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WO1996014434A1 - Procede de sequençage de l'adn - Google Patents

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WO1996014434A1
WO1996014434A1 PCT/JP1995/002254 JP9502254W WO9614434A1 WO 1996014434 A1 WO1996014434 A1 WO 1996014434A1 JP 9502254 W JP9502254 W JP 9502254W WO 9614434 A1 WO9614434 A1 WO 9614434A1
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WO
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nucleic acid
sequence
reaction
acid transcription
rna
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Application number
PCT/JP1995/002254
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshihide Hayashizaki
Nobuya Sasaki
Original Assignee
The Institute Of Physical And Chemical Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Institute Of Physical And Chemical Research filed Critical The Institute Of Physical And Chemical Research
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Priority to CA002204378A priority patent/CA2204378C/en
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the present invention relates to a method for sequencing a DNA. More specifically, the present invention relates to a method for determining the nucleotide sequence of DNA by direct transcript sequencing using PCR. Background art
  • PCR volimase chain reaction
  • the second problem is the rapid renaturation of the PCR product.
  • the PCR product regenerates into double-stranded DNA, it is no longer a single-stranded template (type II) and prevents annealing between the primer and the single-stranded template (type III).
  • Methods to minimize regeneration include, for example, quenching after denaturation, adsorption of PCR products to biotilation and streptavidin coatings on one primer, use of exonucleases, non-target PCs R and the like have been reported [see, for example, Barbara Bachmann et al. (1990) Nucleic Acid Res. Vol. 18, 1309]. However, most of these methods are time consuming and cumbersome.
  • an object of the present invention is to eliminate the unreacted primer and 2 ′ deoxyribonucleoside 5 ′ triphosphates (2 ′ dNTPs) remaining in a PCR reaction system and to rapidly generate a PCR product.
  • An object of the present invention is to provide a completely new method for determining the nucleotide sequence of DNA, which does not require any denaturation itself in order to avoid the problem of regeneration. Disclosure of the invention
  • the present invention is a method for determining the nucleotide sequence of a DNA product amplified by the polymerase chain reaction without removing the primer and Z or 2′-deoxyribonucleoside 5′-triphosphate and Z or a derivative thereof.
  • RNA promoter In the presence of a DNA product amplified by the volimase chain reaction comprising RNA promoter and a promoter sequence for the RNA polymerase,
  • Ribonucleoside 5 'triphosphates consisting of ATP, GTP, CTP and UTP or derivatives thereof and one or more of 3' dATP, 3 'dGTP, 3' dCTP, 3 'd UTP and derivatives thereof 3 ′ deoxyribonucleotide 5 ′ triphosphate (3 ′ dNTP derivative) to obtain a nucleic acid transcript, the resulting nucleic acid transcript is separated, and the nucleic acid sequence is obtained from the obtained separated fraction.
  • the method for determining the nucleotide sequence of DNA characterized by reading the
  • the present invention has solved the problem in the direct sequence method, and it has been proposed that the RNA transfer reaction of RN such as ⁇ 7 RN ⁇ polymerase and the like be completed with the terminus of RNA transcription reaction (for example, 3 '
  • the present invention relates to a direct transcript sequence method using xyribonucleoside 5 'triphosphate (3' dNT P s)).
  • FIG. 1 shows the direct transcript sequence obtained in Example 1.
  • 6 is an electrophoretic photograph showing the result of autoradiography by a squeezing method.
  • FIG. 2 shows the result of an electropherogram obtained by the fluorescence direct transcript quenching method obtained in Example 2.
  • the present invention provides a primer sequence for polymerase chain reaction and Z or 2′-deoxyribonucleotide 5 ′ triphosphonate X- and Z or a derivative thereof. It is a method of determining without removing.
  • DNA polymerase chain reaction As the DNA polymerase chain reaction used here, a method widely used as a PCR method can be used as it is. Therefore, there are no particular restrictions on the DNA sequence to be amplified, primers, conditions for amplification, and the like.
  • reaction system 10 to 50 ng of genomic DNA or 1 pg of cloned DNA, 10 M of each primer, 200 M of each 2′-deoxyribonucleoside 5 ′ triphosphate (DATP, dGTP, dCTP, dTTP) can be carried out in a 20 n1 volume using DNA polymerase, for example, Taq polymerase or the like.
  • DNA polymerase for example, Taq polymerase or the like.
  • either one of the primers for the polymerase chain reaction or the amplified insert DNA must contain the promoter sequence for RNA polymerase described below.
  • the promoter sequence for RNA volimerase can be appropriately selected depending on the RNA polymerase used.
  • a nucleic acid transcript such as an RNA transcript is synthesized from a DNA product amplified by a polymerase chain reaction.
  • the amplified DNA product contains a promoter sequence for RNA volimerase.
  • this promoter sequence activates RNA volumease during the synthesis of nucleic acid transcripts such as RNA transcripts.
  • RNA polymerases used for the synthesis of nucleic acid transcripts such as RNA transcripts include, for example, Pacteriophage RNA vomerase (T7, D3 and ⁇ ? 6). I can do it. Noctophage RNA polymerase is widely used for the in vitro synthesis of RNA transcripts from cloned DNA templates. These phage RNA vomerases specifically transcribe DNA sequences downstream from their promoters. CP. A. rieg et al. (1987) Methods in Enzymology 155, 397-415].
  • Synthesis of a nucleic acid transcript such as an RNA transcript can be performed in the presence of the RNA polymerase by using a ribonucleoside 5 ′ triphosphate (NTP) composed of ATP, GTP, CTP, UTP, or a derivative thereof, and one type thereof. Alternatively, two or more 3 'dNTP derivatives are reacted.
  • NTP ribonucleoside 5 ′ triphosphate
  • the 3 'dNTP derivative is used herein as a generic term for 3' dATP, 3 'dGTP, 3' dCTP, 3 'd UTP, and derivatives thereof.
  • NTPs ribonucleoside 5 'triphosphates
  • at least four types of compounds having different bases are required for the synthesis of transcripts, even if some of them are derivatives such as ATP.
