりケラタン硫酸二糖（III) の免疫調節作用が示唆された。

( 2 ) 細胞の分化誘導作用

(2-1)細胞染色濃度を指標とした細胞の分化誘導の解析

MRL-lpr/lprマウスに、実施例 1で調製した精製ケラタン硫酸二糖（III) の PBS溶液を 1回 lmg/kg体重、 5rag/kg体重または 25mg/kg体重となるように（以下、それぞれ hig/kg投与群、 5mg/kg投与群、 25rag/kg投与群という）、また対照として PBS (以下、対照群ともいう）を、それぞれ 7回 Z週で 4週間、大腿筋内に注射した。その後マウスを解剖し、腸間膜リンパ節及び顎下リンパ節の切片標本（HE染色）を作製した。この標本について画像解析装置（P I AS製）を用いて、単位面積当たりの染色濃度を解析した。なお、未分化の細胞は細胞質の割合が多く、核も薄く染色されるために、単位面積当たりの染色濃度は低い。分化した細胞は、核の占める割合が大きく、かつ核も濃く染色されるため、単位面積当たりの染色濃度は高い。

腸間膜リンパ節における解析結果を図 17に、顎下リンパ節における解析結果を図 18に、それぞれ標準誤差と共に示す。尚、図中 * *は、 p<0.01 (pは Bonfe rroni多重比較検定における危険率）で有意差があることを表す。なお、用いたマウスは、ずれも 6匹であつた。

この結果、上記いずれの投与量のケラタン硫酸二糖（III)投与群においても単位面積当たりの染色濃度の增加（相対明度の減少）が認められ、特に 5mg/kg投与群及び ZSragZkg投与群においては、対照群と比較して有意な染色濃度の増加が見られた。このことは、ケラタン硫酸二糖（ΙΠ) によって分化した細胞が増加したことを示しており、ケラタン硫酸二糖（III)が細胞の分化誘導作用を有することが示された。

(2-2) リンパ節のリンパ球表面抗原を指標とした分化誘導の解析

MRL-lpr/lprマウスに、実施例 1で調製した精製ケラタン硫酸二糖（III) の P B S溶液を 1回 2.5rag/kg体重、 5mg/kg体重または 10mg/kg体重となるように

(以下、それぞれ 2.5rag/kg投与群、 5mg/kg投与群、 10rag/kg投与群という）、また対照として PBS (以下、対照群ともいう）を、それぞれ 7回ノ週で 8週間、大腿筋内に注射した。その後マウスを解剖し、リンパ節を cell strainer (Falcon 2350)上ですりつぶし、リンパ球細胞を調製した。調製した各投与群のリンパ球についてそれぞれ抗 CD 3抗体（生化学工業（株）製）及び抗 CD 4抗体（ファーミンジユン製）を用いた二重免疫染色、抗 CD3抗体と抗 CD8 a抗体（ファ一ミンジヱン製）を用いた二重免疫染色、及び、抗 CD 3抗体及び抗 B 220抗体（ファーミンジヱン製）を用いた二重免疫染色を行った。なお、 CD3、 CD 4及び CD 8 aは T細胞に発現する細胞表面抗原であり、 Β 220は Β細胞に発現する細胞表面抗原である。また、ヌル（null) のリンパ球細胞には、これら細胞表面抗原の発現は見られないことが知られている。

全リンパ球細胞に対する、 CD3及び CD4陽性細胞（以下、 CD3+CD4+細胞ともいう；主にヘルパー T細胞）の割合（％) を標準誤差と共に図 19に、 CD 3 及び CD 8 a陽性細胞（以下、 CD3+CD8a+細胞ともいう；主にサブレッサ一 T細胞及び細胞障害性 T細胞）の割合（％) を標準誤差と共に図 20に、また CD 3及び B 220陽性細胞（以下、 CD3+B220+細胞ともいう； T細胞でありながら B細胞の表面抗原を有する異常な細胞）の割合（％) を標準誤差と共に図 21にそれぞれ示す。尚、図中 *は、 p<0. 05 (pは Ryan多重比較検定における危険率）で有意差があることを表す。なお用いたマウスは各群とも 7匹であった。

図 1 9より、ケラタン硫酸二糖（I II) の lOmgZkg投与群において、対照群、 2. 5mgZkg投与群及び 5mgZkg投与群に対する有意な CD3+CD4+細胞の増加が見られることがわかる。このことは、ヌル（null) のリンパ球細胞が相当量のケラタン硫酸二糖（I I I) の投与により CD3+CD4+細胞に分化したことを示している。

図 2 0より、ケラタン硫酸二糖（I II) の lOmgZkg投与群において、対照群、 2. 5mgZkg投与群及び 5mgZkg投与群に対して、 CD3+CD8a+細胞の増加が見られることがわかる。このことは、ヌル（null) のリンパ球細胞が相当量のケラタン硫酸二糖（III) の投与により CD3+CD8a+細胞に分化したことを示している。

図 2 1より、ケラタン硫酸二糖（III) の lOmgZkg投与群において、対照群、 2. 5mgZkg投与群及び 5mgZkg投与群に対する CD3+B220+細胞の減少が見られた。このことは、相当量のケラタン硫酸二糖（III) の投与により CD3+B220+細胞という異常な細胞が減少したことを示しており、正常なリンパ球細胞への分化が誘導されたことを支持する結果である。

以上の結果から、ケラタン硫酸二糖（I I I) に細胞の分化誘導作用があることが示された。

( 3 ) アポトーシス誘導作用

MR L - lpr/lpr マウスに、実施例 1で調製した精製ケラタン硫酸二糖（II I) の P B S溶液を 1回 lmg/kg体重、 5mg/kg体重または 25mg/kg体重となるように（以下、それぞれ lmg/kg投与群、 5mg/kg投与群、 25mg/kg投与群という）、また対照として P B Sを（以下、対照群ともいう）、それぞれ 7回 Z週で 4週間、大腿筋内に注射した。その後マウスを解剖し、顎下リンパ節の切片標本（Gavrieliらの方法により染色； Terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT) -mediated nick e nd labeling method; J. Cell Biol. , 119, 493-501 (1992)) を作製した。この染色方法は、断片化した D N Aの末端を検出することにより、アポトーシスを引き起こした細胞が検出できる方法である。この標本を光学顕微鏡で観察し、単位面積当たりの染色細胞数（アポトーシスを起こした細胞。以下単にアポトーシス細胞ともいう。）を測定した。結果を標準誤差と共に図 2 2に示す。尚、図中 * は Pく 0. 05、 * *は p<0. 01 (pは Bonferroni多重比較検定における危険率）で有意差があることを表す。なお用いたマウスは各群とも 6匹であった。

この結果から、いずれの投与量のケラタン硫酸二糖（I II) 投与群においてもァポトーシス細胞数の増加が認められ、特に 5mg/kg投与群においては、対照群に対して有意なアポトーシス細胞数の増加が認められることがわかる。

また、上記各群のマウスの顎下リンパ節の切片標本（H E染色）も作製し、光学顕微鏡でアポトーシス小体 (apoptic body) の有無を観察した。その結果上記いずれの投与量のケラタン硫酸二糖（Ι Π) 投与群にもアポトーシス小体が散在しているのが観察された。