  • two or more compounds containing the same base can be used.
  • RNA or nucleic acid that is a transcription product By incorporating a 3 ′ dNTP derivative into the 3 ′ end of RNA or nucleic acid that is a transcription product, a 3 ′ hydroxy group is lost, and the synthesis of RNA or nucleic acid is inhibited. As a result, RNAs or nucleic acid fragments of various lengths whose 3 ′ end is a 3 ′ dNTP derivative are obtained.
  • Such ribonucleoside analogs are obtained for each of the four types of 3 ′ dNTP derivatives having different bases. By preparing four types of this ribonucleoside / analog, it can be used for determination of RNA or nucleic acid sequence.
  • One or more 3 ′ dNTP derivatives can be used in one nucleic acid transcription reaction.
  • the nucleic acid transcription reaction is performed four times to obtain four types of transcription products having different bases of the 3' dNTP derivative at the 3 'end. obtain.
  • a transcription product that is a mixture of various RNAs or nucleic acid fragments having the same 3 ′ dNTP derivative at the 3 ′ end and different molecular weights is obtained.
  • the resulting four transcription products can be independently subjected to separation and sequence reading described below. Also, two or more of the four types of transcription products can be mixed, and this mixture can be subjected to separation and sequence reading.
  • two or more types of 3 'dNTP derivatives are used simultaneously in one nucleic acid transcription reaction, two or more types of transcription products with different bases of the 3' dNTP derivative at the 3 'end can be contained in one reaction product. The product will be included. This can be subjected to separation and sequence reading described below. It is preferable to use two or more types of 3 ′ d NTP derivatives simultaneously in the nucleic acid transcription reaction because the number of operations of the nucleic acid transcription reaction can be reduced.
  • a primer having a phage-bubble motor sequence in one of two types of primers is used, or the amplified DNA is inserted into the inserted DNA.
  • the resulting PCR product can be subjected to in vitro transcription using an RNA polymerase that works by its promoter.
  • transcription of a nucleic acid such as RNA is performed by RNA polymerase in the presence of four types of ribonucleoside 5 ′ triphosphates having different bases, and is terminated by a 3 ′ dNTP derivative.
  • RNA or nucleic acid ladder is generated for the sequence.
  • RNA or nucleic acid transcription products are separated.
  • This separation can be appropriately performed by a method capable of separating a plurality of product molecules having different molecular weights contained in the transcription product according to the molecular weight.
  • An example of such a separation method is electrophoresis.
  • HPLC and the like can be used.
  • the RNA or nucleic acid sequence can be read from the band (RNA or nucleic acid ladder) obtained by subjecting the transcription product to electrophoresis.
  • Reading of the RNA or nucleic acid ladder can be performed by labeling ribonucleoside 5 ′ triphosphates (NTPs) used in the transcript reaction.
  • the reading of the RNA or the nucleic acid ladder can also be performed by labeling the 3 ′ d NTP derivative used in the transcript reaction.
  • the label include a radioactive or stable isotope or a fluorescent label.
  • Radioactive or stable isotope-labeled 3 'd NTP derivatives are commercially available (e.g., 3' dATP (CORDYCEPIN 5'-TRIPHOSPHINE) is available from SIGMA, ST. LOUIS, MO, USA under Product No. Product No.
  • the transcription product is subjected to electrophoresis.
  • the sequence of the transcription product can be read by detecting the radioactive or stable isotope or fluorescence of the band obtained by the application.
  • the radioactivity or the fluorescence intensity between the bands does not vary, and the measurement is facilitated.
  • detection of a radioactive or stable isotope or a ladder that generates fluorescence can be performed, for example, by appropriately using an apparatus conventionally used for a DNA sequence sink.
  • the sequence can be read.
  • 3 'dATP, 3' dGTP, 3 'dCTP and 3' d UTP labeled with different fluorescence the ends are 3 'dATP, 3' dGTP, 3 'dCTP or 3' dUTP, and different labels are made.
  • the mixture of the various transcription product fragments can be subjected to electrophoresis to detect the four types of fluorescence of the bands obtained, thereby allowing the sequence of the RNA or nucleic acid to be read.
  • the sequence of the DNA used as transcription type II can be determined. If a ladder is formed for each base, the RNA or nucleic acid sequence information obtained from the four ladders is integrated. Thus, the sequence of the DNA used as the transcription type II can be determined. In addition, when ladders are formed simultaneously with two or more bases (when two or more base bands coexist in the same ladder), the RNA or nucleic acid sequence obtained from each ladder Collectively, the information can be used to determine the sequence of the DNA used as transcription type II. In particular, when ladders are formed simultaneously for four bases (bands of four bases coexist in the same ladder), transcription of RNA or nucleic acid sequence information obtained from one ladder is used. The sequence of the DNA used as type ⁇ can be determined.
  • the DNA base sequence of the PCR product can be directly determined without purifying the PCR product.
  • RNA volimerase This advantage is characteristic of RNA volimerase in that the 2 'd NTP remaining in the reaction mixture is not consumed as a reagent in the RNA transcription reaction in the presence of 3' d NTP for sequencing. It is due to.
  • the transcription reaction of RNA since the transcription reaction of RNA is used, it is not necessary to use a single-stranded template DNA as in the ordinary DNA sequence method, and no primer is required. No denaturing step is required for hybridization. Therefore, the nucleotide sequence of DNA can be easily determined without being affected by the regeneration of the PCR product.
  • the present invention will be further described with reference to Examples.
  • a human TSHyS chain fragment conjugated to a Bluescript II vector was used as a template for the PCR reaction.
  • This DNA fragment contains l pg, 10 M of each primer (T7 primer and ⁇ 13 reverse primer), and 200 ⁇ of each 2′-deoxyribonucleoside 5 ′ triphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Made in volume.
  • a Taq polymerase buffer [50 mM KC1, 1 OmM Tris.HC1 (pH 8.3), G3 mM MgC ", 0.01% gelatin] and 0.5 units of Taq volimerase.