これらの結果より、ケラタン硫酸二糖（II I) が、アポトーシス誘導作用を有するとが示された。

以上の結果から、ケラタン硫酸オリゴ糖の免疫調節作用、細胞の分化誘導作用およびアポトーシス誘導作用が確認された。実施例 3 軟奢常法により日本薬局方親水軟裔に、実施例 1で調製した精製ケラタン硫酸四糖 ( I ) を 1 O m g Zm 1の濃度で溶解し、軟膏を製造した。本軟膏は、抗炎症剤、抗ァレルギ一剤の I、ずれにも使用できる。実施例 4 点眼剤常法により、リン酸塩で P H 6 . 8〜7 . 6に調整した生理食塩液に、実施例 1で調製した精製ケラタン硫酸四糖（ I ) を 1 O m g Zm 1の濃度で、またヒアルロン酸ナトリウムを 2 m g /m 1の濃度で溶解し、点眼剤を製造した。本点眼剤は、抗炎症剤、抗アレルギー剤のいずれにも使用できる。実施例 5 リポ化剤実施例 1で調製した精製ケラ夕ン硫酸四糖（ I ) を 1 0 m g /m 1 の濃度で、レシチンを含有するリポ化剤（アクアソ一ム L A、日光ケミカルズ株式会社）に溶解し、超音波処理により包接させた。本リポ化剤は、抗炎症剤、抗アレルギー剤、免疫調節剤、分化誘導剤、アポトーシス誘導剤のいずれにも使用できる。実施例 6 注射剤常法により、リン酸塩で pH6. 8〜7. 6に調整した生理食塩液に、実施例 1で調製した精製ケラタン硫酸二糖（III) を 1 OmgZm 1の濃度で溶解し、 0. 22 ^c mのフィルターで無菌濾過することにより注射剤を製造した。本注射剤は、抗炎症剤、抗アレルギー剤、免疫調節剤、分化誘導剤、アポトーシス誘導剤のいずれにも使用できる。産業上の利用性本発明の精製高硫酸化ケラタン硫酸オリゴ糖画分は極めて精製度が高く、ェンドトキシン、核酸、蛋白質、プロテアーゼ、上記オリゴ糖以外の他のグリコサミノグリカン類等を実質的に含まないため、新規な抗炎症剤等の医薬品として利用できる。

Claims

請求の範囲

1 . ケラタン硫酸ォリゴ糖及び Z又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する抗炎症剤。

2 . シアル酸及び又はフコースを含みうる硫酸化された N—ァセチルラクトサミン単位を有するケラタン硫酸ォリゴ糖及び/又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する抗炎症剤。

3 . 前記ケラタン硫酸オリゴ糖が、硫酸化された N—ァセチルグルコサミンを還元末端に有する 2〜 5糖単位のオリゴ糖であって、 1分子中の少なくとも 2 個所の水酸基が硫酸化されたケラタン硫酸ォリゴ糖である請求項 1又は 2記載の抗炎症剤。

4 . 前記ケラタン硫酸ォリゴ糖が、少なくとも下記式で表される二糖を構成成分として含むことを特徵とする請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の抗炎症剤。

Gal(6S)-GlcNAc(6S)

(式中、 Galはガラクトースを、 GlcNはグルコサミンを、 Acはァセチル基を、 6Sは 6-0-硫酸エステルをそれぞれ表す。）

5 . 前記ケラタン硫酸オリゴ糖が、式（ I ) で表わされる四硫酸化 N—ァセチルラク卜サミン四糖、式（II) で表される三硫酸化 N—ァセチルラクトサミン五糖、式（I I I) で表される二硫酸化 N—ァセチルラクトサミンニ糖から選ばれることを特徴とする請求項 4記載の抗炎症剤。

Gal(6S) β l-4GlcNAc(6S) β l-3Gal(6S) β l-4GlcNAc(6S) · · · ( I ) NeuAc〜Gal 4GlcNAc(6S) 3 1-3631(65) l-4GlcNAc(6S) · · · (I I) Gal(6S) /9 1-4GlcNAc(6S) · · · ( II I)

(式中、 Galはガラクトースを、 GlcNはグルコサミンを、 Neuはノイラミン酸を、 Acはァセチル基を、 6Sは 6-0-硫酸エステルをそれぞれ表す。また、〜は α 2 , 3 結合又は α 2， 6結合を表す。）

6. ケラタン硫酸ォリゴ糖及び又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する抗アレルギー剤。

7. シアル酸及びノ又はフコースを含みうる硫酸化された Ν—ァセチルラクトサミン単位を有するケラタン硫酸オリゴ糖及び/又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する抗ァレルギ一剤。

8. 前記ケラタン硫酸オリゴ糖が、硫酸化された Ν—ァセチルグルコサミンを還元末端に有する 2〜 5糖単位のオリゴ糖であって、 1分子中の少なくとも 2 個所の水酸基が硫酸化されたケラタン硫酸ォリゴ糖である請求項 6又は 7記載の抗ァレルギ一剤。

9. 前記ケラタン硫酸オリゴ糖が、少なくとも下記式で表される二糖を構成成分として含むことを特徴とする請求項 6〜 8のいずれか 1項記載の抗ァレルギ一剤。

Gal(6S)-GlcNAc(6S)

10. 前記ケラタン硫酸オリゴ糖が、式（I)で表わされる四硫酸化 N—ァセチルラク卜サミン四糖、式（II)で表される三硫酸化 N—ァセチルラクトサミン五糖、式（III)で表される二硫酸化 N—ァセチルラクトサミンニ糖から選ばれることを特徴とする請求項 9記載の抗アレルギー剤。

Gal(6S) β l-4GlcNAc(6S) β l-3Gal(6S) β l-4GlcNAc(6S) · · · (I) NeuAc〜Gal/31- 4GlcNAc(6S)91-3Gal(6S)91- 4GlcNAc(6S) · · · (II) Gal(6S))Sl-4GlcNAc(6S) · · · (III)

(式中、 Galはガラクトースを、 GlcNはグルコサミンを、 Neuはノイラミン酸を、 Acはァセチル基を、 6Sは 6-0-硫酸エステルをそれぞれ表す。また、〜は α2, 3 結合又は α 2， 6結合を表す。）

1 1. ケラタン硫酸オリゴ糖及びノ又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する免疫調節剤。

12. シアル酸及び Ζ又はフコースを含みうる硫酸化された Ν—ァセチルラクトサミン単位を有するケラタン硫酸オリゴ糖及び又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する免疫調節剤。

13. 前記ケラタン硫酸オリゴ糖が、硫酸化された Ν—ァセチルグルコサミンを還元末端に有する 2〜 5糖単位のオリゴ糖であって、 1分子中の少なくとも 2個所の水酸基が硫酸化されたケラタン硫酸オリゴ糖である請求項 1 1又は 12 記載の免疫調節剤。

14. 前記ケラタン硫酸オリゴ糖が、少なくとも下記式で表される二糖を構成成分として含むことを特徴とする請求項 11〜13のいずれか 1項記載の免疫調節剤。

Gal(6S)-GlcNAc(6S)

(式中、 Galはガラクト一スを、 GlcNはダルコサミンを、 Acはァセチル基を、 6Sは 6 - 0-硫酸エステルをそれぞれ表す。）

15. 前記ケラタン硫酸オリゴ糖が、式（I) で表わされる四硫酸化 N—ァセチルラクトサミン四糖、式（Π)で表される三硫酸化 N—ァセチルラク卜サミン五糖、式（III) で表される二硫酸化 N—ァセチルラクトサミンニ糖から選ばれることを特徵とする請求項 14記載の免疫調節剤。

Gal(6S) β l-4GlcNAc(6S) β l-3Gal(6S) β l-4GlcNAc(6S) · · ■ (I) NeuAc〜Gal/S卜 4GlcNAc(6S);S卜 3Gal(6S) 1- 4GlcNAc(6S) · · · (II) Gal(6S)/91-4GlcNAc(6S) · · · (III) (式中、 Galはガラクトースを、 GlcNはダルコサミンを、 Neuはノイラミン酸を、 Acはァセチル基を、 6Sは 6-0-硫酸エステルをそれぞれ表す。また、〜は α2, 3 結合又は α 2, 6結合を表す。）

16. ケラタン硫酸オリゴ糖及びノ又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する細胞の分化誘導剤。

17. シアル酸及び又はフコースを含みうる硫酸化された Ν—ァセチルラク卜サミン単位を有するケラタン硫酸オリゴ糖及び Ζ又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する細胞の分化誘導剤。

18. 前記ケラタン硫酸オリゴ糖が、硫酸化された Ν—ァセチルグルコサミンを還元末端に有する 2〜 5糖単位のオリゴ糖であって、 1分子中の少なくとも 2個所の水酸基が硫酸化されたケラタン硫酸オリゴ糖である請求項 16又は 17 記載の細胞の分化誘導剤。

19. 前記ケラタン硫酸オリゴ糖が、少なくとも下記式で表される二糖を構成成分として含むことを特徵とする請求項 16〜18のいずれか 1項記載の細胞の分化誘導剤。

Gal(6S)-GlcNAc(6S)