  • the first cycle is 5 minutes at 95 e C (denaturation), 1 minute at 55 to 60 ° C (annealing), and 2 min at 72 ° C (extension). This cycle was followed by 25-30 cycles of 95 minutes for 1 minute, 55-60 minutes for 1 minute, and 72'C for 2 minutes. The last extension step was extended to 10 minutes.
  • RNA was added to the sampling tube containing RNA polymerase to make the total volume 10 / l.
  • the mixture was heated at 80 ° C for 5 minutes, immediately applied to a 6% sequence gel, and filled in a lane. Electrophoresis was performed at a constant power of 30 W for 2 hours. The gel was dried on paper and analyzed with a BAS 2000 image analyzer (FUJ I).
  • a PCR reaction was performed in the same manner as in Example 1 to obtain a PCR reaction product, and the following sequencing was performed on the PCR reaction product.
  • the sample obtained is 37. Incubated with C for 30 minutes. Next, excess fluorescently labeled 3 'dUTP is removed by phenol // chloroform extraction, ethanol precipitation, etc., and the precipitate is dissolved in 31 formamide dye (95% formamide, 1 OmM EDTA), 80. The mixture was heated at C for 5 minutes, immediately applied to a 4% sequence gel, and electrophoresed on an ABI 377 fluorescence automatic sequencer for 7 hours. As a result, as shown in FIG. 2, an elect opening ferogram of U was generated by the above-described protocol.
  • 3'-Deoquin-5'-0-dimethoxytritylperidine (9.02 g) was dissolved in pyridine (100 ml), and acetic anhydride (30 ml) was added under ice-cooling. I let it. After completion of the reaction, the reaction solution was concentrated under reduced pressure, the obtained residue was extracted with ethyl acetate, and the extract was washed with saturated saline.
  • N-propargyl trifluoroacetamide (0.88 ml) was added to a solution of 2'-0-acetyl-3'-dexoxy-5-odouridine (1.0 g) in DMF (12.6 ml) in a nitrogen stream.
  • Copper (I) iodide (96 mg), bis (triphenylphosphine) palladium (H) (177 mg) and triethylamine (0.7 ml) were added, and the mixture was reacted at room temperature for 4 hours.

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Description

明細書
DN Aの塩基配列決定方法 技術分野
本発明は、 DNAの塩基配列決定法に関する。 さらに詳しくは、 PCR法を利 用した、 ダイレクト · トランスクリプトシークェンシング法による DNAの塩基 配列決定方法に関する。 背景技術
ボリメラーゼ連鎖反応（PCR) 法は優れた方法であり、 年々その利用範囲が 広がっている (Randall Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491 〕 。 P CR法では、 1分子の DNA断片を増幅することもできる。 PCR法で増幅した 生成物をシークェンスする方法 （ダイレクト ·シークェンス法） も有用な手法で ある CCorinne Wong et al. (1988) Nature, 330, 384-386〕 。 この方法はライ ブラリ一作製やそのスクリーニングなしに多くのサンブルの配列情報を同時に得 られる迅速な方法である。
しかるに、 上記ダイレクト ·シークェンス法には 2つの大きな問題点がある。
1つは、 取り込まれなかったプライマ一及び 2'デォキシリボヌクレオシド 5' ト リフォスフヱート （2' dNTP s) が反応系中に残存し、 これらがシークェンス 反応を妨げることである。 従って、 従来法では、 これら残存するプライマーと 2' dNTP sは、 シークェンシングの前に P C R生成物から除去する必要があつた。
PCR生成物の精製方法には種々の方法があり、 例えば、 電気泳動による精製法、 エタノール沈殿法、 濾過法、 HP LC精製法がある 〔例えば、 Dorit . L et al. (1991) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. II, John Wiley and Sons, New York, 15.2.1-15.2.11参照〕 。 しかし、 いずれの方法も煩雑である。
2つ目の問題は、 PCR生成物の迅速な再生 （renaturation) である。 PCR 生成物が 2本鎖 DNAに再生してしまうと、 1本鎖のテンプレート （铸型） では なくなり、 プライマーと 1本鎖テンプレート （铸型） との間のアニーリングを妨 げる。 再生を最小限にするための方法として、 例えば変性後の急冷、 1つのブラ イマ一のピオチレーシヨン （biotilation ) とストレプトアビジン被覆物への P CR生成物の吸着、 ェキソヌクレアーゼの使用、 非対象 PC R等が報告されてい る 〔例えば、 Barbara Bachmann et al. (1990) Nucleic Acid Res. Vol.18, 130 9参照〕 。 しかし、 これらの方法の殆どは、 長い時間を必要とし、 面倒である。 そこで本発明の目的は、 PCR反応系中に残存する未反応のプライマー及び 2' デォキシリボヌクレオシド 5' トリフォスフェート （2' dNTPs) を除去するこ となく、 かつ PC R生成物が迅速に再生する問題を回避する為、 変性自体を全く 行わないで良い、 全く新しい D N Aの塩基配列決定方法を提供することにある。 発明の開示
本発明は、 ポリメラーゼ連鎖反応により増幅した DNA生成物の塩基配列を、 プライマ一及び Z又は 2'デォキシリボヌクレオシド 5' トリフォスフェート及び Z 又はその誘導体を除去することなく決定する方法であって、
RN Aボリメラーゼ及び前記 RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を 含む前記ボリメラーゼ連鎖反応により増幅した DNA生成物の存在下、
ATP、 GTP、 CTP及び UTP又はそれらの誘導体からなるリボヌクレオ シド 5' トリフォスフェート類並びに 3' dATP、 3' dGTP、 3' dCTP、 3' d UTP及びそれらの誘導体からなる 1種又は 2種以上の 3'デォキシリボヌクレオ チド 5' トリフォスフェート （3' dNTP誘導体） を反応させて核酸転写生成物を 得、 得られる核酸転写生成物を分離し、 得られる分離分画から核酸の配列を読み 取ることを特徴とする D N Aの塩基配列決定方法 ίこ関する。
本発明は、 前記ダイレクト ·シークェンス法にある問題を解決したものであり、 Τ 7 RN Αポリメラ一ゼ等の RN Αボリメラ一ゼ等と RNA転写反応のターミネ 一夕一 （例えば、 3'デォキシリボヌクレオシド 5' トリフォスフェート （3' dNT P s) ) を用いたダイレクト · トランスクリプトシークェンス法に関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1において得られたダイレクト · トランスクリプトシークェン ス法によるォートラジオグラフィ一の結果を示す電気泳動写真である。
図 2は、 実施例 2において得られた蛍光ダイレクト · トランスクリプトンーク エンス法によるエレクトロフヱログラムの結果を示す。 本発明を実施するための最良の形態
本発明は、 ポリメラ一ゼ連鎖反応により増幅した DNA生成物の塩基配列を、 ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマー及び Z又は 2'デォキシリボヌクレオシ ド 5' トリフォスフ X—ト及び Z又はその誘導体を除去することなく決定する方法 である。
ここで用いる DNAボリメラーゼ連鎖反応は、 P C R法として広く用いられて いる方法をそのまま用いることができる。 従って、 増幅の対象である DN A配列、 プライマー、 増幅のための条件等には特に制限はない。
例えば、 反応系として、 1 0〜5 0 n gのゲノミック DNA又は 1 p gのクロ ーン化された DNA、 1 0 Mの各プライマー、 2 0 0〃Mの各 2'デォキシリボ ヌクレオシド 5' トリフォスフェート （d AT P、 d G T P、 d C T P、 d TT P ) を含む 2 0 n 1容量中で DNAポリメラーゼとして、 例えば T a qポリメラー ゼ等を用いて行うことができる。
但し、 ポリメラ一ゼ連鎖反応のためのプライマーのいずれか一方又は増幅され た挿入（insert) DN Aが、 後述する RNAポリメラーゼのためのプロモ一夕一配 列を含む必要がある。
RNAボリメラーゼのためのプロモーター配列は、 用いる RN Aボリメラ一ゼ により適宜選択することができる。
本発明の方法では、 ポリメラーゼ連鎖反応により増幅した DNA生成物から R NA転写物等の核酸転写物を合成する。 前記のように、 増幅して得られた DNA 生成物は、 RNAボリメラーゼのためのプロモー夕一配列を含む。 従って、 この プロモーター配列が RNA転写物等の核酸転写物の合成の際に、 R NAボリメラ ーゼを起動させる。
R N A転写物等の核酸転写物の合成に用いられる R N Aポリメラーゼとしては、 例えばパクテリオファージ RN Aボリメラーゼ （T 7、 丁3及び≤？ 6等） を挙 げることができる。 ノ<クテリオファージ RNAポリメラーゼは、 クローン化され た DNAテンプレー卜から RNA転写物の in vitroでの合成に広く用いられてい る。 これらのファージ RNAボリメラーゼは、 それらのプロモーターから下流に DN A配列を特異的に転写する CP. A. rieg et al. (1987) Methods in Enzymo logy 155, 397-415〕 。
RNA転写物等の核酸転写物の合成は、 前記 RNAポリメラーゼの存在下、 A TP、 GTP、 CTP及び UTP又はこれらの誘導体からなるリボヌクレオシド 5' トリフォスフヱート （NTP) 類、 並びに 1種又は 2種以上の 3' dNTP誘導 体を反応させる。 尚、 3' dNTP誘導体は、 本明細書においては、 3' dATP、 3' dGTP、 3' dCTP、 3' d UT P及びこれらの誘導体の総称として用いる。 リボヌクレオシド 5' トリフォスフェート （NTP)類としては、 その一部が AT P等の誘導体である場合も含めて、 塩基が異なる少なくとも 4種類の化合物が転 写物の合成に必要である。 但し、 同じ塩基を含む 2種以上の化合物を用いること はできる。
転写生成物である RNA又は核酸の 3'末端には、 3' dNTP誘導体が取り込ま れることにより、 3'ヒドロキシ基が欠落し、 RNA又は核酸の合成が阻害される。 その結果、 3'末端が 3' dNTP誘導体である種々の長さの RN A又は核酸断片が 得られる。 塩基の異なる 4種類の 3' dNTP誘導体について、 それぞれ、 このよ うなリボヌクレオシド ·アナログ体を得る。 このリボヌクレオシド■アナ口グ体 を 4通り用意することで、 RN A又は核酸配列の決定に用いることができる
[Vladimir D. Axel red er al. (1985) Biochemistry Vol. 24, 5716-5723〕 。 尚、 3' dNTP誘導体は、 1つの核酸転写反応に 1種類又は 2種以上を用いる ことができる。 1種のみの 3' dNTP誘導体を用いて 1つの核酸転写反応を行う 場合、 核酸転写反応を 4回行うことで、 3'末端の 3' dNTP誘導体の塩基の異な る 4通りの転写生成物を得る。 1回の核酸転写反応で、 3'末端の 3' dNTP誘導 体は同一で、 分子量の異なる種々の RN A又は核酸断片の混合物である転写生成 物が得られる。 得られた 4通りの転写生成物について、 独立に、 後述する分離及 び配列の読み取りに供することができる。 また、 4通りの転写生成物の 2種以上 を混合し、 この混合物を分離及び配列の読み取りに供することもできる。 1回の核酸転写反応に 2種以上の 3' d NT P誘導体を同時に用いると、 1つの 反応生成物中に、 3'末端の 3' d NT P誘導体の塩基の異なる 2通り以上の転写生 成物が含まれることになる。 これを後述する分離及び配列の読み取りに供するこ とができる。 核酸転写反応に 2種以上の 3' d N T P誘導体を同時に用いると、 核 酸転写反応操作の回数を減らすことができるので好ましい。