(式中、 Galはガラクト一スを、 GlcNはダルコサミンを、 Acはァセチル基を、 6Sは 6-0-硫酸エステルをそれぞれ表す。）

20. 前記ケラタン硫酸オリゴ糖が、式（I)で表わされる四硫酸化 N—ァセチルラクトサミン四糖、式（II)で表される三硫酸化 N—ァセチルラクトサミン五糖、式（III) で表される二硫酸化 N—ァセチルラクトサミンニ糖から選ばれることを特徴とする請求項 19記載の細胞の分化誘導剤。

Gal(6S) 3 l-4GlcNAc(6S) β l-3Gal(6S) β l-4GlcNAc(6S) · · · (I ) NeuAc〜Gal/9卜 4Glc c(6S))91- 3Gal(6S)y81-4GlcNAc(6S) · · · (II) Gal(6S)ySl-4GlcNAc(6S) · · · (III) (式中、 Galはガラクトースを、 GlcNはグルコサミンを、 Neuはノイラミン酸を、 Acはァセチル基を、 6Sは 6-0-硫酸エステルをそれぞれ表す。また、〜は α 2 , 3 結合又は α 2 , 6結合を表す。）

2 1 . ケラタン硫酸オリゴ糖及びノ又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。

2 2 . シアル酸及び Ζ又はフコースを含みうる硫酸化された Ν—ァセチルラクトサミン単位を有するケラタン硫酸オリゴ糖及び又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。

2 3. 前記ケラタン硫酸オリゴ糖が、硫酸化された Ν—ァセチルグルコサミンを還元末端に有する 2〜 5糖単位のオリゴ糖であって、 1分子中の少なくとも 2個所の水酸基が硫酸化されたケラタン硫酸オリゴ糖である請求項 2 1又は 2 2 記載のアポトーシス誘導剤。

2 4 . 前記ケラタン硫酸オリゴ糖が、少なくとも下記式で表される二糖を構成成分として含むことを特徴とする請求項 2 1〜2 3のいずれか 1項記載のアポトーシス誘導剤。

Gal(6S)-GlcNAc(6S)

2 5 . 前記ケラタン硫酸オリゴ糖が、式（ I ) で表わされる四硫酸化 N—ァセチルラクトサミン四糖、式（Π) で表される三硫酸化 N—ァセチルラクトサミン五糖、式（I I I) で表される二硫酸化 N—ァセチルラクトサミンニ糖から選ばれることを特徴とする請求項 2 4記載のァポトーシス誘導剤。

Gal(6S) β l-4GlcNAc(6S) β l-3Gal(6S) β l-4GlcNAc(6S) · · · ( I ) NeuAc〜Gal ^ l-4GlcNAc(6S) 3 1- 3Gal(6S) 卜 4GlcNAc(6S) · · · (II) Gal(6S)^l-4GlcNAc(6S) · · . (Ill)

(式中、 Galはガラクトースを、 GlcNはダルコサミンを、 Neuはノイラミン酸を、 Acはァセチル基を、 6Sは 6-0-硫酸エステルをそれぞれ表す。また、〜は 2, 3 結合又はな 2, 6結合を表す。）

26. 硫酸化された N—ァセチルグルコサミンを還元末端に有する 2〜 5糖単位のオリゴ糖であって、 1分子中の少なくとも 2個所の水酸基が硫酸化されたケラタン硫酸オリゴ糖を 99%以上含有し、下記の特性を有するケラタン硫酸ォリゴ糖画分。

(a)エンドトキシンを実質的に含まず、また核酸、蛋白質、プロテア一ゼの含有量は検出限界以下である。

(b) ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、へパラン硫酸及びケラタン硫酸を実質的に含まない。

27. 少なくとも下記式で表される二糖を構成成分として含むケラタン硫酸オリゴ糖を 99%以上含有し、下記の特性を有するケラタン硫酸オリゴ糖画分。

Gal(6S)-GlcNAc(6S)