以上のように、 本発明のダイレクト · トランスクリプトシークェンス法では、 P C R法において、 2種類のブライマーのいずれか一方にファージブ口モーター 配列を持っているプライマーを用いるか、 又は増幅された挿入 D NA内にファー ジプロモーター配列を持たせることで、 得られる P C R生成物はそのプロモータ 一により働く RNAポリメラーゼを用いる in vi tro転写に付すことができる。 さらに、 R N A等の核酸転写が、 塩基の異なる 4種類のリボヌクレオシド 5' ト リフォスフェート類の存在下で、 RNAポリメラーゼにより行われ、 かつ 3' d N T P誘導体によりターミネートされる。 その結果、 各塩基について、 R NA又は 核酸ラダー （ladder) がシークェンスのために生成される。
本発明の方法では、 RN A又は核酸転写生成物を分離す 。 この分離は、 転写 生成物に含まれる分子量の異なる複数の生成物分子を、 分子量に応じて分離する ことができる方法で適宜行うことができる。 このような分離方法としては、 例え ば電気泳動法を挙げることができる。 その他に H P L C等も用いることができる。 電気泳動法の条件等には特に制限はなく、 常法により行うことができる。 転写 生成物を電気泳動法に付することにより得られるバンド （R N A又は核酸ラダー） から R NA又は核酸の配列を読み取ることができる。
R N A又は核酸ラダ一の読み取りは、 転写物反応に用いるリボヌクレオシド 5' トリフォスフェート （NT P)類を標識することにより行うことができる。 また、 R NA又は核酸ラダーの読み取りは、 転写物反応に用いる 3' d NT P誘導体を標 識することにより行うこともできる。 標識としては、 例えば、 放射性若しくは安 定同位元素又は蛍光標識等を挙げることができる。 放射性若しくは安定同位元素 で標識された 3' d NT P誘導体は市販品として入手可能である 〔例えば、 3' dATP (CORDYCEPIN 5' -TRIPHOSPHINE) は、 SIGMA, ST. LOUIS, MO, USAから Product No. C9137 として、 BOEHRINGER MANNHEIM, Mannheim, Germanyから Product No. 81428 8 として入手可能である。 ひ-32 Ρ-3'dATP (3'- [ひ-32 P]- CORDYCEPIN 5" -T IPH0 SPHINE) は、 DU PONT細 Research Products. A, USAから Product No. NEG-026 として入手可能である。 〕 また、 蛍光標識された 3' dNTP誘導体は、 特開昭 6 3 - 1 52364号、 特開平 7 - 5 1 70号、 特表平 5 - 50237 1号等に記 載の方法を参照して製造することにより入手可能である。
具体的には、 例えば、 標識された 3' dNTP誘導体、 より具体的には、 標識さ れた 3' dATP、 3' dGTP、 3' dCTP及び 3' dUTPを用い、 転写生成物を 電気泳動に付して得られるバンドの放射性若しくは安定同位元素又は蛍光を検出 することで、 転写生成物の配列を読み取ることができる。 このように 3' dNTP 誘導体を標識することで、 各バンド間の放射性強度又は蛍光強度にばらつきがな く、 測定が容易になる。 さらに放射性若しくは安定同位元素又は蛍光を発生する ラダーの検出は、 例えば、 これまで DNAシークェンシンクに用いている装置を 適宜用いて行うことができる。
また、 放射性若しくは安定同位元素又は蛍光標識された ATP、 GTP、 CT P及び UTPを用い、 電気泳動に付して得られるバンドの放射性若しくは安定同 位元素又は蛍光を検出することでも転写生成物の配列を読み取ることができる。 さらに、 異なる蛍光で標識された 3' dATP、 3' dGTP、 3' dCTP及び 3' d UTPを用い、 末端が 3' dATP、 3' dGTP、 3' dCTP又は 3' dUTP あり、 異なる標識がなされた種々の転写生成物断片の混合物を電気泳動に付して 得られるバンドの 4種類の蛍光を検出することで RN A又は核酸の配列を読み取 ることもできる。
この方法では、 4種類の 3' dNTPをそれぞれ異なる蛍光で標識する。 このよ うにして 3'末端の異なる 4種類の転写生成物の混合物を電気泳動に付することで、 4種類の異なる （3'末端の 3' dNTP) 応じた蛍光を発するバンドが得られ、 こ の蛍光の違いを識別しながら、 1度に 4種類の RNA又は核酸の配列を読み取る ことができる。
上記のように読み取られた R N A又は核酸配列から、 転写の铸型として用レ、ら れた DNAの配列を決定することができる。 各塩基について、 それぞれラダーを 形成した場合には、 4種類のラダーから得られた RN A又は核酸配列情報を総合 して、 転写の铸型として用いられた DNAの配列を決定することができる。 また、 2種以上の塩基にっレ、て同時にラダーを形成した場合 （同一のラダー内に 2種以 上の塩基のバンドが共存する場合） には、 各ラダーから得られた RNA又は核酸 配列情報を総合して、 転写の铸型として用いられた D N Aの配列を決定すること ができる。 特に、 4種の塩基について同時にラダーを形成した場合 （同一のラダ 一内に 4種の塩基のバンドが共存する場合） には、 1つのラダーから得られた R N A又は核酸配列情報から、 転写の铸型として用いられた D N Aの配列を決定す ることができる。
本発明の方法によれば、 PCR生成物を精製することなく、 そのまま PCR生 成物の D N Aの塩基配列を決定することができる。
この利点は、 反応混合物に残存する 2' d NT Pが、 シークェンシングのための 3' d NT Pの存在下では RNA転写反応において試薬として消費されることがな いという、 RNAボリメラーゼの特徴によるものである。
さらに、 本発明の方法では、 RNAの転写反応を利用するため、 通常の DNA シークェンス法のように 1本鎖テンプレート DNAを使用する必要も、 プライマ 一も'必要がなく、 さらにシークェンシンダプライマ一のハイブリダィズのための 変性工程も必要としない。 そのため、 PCR生成物の再生の影響も受けず、 容易 に DN Aの塩基配列を決定することができる。 以下本発明を実施例によりさらに説明する。
実施例 1
PCR反応
PCR反応のテンブレートには、 ブルースクリプト IIベクターに結合したヒト TSHyS鎖断片を用いた。 この DNA断片 l pg、 1 0 Mの各プライマー 〔T 7プライマーと Μ 1 3リバースプライマー〕 、 200 Μの各 2'デォキシリボヌ クレオシド 5' トリフォスフェート （dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP) を含む 20 1容量中で行った。 この系に T a qポリメラーゼ緩衝液 〔50mM KC 1、 1 OmM Tr i s · HC 1 (pH8. 3) 、 ト 3mM MgC "、 0. 01 %ゼラチン〕 と 0. 5ユニットの Ta qボリメラーゼを添加した。 第 1のサイクルは 95eC (変性） で 5分間、 55〜60 °C (アニーリング） で 1分間、 72°C (エクステンション） で 2分間とした。 このサイクルに次いで、 95てで1分間、 55〜60 で1分間、 72'Cで 2分間のサイクルを 25〜3 0回おこなった。 最後のエクステンションの工程は 1 0分間に延長した。
シークェンシング反応
上記 PC R反応物の 1〜5 1を、 1 0〜50 Mの 3'デォキシリボヌクレオ チド 5' トリフォスフエ一トの 1つである 3' dATPの 1つ、 1 00 Mの各リボ ヌクレオシド 5' トリフォスフェート （ATP、 GTP、 CTP、 UTP)、 0.5 1のひ一32 P— UTP ( 3000 C i/mmo 1、 1 OmC i/m 1 ) CAmercham, Buckinghamshire, UK〕 、 4 OmM T r i s ■ HC 1 ( p H 7.5 ) 5〜1 OmM MgC l 2、 1 0 mMジチオスレィトール、 ！〜 5ユニットの T
7 RNAボリメラ一ゼを含むサンプリングチューブに添加し、 全体量を 1 0 / l とした。
3'デォキシリボヌクレオチド 5' トリフォスフェートが 3' dCTP、 3' dGTP 又は 3' d UTPの場合も同様に行った。
得られたサンプルは、 37°Cで 30分インキュベートした。 次いで、 各反応物 は 3 1のホルムアミ ドダイ （95%ホルムアミ ド、 1 OmM EDTA、 0. 05%ブロムフエノールブルー及び 0. 05%キシレンシァノール） と混合し、
80°Cで 5分間加熱し、 即座に、 6 %シークェンスゲルにアプライし、 レーンに 充塡した。 電気泳動を 30Wの定電力で 2時間行った。 ゲルは據紙上で乾燥し、 BAS 2000イメージアナライザー （FUJ I) にて解析をおこなった。
その結果、 図 1に示すように、 シークェンスラダ一が前記のプロトコールによ り生成した。 実施例 2
実施例 1と同様にして PC R反応を行い、 PCR反応生成物を得、 この PCR 反応生成物にっレ、て以下のシークェンシングを行なつた。
上記 PC R反応物の 1〜5 1を、 1 0〜50〃Mの蛍光物質 （テトラメチル ローダミ ン） で標識した 3'デォキシリボヌクレオチド 5' トリフォスフヱー卜の 1 つである 3' dUTPの 1つ、 1 00 LiMの各リボヌクレオンド 5' トリフォスフエ —ト （ATP、 CTP、 GTP、 UTP) 、 4 OmM Tr i s · HC】 （pH 7. 5) 、 5〜1 OmM MgC l 2 、 1 0 mMジチオスレイトール、 1〜5ュ ニッ 卜の T 7 RNAポリメラーゼを含むサンプリングチューブに添加し、 全体量を \ 0 fi \ とした。 尚、 テトラメチルローダミンで標識した 3'デォキシリボヌクレオ チド 5' トリフォスフヱ一トは後述の参考例に示す方法により合成した。
得られたサンプルは、 37。Cで 30分インキュベートした。 次いで、 フエノー ル//クロ口ホルム抽出、 エタノール沈殿等により過剰な蛍光標識 3' dUTPを除 去し、 沈殿物を 3 1のホルムアミ ドダイ （95%ホルムアミ ド、 1 OmM E DTA) に溶解し、 80。Cで 5分間加熱し、 即座に、 4%シークェンスゲルにァ プライし、 AB I 377蛍光自動シークェンサ一による泳動を 7時間行った。 そ の結果、 図 2に示すように、 Uのエレクト口フエログラムが前記のブロトコール により生成した。
蛍光標識 3'デォキシリボヌクレオチド 5' トリフォスフェートが 3' dCTP、 3' d G T P又は 3' d A T Pの場合も同様に行うことができる。. 参考例
TMR (テトラメチルローダミン） 標識 3'- デォキシゥリジン- 5'-トリホスフ -トの調製
1 ) 3' - デォキシ -5' -0-ジメ トキシトリチルゥリジン （3' -Deoxy-5' -0- dimethoxytrityluridine; の合成
3'- デォキシゥリジン （4 g) 、 トリェチルァミン （2. 4 6m l) 、 N,N'- ジメチルァミノピリジン （0. 76 g) をピリジン （ 1 00m 1 ) に溶解し、 4, 4'- ジメ トキシトリフエニルメチルクロリ ド （ 1 3. 1 3 g) の塩化メチレン （ 70m l ) 溶液を加えた後室温で 25時間反応させた。 反応終了後、 反応液を減 圧濃縮し、 得られた残渣を酢酸ェチルで抽出し、 抽出液を飽和食塩水で洗浄した。 酢酸ェチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去しシリカゲル カラムクロマトグラフィ （溶出液；酢酸ェチル -ΙΊ- へキサン混合溶媒） で精製し て 3'- デォキシ -5' -0-ジメトキシトリチルゥリジン 9. 04 gを得た （収率 97. 2%) o
2) 2' -0- ァセチル- 3' -デォキシ- 5' -0-ジメ トキシトリチルゥリジン （2'-0- Acetyl-3' -deoxy-5' -O-dimethoxytrityluridine ) の合成
3'- デォキン- 5'- 0-ジメ トキシトリチルゥリジン （ 9. 02 g) をピリジン ( 1 00m l ) に溶解し、 氷冷下無水酢酸 （30m l ) を加え以後室温で一液反 応させた。 反応終了後、 反応液を減圧濃縮し、 得られた残渣を酢酸ェチルで抽出し、 抽出液を飽和食塩水で洗浄した。 酢酸ェチル層を無水硫酸マグネシゥムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去しシリカゲルカラムクロマトグラフィ （溶出液；酢酸ェチル- n- へキサン混合溶媒） で精製して 2' -0- ァセチル- 3'-デォキシ- 5' -0-ジメトキシト リチルゥリジン 7. 1 2 gを得た （収率 73. 2%) 。
3) 2' -0- ァセチル- 3'-デォキシゥリジン（2'- 0- Acetyl- 3'-deoxyuridine) の 合成
2' -0- ァセチル -3'-デォキシ- 5' -0-ジメトキシトリチルゥリジン （7. 1 2 g) を 80%齚酸に溶解し室温で一液反応させた。 反応終了後、 反応液を減圧濃縮し、 得られた残渣をシリカゲルカラムゥクロマトグラフィ （溶出液；醉酸ェチルーメ 夕ノール混合溶媒） で精製し、 酢酸ェチル -n-へキサンより結晶化して 2' -0- ァセチル -3'-デォキシゥリジン 2. 58 gを得た （収率 76. 8 %) 0
融点： 1 48〜 1 4 9 °C
!H-NMR (270MHZ, D S0-d6) 5ppm: 1.92-2.01 (m.1H.3' -Ha), 2.06(s, 3H, CH3C0), 2.17-2.23(m.1H.3' -Hb), 3.35(brs, 1H.5' -OH). 3.52, 3.71(2dd, 2H.