(式中、 Galはガラクトースを、 GlcNはダルコサミンを、 Acはァセチル基を、 6Sは 6-0-硫酸エステルをそれぞれ表す。）

28. 前記ケラタン硫酸オリゴ糖が、式（I) で表わされる四硫酸化 N—ァセチルラクトサミン四糖、式（II)で表される三硫酸化 N—ァセチルラクトサミン五糖、式（III) で表される二硫酸化 N—ァセチルラクトサミンニ糖から選ばれることを特徴とする請求項 26又は 27記載のケラタン硫酸オリゴ糖画分。 Gal(6S) )S l-4GlcNAc(6S) β l-3Gal(6S) β l-4GlcNAc(6S) · · · (I)

NeuAc〜Gal8卜 4GlcNAc(6S);81-3Gal(6S) l-4GlcMc(6S) · · · (II)

Gal(6S)/Sl-4GlcNAc(6S) · · · (III)

(式中、 Galはガラクトースを、 GlcNはグルコサミンを、 Neuはノイラミン酸を、 Acはァセチル基を、 6Sは 6-0-硫酸エステルをそれぞれ表す。また、〜は α 2, 3 結合又はな 2, 6結合を表す。）

29. 軟骨魚類由来の高硫酸化ケラタン硫酸をェンドー ;3— Ν—ァセチルグルコサミニダ一ゼ型ケラ夕ン硫酸分解酵素で分解後、分画して得られる請求項 2 6〜 28のいずれか一項に記載のケラタン硫酸ォリゴ糖画分。

30. ケラタン硫酸を、下記の理化学的性質：

①作用：

ケラタン硫酸に作用し、その Ν—ァセチルダルコサミニド結合を加水分解する

②基質特異性：

ケラタン硫酸 I、ケラタン硫酸 II及びケラタンポリ硫酸に作用し、主な分解物として硫酸化ケラタン硫酸二糖及び硫酸化ケラタン硫酸四糖を生じる；を有するケラタン硫酸分解酵素によつて分解するステップと、この分解生成物から下記性質を有するケラタン硫酸ォリゴ糖を分画するステツプとを含む、ケラ夕ン硫酸ォリゴ糖画分の製造法。

(Α)硫酸化 Ν—ァセチルラクトサミンを基本骨格とするケラタン硫酸オリゴ糖を主成分とする；

(Β)エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、蛋白質及びプロテアーゼの含有量は微量もしくは検出限界以下である；

(C) ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、へパラン硫酸及びケラタン硫酸を実質的に含まない。

31. 前記ケラタン硫酸分解酵素によって分解するステップにおいて、請求項 30記載の理化学的性質に加えて、下記の理化学的性質を有するケラタン硫酸分解酵素を用いることを特徴とする請求項 30記載のケラタン硫酸オリゴ糖画分の製造法。

①至適反応 p H：

4. 5〜6 (0.1M酢酸緩衝液及び lOmM トリスー酢酸緩衝液中、 37 ）；

② pH安定性：

6〜7 (0.1M酢酸緩衝液及び 10mM トリスー酢酸緩衝液中、 37 、 1時間放置）；

③至適反応温度：

50〜60て（0.1M酢酸緩衝液、 pH6.0、 10分反応）；

④熱安定性：

少なくとも 45て以下で安定（0.1M酢酸緩衝液、 p H 6.0、 1時間放置）、

32. 前記ケラタン硫酸が高硫酸化ケラタン硫酸であり、ケラタン硫酸オリゴ糖が、式（I) で表される四硫酸化 N—ァセチルラクトサミン四糖、式（II) で表される三硫酸化 N—ァセチルラクトサミン五糖、式（III)で表される二硫酸化 N—ァセチルラクトサミンニ糖のいずれかである請求項 30又は 31記載のケラタン硫酸ォリゴ糖画分の製造法。

Gal(6S) l-4GlcNAc(6S) β l-3Gal(6S) β l-4GlcNAc(6S) · · . (I) NeuAc〜Gal;Sl- 4GlcNAc(6S))Sl- 3Gal(6S)ySl-4GlcNAc(6S) · · · (II) Gal(6S)^l-4GlcNAc(6S) · · · (III)

(式中、 Galはガラクトースを、 GlcNはダルコサミンを、 Neuはノイラミン酸を、 Acはァセチル基を、 6Sは 6-0-硫酸エステルをそれぞれ表す。また、〜は α 2， 3 結合又は α 2, 6結合を表す。）