J=3.2, 12.2;2.7,11.9, 5' -Ha, b), 4.20-4.30(m, 1H, 4' -H). 5.22-5.26(m, 1H, 2' -H), 5.61 (dd.1H. J=2.2.8.1Hz.5-H). 5.78(d, 1H, J=2.7Hz.1' -H), 7.91 (d.1H, J=8. lHz, 6-H)，11.32(brs, 1H，NH)
4) 2'- 0- ァセチル- 3'-デォキシ- 5- ョードウリジン（2'- 0-Acetyl- 3'deoxy - 5 - i odour i dine) の合成
2' -0- ァセチル -3' -デォキシゥリジン （2. 47 g) のァセトニトリル （1 5 0m l ) 溶液に硝酸二アンモニゥムセリウム （IV) (2. 5 18) とょぅ素 （1. 39 g) を添加し 80°Cで 1時間反応させた。 反応終了後、 反応液を減圧濃縮し、 得られた残渣を酢酸ェチルで抽出し 5 %亜硫酸水素ナトリゥム水と飽和食塩水で 洗浄した。 酢酸ェチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、 溶媒を留去して 2' -0- ァセチル -3'-デォキシ -5- ョードウリジン 3. 37 gを得た （収率 93. 1 %) c 】H—匪 R (270MHZ. CDCh) 5ppm: 2.01-2.07(m, IH.3' -Ha). 2.12(s, IH.
CHsCO), 2.45-2.49(m. IH.3' -Hb), 3.48-3.50(m. IH.5' -OH), 3.75, 4.09(2dd, 2H, J=2.7, 12.7:2.0, 12.4Hz, 5' -Hab), 4.40-4.50(m. IH, 2' -H)， 5.79(d.1H， J=l.9Hz' Γ-Η), 8.28(s, 1H.6-H), 9.50(brs.1H.NH)
5) 2'-0- ァセチル -3'-デォキシ -5-(3"- トリフルォロアセタミ ド -Γ-プロピ ニル） ゥリジン （2' -O-Acetyl-3' -deoxy-5-(3"-trif luoroacetamido-Γ- propynyl) uridine)の合成
2' -0- ァセチル -3' -デォキシ -5- ョードウリジン （ 1. 0 g) の DMF ( 12. 6m l ) 溶液に窒素気流下、 N—プロパギルトリフルォロアセタミ ド （0. 88 m l ) 、 よう化銅 (I) (96mg) 、 塩化ビス （トリフエニルホスフィン） パ ラジウム （H) (1 77mg) 及びトリェチルァミン （0. 7m l ) を加え室温 で 4時間反応させた。 反応液を減圧濃縮して得た残渣を塩化メチレン一メタノー ル混液 （40m l ) に溶解しイオン交換樹脂 AG 1 x 8 (B i o— Ra d社製、 HC03—型； 2 g) を加え 30分間攪拌した。 攄別後、 濾液を濃縮し得られた残渣 を酢酸ェチルで抽出し、 飽和食塩水で洗浄した。 酢酸ェチル層を無水硫酸マグネ シゥムで乾燥後、 溶媒を留去しシリカゲルカラムクロマトグラフィ （溶出液；酢 酸ェチル -n-へキサン混合溶液） で精製して 2' -0- ァセチル -3'-デォキン- 5-(3" トリフルォロアセタミ ド -Γ-プロピニル） ゥリジン 405mgを得た （収率 38. 3%)
!H-NMR (270MHZ, DMS0-d6) dppm: 1.89-1.92(m. IH, 3' -Ha), 2.06(s.3H, CHsCO), 2.17-2.26(m, IH.3' -Hb). 3.40(brs. IH.5' -OH), 3.53, 3.76(2dd.2H.
J=3.1, 11.9 ;2.7, 12.1Hz, 5' -Hab), 4.22-4.30(iii.3H, 4' _H. - CH2- ), 5.28-5.31 (m, IH, 2' -H). 5.75(d, IH. J=l.9Hz.1' -H), 8.34(s, IH.6-H). 10.06(t, IH, J-5.4Hz. NHCOCF3). 11.67(s. IH, NH)
6) 5-(3"-ァミノ- Γ -プロピニル）_3'- デォキシゥリジン- 5'-トリホスフエ一 ト [5-(3" -Amino- l"-propynyl)-3' -deoxyuridine-5' -triphosphate]の合成 2' -0- ァセチル -3'-デォキシ -5-(3"- トリフルォロアセタミ ド -Γ-プロピニル ) ゥリジン （42mg) を無水ピリジン （2m l ) に溶解した後減圧濃縮乾固し 更に 1時間デシケーター （P205) で乾燥した。 窒素気流下に無水ピリジン （ 1 0 0 ^ 1 ) と無水ジォキサン （300 1 ) に溶解し 1M-2- クロ口- 4H-1,3,2-ベン ゾジォキサフォスフォリン -4- オンのジォキサン溶液 （ 1 1 0 1 ) を加え 1 0 分間攪拌した。 反応液に 0. 5M-ビス （トリ- n - プチルアンモニゥ厶） ピロフォ スフエートの DMF溶液 （300 1 ) とトリ -n- プチルアンモニゥム （ 1 00 L 1) を加え 1 0分間浸拌した。 次いで 1 %よう素のピリジン—水 （98/2, v/v) 溶液を加え更に 1 5分間攪拌した。 反応終了後 5 %亜硫酸水素ナトリウ ム水を添加し反応液を減圧濃縮した。 得られた残渣に水 （1 0m〗） を加え 30 分間放置後、 25%アンモニア水 （20m l ) を加え 2時間攪拌した。 反応液を 濃縮乾固して得た残渣を D E A E—トヨパールィォン交換力ラムク πマトグラフ ィ一 （東ソ一社製； 1. 2 X 30 cm；溶出液： トリエチルアンモニゥ厶カーボ ネート緩衝液 （pH7.5)0.05M→0.5M直線濃度勾配 （全量 2L))で精製して 5- (3" -ァ ミノ -1"-プロピニル） -3'-デォキシゥリジン- 5'-トロホスフエ一ト 5 lmgを得 た （収率 55%) 。
7) TMR—標識 3'- デォキシゥリジン- 5'-トリホスフェート（TMR-labeled 3' deoxyuridine-5' -triphosphate) の合成
5- (3"-ァミノ -Γ-プロピニル）-3' - デォキシゥリジン -5' -トリホスフェート（1 0.5 〃mol)の 1Mトリェチルアンモニゥムカーボネート緩衝液 (pH9.05: 1.2ml)に 5- カルボキシテトラメチルローダミンコハク酸イミ ドエステル （モレキュラープロ ーブ社製） （1 5mg) の DMF溶液 （0. 9 m 1 ) を加え室温で一液攪拌した。 反応液に水 （30m l ) を加え希釈した後、 DEAE—トヨパールイオン交換力 ラムクロマ卜グラフィ （1.2 X 30 cm；溶出液： トリェチルアンモニゥム力一 ボネート緩衝液 （pH7.5)0.05M→0.7直線濃度勾配 （全量 2L))で精製して TMR - 標識 3'- デォキシゥルイジン- 5'-トリホスフヱート 7.38 zmol を得た （収率 70. 2%) o

Claims

請求の範囲
(1) ポリメラ一ゼ連鎖反応により増幅した DNA生成物の塩基配列を、 プライマ 一及び/又は 2'デォキシリボヌクレオシド 5' トリフォスフエ一ト及び Z又はその 誘導体を除去することなく決定する方法であって、
RNAボリメラーゼ及び前記 RNAボリメラーゼのためのプロモーター配列を 含む前記ボリメラーゼ連鎖反応により増幅した DN A生成物の存在下、
ATP、 GTP、 CTP及び UTP又はそれらの誘導体からなるリボヌクレオ シド 5' トリフォスフェート類並びに 3' dATP、 3' dGTP、 3' dCTP、 3' d UTP及びそれらの誘導体からなる 1種又は 2種以上の 3'デォキシリボヌクレオ チド 5' トリフォスフヱート （以下、 3' dNTP誘導体という） を反応させて核酸 転写生成物を得、 得られる核酸転写生成物を分離し、 得られる分離分画から核酸 の配列を読み取ることを特徴とする D N Aの塩基配列決定方法。
(2) リボヌクレオシド 5'トリフォスフェート類として ATP、 GTP、 CTP及 び U T Pを用いる請求項 1記載の方法。
(3) 3'デォキシリボヌクレオチド 5' トリフォスフェートとして 3' dATP、 3' d GTP、 3' d CTP及び 3' d UTPを用いる請求項 1記載の方法。
(4) 核酸転写反応は、 異なる塩基を含む 4種の 3' dNTP誘導体について、 4回 独立に行い、 3'末端が異なる塩基である 4通りの核酸転写生成物を得る、 請求項 1〜 3のし、ずれか 1項に記載の方法。
(5) 3'末端が異なる塩基である 4通りの核酸転写生成物を、 それぞれ独立に分離 する力、、 又は少なくとも 2通りの核酸転写生成物を混合した後に、 分離する、 請 求項 4記載の方法。
(6) 少なくとも 1つの核酸転写反応は、 異なる塩基を含む 4種の 3' dNTP誘導 体の内の 2種以上の存在下で行レ、、 3'末端が異なる塩基である 2通り以上の核酸 転写生成物を同時に混合状態で得る、 請求項 1〜 3のレ、ずれか 1項に記載の方法 c
(7) 核酸転写反応は、 異なる塩基を含む 4種の 3' d NT P誘導体の存在下で 1回 行い、 3'末端が異なる塩基である 4通りの核酸転写生成物を同時に混合状態で得 る、 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の方法。
(8) 核酸転写生成物の分離を電気泳動法により行う請求項 1〜 7のいずれか 1項 に記載の方法。
(9) リボヌクレオシド 5' トリフォスフェート類が標識されており、 分離分画から の核酸の配列の読み取りを、 標識からのシグナルを検出することにより行う請求 項 1〜 8のいずれか 1項に記載の方法。 θ) 3' d N T Ρ誘導体が標識され、 分離分画からの核酸の配列の読み取りを、 標 識からのシグナルを検出することにより行う請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載 の方法。
(11) 標識が放射性若しくは安定同位元素又は蛍光標識である請求項 9又は 1 0記 載の方法。
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